CN117106073A - 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新的抗新型冠状病毒(SARS‑Cov‑2)单克隆抗体、包括该抗体的试剂盒、及其相关应用。本发明的抗SARS‑Cov‑2单克隆抗体可以特异性结合多种型别的SARS‑Cov‑2NP蛋白,表现出针对多种新型冠状病毒的高灵敏度和高特异性,能够用于多种型别的新型冠状病毒的检测,尤其是用于具有高传染性和高逃逸能力的Delta和Omicron变异株的检测,极大地提高了新型冠状病毒流行株的检测率,降低了检测成本,为病例筛查、疫情监控、临床诊断/治疗等提供了一种更具特异性且广谱性的稳定、快速且可靠的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,并具体地涉及一种抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段、包括该抗体的试剂盒及相关应用。
背景技术
新型冠状病毒感染引发的肺炎(Corona Virus Disease 2019,Covid-19),是由新型冠状病毒(SARS-Cov-2)引起的一种严重的急性呼吸系统传染病,该病传染性强,近三年来在全球范围内大流行,确诊已达数亿人。
SARS-Cov-2属于冠状病毒科的β冠状病毒属,为单股正链RNA(核糖核酸)病毒,基因组非常小,约30KB。RNA病毒复制依赖于自身携带的RNA聚合酶,RNA聚合酶不具有核酸酶校对活性,因此其基因组在复制过程中核苷酸的错配率就比较高。因此,RNA病毒突变率很高。
早期诊断对于感染病人的及早发现和新冠疫情的防控都至关重要。目前新型冠状病毒感染引发的肺炎的诊断方法主要有:1)基于病毒核酸扩增的分子检测和2)抗原快速检测和3)抗体检测。抗原检测不需要复杂设备,具有速度快、成本低的优点,而且便于居家自检。核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)是新型冠状病毒感染过程中含量最丰富的病毒结构蛋白,在病毒感染人体细胞后会大量表达,引起强烈的免疫反应。NP蛋白的基因序列相对保守稳定,与谱系上最接近的SARS-CoV NP蛋白存在约90%的同源性,因为其良好的免疫原性和稳定性,NP蛋白常作为新型冠状病毒的检测靶标,进行新型冠状病毒的抗原检测,用于病例筛查和疫情监控。
一些携带关键位点突变的病毒变异株,如被世界卫生组织(WHO)列为“关注变异株”(variants of concern,VOC)的阿尔法(Alpha)变异株(B.1.1.7)、贝塔(Beta)变异株(B.1.351)、伽马(Gamma)变异株(P.1)、德尔塔(Delta)变异株(B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron)变异株(B.1.1.529)以及Omicron变异株(BA.2/BA.5)等,表现出更强的感染能力或更强的免疫逃逸能力,使现有的公共卫生干预措施或疫苗的有效性降低,对疫情防控提出了新的严峻挑战。作为新型冠状病毒的抗原检测的主要靶标,NP蛋白发生突变可能会影响抗原检测的灵敏度。面对全球不断出现的变异毒株,特别是奥密克戎毒株,需要进一步寻找针对新毒株灵敏度更高、特异性更强的NP抗体,确保变异株能够被检测出来。
与最初的SARS-CoV-2毒株相比,Omicron变异株明显具有更多的突变,并且具有高度的传播性,从而导致更高的感染率。这导致全球病例数量急剧增加。Omicron变异株在刺突蛋白编码区有30多个突变(包括单核苷酸突变、插入突变和/或缺失突变),此外,OmicronBA.1变异株的核衣壳蛋白(NP蛋白)(P13L、Δ31-33、R203K、G204R)中显示出三个单点突变和一个缺失突变,缺失突变在某些情况下,可能会改变NP蛋白的动态稳定性和免疫原性。
由于NP蛋白是大多数SARS-CoV-2快速抗原检测(RAT)的靶蛋白,因此研究NP蛋白突变是否影响抗原检测的性能至关重要。研究显示,在抗原测试中,某些NP蛋白抗体确实可以检测到Omicron变异株,但敏感性有所降低,这为奥密克戎感染的筛查带来了新的不确定性。此外,新型冠状病毒NP蛋白与其他β属冠状病毒的NP蛋白具有极高同源性,比如与引发“普通感冒”的HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E和引发中东呼吸综合征的MERS-CoV的NP蛋白都高度同源,包含这些冠状病毒的患者临床样本极易被新型冠状病毒的特异性抗体识别,从而产生“假阳性”。
因此,本领域亟需一种不与常见冠状病毒产生交叉反应的且能够检测新型冠状病毒特别是Omicron这类传播力高、免疫逃逸能力强的变异株的高灵敏度和高特异性的抗体。
发明内容
本发明的发明人用SARS-CoV-2NP蛋白免疫小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,由ELISA方法筛选出对SARS-CoV-2NP蛋白有特异性的杂交瘤细胞株,由此获得的抗SARS-CoV-2单克隆抗体表现出针对包括Omicron变异株在内的新型冠状病毒SARS-CoV-2的广谱性、高特异性和高灵敏度。由此,实现了本发明。
因此,在第一方面,本发明提供了一种抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;其中,VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:25所示;VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:26所示;VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27所示;VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28所示;VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29所示;VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30所示。
在第二方面,提供了一种核酸分子,其编码第一方面所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段。
在第三方面,提供了一种载体,其包含第二方面所述的核酸分子。
在第四方面,提供了一种表达细胞,其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体。
在第五方面,提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-Cov-2)的方法,所述方法用于非诊断目的或者诊断目的,包括使用第一方面所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
在第六方面,提供了第一方面所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂中的用途。
在第七方面,提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒,其包括第一方面所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
综上,本发明提供了一种抗SARS-CoV-2单克隆抗体或其抗原结合片段,其表现出针对SARS-CoV-2、尤其是针对Delta和Omicron变异株的高灵敏度和高特异性,能够高效地检测出Delta和Omicron变异株,同时也表现出针对新型冠状病毒的原始毒株和其他变异株的很高的检测效率,并且不与其他常见的冠状病毒发生交叉反应。由此,本发明的抗体能够用于多种型别的SARS-CoV-2的检测,表现出针对SARS-CoV-2的高广谱性、高灵敏度和高特异性,可以通过多种检测方法如胶体金层析、荧光微球免疫层析等实现皮克级浓度的更灵敏检测,极大地提高了SARS-CoV-2流行株的检测率,降低了检测成本,为病例筛查、疫情监控、临床诊断/治疗等提供了一种更具特异性且更普适、稳定、快速、可靠的检测手段。
附图说明
为了更清楚地说明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是示出本发明的单克隆抗体C1-C5分别与三种新型冠状病毒(野生型WT、Delta和Omicron)NP蛋白以及冠状病毒HCoV-HKU1的NP蛋白(对照)的结合反应结果的图。
图2是示出本发明的重组单克隆抗体C7、C13、C24、C42和C45分别与三种新型冠状病毒(野生型WT、Delta和Omicron)NP蛋白以及冠状病毒HCoV-HKU1的NP蛋白(对照)的结合反应结果的图。
具体实施方式
在下文中,将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解,以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明,而无意于对本发明的范围进行限制,本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且,本领域技术人员理解,在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前,提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中,例如浓度范围、百分比范围或比率范围,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且此类实施方案也包括在所述主题内,受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中,排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中,很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述,表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外,还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外,在本文中,表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述,表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤,而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时,该表述等同于表述“由……组成”。
如本文所用,术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链,其可变区各自包含三个CDR,即CDR1、CDR2和CDR3。因此,各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义:Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991));Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987;196:901-917;Chothia et al.,Nature 1989;342:878-883;Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009;38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定,Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统,还提供了限定3个CDR的精确残基边界,这些CDR被称为Kabat CDR;Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性,但具有几乎相同的肽主链构象,这些亚部分被称为Chothia CDR,Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述,CDR边界定义可能不严格遵守上述系统,例如AbM定义。在本文中,可以根据这些系统中任何一种限定的CDR,尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。
如本文中所使用,术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子可以是免疫球蛋白,无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还可以包括具有抗体结构结合域的所有多肽或蛋白质,具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子,以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975;256(5517):495),但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent4,816,567)。如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所使用的,术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同,也可以不完全相同。例如,可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达,由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体,也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达,由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体,例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如本文所使用的,术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物,其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合活性。通常,当基于摩尔来表示活性时,抗原结合片段保留至少10%的母体结合活性。具体地,抗原结合片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段的示例包括但不限于:Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。其中,“Fab片段”由一条轻链、一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(包含VH结构域、CH1结构域、以及CH1和CH2结构域之间区域);由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区,但缺少恒定区。
如本文中使用的,术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
在本发明中,还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中,一些位点仅仅涉及单独的一种碱基,如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种,而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合,在这种情况下,这些碱基被称为彼此的简并碱基,其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示,其中,R代表A/G,Y代表C/T,M代表A/C,K代表G/T,S代表C/G,W代表A/T,H代表A/T/C,B代表G/T/C,V代表G/A/C,D代表G/A/T,以及N代表A/T/C/G。
本文中使用的术语序列“同一性”、“一致性”或者“同源性”具有本领域公认的含义,并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列同一性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列同一性(参见,例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,NewYork,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;and SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性的方法,但是术语“同一性”是技术人员公知的在肽或蛋白中适合于保守型氨基酸置换的,并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常,本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4thEdition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
在第一方面,本发明提供了一种抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括轻链互补决定区VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3;其中,VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:25所示;VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:26所示;VH CDR3的氨基酸序列由SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27所示;VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28所示;VLCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:29所示;VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:30所示。
在一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13-15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28-30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:8所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个具体的实施方案中,所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言,可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列,也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分,其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
作为一个示例,各构架区(FR)可以具有如下序列:
HFR1(重链构架区1):QLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS
HFR2(重链构架区2):WMNWVKQRPGQGLEWIGNI
HFR3(重链构架区3):VKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCAY
HFR4(重链构架区4):WGQGTSVTVS
LFR1(轻链构架区1):IQLTQSPASLAVSTGEKVTIRC
LFR2(轻链构架区2):WLLQKPGQSPKLLIY
LFR3(轻链构架区3):GVPARFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGTYYC
LFR4(轻链构架区4):FGGGTKLEI。
在一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO::39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上、或甚至99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%以上的一致性的序列。
在一个具体的实施方案中,所述抗体还包括恒定区序列,例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列,本领域技术人员能够基于需要进行选择,本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中,所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类,但不限于此。
在一个具体的实施方案中,本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一些实施方案中,所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在一个具体的实施方案中,所述单克隆抗体靶向新型冠状病毒(SARS-Cov-2)的核衣壳(NP)蛋白。
在本文中,“新型冠状病毒”或“SARS-Cov-2”不仅包括最早出现的原始SARS-Cov-2病毒株(下文也称为“野生型”),也包括其后期突变得到的变异株,例如,Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Omicron变异株等。
在一个具体实施方案中,所述单克隆抗体可以特异性结合SARS-Cov-2的野生型病毒株或其变异株如Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Omicron变异株。
在一个优选的实施方案中,所述单克隆抗体可以特异性结合SARS-Cov-2的Delta变异株和Omicron变异株、特别是变异程度更高的Omicron变异株。
在第二方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码第一方面所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段。
对于本领域技术人员而言,在知晓某种蛋白/肽/多肽例如本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的情况下,确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外,为了通过重组方式获得单克隆抗体,可以将所述核酸分子克隆到载体中,并将该载体进一步导入表达细胞中,以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白或其抗原结合片段。
在第三方面,本发明提供了一种载体,其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个具体的实施方案中,所述载体可以为质粒载体,例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在又一个具体的实施方案中,所述载体为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中,所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1载体。
在第四方面,本发明提供了一种表达细胞,其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述,本发明人以SARS-CoV-2NP蛋白免疫小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,由ELISA方法筛选出对多种型别的SARS-CoV-2病毒的NP蛋白均特异结合的杂交瘤细胞株,分别命名为C1-C5。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后,可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA,并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区),然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中,由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。利用单克隆及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子,这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。
在一个具体的实施方案中,所述表达细胞可以为哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中,所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7,ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞,Graham et al.,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO,Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216;例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1,ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138,ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2,HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等,但不限于此。
在第五方面,本发明提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-Cov-2)的方法,所述方法用于非诊断目的或者诊断目的,包括使用第一方面所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个具体的实施方案中,所述新型冠状病毒可以是野生型病毒株或其变异株如Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、或Omicron变异株,但不限于此。
在一个优选的实施方案中,所述新型冠状病毒是Delta变异株或Omicron变异株,特别是变异程度更大的Omicron变异株。
在一个具体的实施方案中,所述检测新型冠状病毒病毒是通过本发明的所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合新型冠状病毒的NP蛋白来实现的。
在又一个具体的实施方案中,所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。
在一个优选的实施方案中,所述ELISA检测可以为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中,所述检测是通过免疫层析法来进行的,所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
在进一步优选的实施方案中,所述免疫层析法是荧光微球免疫层析法。本发明的抗SARS-CoV-2单克隆抗体或其抗原结合片段通过荧光微球免疫层析法检测抗体或其抗原结合片段对SARS-CoV-2NP蛋白(重组抗原)的检测灵敏度可以小于10pg/mL,例如可达1pg/mL。
在本发明的检测中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以作为标记抗体使用。例如所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以与纳米颗粒、磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。本发明的所述单克隆抗体或其抗原结合片段也可以作为包被抗体使用。例如,本发明的所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制,其可以是多孔或无孔材料,例如纳米颗粒、磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
举例来说,当进行基于彩色乳胶微球的免疫层析测试时,可以用本发明的抗SARS-Cov-2单克隆抗体(如抗体C7,但不限于此)或其抗原结合片段标记乳胶微球,本发明(如抗体C34,但不限于此)或现有技术的另一种抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段包被硝酸纤维素膜(NC膜),划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式,组装得到免疫层析试纸条。检测时,阳性样品中的待测物与乳胶微球上标记的抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段结合形成复合物,所述复合物在T线处与包被抗体结合,形成夹心复合物,此处彩色乳胶微球发生聚集沉淀显示出颜色,根据显色条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。
在本发明的上下文中,“另一种抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段”是指能够与本发明的抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体或其抗原结合片段,其可以是本发明抗SARS-Cov-2单克隆抗体之一或其抗原结合片段,也可以是现有技术的其他抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段,但不限于此。值得注意的是,本发明的抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段无论是作为包被抗体还是标记抗体,在与另一种抗SARS-Cov-2单克隆抗体或其抗原结合片段结合使用时,都能够以高灵敏度和高特异性的方式实现对SARS-Cov-2的检测。
在第六方面,本发明提供了第一方面所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂中的用途。
在一个具体的实施方案中,所述检测新型冠状病毒病毒是通过本发明的所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合新型冠状病毒的NP蛋白来实现的。
在又一个具体的实施方案中,所述新型冠状病毒可以是野生型病毒株或其变异株如Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、或Omicron变异株,但不限于此。
在一个优选的实施方案中,所述新型冠状病毒是Delta变异株或Omicron变异株,特别是变异程度更大的Omicron变异株。
在又一个具体的实施方案中,所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。所述免疫层析法可以包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法等。本领域技术人员能够根据需要对检测进行选择,本发明对此并无特别限定。
在又一个优选的实施方案中,ELISA可以是直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在第七方面,本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒试剂盒,其包括第一方面所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
本发明的试剂盒可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的试剂盒和其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用,并进行优化。
实施例
在下述实施例中,示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明,其中采用的试验方法均为常规方法,并且如无特殊说明,下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意,本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的,无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1:抗SARS-Cov-2单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫:将纯化出的SARS-CoV-2NP蛋白(WT野生型)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次,每次免疫间隔2周,免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经背部皮下多点注射,后三次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经腹腔注射。第四次免疫后7天,对小鼠断尾采血,分离血清,采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平,以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合实验,在细胞融合实验前3天用不加佐剂的SARS-CoV-2NP蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立:融合当天,在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合,充分混匀,在与PEG融合前,洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500,轻轻振荡,以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞,再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中,并且在37℃、5%CO2条件下培养细胞。培养4至7天后,改用HT培养基进行培养,当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时,取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选:取SARS-CoV-2NP蛋白,用包被缓冲液(0.05mol/L,pH9.6,PBS)稀释,最终浓度为1μg/mL,以100μL/孔加入至96孔板中,于4℃包被过夜;弃包被液,用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次,拍干;用含2%BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干;将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下,检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1,以测定孔(SARS-CoV-2NP)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化:将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后,稀释成100个细胞/10mL培养基,将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6-7天后,显微镜下可观察到克隆细胞的形成,标记出单个克隆生长孔,取出细胞上清,进行ELISA检测(与上述融合检测相同),选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得五株稳定分泌抗SARS-CoV-2抗体的细胞株,分别命名为杂交瘤细胞株C1-C5。
细胞上清单抗的制备与纯化:将这两株细胞株用含15%血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养,当扩培至约4×107个/皿时,以800rpm离心5min,弃上清并将细胞转移到2L转瓶中,加入无血清培养基,使细胞密度约为3×105个/ml,转瓶培养。继续培养1~2周后,当细胞死亡率达到80%-90%时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml),收取细胞悬液,以6000rpm高速离心20min,取上清,对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由C1-C5杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作单克隆抗体C1-C5。
经微量分光光度计鉴定,单克隆抗体的浓度均为约4mg/mL。将纯化后的单抗浓度测定,并分装(100μL/管,浓度为1mg/ml),保存在4℃-8℃。
纯度检测:用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析这五株单克隆抗体,在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下,利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比,纯度均达到大于98%。
实施例2:抗体与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力的检测
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释三种SARS-CoV-2NP蛋白,使其浓度为1μg/mL,以100μL/孔加入至96孔酶标板,于4℃包被过夜,在自动洗板机上用PBST洗涤3次,拍干。四种常见冠状病毒即HCoV-HKU1(重链生物HP811-34K)、HCoV-229E(重链生物HP811-35K)、MERS-CoV(重链生物HP811-36K)和HCoV-NL63的NP蛋白,以相同浓度、方式包板处理,作为对照。用含2% BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗SARS-CoV-2NP蛋白的C1-C5单克隆抗体进行梯度稀释,抗体起始浓度为5μg/mL,依次按三倍用PBS进行梯度稀释,得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板,于37℃孵育1h,洗涤3次,拍干。加入1:20000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干。TMB底物以100μL/孔加入,于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪在450nm(OD)下测定光密度(OD450nm)。
通过ELISA实验分析单克隆抗体对野生型(WT)-NP蛋白、德尔塔(Delta)-NP蛋白以及奥密克戎(Omicron)-NP蛋白这三种SARS-CoV-2NP蛋白的结合活性。结果如图1所示,单克隆抗体C1-C5均可以特异性结合各类SARS-CoV-2的NP,对奥密克戎变异株、德尔塔变异株和野生型病毒株都显示出很好的亲和力,且与冠状病毒HCoV-HKU1(重链生物HP811-34K)没有交叉反应(参见图1,在其中作为对照);类似地,单克隆抗体C1-C5均对冠状病毒HCoV-NL63、HCoV-229E(HP811-35K)和MERS-CoV(HP811-36K)的NP蛋白都没有交叉反应(未图示),说明本发明的所有抗SARS-CoV-2单克隆抗体均具有良好的特异性。
经酶标仪测定OD450nm值,通过软件分析上述ELISA结果,获得上述单克隆抗体与SARS-CoV-2NP蛋白的EC50值如下表1所示。
表1:本发明的单克隆抗体与SARS-CoV-2NP蛋白的EC50值
实施例3:抗SARS-CoV-2单克隆抗体可变区序列的克隆和测序
从上述五株杂交瘤细胞株分离总RNA,通过反向转录制备cDNA,以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列,并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。参照细胞总RNAM5抽提试剂盒(北京聚合美)说明书,对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录。参照M5 First Strand cDNASynthesis Kit说明书(北京聚合美)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录,制得cDNA,冻存于-20℃备用。以上一步骤所得cDNA为模板,采用通用引物扩增重链及轻链cDNA,回收PCR扩增产物,PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(北京聚合美)说明书,将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,进行测序。对测序得到的杂交瘤细胞株的抗体的重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析,经分析,重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表2所示(依据Chothia编号系统)。
表2:抗体的重链互补决定区和轻链互补决定区序列
实施例4:重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体,通过真核表达制备稳定表达抗新型冠状病毒抗体的细胞株,并对其进行大规模培养纯化。
对于编码下表3中列出的抗体VL和VH的基因,用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达质粒。将该真核表达质粒电转导入CHO宿主细胞,电转后加入压力筛选培养基(50μMMSX)中培养20天后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG为二抗进行筛选,方法同上),筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。重组抗体的重链和轻链可变区的具体序列对应关系如下表3所示。
表3:重组抗体的重链可变区和轻链可变区的序列
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将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养,进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中,1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO),根据生产需求决定接种瓶数量,将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时,温度为37℃,二氧化碳为5%。培养7-9天后取样显微镜下观察,当细胞活率小于50%,离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体。
根据实施例2所述方法,检测所得重组抗体与三种新型冠状病毒NP蛋白的结合能力,其中,重组抗体C7、C13、C24、C42和C45与三种新型冠状病毒NP蛋白以及冠状病毒HCoV-NL63 NP蛋白(作为对照)的结合数据如图2所示。由图2可知,所得重组抗体可以特异性结合SARS-CoV-2的NP蛋白,对奥密克戎变异株、德尔塔变异株和野生型病毒株都显示出很好的亲和力,而对常见冠状病毒HCoV-HKU1的NP蛋白没有显示出交叉反应。类似地,除C7、C13、C24、C42和C45外的其他重组抗体也同样表现针对新型冠状病毒NP蛋白的良好的亲和力和特异性,并且对其他常见冠状病毒HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白没有交叉反应(未图示)。以上结果表明,所得重组抗体表现出良好的特异性。
经酶标仪测定的OD450nm值通过软件分析上述ELISA结果,获得所得重组单克隆抗体与三种SARS-CoV-2NP蛋白的EC50值,如下表4所示。
表4:本发明的重组单克隆抗体与SARS-CoV-2NP蛋白的EC50值
/>
从表4中给出的结果可以看到,所有经重组获得的单克隆抗体与SARS-CoV-2NP蛋白的亲和力也均在nM级甚至pM级,并且其中经重组获得的C1’-C5’抗体与此前经杂交瘤细胞产生的C1-C5抗体具有相当的EC50值。
实施例5:胶体金免疫层析测试
胶体金制备:在三角烧瓶中加入100ml超纯水,加热至沸腾,加入2mL 2%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液,沸腾后立刻加1mL 2%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液,继续搅拌沸腾10分钟,自然冷却备用。
标记胶体金偶合物:取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入120μl的0.2MK2CO3调节pH至7.0,继续搅拌10秒;加入100μg标记抗体(抗体A),继续搅拌5分钟;加入0.1ml10%BSA,继续搅拌5分钟;12000g离心10分钟,弃掉上清,将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB,150mM NaCl,0.2%BSA,0.1%TritonX-100,3%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,作为抗SARS-CoV-2NP单克隆抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫:将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司),冻干,即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被:稀释包被抗体(抗体B)至1mg/mL,制成检测线工作液,用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,50℃干燥1小时,备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装:将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测:分别检测不同浓度的重组抗原的样本。具体地,将80μl待测样本滴加至样品垫处,室温放置5-15分钟,判定结果。根据显示条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性,以HCoV-HKU1NP蛋白作为对照,结果如下表5所示,以厂家A的SARS-CoV-2胶体金层析试剂作为对照。表5的结果表明,与厂家A的试剂相比,本发明采用不同的标记抗体和包被抗体时,本发明抗体组合检测极限比厂家A高一个等级。
表5:本发明的重组抗体组合的胶体金免疫层析测试结果
注:HA811-31MB和HA811-41MB均为重链生物的重组鼠源抗-2019-nCoV NP抗体。
上表重组抗原单位为ng/mL,包被抗体浓度为1mg/mL,每1mL胶体金偶联10μg标记抗体,表中的B表示空白(即不结合)。
此外,还对本发明抗体一个示例性抗体组合(C24作为包被抗体,C45作为标记抗体)的最低检测极限进行了检测,梯度稀释各突变株NP蛋白,然后以稀释的突变株NP蛋白为样品,用该抗体组合进行胶体金层析检测,结果见下表6。
表6:本发明的重组抗体组合的胶体金免疫层析测试的检测限结果
稀释梯度(ng/mL) | 10 | 5 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 | 0.005 |
WT-NP | 1 | 1 | 3 | 5 | 6 | 6- | 7 | 7 |
Delta-NP | 1 | 2 | 4 | 5+ | 6+ | 6+ | 7+ | 8 |
Omicron-NP | 1 | 2 | 4 | 5+ | 6 | 6- | 7- | 8 |
HCoV-HKU1 NP | B | B | B | B | B | B | B | B |
由表6结果可知,若以7为阳性标准,该抗体组合(C24作为包被抗体,C45作为标记抗体)通过夹心法对野生型NP、Delta NP、以及Omicron NP的最低检测限均为10pg/mL。
本发明的抗体还对具有如下表7所示突变的一系列Omicron突变株BA2/BA5做了进一步检测,胶体金层析结果如下表8所示。
表7:一系列Omicron突变株的突变位点
表8:本发明的抗体针对Omicron突变株的检测限结果
突变株 | 包被抗体 | 标记抗体 | 最低检测限 |
HP811-37K | C1’ | HA811-31MB | 10pg |
HP811-38K | C2’ | HA811-22H | 10pg |
HP811-39K | C3’ | C13 | 10pg |
HP811-40K | C4’ | C45 | 10pg |
HP811-41K | C5’ | HA811-34MB | 10pg |
HP811-42K | C7 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-43K | C10 | C13 | 10pg |
HP811-44K | C11 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-45K | C13 | HA811-41MB | 10pg |
HP811-46K | C18 | C42 | 10pg |
HP811-47K | C20 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-48K | C24 | C1’ | 10pg |
HP811-49K | C28 | C29 | 10pg |
HP811-50K | C29 | C34 | 10pg |
HP811-51K | C34 | C7 | 10pg |
HP811-52K | C27 | C2’ | 10pg |
HP811-53K | C40 | C3’ | 10pg |
HP811-54K | C42 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-55K | C45 | HA811-41MB | 10pg |
HP811-56K | C1’ | C10 | 10pg |
HP811-57K | C2’ | C18 | 10pg |
HP811-58K | C3’ | C20 | 10pg |
HP811-59K | C4’ | C29 | 10pg |
HP811-60K | C5’ | C34 | 10pg |
HP811-61K | C7 | C24 | 10pg |
HP811-62K | C24 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-63K | C34 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-64K | C40 | HA811-31MB | 10pg |
HP811-65K | C45 | C5’ | 10pg |
注:HA811-31MB和HA811-41MB均为重链生物的重组鼠源抗-2019-nCoV NP抗体。
由表8可知,本发明的抗体组合通过胶体金层析检测对野生型病毒株和多个突变株的最低检测限可以达到10pg。
特异性检测:以核酸检测结果为对照,使用本发明的抗体制备的试剂条对510份健康人群的鼻咽拭子样品进行测试。结果显示,本发明的抗体制备的试剂条仅有2份假阳性结果,特异性为99.61%。
实施例6:荧光微球免疫层析测试
在将抗体分别包被NC膜(包被抗体)和时间分辨荧光微球(标记抗体),制备层析产品,步骤如下:
1.标记时间分辨荧光微球:将1mg微球加入一定量0.1M的MES缓冲液pH 6.5,混匀后20000rpm离心20min,去上清;加入一定体积的MES缓冲液pH 6.5,超声混匀,加入20μgEDC与40μg NHS,室温反应30min,每5min混匀一次,离心20000rpm,20min弃上清;加入一定体积的50mM pH=8.0的硼酸缓冲液,超声混匀,加入0.05-0.1mg的本发明的重组单克隆抗体,室温混匀反应2小时;加入1mL 100mM Tris-HCl pH8.5(含1% BSA)封闭2小时,20000rpm离心20min,弃上清;用0.1M pH8.5 Tris-HCl清洗2次,20000rpm离心20min,弃上清;保存:加入25mM MES(pH=7.4)0.5mL保存,用25mM MES(pH=7.4)(含1% BSA、0.1%Tween20)稀释50倍后冻干密封备用。
2.包被NC膜:将本发明的另一种单克隆抗体用10mM pH 7.4PBS(含2%蔗糖)稀释至终浓度1.0mg/mL,包被到赛多利斯140的NC膜上,37℃过夜后密封备用。
3.样品垫准备:使用10mM pH7.4 PBS处理样品垫,冻干备用。
4.组装和测试:将上述已标记有抗体的时间分辨荧光微球、已包被有抗体的NC膜、样品垫组装成免疫层析快速测试卡,加入80μL随机临床样本,室温放置15分钟后,使用免疫荧光仪检测。
抗体对SARS-CoV-2NP蛋白重组抗原的灵敏度的检测方法如下:
首先,检测了抗体组合(C24作为包被抗体,C45作为标记抗体)对(0.001-0.5ng/mL)的SARS-CoV-2NP蛋白重组抗原的检测,结果如下表9所示。表9示出该抗体组合对野生型和Omicron变异株蛋白重组抗原的灵敏度的检测结果:在抗原浓度为0.001ng/mL时,T/C值是不含NP蛋白的对照组T/C值(0.00147)的两倍以上,以此为标准,在荧光微球免疫层析体系中,重组抗体对野生型和Omicron变异株的SARS-CoV-2NP蛋白重组抗原的灵敏度可达0.001ng/mL(1皮克/毫升)。
表9:抗体组合对SARS-CoV-2NP蛋白重组抗原的灵敏度结果
本发明人还对其他的抗体组合进行了荧光微球免疫层析测试,这些抗体组合在荧光微球免疫层析平台检测的灵敏度均达到个位数皮克数量级(小于10pg/mL)。
由上述实施例可知,本发明的单克隆抗体与新型冠状病毒野生型、Omicron变种及Delta变种的NP蛋白均具有较强结合能力,且采用多种检测方式来检测新型冠状病毒,均呈现良好的广谱性和灵敏度。
Claims (10)
1.一种抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3;其中,VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19或SEQID NO:25所示;VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:26所示;VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27所示;VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28所示;VL CDR2的氨基酸序列由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29所示;VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30所示。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段,其中
1)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
2)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
3)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13-15所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
4)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
5)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28-30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
6)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
7)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
8)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
9)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3;
10)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
11)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
12)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
13)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:27所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:8所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
14)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
15)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
16)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;
17)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3;
18)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者
19)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,
1)所述重链可变区包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
2)所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
3)所述重链可变区包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;或者
4)所述重链可变区包括SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
5)所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
6)所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
7)所述重链可变区包括SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
8)所述重链可变区包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
9)所述重链可变区包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
10)所述重链可变区包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
11)所述重链可变区包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
12)所述重链可变区包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
13)所述重链可变区包括SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
14)所述重链可变区包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
15)所述重链可变区包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
16)所述重链可变区包括SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
17)所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
18)所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列;
19)所述重链可变区包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列。
4.一种核酸分子,其编码权利要求1-3中任一项所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体,其包含权利要求4所述的核酸分子;优选地,所述载体为质粒载体,例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA如pCDNA3.1、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
6.一种表达细胞,其包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体,优选地,所述表达细胞为哺乳动物细胞,例如选自中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
7.一种检测新型冠状病毒(SARS-Cov-2)、尤其是Delta变异株或Omicron变异株的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用权利要求1-3中任一项所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒、尤其是Delta变异株或Omicron变异株的试剂中的用途。
9.根据权利要求7所述的方法或权利要求8所述的用途,其中,所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的;优选地,所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法;ELISA如直接法、间接法、夹心法和竞争法。
10.一种用于检测新型冠状病毒(SARS-Cov-2)、尤其是Delta变异株或Omicron变异株的试剂盒,其包括权利要求1-3中任一项所述的抗新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
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