KR20220131935A - 항angptl3 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220131935A
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야위웬 푸
잉샤 쑤
빙 린
웨이캉 타오
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지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 항ANGPTL3 항체 및 이의 용도에 관한 것이다, 구체적으로 본 발명은 항ANGPTL3 항체 및 이의 항원 결합 단편, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매, 그리고 의약으로서의 이의 용도, 구체적으로 고지혈증을 치료하기 위한 의약 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.

Description

항ANGPTL3 항체 및 이의 용도
본 발명은 항체 약물 분야에 관한 것이다. 구체적으로 항ANGPTL3 항체 약물 및 이의 용도가 포함된다.
본원의 진술은 오로지 본 발명과 관련된 배경 정보를 제공할 따름이지, 반드시 선행 기술을 구성할 수 있는 것은 아니다.
안지오포이에틴유사 단백질 3(ANGPTL3, ANGPTL-3) 유전자는 Conklin외 다수에 의해 신호 서열 및 양친매성 나선체를 기반으로 한 EST 데이터베이스로부터 동정된 신규 유전자이며, Conklin외 다수는 인간 태아 간/비장 cDNA 라이브러리로부터 인간 ANGPTL3 전장 cDNA를 단리하였다(Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). 460개 아미노산으로 된 인간 ANGPTL3 단백질(hANGPTL3)은 마우스 ANGPTL3 단백질과 76%의 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 안지오포이에틴의 특징적인 구조, 즉 신호 펩티드, 이량체 또는 삼량체의 휘어감는 형태의 코일을 형성할 것으로 예측되는 확장 나선형 도메인, 짧은 링커 펩티드, 그리고 구형의 피브리노겐 상동성 도메인(FD)을 가진다(Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). ANGPTL3은 안지오포이에틴(ANG)과 상이하며, ANGPTL3은 Tie2와 결합하지 않는다. 그러나, ANGPTL3은 자체의 C 말단 FD를 통해 인테그린 αvβ와 결합함으로써 혈관생성을 유도하기도 한다(Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277: 17281-17290).
뿐 아니라, ANGPTL3은 지방 대사에 영향을 미치는 중요한 인자이다. ANGPTL3은 LPL 활성을 억제하여, 트리글리세라이드 및 저밀도 지단백 제거를 줄일 수 있는 한편, 고중성지질혈증은 다양한 대사성 질환의 발병에 연루되어 있다. 혈장중 트리글리세라이드 수준의 증가는 혈소판 응집과 플라스미노겐 활성인자 억제제-1(PAI-1)의 생성을 유도하여, 거품 세포의 수를 증가시키고, 혈관 평활근 세포의 증식과 이동을 촉진함으로써, 죽상경화증의 병리학적 과정에 연루될 수 있다. 항ANGPTL3 항체는 ANGPTL3와 특이적으로 결합할 수 있으므로, ANGPTL3 활성은 억제 또는 방해될 수 있고, 이로써 죽상경화증 및 고지혈증과 같은 질환이 치료될 수 있다. 현재 다양한 항ANGPTL3 항체가 WO2012174178A1, WO2008073300A2 및 CN107085112A와 같은 특허 문헌에 개시되어 있다.
본 발명은 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하되,
i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
ii) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
iii) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단
iv) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
v) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24, 서열 번호 25 및 서열 번호 26에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
vi) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24, 서열 번호 28 및 서열 번호 26에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 27, 서열 번호 22 및 서열 번호 23에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단
(A) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이거나;
(B) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이거나; 또는
(C) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보인다.
몇몇 구현예에서, 이하에 보인 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단
(D) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 제시된 서열을 가지거나;
(E) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 제시된 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 제시된 서열을 가지거나; 또는
(F) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 서열을 가진다.
몇몇 구현예에서, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단 항ANGPTL3 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 몇몇 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 사슬 및 λ사슬 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 몇몇 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 29에 제시된 서열 또는 서열 번호 29에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보이는 서열을 가지고/가지거나, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 30에 제시된 서열 또는 서열 번호 30에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보이는 서열을 가진다. 몇몇 구현예에서, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단 항ANGPTL3 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 단
(G) 중쇄는 서열 번호 31에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄는 서열 번호 32에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이거나;
(H) 중쇄는 서열 번호 33에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄는 서열 번호 34에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이거나; 또는
(I) 중쇄는 서열 번호 35에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이고/보이거나, 경쇄는 서열 번호 36에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보인다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 단
(J) 중쇄는 서열 번호 31에 제시된 서열을 가지고, 경쇄는 서열 번호 32에 제시된 서열을 가지거나;
(K) 중쇄는 서열 번호 33에 제시된 서열을 가지고, 경쇄는 서열 번호 34에 제시된 서열을 가지거나; 또는
(L) 중쇄는 서열 번호 35에 제시된 서열을 가지고, 경쇄는 서열 번호 36에 제시된 서열을 가진다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 단리된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 단 이 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ANGPTL3 항원과의 결합에 대해 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁한다. 몇몇 구현예에서, ANGPTL3 항원은 인간 ANGPTL3, 마우스 ANGPTL3, 원숭이 ANGPTL3 또는 래트 ANGPTL3이다.
몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 인간 항체 또는 인간 유래 항체이다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fd, Fv, dsFv, scFv, Fab 및 다이아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 특징들 a ~ d중 적어도 1가지를 가진다:
a. ANGPTL3 단백질과 특이적으로 결합함[몇몇 구현예에서, 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 ANGPTL3, 마우스 ANGPTL3, 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3 및/또는 래트 ANGPTL3과 10 nM 미만(예컨대 5 nM 이하, 3 nM 이하, 1 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 또는 0.2 nM 이하)의 EC50으로 결합하고; 몇몇 구현예에서, EC50은, 예컨대 본 발명의 시험 실시예 1에 기재된 바와 같은 ELISA 방법에 의해 확정되고; 몇몇 구현예에서, EC50은, 예컨대 본 발명의 시험 실시예 2에 기재된 바와 같은 HTRF 방법에 의해 확정됨];
b. 큰 친화성으로 ANGPTL3 단백질과 결합함[몇몇 구현예에서, 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 ANGPTL3, 마우스 ANGPTL3, 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3 및/또는 래트 ANGPTL3 항원과 10E-10 M 미만(예컨대 9E-10 M 이하, 8E-10 M 이하, 7E-10 M 이하, 6E-10 M 이하, 3E-10 M 이하, 2E-10 M 이하, 1E-10 M 이하, 8E-11 M 이하, 6E-11 M 이하 또는 5E-11 M 이하)의 KD 값으로 결합하고; 몇몇 구현예에서, KD 값은, 예컨대 본 발명의 시험 실시예 4에 기재된 바와 같은 Biacore 방법에 의해 확정됨];
c. LPL 효소에 대한 ANGPTL3의 억제를 차단함[몇몇 구현예에서, 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LPL 효소 활성에 대한 인간 ANGPTL3, 마우스 ANGPTL3, 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3 및/또는 래트 ANGPTL3의 억제를 170 nM 미만(예컨대 80 nM 이하, 135 nM 이하, 80 nM 이하 또는 55 nM 이하)의 IC50 값으로 차단함. IC50은, 예컨대 본 발명의 시험 실시예 3에 기재된 바와 같은 효소 활성 검정에 의해 확정될 수 있음]; 및/또는
d. 우수한 지질 강하 효과를 보임[몇몇 구현예에서, 본 발명의 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 지질 강하 효과는 시험 실시예 5, 6 및/또는 7에 보임. 몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공함].
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명은 형질전환(또는 형질도입이나 형질감염)에 의해 수득된 숙주 세포에 전술된 백터를 제공하고; 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되되, 바람직하게는 진핵생물 세포이고, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이다. 몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 전개체(whole individual)로 발달할 수 있는 세포, 예컨대 인간 배줄기세포, 수정란 또는 생식세포를 포함하지 않고; 몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이고, 더욱 바람직하게는 유전자 편집(예컨대 FUT8 또는 GnT-III과 같은 유전자의 녹아웃(knock-out))이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 당화 변형을 변경함으로써, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 ADCC 기능을 변경한 포유동물 세포, NSO, 293 및 CHO 세포와 같은 포유동물 세포(이에 한정되는 것은 아님)이고; 몇몇 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포를 포함하지 않는다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 전술된 핵산 분자 치료적 유효량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제 1가지 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 약학 조성물은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 전술된 핵산 분자를 단위 용량당 0.01 wt.% ~ 99 wt.% 포함한다. 몇몇 구현예에서, 약학 조성물은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 전술된 핵산 분자를 단위 용량당 0.1 mg ~ 2000 mg, 더욱 바람직하게 1 mg ~ 1000 mg 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방법으로서, ANGPTL3의 면역검출 또는 확정을 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체로부터 유래한 시료중 ANGPTL3의 발현 수준을 시험관내 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 기재된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 시료와 접촉시키는 단계를 포함하고; 몇몇 구현예에서, 시료는 대상체 유래 혈장, 혈청 또는 전혈 시료이다. 몇몇 구현예에서, ANGPTL3의 발현 수준은 당 업자들에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 면역블럿팅(immunoblotting), ELISA 및 질량분광도법(이에 한정되는 것은 아님)이 사용되어 검출될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 ANGPTL3의 면역검출을 위한 시약을 제조함에 있어 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 ANGPTL3의 면역검출 또는 확정에 사용하기 위한, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, ANGPTL3의 발현 수준을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 ANGPTL3의 발현 수준을 검출하기 위한 방법에 사용되고; 몇몇 구현예에서, 검출 방법은 당 업자들에게 공지된 임의의 방법으로서, 예컨대 웨스턴 블럿팅, 면역블럿팅, ELISA 및 질량분광도법(이에 한정되는 것은 아님)이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 약학 조성물 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 어떤 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법을 제공하고; 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 ANGPTL3 연관 질환 또는 장애이고; 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 또는 죽상경화성질환이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 어떤 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약을 제조함에 있어 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 ANGPTL3 연관 질환 또는 장애이고; 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 또는 죽상경화성질환이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 것으로서, 전술된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 의약은 ANGPTL3 연관 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되고; 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 또는 죽상경화성질환이다.
본 발명의 상세한 설명
용어(정의)
본 발명의 이해를 돕기 위해, 몇몇 기술적 및 과학적 용어가 이하에 구체적으로 정의되어 있다. 본원에 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 기타 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.
본 발명에 사용된, 아미노산에 대한 3문자 및 1문자 암호는 문헌[J. biol . chem, 243, p3558(1968)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 "항체"란 면역글로불린을 지칭하고, 천연 비변형 항체는 사슬간 이황화 결합에 의해 동일한 중쇄 2개와 동일한 경쇄 2개가 결합되어 형성된 테트라펩티드 사슬 구조의 항체이다. 면역글로불린은 아미노산 조성과 중쇄 불변 영역들의 배열 순서의 차이에 따라서 면역글로불린의 이소타입(isotype)이라 칭하여지기도 하는 군 5개, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE(이것들의 대응하는 중쇄는 각각 μ 사슬, δ 사슬, γ 사슬, α 사슬 및 ε 사슬임)로 구분될 수 있다. 동일 군의 Ig는 경첩 영역의 아미노산 조성과 중쇄의 이황화 결합 수 및 위치의 차이에 따라서 상이한 하위군으로 구분될 수 있는데; 예를 들어 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구분될 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 의해 κ 사슬 또는 λ사슬로 구분된다. Ig 군 5개 각각은 κ 사슬 또는 λ사슬을 가질 수 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄에서 N-말단 근처 약 110개 아미노산으로 이루어진 서열은 상당히 가변적이므로, 가변 영역(Fv 영역)이라 지칭되고; C-말단 근처 나머지 아미노산 서열은 비교적 안정적이므로, 불변 영역이라 지칭된다. 가변 영역들은 초가변 영역(HVR) 3개와 비교적 보존적인 서열을 가지는 틀 영역(FR) 4개를 포함한다. 초가변 영역 3개는 항체의 특이성을 결정하므로, 상보성결정영역(CDR)이라고도 공지되어 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 또는 중쇄 가변 영역(HCVR)은 아미노 말단으로부터 카복시 말단에 이르기까지 CDR 3개 및 FR 4개가 이하의 순서로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 CDR 3개는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 CDR 3개는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.
전장 항체 이외에, 본원에 기재된 "항체"는 또한 항원과 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 기재된 항체는 인간 항체를 포함한다.
본원에 기재된 "마우스 항체"는 당 분야의 통상의 지식 및 기술에 따라 제조된 것으로서, 인간 ANGPTL3에 대한 모노클로날 항체이다. 이 모노클로날 항체 제조시 ANGPTL3 항원은 시험 대상체에 주입되고, 이후 원하는 서열 또는 기능상의 특성을 가지는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 마우스 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 κ또는 λ사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 "키메라 항체"란 용어는, 이종(예컨대 마우스) 항체의 가변 영역과 부모 항체(예컨대 인간 항체)의 불변 영역을 융합하여 수득된 항체로서, 이종 항체에 의해 유도된 면역 반응을 완화할 수 있는 항체를 지칭한다. 예를 들어 인간-마우스 키메라 항체는, 우선 마우스 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립한 다음, 마우스 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝하고 나서, 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 마우스 가변 영역 유전자 및 인간 불변 영역 유전자를 연결시켜 키메라 유전자를 만들어, 키메라 유전자를 발현 벡터에 삽입한 후, 마지막으로 진핵생물계 또는 원핵생물계에서 키메라 항체를 발현시킴으로써 확립된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항ANGPTL3 키메라 항체의 항체 경쇄는 인간 κ또는 λ사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. ANGPTL3 키메라 항체의 항체 중쇄는 아미노산 돌연변이(예컨대 L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)가 적용된 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체, 바람직하게 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역, 또는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 변이체를 추가로 포함한다.
CDR 그래프팅 항체(CDR grafted antibody)라고도 지칭되는 "인간화 항체"란 용어는, 마우스 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역 틀에 그래프팅하여 제조된 항체, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 틀 서열로부터 생성된 항체를 지칭한다. 따라서 키메라 항체내 다수의 마우스 단백질 구성성분이 존재함으로 말미암아 유도되는 이질적 반응은 극복될 수 있다. 이러한 틀 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 개시된 참고문헌 또는 공공의 DNA 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스뿐 아니라, 문헌[Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition]에서 살펴볼 수 있다. 면역원성 감소로 유발되는 활성 감소를 회피하기 위해, 인간 항체의 가변 영역 틀 서열은 최소 역전 돌연변이 또는 역 돌연변이되고, 이로써 활성은 유지될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 또한 효모 전시에 의해 추가로 CDR 친화성 성숙 돌연변이되었던 인간화 항체도 포함한다.
"인간 항체" 및 "인간 유래 항체"란 용어는 호환되어 사용되는 용어로서, 가변 영역 및 불변 영역중 1가지 이상이 인간 면역글로불린 서열로부터 유래함을 의미한다. 한가지 바람직한 방법은, 가변 영역 및 불변 영역 모두를 인간 면역글로불린 서열로부터 얻는 것이다(즉 "전체가 인간으로부터 유래한 항체" 또는 "전체가 인간의 것인 항체"). 인간 PBMC, 비장 및 림프절 조직으로부터 B 세포를 단리하여, 파아지 전시 기술을 사용해 천연 단일 가닥 파아지 인간 항체 라이브러리를 구성하거나, 또는 인간 항체 경쇄 및 중쇄를 발현할 수 있는 유전자이식 마우스를 면역화하여 스크리닝함으로써 수득된 항체를 비롯하여 이러한 항체는 다양한 방법으로 수득될 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 또한 관심 항원과 여전히 결합하는 항체를 포함하고, 인간 항체를 기반으로 아미노산 1개 이상을 돌연변이함으로써 수득된다.
본원에 기재된 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 인간 항체 경쇄 불변 영역의 "종래의 변이체"란, 선행 기술에 개시되었으며, 항체 가변 영역의 구조와 기능은 변경하지 않은, 인간으로부터 유래한 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 변이체를 지칭한다. 예시적 변이체로서는 중쇄 불변 영역에 부위 유도 변형 및 아미노산 치환을 가지는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 변이체를 포함한다. 특이적 치환으로서는, 예를 들어 YTE 돌연변이, L234A 및/또는 L235A 돌연변이 또는 S228P 돌연변이, 또는 당 분야에 공지된 납-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 수득하기 위한 돌연변이(그래서 항체 중쇄가 납-Fc 및 홀-Fc의 조합을 가지도록 만드는 돌연변이)가 있다. 이러한 돌연변이는 항체가 신규 특성들을 가지되, 항체 가변 영역의 기능은 변경되지 않도록 만드는 것으로 확인되었다.
"전장 항체," "비변형 항체," "완전 항체" 및 "전항체"란 용어는, 이하 정의된 항원 결합 단편과 구별되는 바와 같이, 실질적으로 비변형된 자체의 형태를 가지는 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 호환되어 사용된다. 이 용어는, 특히 경쇄 및 중쇄가 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 "항체"는 "전장 항체" 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 전장 항체는 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역에 결합시키고, 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역에 결합시킴으로써 생성된 전장 항체를 포함한다. 당 업자는 실제 필요에 따라 상이한 항체 유래 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역, 예컨대 인간 항체 유래 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 선택할 수 있다.
"항원 결합 단편" 또는 "기능성 단편"이란 용어는, 항원(예컨대 ANGPTL3)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편 1개 이상을 지칭한다. 전장 항체의 단편은 항체의 항원 결합 기능을 수행하는데 사용될 수 있다. "항원 결합 단편"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로서는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 경첩 영역내 이황화 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 팔(arm) 1개의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (V) dsFv, 즉 VH 및 VL 사이 사슬간 이황화 결합을 통해 VH 및 VL로 형성된 안정적 항원 결합 단편; (vi) scFv, dsFv 및 Fab와 같은 단편을 포함하는 다이아바디, 즉 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 도메인 2개, 즉 VL 및 VH는 별도 유전자에 의해 암호화되지만, 이 도메인 2개는 합성 링커에 의해 재조합을 통해 결합될 수 있으므로, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)라 지칭됨)를 형성하는 단일 단백질이 생산될 수 있다[예컨대 문헌들(Bird et al.(1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc . Natl . Acad . Sci USA 85:5879-5883)을 참조한다]. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당 업자들에게 공지된 종래의 기술이 사용되어 수득되고, 동일한 방식으로 비변형 항체에 대해 그 유용성이 스크리닝된다. 항원 결합부는 재조합 DNA 기술, 또는 비변형 면역글로불린의 효소 절단 또는 화학 절단이 사용되어 제조될 수 있다. 항체는 그 이소타입이 상이할 수 있는데, 예컨대 IgG(예컨대 아형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체가 있을 수 있다.
Fab는 분자량이 약 50,000이고, 항원 결합 활성을 가지며, IgG 항체 분자를 프로테아제, 즉 (H 사슬의 224번 위치에 있는 아미노산 잔기를 절단하는) 파페인으로 처리함으로써 수득될 수 있는 항체이되, 단 여기서 N 말단쪽 H 사슬의 거의 절반과 전체 L 사슬은 이황화 결합에 의해 서로 연결된다.
F(ab')2는 분자량이 약 100,000이고, 항원 결합 활성을 가지며, 경첩 위치에 결합된 Fab 영역 2개를 포함하고, IgG 경첩 영역내 이황화 결합 2개중 하단 일부를 효소인 펩신으로 분해함으로써 수득될 수 있는 항체 단편이다.
Fab'는 분자량 약 50,000이고, 항원 결합 활성을 가지며, 전술된 F(ab')2의 경첩 영역중 이황화 결합을 절단함으로써 수득될 수 있는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'는 환원제, 예컨대 디티오트레이톨을 사용하여, ANGPTL3를 특이적으로 인지하고, 이의 세포외 영역이나 3차원 구조 아미노산 서열과 결합하는 본 발명의 F(ab')2를 처리함으로써 제조될 수 있다. 더욱이, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입한 다음, 이 백터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
"단일 사슬 항체", "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"란 용어는, 링커에 의해 결합된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 일반 구조 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다. 선행 기술의 적합한 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 반복된 변이체 1개 ~ 4개로 이루어져 있다(Holliger et al.(1993), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌(Alfthan et al.(1995), Protein Eng. 8:725-731; Choi et al.(2001), Eur . J. Immunol. 31:94-106; Hu et al.(1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al.(1999), J. Mol . Biol. 293:41-56; 및 Roovers et al.(2001), Cancer Immunol.)에 기재되어 있다.
다이아바디는 scFv 또는 Fab가 이량체화된 항체 단편이자, 2가 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 2가 항원 결합 활성에 있어, 항원 2개는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
이중특이적 항체 및 다중특이적 항체란, 2개 이상의 항원 또는 항원 결정기와동시에 결합할 수 있으며, ANGPTL3과 결합할 수 있는 scFv 또는 Fab 단편을 포함하는 항체를 지칭한다.
본 발명의 다이아바디는 이하의 단계들, 즉 인간 ANGPTL3을 특이적으로 인지하여 이의 세포외 영역 또는 3차원 구조 아미노산 서열과 결합하는, 본 발명의 모노클로날 항체중 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, 펩티드 링커의 아미노산 서열 길이가 8개 이하 잔기가 되도록 scFv를 암호화하는 DNA를 구성하는 단계, 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 DNA를 삽입한 다음, 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 다이아바디를 발현시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.
dsFv는, 각각의 VH 및 VL내 아미노산 잔기 1개가 시스테인 잔기로 치환된 폴리펩티드를, 시스테인 잔기들 사이 이황화 결합을 통해 결합함으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 치환된 아미노산 잔기는 항체의 3차원 구조 예측을 기반으로 한 공지의 방법(Protein Engineering, 7, 697(1994))에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 전장 항체 또는 항원 결합 단편은 이하의 단계들, 즉 인간 ANGPTL3를 특이적으로 인지하여 이의 세포외 영역 또는 3차원 구조 아미노산 서열과 결합하는, 본 발명의 항체를 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, dsFv를 암호화하는 DNA를 구성하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입한 다음, 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 dsFv를 발현시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.
"아미노산 차이" 또는 "아미노산 돌연변이"란 용어는, 원래 단백질 또는 폴리펩티드와는 비교되게 변이체 단백질 또는 폴리펩티드내에 원래 단백질 또는 폴리펩티드를 기반으로 1개, 2개, 3개 또는 이 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환의 발생을 포함하는 아미노산 변화 또는 돌연변이가 존재함을 지칭한다.
"항체 틀" 또는 "FR"이란 용어는, 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대해 틀로서 사용되는 가변 도메인 VL 또는 VH의 일부를 지칭한다. 이는 본질적으로 CDR이 없는 가변 도메인이다.
"상보성 결정 영역," "CDR" 또는 "초가변 영역"이란 용어는, 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 가변 도메인내 6개 초가변 영역중 1개를 지칭한다. 일반적으로 각각의 중쇄 가변 영역에는 CDR이 3개 존재하고(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 각각의 경쇄 가변 영역에는 CDR이 3개 존재한다(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3). "Kabat" 번호메김 규칙[문헌(Kabat et al.,(1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) 참조], "Chothia" 번호메김 규칙[문헌(Al-Lazikani et al.,(1997) JMB 273: 927-948) 참조] 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호메김 규칙[문헌(Lefranc M. P., Immunologist, 7, 132-136(1999); Lefranc, M. P., et al., Dev . Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)) 참조] 등을 비롯하여, 널리 공지된 다양한 체계중 임의의 것 1가지가 CDR의 아미노산 서열 경계를 확정하는데 사용될 수 있다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"란 용어는, 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상 부위(예컨대 ANGPTL3 분자상 특이적 부위)를 지칭한다. 에피토프는 통상 독특한 공간 입체배열내 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 연속적 또는 불연속적 아미노산을 포함한다. 예컨대 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G.E. Morris, Ed.(1996)]을 참조한다.
"특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하다", "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합할 수 있는"이란 용어는, 예정된 항원상 에피토프에 항체가 결합하는 것을 지칭한다. 일반적으로 항체는 약 10-8 M 미만, 예컨대 약 10-9 M, 약 10-10 M 또는 약 10-11 M 미만, 약 10-12 M 이하의 친화도(KD)로 결합한다.
"KD"란 용어는, 특이적 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭한다. 일반적으로 본 발명의 항체는 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만 또는 약 10-9 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 ANGPTL3와 결합한다. 예를 들어 본 발명에서 세포 표면 항원에 대한 항체의 친화성 KD 값은 FACS 방법이 사용되어 확정되고; 다른 구현예에서, 항원에 대한 항체의 친화성 KD 값은 Biacore 방법이 사용되어 확정되며; 다른 구현예에서, 항원과 항체의 결합은 ELISA 방법이 사용되어 확정된다.
"경쟁하다"라는 용어는, 이 용어가, 항원 결합 단백질(예컨대 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)이 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 경우에 사용될 때, 검정될 항원 결합 단백질(예컨대 항체 또는 이의 면역학상 기능성 단편)이, 공통 항원(예컨대 ANGPTL3 항원 또는 이의 단편)과 참조기준 항원 결합 단백질(예컨대 리간드 또는 참조기준 항체)의 특이적 결합을 방지 또는 억제하는(예컨대 감소시키는), 이하 검정에 의해 확정되는 항원 결합 단백질들간의 경쟁관계를 지칭한다. 다수 유형의 경쟁적 결합 검정, 예컨대 고상 직접 또는 간접 방사성면역검정(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정(예컨대 문헌(Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253) 참조), 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예컨대 문헌(Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) 참조), 고상 직접 표지화 검정 및 고상 직접 표지화 샌드위치 검정(예컨대 문헌(Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) 참조), 고상 직접 표지화 RIA(I125 표지)(예컨대 문헌(Morel et al., 1988, Molec . Immunol. 25:7-15) 참조), 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예컨대 문헌(Cheung, et al, 1990, Virology 176:546-552) 참조) 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer et al, 1990, Scand . J. Immunol. 32:77-82)가 항원 결합 단백질이 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 확정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 검정은 고체 표면이나, 또는 미표지화 검정 항원 결합 단백질 및 표지화 참조기준 항원 결합 단백질중 임의의 것을 보유하는 세포에 결합하는 정제 항원의 사용에 관한 것이다. 경쟁적 억제는, 검정 항원 결합 단백질의 존재하에 고체 표면 또는 세포와 결합한 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로 검정된 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁적 검정에 의해 동정되는 항원 결합 단백질(경쟁적 항원 결합 단백질)은 참조기준 항원 결합 단백질에 대한 에피토프와 동일한 에피토프와 결합하는 항원 결합 단백질과, 참조기준 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프와 충분히 가까이에 위치하는 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하고, 2개의 에피토프는 결합을 막기 위해 공간상 서로를 방해한다. 경쟁적 결합을 검정하기 위한 방법에 관한 기타 상세한 정보는 본원의 실시예에 제공되어 있다. 일반적으로 경쟁적 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 참조기준 항원 결합 단백질과 공통의 항원간 특이적 결합은 적어도 40% ~ 45%, 45% ~ 50%, 50% ~ 55%, 55% ~ 60%, 60% ~ 65%, 65% ~ 70%, 70% ~ 75%, 또는 75% 이상만큼 억제(예컨대 감소)될 것이다. 몇몇 경우, 결합은 적어도 80% ~ 85%, 85% ~ 90%, 90% ~ 95%, 95% ~ 97% 또는 97% 이상만큼 억제된다.
본원에 사용된 바와 같은 "핵산 분자"란 용어는, DNA 분자 또는 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 mRNA 또는 변형 mRNA이다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능상 관련이 있도록 배치될 때 "작동 가능하도록 결합"되어 있다고 한다. 예를 들어 프로모터 또는 인핸서는 만일 이것이 암호화 서열의 전사에 영향을 미치면, 암호화 서열과 작동 가능하도록 결합된 것이다.
아미노산 서열 "동일성"이란, 제1 서열과 제2 서열이 공유하는 아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭하는데, 이때 아미노산 서열들을 정렬함에 있어 필요하다면 겝이 도입되어 최고의 서열 동일성%가 달성될 수 있고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성%를 확정하기 위해, 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법, 예컨대 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 사용되어 정렬이 이루어질 수 있다. 당 업자는, 정렬을 측정하기 적합한 매개변수, 예컨대 정렬되는 서열들 전장에 대해 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 결정할 수 있다.
"발현 벡터"란 용어는, 이 자체와 결합하였던 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 벡터는 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 것으로서, 원형의 이중 가닥 DNA 루프라 지칭되는 "플라스미드"이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 본원에 개시된 벡터(예컨대 세균 복제 기원을 가지는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)는 그것이 도입된 숙주 세포내에서 자율적으로 복제할 수 있거나, 또는 숙주 세포에 도입된 후 숙주 세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제할 수 있다(비 에피좀 포유동물 벡터).
항체 및 항원 결합 단편을 제조 및 정제하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)의 챕터 5 ~ 8에 기재된 방법이 있다. 예를 들어 마우스는 인간 ANGPTL3 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 수득된 항체는 재생 및 정제될 수 있으며, 아미노산 서열결정은 종래의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 마찬가지로 항원 결합 단편은 종래의 방법이 사용되어 제조될 수 있다. 본 발명에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 비인간 CDR에 추가의 인간 FR 1개 이상이 함유되도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은, ImMunoGeneTics(IMGT) 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스를 MOE 소프트웨어와 비교함으로써, IMGT 웹사이트에서 수득될 수 있거나, 또는 면역글로불린 저널 2001 ISBN 012441351로부터 수득될 수 있다.
"숙주 세포"란 용어는, 내부에 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환에 민감한 세균은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 일원, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 변종, 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 일원, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 뉴모코커스(Pneumococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물로서는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(중국햄스터난소세포주), 293 세포 및 NS0 세포를 포함한다.
본 발명의 조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 종래의 방법이 사용되어 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 GS 발현 벡터에 클로닝되어 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포를 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 더욱 많이 권장되는 선행 기술인 포유동물 발현계는 항체의 당화, 구체적으로 Fc 영역의 매우 보존적인 N 말단 부위의 당화를 초래할 것이다. 안정적 클론은 인간 ANGPTL3과 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 의해 수득된다. 양성의 클론은 생물반응기내 무혈청 배지중에서 증식되어 항체를 생산하게 된다. 분비된 항체를 포함하는 배양액은 종래의 기술이 사용되어 정제될 수 있다. 예컨대 조정된 완충제를 함유하는 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼상에서 정제가 수행된다. 비특이적으로 결합된 분획들은 세척에 의해 떨어져 나간다. 결합된 항체는 pH 구배 방법이 사용되어 용리되고, 항체 단편은 SDS-PAGE가 사용되어 검출된 후 수집된다. 항체는 종래의 방법이 사용되어 여과 및 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체는 또한 종래의 방법, 예컨대 분자체 및 이온 교환법이 사용되어 제거될 수 있다. 획득된 생성물은, 예컨대 -70℃에서 즉시 동결되어야 하거나, 동결건조되어야 한다.
"투여하는 것", "제공하는 것" 및 "치료하는 것"이란 용어가 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 이는 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여하는 것", "제공하는 것" 및 "치료하는 것"이란, 예를 들어 치료 방법, 약동학적 방법, 진단 방법, 연구 방법 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉 및 시약과 유체의 접촉을 포함하는데, 이 경우 유체는 세포와 접촉하게 된다. "투여하는 것", "제공하는 것" 및 "치료하는 것"이란, 또한 에컨대 세포를, 시약, 진단제, 결합 조성물로 처리하는 것 또는 또 다른 세포로 시험관내 및 생체외 처리하는 것을 지칭한다. "치료하는 것"이란 용어가 인간, 수의학적 또는 연구용 대상체에 적용될 때, 이는 치료적 치료, 예방적 치료 또는 예방학적 수단, 그리고 연구 및 진단 적용을 지칭한다.
"치료하는 것" 또는 "치료"란, 치료제, 예컨대 본 발명의 접합 화합물중 임의의 것 하나를 포함하는 조성물을, 해당 치료제가 치료 효과를 발휘하는 것으로 공지된 어떤 질환의 증상 1가지 이상을 보이는 환자에 내부적으로나 외부적으로 투여하는 것을 지칭한다. 통상적으로 치료제는 치료중인 환자 또는 모집단에서 질환의 증상 1가지 이상을 경감시키기에 효과적인 양만큼 투여되고, 그 결과 이러한 증상의 퇴행 또는 이러한 증상 발달의, 임상적으로 측정가능한 임의의 정도로의 억제를 유도한다. 임의의 특정 질환 증상을 경감시키기에 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"이라고 지칭되기도 함)은 질환의 상태, 환자의 연령 및 체중, 환자에서 약물이 원하는 치료 효과를 발휘하는 능력과 같은 다양한 요인에 따라 가변적일 수 있다. 질환의 증상이 경감되었는지 여부는, 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 기타 건강 케어 전문인력에 의해 통상적으로 사용되는 임의의 임상 시험 방법에 의해 평가될 수 있다. 비록 본 발명의 구현예(예컨대 치료 방법 또는 생성물)는 모든 환자에서 모든 표적 질환의 증상을 경감시키기에 효과적이지 않을 수 있지만, 당 분야에 공지된 임의의 통계학적 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정, 카이2 검정, 만-휘트니 U 검정, Kruskal-Wallis 검정(H 검정), Jonckheere-Terpstra 검정 및 Wilcoxon 검정에 따라 확정되는 바에 의하면, 이러한 구현예는 통계학적으로 유의미한 수의 환자에서 표적 질환의 증상을 감소시켜야 한다.
"보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"이란, 어떤 단백질중 아미노산이, 유사한 특징(에컨대 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성 또는 백본(backbone)의 입체형태 및 견고성)을 가지는 다른 아미노산으로 대체되되, 단백질의 생물 활성에 변화를 일으키지 않고 변화가 빈번하게 이루어질 수 있는 것을 지칭한다. 당 업자는, 일반적으로 말해서 폴리펩티드 불필수 영역내 단일 아미노산 대체는 실질적으로 생물 활성을 변경시키지 않음을 알고 있다[예컨대 문헌(Watson et al.(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p224,(4th edition))을 참조한다]. 뿐 아니라, 유사한 구조 또는 기능을 가지는 아미노산의 대체는 생물 활성을 좀처럼 억제할 것으로 보이지는 않는다. 예시적인 보존적 치환은 이하 표 1("아미노산의 예시적인 보존적 치환")에 진술되어 있다.
표 1
Figure pct00001
"유효량" 또는 "유효 투여량"이란, 유리하거나 원하는 임의의 치료 결과 1가지 이상을 얻는데 필요한, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 사용의 경우, 유리하거나 원하는 결과로서는 장애의 발생 위험 제거 또는 감소, 장애의 중증도 감소 또는 장애의 발병 지연, 예컨대 장애의 생화학, 병력 및/행동 증상, 이의 합병증, 그리고 해당 장애의 진행중에 나타나는 중간단계의 병리학적 표현형을 포함한다. 치료적 적용의 경우, 유리하거나 원하는 결과로서는 임상 결과, 예컨대 본 발명의 표적 항원과 관련된 다양한 장애 발생의 감소 또는 해당 장애의 증상 1가지 이상의 경감, 해당 장애를 치료하는데 필요한 기타 제제의 투여량 감소, 또 다른 제제의 치료 효과 향상 및/또는 본 발명의 표적 항원과 관련된 환자에서 장애 진행의 지연을 포함한다.
"외인성"이란, 성분이 환경에 따라 유기체, 세포 또는 인간의 신체 외부에서 생성된 경우를 지칭한다. "내인성"이란, 성분이 환경에 따라 세포, 유기체 또는 인간의 신체 내부에서 생성된 경우를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"이란 표현은 호환되어 사용되는 것으로서, 이 표현이 가리키는 것에는 자체의 자손도 포함된다. 따라서 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 용어는, 계대배양의 횟수와는 상관없이, 1차 시험 세포 및 이로부터 유래한 배양액을 포함한다. 의도적이거나 의도적이지 않은 돌연변이로 말미암아 모든 자손은 DNA 함량면에서 정확하게 동일할 수는 없음도 또한 이해되어야 할 것이다. 형질전환된 원래 세포를 대상으로 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 가지는 돌연변이 자손이 포함된다. 상이한 명칭들이 참조될 때, 그것이 무엇을 의미하는 것인지는 내용을 통해 명료해질 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"이란, 예컨대 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 부분 미량만큼이 증폭되는 방법 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로 말해서, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 디자인될 수 있기 위해서는 표적 영역의 말단 또는 외부로부터 서열 정보를 수득할 필요가 있는데; 이 프라이머는 서열의 관점에서 증폭될 주형의 대응 가닥과 동일하거나 유사하다. 프라이머 2개의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭될 재료 말단과 일치할 수 있다. PCR은 총 세포성 RNA, 파아지 또는 플라스미드 서열 등으로부터 전사된 cDNA 서열 및 총 게놈 DNA로 부터 특정의 RNA 서열, 특정의 DNA 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌[Mullis, et al.,(1987) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 51: 263; Ed. Erlich(1989) PCR TECHNOLOGY(Stockton Press, N.Y.)]을 참조한다. 본원에 사용된 PCR은 예시적인 것으로 간주되지만, 핵산 시험 시료를 증폭시키기 위한 핵산 중합효소 반응 방법 단 1가지는 그렇지 않으며, 이 방법은 공지의 핵산을 프라이머로 사용하는 것과, 핵산의 특정 일부를 증폭 또는 제조하기 위해 핵산 중합효소를 사용하는 것을 포함한다.
"단리된"이란, 정제된 상태를 지칭하고, 이 경우에는 지정된 분자가 다른 생물분자, 예컨대 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 재료(예컨대 세포 파편 및 성장 배지)로부터 실질적으로 분리된 상태를 의미한다. 일반적으로 "단리된"이란 용어는, 이러한 성분, 물, 완충제 또는 염이 본원에 기재된 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 유의미하게 방해할만큼의 양으로 존재하지 않는다면, 해당 성분의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 의미하지 않는다.
"선택적" 또는 "선택적으로"란 용어는, 이후 기재될 이벤트나 환경이 발생/조성될 수 있지만 반드시 그러한 것은 아닌 경우, 그리고 그 기재가 이벤트나 환경이 발생/조성되거나 발생하지 않는/조성되지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
"약학 조성물"이란 용어는, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물중 1개 이상과, 기타 화학적 성분, 예컨대 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물의 용도는, 유기체로의 투여를 촉진하여, 활성 성분의 흡수를 가속화하고, 이로써 생물 활성을 발휘시키기 위함이다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는, 항체 또는 항원 결합 단편의 전달을 위한 제제에 사용하기 적합한 임의의 불활성 성분을 지칭한다. 담체는 부착 방지제, 결합제, 코팅, 붕해제, 충전제 또는 희석제, 보존제(예컨대 항산화제, 항균제 또는 항진균제), 감미제, 흡수지연제, 습윤제, 유화제, 완충제 등일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 적합한 것의 예로서는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로판디올 및 폴리에틸렌글리콜), 덱스트로스, 식물성 오일(예컨대 올리브 오일), 염수, 완충제, 완충 염수 및 등장제, 예컨대 당, 폴리올, 솔비톨 및 염화나트륨을 포함한다.
또한, 본 발명은 표적 항원(예컨대 ANGPTL3)의 양성 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 제제를 포함하고, 이 제제는 활성 성분으로서 본 발명의 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
질환이 ANGPTL3과 관련된 질환인 한, 본 발명에서 ANGPTL3과 관련된 질환에 제한은 없다. 예를 들어 본 발명의 분자에 의해 유도되는 치료 반응은 본 발명의 분자가 인간 ANGPTL3과 결합한 후 ANGPTL3과 자체의 수용체의 결합을 차단함으로써 달성될 수 있다. 그러므로 본 발명의 분자가 치료적 적용에 적합한 제제 및 제형중에 있을 때, 이 분자는 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 또는 죽상경화성질환 등을 앓고있는 개체에 매우 유용하다.
뿐 아니라, 본 발명은 표적 항원(예컨대 ANGPTL3)의 면역검출 또는 확정을 위한 방법, 표적 항원(예컨대 인간 ANGPTL3)의 면역검출 또는 확정을 위한 시약, 표적 항원(예컨대 인간 ANGPTL3)을 발현하는 세포의 면역검출 또는 확정을 위한 방법, 표적 항원(예컨대 인간 ANGPTL3)을 특이적으로 인지하고, 이의 세포외 영역 또는 3차원 구조의 아미노산 서열과 결합하는, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 활성 성분으로서 포함하는, 표적 항원(예컨대 ANGPTL3) 양성 세포와 관련된 질환을 진단하기 위한 진단제에 관한 것이다.
본 발명에서, 표적 항원(예컨대 ANGPTL3)을 검출하거나 그 양을 확정하는데 사용되는 방법은 임의의 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어 이 방법은 면역검출 또는 확정 방법을 포함한다.
면역검출 또는 확정 방법은 표지화된 항원 또는 항체를 사용하여 항체 또는 항원을 검출하거나 그 양을 확정하는 방법이다. 면역검출 또는 확정 방법의 예는 방사성면역검정(RIA), 효소면역검정(EIA 또는 ELISA), 형광면역검정(FIA), 발광면역검정, 웨스턴블럿팅, 물리화학적방법 등을 포함한다.
ANGPTL3의 양성 세포와 관련된 전술 질환은, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 ANGPTL3을 발현하는 세포를 검출하거나 확정하여 진단될 수 있다.
폴리펩티드를 발현하는 세포를 검출하기 위해, 바람직하게 면역침전법, 형광세포염색, 면역조직화학적염색 등과 같이 공지된 면역검출 방법이 사용될 수 있다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(Applied Biosystem)이 사용되는 형광 항체 염색 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서, 시료, 예컨대 조직구, 혈액, 혈장, 혈청, 췌장액, 소변, 대변, 조직액 또는 배양용액이 표적 항원(예컨대 ANGPTL3)을 발현하는 세포를 포함할 가능성이 있는 한, 표적 항원(예컨대 ANGPTL3)을 검출 또는 확정하는데 사용되는 시료에 특별한 제한은 없다.
필요한 진단 방법에 따르면, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 항체 단편을 함유하는 진단제는 또한 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약 또는 이 반응을 검출하기 위한 시약을 함유할 수 있다. 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약은 완충제, 염 등을 포함한다. 검출을 위한 시약은 면역검출 또는 확정 방법에 통상 사용되는 시약, 예컨대 모노클로날 항체, 이의 항체 단편 또는 이의 접합체를 인지하는 표지화된 2차 항체와, 표지에 대응하는 기질 등을 포함한다.
본 발명의 구현예 1개 이상은 상기 발명의 설명에 상세히 기재되어 있다. 바록 본원에 기재된 방법과 재료와 유사하거나 동일한 임의의 방법과 재료도 또한 본 발명을 수행하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료가 이하에 기재되어 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 발명의 설명과 청구 범위로부터 명백할 것이다. 발명의 설명과 청구 범위에서, 맥락중 달리 명확하게 명시되어 있지 않는 한 단수 형태는 복수의 대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자들에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 참고문헌으로 인용된다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 더욱 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 스프라그 돌리(Sprague Dawley; SD) 래트의 혈청중 트리글리세라이드에 대한 항체 P8BG의 효과를 보여주는 것이고;
도 2는 SD 래트의 혈청중 트리글리세라이드에 대한 항체 P3G의 효과를 보여주는 것이며;
도 3은 고지방식(High-Fat-Diet; HFD) 마우스의 혈장중 트리글리세라이드에 대한 항ANGPTL3 항체의 효과를 보여주는 것이고;
도 4는 HFD 마우스의 혈장중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C)에 대한 항ANGPTL3 항체의 효과를 보여주는 것이며;
도 5는 HFD 마우스의 혈장중 총 콜레스테롤에 대한 항ANGPTL3 항체의 효과를 보여주는 것이고;
도 6은 APOE 마우스(아포지단백 E(ApoE) 유전자 녹아웃 마우스)의 혈장중 트리글리세라이드에 대한 항ANGPTL3 항체의 효과를 보여주는 것이며;
도 7은 APOE 마우스의 혈장중 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)에 대한 항ANGPTL3 항체의 효과를 보여주는 것이고;
도 8은 마우스에서 항ANGPTL3 항체의 생체내 약동학적 실험의 결과를 보여주는 것이며;
도 9는 사이노몰거스 원숭이에서 항ANGPTL3 항체의 생체내 약동학적 실험의 결과를 보여주는 것이다.
이하 실시예는 본 발명을 추가로 설명하고 있지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예 또는 시험 실시예에 명시된 조건이 조성되지 않은 실험 절차는 종래의 조건 또는 출발 재료나 시판품의 제조사에 의해 권장되는 조건에 따라 진행한다. 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory"; Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY]을 참조한다. 구체적인 출처가 표시되지 않은 시약은 시중에서 구입할 수 있는 종래의 시약이다.
실시예
실시예 1: ANGPTL3 항원의 디자인 및 발현
인간 ANGPTL3 단백질(Uniprot 번호: Q9Y5C1), 마우스 ANGPTL3 단백질(Uniprot 번호: Q9R182), 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3 단백질(Uniprot 번호: A0A2K5UDC5) 및 래트 ANGPTL3 단백질(Uniprot 번호: F7FHP0)을 본 발명의 ANGPTL3 주형으로 사용하여, 항원 및 단백질 디자인을 도모하여, 본 발명과 관련된 검출을 수행하였다. 상이한 태그를 ANGPTL3 단백질에 융합하였으며, 수득한 단백질 각각을 pTT5 벡터(Biovector, Cat #: 102762)에 클로닝하여 293 세포에서 일시적 형질감염 발현을 실시하여 정제하였으며, 그 결과 본 발명의 검출을 위한 항원과 단백질을 수득하였다.
1. 전장 인간 ANGPTL3: 면역화 및 검출에 사용되고, 이하의 아미노산 서열을 가지는 인간-ANGPTL3(17-460)-His:
Figure pct00002
주의: 일중으로 밑줄친 부분은 신호 펩티드 서열을 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 His 서열을 나타내며, 굵은 글씨체 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 460번 위치의 아미노산을 나타낸다.
2. 인간 ANGPTL3의 세포외 영역: 면역화 및 검출에 사용되고, 이하의 아미노산 서열을 가지는 인간 ANGPTL3(17-170)-Flag-His:
Figure pct00003
주의: 일중으로 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 링커 펩티드를 나타내며, 이탤릭체로 표시한 부분은 Flag 및 His를 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 170번 위치의 아미노산을 나타낸다.
3. 인간 ANGPTL3 세포외 영역(인간 ANGPTL3(17-170)) 및 마우스 IgG2a Fc 단편(mFc로 축약하여 표시)의 융합 단백질: 검출에 사용되고 이하 아미노산 서열을 가지는 인간 ANGPTL3(17-170)-mFc:
Figure pct00004
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 170번 위치의 아미노산을 나타낸다.
4. 인간 ANGPTL3의 세포외 영역(인간 ANGPTL3(17-220)) 및 마우스 IgG2aFc 단편의 융합 단백질: 면역화 및 검출에 사용될 수 있고, 이하의 아미노산 서열을 가지는 인간 ANGPTL3(17-220)-mFc:
Figure pct00005
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 220번 위치의 아미노산을 나타낸다.
5. 전장 마우스 ANGPTL3: 면역화 및 검출에 사용되고, 이하 아미노산 서열을가지는 마우스 ANGPTL3(17-455)-His:
Figure pct00006
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 His 서열을 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 마우스 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 455번 위치의 아미노산을 나타낸다.
6. 마우스 ANGPTL3의 세포외 영역(마우스-ANGPTL3(17-220)) 및 마우스 IgG2aFc 분절의 융합 단백질: 면역화에 사용되고, 이하의 아미노산 서열을 가지는 마우스 ANGPTL3(17-220)-mFc:
Figure pct00007
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 마우스 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 220번 위치의 아미노산을 나타낸다.
7. 전장 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3: 검출에 사용되고, 이하 아미노산 서열을 가지는 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His:
Figure pct00008
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 His 서열을 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 460번 위치의 아미노산을 나타낸다.
8. 전장 래트 ANGPTL3: 검출에 사용되고, 이하의 아미노산 서열을 가지는 래트 ANGPTL3(17-455)-His:
Figure pct00009
주의: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 His 서열을 나타내고, 굵은 글씨체 부분은 전장 래트 ANGPTL3 단백질의 17번 ~ 455번 위치의 아미노산을 나타낸다.
실시예 2: ANGPTL3 항원 단백질, 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제
1. His-태그를 가지는 재조합 단백질 또는 Flag-His 태그를 가지는 재조합 단백질의 정제
세포 발현 시료를 고속으로 원심분리하여 세포와 불용성 불순물을 제거하고, 상청액을 수집하였으며, 여기에 이미다졸을 첨가하여 최종 농도 5 mM에 도달하게 만들었다. 니켈 컬럼을, 5 mM 이미다졸 함유 PBS 용액으로 평형화하고 나서, 2 ~ 5 컬럼 부피로 세척하였다. 그 다음, 세포 상청액을 컬럼상에 로딩(loading)하였다. A280 판독결과가 기준선으로 강하할 때까지 컬럼을 5 mM 이미다졸 함유 PBS 용액으로 세척하였다. 이후, 크로마토그래피 컬럼을 PBS 및 10 mM 이미다졸의 혼합물로 세척하여, 비특이적으로 결합한 불순물 단백질을 제거하였으며, 이 컬럼을 통과하여 흐른 유체를 수집하였다. 표적 단백질을 300 mM 이미다졸 함유 PBS 용액과 함께 용리하였으며, 용리 피크(elution peak)에 용리된 물질을 수집하였다.
수집한 용리액을 Superdex 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제하고 나서, 튜브에 수집하여 두었다. 수득한 시료를 SDS-PAGE, 펩티드 맵핑(peptide mapping) 및 LC-MS로 동정한 다음, 그것이 올바른 것으로서 확정되면 추후 사용을 위해 분액하여 두었다. 즉 His 태그를 가지는 재조합 단백질 또는 Flag-His 태그를 가지는 재조합 단백질을 수득하였다.
2. mFc 태그를 가지는 하이브리도마 항체 또는 재조합 단백질의 정제
시료를 고속으로 원심분리하여 세포와 불용성 불순물을 제거한 다음, 상청액을 체류시켰다. 단백질 A 친화성 컬럼을 1 x PBS로 평형화한 다음, 2 ~ 5 컬럼 부피로 세척하였다. 원심분리한 세포 발현 상청액 시료를 컬럼상에 로딩하였다. A280 판독결과가 기준선으로 강하할 때까지 컬럼을 1 x PBS로 세척하였다. 그 다음, 컬럼을 1 x PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 0.1 M 아세트산(pH 3.5-4.0)와 함께 용리한 다음, 수집한 직후, 용리된 단백질의 pH를 1 M Tris-HCl(pH 7.0)을 사용하여 중성으로 조정한 다음, 최종적으로 용리된 단백질을 대상으로 투석 또는 1 x PBS 완충제로의 완충제 교환을 실시하였다. 시료를 수집하고 나서, 전기영동, 펩티드 맵핑 및 LC-MS로 동정한 후, 그것이 올바른 것으로서 확정되면 추후 사용을 위해 분액하여 두었다. 즉 mFc 태그를 가지는 재조합 단백질 또는 하이브리도마 항체를 수득하였다.
3. Fc 태그를 가지는 항체 및 재조합 단백질의 정제
시료를 고속에서 원심분리하여 세포와 불용성 불순물을 제거한 다음, 상청액을 체류시켰다. 단백질 G 친화성 컬럼을 1 x PBS로 평형화한 다음, 2 ~ 5 컬럼 부피로 세척하였다. 원심분리한 세포 발현 상청액 시료를 컬럼상에 로딩하였다. A280 판독결과가 기준선으로 강하할 때까지 컬럼을 1 x PBS로 세척하였다. 그 다음, 컬럼을 1 x PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 아세트산(pH 3.0)과 함께 용리한 다음, 수집한 직후, 용리된 단백질의 pH를 1 M Tris-HCl(pH 7.0)을 사용하여 중성으로 조정한 다음, 최종적으로 용리된 단백질을 대상으로 투석 또는 1 x PBS 완충제로의 완충제 교환을 실시하였다. 시료를 수집하고 나서, 전기영동, 펩티드 맵핑 및 LC-MS로 동정한 후, 그것이 올바른 것으로서 확정되면 추후 사용을 위해 분액하여 두었다. 즉 hFc 태그를 가지는 재조합 단백질 또는 항체를 수득하였다.
실시예 3: 항ANGPTL3 항체의 제조
1. 파아지 라이브러리에 의한 항ANGPTL3 인간 유래 항체의 스크리닝
인간 파아지 단일 사슬 항체 라이브러리를 패키징(packaging) 및 농축한 다음, 파아지 라이브러리(1012 ~ 1013/pfu)를 2% MPBS(2% 탈지 분유 함유 PBS) 1 mL중에 현탁한 다음, 여기에 Dynabeads® M-280 스트렙타비딘(Invitrogen, Cat No. 11206D) 100 μL를 첨가하였다. 튜브를 회전판위에 놓고 반복해서 회전시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 차단(blocking)하였다. 이후 튜브를 자성을 띠는 선반위에 2분 동안 놓은 후, Dynabeads를 제거하고 나서, 파아지 라이브러리를 새 튜브에 옮겨담았다. 바이오틴 표지화 인간 ANGPTL3(17-460)-His 2 μg/mL를, 차단한 파아지 라이브러리에 첨가한 다음, 튜브를 회전판위에 놓고 1시간 동안 반복해서 회전시켰다. 이와 동시에 Dynabeads 100 μL를 2% MPBS 1 mL중에 현탁하였으며, 이후 튜브를 회전판위에 놓고 반복해서 회전시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 그 다음, 튜브를 자성을 띠는 선반위에 2분 동안 놓은 후, 차단용 용액을 피펫으로 흡인하여 제거하였다. 차단한 Dynabeads를, 파아지 라이브러리 및 인간 ANGPTL3(17-460)-His의 혼합물에 첨가하고 나서, 이로부터 생성된 혼합물이 담긴 튜브를 회전판위에 놓고 15분 동안 반복해서 회전시켰다. 그 다음, 튜브를 자성을 띠는 선반위에 2분 동안 놓은 후, 혼합 용액을 피펫으로 흡인하여 제거하였다. PBST(0.1% Tween-20 함유 PBS) 1 mL로 Dynabeads를 10회 세척하였으며, 여기에 1 mg/mL 트립신(Sigma, Cat No. T1426-250MG) 0.5 mL를 첨가하였다. 그 다음, 튜브를 회전판위에 놓고, 15분 동안 반복적으로 회전시키면서 항온처리한 후, 용리를 진행하였다. 이후, 용리된 파아지를 이.콜라이 TG1(E. coli TG1)을 감염시키는데 사용하였으며, 추후 이.콜라이 TG1은 도말에 사용하였다. 파아지 ELISA를 수행하기 위해 단일 클론을 무작위로 골라냈다.
클론을 96웰 심부 웰 평판(Nunc Cat No. 260251)에 접종하여, 37℃에서 16시간 ~ 18시간 동안 항온처리하였다. 항온처리한 클론 소수를 OD600이 약 0.5에 도달할 때까지 또 다른 96웰 심부 웰 평판에 접종하고 나서, M13K07 헬퍼 파아지(NEB, Cat No. N0315S)를 첨가하여 팩키징을 도모하였다. 혼합물을 4000 g에서 10분 동안 원심분리하여 세균을 제거하였으며, 배양 용액을 피펫으로 꺼내어 ANGPTL3 결합의 ELISA 검출을 도모하였다. 양성 클론 변종을 초저온보존한 후, 서열결정을 위해 서열결정 업체에 보냈다. 양성 클론 P3 및 P8에 대응하는 아미노산 서열은 이하와 같다:
Figure pct00010
주의: 서열내 밑줄친 부분은 Kabat 번호메김 체계에 따라 확정된 CDR 서열을 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 FR 서열을 나타낸다.
2. 항ANGPTL3 항체의 돌연변이
P8 항체의 3차원 구조를 기반으로, P8 중쇄 가변 영역내 (자연상 순서대로 번호를 메겨) 55번 위치의 아미노산 잔기를 D에서 E로 돌연변이시켰으며, P8 경쇄 가변 영역내 (자연상 순서대로 번호를 메겨) 34번 위치의 아미노산 잔기를 G에서 V로 돌연변이시켜, 신규 항체 분자 P8B를 수득하였는데, 이때 P8B의 아미노산 서열은 이하와 같다:
Figure pct00011
주의: 서열내 밑줄친 부분은 Kabat 번호메김 체계에 따라 확정된 CDR 서열을 나타내고, 이탤릭체로 표시한 부분은 FR 서열을 나타낸다.
표 2
Figure pct00012
3. 항ANGPTL3 항체의 구성 및 발현
프라이머를 디자인한 다음, PCR에 의해 항체의 VH/VK 유전자 단편을 구성하여, 이를 대상으로 (신호 펩티드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편을 보유하는) 발현 벡터 pHr과의 상동성 재조합을 수행함으로써, 전장 항체에 대한 발현 벡터 VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr을 구성하였다. 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG4의 불변 영역 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있었으며, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 및 λ 사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있었다. 예시적으로 항체 중쇄 불변 영역은 서열 번호 29에 제시된 서열을 가지는 인간 IgG4-YTE 변이체로부터 선택하였고, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 30에 제시된 서열을 가지는 인간 κ 사슬의 불변 영역으로부터 선택하였다.
Figure pct00013
예시적으로, 전술된 경쇄/중쇄 불변 영역은 전술된 P3, P8 및 P8B의 가변 영역과 함께 완전 항ANGPTL3 항체를 형성하였으며: P3G, P8G 및 P8BG, 그리고 이 항체들의 경쇄/중쇄 서열은 이하와 같다:
Figure pct00014
Figure pct00015
생화학적 시험 방법에 의한 본 발명의 항체 활성 인증
시험 실시예 1: ANGPTL3 단백질과 항ANGPTL3 항체의 결합에 대한 ELISA 검정
항ANGPTL3 항체는 ANGPTL3 단백질과 결합함으로써 ANGPTL3 단백질 활성 적어도 1가지를 억제하거나 방해하였다. 항ANGPTL3 항체의, ANGPTL3 항원과에 대한 결합 활성을 ELISA 검정에 의해 시험하였다. ANGPTL3 단백질(인간 ANGPTL3(17-170)-mFc)을, 96웰 미세평판상에 코팅한 염소 항마우스 IgG와 결합시킴으로써 이 미세평판상에 부동화하였으며, 항체의 ANGPTL3에 대한 결합 활성은, 항체를 첨가한 후 신호 세기에 따라 확정하였다. 이러는 와중에 HIS 태그를 가지고, 바이오틴 표지화 키트(Dojindo China, LK03)로 표지화한 ANGPTL3 단백질들(마우스 ANGPTL3(17-455)-His, 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His)을, 96웰 미세평판상에 코팅한 스트렙타비딘과 결합킴으로써 이 미세평판상에 부동화하였으며, 항체를 첨가한 후 신호 세기에 따라 항체의 ANGPTL3에 대한 결합 활성을 확정하였다.
염소 항마우스 IgG(Sigma, M3534-1ML)를, 농도 2 μg/mL가 되도록 PBS 완충제(Shanghai BasalMedia, B320, pH 7.4)로 희석한 다음, 96웰 미세평판(Corning, CLS3590-100EA)에 첨가한 다음(50 μL/웰), 항온처리기내에서 3시간 동안 항온처리(37℃하였거나, 또는 밤새도록(16시간 ~ 18시간) 항온처리(4℃하였다. 액체를 폐기한 다음, PBS로 희석한 5% 탈지유(BD, 232100) 차단 용액을 첨가하였으며(250 μL/웰), 혼합물을 항온처리기내에서 3시간 동안 항온처리(37℃하였거나, 또는 밤새도록(16시간 ~ 18시간) 항온처리(4℃하여 차단을 도모하였다. 차단과정을 종료한 후, 차단 용액을 폐기하고 나서 평판을 PBST 완충제(0.05% Tween-20 함유 PBS; pH 7.4)로 3회 세척한 후, 시료 희석제(1% BSA 함유 PBS; pH 7.4)를 사용하여 0.5 μg/mL로 희석한 인간 ANGPTL3(17-170)-mFc(서열 번호 3에 제시된 서열 보유)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 이 혼합물을 항온처리기내에서 2시간 동안 항온처리(37℃하였다. 항온처리를 끝낸 후, 미세평판내 반응 용액을 폐기하였다. 평판을 PBST로 3회 세척하고 나서, 시료 희석제로써 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 항온처리기내에서 2시간 동안 항온처리(37℃하였다. 항온처리를 마친 후, 평판을 PBST로 3회 세척하고 나서, 시료 희석제로써 희석한 염소 항인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 109-035-003)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 항온처리(37℃하였다. 평판을 PBST로 3회 세척하고 나서, TMB 발색 기질(KPL, 52-00-03)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2분 ~ 5분 동안 항온처리하였으며, 1 M H2SO4를 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 종결시켰다. VersaMax 미세평판 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였으며, ANGPTL3 항원 단백질에 대한 항ANGPTL3 항체의 결합 EC50 값을 산정하였다. 실험 결과를 표 3에 제시하였다.
스트렙타비딘(Sigma, S4762-5MG)을 PBS 완충제(Shanghai BasalMedia, B320, pH 7.4)로써 농도 3 μg/mL로 희석한 다음, 96웰 미세평판(Corning, CLS3590-100EA)에 50 μL/웰로 첨가하고 나서, 항온처리기내에서 3시간 동안 항온처리(37℃하였거나, 또는 밤새도록(16시간 ~ 18시간) 항온처리(4℃하였다. 액체를 폐기한 다음, PBS로 희석한 5% 탈지유(BD, 232100) 차단 용액을 250 μL/웰로 첨가하였으며, 혼합물을 항온처리기내에서 3시간 동안 항온처리(37℃하였거나, 또는 밤새도록(16시간 ~ 18시간) 항온처리(4℃하여 차단을 도모하였다. 차단을 마친 후, 차단 용액을 페기하였으며, 평판을 PBST 완충제(0.05% Tween-20 함유PBS; pH 7.4)로 3회 세척하였으며, 바이오틴 표지화 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 5에 제시된 서열 보유), 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(서열 번호 7에 제시된 서열 보유) 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 8에 제시된 서열 보유)(각각 시료 희석제(1% BSA 함유 PBS; pH 7.4)로써 0.5 μg/mL로 희석함)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 항온처리기내에서 2시간 동안 항온처리(37℃하였다. 항온처리를 마친 후, 미세평판내 반응 용액을 폐기하였다. 평판을 PBST로 3회 세척한 다음, 시료 희석제로써 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 항온처리기내에서 2시간 동안 항온처리(37℃하였다. 항온처리를 마친 후, 평판을 PBST로 3회 세척한 다음, 시료 희석제로 희석한 HRP 표지화 염소 항마우스 2차 항체(Jackson Immuno Research, 115-035-003), 염소 항인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 109-035-003) 또는 마우스 HRP/항M13 접합체 2차 항체(Sino Biological, Cat No. 11973-MM05-100, 파아지 스크리닝에 사용)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 항온처리(37℃하였다. 평판을 PBST로 3회 세척한 다음, TMB 발색 기질(KPL, 52-00-03)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2분 ~ 5분 동안 항온처리한 다음, 1 M H2SO4를 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 종결시켰다. VersaMax 미세평판 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였으며, ANGPTL3 항원 단백질에 대한 항ANGPTL3 항체의 결합 EC50 값을 산정하였다. 실험 결과를 표 3에 제시하였다. 결과는, 본 발명의 항ANGPTL3 항체가 상이한 종의 ANGPTL3 단백질과 결합할 수 있음을 보여준다.
표 3
Figure pct00016
시험 실시예 2: 항ANGPTL3 항체와 ANGPTL3 항원 단백질 결합에 대한 HTRF 검정
HTRF 검정도 또한 항ANGPTL3 항체의 항원에 대한 결합 활성을 검출하는데 사용하였다. 바이오틴 표지화 키트(Dojindo China, LK03)로 표지화한 것으로서, HIS 태그를 가지는 ANGPTL3(인간 ANGPTL3(17-460)-His, 마우스 ANGPTL3(17-455)-His, 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His)는 HTRF 시약인 스트렙타비딘-Tb 크립타타(cryptata)(Cisbio, 610SATLA)와 결합하였는데, 항체를 첨가한 후 항체는 HTRF 시약 Pab 항마우스 IgG-XL665(Cisbio, 61PAMXLA) 및 안지오포이에틴 유사 단백질 3과 결합하였다. 항체의 안지오포이에틴 유사 단백질 3에 대한 결합 활성을 확정하기 위해 신호 세기를 사용하였다.
희석제(1% BSA 함유 PBS; pH 7.4)를 사용하여, 4 μg/mL의 바이오틴 표지화 인간 ANGPTL3(17-460)-His(서열 번호 1에 제시된 서열 보유), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 5에 제시된 서열 보유), 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(서열 번호 7에 제시된 서열 보유) 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 8에 제시된 서열 보유) 각각을 제조하고 나서, 384웰 평판(PerkinElmer, Optiplatte-384)에 5 μL/웰로 첨가하였으며, 이후 HTRF 시약 스트렙타비딘-Tb 크립타타 및 Pab 항마우스 IgG-XL665의 혼합 용액을 5 μL/웰로 첨가하였으며, 최종적으로 시료 희석제로써 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 10 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 값을 PHERAstar FS(BMG LabTECH)를 사용하여 HTRF 모듈로 판독하였으며, 안지오포이에틴 유사 단백질 3에 대한 항ANGPTL3 항체의 결합에 대한 EC50 값을 산정하였다. 실험 결과를 표 4에 보였다. 결과는, 본 발명의 항체는 모두 인간, 마우스, 사이노몰거스 원숭이, 래트 및 기타 종의 ANGPTL3 항원에 대하여 우수한 결합 활성을 가짐을 보여준다.
표 4
Figure pct00017
시험 실시예 3: 항 ANGPTL3 항체에 의한 LPL 억제에 대한 효소 활성 검정
LPL의 효소 활성 검출 실험을 사용하여, ANGPTL3 단백질에 의한 LPL 효소의 억제를 차단함에 있어 항ANGPTL3 항체의 활성을 검출하였다.
소 LPL(Sigma, L2254-5KU)을 희석 완충제(pH 7.4 PBS + 2 mg/mL BSA)로써 12.5 유닛으로 희석하여, 96웰 평판(Corning, 3603)에 25 μL/웰로첨가한 후, 시료 희석제로써 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 25 μL/웰로 첨가한 다음, 27.6 μg/mL의 ANGPTL3 단백질(인간 ANGPTL3(17-170)-Flag-His(서열 번호 2에 제시된 서열 보유), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 5에 제시된 서열 보유), 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(서열 번호 7에 제시된 서열 보유) 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 8에 제시된 서열 보유))을 25 μL/웰로 첨가하였다. 96웰 평판을 진탕기상에서 진탕하여 혼합물을 잘 혼합한 다음, 이 혼합물을 항온처리기(37℃내에서 30분 동안 항온처리하였다. 마지막으로 희석 완충제로 희석한 20 μM 기질(Sigma, 30058-10MG-F)을 25 μL/웰로 첨가하였으며, 96웰 평판을 진탕기상에서 진탕시켜 혼합물을 잘 혼합하였고, 이후 이 혼합물을 항온처리기(37℃내에서 30분 동안 항온처리하였다. Flexstation3 미세평판 판독기를 사용하여 Ex535/Em612를 판독하였다. Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 농도 및 대응하는 형광도 데이터를 처리하여 IC50을 산정하였다. 실험 결과를 표 5에 제시하였다. 결과는, 본 발명의 항체가 LPL 효소에 대해 우수한 억제 효과를 발휘하였음을 보여준다.
표 5
Figure pct00018
시험 실시예 4: 항ANGPTL3 항체 및 ANGPTL3 단백질의 Biacore 검정
Biacore를 사용하여, 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 ANGPTL3에 대한 시험 항ANGPTL3 항체의 친화성을 확정하였으며, 그 방법은 이하와 같았다:
시험 항체 임의의 양만큼을 대상으로 단백질 A 바이오센서 칩(Cat. # 29127556, GE)에 의해 친화성 포착(affinity capture)을 진행시키고 나서, 임의의 농도의 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 ANGPTL3 항원(인간-ANGPTL3(R&D, 3829-AN), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 5에 제시된 서열 보유), 사이노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(서열 번호 7에 제시된 서열 보유) 및 래트 ANGPTL3(17-455)-His(서열 번호 8에 제시된 서열 보유)) 각각을, 이 칩 표면을 통과하여 흐르게 하였다. Biacore T200 기기를 사용하여 반응 신호를 실시간으로 검출함으로써, 결합 및 해리 곡선을 획득하였다. 해리 주기가 끝날때마다 바이오칩을 세척하고, 글리신-염화수소산 재생 용액(Cat. # BR-1003-54, GE, pH 1.5)을 사용하여 재생시켰다. 실험용 전개 완충제는 1 x HBS-EP 완충제(Cat. # BR-1001-88, GE)였다. 실험으로부터 수득한 데이터를, GE Biacore T200 평가 소프트웨어(3.0 버전)를 사용하여 (1:1) 랑뮈르 모델(Langmuir model)로 피팅(fitting)함으로써 친화성 값을 수득하였다. 실험 결과를 표 6에 보였다. 결과는, 본 발명의 항ANGPTL3 항체는 인간, 사이노몰거스 원숭이, 래트 및 마우스 ANGPTL3 항원과 큰 친화성으로 결합할 수 있음을 보여준다.
표 6
Figure pct00019
시험 실시예 5: 래트에서 항ANGPTL3 항체의 생체내 효능 평가
1. 래트에서 항체 P8BG의 생체내 지질 강하 실험
실험용 SD 래트(4주령, SPF, 약 100 g, 수컷, Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입; 인증 번호: 20170005013017, SCXK(Shanghai) 2017-0005)를 대상으로 실험실 환경(12시간/12시간, 명주기/암주기, 온도 23±1℃, 습도 40% ~ 50%)에서 1주일간의 적응 급식을 실시한 다음, 동물들에게 표준 멸균 마우스 사료를 공급하였는데, 이때 동물들이 사료와 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 실험 개시 7일 전, 동물들을 4시간 동안 금식시킨 다음, 안와로부터 채혈하여 3500 rpm에서 15분 동안 원심분리함으로써 혈청을 수집하였다. ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈청중 지질(트리글리세라이드) 농도를 확정하였다. 래트를, 트리글리세라이드 수준에 따라 6개의 군으로(각 군당 래트 6마리씩) 나누었다[무관 이소타입 인간 IgG 단백질(hIgG, 이하와 같음)(음성 대조군), 에비나쿠맙(서열 구조파악용, WHO Drug Information, Vol. 29, No. 3, 2015의 에비나쿠맙 서열 참조) 3.5 mpk군, 에비나쿠맙 7 mpk군, P8BG 3.5 mpk군, P8BG 1.75 mpk군 및 P8BG 7 mpk군]. 모든 군에 있는 래트 각각을 대상으로 1회 피하 주사를 실시한 후, 주사후 1일차, 5일차, 9일차, 13일차 및 16일차에 4시간 금식후 채혈을 실시하였다. 혈청을 분리해낸 다음, ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈청중 지질(트리글리세라이드) 농도를 확정하였다. 실험 데이터는 평균±표준편차(평균±SEM)로 표현하였으며, Graphpad Prism5 소트트웨어를 사용하여 플롯(plot)을 작성하였고, 통계 분석을 위해 TTEST를 사용하였다.
실험 결과를 도 1과 표 7에 보였다. 음성 대조군 1과는 비교되게, 투여후 1일차에 처리군 각각의 트리글리세라이드는 감소하였으며, 에비나쿠맙 3.5 mpk군을 제외한 군들에서 통계학적 차이가 관찰되었다. 실험이 진행되는 동안, P8BG 7 mpk군의 트리글리세라이드는 최대 83.7%까지 감소하였으며, P8BG 3.5 mpk군의 트리글리세라이드는 최대 81.8%까지 감소하였고, P8BG 1.75 mpk군의 트리글리세라이드는 최대 68.7%까지 감소하였고; 투여후 5일차에 P8BG 3.5 mpk군의 트리글리세라이드는 감소하였고, P8BG 1.75 mpk군 및 P8BG 7 mpk군은 여전히 통계학적 차이를 보였던 반면, 에비나쿠맙 3.5 mpk군 및 에비나쿠맙 7 mpk군은 통계학적 차이를 보이지 않았고; 투여후 9일차에 P8BG 7 mpk군 및 P8BG 3.5 mpk군의 트리글리세라이드 감소는 여전히 통계학적 차이를 보였다. 이는, P8BG가 동일 용량의 에비나쿠맙보다 더욱 효과적이고, 트리글리세라이드 강하 효과를 더 오래 지속시켰음을 나타낸다. 뿐 아니라, 각각의 군의 동물은 실험이 진행되는 동안 정상적인 중량을 보였다.
표 7
Figure pct00020
2. 래트에서 항체 P3G의 생체내 지질 강하 실험
실험용 SD 래트(4주령, SPF, 수컷, Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입; 인증 번호: 20170005013017, SCXK(Shanghai) 2017-0005)를 대상으로 실험실 환경(12시간/12시간, 명주기/암주기, 온도 23±1℃, 습도 40% ~ 50%)에서 1주일간의 적응 급식을 실시한 다음, 동물에게 표준 멸균 마우스 사료를 공급하였는데, 이때 동물들이 사료와 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 실험 개시 7일 전, 동물들을 4시간 동안 금식시킨 다음, 안와로부터 채혈하여 3500 rpm에서 15분 동안 원심분리함으로써 혈청을 수집하였다. ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈청중 지질(트리글리세라이드) 농도를 확정하였다. 래트를, 트리글리세라이드 수준에 따라 4개의 군으로(각 군당 래트 6마리씩) 나누었다[hIgG 음성 대조군, 에비나쿠맙3.5 mpk군, P3G 3.5 mpk군 및 P3G 7 mpk군]. 모든 군에 있는 래트 각각을 대상으로 1회 피하 주사를 실시한 후, 주사후 1일차, 5일차, 9일차 및 13일차에 4시간 금식후 채혈을 실시하였다. 혈청을 분리해낸 다음, ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈청중 지질(트리글리세라이드) 농도를 확정하였다. 실험 데이터는 평균±표준편차(평균±SEM)로 표현하였으며, Graphpad Prism5 소트트웨어를 사용하여 플롯을 작성하였고, 통계 분석을 위해 TTEST를 사용하였다.
실험 결과를 도 2에 보였다. hIgG 음성 대조군과는 비교되게, 투여후 1일차에 처리군 각각의 트리글리세라이드는 감소하였으며, P3G 3.5 mpk군 및 P3G 7 mpk군에서의 감소 정도는 에비나쿠맙 3.5 mpk군에서의 감소 정도보다 컸고; 투여후 9일차에 P3G 3.5 mpk군 및 P3G 7 mpk군의 혈청중 지질 농도는 양성 대조군의 혈청중 지질 농도보다 더 낮게 유지되었다.
시험 실시예 6: 고지방 고콜레스테롤 급식 c57bl /6 마우스에 있어 혈장중 지질 농도에 대한 항ANGPTL3 항체의 생체내 효과 확정
c57bl/6 마우스(4주령, SPF, 약 16 g ~ 18 g, 수컷, Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입; 인증 번호: 201913812, SCXK(Jiangsu) 2016-0010)를 대상으로 실험실 환경(12시간/12시간, 명주기/암주기, 온도 23±1℃, 습도 40% ~ 50%)에서 4주일간의 적응 급식을 실시한 다음(케이지당 동물 5마리), 동물들에게 보통의 사료를 공급하였는데, 이때 동물들이 사료와 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 예비 채혈후 5일차에, 공통적으로 공급하였던 사료를 고지방 고콜레스테롤 사료(D12079B, Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.로부터 구입)로 바꾸어, 실험 막바지까지 마우스에 공급하였다. 실험 개시전 8일차에, 동물을 4시간 동안 금식시키고 나서, 안와로부터 채혈하여 8000 rpm에서 2분 동안 원심분리함으로써 혈장을 수집하였다. ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈장중 지질 농도를 확정하였다. 마우스를, 트리글리세라이드 수준에 따라 4개의 군으로(각 군당 마우스 11마리씩) 나누었으며[hIgG 음성 대조군, 에비나쿠맙 25 mpk군, P8BG 25 mpk군 및 P8BG 5 mpk군], 마우스를 대상으로 1주일에 1회씩 총 8회 피하 주사하였다. 실험 개시후 2주, 3주, 5주, 7주, 9주, 10주 및 11주차에, 각각의 군에 있는 마우스를 4시간 동안 금식시키고 나서, 안와로부터 채혈하고, 혈장을 수집하였다. ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 혈장중 지질(트리글리세라이드(TG), 총 콜레스테롤(TC) 및 LDL 콜레스테롤(LDL-C)) 농도를 확정하였다. 실험 데이터는 평균±표준편차(평균±SEM)로 표현하였고, Graphpad Prism5 소트트웨어를 사용하여 플롯을 작성하였으며, 통계 분석을 위해 TTEST를 사용하였다.
결과를 표 8 ~ 표 10과 도 3 ~ 도 5에 보였다. hIgG 음성 대조군과는 비교되게, 실험 개시후 2주, 3주, 5주 및 7주차에 P8BG 25 mpk군의 TG, TC 및 LDL-C는 유의미하게 감소하였는데; 에비나쿠맙 25 mpk군 및 P8BG 5 mpk군은, 실험 개시후 3주, 5주 및 7주차에 TG, TC 및 LDL-C 감소를 보였다. 실험 개시후 9주차에는 단지 2개의 군, 즉 P8BG 25 mpk군 및 P8BG 5 mpk군만이, hIgG 음성 대조군과 비교하였을 때 유의미한 트리글리세라이드 감소를 보였다. 에비나쿠맙 25 mpk군과는 비교되게, P8BG 25 mpk군은 실험 2주차, 3주차 및 9주차에 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤의 유의미한 감소를 보였고; 에비나쿠맙 25 mpk군과는 비교되게, P8BG 25 mpk군은 실험 2주차 및 9주차에 LDL-C의 유의미한 감소를 보였다. 1주차 ~ 11주차에 걸친 전체 실험 주기 동안 에비나쿠맙 25 mpk군의 TG는 최저 40.5±2.3만큼까지 감소하였는데, 이는 개시시 TG에 비해 32.60% 감소한 것이었으며; P8BG 25 mpk군의 TG는 21.1±1.3만큼까지 감소하였는데, 이는 개시시 TG에 비해 64.90% 감소한 것이었다. 이는, 항체 P8BG의 지질 강하 효과가 더 효과적이고, 에비나쿠맙의 지질 강하 효과보다 오래 지속되었음을 나타낸다.
표 8
Figure pct00021
표 9
Figure pct00022
표 10
Figure pct00023
시험 실시예 7: APOE 마우스에서 혈장중 지질 농도에 대한 항ANGPTL3 항체의 생체내 효과 확정
APOE 마우스(8주령, SPF, 약 22 g, 수컷, Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입; 인증 번호: 201917260, SCXK(Jiangsu) 2016-0010)를 대상으로 실험실 환경(12시간/12시간, 명주기/암주기, 온도 23±1℃, 습도 40% ~ 50%)에서 4주일간의 적응 급식을 실시한 다음(케이지당 동물 2마리), 동물들에게 고지방 사료(D12108C)를 공급하였는데, 이때 동물들이 사료와 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 실험 개시전 7일차에, 동물을 4시간 동안 금식시킨 후, 안와로부터 채혈하고 나서, 8000 rpm에서 2분 동안 원심분리함으로써 혈장을 수집하였다. ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 이용하여 혈장중 지질 농도를 확정하였다. 마우스를, 트리글리세라이드 수준에 따라 5개의 군으로(각 군당 마우스 8마리씩) 나누었다[hIgG 음성 대조군, 에비나쿠맙 10 mpk군, 에비나쿠맙 5 mpk군, P8BG 10 mpk군 및 P8BG 5 mpk군]. 모든 군에 있는 마우스 각각을 대상으로 1회 피하 주사하고 나서(각각의 군에서의 투여 용량에 대한 표 11 참조), 투여후 1일차, 7일차 및 11일차에 4시간 동안 금식시킨 후 안와로부터 채혈하였다. 혈장을 수집한 다음, ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 지질(트리글리세라이드 및 HDL 콜레스테롤) 농도를 확정하였다. 실험 데이터는 평균±표준편차(평균±SEM)로 표현하였고, Graphpad Prism5 소트트웨어를 사용하여 플롯을 작성하였으며, 통계 분석을 위해 TTEST를 사용하였다.
실험 결과를 도 6 ~ 도 7 및 표 11에 제시하였다. 투여후 1일차에 각각의 처리군의 트리글리세라이드는 hIgG 음성 대조군과 비교하였을 때 감소하였다. 에비나쿠맙(10 mpk)군에서, 트리글리세라이드는 65.6±5.4 mg/dL만큼 감소하였는데, 이는 개시시 TG값에 비하여 46.2% 감소한 수준이었고; 에비나쿠맙(5 mpk)군에서, 트리글리세라이드는 71.8±3.3 mg/dL만큼 감소하였는데, 이는 개시시 TG값에 비하여 42.1% 감소한 수준이었으며; P8BG(10 mpk)군에서 트리글리세라이드는 33.3±2.2 mg/dL만큼 감소하였는데, 이는 개시시 TG값에 비하여 72.9% 감소한 수준이었고; P8BG(5 mpk)군에서 트리글리세라이드는 37.0±1.7 mg/dL만큼 감소하였는데, 이는 개시시 TG값에 비하여 70.2% 감소한 수준이었다. 뿐 아니라, 실험 결과는, 투여후 1일차에 P8BG 10 mpk군의 혈장중 HDL-C는 증가하였고, 에비나쿠맙 10 mpk군의 혈장중 HDL-C는 감소하였음을 보여준다. 그러나 지질 강하 실험에서 HDL-C 감소는 일반적으로 지질 강하 동안에 바람직하지 않았다
표 11
Figure pct00024
시험 실시예 8: 항ANGPTL3 항체의 약동학 평가
1. 마우스에서 항ANGPTL3 항체에 관한 생체내 약동학적 실험
C57BL/6 마우스(18 g ~ 24 g, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입)를 대상으로 실험실 환경(12시간/12시간, 명주기/암주기, 온도 16℃~ 26℃습도 40% ~ 70%)에서 적응 급식을 실시한 다음(3일 이상), 급식이 이루어지는 동안 동물들이 물과 사료에 자유로이 접근하도록 하였다. 실험 개시 전날, C57BL/6 마우스를 계수하여 군당 3마리씩 무작위로 나누었다. 실험 당일, 군에 있는 마우스에 시험 약물인 P8BG 및 에비나쿠맙 각각을 정맥내 주사하였으며(투여량 10 mg/kg), 주사 용적은 5 mL/kg이었다.
투여전, 그리고 투여후 5분, 8시간, 1일차, 2일차, 4일차, 7일차, 10일차, 14일차, 21일차 및 28일차에 투여군의 마우스 각각을 대상으로 전혈 0.1 mL씩을 채혈하였으며, 항응고제 없이 혈액을 4℃에 30분 동안 방치한 후, 1000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액(혈청)을 수집하여, EP 튜브에 넣은 후, -80℃에 보관하여 두었다.
혈청중 항체 농도를 ELISA로 확정하였으며, 시험 약물에 대한 약동학적 매개변수를 Winnolin 소프트웨어로 산정하였다. 얻어진 주요 약동학적 결과를 표 12 및 도 8에 보였다. 실험 결과는, 본 발명의 P8BG 항체가 양성 대조군 에비나쿠맙보다 마우스내 반감기가 더 길었음을 보여준다.
표 12
Figure pct00025
2. 사이노몰거스 원숭이에서 항ANGPTL3 항체의 약동학 평가
사이노몰거스 원숭이(3 kg ~ 4 kg, Guangdong Qianyan Biological Science and Technology Co., Ltd.로부터 구입)를 사용하였으며, 동물들을 실험에 사용할 때까지 14일 동안 격리 및 적응 급식을 실시하였다. 동물들을 스테인레스 강철 케이지내에 넣었다(케이지당 동물 2마리 이하). 동물실 실내 온도를 18℃~ 26℃로 제어하였으며, 상대 습도는 40% ~ 70%로, 그리고 조명은 12/12 명주기/암주기로 하였다. 실험 동안 동물이 자유로이 물에 접근하도록 하였다. 생화학적 기준에 따라 사이노몰거스 원숭이 6마리를 무작위로 2개 군(군당 동물 3마리)으로 나누었다. 군의 사이노몰거스 원숭이에게 시험 약물 P8BG 및 에비나쿠맙 각각을 피하 주사하였으며, 이 때의 투여량은 10 mg/kg이었고, 주사 용적은 2 mL/kg이었다.
동물들을 군으로 나눈 후, 밤새도록 금식시키고 나서, 투여전과 투여후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 1일차, 3일차, 5일차, 7일차, 10일차, 14일차, 21일차, 28일차, 35일차, 42일차, 49일차 및 56일차에 각각의 동물 뒷다리 정맥에서 약 2 mL씩 채혈하였다. 혈액을, 분리 겔이 담긴 채혈 튜브에 넣어, 실온에 30분 동안 방치한 다음, 1000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 나서, 2개의 청결한 EP 튜브에 분액한 다음, 일시적으로(채혈후 2시간 이내) -70℃에 보관하여 두었다. 혈청중 항체 농도를 ELISA로 확정한 다음, 시험 약물에 대한 약동학적 매개변수를 Winnolin 소프트웨어로 산정하였다. 얻어진 주요 약동학적 결과를 표 14 및 도 9에 보였다. 실험 결과는, 본 발명의 항체 P8BG는 양성 대조군 에비나쿠맙보다 사이노몰거스 원숭이내 반감기가 더 길었음을 보여준다.
표 13
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> ANTI-ANGPTL3 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 721011CPCT <150> CN202010073192.4 <151> 2020-01-22 <160> 36 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Human ANGPTL3(17-460)-His sequence <400> 1 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val 50 55 60 His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile 65 70 75 80 Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys 85 90 95 Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys 100 105 110 Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu 115 120 125 Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu 130 135 140 Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu 145 150 155 160 His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn 165 170 175 Ser Ile Lys Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu 180 185 190 Asn Gln Gln His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg 195 200 205 Thr Ser Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg 210 215 220 Ala Pro Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val 225 230 235 240 Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly 245 250 255 Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val 260 265 270 Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile 275 280 285 Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn 290 295 300 Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu 305 310 315 320 Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile 325 330 335 Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe 340 345 350 Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile 355 360 365 Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe 370 375 380 Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly 385 390 395 400 Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu 405 410 415 Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg 420 425 430 Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys 435 440 445 Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu His 450 455 460 His His His His His His His His His 465 470 <210> 2 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Human ANGPTL3(17-170)-Flag-His sequence <400> 2 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val 50 55 60 His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile 65 70 75 80 Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys 85 90 95 Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys 100 105 110 Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu 115 120 125 Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu 130 135 140 Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu 145 150 155 160 His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gly Ser Ser 165 170 175 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His 180 185 190 <210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Human ANGPTL3(17-170)-mFc sequence <400> 3 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val 50 55 60 His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile 65 70 75 80 Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys 85 90 95 Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys 100 105 110 Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu 115 120 125 Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu 130 135 140 Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu 145 150 155 160 His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Glu Pro Arg 165 170 175 Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 180 185 190 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 195 200 205 Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 210 215 220 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 225 230 235 240 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 245 250 255 Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 260 265 270 Met Ser Gly Lys 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HCDR2 sequence of P3 <400> 19 Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 sequence of P3 <400> 20 Asp Ile Ala Thr Leu Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 sequence of P8 <400> 21 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR2 sequence of P8/P8B <400> 22 Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR3 sequence of P8/P8B <400> 23 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR1 sequence of P8/P8B <400> 24 Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 sequence of P8 <400> 25 Leu Ile Asn Pro Arg Asp Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 sequence of P8/P8B <400> 26 Asp Leu Gly Ser Ile Arg Glu Val Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 sequence of P8B <400> 27 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Val Tyr Thr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 sequence of P8B <400> 28 Leu Ile Asn Pro Arg Glu Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Heavy chain constant region sequence of human IgG4-YTE variant <400> 29 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Light chain constant region sequence of human kappa chain <400> 30 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 31 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Heavy chain sequence of P3G <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ile Ala Thr Leu Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 245 250 255 Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 32 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Light chain sequence of P3G <400> 32 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 33 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Heavy chain sequence of P8G <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Arg Asp Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Met Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ile Arg Glu Val Leu Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 245 250 255 Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 34 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Light chain sequence of P8G <400> 34 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 35 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Heavy chain sequence of P8BG <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Arg Glu Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Met Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ile Arg Glu Val Leu Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 245 250 255 Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 36 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Light chain sequence of P8BG <400> 36 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Val Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (14)

  1. 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    i) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
    ii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
    iii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 서열이 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 서열이 동일한 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 단
    iv) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24, 서열 번호 28 및 서열 번호 26에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 27, 서열 번호 22 및 서열 번호 23에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
    v) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24, 서열 번호 25 및 서열 번호 26에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
    vi) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20에 제시된 서열 각각을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 제시된 서열 각각을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 단
    (A) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이고/보이거나, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 서열에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이거나;
    (B) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이고/보이거나, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이거나; 또는
    (C) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이고/보이거나, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 대하여 적어도 90%의 동일성을 보이는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 단
    (D) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 서열을 가지거나;
    (E) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 제시된 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 제시된 서열을 가지거나; 또는
    (F) 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 10에 제시된 서열을 가지는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항ANGPTL3 항체는 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
    바람직하게 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 κ 사슬 및 λ사슬 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게 상기 중쇄 불변 영역은 서열 번호 29에 제시된 서열 또는 서열 번호 29에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 보이는 서열을 가지고/가지거나, 상기 경쇄 불변 영역은 서열 번호 30에 제시된 서열 또는 서열 번호 30에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 보이는 서열을 가지는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항ANGPTL3 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되,
    (G) 상기 중쇄는 서열 번호 35에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고/가지거나; 상기 경쇄는 서열 번호 36에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지거나;
    (H) 상기 중쇄는 서열 번호 33에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고/가지거나; 상기 경쇄는 서열 번호 34에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지거나; 또는
    (I) 상기 중쇄는 서열 번호 31에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고/가지거나; 상기 경쇄는 서열 번호 32에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항ANGPTL3 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 단
    (J) 상기 중쇄는 서열 번호 35에 제시되어 있고, 상기 경쇄는 서열 번호 36에 제시되어 있거나;
    (K) 상기 중쇄는 서열 번호 353에 제시되어 있고, 상기 경쇄는 서열 번호 34에 제시되어 있거나; 또는
    (L) 상기 중쇄는 서열 번호 31에 제시되어 있고, 상기 경쇄는 서열 번호 32에 제시되어 있는,
    항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 ANGPTL3 항원과의 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  10. 제9항에 의한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  11. (A) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 의한 핵산 분자 치료적 유효량만큼과,
    (B) 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제 1가지 이상
    을 포함하는 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 단계를 포함하는, ANGPTL3를 면역검출 또는 확정하기 위한 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 항ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제9항에 의한 핵산 분자 또는 제11항에 의한 약학 조성물 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 질환 또는 상기 장애는 ANGPTL3 연관 질환 또는 장애이고; 더욱 바람직하게 상기 질환 또는 상기 장애는 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 또는 죽상경화성질환인 방법.
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