CN114574448A

CN114574448A - 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN114574448A
Application number: CN202210339643.3A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 殷月兰; 赵梦迪; 孟凡增; 陈祥; 黄金林; 潘志明; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN115112881A; WO2023186189A3; WO2023186189A2; CN114574448B

Abstract

本发明公开了分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2021174。本发明还公开了该杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到ActA单克隆抗体，含有该ActA单克隆抗体的检测试剂盒和免疫磁珠、免疫磁珠的制备方法和应用及竞争ELISA和间接ELISA检测方法。本发明ActA单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体研制的李斯特菌竞争ELISA检测试剂盒及免疫磁珠灵敏度高、稳定性良好，能有效监测临床血清样品中ActA抗体的水平，可用于标记单核细胞增生李斯特菌。

Description

分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性人兽共患致病菌，具有广泛的宿主谱，能引起人和动物的李斯特菌病。该菌感染动物后给养殖场造成严重的经济损失，动物携带的Lm经屠宰加工环节进入食物链，沿着动物产品加工、运输、销售环节到了餐桌，引起人类的感染，死亡率高达30％，严重危害了人类健康。

加强对动物养殖环节李斯特菌病的筛查，能够在感染初始阶段发现并采取相应的防控措施，从而阻止患病家畜进入食品产业链，对公众卫生安全具有重要意义。病原菌分离培养的方法耗时长，不能满足快速检测的需求，且只在动物发病的特定阶段检测出。目前，血清学方法是检测李斯特菌病的重要依据之一，该方法能够利用已知的细菌或者细菌抗原，对体液中有无相应的抗体进行检测，从而实现对传染性疾病的诊断。此外，ActA是Lm重要的毒力因子，位于细胞壁表面且被证实具有较强的免疫原性。选用Lm表面蛋白ActA作为检测抗原，建立竞争ELISA检测方法，实现对李斯特菌病的有效防控意义重大。

传统的细菌分离培养是检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)的金标准，但该技术耗时长，不能满足快速检测需求。基于核酸的病原学检测方法耗时较短，灵敏度较高，但容易受到样品种类、模板和引物等多种因素影响，对仪器设备有较高要求。而基于抗原和抗体的免疫学检测方法较好地弥补了传统检测方法和分子生物学方法的不足，在食源性疾病的检测和控制中应用广泛。其中免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbeads technology，IMBS)以其高特异性及固相化试剂较好的稳定性等优势而被广泛研究。此外，单克隆抗体(ActA)是Lm重要的毒力因子，位于细胞壁表面且被证实具有较强的免疫原性。因此如何快速特异地检出食品中的Lm显得尤为重要。

发明内容

发明目的：本发明的所要解决的技术问题是提供了一株杂交瘤细胞株。

本发明还要解决的技术问题是提供了由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的ActA单克隆抗体。

本发明的还要解决的技术问题是提供了含有ActA单克隆抗体编码的多核苷酸。

本发明的还要解决的技术问题是提供了所述的ActA单克隆抗体、所述的多核苷酸在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。

本发明的还要解决的技术问题是提供了检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于检测单核细胞增生李斯特菌的免疫磁珠及其制备方法和应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了含有该免疫磁珠或免疫磁珠制成的试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌单核细胞增生李斯特菌抗体的杂交瘤细胞株3G11，于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2021174，保藏地址为中国武汉大学，分类命名为：杂交瘤细胞株3G11。

本发明内容还包括ActA单克隆抗体，其由上述的杂交瘤细胞株3G11或其传代细胞株分泌得到。

其中，所述的ActA单克隆抗体包括重链和轻链。

其中，所述轻链包括三个互补决定区，所述轻链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

其中，所述重链包括三个互补决定区，所述重链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

其中，所述轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

其中，所述重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还包括一种多核苷酸，其多核苷酸编码为本发明所述ActA单克隆抗体。

其中，所述多核苷酸中轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

其中，所述多核苷酸中重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明内容还包括所述的ActA单克隆抗体、所述的多核苷酸在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含所述的ActA单克隆抗体或所述的多核苷酸。

其中，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为单核细胞增生李斯特菌阳性血清，所述阴性性对照为单核细胞增生李斯特菌阴性血清。

其中，所述检测试剂盒还包括包被抗原、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和反应终止液。

本发明内容还包括检测单核细胞增生李斯特菌中应用的竞争ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)将检测抗原用包被液稀释，用PBST洗涤，封闭，洗涤；

(2)稀释液稀释后的单核细胞增生李斯特菌阳性和阴性血清加至步骤(1)的抗原中，孵育；

(3)加入稀释液稀释后的HRP标记的针对该菌表面蛋白的抗体，孵育，洗涤；

(4)加入显色液，显色后加入终止液，检测吸光度值，分析结果。

其中，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

其中，所述洗涤使用的洗涤液为pH 7.2的PBST溶液。

其中，所述封闭使用的封闭液为含有2-5％脱脂奶粉的PBS溶液。

其中，所述稀释液为含有1-2％BSA的PBS溶液。

其中，所述终止液为0.5-2mol/L的H₂SO₄溶液。

本发明内容还包括一种荧光标记单核细胞增生李斯特菌的间接ELISA方法，包括以下步骤：

(1)在24孔板内提前加入爬片，将细胞系或原代细胞与Lm菌液按照MOI＝20:1的比例混合均匀，每孔中均加入1mL混合液，37℃孵育7-8h；

(2)洗涤，于(1)中每孔加入400μL封闭液，37℃封闭2-3h；

(3)于(2)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的ActA单抗溶液，孵育，洗涤；

(4)于(3)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的Goat Anti-Mouse IgG(AlexaFlour488)，孵育，洗涤；

(5)于(4)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的鬼笔环肽，孵育，洗涤；

(6)于(5)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的DAPI，孵育，洗涤；

(7)镊子轻取(6)中24孔板内的爬片，并用浓度为50％的甘油封片后，进行激光共聚焦观察。

其中，所述洗涤液为pH 7.2的PBS溶液。

其中，所述封闭液为含有2-5％BSA的PBS溶液。

其中，所述稀释液为含有2-5％BSA的PBS溶液。

其中，步骤(3)中，所述稀释比例为体积比1:100，所述孵育温度为37℃，孵育时间为2-3h。

其中，步骤(4)中，所述稀释比例为体积比1:200，所述孵育温度为37℃，孵育时间为2-3h。

其中，步骤(5)中，所述稀释比例为体积比1:1000，所述孵育温度为37℃，孵育时间为1-2h。

其中，步骤(6)中，所述稀释比例为体积比1:10万，所述孵育温度为37℃，孵育时间为15-30min。

本发明内容还包括一种免疫磁珠，所述免疫磁珠由ActA单克隆抗体与活化后的羧基磁珠共价偶联制得。

本发明所述免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与MEST溶液混合，分离静置，弃上清，重悬于MEST溶液中，洗涤后羧基磁珠重悬于MEST溶液中得到磁珠悬液，向磁珠悬液中加入活化试剂，振荡混匀，得到活化后的羧基磁珠溶液；

(2)抗体的偶联：将ActA单克隆抗体与活化的羧基磁珠溶液混合，用MEST溶液调节总体积，混匀，孵育偶联，即得免疫磁珠。

其中，步骤(1)中，所述MEST溶液为含有0.05％Tween-20的MES溶液，pH为6.0。

其中，所述MES溶液浓度为0.01mol/L，pH为6.0。

其中，步骤(1)中，所述活化试剂为含EDC和NHS的MEST溶液。

其中，步骤(1)中，所述振荡混匀温度为37℃，振荡混匀时间为1h。

其中，步骤(2)中，所述孵育偶联的时间为3-5h。

本发明内容还包括所述的免疫磁珠在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种检测单核细胞增生李斯特菌的试剂盒，所述检测试剂盒包含所述的免疫磁珠。

本发明的ELISA检测过程的机理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

本发明的基于免疫磁珠技术快速捕获并富集Lm，在多个方面具有较高的应用价值。磁珠所包被的免疫活性物质决定了此方法的特异性；磁性颗粒捕获菌体后，既可以通过化学发光等方法直接观测定性结果，也可以与分子检测技术联用；同时，磁珠的可再生性也降低了检测成本。以上特点，决定了此方法可以广泛应用于检测机构、企业等。基于此亦可以进一步开发试剂盒，其成本低且高效的特点，也可以满足基层单位的需要。因此，此方法具有良好的应用前景，并有能力带来可观的经济效益。免疫磁珠法捕获食品中的Lm突破了传统检测技术中所必需的纯培养的富集方法，大大缩短了检测时间。同时，还形成了涵盖生物学和免疫学领域的集成检测体系。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

(1)本发明所提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体建立的李斯特菌病竞争ELISA检测方法及试剂盒，灵敏度高，稳定性良好，与其它病原菌无交叉反应。因此，本发明为单核细胞增生李斯特菌提供了一种灵敏快捷的检测方法，为李斯特菌病防控提供了一种重要的检测手段。

(2)本发明所述的竞争ELISA检测方法可以对单核细胞增生李斯特菌感染的所有阶段进行检测，检测结果可用简单的标准曲线进行解释，这为单核细胞增生李斯特菌的定量提供了依据。竞争ELISA检测方法和其他ELISA检测方法相比，操作时间简短，实验流程更加高效。而且竞争ELISA能够量化抗体的浓度，更有利于低浓度抗体的检测。

(3)本发明所提供的免疫磁珠中包含的单克隆抗体具有特异性好、亲和力高、与天然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体建立的单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠检测方法，稳定性好，与其它病原菌无交叉反应。本发明将Lm的特异性抗体与羧基磁珠进行共价偶联，将特异性抗体包被于磁性颗粒表面以及抗原形成复合物，从而制备免疫磁珠。本发明可以快速、高效的富集Lm，改善了传统前增菌过程的弊端，具有耗时短、操作简便、特异性强等优点，同时在磁场的作用下，可达到富集、分离，用于后续检测的目的，本发明为实现快速检测Lm提供了前提条件，同时为各种病原体的检测提供了新的方法。本发明利用Lm的单克隆抗体制备免疫磁珠，建立了完整的免疫磁捕获体系，最低捕获时间仅为15min，能够实现短时间内对Lm的快速富集，为致病菌的检测提供了一种全新有效的富集方式。同时，实验操作简单，无需专业技术人员。

(4)本发明检测方法特异性强，且针对纯培养物中Lm的检测灵敏度达到10²-10³CFU/mL。该方法能够大大缩短Lm的检测时间，辅以适宜的联合检测方法即可实现对Lm的快速富集，并且具有较高的特异性。

附图说明

图1为ActA单抗的激光共聚焦观察结果图；

图2为竞争ELISA中不同血清稀释度对抑制率和P/N值的影响图；

图3为不同包被温度和时间对抑制率和P/N值的影响图；

图4为不同封闭液对抑制率和P/N值的影响图；

图5为不同封闭时间对抑制率和P/N值的影响图；

图6为酶标抗体的不同孵育时间对抑制率和P/N值的影响图；

图7为不同显色时间对抑制率和P/N值的影响图；

图8为竞争ELISA方法的特异性、敏感性交汇图；

图9为竞争ELISA方法的ROC分析曲线图；

图10为竞争ELISA方法的特异性图；

图11为固相载体在37℃保存不同时间对检测结果的影响图；

图12为酶标抗体在37℃保存不同时间对检测结果的影响图；

图13为各对照血清在37℃保存不同时间对检测结果的影响图；

图14为抗体不同偶联时间对捕获效果的影响图；

图15为抗体不同添加量对捕获效果的影响图；

图16为菌液不同富集时间对捕获效果的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

1、菌株与抗体：

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)均为本实验室保存；抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体为本实验室制备。

2、主要试剂及仪器

羧基化磁珠(PM3-020)购自上海澳润微纳新材料科技有限公司；碳二亚胺(EDC)购自上海源叶生物科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海嘉辰化工有限公司；UVM改良李斯特菌增菌培养基、Fraser基础培养基、脑心浸出液(BHI)培养基、缓冲蛋白胨水购自BD公司；李斯特菌显色培养基购自法国科马嘉公司；多功能磁分离器购自上海澳润微纳新材料科技有限公司。

实施例1：ActA单克隆抗体3G11的获得

1、动物免疫

具体免疫步骤如下：以纯化的His标签的ActA蛋白即rHis-ActA蛋白免疫8周龄雌性BALB/c小鼠。首次免疫时，将rHis-ActA蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比1:1进行混合并充分乳化，腹腔注射，免疫剂量为50μg/只。14天后进行第二次免疫，第二次免疫使用的佐剂为弗氏不完全佐剂，其余步骤与首次免疫完全相同。第二次免疫后7天，采集小鼠血清，并通过间接ELISA检测血清中ActA的抗体效价，选择抗体水平最高的小鼠加强免疫。第二次免疫后14天进行加强免疫，将rHis-ActA蛋白腹腔注射入小鼠体内，免疫剂量为100μg/只。加强免疫后第3天，取小鼠脾脏淋巴细胞用于细胞融合。

其中，rHis-ActA蛋白来源：新鲜培养的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-actA)以1：50接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD值为0.4，加入0.lmM/L的蛋白诱导剂(IPTG)，37℃诱导6h，离心收集菌体，以无菌PBS洗涤、悬浮。在冰浴中利用超声波破碎仪裂解菌体(800W超声10S间隔20S)。离心裂解上清，收集离心后的上清，加入用20mL无菌纯水冲洗的亲和层析柱His-Bind purification kit(购自Novagen公司)中，然后依次加入20mL bindingbuffer，12mLwashing buffer，12mL elute buffer，无菌指形管收集纯化产物rHis-ActA。bindingbuffer、washing buffer、elute buffer均为His-Bindpurification kit自带。

2、细胞融合

具体步骤如下：按生物安全方法处死实施例1中加强免疫后第3天的免疫鼠，用75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW1450)作用下融合，用ICR小鼠(购自扬州大学比较医学中心)腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％CO2培养箱中培养。5天后加入新鲜HAT培养基，10天后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

3、间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆，方阵试验确定检测抗原rGST-ActA的包被缓冲液浓度。检测抗原rGST-ActA包被缓冲液横向梯度稀释，每孔100μL包被酶标板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入300μL含有2％BSA的PBS溶液作为封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清用封闭液以1：100、1：200、1：400、1：800、1：1000、1：2000纵向倍比稀释，每孔100μL，SPF小鼠血清以同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗第3次，加入用封闭液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为工作液每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，每孔加入100μL TMB显色5min；加入50μL的2M H₂SO₄硫酸溶液作为终止液，读取酶标仪OD₄₅₀nm处吸光值，以阴性血清OD₄₅₀数值最大，阳性血清OD₄₅₀在1.0左右为最佳判定条件。

其中，rGST-ActA来源：新鲜培养的重组大肠杆菌BL21(pGEX-6p-1-actA)以1：50接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD值为0.4，加入0.2mM/L IPTG，30℃诱导5h，离心收集菌体，以无菌PBS洗涤、悬浮。在冰浴中利用超声波破碎仪裂解菌体(800W超声10S间隔20S)。离心裂解上清，将离心后收集的裂解上清加入预先用10mL预冷PBS冲洗的Sepharose 4B柱中，待裂解上清流尽后，加入预冷PBS平衡柱床，再加入2ml洗脱液，灭菌指形管收集纯化产物rGST-ActA。(参照Redipack GST purification moduce步骤，购自Amersham Bioscience公司)。

4、筛选阳性克隆

采用建好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清液加入预先包被好的酶标板中，100μL/孔，以SP2/0细胞上清液作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入用封闭液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体的工作液，100μL/孔，37℃水浴1h；洗涤后，TMB显色5min，读取酶标仪OD₄₅₀处数值。被测孔OD₄₅₀nm读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的1株阳性克隆命名为阳性细胞克隆3G11，该阳性细胞克隆3G11于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:C2021174，保藏地址为中国武汉大学，分类命名为：杂交瘤细胞株3G11。

5、阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆3G11进行连续3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆3G11对应保藏号为C2021174的杂交瘤细胞株。

实施例2：单核细胞增生李斯特菌ActA单抗的制备

1、腹水的制备

制备腹水时选用10周龄左右的BALB/c雌鼠。以液体石蜡作为诱导剂腹腔注射到小鼠体内，500μL/只。一周以后，每只小鼠注射5×10⁵个杂交瘤细胞。待到小鼠腹部明显膨大即可采集腹水。将收集的腹水室温离心去除沉淀，收集上清，置于-70℃保存。保藏号为C2021174的杂交瘤细胞株或其传代细胞株(对应杂交瘤细胞3G11)分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体3G11。

2、腹水效价的测定

在包被有检测抗原rGST-ActA的酶标板中加入用封闭液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的倍比稀释的3G11单抗腹水，每孔100μL；以同样倍比稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入用封闭液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体的工作液，每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，加入TMB显色，终止后读取OD₄₅₀nm处吸光度值并分析实验结果。以P/N值≥2.1为判定标准，分析单克隆抗体腹水效价。结果显示，单克隆抗体3G11的腹水效价达到1×10⁵。

3、单抗的纯化和标记

将制备的单克隆抗体3G11腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化，将纯化后的3G11单抗进行辣根过氧化物酶标记(此步在南京金斯瑞公司完成)。

4、Lm单克隆抗体测序

经鉴定，结果表明单克隆抗体3G11轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：RSSQSLVHSNGNTYLH。

轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ I D NO.2所示，具体为：RVSNRFS。

轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ I D NO.3所示，具体为：SQSTHVPYT。

重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：NYWIG。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：DIYPGTGYTNYNEKFKG。

重链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：DLDY。

轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGNQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK。

编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAAATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。

重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

MEWSGVFIFLLSVTAGVHSQVQLQQSGADLVRPGTSVKMSCKAAGYTFTNYWIGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGTGYTNYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCARDLDYWGQGTSVTVSS。

编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

ATGGAATGGAGCGGGGTCTTTATCTTTCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGACCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTGCGGGATACACCTTCACTAACTACTGGATAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGAACTGGTTATACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGACTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。

实施例3：ActA单抗与单核细胞增生李斯特菌表面蛋白ActA特异性结合

1、基于ActA单抗标记李斯特菌的激光共聚焦观察

(1)利用激光共聚焦试验，进一步测定ActA单抗与Lm表面ActA抗原的结合能力。具体步骤如下：在24孔板内提前加入爬片，将Caco-2细胞与Lm菌液按照MOI＝20:1的比例混合均匀得到混合液，每孔均加入1mL混合液，37℃孵育7-8h后，用10mM的PBS溶液(pH为7.2)洗涤2次；

(2)在步骤(1)中每孔加入400μL 4％多聚甲醛固定20min；用PBS洗涤2次后，每孔加入400μL 0.5％tritox-100溶液，置于37℃水浴条件下透化20min；用10mM PBS溶液(pH为7.2)洗涤3次；

(3)于步骤(2)中每孔加入400μL含有含2-5％BSA的PBS溶液，于37℃封闭2-3h；

(4)向步骤(3)中每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:100的比例稀释的ActA单抗溶液，于37℃孵育2-3h后，用10mM PBS溶液(pH为7.2)洗涤5次；

(5)向步骤(4)中每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:200的比例稀释的Goat Anti-Mouse IgG(Alexa Flour 488)溶液，于37℃孵育2-3h，用10mM PBS溶液(pH为7.2)洗涤5次；

(6)向步骤(5)中每孔中加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:1000的比例稀释的鬼笔环肽溶液，于37℃孵育1-2h后，用10mM PBS溶液(pH为7.2)洗涤5次；

(7)向步骤(6)每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:10万的比例稀释的DAPI溶液，于37℃孵育15-30min后，用10mM PBS溶液(pH为7.2)洗涤5次；

(8)用镊子轻轻将步骤(7)中24孔板内的爬片取出，并用50％的甘油封片，之后进行激光共聚焦观察，结果如图1所示。

图1为ActA单抗的激光共聚焦观察结果图，由图1可知，Lm进入宿主细胞，逃离宿主自噬，同时利用宿主肌动蛋白的聚集，形成哈雷彗星尾，从而利于它在胞内运动以及细胞与细胞间的扩散传播，这种聚集宿主肌动蛋白的过程需要李斯特菌表面抗原ActA的参与。本试验利用ActA单克隆抗体和羊抗鼠Alexa Fluor 488等对ActA进行可视化观察，发现肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽染成红色，细胞核在固定和透化后被DAPI染成蓝色，结果清晰且明显，表明ActA单抗与胞内李斯特菌表达在细胞壁表面的ActA抗原的结合能力较强。

实施例4：ActA单抗竞争ELISA方法的建立

1、包被抗原和酶标抗体工作浓度的确定

采用方阵滴定法，用包被液(pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将检测抗原rHis-ActA稀释至终浓度分别为3.0、2.0、1.0μg/mL，每孔加入100μL，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.2的PBST溶液)洗涤3次，每次5min；每孔加入300μL含有2％BSA的PBS溶液，于37℃封闭3h；用洗涤液洗涤3次，每次5min；血清样品按照1:10用含有2％BSA的PBS溶液进行稀释，酶标抗体辣根过氧化物酶标记的单抗HRP-ActA分别按照1:16000、1:20000、1:24000、1:28000、1:32000用含有2％BSA的PBS溶液进行稀释，将稀释好的血清样品和酶标抗体同时加入酶标板中，每孔各50μL，置于摇床上室温混匀5min，随后于37℃孵育2h。用洗涤液洗涤7次，每次5min；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色5min，并向每孔加入50μL的反应终止液(2mol/L的H₂SO₄溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值(OD_450nm)，同时设置空白对照(酶标孔里面只有检测抗原和酶标抗体，不加血清)。血清抑制率(PI)的计算公式为：抑制率＝(1-检测血清OD₄₅₀/空白对照OD₄₅₀)×100％。选择P(阳性对照抑制率)/N(阴性对照抑制率)值较大，抗原和酶标抗体用量较少，阴性抑制率较低时的抗原浓度和酶标抗体稀释度作为最佳工作浓度。比较各组阴性及阳性血清抑制率和P/N值，确定最佳包被抗原浓度为2.0μg/mL，酶标抗体最佳稀释度为1:32000。

2、血清稀释倍数的确定

按照最佳抗原浓度2.0μg/mL包被酶标板，4℃过夜且用pH 7.2的PBST溶液洗涤后，每孔加入300μL封闭液(含有2％BSA的PBS溶液)于37℃封闭3h；洗涤后，将按1:8、1:10、1:12、1:16、1:20倍比稀释的血清样品和最适浓度1:32000的酶标抗体HRP-ActA1:1混合，每孔100μL，作两个重复孔，37℃孵育2h；洗涤后加入TMB显色液，于37℃避光显色3min后加入终止液2M的H2SO4溶液。读取OD450nm，计算和比较P/N值并观察阴性对照和阳性对照抑制率的变化趋势，选择合适的血清稀释度，结果如图2所示，图2为竞争ELISA中不同血清稀释度对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照。由图2可知，血清1:10稀释时，P/N值最大，为保证该方法的检测灵敏度，选择血清的最佳稀释度为1:10。

3、包被条件的确定

在上述最适条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10)的基础上，实验过程同步骤2，分别设置3组包被条件：组1为4℃12h、组2为4℃16h、组3为4℃20h，其余操作不变。比较各组PI及P/N值，选择时间成本较少、P/N值较大的包被条件作为最适包被条件，结果如图3所示。图3为不同包被温度和时间对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，由图3可知，4℃包被16h，阴性PI较低，时间成本较少，因此将4℃包被16h作为最佳包被条件。

4、封闭液的确定

在上述最适条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10、包被条件为4℃16h)的基础上，实验过程同步骤2，分别设置2％的BSA、5％的BSA、2％的脱脂奶、5％的脱脂奶作为封闭液，其余操作不变。比较各条件下的PI值及P/N值，选择P/N值最大条件下的封闭液作为最适封闭液，结果如图4所示。图4为不同封闭液对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，由图4可知，当以2％的脱脂奶作为封闭液时，阳性PI最高、阴性PI最低，P/N值最大，因此将2％脱脂奶作为最佳封闭液。

5、封闭时间的确定

在上述最适条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10、包被条件为4℃16h、封闭液为含有2％脱脂奶的PBS)的基础上，实验过程同步骤2，设置不同的封闭时间2h、2.5h、3h和3.5h，其余操作不变。分别计算各个时间点的PI值及P/N值，选择P/N值最大的时间点作为最适封闭时间，结果如图5所示。图5为不同封闭时间对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，由图5可知，2％脱脂奶封闭3h，P/N值最大，因此将封闭3h作为最佳封闭时间。

6、酶标抗体孵育时间的确定

基于上述实验确定的最适条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10、包被条件为4℃16h、封闭液为含有2％脱脂奶的PBS、封闭时间为3h)，实验过程同步骤2，设置不同的酶标抗体孵育时间0.5h、1.0h、1.5h、2.0h，其余操作不变。分别计算不同时间点的PI值及P/N值，选择P/N值最大的时间点作为酶标抗体最适孵育时间，结果如图6所示。图6为酶标抗体的不同孵育时间对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照。由图6可知，当在37℃孵育1.0、1.5、2.0h时P/N值无显著性差异，因此选择孵育时间更短的1.0h作为最佳孵育时间。

7、显色时间的确定

在上述确定的最佳条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10、包被条件为4℃16h、封闭液为含有2％脱脂奶的PBS、酶标抗体孵育时间为1h)的基础上，实验过程同步骤2，分别设置不同的显色时间(5min、7min、9min)，其余操作不变。对不同显色时间下的PI值及P/N值进行计算，选择P/N值最大的时间点作为底物最适作用时间，结果如图7所示。图7为不同显色时间对抑制率和P/N值的影响图，其中，Positivecontrol为阳性对照，Negative为阴性对照，由图7可知，当在37℃孵育3min时P/N值最高，且空白对照OD450nm值接近1.0，因此选择显色时间3min作为最佳显色时间。

实施例5：ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒阈值的确定

ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒的组成：抗原包被板1块、阳性对照血清1:10 800μL、阴性对照血清1:10 800μL、酶标抗体1:640 450μL、抗体稀释液(1x)30mL、PBST洗液(20×)60mL、底物显色液(TMB单组分显色液)22mL、终止液0.5-2mol/L的H₂SO₄ 12mL、说明书1份。

按照上述实验确定的竞争ELISA反应条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:32000、血清稀释倍数1:10、包被条件为4℃16h、封闭液为含有2％脱脂奶的PBS、显色时间为3min)，实验过程同步骤2，对23份阳性羊血清和35份阴性羊血清(羊血清来源江苏省某羊养殖场)进表1部分血清样品尤登指数分析，计算每份羊血清的PI值。利用SPSSStatistics 17.0软件对数据进行分析，绘制出敏感度和特异性交汇图，如图8所示。并进一步绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，以尤登指数(尤登指数＝敏感性+特异性-1)最大时的数值作为竞争ELISA的Cut off值，如图9所示。图8为竞争ELISA方法的特异性、敏感性交汇图，由图8可知，敏感性和特异性随抑制率的变化趋势。特异性随抑制率呈现先上升后下降的趋势，在抑制率为0.275(即27.5％)时，达到最大。敏感性始终可达到100％，另外表明，两条曲线的点为本方法阈值，即0.275(27.5％)。图9为竞争ELISA方法的ROC分析曲线图，其中，ROC curve为ROC曲线，Area为去线下面积，P valuef1/4为P值，Cut off valuef为阈值，Sensitivity为敏感性，Sepcificity为特异性；对角线为参考线。对ROC曲线下面积进行检验，结果表明曲线下面积为1.000，P<0.0001，统计学上存在极显著差异。并结合尤登指数(Youden’s index)即表1，选择Youden’s index最大时抑制率作为该方法的阈值。当尤登指数最大时，竞争ELISA的最佳临界值为27.5％，此时敏感性和特异性均为100％。这表明当样品的抑制率大于27.5％时，判定为阳性，反之则为阴性。

表1 部分羊血清样品尤登指数分析结果

Cut-off	DSn	1-DSp	Youden Index
				13.5％	0.714	0	0.714
14.5％	0.771	0	0.771
				15.5％	0.8	0	0.8
16.5％	0.886	0	0.886
				18.5％	0.914	0	0.914
20.5％	0.943	0	0.943
				27.5％	1	0	1
34.0％	1	0.043	0.957
				37.0％	1	0.087	0.913
40.0％	1	0.13	0.87
				42.0％	1	0.174	0.826
45.0％	1	0.217	0.783

实施例6：ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒的特异性试验

按照实施例5建立的竞争ELISA方法，分别对大肠杆菌(E.coli)、肠炎沙门菌(S.Enteritidis)、鸡白痢沙门菌(S.Pullorum)、鸡伤寒沙门菌(S.Gallinarum)、空肠弯曲菌(C.jejunni)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)共7种常见病原菌的阳性血清进行检测，同时设立阳性血清(Neggetive control)及阴性血清(Positive control)对照。计算各血清样品的PI值并与该方法的Cut off进行比较，判断是否存在交叉反应，结果如图10所示。图10为竞争ELISA方法的特异性图，由图10可知，该竞争ELISA检测试剂盒特异性良好，与其它常见病原菌的阳性血清无交叉反应。

实施例7：ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒的重复性试验

1、批内重复性试验

对于批内重复性实验，按照实施例5建立的竞争ELISA方法，使用同一批次抗原包被的酶标板，连续三天分别对7份阳性羊血清、1份阴性羊血清(羊血清来源江苏省某羊养殖场)样本进行检测，统计实验数据并分析三次实验中各样品的变异系数(CV)。结果如表2所示，该竞争ELISA方法的批内变异系数在2.55％-6.80％之间。

表2 竞争ELISA批内重复性试验结果

注：P：阳性样本；N：阴性样本

2、批间重复性试验

对于批间重复性实验，按照实施例5建立的竞争ELISA方法，分别制备三个批次的抗原rHis-ActA，用包被有不同批次抗原的酶标板，对10份阳性羊血清和2份阴性羊血清样品进行检测，统计实验数据并分析CV值。结果如表3所示。该竞争ELISA方法的批间变异系数在1.22％-14.44％之间低于15％。上述结果表明，该竞争ELISA检测试剂盒变异程度较小，具有良好的批间重复性。

表3 竞争ELISA批间重复性试验结果

注：P：阳性样本；N：阴性样本

3、不同操作者的重复性试验

分别由操作者A、操作者B、操作者C三位不同的操作者，按照实施例5建立的竞争ELISA方法，使用建立好的竞争ELISA方法检测14份阳性羊血清和10份阴性羊血清样本，统计实验数据并分析CV值。结果如表4所示，该竞争ELISA方法不同操作者间的变异系数在1.0％-9.7％之间。由此可知：该竞争ELISA检测试剂盒变异程度较小，具有良好的重复性。

表4 竞争ELISA不同操作者重复性试验结果

样品	操作者A	操作者B	操作者C	M	SD	CV
							P1	0.177	0.2	0.215	0.197	0.016	7.9％
P2	0.225	0.247	0.261	0.244	0.015	6.1％
							P3	0.356	0.356	0.414	0.375	0.027	7.3％
P4	0.249	0.292	0.294	0.278	0.021	7.5％
							P5	0.257	0.282	0.316	0.285	0.024	8.5％
P6	0.274	0.294	0.264	0.277	0.012	4.5％
							P7	0.321	0.382	0.388	0.364	0.030	8.3％
P8	0.237	0.269	0.301	0.269	0.026	9.7％
							P9	0.172	0.203	0.206	0.194	0.015	7.9％
P10	0.214	0.208	0.218	0.213	0.004	1.9％
							P11	0.074	0.077	0.086	0.079	0.005	6.5％
P12	0.062	0.062	0.069	0.064	0.003	5.1％
							P13	0.073	0.077	0.081	0.077	0.003	4.2％
P14	0.075	0.08	0.081	0.079	0.003	3.3％
							N1	0.743	0.736	0.767	0.749	0.013	1.8％
N2	0.666	0.646	0.654	0.655	0.008	1.3％
							N3	0.724	0.701	0.77	0.732	0.029	3.9％
N4	0.776	0.73	0.725	0.744	0.023	3.1％
							N5	0.821	0.774	0.81	0.802	0.020	2.5％
N6	0.763	0.706	0.789	0.753	0.035	4.6％
							N7	0.747	0.73	0.742	0.740	0.007	1.0％
N8	0.737	0.712	0.729	0.726	0.010	1.4％
							N9	0.726	0.717	0.802	0.748	0.038	5.1％
N10	0.619	0.616	0.587	0.607	0.014	2.4％
							空白	0.934	0.873	1.05	0.952	0.073	7.7％

注：P：阳性样本；N：阴性样本

实施例8：ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒的热稳定性试验

1、包被有抗原的固相载体的热稳定性试验结果

按照实施例5建立的竞争ELISA方法，将包被有检测抗原的酶标板放置在37℃，分别在第1、2、3、5、7、10、15、20和25天对酶标板进行检测。检测结果如图11所示，图11为固相载体在37℃保存不同时间对检测结果的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，Blank control为空白对照，由图11可知，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于10％。表明包被有检测抗原的固相载体具有良好的热稳定性。

2、酶标抗体的热稳定性试验结果

按照实施例5建立的竞争ELISA方法，使用Candor公司的HRP-ProtectorTM对酶标抗体进行稀释，稀释比为50:1。将稀释好的酶标抗体放入37℃进行加速破坏。在第1、3、5、7、10、15、20和25天对酶标抗体进行检测。检测结果如图12所示，图12为酶标抗体在37℃保存不同时间对检测结果的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，Blank control为空白对照，由图12可知，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于5％。由此可知：酶标抗体具有较好的热稳定性。

3、阴性对照及阳性对照热稳定性试验结果

按照实施例5建立的竞争ELISA方法，使用1％BSA-PBS溶液和Candor公司的酶标抗体保护剂HRP-ProtectorTM对阴性羊血清和阳性羊血清进行稀释，三者的稀释比为：17:1:2。将稀释好的阴阳性血清放入37℃进行加速破坏。在第1、3、5、7、10、15、20、25天对阴阳性血清进行检测。检测结果如图13所示，图13为各对照血清在37℃保存不同时间对检测结果的影响图，其中，Positive control为阳性对照，Negative为阴性对照，Blank control为空白对照，由图13可知，阴性对照、阳性对照和空白对照的变异系数均小于5％。由此可知：阴性对照及阳性对照具有较好的热稳定性。

实施例9：ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒应用测试之一

采用本发明所述的竞争ELISA检测试剂盒，对采集自国内羊养殖场共计928份羊血清样品进行检测。结果显示共有205份羊血清样品中抗体呈阳性，723份羊血清抗体水平为阴性，ActA抗体阳性率达22.10％。提示该羊养殖场中单核细胞增生李斯特菌感染阳性率较高，应做好防控工作。

实施例10：李斯特菌病竞争ELISA检测试剂盒应用测试之二

采用本发明所述的竞争ELISA检测试剂盒，对采集自国内江苏省份共计306份人血清样品(来源于江苏某疾控中心)进行检测。结果显示306份血清样品中ActA抗体水平均为阴性。

实施例11 ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒的符合性试验

采用本发明所述的竞争ELISA检测试剂盒，对共47份羊血清样本进行检测，其中，有25份阳性，22份阴性。检测结果如表5所示，共有45份样本检测结果一致，总体符合率为95.7％。

表5 竞争ELISA检测试剂盒符合性结果

实施例12：免疫磁珠的制备

首先取200μL羧基化磁珠加入浓度为0.01mol/L，pH为6.0的一水吗啉乙磺酸吐温(MEST)溶液500μL洗涤3次，置于磁分离器中弃上清。重悬于MEST溶液中得到磁珠悬液，向磁珠悬液中缓慢加入活化试剂(每毫升中含碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各5mg的MEST溶液，即5mg/mL)，37℃振荡混匀1h，得到活化后的羧基磁珠。然后将实施例2中的ActA单克隆抗体3G11与活化的羧基磁珠混合，并用MEST偶联缓冲液调节总体积至500μL，置于混匀仪上振荡混匀，37℃孵育4h，即得免疫磁珠。加入1mL磷酸盐吐温(PBST(pH为7.4，2％BSA)缓冲液，37℃封闭2h。最后磁分离弃上清，PBST洗涤3次后，重悬于PBST(pH为7.4，0.02％NaN3，0.5％BSA)保存液中，4℃保存。

实施例13：抗体偶联时间的优化

分别取等量实施例12得到的活化后的羧基磁珠200μL，加入100μg ActA单克隆抗体3G11，并用MEST偶联缓冲液调节总体积至500μL，37℃条件下分别反应3h、4h、5h，每组设定3个平行，共得到9组免疫磁珠。分别将9组免疫磁珠加入到10³CFU/mL的Lm菌液(浓度为10³CFU/mL，体积为1mL)中，37℃孵育1h。用无菌PBS溶液洗涤3次，离心管置于磁力架上进行磁分离，弃上清，免疫磁珠重悬于100μL无菌PBS溶液，涂布BHI平板中，依据平板计数法所得结果计算免疫磁珠捕获效率，确定最佳抗体偶联时间，磁珠捕获效率(captureefficiency，CE)按照公式(1)计算：

CE(％)＝(1-C_u/C₀)×100 (1)

式中：C₀为捕菌前菌落数，Cu为捕菌后上清液中的菌落数。

结果如图14所示，图14为抗体不同偶联时间对捕获效果的影响图，其中Colonycount为捕菌数，Capture rate为捕获效率。由图14可知，随着ActA单克隆抗体3G11的偶联时间由3h向4h延长，免疫磁珠捕菌数及其捕获效率呈现上升趋势；在4h时，免疫磁珠捕菌数及其捕获效率达到最高峰；ActA单克隆抗体3G11的偶联时间多于4h后，捕菌数及其捕获效率逐渐下降。综合考虑抗体的生物活性及时间成本，故选择4h作为ActA单克隆抗体3G11的最适抗体偶联时间。

实施例14：抗体偶联用量的优化

分别取实施例12中等量活化后的羧基磁珠200μL，分别加入50μg、100μg、150μg、200μg的ActA单克隆抗体3G11，并用MEST偶联缓冲液调节总体积至500μL，37℃孵育4h，每组设定3个平行，共得到12组免疫磁珠。分别用12组将免疫磁珠加入到10³CFU/mL的Lm菌液(浓度为10³CFU/mL，体积为1mL)中，37℃孵育1h。用无菌PBS溶液洗涤3次，离心管置于磁力架上进行磁分离，移除上清，免疫磁珠重悬于100μL无菌PBS溶液，涂布BHI平板中，依据平板计数法所得结果计算免疫磁珠捕获效率，确定最佳抗体偶联量，计算同公式(1)。

结果如图15所示，图15为抗体不同添加量对捕获效果的影响图，其中Colonycount为捕菌数，Capture rate为捕获效率。由图15可知，当加入的ActA单克隆抗体3G11的量在50-100μg时，随着ActA单克隆抗体3G11的加入量的增加免疫磁珠捕菌数及其捕获效率增大；随着ActA单克隆抗体3G11的加入量由100-200μg的增大，捕菌数及其捕获效率逐渐下降。为保证在不过度消耗抗体的前提下，实现抗体与目标抗原之间最大程度的免疫反应，故选择100μg为最适ActA单克隆抗体3G11的抗体偶联量。

实施例15：菌液富集时间的优化

将Lm菌液稀释至10³CFU/mL后(浓度为10³CFU/mL，体积为1mL)，加入等量实施例12得到的免疫磁珠200μL，37℃分别孵育15min、30min、60min、90min，每组设定3个平行，共得到12组捕获实验样品。无菌PBS溶液洗涤3次，离心管置于磁力架上进行磁分离，移除上清，免疫磁珠重悬于100μL无菌PBS溶液，涂布BHI平板中，依据平板计数法所得结果计算免疫磁珠捕获效率，确定最佳菌液富集时间，计算同公式(1)。

结果如图16所示，图16为菌液不同富集时间对捕获效果的影响图，其中Colonycount为捕菌数，Capture rate为捕获效率。由图16可知，免疫捕获时间在15min时，免疫磁珠对Lm的捕获效率相对最高。15min-90min之间捕获效率缓慢下降并趋于平缓。另外本研究致力于开发快速高效的检测方法，故选择15min作为免疫磁珠与菌液最佳富集时间。

实施例16：免疫磁珠分离Lm的特异性试验

将实施例12得到的免疫磁珠200μL加入到Lm菌液、金黄色葡萄球菌液、鼠伤寒沙门菌液、大肠杆菌液、副溶血弧菌液的混合菌液中，上述菌液浓度均为10³CFU/mL，体积各为0.2mL，混合菌液共1mL。37℃振荡孵育15min后弃上清，无菌PBS溶液洗涤3次，用100μL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠并涂布李斯特菌显色培养基，37℃培养18-24h，观察平板上菌落生长状况，结果如表6所示。

表6 免疫磁珠特异性试验分析(Table 6 Specificity of immunomagneticbeads)

注：+：免疫磁珠分离后在显色培养基上有菌落生长(Positive reaction)；

-：免疫磁珠分离后在显色培养基上无菌落生长(Negative reaction)。

由表6可知，将最优条件下制备的免疫磁珠加入到上述五种不同属的菌株混合液中进行培养，只有Lm在李斯特菌显色培养基中生长，其他属细菌不生长。由此表明，免疫磁珠只捕获Lm，该方法针对Lm具有较高的特异性。

实施例17：免疫磁珠分离Lm的敏感性试验

将Lm菌液分别稀释至1×10⁵CFU/mL、1×10⁴CFU/mL、1×10³CFU/mL、1×10²CFU/mL和1×10¹CFU/mL，各取1mL于1.5mL离心管。每只离心管均加入等量实施例12得到的免疫磁珠200μL，37℃振荡孵育15min后弃上清，无菌PBS溶液洗涤3次，用100μL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠并涂布李斯特菌显色培养基，37℃培养18-24h，观察平板上菌落生长状况，采用IMBS-李斯特菌显色培养基联合检测10¹-10⁵CFU/mL浓度范围下的Lm，结果如表7所示。

表7 免疫磁珠灵敏度试验分析(Table 7 Sensitivity of immunomagneticbeads)

注：+：免疫磁珠分离后在李斯特菌显色培养基上有Lm生长(Positive reaction)；

-：免疫磁珠分离后在李斯特菌显色培养基上无Lm生长(Negative reaction)。

由表7可知，本发明的检测方法对浓度≥10³CFU/mL的Lm可以检出；浓度<10²CFU/mL的Lm无法准确检出。表明在液相中本发明的检测方法对Lm的检测限为10²-10³CFU/mL。

实施例18：免疫磁珠捕获实际样本中的Lm

用建立的免疫磁珠方法检测20份市售鸡肉样品：每份样品均加入25mL无菌PBS溶液充分洗涤，取12.5mL的洗涤液直接用于实施例12得到的免疫磁珠富集。磁分离后，无菌PBS溶液洗涤3次，用100μL的无菌PBS溶液吹打重悬免疫磁珠并涂布显色培养基，37℃培养18-24h，观察平板上菌落生长状况，并与传统微生物培养法的实验结果相比较(将另外12.5mL的PBS洗涤液加入到BPW中，按照传统微生物培养法进行Lm的分离和鉴定)，按照本方法与传统微生物培养法两种方法共阳性加上两种方法共阴性的份数除以总份数，再乘以100％计算符合率得出结果，以评价该方法的实际应用价值，结果如表8所示。

表8 免疫磁珠与传统微生物培养法的符合率试验(Table 8 Test results ofcoincidence rate between immunomagnetic bead and traditional microbialculture method)

由表8可知，上述20份待测肌肉样品经免疫磁珠方法检测，显示7份样品为阳性，13份样品为阴性，免疫磁珠方法样品阳性率为35.0％。传统微生物培养法检测结果8份为阳性，12份为阴性，其阳性检出率为40.0％。免疫磁珠与传统微生物培养法检测结果符合率达95.0％，表明免疫磁珠方法吻合性良好，适用于临床检测的需要。

本发明的基于免疫磁珠(IMBS)技术联合李斯特菌显色培养基，选取针对Lm表面蛋白ActA的特异性单克隆抗体3G11，偶联于羧基化磁珠表面，通过与样品中李斯特菌的ActA抗原特异性结合，达到富集李斯特菌的目的。相较于常规的Lm检测技术，上述实施例检测Lm具有特异性、高效性和稳定性，ActA单克隆抗体3G11可特异性偶联羧基化磁珠，无需进行预增菌即可直接锚定目标抗原，减少假阳性现象，提高结果的准确性。本发明充分结合二者的优点，利用IMBS技术的高富集特性，分离样品中的Lm，再结合李斯特菌显色培养基鉴定，针对性强，可在20h左右将其检出，相较于传统国标法检测Lm，整个过程可节省40h以上，满足本发明致力于开发快速检测Lm的目的。另外，该方法操作简单，无需大型仪器和特殊培训的专业操作人员，适宜在基层大范围推广应用并且有望成为卫生防疫及卫生监督部门的技术支撑。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Leu Asp Tyr

1

<210> 7

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asn Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 8

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial sequence)

<400> 8

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggaaatca agcctccatc 120

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180

ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca gagtttccaa ccgattttct 240

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393

<210> 9

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 10

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gtccagctgc agcagtctgg agctgacctg gtaaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctg cgggatacac cttcactaac tactggatag gttgggtaaa gcagaggcct 180

ggacatggcc ttgagtggat tggagatatt tatcctggaa ctggttatac taactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacacat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gccatctatt actgtgcaag agacttggac 360

tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 396

Claims

1.一株分泌单核细胞增生李斯特菌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G11，其特征在于，所述杂交瘤细胞株3G11于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2021174。

2.ActA单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的杂交瘤细胞株3G11或其传代细胞株分泌得到。

3.根据权利要求2所述的ActA单克隆抗体，其特征在于，所述ActA单克隆抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，所述轻链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述重链包括三个互补决定区，所述重链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求3所述的ActA单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码如权利要求2-4任一项所述ActA单克隆抗体，所述多核苷酸中轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述多核苷酸中重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

6.权利要求2～4任一项所述的ActA单克隆抗体、权利要求5所述的多核苷酸在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。

7.一种检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求2～4任一项所述的ActA单克隆抗体或权利要求5所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标抗体，所述酶标抗体为不限于辣根过氧化物酶标记的单核细胞增生李斯特菌ActA单克隆抗体。

9.根据权利要求7所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被抗原、单核细胞增生李斯特菌阳性血清/阴性血清、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、底物液或反应终止液中的一种或多种。

10.一种用于鉴定单核细胞增生李斯特菌的间接ELISA方法，其特征在于，权利要求2～4任一项所述的ActA单克隆抗体与单核细胞增生李斯特菌孵育后，加入荧光标记的抗鼠的抗体，标记李斯特菌。