CN116589564B - 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 - Google Patents
抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116589564B CN116589564B CN202310329886.3A CN202310329886A CN116589564B CN 116589564 B CN116589564 B CN 116589564B CN 202310329886 A CN202310329886 A CN 202310329886A CN 116589564 B CN116589564 B CN 116589564B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- aav5
- detection
- seq
- aav
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 title claims abstract description 78
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 54
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 21
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 101710151768 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 208000026552 Severe hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700013125 Zolgensma Proteins 0.000 description 1
- -1 acridine ester Chemical class 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229950009805 onasemnogene abeparvovec Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001147420 ssDNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种抗AAV5抗体,以及包含所述抗体的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。具体地,本发明提供了一种高特异性结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体的单克隆抗体,其不与变性解聚的VP1、VP2和/或VP3亚基结合,且不与AAV2,6,8,9血清型结合。基于该抗体制备的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒具有4E+09capsids/ml~6.25E+07capsids/ml的线性范围,灵敏度达到3E+07capsids/ml,且具有较好的精密度,可应用于基因治疗的AAV5载体滴度测定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种抗AAV5抗体,以及包含所述抗体的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。
背景技术
腺相关病毒(AAV)作为基因治疗递送载体具有较高的安全性和临床价值,已成为体内基因导入的主要平台之一。美国FDA于2017年批准了基因治疗药物Luxturna用于治疗遗传性视网膜疾病,2019年批准了Zolgensma用于治疗脊髓性肌萎缩症,两款药物分别采用AAV2,AAV9载体进行基因递送。2022年欧盟批准上市了两款AAV基因治疗药物,Upstaza治疗AADC缺乏症,Roctavian治疗重度A型血友病成人患者,分别采用AAV2,AAV5载体进行基因递送。
国际病毒学会将AAV划分为两个种属,其中AAV1-4和AAV6-13属于腺相关依赖性病毒A,AAV5属于腺相关依赖性病毒B[1]。AAV病毒粒子由60个VP亚基组成,组装衣壳的三个结构蛋白VP1:VP2:VP3的比例为1:1:10。VP1,2,3只在蛋白的N端序列上有差异,VP1,2都含有VP3的氨基酸序列,同时N端还有额外的其它氨基酸序列。AAV的序列和结构决定了不同血清型AAV与宿主细胞受体结合作用的差异,导致不同血清型的AAV对不同的组织和细胞感染效率不同,具有组织趋向性,AAV5对肺,眼,神经系统表现出一定亲和性。AAV5与其它血清型的衣壳蛋白同源性低,约为55%[2,3]。
对于治疗型AAV载体,准确的滴度测定是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分,稳定可靠的滴度才能保证准确给药剂量。AAV的物理滴度一般是指基因组滴度或者衣壳滴度。基因组滴度常采用qPCR、Digital droplet PCR(ddPCR)检测,qPCR由于样品制备,引物设计,PCR效率等差异,不同批次不同实验室会产生实验偏差,ddPCR虽然能克服一些qPCR的局限,不同样品处理方法仍然会产生偏差。衣壳滴度主要是通过ELISA方法进行检测,ELISA方法具有可靠及重现性好的优点。对于应用于基因治疗的不同血清型的AAV载体,尤其是经过序列结构优化改造的AAV载体,都有需求开发出特异性抗体作为捕获和检测抗体,以ELISA方法测定AAV滴度[4]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体上衣壳蛋白构象表位的抗体,以及使用所述抗AAV5抗体制备得到具有高灵敏度、高精密度的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。
本发明的第一方面,提供了一种抗AAV5抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以下3个CDR:
SEQ ID NO:3所示的H-CDR1;
SEQ ID NO:4所示的H-CDR2;
SEQ ID NO:5所示的H-CDR3;以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR:
SEQ ID NO:6所示的L-CDR1;
序列如LAS所示的L-CDR2;
SEQ ID NO:7所示的L-CDR3。
在另一优选例中,所述重链可变区还包含鼠源的FR区,以及所述的轻链可变区还包含鼠源的FR区。
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或与其具有至少90%(优选地至少95%,96%,97%,98%,99%)序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或与其具有至少90%(优选地至少95%,96%,97%,98%,99%)序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在另一优选例中,所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中,所述重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的或人源的。
在另一优选例中,所述重链恒定区来源于小鼠重链IgG1,和/或所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。
在另一优选例中,所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗体包括:单克隆抗体、多克隆抗体、双链抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2抗体。
在另一优选例中,所述抗体为双链抗体,其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的重链,以及氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的轻链。
在另一优选例中,所述抗体包括动物源抗体(例如不同亚型的鼠源抗体)、嵌合抗体(例如人-鼠嵌合抗体)。
在另一优选例中,所述抗体仅特异性结合完整的AAV5病毒颗粒,不结合变性解聚的VP1、VP2和/或VP3亚基。
本发明的第二方面,提供了一种重组抗体,所述的重组抗体具有:
(i)如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段的序列;以及
(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或纯化、检测的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列选自下组:FLAG、Myc、His标签等。
本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸分子,其编码选自下组的多肽:
(1)如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段;或
(2)如本发明第二方面所述的重组抗体。
在另一优选例中,所述多核苷酸分子包含如SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
本发明的第四方面,提供了一种表达载体,其含有本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中,所述载体包括真核细胞表达载体、原核细胞表达载体。
本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,其含有如本发明第四方面所述的载体,或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中,所述宿主细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)、原核细胞。
本发明的第六方面,提供了一种抗体偶联物,所述抗体偶联物包含:
(a)如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段或如本发明第二方面所述的重组抗体;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物或酶。
在另一优选例中,所述偶联部分选自:荧光或发光标记物、能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒等。
在另一优选例中,所述偶联部分为生物素。
在另一优选例中,所述抗体偶联物为生物素标记的抗AAV5抗体。
本发明的第七方面,提供了如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物在制备用于检测AAV5病毒颗粒/AAV5载体的检测试剂、检测板或试剂盒中的用途。
在另一优选例中,所述检测试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的存在(定性检测),和/或用于测定样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的滴度(定量检测)。
本发明的第八方面,提供了一种检测试剂,所述检测试剂包括:如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物;以及检测学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的第九方面,提供了一种检测板,所述检测板的检测表面上包被有如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物。
本发明的第十方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物作为抗体试剂。
在另一优选例中,所述试剂盒为ELISA试剂盒,其包含:
(C1)如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体;
(C2)如本发明第六方面所述的抗体偶联物(优选地,所述抗体偶联物为生物素标记的抗AAV5抗体)作为检测抗体。
在另一优选例中,所述ELISA试剂盒还包含ELISA检测所需的其他试剂,包括(但不限于):
ELISA检测所需洗液、分析缓冲液、封闭液、显色液、显色终止液、AAV5标准品或其组合。
在另一优选例中,所述试剂盒还包含一说明书,所述说明书注明所述试剂盒用于检测样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的存在(定性检测),和/或用于测定样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的滴度(定量检测)。
本发明的第十一方面,提供了一种检测样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的方法,所述方法包括步骤:(1)将样品与本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物接触并结合;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在AAV5病毒颗粒/AAV5载体。
在另一优选例中,所述方法为体外检测方法。
在另一优选例中,所述方法为非诊断性和非治疗性的。
本发明的第十二方面,提供了一种测定样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体滴度的方法,所述方法为ELISA法,其包括以下步骤:
(S1)将捕获抗体包被于ELISA板的检测孔中,所述捕获抗体为如本发明第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段;
(S2)将待测样品或梯度稀释的标准品加入到(S1)的ELISA板的检测孔中,于37±2℃恒温震荡反应15-60分钟,较佳地,20-30分钟;
(S3)洗板后,在检测孔中加入检测抗体,所述检测抗体为如本发明第六方面所述的抗体偶联物,于37±2℃恒温震荡反应15-60分钟,较佳地,20-30分钟,从而形成捕获抗体-AAV5病毒颗粒/AAV5载体-检测抗体复合物;
(S4)洗板后,检测各检测孔中所述捕获抗体-AAV5病毒颗粒-检测抗体复合物的形成。
在另一优选例中,在步骤(S3)中,所述检测抗体为生物素标记的抗AAV5抗体,在检测孔中形成捕获抗AAV5抗体-AAV5病毒颗粒/AAV5载体-生物素标记的抗AAV5抗体复合物;
进一步地,在步骤(S4)中,具体包括以下步骤:
(S4-a)洗板后,在检测孔中加入链霉亲和素过氧化物酶(SA-HRP)溶液,于37±2℃恒温震荡反应15-60分钟,较佳地20-30分钟;
(S4-b)洗板后,加入TMB显色液,避光显色后加入终止液终止反应,立即使用酶标仪读取450nm波长的吸光度值。
在另一优选例中,所述方法中的洗板次数为3-4次。
在另一优选例中,步骤(S1)中捕获抗体的工作浓度为3-10ug/ml,较佳地5ug/ml。
在另一优选例中,步骤(S3)中检测抗体的工作浓度为0.5-2ug/ml,较佳地0.6ug/ml。
在另一优选例中,所述样品为制备的治疗型基因递送AAV5载体。
应理解,在本发明范围内,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了AAV5杂交瘤单抗筛选
图2显示了4B12B8重组抗体特异性测试
图3显示了4B12B8重组抗体结合未变性AAV5载体颗粒而不结合变性解聚AAV5
图4显示了AAV5滴度测定快速法ELISA试剂盒线性范围及灵敏度
图5显示了AAV5滴度测定普通法ELISA试剂盒线性范围及灵敏度
图6显示了竞品AAV5滴度测定ELISA试剂盒线性范围及灵敏度
具体实施方式
本发明通过小鼠免疫筛选获得了一种抗AAV5(Anti-AAV5)高特异性抗体,克隆号4B12B8,该Anti-AAV5抗体只识别AAV5病毒颗粒,不能结合解聚的VP1,2,和3亚基。该Anti-AAV5抗体不与AAV2,6,8,9血清型的病毒颗粒/载体结合。本发明以4B12B8抗体作为捕获和检测抗体,开发出快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。AAV5滴度测定快速ELISA试剂盒与普通ELISA试剂盒的线性范围,灵敏度及精密度一致,且线性范围与灵敏度优于市场上广泛应用的一款竞品ELISA试剂盒。在此基础上,完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用,术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有,可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时,两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85%、90%或95%,优选至少为95%。非限制性实施例包括85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%。
抗体
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”由两条轻链(L)和两条重链(H)形成的异元四聚体。每条重链的N端为可变区(VH),连接重链恒定区。每条轻链的N端为可变区(VL),连接轻链恒定区。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区在特定序列上有所不同,形成了特定抗体对特定抗原结合的亲和力和特异性。抗体可变区包括互补决定区(CDR)或超变区以及序列较为保守的构架区(FR)。重链,轻链可变区的一级序列由4段FR序列及3段CDR序列间隔排列组成(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。重链及轻链可变区的序列及空间结构构象决定了抗体对抗原表位的特异性结合。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但对捕获抗体及检测抗体的性能有影响。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为κ和λ中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类,主要有5类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,以及抗体亚型(同种型),如小鼠IgG包括IgG1,IgG2a,IgG2b亚型。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用,术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原决定簇(表位)。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述抗AAV5的单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述抗AAV5的单克隆抗体可变区链的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明的轻链和重链的可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
如本领域技术人员所知,抗体偶联物及融合表达产物包括:荧光或发光标记物、能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒和其他可用于检测的分子与所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段结合的而形成的偶联物。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,包含通过较链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的scFv片段。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有结合活性的抗体片段,如Fab或(Fab’)2片段;抗体重链;抗体轻链或scFv。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。
如本文所用,术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的,由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中,抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠源抗体。重组抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的针对AAV5载体衣壳蛋白的单克隆抗体。
在本发明中,抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人,(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个方面,提供了一种抗AAV5抗体或其抗原结合片段,所述抗体的重链可变区包含以下3个CDR:
H-CDR1:GYTFTDYS(SEQ ID NO:3)
H-CDR2:IDTATGDP(SEQ ID NO:4)
H-CDR3:ARSYGNYGWFAY(SEQ ID NO:5)
以及,所述抗体的轻链可变区包含以下3个CDR:
L-CDR1:ESVDSYGNSF(SEQ ID NO:6)
L-CDR2:LAS
L-CDR3:QQNYEDPYT(SEQ ID NO:7)
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示,其中下划线标注的依次为重链可变区CDR1,CDR2,CDR3的氨基酸序列(按照IMGT规则)。
4B12B8重链可变区(SEQ ID NO:1):
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHCVKQAPGKGLQWMGWIDTATGDPTYADDFKGRFAFSLETTASTAYLQISNLKNDDTATYFCARSYGNYGWFAYWGQGTLVTVSA
在另一优选例中,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,其中下划线标注的依次为轻链可变区CDR1’,CDR2’,CDR3’的氨基酸序列(按照IMGT规则)。
4B12B8轻链可变区(SEQ ID NO:2):
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNYEDPYTFGGGTKLEIK
在本发明的一个优选实施方式中,所述抗AAV5抗体为鼠源单克隆抗体,其包含鼠源的重链和轻链恒定区。
重链恒定区序列(SEQ ID NO:8):
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
轻链恒定区序列(SEQ ID NO:9):
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
进一步地,所述抗AAV5抗体的重链为IgG1亚型,轻链为kappa亚型。所述抗AAV5抗体包含如SEQ ID NO:10所示的重链和如SEQ ID NO:11所示的轻链,其中下划线指示抗体分泌信号肽序列。
重链序列(SEQ ID NO:10):
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHCVKQAPGKGLQWMGWIDTATGDPTYADDFKGRFAFSLETTASTAYLQISNLKNDDTATYFCARSYGNYGWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
轻链序列(SEQ ID NO:11):
METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNYEDPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区序列和抗体结构构象决定,可以特异性地结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体。利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因,可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中,术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用,都指特异性结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体的抗体,例如具有重链(如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)和/或轻链(如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的蛋白或多肽。
抗体的“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如用于化学发光的化合物,例如吖啶酯)偶联所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化或检测此多肽的标签蛋白序列或其它融合蛋白序列)。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有AAV5病毒颗粒/AAV5载体结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还包括本发明抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约60个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
多核苷酸分子、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:12或13所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列,但与SEQ ID NO.:12或13所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。此外,还可将重链或轻链与蛋白或标签序列(如荧光蛋白,Flag标签)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了抗体序列,就可以采用生物工程方法进行重组抗体制备。通常是将编码抗体序列的基因克隆入载体,再将表达载体转入细胞表达,收获细胞或表达上清,纯化获得重组抗体。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的质粒(或载体)。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明抗体序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞,重组表达抗体为本领域技术人员熟知的常规技术。重组表达的抗体可通过本领域技术人员熟知的常规技术分离和纯化,在此不再赘述。
快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒以及方法
本发明的抗体可用于检测应用,制备用于检测AAV5病毒颗粒/AAV5载体的检测试剂、检测板或试剂盒,所述检测试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的存在(定性检测),和/或用于测定样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的滴度(定量检测)。
在本发明的一个优选实施方式中,提供了一种快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。
快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒基于抗体夹心ELISA方法,具体地,首先将特异识别AAV5载体构象表位的4B12B8单克隆抗体包被在平板上,从样本中捕获AAV5载体颗粒,而未组装的AAV5衣壳蛋白上则不具有该特异性抗体结合的构象表位,不能被抗体捕获,从而大大降低了检测的假阳性率的产生。以生物素标记单抗4B12B8作为检测抗体,AAV5载体颗粒含有多个相同的构象表位,生物素偶联单抗4B12B8能够与被捕获的重组AAV5载体结合。接下来以链霉亲和素过氧化物酶(SA-HRP)与抗体分子上的生物素结合,加入TMB显色液产生颜色反应,反应吸光度值与特异性结合的AAV5载体的数量成正比,实现对AAV5进行滴度测定。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明通过小鼠免疫筛选获得了只识别AAV5载体颗粒构象表位,不识别解聚的VP1,2,3亚基的抗AAV5抗体4B12B8。
(2)本发明的抗AAV5抗体4B12B8不与AAV2,6,8,9血清型载体的病毒颗粒结合,仅与AAV5载体的病毒颗粒特异性结合。
(3)使用本发明的抗AAV5抗体4B12B8制备的AAV5滴度测定试剂盒具有高灵敏度和高精密度,相对于市场上广泛应用的竞品AAV5滴度测定试剂盒,具有更宽的线性范围,更高的灵敏度。
(4)本发明的AAV5滴度测定试剂盒快速方便,2小时内便获得滴度测定结果,大大缩短了测定时间。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验,通常按常规条件进行,或按照原料/商品制造商建议的条件;未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
主要试剂材料及仪器:
1.AAV5-GFP;AAV2-GFP;AAV8-GFP:云舟生物
2.AAV6-GFP;AAV9-GFP:维真生物
3.酶标板;洗板机;37度恒温振荡孵育器;SA-HRP:Thermofisher
4.TMB显色液:湖州英创生物科技有限公司
5.免疫小鼠:上海昇敞生物科技有限公司
实施例1 AAV5抗原免疫及抗体筛选
1、小鼠免疫:
将AAV5-GFP(1E+13vg/ml)1ul,以PBS稀释100倍与等体积的氢氧化铝佐剂混合,混匀后以200μl/只剂量,选取6-8周雌性Balb/C小鼠进行皮下多点免疫。每次免疫间隔两周再以相同剂量和方式加强免疫,免疫四次以后进行血清效价检测,效价大于1:30000后进行骨髓瘤细胞SP2/0融合,于融合前三天用100μl AAV5-GFP(1E+13vg/ml,取1ul用PBS 100倍稀释,不加佐剂)腹腔加强免疫一次。
2、杂交瘤细胞株的筛选及抗体亚型鉴定:
小鼠加强免疫3天后,取小鼠脾脏细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合,制备杂交瘤细胞。10天之后,以AAV5-GFP和AAV2/6/8/9-GFP包板,间接ELISA法检测,筛选出只与AAV5-GFP结合而与其他血清型不结合的抗体细胞株,经有限稀释至单克隆状态后进行扩大培养和冻存。将扩大培养的杂交瘤单克隆细胞上清与AAV5-GFP结合,通过间接法ELISA,再次验证杂交瘤细胞株抗体与AAV5结合的特异性,由于AAV5的免疫原性较弱,难以获得高活性、特异性抗体。如图1所示,经筛选4B12B8杂交瘤单抗和5EH8,4B128B,7D6E3,3E11E11克隆相比具有最高的结合活性。使用抗体亚型鉴定试剂盒(武汉三鹰生物)确定4B12B8抗体亚型,重链为IgG1,轻链为kappa(κ)。
3、杂交瘤单抗测序及重组抗体表达纯化:
将4B12B8杂交瘤细胞株培养至1E+07cell/ml细胞密度,送做杂交瘤单抗测序(苏州鸿讯生物科技股份有限公司)。基因合成编码信号肽,可变区及恒定区的抗体重链及轻链基因序列(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13),分别构建进哺乳细胞表达载体,表达载体可选用pTT5、pCDNA3.1等任意哺乳细胞表达商业化载体。重组质粒转染Expi293哺乳细胞,分泌表达4B12B8抗体,细胞表达上清经protein A亲和纯化得到AAV5特异性重组抗体4B12B8。用于抗体表征及ELISA试剂盒开发。
实施例2 4B12B8重组抗体特异性验证
本实施例验证4B12B8重组抗体与不同血清型AAV的结合情况。
分别以1E+09vg/ml浓度的AAV2/5/6/8/9-GFP包被微孔板,将重组4B12B8抗体以10ug/ml的初始浓度开始,3倍梯度稀释,每孔加样100μl,以山羊抗小鼠Fc-HRP抗体0.5ug/ml做为二抗,显色反应终止后,在酶标仪上测定450nm吸光度值。
结果显示4B12B8重组抗体只与AAV5载体反应,而不与AAV2/6/8/9这些常用于基因递送的AAV血清型载体反应,表明4B12B8重组单抗具有良好的特异性(图2)。
实施例3 4B12B8抗体与AAV5载体颗粒的结合
将4B12B8抗体以5ug/ml的浓度包被在微孔板上,将AAV5-GFP(1E+13vg/ml)以PBST缓冲液1:1000倍稀释,取部分稀释好的样品95℃加热5分钟进行解聚变性,分别以稀释好的未变性和变性后的AAV5-GFP样品做为检测物,以生物素标记的4B12B8抗体5ug/ml做为检测抗体进行夹心法ELISA检测。
结果显示4B12B8抗体只与未解聚的AAV5-GFP载体颗粒结合,识别AAV5颗粒的空间构象表位。不与变性解聚的AAV5 VP1,2,3亚基结合(图3)。
实施例4 AAV5快速及普通法ELISA试剂盒的线性范围,灵敏度及精密度
使用本发明制备的4B12B8抗体分别开发了快速法和普通法AAV5滴度测定ELISA试剂盒。表1为两种试剂盒所用试剂,表2为快速法和普通法试剂盒的使用操作流程。
表1 AAV5快速及普通法ELISA试剂盒试剂
表2 AAV5快速及普通法ELISA试剂盒测定AAV5滴度实验流程
同时,使用市场上一款广泛应用的竞品AAV5滴度测定ELISA试剂盒,按照该竞品试剂盒的使用说明书测定AAV5滴度,具体操作为表2中ELISA普通法实验流程,区别在于所用抗体为该竞品ELISA试剂盒中的抗AAV5抗体。
AAV5快速及普通ELISA试剂盒线性范围和灵敏度分析
图4和图5显示,使用本发明4B12B8抗体的AAV5快速和普通ELISA试剂盒具有相同的线性范围4E+09 capsids/ml~6.25E+07 capsids/ml,灵敏度达到3E+07 capsids/ml。图6显示市场上一款广泛应用的竞品试剂盒线性范围是3E+09 capsids/ml~2E+08 capsids/ml,灵敏度为1E+08 capsids/ml。试剂盒的线性范围和灵敏度由检测抗体性质决定。本发明AAV5滴度测定快速及普通ELISA试剂盒与竞品相比具有更宽的线性范围和更高的灵敏度。
AAV5快速及普通ELISA试剂盒精密度分析
将AAV5-GFP颗粒用1X稀释缓冲液稀释成2E+09 capsids/ml、5E+08 capsids/ml、1.25E+08 capsids/ml高、中、低三个滴度,利用AAV5快速及普通ELISA试剂盒对线性范围内稀释的高、中、低三个滴度的AAV5-GFP颗粒连续检测20次,每天检测1次,连续检测20天,结果显示,批内和批间的CV%分别为3.5%和3.1%,均在允许误差范围内(批内CV%<5%,批间CV%<5%),结果显示该试剂盒精密度高,重复性较好。
参考文献
1.Genus:Dependoparvovirus.ICTV.(n.d.).2022,from https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/ssdna-viruses/w/parvoviridae/1043/genus-dependoparvovirus
2.Adeno-associated virus(AAV)cell entry:structural insights.Trends inMicrobiology,vol.30(2022)
3.Structural characterization of a novel human adeno-associated viruscapsid with neurotropic properties Nature Communications.vol 11(2020)
4.Generation and characterization of anti-Adeno-associated virusserotype 8(AAV8)and anti-AAV9 monoclonal antibodies.Journal of VirologicalMethods,vol 236(2016)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (24)
1.一种抗AAV5抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以下3个CDR:
SEQ ID NO:3所示的H-CDR1;
SEQ ID NO:4所示的H-CDR2;
SEQ ID NO:5所示的H-CDR3;以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR:
SEQ ID NO:6所示的L-CDR1;
序列如LAS所示的L-CDR2;
SEQ ID NO:7所示的L-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或与其具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或与其具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区。
5.如权利要求4所述的抗体,其特征在于,所述重链恒定区来源于小鼠重链IgG1,所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。
6.如权利要求4所述的抗体,其特征在于,所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的重链,以及氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的轻链。
7.一种重组抗体,其特征在于,所述的重组抗体具有:
(i)如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段的序列;以及
(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或纯化、检测的标签序列。
8.一种多核苷酸分子,其编码选自下组的多肽:
(1)如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段;或
(2)如权利要求7所述的重组抗体。
9.一种抗体偶联物,其特征在于,所述抗体偶联物包含:
(a)如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述的重组抗体;和
(b)偶联部分,所述偶联部分包括:可检测标记物、或酶。
10.如权利要求9所述的抗体偶联物,其特征在于,所述偶联部分为生物素。
11.如权利要求1-6任一项所述抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的重组抗体或如权利要求9所述的抗体偶联物在制备用于检测AAV5病毒颗粒/AAV5载体的检测试剂、检测板或试剂盒中的用途。
12.一种检测试剂,所述检测试剂包括:如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的重组抗体或如权利要求9所述的抗体偶联物;以及检测学上可接受的载体或赋形剂。
13.一种检测板,所述检测板的检测表面上包被有如权利要求1-6任一项所述抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的重组抗体或如权利要求9所述的抗体偶联物。
14.一种试剂盒,所述试剂盒包含如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的重组抗体或如权利要求9所述的抗体偶联物作为抗体试剂。
15.如权利要求14所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为ELISA试剂盒,其包含:
(C1)如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体;和
(C2)如权利要求9所述的抗体偶联物作为检测抗体。
16.一种体外非诊断性和非治疗性检测样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体的方法,所述方法包括步骤:
(1)将样品与如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的重组抗体或如权利要求9所述的抗体偶联物接触并结合;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在AAV5病毒颗粒/AAV5载体。
17.一种体外非诊断性和非治疗性测定样品中AAV5病毒颗粒/AAV5载体滴度的方法,所述方法为ELISA法,其包括以下步骤:
(S1)将捕获抗体包被于ELISA板的检测孔中,所述捕获抗体为如权利要求1-6任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段;
(S2)将待测样品或梯度稀释的标准品加入到(S1)的ELISA板的检测孔中,于37±2℃恒温震荡反应15-60分钟;
(S3)洗板后,在检测孔中加入检测抗体,所述检测抗体为如权利要求9所述的抗体偶联物,于37±2℃恒温震荡反应15-60分钟,从而形成捕获抗体-AAV5病毒颗粒/AAV5载体-检测抗体复合物;
(S4)洗板后,检测各检测孔中所述捕获抗体-AAV5病毒颗粒/AAV5载体-检测抗体复合物的形成。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述方法中的洗板次数为3-4次。
19.如权利要求17所述的方法,其特征在于,步骤(S1)中捕获抗体的工作浓度为3-10ug/ml。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,步骤(S1)中捕获抗体的工作浓度为5ug/ml。
21.如权利要求17所述的方法,其特征在于,步骤(S3)中检测抗体的工作浓度为0.5-2ug/ml。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,步骤(S3)中检测抗体的工作浓度为0.6ug/ml。
23.如权利要求17所述的方法,其特征在于,步骤(S2)中的反应时间为20-30分钟。
24.如权利要求17所述的方法,其特征在于,步骤(S3)中的反应时间为20-30分钟。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310329886.3A CN116589564B (zh) | 2023-03-30 | 2023-03-30 | 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310329886.3A CN116589564B (zh) | 2023-03-30 | 2023-03-30 | 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116589564A CN116589564A (zh) | 2023-08-15 |
CN116589564B true CN116589564B (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=87592644
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310329886.3A Active CN116589564B (zh) | 2023-03-30 | 2023-03-30 | 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116589564B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117285620B (zh) * | 2023-11-27 | 2024-02-13 | 恺佧生物科技(上海)有限公司 | 抗aav9抗体及aav9滴度测定elisa试剂盒 |
CN118085066B (zh) * | 2024-04-26 | 2024-06-21 | 朗信启昇(苏州)生物制药有限公司 | 一种抗aav的单克隆抗体及其用途 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190006154A (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-17 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 혈청형 o 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
KR20190057914A (ko) * | 2017-11-21 | 2019-05-29 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
WO2019215644A1 (en) * | 2018-05-08 | 2019-11-14 | Neuracle Science Co., Ltd. | Adeno-associated virus (aav) delivery of anti-fam19a5 antibodies |
KR20200059381A (ko) * | 2018-11-20 | 2020-05-29 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
WO2022166949A1 (zh) * | 2021-02-07 | 2022-08-11 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 抗aav2单克隆抗体及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-03-30 CN CN202310329886.3A patent/CN116589564B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190006154A (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-17 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 혈청형 o 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
KR20190057914A (ko) * | 2017-11-21 | 2019-05-29 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
WO2019215644A1 (en) * | 2018-05-08 | 2019-11-14 | Neuracle Science Co., Ltd. | Adeno-associated virus (aav) delivery of anti-fam19a5 antibodies |
KR20200059381A (ko) * | 2018-11-20 | 2020-05-29 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
WO2022166949A1 (zh) * | 2021-02-07 | 2022-08-11 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 抗aav2单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
AAV载体介导的蓬佩病模型小鼠体内基因治疗研究;武志杰 等;中国生物工程杂志;第第42卷卷(第第7期期);第24⁃34页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116589564A (zh) | 2023-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116589564B (zh) | 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒 | |
JP7215759B2 (ja) | 4-1bb抗体およびその製造方法と使用 | |
CN111234020B (zh) | 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN112390879A (zh) | 靶向SARS-CoV-2的抗体及其制备方法和应用 | |
CN112812178B (zh) | PCV3 Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
EP4067385A1 (en) | Monoclonal antibody for detection of car-t cells, kit and application | |
CN110066336A (zh) | 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途 | |
WO2018153366A1 (zh) | Tim-3抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
CN116836270B (zh) | 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途 | |
CN113416245A (zh) | 一种可结合SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的中和抗体及其应用 | |
CN113493508A (zh) | 一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒 | |
KR20220131935A (ko) | 항angptl3 항체 및 이의 용도 | |
WO2024140337A1 (zh) | 登革病毒非结构蛋白1的抗体及其相关应用 | |
CN116769021A (zh) | 一种针对非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体及用途 | |
CN109651509B (zh) | 抗cd20的人源化单抗及其制剂 | |
CN104045713A (zh) | 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物 | |
JP2001510329A (ja) | ヒトモノクローナル抗体 | |
CN113683692B (zh) | SARS-CoV-2 N蛋白抗体及其应用 | |
CN113603786B (zh) | 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体 | |
WO2021238854A1 (zh) | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
CN109593134B (zh) | 抗cd20的人源化单克隆抗体及其制剂 | |
CN110702913B (zh) | 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物 | |
CN118085066B (zh) | 一种抗aav的单克隆抗体及其用途 | |
CN114276451A (zh) | 靶向CD3e/g的抗体或其抗原结合片段、其制备和应用 | |
CN111018984A (zh) | 抗ck8单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |