CN108254556B - 一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用。本发明首先获得了一个抗体效价高达107,亲和常数为3.85×1011M‑1的百日咳毒素单克隆抗体,该单抗是由保藏编号为CGMCC No.15288的杂交瘤细胞株分泌得到,将本发明的单抗包被ELISA试剂盒,可用于酶联免疫法检测百日咳疫苗生产过程以及成品疫苗中百日咳毒素的含量检测,以便进行疫苗的质控,具有广泛的应用前景与市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学与试剂盒制备技术领域,具体涉及一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用。
背景技术
百日咳是一种通过呼吸道传播的细菌感染性疾病,在百日咳疫苗广泛接种之前,它是儿童致死率最高的感染性疾病。通过实施百日咳疫苗的接种,特别是全球实施扩大免疫规划后,百白破联合疫苗免疫覆盖率提高,全球的百日咳得到了有效的控制,发病率和死亡率显著下降。据世界卫生组织(WHO)估计,实施疫苗接种已减少了千万病例及百万的死亡病例。中国自1978年实施EPI,百白破被纳入儿童计划免疫,根据全国疾病监测点百日咳疫情资料分析,发病率从20世纪60-70年代的100/10万-200/10万降至90年代末<1/10万,大部分省的报告发病率在0.5/10万左右,流行范围逐步缩小,近十年全国发病率均<0.5/10万。
百日咳杆菌能够产生多种毒性因子,包括百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、黏附素(PRN),气管细胞毒素(TCT),腺苷酸环化酶毒素(ACT)等。其中PT是主要的致病因子,在百日咳的发病中具有重要作用。PT能诱发机体的持久免疫力,并具有多种生物活性,如提高小鼠对组织胺、5-羟色胺和敏感性,促进白细胞增多,抑制巨噬细胞功能,损伤呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽等。
百日咳感染病原学诊断是指在患儿卡他期和痉咳初期获得的鼻咽部样本中找到百日咳杆菌。这是百日咳诊断的金标准,但普遍认为这种培养的敏感性较低。如在疾病的早期采集标本,实现快速运转,在实验室技术良好的情况下,分离率可达80%以上,但如果患儿已经应用了抗生素,进行免疫或采集标本时间过短,则分离率较低。经典细菌培养法具有较好的特异性,但其敏感性受很多因素的影响,且培养时间长,所以不利于疑似患者的快速诊断和治疗,不利于临床早期诊断。因此,建立一种快速百日咳感染后的诊断手段则显得尤为重要。本发明提供了一种双抗体夹心酶联免疫法检测试剂盒,可以实现PT毒素的快速鉴别,为百日咳疾病的快速诊断提供了必要条件。
2015版药典中对百日咳的鉴别提供方法,其中有动物法。作为传统方法,有其固有的优势。但动物实验存在试验周期长,费用高、试验结果波动较大等缺点,并且只能用作鉴别,不能定量。在实际生产过程中发现,用于百日咳预防的无细胞吸附百白破疫苗或以百白破为基础制备的联合疫苗,在不同厂家之间,同一厂家不同联合疫苗之间,即使同一厂家同一产品在不同国家的注册质量标准也存在差异。因此,亟需开发一种能快速准确检测PT毒素的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速准确检测PT毒素的双抗体夹心ELISA试剂盒,便于PT抗原的快速检出及含量检测,为百日咳疾病诊断、百白破疫苗及以百白破为基础制备的联合疫苗的质量标准的统一奠定基础。
本发明的百日咳毒素检测试剂盒,包被抗体是由保藏编号为CGMCC No.15288杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
进一步地,所述单克隆抗体经酶标记。
进一步地,所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
该杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCCNo.15288,保藏日期2018年1月18日,分类命名为:PT鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明提供了上述杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测百日咳毒素试剂盒中的应用。
本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测百日咳抗体试剂盒中的应用。
具体流程为:(1)单克隆抗体的制备:通过将免疫PT毒素原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分离出能够分泌PT毒素抗体的单克隆杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔,制备含有特异性PT毒素抗体的腹水,经过后期处理并验证,得到特异性好、抗体水平高且能长期保存的PT毒素单克隆抗体。
(2)多克隆抗体的制备:采用PT脱毒液免疫新西兰大白兔,背部皮下多点接种;共免疫5针,第一针为弗氏完全佐剂与样品等体积混合乳化,2-5针为弗氏不完全佐剂与样品等体积混合乳化;末次免疫后1周采血,离心分离血清。检测血清间接酶联免疫法效价和中和效价。
(3)抗体匹配:将单克隆抗体适当稀释后,100.0μl/孔加样于酶标板,2~8℃孵育过夜,封闭后拍干,加入稀释后的样品或者参比品,反应后加入多克隆抗体,再加入羊抗兔-HRP,洗板拍干,显色,终止反应后,读数。
(4)抗体浓度的确定:单克隆纯化抗体用碳酸盐缓冲液按稀释成不同浓度进行包被,检测一定浓度的抗原含量,多克隆抗体稀释成不同浓度,与不同浓度的单克隆纯化抗体进行方阵匹配,显色后检测OD值。确定包被抗体和二级抗体的浓度。
本发明提供了上述的单克隆抗体在含百日咳抗原的疫苗质量控制中的应用。
本发明还提供一种治疗或预防百日咳杆菌感染引起疾病的药物,含有所述的单克隆抗体。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.15288的杂交瘤细胞株或其分泌的单克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用。
进一步地,所述的应用为单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备过程中或疫苗成品中的百日咳毒素抗原的含量。
试剂盒抗体制备过程中,抗原即免疫原起着至关重要的作用,不同的抗原制备的抗体对抗原位点的识别不同。由于抗体制备的限制,各厂家建立的PT抗原检测系统多数情况下不识别其他厂家的原液或成品,或微弱识别。单克隆抗体可广泛应用于PT毒素的检测、鉴别、筛查与疫苗生产的抗原检测以及流行病调查中;同时检测的是抗原决定簇,可以更加有效的反应疫苗的有效组分,对疫苗的工艺研究与生产具有重要意义。本发明提供的试剂盒,从抗体进行初步筛选,得到了抗体效价高达107,亲和常数为3.85×1011M-1的百日咳毒素单克隆抗体,并进行了匹配以及浓度调试,得到了可与不同厂家解离后成品反应的抗原检测系统。
本发明的有益效果还在于:
(1)本发明的单克隆抗体具有较高的中和效价,可以有效反映PT毒素有效抗原表位,用于抗原含量检测优于多抗——多抗的检测体系;同时该单抗反映的中和表位即有效抗体,可用于抗PT毒素IgG抗体竞争法检测,该单抗的亲和常数为3.85×1011M-1,用于疫苗免疫效果的评价及流行病学调查,更加有效的评价疫苗的免疫效果及地区的过往发病史。
(2)本发明的PT毒素单克隆抗体可以特异性的区分PT和FHA、PRN,不与其反应,是能够与PT毒素特异性结合的单抗。本发明的单克隆抗体与脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,甲肝病毒、乙肝病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素等无交叉反应,均有较好的特异性。
(3)通过双抗体夹心酶联免疫(ELISA)法检测供试品中PT毒素的试剂盒,能快速有效地实现PT毒素的快速鉴别及含量检测。本发明提供的试剂盒,可以与多厂家解离后成品反应,并可检测PT毒素含量。为无细胞吸附百白破联合疫苗或由百白破组成的其他联合疫苗的质量控制提供了可能,有利于形成一致的百白破疫苗及以百白破为基础制备的联合疫苗的质量标准。
附图说明
图1为实施例10的层析样品SDS-PAGE检测结果图。1、2、3、4、5、6、7分别为工序过程产品。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1杂交瘤细胞的制备
(1)将百日咳工作种子经复苏、摇瓶培养后接种于发酵培养基,35.0±2.0度℃培养44-46小时,于指数生长期后期收获。
(2)收获后对其进行杀菌,澄清,粗纯、精纯。
(3)即得纯化液,戊二醛脱毒后即得PT原液。
(4)将疫苗原液与弗氏佐剂(0天免疫为弗氏完全佐剂,14天、28天免疫为弗氏不完全佐剂)等体积混合乳化后于0天、14天、28天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠,0.2ml/只。
(5)末次免疫一周后采血检测抗体效价,血清稀释104时PT脱毒液免疫小鼠血清的间接ELISA的OD值为1.126。于末次免疫二周后采用收获液腹腔冲击选定的小鼠,3天后取小鼠脾脏,进行细胞融合。
实施例2细胞融合及建株
(1)细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株,融合前3天扩大培养,融合前1天去除RPMI1640细胞培养液(Gibco),重新添加培养液,准备SP2/0细胞。
(2)处死免疫小鼠,按常规方法制备小鼠脾细胞悬液。
(3)根据脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco),SP2/0细胞晃动混匀,脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2~10:1混合于50ml离心管中,混匀。
(4)加不完全IMDM培养液至50ml,离心5-10分钟,倒净上清。轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀,离心管置37℃水浴,准备融合。
(5)将37℃预热的50%的PEG4000 1ml,用滴管缓慢滴入混合细胞管,边滴边转动离心管,使细胞保存在混匀状态。
(6)静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的IMDM培养基(Gibco)(37℃),然后离心5-10分钟,弃去上清。
(7)加入IMDM完全培养液(Gibco),混匀,将混悬液分别加至96孔细胞培养板中,100μl/孔,于37℃,5%CO2培养箱内培养。
(8)第2天细胞板加HAT培养液(IMDM含1*HAT(Sigma))100μl/孔。
(9)每2-3天换一次HAT培养液,观察是否出现杂交瘤,两周后换HT培养基(IMDM含1*的HT(Sigma)),观察融合细胞生长状况。
(10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养,及时做亚克隆。
(11)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系,名为MC-8,将此细胞系建立细胞库,冻存至液氮。
该杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCCNo.15288,保藏日期2018年1月18日,分类命名为:PT鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例3杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测
分别在杂交瘤细胞制备完成后第3个月和第9个月后,从液氮中取出冻存的保藏编号CGMCC No.15288的PT鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后,制备腹水,进行间接ELISA检测抗体效价,以前期制备的腹水为对照同时进行检测。结果本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到107以上,与前期腹水效价无差异,表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低,稳定性良好。将本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水分别置于37℃与25℃中,放置时间均为12天,以前期制备的腹水为对照同时进行间接法ELISA检测。结果见表1。
表1单抗热稳定性结果
由以上结果可知,本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水在25℃放置时,随时间的延长,抗体效价呈下降趋势;37℃放置的抗体效价在放置12天约为原效价的一半。
实施例4单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测
按常规方法将冻存的实施例2获得的保藏编号CGMCC
No.15288的杂交瘤细胞进行复苏,培养,待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50%以上时即可按照常规方法腹腔接种BALB/c小鼠,定期收集腹水。
将PT脱毒液采用0.01mol/L PBS1:100稀释,100μl/孔包被酶标板,2-8℃过夜,检测抗体效价,抗体效价最高达为107,结果见表2。
表2抗体效价检测结果
实施例5抗体特异性检测结果
将FHA、PRN原液采用0.01mol/L PBS 1:100稀释,100μl/孔包被酶标板,2-8℃过夜,检测实施例3获得的PT抗体效价,均为阴性,结果见表3。
表3间接ELISA法抗体特异性检测结果
本发明中PT单抗不与FHA、PRN原液反应,说明该单克隆抗体能够区分百日咳杆菌产生的另两种组分FHA和PRN,本发明杂交瘤细胞分泌的单抗在检测时可以特异的识别PT抗原,而不被FHA及PRN抗原干扰,具有较好的特异性和应用价值。
实施例6细胞簇集实验
用细胞维持液将本发明提供的单克隆抗体稀释至适宜浓度,将上述稀释后溶液在96孔细胞培养板中进行2倍系列稀释,稀释后每孔样品体积为50μl,加入稀释至6ng/ml的PT标准毒素50μl,室温中和1h后加入4×104cells/ml的细胞悬液,每孔100μl;置37℃的CO2培养箱中培养48h。培养结束后,去除细胞培养液加入PBS,每孔200μl,冲洗2次,拍干后置通风处风干10min。加入甲醇,每孔100μl,室温固定10min。弃去甲醇并拍干,加入吉姆萨染液,每孔100μl,室温染色10min。弃去染液,水洗掉背景颜色后置显微镜下观察细胞簇集状态。结果显示单克隆抗体的效价为4×102~8×102。
本发明PT腹水能有效中和PT抗原发生中和效应,表明该单抗具有良好的中和效果,它针对的表位是PT毒素的中和性表位,即抗原决定簇,该表位的存在与检出直接反应疫苗的免疫效果,表明采用该单抗检测抗原可以反应疫苗的有效性。
实施例7抗体亚类测定
将PT原液采用0.01mol/L PBS 1:100倍稀释后100μl/孔包被酶标板2-8℃过夜,然后采用Southern Biotech鼠单抗分型试剂按照单抗亚类试剂说明书进行试验,最后加入HRP标记的羊抗鼠二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明单抗为IgG1型。
实施例8免疫印迹(Western blotting)实验
将PT原液采用BIO-RAD的电泳电转设备使用12%的SDS-PAGE电泳胶进行电泳,电转到硝酸纤维素膜,以本发明杂交瘤细胞腹水为一抗(1:4000),HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blotting鉴定,结果显示,杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与PT的S1,S2,S3,S4,S5等5个亚基均不反应,表明该单抗与变性后的抗原不能反应,说明本发明提供的杂交瘤细胞分泌的单抗是构象型单抗。
实施例9亲和常数测定
将本发明的杂交瘤细胞株分泌的PT单抗纯化后检测蛋白质含量,采用1:5、1:10、1:20稀释的不同浓度的PT抗原横向包被酶标板,100μl/孔,2-8℃包被过夜。第二天洗板后37℃封闭2小时,拍干待用。将纯化抗体2倍梯度稀释,纵向加入包被后的酶标板,采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度时的曲线平坦段的OD值计为100%,计算50%OD值,考察50%OD值所对应点的单抗浓度[Ab]t,再根据亲和常数计算公式可以得到本发明单抗的亲和常数为3.85×1011M-1。
实施例10抗原含量检测试剂盒初步结果
本发明中单克隆抗体包被浓度分别为1:2000、1:4000、1:8000,兔多克隆抗体使用浓度分别为1:4000、1:8000、1:16000,羊抗兔HRP浓度为1:20000。
表4抗体浓度匹配
由以上结果可知,以上浓度均可以进行抗原浓度检测,最佳匹配浓度为单抗1:4000,多抗1:8000,羊抗兔HRP浓度为1:20000。
分别按1:2000、1:4000、1:8000包被鼠单抗,兔多抗使用浓度为1:4000、1:8000、1:16000,羊抗兔HRP使用浓度为1:20000,检测相同浓度的已知抗原含量20ng/ml,检测结果如下。
表5抗原含量结果
由以上结果可知,在不同的包被及兔多抗浓度时,检测结果均满足ELISA方法要求,但1:4000包被浓度,1:8000二抗浓度为最佳浓度,在该浓度下,抗原结果最接近理论值。
将本发明PT鼠单抗采用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)
1:4000稀释,100μl/孔包被酶标板,2-8℃过夜。封闭液37℃封闭2小时,分别加入PT抗原参比品和3批37℃不同时间的热加速原液,37℃反应1小时,洗板后加入纯化后的1:8000稀释PT兔多抗,37℃反应1小时,洗板后加入1:20000稀释的羊抗兔HRP,37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数,检测PT抗原含量。结果见表6。
表6抗原含量检测方法应用
采用本发明建立的抗原含量检测方法检测3批37℃不同热加速时间的PT脱毒液,抗原结果CV<10%,蛋白结果CV<8%,均在试验允许的误差范围内,表明检测方法准确可靠。本发明具有较好的应用效果。SDS-PAGE结果见图1,PT抗原含量与SDS-PAGE结果相符。由SDS-PAGE结果可知,经过纯化过程后,非目标条带明显减少,目标抗原的纯度得到提高。
表7 PT生产过程比活变化
名称 | 蛋白质含量(μg/ml) | 抗原含量(ng/ml) | 比活(抗原/蛋白) |
1 | 3780 | 669372 | 177 |
2 | 614 | 1355 | 2 |
3 | 326 | 10296 | 32 |
4 | 168 | 216609 | 1289 |
5 | 954 | 2157117 | 2261 |
6 | 3151 | 8373 | 3 |
7 | 717 | 6605 | 9 |
由以上结果可得,经过纯化后,目标蛋白质的比活有了明显提到,由上样时的177增高至2261。
实施例11抗原含量检测试剂盒特异性研究
将本发明PT鼠单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)1:4000稀释,100μl/孔包被酶标板,2-8℃过夜(12-18小时)。封闭液37℃封闭2小时,分别加入脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型疫苗原液、甲肝原液、乙肝原液、白喉类毒素、破伤风类毒素、FHA原液、PRN原液,37℃反应1小时,洗板后加入纯化后的1:8000稀释的PT兔多抗,37℃反应1小时,洗板后加入1:20000稀释的羊抗兔HRP,37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数,检测样品的抗原含量,结果见表8。
表8单克隆抗体特异性OD值
本发明与脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型疫苗原液、甲肝原液、乙肝原液、白喉类毒素、破伤风类毒素、FHA原液、PRN原液均不反应,表明本发明可以有效区分上述病毒,同时采用本发明建立的体系和培养基不存在交叉反应,可以有效检出PT抗原含量,具有高的特异性。
实施例12抗原含量检测试剂盒稳定性研究
本发明试剂盒中包含的原材料有,包被抗体,二级抗体,酶标抗体,酶稀释液,显色液A/B,终止液以及检测用酶标板。将本发明所用原材料置于37℃,时间为7天。7天后使用热加速试剂盒与2-8℃存放试剂盒检测相同的PT抗原,对检测结果进行比较。
表9热加速试验结果
PT原液1 | PT原液2 | PT原液3 | |
热加速试剂盒 | 126914 | 119340 | 141579 |
2-8℃试剂盒 | 133378 | 110728 | 144883 |
从结果来看,本发明提供的试剂盒,在37℃热加速7天后,检测结果与2-8℃试剂盒无明显差异,说明本发明提供的抗原检测试剂盒稳定性较好,间接证明了本发明PT鼠单抗的稳定性。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种百日咳毒素检测试剂盒,其特征在于,包被抗体是由保藏编号为CGMCCNo.15288杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
3.百日咳毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,其保藏编号为CGMCC No.15288。
4.由权利要求3所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
5.权利要求3所述的杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。
6.权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测百日咳毒素试剂盒中的应用。
7.权利要求4所述的单克隆抗体在含百日咳抗原的疫苗质量控制中的应用。
8.权利要求4所述的单克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用,所述的应用为所述单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备过程中或疫苗成品中的百日咳毒素抗原的含量。
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