CN117003880A - 抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117003880A CN117003880A CN202310818854.XA CN202310818854A CN117003880A CN 117003880 A CN117003880 A CN 117003880A CN 202310818854 A CN202310818854 A CN 202310818854A CN 117003880 A CN117003880 A CN 117003880A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- fitc
- antibody
- amino acid
- sequence shown
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 19
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 12
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 12
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 3
- -1 microtiter plate Substances 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical group COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 4
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 108010006205 fluorescein isothiocyanate bovine serum albumin Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本发明涉及一种新的单克隆抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体、包括该抗体的试剂盒、及其相关应用。本发明的抗FITC抗体表现出针对FITC的高灵敏度和高特异性，能够用于FITC检测，并且可以作为通用指示试剂，通过FITC与其他免疫化学试剂桥联。FITC‑抗FITC抗体系统与生物素‑链霉亲和素系统具有相似的敏感性和稳定性，可以用于放大免疫检测信号，进而用于免疫检测如磁微粒分离酶联免疫检测、ELISA检测、免疫印迹检测、或流式检测等。
Description
本申请要求申请日为2022年7月6日、申请号为202210799318.5、发明名称为“单克隆抗硫氰酸荧光素抗体及其应用”的中国发明专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，并具体地涉及一种抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体、包括该抗体的试剂盒及相关应用。
背景技术
异硫氰酸荧光素(FITC,Fluorescein Isothiocyanate)是一种荧光染料，能够吸收紫外光或蓝光，使得分子被激发后发出黄绿色光。一旦移除引起分子激发的紫外线或蓝光，黄绿色发光则会立刻停止。FITC的异硫氰酸基团可以与蛋白质的氨基末端或者伯胺反应，因而能够与蛋白质发生偶联，被广泛地用于抗体的标记。
FITC与抗体偶联后不丧失其抗原结合特异性，FITC偶联的抗体与待测抗原反应形成抗原-抗体复合物，该复合物上带有FITC标记，通过对FITC发光的检测，则可以快速、准确的检测出待测抗原。FITC也易与抗原结合，标记率高，FITC偶联的抗原也同理地可与待测抗体反应，形成抗原-抗体复合物，从而实现对抗体的检测。
目前现有的FITC抗体在灵敏度、特异性方面上都存在不足，还有较大的改善空间。因此，本领域仍需要一种具有高的特异性和灵敏度FITC抗体。
发明内容
如前所述，本领域需要一种具有高的特异性和灵敏度抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体。
本发明人通过以FITC作为半抗原，与大分子载体蛋白偶联后诱导动物产生免疫应答，再利用杂交瘤技术获得既能无限增殖又能分泌抗FITC单抗的杂交瘤细胞株(分别命名为Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5，其中Y8D7-6E5于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45186)，最后通过体外转瓶培养的方法收取上清，获得大量的抗FITC单克隆抗体，经筛选得到具有高灵敏度和高特异性的抗FITC抗体。本发明的抗FITC抗体不仅能够用于FITC检测，而且可以作为通用指示试剂，将FITC与其他免疫化学试剂桥联。由此，实现了本发明。
在第一方面，本发明提供了一种抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中，SEQ ID NO:1所示序列为GFTFX1X2F，SEQ ID NO:2所示序列为SSDSRT，SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y，其中X1为S或I，X2为S或T，X3为F或Y，X4为E或D。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45186。
在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体。
在第四方面，本发明提供了一种载体，其包含第三方面所述的核酸分子。
在第五方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的载体。
在第六方面，本发明提供了一种免疫检测方法，所述方法用于非诊断目的或诊断目的，包括使用第一方面所述的抗FITC单克隆抗体的步骤。
在第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体在制备用于免疫检测的检测剂中的用途。
在第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括第一方面所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体以及使用说明。
综上，本发明提供了一种具有高灵敏度和高特异性的抗FITC单克隆抗体。本发明的抗FITC抗体能够与FITC发生特异性结合，得到的FITC-抗FITC抗体系统与生物素-链霉亲和素系统具有相似的敏感性和稳定性，可用于放大免疫荧光检测信号。本发明的抗FITC抗体通过抗原-抗体反应，可以特异性地结合与FITC偶联的抗体或抗原。由于一个抗FITC抗体可以结合多个FITC，这样可以形成多级放大效应，极大地提高检测、分析的灵敏度。本发明的抗体可以用于ELISA检测，细胞捕获、分选和富集，免疫印迹检测，流式检测等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的Ab400、Ab401和Ab402单克隆抗体分别在1.268mg/mL、1.74mg/mL和1.941mg/mL的浓度下的SDS-PAGE电泳结果，每孔上样8μg。
图2示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的单克隆抗体Ab401的竞争抑制曲线。
图3示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的单克隆抗体Ab402的竞争抑制曲线。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009；38(suppl_1):D301-D307。
在本文中，发明人使用了Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。根据Chothia等人的编号系统，抗体的VH CDR1位于第26至32位，VH CDR2位于第52至57位，VH CDR3位于第99至108位，而VL CDR1位于第24至39位，VL CDR2位于第55至61位，并且VL CDR3位于第94至102位。还可以采用例如Kabat编号系统来定义CDR。根据Kabat编号系统，抗体的VH CDR1位于第31至35位，VH CDR2位于第50至66位，VH CDR3位于第99至108位，而VL CDR1位于第24至39位，VL CDR2位于第55至61位，并且VL CDR3位于第94至102位。然而，可以理解，应用任一定义来定义抗体的CDR，也在如本文所定义和使用的术语的范围内。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,MilsteinC.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
在本发明中，还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中，一些位点仅仅涉及单独的一种碱基，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种，而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合，在这种情况下，这些碱基被称为彼此的简并碱基，其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示，其中，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。
本文中使用的术语序列“同一性”、“一致性”或者“同源性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列同一性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列同一性(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性的方法，但是术语“同一性”是技术人员公知的在肽或蛋白中适合于保守型氨基酸置换的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4thEdition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
在第一方面，本发明提供了一种抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中，SEQ ID NO:1所示序列为GFTFX1X2F，SEQ ID NO:2所示序列为SSDSRT，SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y，其中X1为S或I，X2为S或T，X3为F或Y，X4为E或D。
在一个具体的实施方案中，在所述抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体中，X1为S，X2为S，X3为F，X4为E，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5表示。
以上CDR的具体序列是依据Chothia编码系统来给出的。相应地，如果采用Kabat编号系统，则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为SFGMH、FISSDSRTIYYADTVKG、SRAFYRSLEY，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在一个优选的技术方案中，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，在所述抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体中，X1为S，X2为T，X3为Y，X4为D，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：6、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:7表示。
以上CDR的具体序列是依据Chothia编码系统来给出的。相应地，如果采用Kabat编号系统，则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为TFGMH、FISSDSRTIYYTDTVKG、SRAYYRSLDY，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在一个优选的技术方案中，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，在所述抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体中，X1为I，X2为T，X3为Y，X4为D，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：8、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:9表示。
以上CDR的具体序列是依据Chothia编码系统来给出的。相应地，如果采用Kabat编号系统，则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为TFGMH、FISSDSRTIYYTDTVKG、SRAYYRSLDY，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在一个优选的技术方案中，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在一个进一步优选的实施方案中，所述抗体是由2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏号为CGMCC No.45186的杂交瘤细胞生产的。
在一个具体的实施方案中，所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。需要注意的是，在本文中，所谓“原FR或恒定区”是指由各杂交瘤细胞分泌的各单克隆抗体所包含的原始FR或恒定区。本领域普通技术人员能够理解，基于原FR或恒定区的氨基酸序列进行的一个或多个修饰得到的新构架区或恒定区，仍在本发明要求保护的技术方案的范围以内。
作为一个示例，各构架区(FR)可以具有如下序列：
HFR1(重链构架区1)：QLKESGPGLVAPSQSLSISCTVS
HFR2(重链构架区2)：WMNWIKQRPGQGLEWIGEI
HFR3(重链构架区3)：TYYNSALKSRLTISKDNSKSQVFLKMN SLQTDDTAMYYCAK
HFR4(重链构架区4)：WGQGTLVTVS
LFR1(轻链构架区1)：VVMTQTPLSLPVSLGDQASISC
LFR2(轻链构架区2)：WYQQKPGQSPKLLIY
LFR3(轻链构架区3)：GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDL GVYYC
LFR4(轻链构架区4)：FGGGTKLEI。
在一个具体的实施方案中，所述抗体还包括恒定区序列，例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列，本领域技术人员能够基于需要进行选择，本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中，所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一些实施方案中，所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在一个更具体的实施方案中，所述抗体的IC50小于17ppb。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45186。
在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体。
对于本领域技术人员而言，在知晓某种蛋白例如本发明的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体的氨基酸序列的情况下，确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外，为了通过重组方式获得单克隆抗体，可以将所述核酸分子克隆到载体中，并将该载体进一步导入表达细胞中，以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白。
在第四方面，本发明提供了一种载体，其包含第二方面所述的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述载体可以为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个具体的实施方案中，所述载体为pTOPO载体。
在又一个具体的实施方案中，所述载体为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1载体。
在第五方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述，本发明人以FITC作为半抗原，与大分子载体蛋白偶联后诱导动物产生免疫应答，再利用杂交瘤技术获得既能无限增殖又能分泌抗FITC单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后，可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA，并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)，然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中，由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。利用单克隆抗体及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。
在一个具体的实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.Gen Virol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub et al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。
在第六方面，本发明提供了一种免疫检测方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的抗FITC抗体单克隆的步骤。
在一个具体的实施方案中，所述抗FITC单克隆抗体作为包被抗体使用。所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中，所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中，固相支持物没有特别限制，其可以是例如磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。例如，本发明的抗FITC单克隆抗体可以作为包被抗体来包被介质如磁珠。通过与FITC的特异性结合，可以将与FITC偶联的其他免疫化学试剂如其他抗体、抗原、第二抗体等与介质如磁珠桥联。在本发明中，由于一个抗FITC抗体可以结合多个FITC，这样可以形成多级放大效应，极大地提高检测、分析的灵敏度。
在一个具体的实施方案中，所述免疫检测方法可以是磁微粒分离酶联免疫检测方法、ELISA检测方法、免疫印迹检测或流式检测方法。例如，在磁微粒分离酶联免疫检测中，用抗FITC抗体包被磁微粒，通过抗FITC抗体-FITC之间的特异性结合，可以使FITC标记的抗体(或抗原)间接偶联到磁微粒上，间接偶联的抗体(或抗原)可以特异性地捕获样品中的待测物质，再加入酶标抗体和显色底物，就可以对样品中的待测物质进行检测。结合外磁场的施加，则可以轻易地将样品中与磁珠偶联的待测物质分离，从而实现快速灵敏的检测。
在一个进一步具体的实施方案中，所述磁微粒分离酶联免疫检测方法可以为磁微粒化学发光免疫检测方法。本领域技术人员能够理解，FITC作为荧光染料能够被紫外光或蓝光激发而发出黄绿色光，通过对FITC发光的检测，则可以快速准确的检测出经外磁场而分离得到的待测物质。
在又一个进一步具体的实施方案中，所述ELISA检测为胶体金法。
例如，以FITC标记特异性抗体，再以胶体金标记抗FITC抗体，检测线(T线)为与所述FITC标记特异性抗体结合相同抗原的配对抗体，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到免疫层析检测试纸。检测时，阳性样品中存在的抗原，与FITC标记特异性抗体结合，经进一步层析与胶体金标记抗FITC抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。在这种情况下，经由这种FITC-抗FITC抗体系统将样品中可能存在的抗原与胶体金桥联。本发明的这种FITC-抗FITC抗体系统不仅表现出与生物素-链霉亲和素系统相似的敏感性和稳定性，而且能够放大免疫检测信号。
利用本发明的抗FITC单克隆抗体与FITC之间的特异性结合、FITC-抗FITC抗体系统的敏感性和稳定性、以及一个抗FITC抗体结合多个FITC的放大效应，除前述的免疫检测之外，本领域技术人员能够理解，本发明的抗FITC单克隆抗体还可以进行免疫印迹检测、或流式检测，例如细胞的捕获、分选和富集等等。
在第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体在制备用于免疫检测的检测剂中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述抗FITC单克隆抗体作为包被抗体使用。所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中，所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中，固相支持物没有特别限制，其可以是例如磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。例如，本发明的抗FITC单克隆抗体可以作为包被抗体来包被介质如磁珠。通过与FITC的特异性结合，可以将与FITC偶联的其他免疫化学试剂如其他抗体、抗原、第二抗体等与介质如磁珠桥联。在本发明中，由于一个抗FITC抗体可以结合多个FITC，这样可以形成多级放大效应，极大地提高检测、分析的灵敏度。
在一个具体的实施方案中，所述免疫检测可以是磁微粒分离酶联免疫检测、ELISA检测、免疫印迹检测或流式检测。例如，在磁微粒分离酶联免疫检测中，用抗FITC抗体包被磁微粒，通过抗FITC抗体-FITC之间的特异性结合，可以使FITC标记的抗体(或抗原)间接偶联到磁微粒上，间接偶联的抗体(或抗原)可以特异性地捕获样品中的待测物质，再加入酶标抗体和显色底物，就可以对样品中的待测物质进行检测。结合外磁场的施加，则可以轻易地将样品中与磁珠偶联的待测物质分离，从而实现快速灵敏的检测。
在一个进一步具体的实施方案中，所述磁微粒分离酶联免疫检测可以为磁微粒化学发光免疫检测。本领域技术人员能够理解，FITC作为荧光染料能够被紫外光或蓝光激发而发出黄绿色光，通过对FITC发光的检测，则可以快速准确的检测出经外磁场而分离得到的待测物质。
在又一个进一步具体的实施方案中，所述ELISA检测为胶体金法。
例如，以FITC标记特异性抗体，再以胶体金标记抗FITC抗体，检测线(T线)为与所述FITC标记特异性抗体结合相同抗原的配对抗体，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到免疫层析检测试纸。检测时，阳性样品中存在的抗原，与FITC标记特异性抗体结合，经进一步层析与胶体金标记抗FITC抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。在这种情况下，经由这种FITC-抗FITC抗体系统将样品中可能存在的抗原与胶体金桥联。本发明的这种FITC-抗FITC抗体系统不仅表现出与生物素-链霉亲和素系统相似的敏感性和稳定性，而且能够放大免疫检测信号。
利用本发明的抗FITC单克隆抗体与FITC之间的特异性结合、FITC-抗FITC抗体系统的敏感性和稳定性、以及一个抗FITC抗体结合多个FITC的放大效应，除前述的免疫检测之外，本领域技术人员能够理解，本发明的抗FITC单克隆抗体还可以进行免疫印迹检测、或流式检测，例如细胞的捕获、分选和富集等等。
在第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括第一方面所述的抗FITC单克隆抗体、以及使用说明书。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗FITC单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫：将FITC与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次，每次免疫间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将偶联BSA的FITC与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将偶联BSA的FITC与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1：10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的FITC-BSA经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1：5的比例融合，充分混匀，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：取卵清蛋白(OVA)偶联的FITC，用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含3％脱脂奶的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下，检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔(FITC-BSA)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得三株稳定分泌抗FITC抗体的细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5。
细胞上清单抗的制备与纯化：将这三株细胞株用含15％血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养，当扩培至约4×107个/皿时，以800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml，转瓶培养。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到80％-90％时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml)，收取细胞悬液，以6000rpm高速离心20min，取上清，对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由Y3B8-2C8杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab400；将由Y3G10-5G5杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab401；将由Y8D7 -6E5杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab402。
经微量分光光度计鉴定，Ab400、Ab401和Ab402单克隆抗体的浓度分别为1.268mg/mL、1.74mg/mL和1.941mg/mL。将纯化后的单抗分装(100μL/管，浓度为1mg/ml)，并保存在4℃-8℃。用SDS-PAGE电泳鉴定三种抗体(每孔上样8μg)，结果如图1所示。从该图中可以看出，三个抗体均出现约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析三株单克隆抗体，在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例2：间接ELISA法检测抗体效价
用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释OVA偶联的FITC，使其浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含3％脱脂奶粉的PBST封闭，100μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗FITC单克隆抗体Ab400、Ab401和Ab402进行梯度稀释，得到不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，以形成明显梯度的阳性反应的最高稀释倍数作为抗体的效价，具体测试参数和结果见下表1。本发明的三种抗体的效价均达到500K。这证明了本发明的抗体效价高，具有很好的亲和力。
表1：抗体效价检测的参数和结果
实施例3：单克隆抗体特异性分析
采用间接ELISA法，用1μg/ml的卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、FITC-OVA分别包被酶标板，100μL/孔，检测杂交瘤细胞培养上清，测定本发明的三株单克隆抗体与这些蛋白的交叉反应的OD450nm值，判断抗体的特异性，三株单克隆抗体稀释倍数为1：100K，以100μL/孔加入稀释的单克隆抗体，经显色后，结果具体如下表2：
表2：抗体与OVA、BSA和FITC-OVA的交叉反应的OD450nm
由上表2的结果可知，本发明的这三种抗FITC抗体对FITC具有特异性识别活性，与OVA、BSA无交叉反应。这证明了本发明的抗体具有很高的特异性。
实施例4：间接竞争ELISA法检测抗体
在本实施例中，以竞争ELISA法进一步对筛选出的3株单克隆抗体进行了测定，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加单抗、加酶标抗体、显色与终止、测定OD450nm读数，数据处理。
具体地，在该间接竞争ELISA检测方法中：取100μL 1μg/ml的包被抗原FITC-OVA加入至96孔酶标板小孔中，包被过夜。然后将经FITC-OVA包被的96孔酶标板用PBST洗涤液洗涤两次，加入封闭液(3％脱脂奶粉/洗涤液)室温封闭2小时，将封闭液倒掉，得到封闭后的酶标板。将本发明的三种抗体做100K稀释，得到待测样品。将该待测样品以每孔100μL加入到封闭后的酶标板中，然后加入50μL 100ppb的FITC标准品，混匀，室温孵育1小时，将上清液倒掉，用洗板机洗2次。加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，酶标抗体的稀释浓度为1：4000，每孔50μL，于室温孵育1小时，用洗涤液洗3次，吸水纸上拍干。加入新鲜配制的100μLTMB显色反应底物，室温显色30分钟后用2mol/L H2SO4终止反应，读取波长450nm处的吸光度OD450nm。最后，利用测定的吸光值OD450nm计算出吸光度百分数(％)＝(B/B0)×100％，其中B为加入竞争物FITC的检测孔的OD450nm，B0为未加竞争物的对照孔的OD450nm，抑制率为100％减去吸光度百分比。具体结果如表3所示。
表3：抗体的间接竞争ELISA检测结果
在间接竞争ELISA中，抗体是限量的，加入的游离标准品FITC与包被的固相FITC-OVA抗原一起竞争地与抗FITC抗体结合，固相吸附的抗FITC抗体与游离标准品FITC的加入量成反比。以梯度稀释的标准品FITC与包被抗原竞争，当加入标准品FITC浓度在125ppb附近，吸光度百分比小于10％，即抑制率>90％。标准品FITC浓度在15ppb附近，吸光度百分比约50％，达到约一半抑制。在标准品FITC浓度为100ppb时，三种抗体的吸光度百分比分别为15.59％、33.06％和18.21％，即抑制率分别达到了84.41％、66.9％和81.79％，这显示出三株抗体有很好的亲和力和特异性。
实施例5：抗FITC抗体的IC50测定
将溶于碳酸盐(CB)缓冲液的浓度为1μg/ml的FITC-OVA以50μL/孔加入到96孔酶标板的小孔中，于4℃封闭过夜。然后将经FITC-OVA包被的96孔酶标板用洗涤液(含有0.05％Tween的PBS缓冲液)洗两次。加入封闭液(3％脱脂奶粉/洗涤液)室温封闭2小时。以1：100000预稀释抗FITC抗体(纯化后的单克隆抗体)。将FITC游离小分子预调整到合适起始浓度，随后在稀释板上做倍比稀释，共八个梯度(0.0006μg/ml至1μg/ml，每一浓度均作三复孔)。将封闭液倒掉，加入50μL不同稀释度的FITC溶液，然后加入100μL稀释的抗体，混匀。室温孵育1小时，将上清液倒掉，用洗涤液洗板2次，然后加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育1小时，用洗涤液洗2次，加入100μl TMB显色反应底物，于室温显色30分钟后用2mol/L H2SO4终止反应，读取波长450nm处的吸光度。
然后，以竞争物FITC竞争浓度为横坐标，以加入竞争物FITC的检测孔的OD450nm(B)与未加竞争物的对照孔的OD450nm(B0)的比例(B/B0％，称为结合率)为纵坐标制作竞争抑制曲线，得到IC50。图2为单克隆抗体Ab401的竞争抑制曲线。其中，游离FITC与包被的FITC-OVA竞争结合FITC抗体，洗涤后加入酶标二抗，显色读取波长450nm处吸光度，计算结合率，X值为FITC游离小分子浓度取对数，Y值为结合率。经计算，结合率50％时，X值为16.9μg/L，即IC50。按此方法，做单克隆抗体Ab400和Ab402的竞争抑制曲线，单克隆抗体Ab402的竞争抑制曲线如图3所示，计算IC50，结果如表4所示，表明本发明的三株抗FITC单克隆抗体Ab400、Ab401和Ab402的IC50分别为15.6ppb、16.9ppb和14.8ppb(1ppb等同于1μg/L)，该结果表明本发明的三株FITC单克隆抗体均具有高灵敏度。
表4：本发明的三株抗FITC单克隆抗体的IC50
| 杂交瘤细胞系 | Y3B8-2C8(Ab400) | Y3G10-5G5(Ab401) | Y8D7-6E5(Ab402) |
| IC50 | 15.6ppb | 16.9ppb | 14.8ppb |
实施例6：抗FITC杂交瘤细胞株抗体Ab400、Ab401和Ab402可变区序列的克隆和测序
从杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5克隆分离总RNA，通过反向转录制备cDNA，以从Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5克隆免疫球蛋白序列，进而对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
(1)RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取，并立即进行下述反转录的步骤；
(2)将RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合酶(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；
(3)可变区序列的PCR扩增及回收：以步骤(2)中所得cDNA为模板，用下表5中给出的重链引物MulgVH5’-A和MulgGVH3’-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，用下表5中给出的轻链引物MuIgκVL5'-G和MuIgκVL3'-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA，对PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
表5：引物序列
(4)可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到的杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析。经分析，重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表6所示。
表6：三种抗体的重链互补决定区和轻链互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
实施例7：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株，并大规模培养纯化。
对于编码下表7中给出的三种重组抗体的VL和VH基因，用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达质粒。将真核表达质粒pCDNA3.1电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20d后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
表7：重组抗体的重链可变区和轻链可变区序列
/>
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中，1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后即得到重组单克隆抗体。
根据实施例2所述方法，检测各重组抗体与FITC的结合能力。结果发现，由本实施例得到的重组单克隆抗体与实施例1中得到的单克隆抗体具有相似的抗体效价和亲和力。
Claims (10)
1.一种抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中，SEQ ID NO:1所示序列为GFTFX1X2F，SEQID NO:2所示序列为SSDSRT，SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y，其中X1为S或I，X2为S或T，X3为F或Y，X4为E或D。
2.根据权利要求1所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体，其中，
a)X1为S，X2为S，X3为F，X4为E，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5表示；优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
b)X1为S，X2为T，X3为Y，X4为D，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7表示；优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；或者
c)X1为I，X2为T，X3为Y，X4为D，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9表示；优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；更优选地，所述抗体是由2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏号为CGMCCNo.45186的杂交瘤细胞生产的。
3.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.45186。
4.一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体。
5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述载体为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA如pCDNA3.1、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
6.一种表达细胞，其包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体，优选地，所述表达细胞为哺乳动物细胞，例如选自中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
7.一种免疫检测方法，所述方法用于非诊断目的，包括使用权利要求1或2所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体的步骤；优选地，所述免疫检测方法为磁微粒分离酶联免疫检测方法如磁微粒化学发光免疫检测方法、ELISA检测方法如胶体金法、免疫印迹检测、或流式检测方法。
8.根据权利要求1或2所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体在制备用于免疫检测的检测剂中的用途；优选地，所述免疫检测为磁微粒分离酶联免疫检测如磁微粒化学发光免疫检测、ELISA检测如胶体金法、免疫印迹检测、或流式检测。
9.根据权利要求7所述的免疫检测方法或根据权利要求8所述的用途，其中，所述抗FITC单克隆抗体连接至固相，固相例如是磁性微粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。
10.一种试剂盒，其包括权利要求1或2所述的抗硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体以及使用说明。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210799318.5A CN115850498A (zh) | 2022-07-06 | 2022-07-06 | 单克隆抗硫氰酸荧光素抗体及其应用 |
| CN2022107993185 | 2022-07-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117003880A true CN117003880A (zh) | 2023-11-07 |
| CN117003880B CN117003880B (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=85660233
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210799318.5A Withdrawn CN115850498A (zh) | 2022-07-06 | 2022-07-06 | 单克隆抗硫氰酸荧光素抗体及其应用 |
| CN202310818854.XA Active CN117003880B (zh) | 2022-07-06 | 2023-07-05 | 抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210799318.5A Withdrawn CN115850498A (zh) | 2022-07-06 | 2022-07-06 | 单克隆抗硫氰酸荧光素抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN115850498A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101235085A (zh) * | 2008-01-24 | 2008-08-06 | 中国科学院微生物研究所 | 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用 |
| CN111254180A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 浙江大学 | 一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法 |
| CN114574448A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-03 | 扬州大学 | 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD260132A1 (de) * | 1987-04-24 | 1988-09-14 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur nutzung monoklonaler antikoerper gegen fitc |
| CN104880564A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-09-02 | 南京格耀生物科技有限公司 | 一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| CN106706895A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-05-24 | 郑州大学 | 一种抗fitc荧光单克隆抗体及其免疫层析试纸 |
-
2022
- 2022-07-06 CN CN202210799318.5A patent/CN115850498A/zh not_active Withdrawn
-
2023
- 2023-07-05 CN CN202310818854.XA patent/CN117003880B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101235085A (zh) * | 2008-01-24 | 2008-08-06 | 中国科学院微生物研究所 | 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用 |
| CN111254180A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 浙江大学 | 一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法 |
| CN114574448A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-03 | 扬州大学 | 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117003880B (zh) | 2024-01-16 |
| CN115850498A (zh) | 2023-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2017206773A1 (zh) | 一种发掘特异性功能抗体的方法 | |
| CN115838419A (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
| CN111196851B (zh) | 针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用 | |
| CN109336973B (zh) | 抗转铁蛋白抗体及其用途 | |
| CN111647081B (zh) | 一种重组小鼠抗人白介素19单克隆抗体、制备方法和应用 | |
| CN115925909B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
| CN117003880B (zh) | 抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用 | |
| CN113683692B (zh) | SARS-CoV-2 N蛋白抗体及其应用 | |
| CN111647086B (zh) | 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用 | |
| CN116789807B (zh) | 抗腺病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN115825415B (zh) | 阻断剂和体外免疫诊断产品、应用 | |
| WO2024067151A1 (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
| CN116396392B (zh) | 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用 | |
| US20030044849A1 (en) | Methods for screening monoclonal antibodies on heterogeneous antigen substrates | |
| CN118027181A (zh) | 六邻体蛋白抗体及其应用 | |
| CN117402249A (zh) | 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用 | |
| CN117467005A (zh) | 抗疟原虫单克隆抗体及其应用 | |
| US8349569B2 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
| CN112094350B (zh) | 可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白cd326的单克隆抗体 | |
| CN116143914B (zh) | 一种针对登革病毒ns1蛋白的抗体及其相关应用 | |
| CN111647083B (zh) | 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用 | |
| CN117024585A (zh) | 抗甲状腺球蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| CN117106073A (zh) | 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN112094345B (zh) | 可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗免疫球蛋白关联βCD79b的单克隆抗体 | |
| WO2024051106A1 (zh) | 一种抗IL4i1纳米抗体的制备及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |