CN117402249A - 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117402249A
CN117402249A CN202311189846.XA CN202311189846A CN117402249A CN 117402249 A CN117402249 A CN 117402249A CN 202311189846 A CN202311189846 A CN 202311189846A CN 117402249 A CN117402249 A CN 117402249A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
variable region
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311189846.XA
Other languages
English (en)
Inventor
林育佳
陈立
张荣华
袁克湖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd filed Critical Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Priority to CN202311189846.XA priority Critical patent/CN117402249A/zh
Publication of CN117402249A publication Critical patent/CN117402249A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • G01N2333/92—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/067—Pancreatitis or colitis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的抗胰脂肪酶单克隆抗体、包括该抗体的试剂盒、及其相关应用。本发明的抗胰脂肪酶单克隆抗体可以特异性结合胰脂肪酶，表现出针对胰脂肪酶的高灵敏度和高特异性，由此能够用于诊断犬胰腺炎和猫胰腺炎，为临床上犬和猫的胰腺炎、尤其是急性胰腺炎的诊断和检测提供快速、确切的诊断依据。

Description

抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及胰腺炎的检测领域，具体地涉及一种检测胰脂肪酶的单克隆抗体、其制备方法及其用于检测犬和猫的胰腺炎的相关应用。
背景技术
犬胰腺炎是目前宠物医院临床诊疗中一种常见的疾病，其临床症状缺乏特异性，常见症状包括精神差、呕吐、腹泻、食欲废绝、腹部触诊敏感、腹痛和心率高等，在临床症状上和胃肠道疾病有很多相似之处，临床诊断困难，容易出现误诊、漏诊。目前，兽医临床上对急性胰腺炎的诊断主要是依靠影像学检查和实验室诊断指标相结合的办法。然而，包括X光检查、超声检查和CT检查等在内的体检方法对犬胰腺炎的诊断特异性和敏感性都不强，无法单纯通过这些方法建立对犬急性胰腺炎的确切诊断。
胰腺炎与泄露到血液中的胰脂肪酶量的增加有关，因此已开发了许多基于催化反应的检测方法来分析血液中脂肪酶的存在。然而，这些方法对犬的胰腺炎缺乏敏感性和特异性。例如，基于脂肪酶活性的测定法如催化反应底物比色法不能区分胰腺来源的脂肪酶和其他来源的脂肪酶，并且特异性低。而针对胰脂肪酶的测定相较于传统的脂肪酶活性测定法，具有更高的特异性，被认为是目前诊断犬胰腺炎的敏感性和特异性最高的血清检验指标。因此，基于胰脂肪酶免疫反应性的测定是目前犬急性胰腺炎最具前景的检测方向。然而基于胰脂肪酶的测定法需要特异的抗体，市面上缺乏此类抗体。
因此，本领域需要一种简便、快速、灵敏、特异检测胰脂肪酶的方法和试剂。
发明内容
本发明人用重组的犬胰脂肪酶(重链生物HP225-2)免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出胰脂肪酶特异结合的杂交瘤细胞株，构建重组抗体，获得重组抗胰脂肪酶抗体。由此，实现了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQID NO:19所示；VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14或SEQID NO:20所示；VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15或SEQID NO:21所示；VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16或SEQID NO:22所示；VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17或SEQID NO:23所示；VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18或SEQID NO:24所示。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含第二方面所述的核酸分子。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体。
在第五方面，本发明提供了第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断胰腺炎的诊断剂中的用途。
在第六方面，本发明提供了一种用于诊断胰腺炎的试剂盒，其包括第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
综上，本发明提供了一种新的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其表现出结合胰脂肪酶的高灵敏度和高特异性，采用本发明抗体的免疫层析方法的最低检测限可以达到1ng/mL，由此能够解决现有技术的测定方法在检测犬胰腺炎和猫胰腺炎时缺乏敏感性和特异性的问题，为临床上对犬和猫的胰腺炎、尤其是急性胰腺炎进行快速诊断和检测提供了一种简便、高灵敏度且高效价的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的四种单克隆抗体(PL1-PL4)与犬胰脂肪酶(Canine)、猫胰脂肪酶(Feline)以及淀粉酶(作为对照)的结合反应结果。
图2示出了本发明的重组单克隆抗体(PL5-PL12)与犬胰脂肪酶(Canine)、猫胰脂肪酶(Feline)以及淀粉酶(作为对照)的结合反应结果。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的要素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的要素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research2009；38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定，Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDR的精确残基边界，这些CDR被称为Kabat CDR；Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性，但具有几乎相同的肽主链构象，这些亚部分被称为Chothia CDR，Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述，CDR边界定义可能不严格遵守上述系统，例如AbM定义。在本文中，可以根据这些系统中任何一种限定CDR，尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。根据Chothia编号系统，抗体的VH CDR1位于第26至32位，VH CDR2位于第52至57位，VH CDR3位于第99至108位，而VL CDR1位于第24至39位，VL CDR2位于第55至61位，并且VL CDR3位于第94至102位。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外的一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子可以是免疫球蛋白，无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还可以包括具有抗体结合结构域的所有多肽或蛋白质，具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子，以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用Ala或A表示，甘氨酸可用Gly或G表示，缬氨酸可用Val或V表示，亮氨酸可用Leu或L表示，异亮氨酸可用Ile或I表示，脯氨酸可用Pro或P表示，苯丙氨酸可用Phe或F表示，酪氨酸可用Tyr或Y表示，色氨酸可用Trp或W表示，丝氨酸可用Ser或S表示，苏氨酸可用Thr或T表示，半胱氨酸可用Cys或C表示，蛋氨酸可用Met或M表示，天冬酰胺可用Asn或N，谷氨酰胺可用Gln或Q表示，天冬氨酸可用Asp或D表示，谷氨酸可用Glu或E表示，赖氨酸可用Lys或K表示，精氨酸可用Arg或R表示，组氨酸可用His或H表示。
如本文所使用的，术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同，也可以不完全相同。例如，可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达，由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体，也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达，由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指来自抗体的能够结合抗原的片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合活性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段的示例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。其中，“Fab片段”由一条轻链、一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(包含VH结构域、CH1结构域、以及CH1和CH2结构域之间的区域)；由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
在本发明中，还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中，一些位点仅仅涉及单独的一种碱基，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种，而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合，在这种情况下，这些碱基被称为彼此的简并碱基，其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示，其中，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。
本文中使用的术语序列“同一性”、“一致性”或者“同源性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列同一性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列同一性(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性的方法，但是术语“同一性”是技术人员公知的在肽或蛋白中适合于保守型氨基酸置换的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4thEdition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
如前所述，本发明旨在提供一种具有高灵敏度、高特异性的抗胰脂肪酶单克隆抗体。如前所述，本发明人用犬胰脂肪酶免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出能特异结合胰脂肪酶的杂交瘤细胞株，分别命名为PL1、PL2、PL3和PL4。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQID NO:19所示；VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14或SEQID NO:20所示；VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15或SEQID NO:21所示；VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16或SEQID NO:22所示；VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17或SEQID NO:23所示；VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18或SEQID NO:24所示。
在一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13-15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个具体的实施方案中，所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
作为一个示例，各构架区(FR)可以具有如下序列：
HFR1(重链构架区1)：QLQQPGAELVRPGASVKLSCKAS
HFR2(重链构架区2)：WIIWVKQRPGQGLEWIGNI
HFR3(重链构架区3)：TNYNQRFRGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCA
HFR4(重链构架区4)：WGQGTLVTVS
LFR1(轻链构架区1)：IVLTQSPASLSVATGEKVTIRC
LFR2(轻链构架区2)：WYQQKPGQPPKLLIY
LFR3(轻链构架区3)：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISPMEEDDTAMYFC
LFR4(轻链构架区4)：FGGGTKLEI。
在一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗体还包括恒定区序列，例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列，本领域技术人员能够基于需要进行选择，本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中，所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一些实施方案中，所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
对于本领域技术人员而言，在知晓某种蛋白例如本发明的抗胰脂肪酶单克隆抗体的氨基酸序列的情况下，确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外，为了通过重组方式获得单克隆抗体，可以将所述核酸分子克隆到载体中，并将该载体进一步导入表达细胞中，以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述载体可以为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个具体的实施方案中，所述载体可以为pTOPO载体。
在又一个具体的实施方案中，所述载体可以为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述，本发明人以犬胰脂肪酶免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出能够特异结合胰脂肪酶的杂交瘤细胞株，分别命名为PL1、PL2、PL3和PL4。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后，可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA，并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)，然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中，由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。利用单克隆抗体及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。
在一个具体的实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.Gen Virol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub et al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。
在第五方面，本发明提供了第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断胰腺炎的诊断剂中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段用于检测来自受试者的样本中的胰脂肪酶的水平。
在一个具体的实施方案中，所述受试者是犬和猫。
如前所述，胰脂肪酶是检测犬和猫的胰腺炎的特异性指标。在犬胰腺炎诊断中，通常的标准是：当胰脂肪酶含量在200ng/mL以下时，可基本排除犬急性胰腺炎的可能；当胰脂肪酶含量在200-400ng/mL范围并伴随胰腺炎症状时，应怀疑犬只患有胰腺炎；当胰脂肪酶含量大于400ng/mL时，则认为犬只患有胰腺炎的概率大于83％。而在猫胰腺炎诊断中，通常的标准是：当胰脂肪酶含量3.5ng/mL以下，可基本排除猫急性胰腺炎的可能；当胰脂肪酶含量在3.5-5.4ng/mL范围并伴随胰腺炎症状时，应怀疑猫患有胰腺炎；当胰脂肪酶含量大于5.4ng/mL时，则认为猫大概率患有胰腺炎。因此，通过本发明的抗胰脂肪酶单克隆抗体定量检测得到的胰脂肪酶含量可以用于猫和犬的胰腺炎、尤其是急性胰腺炎的诊断和风险排查。
在一个具体的实施方案中，所述胰腺炎是犬胰腺炎或猫胰腺炎。
在一个更具体的实施方案中，所述胰腺炎是犬急性胰腺炎或猫急性胰腺炎。
在又一个具体的实施方案中，所述检测可以是定量检测。
在又一个具体的实施方案中，所述胰脂肪酶来源于受试者的样本，例如血液、血清、血浆。
在又一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。
在一个优选的实施方案中，所述检测可以为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
在本发明中，所述抗胰脂肪酶单克隆抗体可以作为标记抗体使用。例如，抗胰脂肪酶抗体可以与纳米颗粒、磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。抗胰脂肪酶单克隆抗体也可以作为包被抗体使用。例如，抗胰脂肪酶单克隆抗体可以与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如纳米颗粒、磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
举例来说，当进行胶体金免疫层析测试时，可以用胶体金标记本发明的一种抗胰脂肪酶单克隆抗体(如抗体PL1，但不限于此)，本发明(如抗体PL9、PL11等，但不限于此)或现有技术的另一种抗胰脂肪酶单克隆抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到胶体金检测试纸。检测时，阳性样品中的待测物与胶体金标记的抗甲胰脂肪酶单克隆抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。
在一个示例性实施方案中，通过上述夹心法对犬胰脂肪酶的最低检测限至少为10ng/mL。但是，本领域技术人员会知道，通过调整包被抗体和标记抗体浓度及比例、多种抗体组合使用、调整膜或缓冲液成分等方法，可以调整胶体金免疫层析的灵敏度，进而对检出范围进行调整。例如，当采用合适的抗体组合如本发明的PL6/PL4或PL11/PL10时，最低检测限可以达到1ng/mL，由此可以实现对猫胰脂肪酶的检测。另外，也可以通过灵敏度更高的免疫层析方法，如彩色乳胶微球标记、化学发光法、荧光微球标记、时间分辨荧光微球标记等，从而对检出范围进行调整，由此既可以提高灵敏度，也可以降低灵敏度，使检出范围更大或更小。
在第六方面，本发明提供了一种用于诊断胰腺炎的试剂盒，其包括第一方面所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
在一个具体的实施方案中，所述诊断是通过使用所述抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段检测来自受试者的样本中的胰脂肪酶来进行的。
在又一个具体的实施方案中，所述检测可以是定量检测。
在一个进一步具体的实施方案中，所述受试者的样本可以是来自犬或猫的血液、血清或血浆样本。
根据本发明的试剂盒和其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并进行优化。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗胰脂肪酶单克隆抗体的制备
免疫接种：将重组犬胰脂肪酶(重链生物HP225-2，SEQ ID NO:60：MLLIWTLSLLLGAVVGKEVCFPRLGCFSDDSPWAGIVERPLKILPWAPKDVNTRLLLYTNENPDNFQELTADPSIITSSSFKTDRKTRFIIHGFIDKGEESWLANMCKKMFVVESVNCICVDWKSGSRTGYTQASQNIRIVGAEVAYFVEVLQSAFGYSPSDVHIIGHSLGAHAAGEAGRRLNGTAGRITGLDPAEPCFEGTPELVRLDPSDAQFVDVIHTDAAPIIPNMGFGMSQTVGHLDFFPNGGKEMPGCQKNILSQIVDIDGIWEGTRDFVACNHLRSYKYYSDSILNPDGFAGFPCASYNVFTANKCFPCPSEGCPQMGHYADRFPGKTDKVNQIFYLDTGDASNFARWRYKVAVTLSGKKVTGHVLVSLFGNKGNSKQYEIFKGTLQPESTHSNEFDSDVEVGDVQKVKFVWYNNVINPTLPRVGASKITVERNDGKIFNFCSKETVREDILLTLTPC)作为免疫原以用于免疫接种小鼠。具体地，选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。将小鼠免疫接种4次，每次免疫接种间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将重组犬胰脂肪酶与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将重组犬胰脂肪酶与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫接种后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫接种小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1：10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的重组犬胰脂肪酶经腹腔注射以加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫接种小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1：5的比例融合，充分混匀，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：将重组犬胰脂肪酶用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含2％BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔分别加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
利用酶标仪在450nm波长下检测所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm值的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取出阳性值高的单克隆稳定株。最后获得四株稳定分泌抗重组犬胰脂肪酶抗体的细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株PL1、PL2、PL3、PL4。
细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株用含15％血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养，当扩培至约4×107个/皿时，以800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml，转瓶培养。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到80％-90％时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml)，收取细胞悬液，以6000rpm高速离心20min，取上清，对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由杂交瘤细胞制备的单克隆抗体分别记作PL1、PL2、PL3、PL4抗体。经微量分光光度计鉴定，上述单克隆抗体的浓度均大于4mg/mL。对各单克隆抗体进行分装，于4℃-8℃保存。
用SDS-PAGE电泳鉴定上述单克隆抗体，抗体具有约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析单克隆抗体，在保证待测样品中所有组分均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例2：抗体与胰脂肪酶的结合能力
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释重组犬胰脂肪酶，使其浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含2％ BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗重组犬胰脂肪酶单克隆抗体进行梯度稀释，抗体起始浓度为5μg/mL，依次按三倍进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：15000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。利用酶标仪测定OD450nm值，并通过软件分析上述ELISA结果，获得单克隆抗体的EC50值。
使用酶标仪测定OD450nm值的结果示于图1。从图1可以得出，这四种单克隆抗体均能够结合来自猫和犬的胰脂肪酶，但不结合淀粉酶(对照)，表现出良好的特异性。进一步通过软件分析上述ELISA结果，获得单克隆抗体与这两种胰脂肪酶的EC50值，结果示于下表1。
表1：本发明的单克隆抗体与胰脂肪酶的EC50(nM)值
单克隆抗体 犬胰脂肪酶 猫胰脂肪酶
PL1 0.258 0.556
PL2 0.135 0.347
PL3 0.264 0.121
PL4 0.254 0.272
从表1中给出的数据可以看出，所获得的四种单克隆抗体与胰脂肪酶的亲和力均在nM级，其中单克隆抗体PL2表现出与犬胰脂肪酶最高的亲和力，而PL3表现出与猫胰脂肪酶最高的亲和力。
实施例3：抗体可变区序列的克隆和测序
从上述杂交瘤细胞株分离总RNA，通过反向转录制备cDNA，从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列，并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录。
b.RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNASynthesis Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用。
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，用通用重链引物Mu Ig VH 5′-A和Mu IgG VH 3′-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，使用轻链引物Mu IgκVL 5′-A和Mu IgκVL 3′-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA。然后，将PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到的杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析，重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表2所示(依据Chothia编号系统)。
表2：抗体的重链和轻链的互补决定区序列
实施例4：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株，并大规模培养纯化。
对于编码下表3中列出抗体VL和VH的基因，用分子克隆的方法构建重组抗体的真核表达质粒。将该真核表达质粒电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μMMSX)中培养20d后取上清进行ELISA检测(用HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。重组抗体的重链和轻链可变区的具体序列对应关系如下表3所示。
表3：重组抗体的重链可变区和轻链可变区的序列
/>
/>
/>
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中，1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体。
根据实施例2所述方法，检测重组抗体与犬和猫胰脂肪酶的结合能力，重组抗体PL5-PL12与这两种胰脂肪酶的结合数据如图2所示。由图2可知，重组抗体PL5-PL12与这两种胰脂肪酶结合能力也很强，表现出很好的亲和力，并且与淀粉酶(对照)不结合，表现出良好的特异性。除PL5-PL12之外的其他重组抗体也同样表现针对这两种胰脂肪酶的良好的亲和力和特异性(未示出)。
进一步，将所得OD450nm值通过软件进行分析，以获得各重组抗体的EC50值，分别如下表4所示。
表4：本发明的重组单克隆抗体与胰脂肪酶的EC50值(nM)
抗体 犬胰脂肪酶 猫胰脂肪酶 抗体 犬胰脂肪酶 猫胰脂肪酶
PL1’ 0.255 0.552 PL11 0.182 0.182
PL2’ 0.132 0.341 PL12 0.327 0.168
PL3’ 0.258 0.123 PL13 0.220 0.353
PL4’ 0.253 0.268 PL14 0.246 0.248
PL5 0.271 0.329 PL15 0.367 0.246
PL6 0.152 0.290 PL16 0.329 0.255
PL7 0.169 0.130 PL17 0.182 0.236
PL8 0.261 0.152 PL18 0.242 0.201
PL9 0.140 0.278 PL19 0.381 0.179
PL10 0.178 0.210 PL20 0.415 0.203
从表4中给出的结果可以看出，所有经重组获得的单克隆抗体与胰脂肪酶的亲和力也均在nM级，并且其中经重组获得的PL1’、PL2’、PL3’和PL4’抗体与此前经杂交瘤细胞产生的PL1、PL2、PL3和PL4抗体具有相当的EC50值。
实施例5：胶体金免疫层析测试
胶体金制备：在三角烧瓶中加入100mL超纯水，加热至沸腾，加入2mL2％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加1mL 2％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续搅拌沸腾10分钟，自然冷却备用。
标记胶体金偶合物：取10mL上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入120μL的0.2MK2CO3调节pH至7.0，继续搅拌10秒；加入100μg标记抗体(抗体A)，继续搅拌5分钟；加入0.1mL10％BSA，继续搅拌5分钟；12000g离心10分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB，150mM NaCl，0.2％BSA，0.1％TritonX-100，3％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1mL，作为抗胰脂肪酶单克隆抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫：将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司)，冻干，即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被：稀释包被抗体(抗体B)至1mg/mL，制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，50℃干燥1小时，备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装：将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测：分别检测不同浓度的重组抗原的样本。具体地，将80μL待测样本滴加至样品垫处，室温放置5-15分钟，判定结果。根据显示条带颜色的深浅，可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较，选出最接近的颜色，将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性，以淀粉酶蛋白作为对照，结果如下表5所示(B表示空白，即不结合)。
表5：本发明的重组抗体组合的胶体金免疫层析测试结果
若以7为阳性标准，上表中抗体组合(B为包被抗体，A为标记抗体)通过夹心法对犬胰脂肪酶的最低检测限至少为10ng/mL。当抗体组合为PL6/PL4或PL11/PL10时，最低检测限可以达到1ng/mL，由此可以实现对猫胰脂肪酶的检测。
进一步在胶体金免疫层析平台上以四个抗体组合对犬临床血清进行了测试，测试了19例阳性样本及20例阴性样本，结果如下表6所示。
表6：本发明的重组抗体组合对犬临床血清的胶体金免疫层析测试结果
由上表6可以看出，在胶体金层析平台上，四个抗体组合对犬临床血清的测试结果与血清情况一致，这证实了本发明的抗体组合能够通过对临床血清的检测实现对犬胰脂肪酶的诊断。

Claims (10)

1.一种抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19所示；VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20所示；VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21所示；VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22所示；VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23所示；VLCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
1)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
2)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
3)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13-15所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
4)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
5)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
6)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；
7)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
8)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
9)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
10)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
11)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
12)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
13)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
14)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
15)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
16)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
17)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
18)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
19)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；或
20)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
1)所述重链可变区包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
2)所述重链可变区包括SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
3)所述重链可变区包括SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
4)所述重链可变区包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
5)所述重链可变区包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
6)所述重链可变区包括SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
7)所述重链可变区包括SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
8)所述重链可变区包括SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
9)所述重链可变区包括SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
10)所述重链可变区包括SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
11)所述重链可变区包括SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
12)所述重链可变区包括SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
13)所述重链可变区包括SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
14)所述重链可变区包括SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
15)所述重链可变区包括SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
16)所述重链可变区包括SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
17)所述重链可变区包括SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
18)所述重链可变区包括SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
19)所述重链可变区包括SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
20)所述重链可变区包括SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
4.一种核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述载体为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA如pCDNA3.1、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
6.一种表达细胞，其包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体，优选地，所述表达细胞为哺乳动物细胞，例如选自中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断胰腺炎的诊断剂中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述胰腺炎是犬胰腺炎或猫胰腺炎，例如犬急性胰腺炎、猫急性胰腺炎。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的；优选地，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法；ELISA如直接法、间接法、夹心法和竞争法。
10.一种用于诊断胰腺炎、尤其是犬胰腺炎和猫胰腺炎的试剂盒，其包括权利要求1-3中任一项所述的抗胰脂肪酶单克隆抗体或其抗原结合片段以及使用说明。
CN202311189846.XA 2023-09-14 2023-09-14 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用 Pending CN117402249A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311189846.XA CN117402249A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311189846.XA CN117402249A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117402249A true CN117402249A (zh) 2024-01-16

Family

ID=89496963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311189846.XA Pending CN117402249A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117402249A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115838419B (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
WO2017206773A1 (zh) 一种发掘特异性功能抗体的方法
CN115724958B (zh) 抗诺如病毒gⅱ基因组衣壳蛋白vp1的单克隆抗体及其应用
CN109336973B (zh) 抗转铁蛋白抗体及其用途
WO2020103691A1 (zh) 针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用
CN115925909B (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
CN115960216B (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
JP7307158B2 (ja) 抗ヒト心筋型トロポニンｉ抗体及びその応用
CN117402249A (zh) 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用
CN113683692B (zh) SARS-CoV-2 N蛋白抗体及其应用
CN116789807B (zh) 抗腺病毒单克隆抗体及其应用
CN113004405B (zh) 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白
CN117003880B (zh) 抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用
WO2024067151A1 (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
CN116143914B (zh) 一种针对登革病毒ns1蛋白的抗体及其相关应用
CN117467005A (zh) 抗疟原虫单克隆抗体及其应用
CN117024585A (zh) 抗甲状腺球蛋白单克隆抗体及其应用
CN116396392B (zh) 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用
CN117551189A (zh) 抗寨卡病毒单克隆抗体及其应用
CN115825415B (zh) 阻断剂和体外免疫诊断产品、应用
CN116082500B (zh) 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用
CN116023483B (zh) 抗SARS-CoV-2抗体及其应用
CN117106073A (zh) 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用
CN116693664A (zh) 抗腺病毒单克隆抗体及其应用
CN117466995B (zh) 与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination