CN116143914B - 一种针对登革病毒ns1蛋白的抗体及其相关应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体、该抗体的制备方法、及其用于免疫检测的相关应用。本发明的单克隆抗DENV抗体靶向DENV的NS1结合蛋白，并且表现出靶向DENV NS1蛋白的高灵敏度和高特异性，由此能够满足DENV的临床检测需求。

Description

一种针对登革病毒NS1蛋白的抗体及其相关应用
技术领域
本发明涉及病毒的检测领域，具体地涉及一种单克隆抗登革病毒(DENV)抗体、其制备方法及其用于免疫检测的相关应用。
背景技术
登革病毒(DENV)是小型黄病毒，属于黄热病毒属，为单股正链RNA病毒。登革病毒通过节肢动物传播给哺乳动物，可导致人类隐性感染、登革热、登革出血热。全世界范围内每年发生的登革热感染例数约达5千万到1亿，死亡例数约达2万。典型的登革热临床表现为起病急骤、高热、头痛、肌肉痛、骨关节剧烈酸痛、部分患者出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。
目前诊断登革病毒感染主要有以下方法：病毒分离、病毒核酸检测、血清学检查及抗原分离。病毒分离虽然是诊断登革病毒的金标准，但是诊断周期较长，病毒核酸检测通常用RT-PCR，其诊断成本较高，实验条件要求严格，故以上两种检测均不适合于常规诊断。
登革基因组编码多种非结构(NS)蛋白，包括NS1蛋白，NS1蛋白是登革病毒中一种高度保守的非结构糖蛋白，在复制中发挥重要作用，且在登革热急性感染期即在病人血清中存在，在症状出现0-7天内，NS1检测可以达到病毒核酸检测的灵敏度，是良好早期诊断靶标。
然而，黄病毒属NS1蛋白之间存在广泛的相似性，可能会损害测试的特异性，比如与黄热病毒(YFV)、寨卡病毒(ZIKA)、西尼罗河病毒(WNV)、蜱穿脑炎病毒(TBEV)的NS1可能有交叉反应，接种乙型脑炎病毒疫苗的人群，也可能发生假阳性反应。
因此，需要一种特异性高、灵敏度高、且交叉反应少的登革病毒检测方法和产品。
发明内容
如前所述，本领域需要一种高特异性和高灵敏度的单克隆抗登革病毒抗体。
本发明人通过将纯化的DENV NS1蛋白作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出对登革病毒1-4型NS1蛋白均特异性结合但不与其他黄病毒NS1蛋白发生交叉反应的杂交瘤细胞株，获得了具有高灵敏度和高特异性的单克隆抗DENV抗体。由此，实现了本发明。
在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗登革病毒(DENV)抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一方面的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明第二方面的核酸分子。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
在第五方面，本发明提供了一种检测登革病毒(DENV)的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体的步骤。
在第六方面，本发明提供了第一方面的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体在制备用于检测登革病毒(DENV)的试剂中的用途。
在第七方面，本发明提供了一种用于检测登革病毒(DENV)的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体以及用于指导如何检测登革病毒(DENV)的说明书。
综上，本发明提供了一种单克隆抗登革病毒(DENV)抗体，其表现出针对DENV NS1蛋白的高灵敏度和高特异性，能够适用于多种免疫层析检测如荧光微球层析、胶体金层析、彩色微球层析；ELISA检测如直接法、间接法、夹心法和竞争法；化学发光法；电化学发光法等，进而能够用于纳克级甚至皮克级浓度的DENV检测，极大地提高了DENV检测与分析的灵敏度，由此满足DENV临床检测的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的单克隆抗体DN 3G8与登革病毒1-4型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)NS1蛋白的结合反应的结果图，以寨卡病毒(ZIKA)作为对照。
图2示出了本发明的重组抗体DN 3G8与登革病毒1-4型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)NS1蛋白的结合反应的结果图，以寨卡病毒(ZIKA)作为对照。
图3示出了本发明的单克隆抗体DN3G8对不同浓度的登革病毒1型(DENV1)NS1蛋白通过双夹心ELISA法进行的检测结果。
图4示出了本发明的单克隆抗体DN3G8与登革病毒1-4型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)、寨卡病毒(ZIKA)、黄热病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)的NS1蛋白通过双夹心ELISA法进行的检测结果。
图5示出了本发明的重组抗体DN3G8对登革病毒1-4型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)、寨卡病毒(ZIKA)、黄热病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)的NS1蛋白的胶体金层析检测结果。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009；38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定，Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDR的精确残基边界，这些CDR被称为Kabat CDR；Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性，但具有几乎相同的肽主链构象，这些亚部分被称为Chothia CDR，Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述，CDR边界定义可能不严格遵守上述系统，例如AbM定义。在本文中，可以根据这些系统中任何一种限定的CDR，尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子是免疫球蛋白，无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还包括具有抗体结构结合域的所有多肽或蛋白质，具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子，以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所使用的，术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同，也可以不完全相同。例如，可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达，由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体，也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达，由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如本文中所使用，术语“抗登革病毒抗体”、“抗DENV抗体”、“抗登革病毒NS1抗体”和“抗DENV NS1抗体”可以互换使用。
如前所述，本发明旨在提供一种具有高亲和力、高灵敏度和高特异性的单克隆抗DENV抗体。
在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗登革病毒(DENV)抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包括至少六个CDR。
在一些优选的实施方案中，所述抗体包括：
1)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，优选95％以上一致性的序列；
2)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，优选95％以上一致性的序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗体为选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、二硫键稳定的双功能抗体、scFv、scFv二聚体、多特异性抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体中的任意一种。
在又一个具体实施方案中，所述抗体可以为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何框架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸替换、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
在一个具体的实施方案中，所述抗体还包括恒定区序列，例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列，本领域技术人员能够基于需要进行选择，本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中，所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一个具体的实施方案中，所述抗体靶向登革病毒NS1结合蛋白。NS1蛋白是登革病毒中一种高度保守的非结构糖蛋白，在复制中发挥重要作用，且在登革热急性感染期即在病人血清中存在，在症状出现0-7天内，NS1检测可以达到病毒核酸检测的灵敏度，是良好早期诊断靶标。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体以小于100nM的EC50结合登革病毒NS1结合蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体以小于10nM的EC50结合登革病毒NS1结合蛋白。在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体以小于1nM的EC50结合登革病毒NS1结合蛋白，例如以0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合登革病毒NS1结合蛋白。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一方面的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体。
对于本领域技术人员而言，在知晓某种蛋白例如本发明的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体的氨基酸序列的情况下，确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外，为了通过重组方式获得单克隆抗体，可以将所述核酸分子克隆到载体中，并将该载体进一步导入表达细胞中，以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述载体可以为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个具体的实施方案中，所述载体为pTOPO载体。
在又一个具体的实施方案中，所述载体为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1载体。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述，本发明人将纯化的DENV NS1蛋白作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答，再利用杂交瘤技术获得能够分泌单克隆抗DENV单抗的杂交瘤细胞株，通过体外滚瓶培养的方法收取上清，获得大量抗DENV抗体，经筛选得到具有高亲和力、高灵敏度和高特异性的单克隆抗DENV抗体。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后，可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA，并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)，然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中，由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。另外，利用单克隆及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加框架区。
在一个实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.Gen Virol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub et al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。
在第五方面，本发明提供了一种检测登革病毒(DENV)的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体的步骤。
在一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法中的任意一种或几种来进行的。
在又一个具体的实施方案中，所述检测可以为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
在本发明中，所述单克隆抗DENV抗体可以作为包被抗体使用。例如单克隆抗DENV抗体与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
本发明的检测方法可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的检测方法或其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并根据具体情况进行优化。
不期望被理论束缚，本发明的所述单克隆抗DENV抗体也可以作为标记抗体使用。例如所述单克隆抗DENV抗体与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。
举例来说，当进行胶体金免疫层析测试时，可以用胶体金标记本发明的单克隆抗DENV抗体，另一种单克隆抗DENV抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到胶体金检测试纸。检测时，阳性样品中的待测物与胶体金标记抗DENV抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。
又例如，当进行基于彩色乳胶微球的免疫层析测试时，可以用本发明的单克隆抗DENV抗体标记的乳胶微球、包被有另一种单克隆抗DENV抗体的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫、吸水纸、聚酯板等按常规方式组装成免疫层析快速测试卡。检测时，阳性样品中的待测物与标记有单克隆抗DENV抗体的乳胶微球结合，在室温下发生凝集反应，因此放置一段时间后，可以通过肉眼观察并判定结果。
又例如，当进行荧光微球免疫层析测试时，可以用本发明的单克隆抗DENV抗体标记时间分辨荧光微球，用另一种单克隆抗DENV抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，与样品垫等组装成免疫层析快速测试卡。当检测时，样品中的待测物与结合垫中的荧光微球标记抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线T线上固定的另一种单克隆抗DENV抗体进一步结合形成双抗夹心的“三明治”型。层析结束后，用免疫荧光仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中待测物的含量。
因此，在一个具体的实施方案中，在所述检测中还使用另一种单克隆抗DENV抗体，并且本发明的单克隆抗DENV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用，所述另一种单克隆抗DENV抗体作为包被抗体和标记抗体中的另一种使用。
在本发明的上下文中，“另一种单克隆抗DENV抗体”是指能够与本发明的单克隆抗DENV抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明单克隆抗DENV抗体，也可以是现有技术的单克隆抗DENV抗体，例如重链生物的小鼠抗登革病毒单抗HA806-1M、HA806-2H，但不限于此。举例来说，在检测中，当选择本发明的单克隆抗DENV抗体作为标记抗体时，可以仍然选择本发明的单克隆抗DENV抗体作为包被抗体，但优选地选择另一种不同的单克隆抗DENV抗体作为包被抗体，例如，可以选择抗体HA806-1M作为包被抗体。值得注意的是，本发明的单克隆抗DENV抗体无论是作为包被抗体还是标记抗体，与另一种单克隆抗DENV抗体结合使用时，都能够以高灵敏度和高特异性的方式实现对登革病毒的检测。
因此，在本发明的检测方法中，标记抗体与包被抗体可以是相同的或不同的，并且优选是不同的。也就是说，当本发明的单克隆抗DENV抗体用于免疫层析以检测DENV病毒时，其在用作标记抗体以标记磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、胶体金等的同时，也可以用作包被抗体包被固相支持物如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
本发明人发现，无论是作为包被抗体还是标记抗体，本发明的单克隆抗DENV抗体均表现出极高的检测灵敏度，例如采用ELISA平台进行DENV病毒检测的灵敏度能够达到100pg/mL或更低的浓度，而采用胶体金免疫层析法进行DENV病毒检测的灵敏度能够达到了1ng/mL或更低的浓度。
在又一个具体的实施方案中，所述方法可以通过标记可显示信号指示剂实现对登革病毒NS1蛋白的检测。
在一个进一步具体的实施方案中，所述可显示信号指示剂可以选自但不限于胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任一种。
在一个优选的实施方案中，所述催化底物显色的酶可以选自但不限于辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱脂酶中的任一种。
在一个优选的实施方案中，所述荧光物质可以选自但不限于伞形酮，荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白中的任一种。
在一个优选的实施方案中，所述化学发光试剂可以为氨基苯二酰肼，但不限于此。
在一个优选的实施方案中，所述放射性同位素可以选自但不限于3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm中的任一种。
在第六方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗DENV抗体在制备用于检测登革病毒(DENV)的试剂中的用途。
在本发明的上下文中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。所述免疫层析法可以包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法等。本领域技术人员能够根据需要对检测进行选择，本发明对此并无特别限定。
在本发明的上下文中，所述检测可以是直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个具体的实施方案中，所述单克隆抗DENV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用。如前所述，所述单克隆抗DENV抗体在检测用途中可以作为包被抗体使用。例如单克隆抗DENV抗体与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。同样，所述单克隆抗DENV抗体也可以作为标记抗体使用。例如所述单克隆抗DENV抗体与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。
在又一个具体的实施方案中，在所述用途中，还可以使用另一种单克隆抗DENV抗体，并且本发明的单克隆DENV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用，所述另一种单克隆抗DENV抗体作为包被抗体和标记抗体中的另一种使用。所述“另一种单克隆抗DENV抗体”的定义如前所述，是指能够与本发明的单克隆抗DENV抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明的单克隆抗DENV抗体，也可以不是本发明的单克隆抗DENV抗体。
因此，在一个优选的实施方案中，在所述用途中，所述包被抗体和所述标记抗体是不同的单克隆抗DENV抗体。
本发明人研究发现，本发明的所述单克隆抗DENV抗体无论是作为包被抗体还是标记抗体，与另一种单克隆抗DENV抗体结合使用时，在用于免疫层析反应如基于胶体金的免疫层析反应中，均表现出高灵敏度和高特异性。
在第七方面，本发明提供了一种用于检测登革病毒(DENV)的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面的单克隆抗登革病毒(DENV)抗体以及用于指导如何检测登革病毒(DENV)的说明书。
本发明的试剂盒可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的试剂盒或其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并根据具体情况进行优化。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗DENV NS1蛋白单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫：将纯化出的登革病毒3型NS1蛋白(SEQ ID NO:9)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次，每次免疫间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将NS1蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将NS1蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的NS1蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合，充分混匀，在与PEG1500融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：取NS1蛋白，用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含2％BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下，检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔(NS1蛋白)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得一株稳定分泌抗NS1抗体的细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G8。
细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株用含15％血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养，当扩培至约4×107个/皿时，以800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml，转瓶培养。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到80％-90％时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml)，收取细胞悬液，以6000rpm高速离心20min，取上清，对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作DN 3G8抗体。
经微量分光光度计鉴定，DN 3G8单克隆抗体的浓度为5.73mg/mL。测定纯化后的单抗浓度，并分装(100μL/管，浓度为1mg/ml)，保存在4℃-8℃。
用SDS-PAGE电泳鉴定DN 3G8抗体，抗体具有约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析上述单克隆抗体，在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例2：单克隆抗体与NS1蛋白的结合能力
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释登革病毒1-4型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)的NS1蛋白，使其浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含2％ BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗NS1蛋白单克隆抗体DN 3G8进行梯度稀释，抗体起始浓度为5μg/ml,依次按三倍进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，通过软件分析上述ELISA结果，获得单克隆抗体DN 3G8对DENV NS1的结合活性。结果如图1和下表1所示，其中以寨卡病毒的NS1蛋白作为对照。
表1：单克隆抗体DN 3G8与四种登革病毒NS1蛋白的EC50值(nM)
单克隆抗体DN 3G8 DENV1 NS1 DENV1 NS2 DENV1 NS3 DENV1 NS4
EC50 0.42 0.64 0.7 0.65
从图1可以得出，DN 3G8抗体与登革病毒1-4型的NS1蛋白都能结合，但与寨卡病毒NS1不结合，表明本发明的单克隆抗体具有优异的特异性。从表1可以得出，本发明的单克隆抗体DN 3G8与登革病毒1-4型的NS1蛋白结合的EC50值分别0.42nM、0.64nM、0.7nM和0.65nM。
实施例3：抗体可变区序列的克隆和测序
从上述三株杂交瘤细胞株分离总RNA，通过反向转录制备cDNA，以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列，并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录；
b.RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNASynthesi s Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，用通用重链引物Mu Ig VH 5′-A和Mu IgG VH 3′-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，使用轻链引物Mu IgκVL5′-A和Mu IgκVL 3′-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA，将PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cl oning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
测序得到杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析，经分析，重链的互补决定区(SEQ ID NO:1-3)、轻链的互补决定区(SEQ ID NO:4-6)序列如下表2所示。
表2：本发明的单克隆抗体DN 3G8的重链和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
另外，该抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
实施例4：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株，并对其进行大规模培养纯化。
采用PCR方法，以反转录得到的cDNA为模板，扩增鼠单克隆抗体重轻链可变区基因(VH和VL)，并经测序确定序列。对抗体的VL和VH基因，用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20d后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)x106cells/ml接种于滚瓶中，1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体DN 3G8。
根据实施例2所述方法，检测重组抗体DN 3G8与登革病毒1-4型的NS1蛋白的结合能力，结果示于图2。由图2可以看出，重组抗体DN 3G8与登革病毒1-4型的NS1结合能力也很强，与寨卡病毒NS1不结合。
经酶标仪测定OD450nm值，通过软件分析上述ELISA结果，获得重组抗体DN 3G8抗体的EC50值，结果如下表3所示。从该表3可以得出，本发明的重组抗体DN 3G8与登革病毒1-4型的NS1蛋白结合的EC50值分别为0.40nM、0.55nM、0.64nM和0.66nM。
表3：重组抗体DN 3G8与四种登革病毒1-4型NS1蛋白的EC50值(nM)。
重组抗体DN 3G8 DENV1 NS1 DENV1 NS2 DENV1 NS3 DENV1 NS4
EC50 0.40 0.55 0.64 0.66
实施例5：双夹心ELSIA法验证单克隆抗体的灵敏性和特异性
本实施例中使用单克隆抗体DN 3G8为标记抗体，小鼠抗登革病毒NS1单抗HA806-1M(重链生物)为包被抗体。
a，以辣根过氧化物酶(HRP)标记DN 3G8抗体，得到DN 3G8-HRP偶合物。
b，采用双抗体夹心ELISA根据以下步骤验证DN 3G8-HRP的灵敏性：
包被：用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释HA806-1M，使其浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干；
封闭：每孔加入120μl封闭液(含2％ BSA的PBST)，37℃封闭2小时，甩干晾干后待用；
加样：分别加入待测样本和阳性对照、阴性对照各50μl，置于37℃孵育60min；
加酶：将DN 3G8-HRP按照一定浓度加入酶稀释液中，混匀。每孔加入50μl，置37℃温育30min；
洗涤：拍去孔板中液体，洗板5次；
显色：每孔加入显色剂TMB底物100μL，轻轻振荡混匀，室温避光显色30min；
终止：每孔50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应，轻轻振荡混匀；
读值：在酶标仪上，于450nm和630nm处读取OD值。
将登革病毒1-4型NS1蛋白(重组DENV1-NS1、DENV2-NS1、DENV3-NS1和DENV4-NS1)从100ng/mL开始倍比稀释若干梯度，待检测，同时稀释相同浓度的寨卡病毒NS1蛋白(ZIKANS1)作为对照。以ZIKA NS1的检测值作为标准，以检测值大于或等于相同ZIKA NS1浓度检测值的2.1倍的DENV NS1的最低浓度作为本方法检测该抗原的灵敏度。结果如图3和下表4所示。
表4：本发明的单克隆抗体对多种黄病毒科病毒的检测结果
由上表可知，当重组DENV1-NS1稀释至100pg/ml(即0.1ng/mL)时，A450/630nm＝0.2875，是相应浓度的ZIKANS1对照(A450/630nm＝0.0418)的6.88倍。当重组DENV2-NS1稀释至100pg/ml时，A450/630nm＝0.3265，是相应浓度的ZIKA NS1对照(A450/630＝0.0418)的7.81倍。当重组DENV3-NS1稀释至100pg/ml，A450/630nm＝0.2270，是相应浓度的ZIKA(A450/630nm＝0.0418)的5.43倍。当重组DENV4-NS1稀释至100pg/ml时，A450/630nm＝0.1897，是相应浓度的ZIKANS1对照(A450/630nm＝0.0418)的4.54倍。因此根据上述判断标准，本发明的单克隆抗体检测DENV-NS1的最低浓度为100pg/ml，保守地说，本发明的DN 3G8抗体对上述四种登革病毒1-4型NS1蛋白的检测灵敏度可高达100pg/mL(即0.1ng/mL)，显示出较高的灵敏度和良好的亲和力。
据文献报道，在登革病毒感染病人血清中的NS1蛋白的浓度在几纳克/毫升到几微克/毫升之间。因此，由本发明抗体构建的试剂盒检测灵敏度高，完全满足临床检测需求。
另外，本发明人还采用该夹心ELISA法检测了表5所示抗体组合的灵敏度和特异性。结果发现，不管是作为包被抗体还是标记抗体，不管是单克隆抗体还是重组抗体，本发明的抗体均显示出类似的灵敏度和特异性，对重组抗原的检测灵敏度能达到100pg/mL。
表5：夹心ELISA法中采用的抗体组合
标记抗体 包被抗体
抗体DN 3G8 抗体HA806-2H
抗体HA806-1M 抗体DN 3G8
抗体HA806-2H 抗体DN 3G8
还以上述相同方法对其他常见黄病毒科病毒——黄热病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、蜱穿脑炎病毒(TBEV)的NS1蛋白(浓度为1ng/mL)进行双夹心ELISA检测，以观察抗体与常见黄病毒NS1蛋白的交叉反应情况，结果同样见上表4和图4。由此可知，本发明的抗体与黄病毒科其他成员如乙脑病毒和丙型肝炎病毒无交叉反应，与其他RNA病毒如流感病毒也无交叉反应。由此可见，本发明的抗体具有良好的特异性。
实施例6：胶体金免疫层析测试
胶体金制备：在三角烧瓶中加入200ml超纯水，加热至沸腾，加入1ml 2％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加1ml 2％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续搅拌沸腾10分钟，自然冷却备用。
标记胶体金偶合物：取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入140μl的0.2MK2CO3调节pH至7.4，继续搅拌10秒；加入100μg抗登革病毒NS1重组抗体DN 3G8，继续搅拌5分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；12000g离心10分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB，150mM NaCl，0.2％BSA，0.1％TritonX-100，3％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1ml，作为抗登革病毒NS1抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫：将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司)，冻干，即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被：稀释抗登革病毒NS1抗体HA806-2H(重链生物，产品代码4C1H)至1.5mg/ml，制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，50℃干燥1小时，备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装：将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测：分别检测不同稀释度的病毒培养物和不同浓度的重组抗原的样本。具体地，将80μl待测样本滴加至样品垫处，室温放置15-30分钟，判定结果。根据显示条带颜色的深浅，可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较，选出最接近的颜色，将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性，结果分别如下表6和表7所示，以厂家A的登革病毒NS1抗原胶体金层析试剂作为对照。结果表明，与厂家A的登革病毒NS1抗原胶体金层析试剂相比，本发明采用的标记抗体和包被抗体表现出更高的灵敏度：样品为登革病毒1型和2型抗原时，比厂家A的产品灵敏度高3.5至4个(色卡)等级，样品为登革病毒3型抗原时，比厂家A的产品灵敏度高1.5至2.5个(色卡)等级，样品为登革病毒4型抗原时，比厂家A的产品灵敏度高0.5至2.5个(色卡)等级。
若以C7为阳性标准，重组抗体DN 3G8对登革病毒1-4型NS1的检测限达1ng/mL。
表6：基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/mL)
(+表示半个等级，比如C5+为显色介于C5和C4中间的条带)
表7：基于胶体金的免疫层析反应结果(病毒培养物稀释度)
特异性检测：以厂家A的登革病毒NS1抗原胶体金层析试剂为对照，使用本发明的抗体制备的试剂条对384份健康人群的血清样品进行测试。结果显示，本发明抗体制备的试剂条无假阳性结果，特异性为100％。
图5示出了当登革病毒1-4型、黄热病毒(YFV)、寨卡病毒(ZIKA)、西尼罗河病毒(WNV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、蜱穿脑炎病毒(TBEV)的重组抗原为100ng时的胶体金层析检测结果，同样显示出本发明抗体针对登革病毒的特异性。
本发明人还用胶体金免疫层析法测试了表8所示抗体组合的灵敏性和特异性。结果显示，不管是作为包被抗体还是标记抗体，不管是单克隆抗体还是重组抗体，本发明的抗体DN 3G8在本实施例中均显示出类似的灵敏度和特异性，对重组抗原的检测灵敏度能达到1ng/mL。
表8：胶体金免疫层析法中采用的抗体组合
标记抗体 包被抗体
抗体DN 3G8 抗体HA806-1M
抗体HA806-1M 抗体DN 3G8
抗体HA806-2H 抗体DN 3G8
序列表
SEQ ID NO:1(VH CDR1)：GYTFTRY
SEQ ID NO:2(VH CDR2)：LPSDGY
SEQ ID NO:3(VH CDR3)：LGVSPLAY
SEQ ID NO:4(VL CDR1)：RASQDIRNYLN
SEQ ID NO:5(VL CDR2)：YTSRLHS
SEQ ID NO:6(VL CDR3)：QQGDTLPWT
SEQ ID NO:7(VH)：
EVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYTFTRYWVKQRPGQGLEWIGNILPSDGYTNYNQKFKDKATLTVDRSSTTVYMQLSSLTSEDSAVYYCTRLGVSPLAYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:8(VL)：
DIQMTQTISSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWFQQQPDGAVKVLIFYTSRLHSGVLSRFSGSGSSADYSLTITNLAQEDAATHFCQQGDTLPWTFAGGTKLELK
SEQ ID NO:9(DENV3 NS1)：
DMGCVINWKGKELKCGSGIFVTNEVHTWTEQYKFQADSPKRLATAIAGAWENGVCG
IRSTTRMENLLWKQIANELNYILWENNIKLTVVVGDTLGVLEQGKRTLTPQPMELKYS
WKTWGKAKIVTAETQNSSFIIDGPNTPECPSASRAWNVWEVEDYGFGVFTTNIWLKL
REVYTQLCDHRLMSAAVKDERAVHADMGYWIESQKNGSWKLEKASLIEVKTCTWPK
SHTLWTNGVLESDMIIPKSLAGPISQHNYRPGYHTQTAGPWHLGKLELDFNYCEGTTV
VITESCGTRGPSLRTTTVSGKLIHEWCCRSCTLPPLRYMGEDGCWYGMEIRPISEKEEN
MVKSLVSA

Claims (26)

1.一种单克隆抗登革病毒（DENV）抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1-3的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 4-6的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述抗体为Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、scFv、scFv二聚体中的任一种。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述抗体为多特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述多特异性抗体是双功能抗体。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述双功能抗体是二硫键稳定的双功能抗体。
7.根据权利要求1或2所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述抗体还包含恒定区。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述恒定区为选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗DENV抗体，其中，所述恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人。
10.一种核酸分子，其编码权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗登革病毒（DENV）抗体。
11.一种载体，其包含权利要求10所述的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的载体，其中，所述载体为质粒载体。
13.根据权利要求12所述的载体，其中，所述质粒载体为pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
14.根据权利要求12所述的载体，其中，所述质粒载体为pCDNA3.1。
15.一种表达细胞，其包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11-14中任一项所述的载体。
16.根据权利要求15所述的表达细胞，其中，所述表达细胞为哺乳动物细胞。
17.根据权利要求16所述的表达细胞，其中，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、或人胚胎肾细胞。
18.一种检测登革病毒（DENV）的方法，所述方法用于非诊断目的，包括使用权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗登革病毒（DENV）抗体的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法（ELISA）、化学发光法、电化学发光法来进行的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述荧光微球免疫层析法是时间分辨荧光微球免疫层析法。
22.权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗登革病毒（DENV）抗体在制备用于检测登革病毒的试剂中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法（ELISA）、化学发光法、电化学发光法来进行的。
24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述荧光微球免疫层析法是时间分辨荧光微球免疫层析法。
26.一种用于检测登革病毒（DENV）的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗登革病毒（DENV）抗体以及用于指导如何检测登革病毒（DENV）的使用说明。
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重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备;江澜;汤云霞;尹悦;方丹云;周俊梅;江丽芳;;热带医学杂志(第06期);全文 *

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