CN111004322B

CN111004322B - 丝状血凝素检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111004322B
Application number: CN201911370156.8A
Authority: CN
Inventors: 程会欣; 张立志; 王治伟; 王巍巍; 刘波; 马国涛
Original assignee: Sinovac Research & Development Co ltd
Current assignee: Sinovac Research & Development Co ltd
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN111004322A

Abstract

本发明涉及丝状血凝素检测试剂盒及其应用。本发明首先获得了一个抗体效价高达10⁷，亲和常数为3.42×10¹¹M^‑1的丝状血凝素(FHA)单克隆抗体，将本发明的单抗包被ELISA试剂盒，可用于酶联免疫法检测百日咳，检测疫苗生产过程以及成品疫苗中丝状血凝素的含量，以便进行疫苗的质控，具有广泛的应用前景与市场价值。

Description

丝状血凝素检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学与试剂盒制备技术领域，具体涉及丝状血凝素试剂盒及其应用。

背景技术

百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病,在百日咳疫苗广泛接种之前，它是儿童致死率最高的感染性疾病。通过实施百日咳疫苗的接种,特别是全球实施扩大免疫规划(EPI)后,百白破联合疫苗免疫覆盖率提高，全球的百日咳得到了有效的控制,发病率和死亡率显著下降。据世界卫生组织(WHO)估计,实施疫苗接种后已减少了千万的患病病例及百万的死亡病例。中国自1978年实施扩大免疫规划后，百白破被纳入儿童计划免疫，根据全国疾病监测点百日咳疫情资料分析，发病率从20世纪60-70年代的100/10万-200/10万降至90年代末<1/10万，大部分省的报告发病率在0.5/10万左右，流行范围逐步缩小,近十年的全国发病率均<0.5/10万。

百日咳杆菌能够产生多种毒性因子，包括百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、黏附素(PRN)、气管细胞毒素(TCT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)等。其中FHA是细胞壁成分，该蛋白质分子具有粘附作用，并且对红细胞有凝集作用。FHA与百日咳杆菌黏附和定居在呼吸道上皮细胞上是至关重要的，是百日咳杆菌致病的重要毒力因子。FHA还具有较强的免疫原性，能刺激机体免疫系统产生特异的保护性抗体，已被世界上很多国家用作无细胞百日咳疫苗的主要组分之一。用FHA免疫的小鼠能抵抗百日咳杆菌的致死性呼吸道攻击，但不能抵抗对脑部的攻击。百日咳杆菌的菌毛是表面结构，可直接通过菌体与型特异性抗血清或单克隆抗体的凝集反应进行检测。

百日咳感染的病原菌诊断是指在患儿卡他期和痉咳初期获得的鼻咽部样本中找到百日咳杆菌，这是百日咳诊断的金标准，但是通常认为直接培养病原菌的灵敏度过低，受到患儿应用抗生素、实验条件、标本采集等因素的影响，而且培养时间较长，不利于疑似患者的快速诊断和治疗，不利于临床早期诊断。

2015版《药典》中提供了对百日咳的鉴别方法，其中有动物法和酶联免疫法。动物法作为传统方法，有其固有的优势，但存在试验周期长、费用高、试验结果波动较大等缺点，并且只能用于进行鉴别，不能用于定量。酶联免疫法试验具有周期短，费用低、结果受外界波动小等优点，不仅可以定性，也可以进行定量。虽然目前有针对PT毒素的ELISA试剂盒，可以便于PT抗原的快速检出及含量检测，但是目前还没有针对FHA毒素的用于百日咳疾病诊断的试剂盒。

此外，在实际生产过程中发现，用于百日咳预防的无细胞吸附百白破疫苗或以百白破为基础制备的联合疫苗，在不同厂家之间、同一厂家不同联合疫苗之间，同一厂家同一产品在不同国家的注册质量标准均存在差异。因此，亟需开发一种能快速准确检测FHA的方法，从而对不同厂家以及同一厂家不同联合疫苗之间的质量标准进行统一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速准确检测FHA的双抗体夹心ELISA试剂盒，以便于FHA抗原的快速检出及含量检测，用于百日咳的疾病诊断，并且为百白破疫苗及以百白破为基础制备的联合疫苗的质量标准的统一奠定基础。

第一方面，本发明提供了针对丝状血凝素的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有三个重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3或保持其功能的保守修饰的变体；以及三个轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3或保持其功能的保守修饰的变体，

所述重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；以及

所述轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:13所示的重链或保持其功能的保守修饰的变体，以及SEQ ID NO:14所示的轻链或保持其功能的保守修饰的变体。

第二方面，本发明提供了编码权利要求1或2的针对丝状血凝素的单克隆抗体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列具有编码三个重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列或保持其功能的变体；以及编码三个轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列或保持其功能的变体，

所述编码重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；以及

所述编码轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

优选地，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列或保持其功能的变体，以及SEQ ID NO:16所示的多核苷酸序列或保持其功能的变体。

第三方面，本发明提供了用于检测丝状血凝素的试剂盒，其包含包被抗体，所述包被抗体为第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体。

优选地，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

优选地，所述单克隆抗体经酶标记。

优选地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

优选地，所述试剂盒中包括包被抗体，二级抗体，酶标抗体，酶稀释液，显色液A/B，终止液以及检测用酶标板，所述包被抗体为本发明的单克隆抗体。

第四方面，本发明提供了用于诊断百日咳的试剂盒，其包含包被抗体，所述包被抗体为第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体。

优选地，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

优选地，所述单克隆抗体经酶标记。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在制备用于检测丝状血凝素的试剂盒中的应用。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在制备用于检测百日咳的试剂盒中的应用。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

第七方面，本发明提供了用于制备抗丝状血凝素(FHA)单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：将免疫了FHA原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌FHA抗体的单克隆杂交瘤细胞，接种小鼠腹腔，制备含有特异性FHA抗体的腹水，经过后期处理并验证，得到特异性好、抗体水平高且能长期保存的FHA单克隆抗体。

第八方面，本发明提供了用于制备抗丝状血凝素(FHA)多克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：经FHA脱毒液背部皮下多点接种免疫新西兰大白兔；共免疫5针，第1针为弗氏完全佐剂与FHA脱毒液样品等体积混合乳化，第2-5针为弗氏不完全佐剂与FHA脱毒液样品等体积混合乳化；末次免疫后1周采血，离心分离血清。

优选地，检测血清间接酶联免疫法效价和中和效价。

优选地，经包含如下步骤的方法进行抗体匹配：将单克隆抗体适当稀释后，以100.0μl/孔加样于酶标板，2～8℃孵育过夜，封闭后拍干，加入稀释后的样品或者参比品，反应后加入多克隆抗体，再加入羊抗兔-HRP，洗板拍干，显色，终止反应后读数。

优选地，经包含如下步骤的方法进行单克隆抗体和多克隆抗体浓度的测定：

单克隆抗体浓度的测定：将单克隆纯化抗体用碳酸盐缓冲液稀释成不同浓度进行包被，检测一定浓度的抗原含量；

多克隆抗体浓度的测定：将多克隆抗体稀释成不同浓度，与不同浓度的单克隆纯化抗体进行方阵匹配，显色后检测OD值，从而确定包被抗体和二级抗体的浓度。

第九方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在对含FHA抗原的疫苗进行质量控制中的应用。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

第十方面，本发明提供了一种用于治疗或预防由百日咳杆菌感染引起的疾病的药物，其中含有第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

第十一方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体，或第二方面的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用。

所述单克隆抗体是针对丝状血凝素抗原的单克隆抗体。

优选地，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备过程中或疫苗成品中FHA抗原的含量。

单克隆抗体可广泛应用于FHA的检测、鉴别、筛查与疫苗生产的抗原检测以及流行病调查中；同时因为单克隆抗体检测的是抗原决定簇，可以更加有效地反映疫苗的有效组分，对疫苗的工艺研究和生产具有重要意义。但是，试剂盒抗体制备过程中，抗原即免疫原起着至关重要的作用，不同的抗原制备的抗体对抗原位点的识别不同。由于抗体制备的限制，各厂家建立的FHA抗原检测系统多数情况下不识别其他厂家的原液或成品，或微弱识别。然而，本发明提供的试剂盒中所采用的本发明的FHA单克隆抗体，效价高达10⁷，亲和常数为3.42×10¹¹M^-1，而且经匹配以及浓度调试发现可与不同抗原原液都具有识别活性，因此是可以用于不同厂家抗原的检测系统。

本发明的有益效果还在于：

(1)本发明的FHA单克隆抗体具有较高的中和效价，可以有效地反映FHA的有效抗原表位，用于抗原含量的检测优于多抗检测体系；同时该单抗反映的中和表位即有效抗原表位，可用于抗FHA IgG抗体竞争法检测；本发明的单抗的亲和常数为3.42×10¹¹M^-1，可用于疫苗免疫效果的评价及百日咳流行病学调查，能够更加有效地评价疫苗的免疫效果及地区的过往百日咳发病史；

(2)本发明的FHA单克隆抗体可以特异性地区分PT，FHA和PRN，不与PT和PRN反应，是能够与FHA特异性结合的单抗。本发明的FHA单抗与脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，甲肝病毒、乙肝病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素等无交叉反应，有较好的特异性，可用于百日咳的诊断；

(3)本发明制备的通过双抗体夹心酶联免疫(ELISA)法检测供试品中FHA的试剂盒，能快速有效地实现FHA的快速鉴别及含量检测。所述试剂盒，可以与多厂家解离后成品反应，并可检测FHA的含量。因此，为无细胞吸附百白破联合疫苗或由百白破组成的其他联合疫苗的质量控制提供了可能，有利于形成一致的百白破疫苗以及以百白破为基础制备的联合疫苗的质量标准。

附图说明

图1显示了FHA鼠单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例10的层析样品SDS-PAGE检测结果图，1、2、3、4、5、6分别为工序过程产品。

序列表说明

注：加下划线字体为CDR区，加粗字体为CH1端引物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1杂交瘤细胞的制备

(1)将百日咳工作种子经复苏、摇瓶培养后接种于发酵培养基，35.0±2.0度℃培养44-46小时，于指数生长期后期收获。

(2)收获后对其进行杀菌，澄清，粗纯、精纯。

(3)得到纯化液，经甲醛脱毒后即得FHA原液。

(4)将FHA原液与弗氏佐剂(0天免疫为弗氏完全佐剂，14天、28天免疫为弗氏不完全佐剂)等体积混合乳化后于0天、14天、28天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，0.2ml/只。

(5)末次免疫一周后采血检测抗体效价，血清稀释10⁴时以FHA原液免疫小鼠血清的间接ELISA的OD值为1.311。于末次免疫二周后采用收获液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。

实施例2细胞融合及建株

(1)细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液(Gibco)，重新添加培养液，准备SP2/0细胞。

(2)处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2～10:1于50ml离心管中混匀。

(4)加不完全IMDM培养液至50ml，离心5-10分钟，倒净上清。轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。

(5)将1ml于37℃预热的50％的PEG4000用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(6)静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的IMDM完全培养液(Gibco)(37℃)，然后离心5-10分钟，弃去上清。

(7)加入IMDM完全培养液(Gibco)，混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100μl/孔，于37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(8)第2天向96孔细胞培养板加HAT培养液100μl/孔。

(9)每2-3天更换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后更换HAT培养基。

(10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，并做亚克隆。

(11)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，将此细胞系建立细胞库，冻存至液氮。

实施例3杂交瘤细胞系分泌单抗的测序以及稳定性检测

从液氮中取出冻存的FHA鼠单克隆杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养，10⁶以上数量时提取总核酸，委托北京六合华大基因科技有限公司经PCR扩增单抗的重链和轻链序列并进行测序，然后通过核苷酸序列确定对应的氨基酸序列，测定的多核苷酸序列和氨基酸序列参见序列表。

分别在杂交瘤细胞制备完成后第3个月和第9个月，从液氮中取出冻存的FHA鼠单克隆杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后，制备腹水，经间接ELISA检测抗体效价，以前期制备的腹水为对照同时进行检测。结果显示以本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到10⁷以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此，本发明制备的单克隆杂交瘤细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。将本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水分别置于37℃与25℃中，放置时间均为12天，以前期制备的腹水为对照同时进行间接法ELISA检测。结果见下表：

表1单抗热稳定性结果

由以上结果可以看出，以本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水在25℃放置时，随时间的延长，抗体效价呈下降趋势；37℃放置的抗体效价在放置12天约为原效价的一半。

实施例4单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测

按常规方法将冻存的实施例2获得的保藏编号为CGMCC No.15787的杂交瘤细胞进行复苏，培养，待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50％以上时即可按照常规方法腹腔接种BALB/c小鼠，定期收集腹水。

将腹水2～8℃、8000r/min离心15分钟，取上清经定性滤纸过滤后，采用0.45μm滤膜过滤，经SPA亲和层析获得纯化单克隆抗体。纯化后采用lowry法检测蛋白质含量，采用12％SDS-PAGE电泳胶对纯化抗体进行电泳，考察纯化抗体的纯度，要求IgG的重链和轻链所占含量应不低于80％。

对纯化后的单克隆抗体采用lowry法检测蛋白质含量分别为3.2mg/ml。对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图1所示。

将FHA原液采用0.01mol/L PBS1:100稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜，检测抗体效价，抗体效价最高达为10⁷，结果见表2。

表2抗体效价检测结果

实施例5抗体特异性检测结果

将PT、PRN原液采用0.01mol/L PBS 1:100稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜，检测实施例3获得的FHA单克隆抗体的效价，均为阴性，结果见表3。

表3间接ELISA法抗体特异性检测结果

本发明的FHA单抗不与PT、PRN原液反应，说明该单克隆抗体能够区分百日咳杆菌的另两种重要组分PT和PRN，由本发明制备的杂交瘤细胞分泌的单抗在检测时可以特异性识别FHA抗原，而不被PT及PRN抗原干扰，具有较好的特异性和应用价值。

实施例6中和抗体检测试验

取百日咳发酵液，生理盐水稀释10倍后以50μl/孔加入血凝板中。抗体先进行50倍稀释，然后进行倍比稀释，共稀释12个梯度，以50μl/孔加入血凝板中。以生理盐水100μl/孔作为阴性对照，设置复孔。将100μl的10倍稀释的发酵液加入血凝板中，设置复孔作为阳性对照。于37℃孵育30min后，加入1％的鸡红细胞，室温下静置30min后观察结果。最后产生红细胞凝集的孔为该抗体的滴度。

本发明的FHA腹水能有效中和FHA抗原而发生中和效应，表明本发明制备的单抗具有良好的中和效果，所述单抗针对的表位是FHA的中和性表位，即抗原决定簇，该表位的存在与检出直接反映疫苗的免疫效果，表明采用所述单抗检测抗原可以反映疫苗的有效性。

实施例7抗体亚类测定

将FHA原液经0.01mol/L PBS 1:100倍稀释后100μl/孔包被酶标板2-8℃过夜，然后采用Southern Biotech鼠单抗分型试剂按照单抗亚类试剂说明书进行试验，最后加入HRP标记的羊抗鼠二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明的单抗为IgG1型。

实施例8免疫印迹(Western blotting)实验

将FHA原液经BIO-RAD电泳电转设备使用12％的SDS-PAGE电泳胶进行电泳，电转到硝酸纤维素膜，以本发明的杂交瘤细胞腹水为一抗(1:4000)，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blotting鉴定。结果显示，本发明制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与FHA蛋白反应，表明所述单抗与变性后的抗原反应，说明本发明提供的杂交瘤细胞分泌的单抗识别抗原的线性结构，或者说是识别FHA的耐变性表位。

实施例9亲和常数测定

将本发明的保藏编号为CGMCC No.15787的杂交瘤细胞株分泌的FHA单抗纯化后检测蛋白质含量，采用1:5、1:10、1:20稀释的不同浓度的FHA抗原横向包被酶标板，100μl/孔，2-8℃包被过夜。第二天洗板后37℃封闭2小时，拍干待用。将纯化抗体2倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度时曲线平坦段的OD值计为100％，计算50％OD值，考察50％OD值所对应点的单抗浓度，再根据亲和常数计算公式可以得到本发明单抗的亲和常数为3.42×10¹¹M^-1。

实施例10抗原含量检测试剂盒的初步结果

本发明的FHA单抗的包被浓度分别为1:2000、1:4000、1:8000，兔多克隆抗体的使用浓度分别为1:4000、1:8000、1:16000，羊抗兔HRP的浓度为1:20000。

表4抗体浓度匹配

由以上结果可以看出以上浓度均可以进行抗原浓度检测，最佳匹配浓度为单抗1:4000，多抗1:8000，羊抗兔HRP浓度为1:20000。

分别按1:2000、1:4000、1:8000包被鼠单抗，兔多抗的使用浓度为1:4000、1:8000、1:16000，羊抗兔HRP的使用浓度为1:20000，检测相同浓度的已知抗原含量20ng/ml，检测结果如下。

表5抗原含量结果

由以上结果可以看出在不同的包被及兔多抗浓度时，检测结果均满足ELISA方法要求，但1:4000包被浓度，1:8000二抗浓度为最佳浓度，在这两个浓度下，抗原结果最接近理论值。

将本发明的FHA单抗采用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜。37℃下于封闭液中封闭2小时，分别加入FHA抗原参比品和3批37℃分别放置60天、90天、180天的FHA原液，于37℃反应1小时，洗板后加入纯化后的1:8000稀释的FHA兔多抗，37℃反应1小时，洗板后加入1:20000稀释的羊抗兔HRP，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，FHA抗原含量的结果见表6。

表6抗原含量检测方法应用

采用本发明建立的抗原含量检测方法检测了3批37℃不同热加速时间的FHA原液，抗原结果变异系数(CV)<10％，蛋白结果变异系数(CV)<8％，均在试验允许的误差范围内，表明本发明的检测方法准确可靠，具有较好的应用效果。SDS-PAGE结果参见图2，FHA抗原含量与SDS-PAGE结果相符。由SDS-PAGE结果可知，经过纯化过程后，非目标条带明显减少，目标抗原的纯度得以提高。

表7 FHA生产过程比活变化

由以上结果可得，经过纯化后，目标蛋白质的比活有了明显提到，由上样时的482增高至1202，样品6为目标峰。同时考察了目标峰的PT抗原去除，PT抗原/蛋白从最初的210降低至7，去除效果明显。

实施例11抗原含量检测试剂盒的特异性研究

将本发明的FHA单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜(12-18小时)。于37℃用封闭液封闭2小时，分别加入脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型疫苗原液、甲肝原液、乙肝原液、白喉类毒素、破伤风类毒素、PT原液、PRN原液，于37℃反应1小时，洗板后加入纯化后的1:8000稀释的PT兔多抗，37℃反应1小时，洗板后加入1:20000稀释的羊抗兔HRP，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，样品抗原含量的测定结果见表8。

表8单克隆抗体的特异性OD值

本发明的FHA单抗与脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型疫苗原液、甲肝原液、乙肝原液、白喉类毒素、破伤风类毒素、PT原液、PRN原液均不反应，表明本发明可以有效区分上述病毒，同时采用本发明建立的体系和培养基不存在交叉反应，可以有效测定出FHA抗原的含量，具有较高的特异性。

实施例12抗原含量检测试剂盒的稳定性研究

本发明的试剂盒中包含的组分有：包被抗体，二级抗体，酶标抗体，酶稀释液，显色液A/B，终止液以及检测用酶标板，所述包被抗体为本发明的单克隆抗体。将本发明的试剂盒置于37℃，时间为7天进行热加速稳定性试验，该试剂盒称为热加速试剂盒。7天后使用热加速试剂盒与2-8℃存放的试剂盒检测相同的FHA抗原，对检测结果进行比较。

表9热加速试验结果

	FHA原液1	FHA原液2	FHA原液3
				热加速试剂盒	120920	124564	114114
2-8℃试剂盒	125864	134123	117410

注：以上单位均为ng/ml

从上表结果可以看出本发明提供的试剂盒在37℃热加速7天后，检测结果与2-8℃试剂盒无明显差异，说明本发明提供的抗原检测试剂盒稳定性较好，而且还间接证明了本发明的FHA单抗的稳定性。

实施例13不同厂家抗原的检测研究

本发明提供的试剂盒中所采用的本发明的FHA单克隆抗体，效价高达10⁷，亲和常数为3.42×10¹¹M^-1，而且经匹配以及浓度调试发现针对不同的抗原原液都具有识别活性，从而能够对不同厂家以及同一厂家不同联合疫苗之间的质量标准进行统一。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京科兴生物制品有限公司

<120> 丝状血凝素检测试剂盒及其应用

<130> RYP1910299.4

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Arg Val Thr Thr Val Ala Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Lys Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 7

ggattcactt tcagtaccta tggc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 8

attagtggtg gtggtagtta cacc 24

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

gcaagacggg ttactacggt agcggagtac tactttgact ac 42

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

cagagcattg tacatagtaa tggaaacacc tat 33

<210> 11

<211> 9

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 11

aaagtttcc 9

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12

tttcaaggtt cacatgttcc gtacacg 27

<210> 13

<211> 133

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu Ser

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Val Thr Thr Val Ala Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro

130

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gly Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

20 25 30

Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Cys Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln

85 90 95

Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe

115 120

<210> 15

<211> 402

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15

ggtgcagctg caggagtcag ggggaggctt agtgaagcct ggagagtccc tgaaactctc 60

ctgtgcagcc tctggattca ctttcagtac ctatggcatg tcttgggttc gccagactcc 120

ggagaagggg ctggagtggg tcgcaaccat tagtggtggt ggtagttaca cctactatcc 180

agacagtgtg aagggtcgat tcaccatctc cagagacaat gccaagaaca ccctgtacct 240

gcaaatgagc agtctgaggt ctgaggacac ggccatgtat tactgtgcaa gacgggttac 300

tacggtagcg gagtactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc 360

agccaaaacg acacccaagc ttgtctatcc actggcccct gg 402

<210> 16

<211> 374

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 16

ggtgatatct tgatgaccca aactccactc tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc 60

tccatctctt gcagatctag tcagagcatt gtacatagta atggaaacac ctatttagaa 120

tggtgcctgc agaaaccagg ccagtctcca aagctcctga tctacaaagt ttccaaccga 180

ctttctgggg tcccagacag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 240

atcagcagag tggaggctga ggatctggga gtttattact gctttcaagg ttcacatgtt 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact 360

ggatccatct tccc 374

Claims

1.针对丝状血凝素的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体具有三个重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3；以及三个轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3，

所述重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及

所述轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链，以及SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链。

3.编码权利要求1或2的针对丝状血凝素的单克隆抗体的核酸分子，其特征在于所述核酸分子的序列具有编码三个重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列；以及编码三个轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列，

所述编码重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO:7,SEQID NO:8和SEQ ID NO:9所示；以及

所述编码轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10,SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子的序列具有SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，以及SEQ ID NO:16所示的多核苷酸序列。

5.用于检测丝状血凝素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被抗体，所述包被抗体为权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4的核酸分子编码的单克隆抗体。

6.用于诊断百日咳的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含包被抗体，所述包被抗体为权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4的核酸分子编码的单克隆抗体。

7.根据权利要求5或6的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

8.根据权利要求7的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经酶标记。

9.根据权利要求8的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。

10.根据权利要求5或6的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含二级抗体，酶标抗体，酶稀释液，显色液A/B，终止液以及检测用酶标板。

11.权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4的核酸分子编码的单克隆抗体在制备用于检测丝状血凝素或诊断百日咳的试剂盒中的应用。

12.权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4的核酸分子编码的单克隆抗体在对含FHA抗原的疫苗进行质量控制中的应用。

13.权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4的核酸分子编码的单克隆抗体在检测百日咳疫苗制备过程中或疫苗成品中FHA抗原的含量中的应用，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。