KR101652962B1 - 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 - Google Patents
돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101652962B1 KR101652962B1 KR1020160046441A KR20160046441A KR101652962B1 KR 101652962 B1 KR101652962 B1 KR 101652962B1 KR 1020160046441 A KR1020160046441 A KR 1020160046441A KR 20160046441 A KR20160046441 A KR 20160046441A KR 101652962 B1 KR101652962 B1 KR 101652962B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- erns
- csfv
- virus
- recombinant protein
- fever virus
- Prior art date
Links
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 title claims 9
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 claims abstract description 141
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 claims abstract description 112
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 43
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 17
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 claims description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 47
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 42
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 19
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 9
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 24
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 6
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 9
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101150031366 P3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DVWVZSJAYIJZFI-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DVWVZSJAYIJZFI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N Arg-Gln-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N Arg-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N Arg-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AOJYORNRFWWEIV-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AOJYORNRFWWEIV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- RQYMKRMRZWJGHC-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RQYMKRMRZWJGHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N Asp-His-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- QQAPDATZKKTBIY-YUMQZZPRSA-N Gln-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O QQAPDATZKKTBIY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HWEINOMSWQSJDC-SRVKXCTJSA-N Gln-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HWEINOMSWQSJDC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- SAEBUDRWKUXLOM-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SAEBUDRWKUXLOM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(O)=O LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RZEDHGORCKRINR-STQMWFEESA-N Gly-Trp-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN RZEDHGORCKRINR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- DGYNAJNQMBFYIF-SZMVWBNQSA-N His-Glu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 DGYNAJNQMBFYIF-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- AQCUAZTZSPQJFF-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ala-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O AQCUAZTZSPQJFF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N Ile-Asp-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPKIQULSKFVCSM-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VPKIQULSKFVCSM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ARRIJPQRBWRNLT-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ARRIJPQRBWRNLT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N Lys-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SEZADXQOJJTXPG-VFAJRCTISA-N Lys-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O SEZADXQOJJTXPG-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N Phe-Ala-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 1
- JIYJYFIXQTYDNF-YDHLFZDLSA-N Phe-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N JIYJYFIXQTYDNF-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N Ser-Glu-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N Thr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N Thr-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- DGOJNGCGEYOBKN-BWBBJGPYSA-N Thr-Cys-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O DGOJNGCGEYOBKN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- OCCYDHCUKXRPSJ-SXNHZJKMSA-N Trp-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O OCCYDHCUKXRPSJ-SXNHZJKMSA-N 0.000 description 1
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N Val-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- UQMPYVLTQCGRSK-IFFSRLJSSA-N Val-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UQMPYVLTQCGRSK-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 108010084758 arginyl-tyrosyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108010040856 glutamyl-cysteinyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
- G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체, 이들을 포함하는 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트, 및 이를 이용한 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단클론항체 및 이를 포함하는 키트는 민감도 및 특이도가 뛰어나기 때문에, 이를 이용한 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법은 정확성이 매우 우수하고, C-ELISA를 이용함으로써 용이하고 신속하게 감별할 수 있다. 따라서, 돼지열병 바이러스 야외주에 감염된 돼지를 조기에 검색하여 제거함으로써 돼지열병의 청정화에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 단클론항체 및 이를 포함하는 키트는 민감도 및 특이도가 뛰어나기 때문에, 이를 이용한 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법은 정확성이 매우 우수하고, C-ELISA를 이용함으로써 용이하고 신속하게 감별할 수 있다. 따라서, 돼지열병 바이러스 야외주에 감염된 돼지를 조기에 검색하여 제거함으로써 돼지열병의 청정화에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체, 이들을 포함하는 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트, 및 이를 이용한 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별 방법에 관한 것이다.
돼지열병은 돼지 질병 중 가장 심각한 질병으로, 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus, CSFV)에 감염된 돼지는 고열, 식욕결핍, 설사나 변비, 피부청색증 및 뒷다리를 잘 못쓰거나 비틀거리는 증상을 나타내며, 한 번 발생하면 치료방법이 없고, 감염된 돼지는 전부 죽게 된다. 돼지열병은 세계동물보건기구(OIE)에서 A급으로 분류하고 있고 가축전염병예방법에서도 제1종 가축전염병으로 여기는 악성전염병이다.
돼지열병의 방제를 위한 가장 효과적인 방법은 백신을 접종하는 것이다. 돼지열병 백신은 유전자재조합 백신, DNA 백신, 서브유닛 백신 등 다양하게 개발 진행이 되고 있으나, 가장 효과적으로 면역을 유도하는 것은 생백신이다. 국내에서도 1974년부터 생백신(LOM주)을 사용하고 있으나 야외주와 백신주가 혈청학적으로 감별이 되지 않는다는 문제점이 있다. 최근 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 생백신의 특성을 가지고 있으면서 혈청학적 감별이 가능한 생마커백신을 개발하고 있다.
국내에서는 유전자재조합 기술을 이용하여 돼지열병을 예방할 수 있는 백신용 바이러스 개발 연구를 수행하여, 돼지열병 바이러스 생백신주(LOM주)의 Erns 유전자를 국내에서 분리한 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 유전자로 치환한 돼지열병 바이러스 생마커백신주(Flc-LOM-BErns주)를 개발하였다(한국 공개특허공보 제10-2010-0121288호). Flc-LOM-BErns주의 경우, 돼지열병 바이러스의 Erns 부위가 BVDV Erns로 치환되어, 접종시 돼지열병 바이러스의 Erns 단백질에 대한 항체가 생성되지 않기 때문에, 돼지열병 바이러스 Erns ELISA에서 음성으로 나타나게 되는 반면, 돼지열병 야외주 바이러스에 감염된 경우 돼지열병 바이러스의 Erns 단백질에 대한 항체가 생성되기 때문에, 돼지열병 바이러스 Erns ELISA에서 양성으로 나타나게 된다. 이러한 원리는 이미 알려져 있으나, 이를 이용하여 생마커백신주 접종 혈청과 야외주 감염 혈청을 높은 감별력으로 감별할 수 있는 진단법이 필요한 실정이었다.
또한, 한국 등록특허공보 제10-0791538호에는, 돼지콜레라(돼지열병) 바이러스 유전형 1형, 2형, 및 3형으로부터 각각 유래된 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 C-ELISA에 이용하여, 돼지열병 바이러스 Erns 단백질을 검출하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법으로도 돼지열병 생마커백신주(Flc-LOM-BErns) 접종 개체와 야외주 감염 개체를 감별할 수는 있으나, 키트의 민감도가 떨어지고 BVDV 항체와 교차반응이 50%로 확인되었다. 돼지열병 생마커백신주(Flc-LOM-BErns)는 Erns가 BVDV Erns로 교체된 바이러스이기 때문에 BVDV 항체 교차반응으로 인하여 의양성으로 검출시 문제가 된다.
이에, 본 발명자들은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 개체의 혈청에 포함된 항체와, 돼지열병 바이러스 야외주가 감염된 개체의 혈청에 포함된 항체를 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용해 높은 정확도로 신속하게 감별하는 방법을 개발하고자 예의 노력하였다.
곤충세포에서 발현한 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns 재조합 단백질의 P3 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 경쟁적 효소면역측정법(C-ELISA)에 적용시키면, 민감도와 특이도가 뛰어날 뿐만 아니라 정확도가 높은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 혈청과 야외주 감염 혈청의 감별 진단 시스템 및 키트가 만들어질 수 있고, 여기에 BVDV Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체도 함께 사용하면 감별의 정확도를 더욱 높일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 C-Erns 1(기탁번호: KCTC18432P) 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 B-Erns 1(기탁번호: KCTC18435P)을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 항체들을 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항체들을 이용하여 검사 대상 시료를 분석함으로써, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지를 감별하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체; 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는, 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 단클론항체를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트로서, 상기 키트는 바람직하게는 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는, 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 단클론항체를 더 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 돼지로부터 혈액을 채취하여 검사 대상 시료를 준비하는 단계; (b) 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계; (c) 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 단계의 분석 결과가 양성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 음성인 경우, 상기 검사 시료에 돼지열병 바이러스 야외주 감염 혈청이 존재하는 것으로 판정하고, 상기 (b) 단계의 분석 결과가 음성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 양성인 경우, 상기 검사 대상 시료에 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 혈청이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와, 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단클론항체 및 이를 포함하는 키트는 민감도 및 특이도가 뛰어나기 때문에, 이를 이용한 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법은 정확성이 매우 우수하고, ELISA, 바람직하게는 C-ELISA를 이용함으로써 용이하고 신속하게 감별할 수 있다. 따라서, 돼지열병 바이러스 야외주에 감염된 돼지를 조기에 검색하여 제거함으로써 돼지열병의 청정화에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 LOM주의 Erns 단백질을 P1~P4의 4개의 부위로 나누어서 각각의 아미노산 서열을 표시한 것이다.
도 2는 종래 기술의 단클론항체인 3.39-1과 본 발명의 단클론항체인 C-Erns 1이 인식하는 돼지열병 바이러스 Erns 단백질의 에피토프(epitope, 항원결정부위)가 서로 다름을 보여주는 웨스턴블럿팅(Western blotting) 결과이다.
도 3은 돼지열병 바이러스(CSFV) 재조합 단백질에 대한 단클론항체인 C-Erns 1 및 BVDV 재조합 단백질 각각에 대한 단클론항체인 B-Erns 1을 이용하여 간접 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns C-ELISA의 조건 및 수행 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 BVDV Erns C-ELISA의 조건 및 수행 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 또는 생백신주(LOM주)를 접종한 야외 농장 돼지의 혈청을 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns C-ELISA로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다(도 6a: K사 농장 1, K사 농장 2; 도 6b: D사 농장 1, D사 농장 2).
도 2는 종래 기술의 단클론항체인 3.39-1과 본 발명의 단클론항체인 C-Erns 1이 인식하는 돼지열병 바이러스 Erns 단백질의 에피토프(epitope, 항원결정부위)가 서로 다름을 보여주는 웨스턴블럿팅(Western blotting) 결과이다.
도 3은 돼지열병 바이러스(CSFV) 재조합 단백질에 대한 단클론항체인 C-Erns 1 및 BVDV 재조합 단백질 각각에 대한 단클론항체인 B-Erns 1을 이용하여 간접 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns C-ELISA의 조건 및 수행 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 BVDV Erns C-ELISA의 조건 및 수행 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 돼지열병 바이러스 생마커백신주 또는 생백신주(LOM주)를 접종한 야외 농장 돼지의 혈청을 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns C-ELISA로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다(도 6a: K사 농장 1, K사 농장 2; 도 6b: D사 농장 1, D사 농장 2).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서, "돼지열병 바이러스 야외주"는 특별한 언급이 없으면, 야외(외부)로부터 감염된 돼지열병 바이러스주를 지칭하며, 백신의 기능을 하는 "돼지열병 바이러스 생백신주" 또는 "돼지열병 바이러스 생마커백신주" 등과 구별되는 개념이다.
본 명세서에서, 돼지열병 바이러스 "생백신주"는 국내에서 백신주로 사용되고 있는 LOM주로, 돼지열병 바이러스의 Erns 부위가 그대로 존재하며, 돼지열병 바이러스 "생마커백신주"는 돼지열병 바이러스의 Erns 부위가 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns로 치환된 유전자재조합 백신주, 예를 들면 Flc-LOM-BErns 주와 같은 백신주를 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(C-Erns 1)로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체에 관한 것이다. 또한, 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(B-Erns 1)로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 C-Erns 1 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주는 Classical swine fever virus Erns hybridoma(C-Erns 1)으로 명명하여, 한국생명공학연구원에 기탁하였고, 2016년 1월 7일자로 수리되어 기탁번호 KCTC18432P를 부여받았다. 또한, 본 발명에 따른 상기 B-Erns 1 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주는 Bovine viral diarrhea virus Erns hybridoma(B-Erns 1)로 명명하여, 한국생명공학연구원에 기탁하였고, 2015년 12월 23일자로 수리되어 기탁번호 KCTC18435P를 부여받았다.
특히, 상기 C-Erns 1 항체는 돼지열병 바이러스 유전형 1형으로부터 유래한 Erns 단백질의 P3 부위(서열번호 1)의 일부를 에피토프로 인식하여 결합한다. 반면, 종래 기술인 한국 등록특허공보 제10-0791538호에 개시된 돼지열병 바이러스 Erns 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론항체는 돼지콜레라(돼지열병) 바이러스 유전형 1형, 2형 및 3형으로부터 유래된 3종의 Erns 재조합 단백질을 모두 혼합하여 항원으로 사용하였고, 이에 특이적으로 결합하는 항체('3.39-1' 항체로 명명)는 특히 유전형 1형의 P2(서열번호 2) 및 P4(서열번호 3) 부위를 에피토프로 인식한다는 점에 본 발명의 C-Erns 1 항체와 차이가 있다. 상기 선행특허에 공개된, P2 및 P4 부위를 인식하는 3.39-1 항체는 민감도 및 특이도가 만족할 만한 수준으로 나타나지 않아, P1~P4 부위 중 어느 한 부위 이상을 선택 및 조합하여 만든 재조합 항원들에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 제조하여 각각에 대한 민감도 및 특이도를 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 P3 부위를 인식하는 C-Erns 1 항체가 가장 안정적으로 발현되고 민감도 및 특이도가 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
상기 C-Erns 1 항체와 3.39-1 항체의 인식부위는 LOM주의 Erns 단백질을 P1, P2, P3, P4의 4개 부위로 각각 발현시켜 웨스턴 블럿팅을 이용해 반응성을 확인한 결과로부터 알 수 있다(도 1, 도 2). LOM Erns 단백질의 P1~P4 도메인 증폭을 위해 사용한 프라이머는 아래 표와 같다.
<돼지열병 바이러스 LOM 주의 Erns 증폭을 위한 프라이머>
또한, 상기 B-Erns 1 항체는 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 단백질을 특이적으로 인식하여 결합하며, 소바이러스성설사병 바이러스 중 특히 08Q44-1주로부터 유래한 Erns 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 제조된 하이브리도마 세포에서 생성되는 단클론항체인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질은, 바람직하게는, 곤충세포를 이용한 베큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 통해 발현된 것임을 특징으로 할 수 있다. 베큘로바이러스 발현 시스템에서 상기 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질 또는 BVDV Erns 재조합 단백질을 발현시킬 경우, 발현 단백질이 글리코실화(glycosylation)되어 본래의 단백질과 유사한 형태로 발현되고, 이를 ELISA에 적용시킬 경우 반응성이 우수하다. 일반적으로 사용되는 대장균(E. coli) 발현 시스템은 발현 단백질의 글리코실화가 되지 않아 본래의 단백질 구조가 그대로 나타나기 어렵기 때문에, 대장균 발현 시스템으로 발현된 Erns 재조합 단백질을 ELISA에 적용시키는 경우 비특이 반응이 많이 나타나며 항체 반응성도 떨어진다는 단점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질의 P3 부위에 대한 단클론항체인 상기 C-Erns 1을 이용하여 C-ELISA 키트를 제작한 후 검사 시료에 대하여 C-ELISA를 수행한 결과, 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 혈청에 대해서만 양성 반응이 나타났고, BVDV Erns 재조합 단백질에 대한 단클론항체인 B-Erns 1를 이용하여 C-ELISA 키트를 제작한 후 검사 시료에 대하여 C-ELISA를 수행한 결과, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지의 혈청에 대해서만 양성 반응이 나타났다. 또한, 상기 C-Erns 1 항체를 이용한 C-ELISA 키트와 B-Erns 1 항체를 이용한 C-ELISA 키트는 민감도 및 특이도가 우수하여, 정확하고 신속하게 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지와 생마커백신 접종 돼지를 감별할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체(C-Erns 1, 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성)를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 효소면역분석법(ELISA), 바람직하게는 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 키트에 포함된 C-Erns 1 항체는 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns ELISA(C-ELISA)를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는, 바람직하게는, 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체(B-Erns 1, 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함된 B-Erns 1 항체는 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV) Erns ELISA(C-ELISA)를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트는 다음과 같은 원리를 이용한다. 돼지열병 바이러스 생마커백신주의 경우, 돼지열병 바이러스의 Erns 부위가 BVDV Erns로 치환되어, 접종시 돼지열병 바이러스의 Erns 단백질에 대한 항체를 형성시키지 않기 때문에, 생마커백신주 접종 개체의 혈청은 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns ELISA에서 음성으로 나타나고 BVDV Erns ELISA에서 양성으로 나타나게 되는 반면, 돼지열병 바이러스 야외주에 감염된 개체의 혈청은 돼지열병 바이러스의 Erns 부위가 그대로 존재하기 때문에 이에 대한 항체가 형성되어, 돼지열병 바이러스 Erns ELISA에서 양성으로 나타나고 BVDV Erns ELISA에서 음성으로 나타나게 된다.
상기 키트는, 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질(항원)(또는, 돼지열병 바이러스 Erns P3 재조합 단백질)이 코팅된 흡착 플레이트와 이에 특이적으로 결합하는 C-Erns 1 항체(효소표지항체), BVDV Erns 재조합 단백질(항원)이 코팅된 흡착 플레이트와 이에 특이적으로 결합하는 B-Erns 1 항체(효소표지항체), 2차항체(간접 ELISA의 경우), 발색제, 흡광도 측정을 위한 판독기(ELISA reader) 등으로 구성될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 ELISA, 바람직하게는 C-ELISA에 필요한 구성요소를 더 포함할 수 있다.
상기 효소표지항체의 효소는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하도록 하기 위한 표지물질로서, 예를 들면, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 퍼옥시다아제를 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 효소는 당업계에 공지된 방법으로 항체에 접합시킬 수 있다. 또한, 상기 발색제는 항체에 접합시킨 효소에 대한 기질로서, 효소의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 본 발명에서는 HPR(horseradish peroxidase) 컨쥬게이션 된 항체를 사용하였으므로, HPR에 대한 기질인 TMB(테트라메칠벤지딘)을 사용하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 돼지로부터 혈액을 채취하여 검사 대상 시료를 준비하는 단계; (b) 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계; (c) 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 단계의 분석 결과가 양성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 음성인 경우, 상기 검사 시료에 돼지열병 바이러스 야외주 감염 혈청이 존재하는 것으로 판정하고, 상기 (b) 단계의 분석 결과가 음성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 양성인 경우, 상기 검사 대상 시료에 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 혈청이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와, 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법에 관한 것이다.
상기 (b) 단계는 시료 내에 존재하는 돼지열병 바이러스 Erns 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 단계로, 상기 (b) 단계의 분석은 바람직하게는, 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 통해 수행될 수 있다. C-ELISA를 이용한 상기 (b) 단계의 분석은, 항원-항체 반응이 완료된 후 시료의 흡광도를 측정하여, %PC 값을 산출하고, 산출된 %PC 값이 미리 정해진 컷오프(cut-off) 값 이상이면 양성, 컷오프 값 이하이면 음성으로 판단함으로써 수행된다. 상기 %PC 값은 하기 수학식 1을 이용하여 산출되고, 상기 컷오프 값은 20인 것을 특징으로 할 수 있다.
[수학식 1]
%PC = [(음성대조시료 평균흡광도-검사대상시료 흡광도)/음성대조시료 평균 흡광도)] X 100
또한, 상기 (c) 단계는 시료 내에 존재하는 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV) Erns 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 단계로, 상기 (c) 단계의 분석은 바람직하게는, 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 통해 수행될 수 있다. C-ELISA를 이용한 상기 (c) 단계의 분석은, 항원-항체 반응이 완료된 후 시료의 흡광도를 측정하여, S/N(sample OD/negative OD) 값을 산출하고, 산출된 S/N 값이 미리 정해진 컷오프(cut-off) 값 이하이면 양성, 컷오프 값 이상이면 음성으로 판단함으로써 수행된다. 상기 S/N 값은 하기 수학식 2를 이용하여 산출되고, 상기 미리 정해진 컷오프 값은 0.5인 것을 특징으로 할 수 있다.
[수학식 2]
S/N = 검사대상시료 흡광도/음성대조시료 평균 흡광도
상기 (b) 단계의 단클론항체(C-Erns 1)는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질의 P3 부위(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성될 수 있다. 또한, 상기 (c) 단계의 단클론항체(B-Erns 1)는 바람직하게는 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 감별방법은 (b) 단계 전에 돼지열병 바이러스 E2 단백질 또는 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 “사전 단계”를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 사전 단계는 시료 내에 존재하는 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 단계이다.
돼지열병 바이러스 E2 단백질은 돼지열병 바이러스 야외주, 돼지열병 바이러스 생백신주, 및 돼지열병 바이러스 생마커백신주가 공통적으로 가지고 있는 부위이므로, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 개체와 야외주 감염 개체의 혈청은 모두 E2 단백질에 대한 항체를 가지고 있어, 상기 사전 단계의 분석 결과가 양성으로 나타난다. 반면, 돼지열병 바이러스 백신주가 접종되지 않고 야외 감염되지도 않은 개체의 혈청은 E2 단백질에 대한 항체가 없기 때문에 상기 사전 단계의 분석 결과가 음성으로 나타난다.
돼지열병 바이러스에 대한 항체 형성 반응은 주로 E2 및 Erns 부위가 유도하는데, E2 부위가 가장 많은 항체를 유도하는 반면, Erns 부위에 대한 항체 형성은 E2 부위에 대한 항체 형성에 비하여 느리고, 적은 양으로 형성될 수도 있다. 따라서, 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns 부위에 대한 항체를 검출하기 위한 상기 (b) 단계를 수행하기 이전에, 먼저 E2 항체를 검출하기 위한 상기 사전 단계를 수행하여 검사 대상 시료 내의 돼지열병 바이러스(야외주이든, 백신주이든) 항체 존재여부를 신속하게 알아볼 수 있다. E2 항체를 검출하기 위한 상기 사전 단계와, 돼지열병 바이러스 Erns 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 상기 (b) 단계의 2가지 단계만 수행하더라도 돼지열병 바이러스 야외주 감염 개체인지, 또는 생마커백신주 접종 개체인지 여부를 감별할 수 있기 때문에 경우에 따라 BVDV Erns 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 상기 (c) 단계는 생략할 수 있으나, 감별의 정확도 및 정밀도를 높이기 위해서는 상기 (c) 단계까지 모두 수행하는 것이 바람직하다(실시예 6의 표 9, 표 10 참조).
상기 사전 단계에서 돼지열병 바이러스 E2 단백질을 이용하고 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체는 이용하지 않는 경우, 상기 사전 단계의 분석은 간접 효소면역분석법(Indirect ELISA)를 통해 수행되고, 상기 사전 단계에서 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하는 경우, 상기 사전 단계의 분석은 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 통해 수행되는 것이 바람직하다. E2 단백질을 이용하는 indirect ELISA의 경우, 바람직하게는 한국 공개특허공보 제1999-0020106호에 공개된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하는 C-ELISA의 경우, 바람직하게는 한국 공개특허공보 제2001-0051314호에 공개된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[
실시예
1]
돼지열병
바이러스
Erns
재조합 단백질 및
BVDV
Erns
재조합 단백질의 제작
돼지열병 바이러스(CSFV) Erns C-ELISA 키트 및 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV) Erns C-ELISA 키트의 제작에 필요한, 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질(전체부위 및 P3 부위) 및 BVDV Erns 재조합 단백질의 제작을 (주)메디안 디노스틱에 의뢰하여 하기와 같이 제작하였다.
[
실시예
1-1]
돼지열병
바이러스
Erns
재조합 단백질의 제작
돼지열병 바이러스 Erns 전체 서열에 대한 재조합 단백질을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
1. 베큘로바이러스의 제작
1-1. 돼지열병 Erns 유전자 클로닝 및 염기서열 분석
돼지열병 생백신 바이러스(LOM주)의 Erns 단백질(전체)을 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 서열번호 4의 유전자를 RT-PCR 법으로 증폭한 다음 클로닝하기 위하여, 서열번호 14의 정방향 프라이머(5'-CCAGGATCCGAAAATATAACTCAATGGAA-3')와 서열번호 15의 역방향 프라이머(5'-CTCCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAGG-3')를 사용하였다.
PCR 조건은 92℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초 동안 반응하는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 동안 S1000™ Thermal Cycler(BioRad)에서 반응시켰으며, 아가로즈 겔 전기영동으로 증폭된 Erns 유전자를 확인하였다. 증폭된 유전자는 정제하여 BamHI, XhoI 효소를 처리한 후, 전기영동하여 681bp DNA 단편을 분리하고, 베큘로바이러스 트랜스퍼 벡터 pFastBac1(Thermo Fisher Scientific)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 Mini_Prep kit(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 염기서열의 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하였고, 데이터 분석은 Clone manager version 6.0을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 얻어진 염기서열은 돼지열병 생백신 바이러스(LOM주) Erns의 전체 서열임이 확인되었다.
1-2. 형질주입 및 플라크 어세이
베큘로바이러스 DNA는 Thermo Fisher Scientific사의 Bacmid(DH10Bac)를 사용하였다. Erns 베큘로바이러스 DNA를 Thermo Fisher Scientific사의 Bac-Bac 메뉴얼에 따라 제작하였다.
형질주입(transfection)은 Cellfectin II Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 2㎍의 Erns 베큘로바이러스 DNA를 8㎕의 Cellfectin II 용액에 용해한 다음 혼합하여 형질주입 혼합물(transfection mixture)을 제조하여 실온에서 15~20분간 방치하였다. Sf9 세포를 6-웰 조직배양 플라스크에 단층배양한 후에 배지를 제거하고 FBS 및 항생제가 첨가되지 않은 Grace's 배지로 2회 세척한 다음 형질주입 혼합물을 첨가하여 27℃에서 4-5시간 동안 형질주입시킨 다음, 2㎖의 TNM-FH 배지를 가하여 27℃에서 5일간 배양하면서 세포변성효과 출현 여부를 관찰하였다. 형질주입 배양 상층액에서 재조합 베큘로바이러스를 분리하기 위해 플라크 정제를 실시하였다. 플라크 정제를 위해 1x106개의 Sf9 세포를 직경 60㎜ 조직배양 페트리디쉬에 단층배양한 후, 형질주입 배양 상층액을 10배 단계 계단희석하여 접종하여 27℃에서 90분간 감작한 후 접종한 바이러스액을 제거하고 1.5% low melting 아가로즈가 포함된 TNM-FH 배지를 overlayer하여 3∼4일간 27℃에서 배양하였다. 단일 플라크를 선발하여 연속해서 2∼3회 플라크 정제를 실시하여 재조합 베큘로바이러스를 선발하였다.
2. 베큘로바이러스를 이용한 항원의 생산
2-1. 세포주, 배지 및 바이러스
곤충세포주는 Sf9(Spodoptera frugiperda , Invitrogen)을 TNF-NH media(Gibco)를 이용하여 27℃ 인큐베이터에서 85rpm으로 교반배양 하였다. 재조합 바이러스는 pFastBac(Invitrogen) 벡터를 이용하여 제작되었으며, 정치배양한 세포에 감염시켜 72시간 후 배양 상층을 회수하여 냉장보관 상태로 시드(seed)를 준비하였다.
2-2. 바이러스의 정량
시드로 준비된 바이러스의 역가(titer)는 Baculovirus rapid titer kit(Clontech)를 이용하여 결정하였다.
2-3. 감염조건
Spinner flask에서 부유 배양한 Sf9 세포에(1x106 cells/ml) 재조합 바이러스 시드를 1 MOI(multiplicity of infection)로 감염시켰다. 감염 72시간 후 원심분리를 이용하여(3000rpm, 10분) 재조합 단백질을 생산한 세포를 회수하였다.
2-4. 친화크로마토그래피를 이용한 항원의 정제
회수한 세포는 10mM 이미다졸(imidazole)이 포함된 PBS, pH 7.4 버퍼를 이용하여 cell pellet 무게의 10배로 잘 풀어주었다. 균질하게 풀어진 세포를 Sonicator를 이용하여 세포파쇄를 진행하였다. Cell lysate는 15,000 rpm, 4℃로 20분간 원심분리 후 상층액을 0.45μm 필터로 여과하였다. 여과가 완료된 상층액을 친화크로마토그래피 수지(Ni-NTA, GE)에 로딩한 후 10mM 이미다졸이 함유된 PBS, pH 7.4 버퍼를 이용하여 세척하였다. 세척이 완료된 후 500 mM 이미다졸이 함유된 PBS, pH 7.4를 이용하여 용출하였다. 용출된 분획의 이미다졸을 제거하기 위하여 PBS, pH 7.4를 이용하여 투석한 후 BCA assay kit(Pierce)를 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 그 결과, 정제된 돼지열병 바이러스 Erns 단백질을 얻을 수 있었다.
[
실시예
1-2]
돼지열병
바이러스
Erns
P3 재조합 단백질의 제작
돼지열병 바이러스 Erns 단백질의 P3 부위에 대한 재조합 단백질을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
1. 베큘로바이러스의 제작
1-1. 돼지열병 Erns P3 유전자 클로닝 및 염기서열 분석
돼지열병 생백신 바이러스(LOM주)의 Erns 단백질 중 특히 P3 부위의 유전자를 클로닝하였다. P3를 암호화하는 서열번호 5의 유전자를 RT-PCR 법으로 증폭한 다음 클로닝하기 위하여, 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR 조건은 실시예 1-1에서와 동일하게 하였고, PCR을 통해 증폭된 Erns P3 유전자의 염기서열을 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 분석한 결과, 얻어진 염기서열은 돼지열병 생백신 바이러스(LOM주)의 Erns 단백질의 P3 부위 서열임이 확인되었다.
1-2. 형질주입 및 플라크 어세이
상기 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 형질주입 및 플라크 어세이를 수행하여 Erns P3 재조합 베큘로바이러스를 선발하였다.
2. 베큘로바이러스를 이용한 항원의 생산
상기 실시예 1-1의 2-1 내지 2-4와 동일한 방법으로 재조합 바이러스 시드를 준비하고 정량한 후, Sf9 세포에 감염시키고, 재조합 단백질을 생산한 세포를 회수한 후 정제한 결과, 돼지열병 바이러스 Erns P3 재조합 단백질을 얻을 수 있었다.
[
실시예
1-3]
BVDV
Erns
재조합 단백질의 제작
소바이러스성설사병 바이러스(BVDV) Erns 재조합 단백질을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
1. 베큘로바이러스의 제작
1-1. BVDV Erns 유전자 클로닝 및 염기서열 분석
BVDV 08Q44-1 주(농림축산검역본부 바이러스질병과에서 야외주로부터 분리한 것으로, 농림축산검역본부내 KVCC로부터 분양 가능)로부터 유래한 BVDV Erns 단백질(전체)을 코딩하는 서열번호 16의 유전자를 RT-PCR 법으로 증폭한 다음 클로닝하기 위하여, 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18의 역방향 프라이머를 사용하였다(아래 표 참조).
<BVDV Erns 증폭을 위한 프라이머>
PCR 조건은 92℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초 동안 반응하는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 동안 S1000™ Thermal Cycler(BioRad)에서 반응시켰으며, 아가로즈 겔 전기영동으로 증폭된 BVDV Erns 유전자를 확인하였다. 증폭된 유전자는 정제하여 Nco I, Sal I 효소를 처리한 후, 전기영동하여 681bp DNA 단편을 분리하고, 베큘로바이러스 트랜스퍼 벡터 pFastBac1(Thermo Fisher Scientific)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 Mini_Prep kit(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 염기서열의 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하였고, 데이터 분석은 Clone manager version 6.0을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 얻어진 염기서열은 소바이러스성설사병 바이러스(08Q44-1 주) Erns의 전체 서열임이 확인되었다.
1-2. 형질주입 및 플라크 어세이
상기 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 형질주입 및 플라크 어세이를 수행하여 BVDV Erns 재조합 베큘로바이러스를 선발하였다.
2. 베큘로바이러스를 이용한 항원의 생산
상기 실시예 1-1의 2-1 내지 2-4와 동일한 방법으로 재조합 바이러스 시드를 준비하고 정량한 후, Sf9 세포에 감염시키고, 재조합 단백질을 생산한 세포를 회수한 후 정제한 결과, BVDV Erns 재조합 단백질을 얻을 수 있었다.
[
실시예
2]
돼지열병
Erns
P3 재조합 단백질 및
BVDV
Erns
재조합 단백질을 이용한 단클론항체 제작 및 성상분석
먼저, 서로 다른 Balb/c 마우스에, 상기 실시예 1-2에서 제조된 돼지열병 바이러스 Erns P3 재조합 단백질과, 상기 실시예 1-3에서 제조된 BVDV Erns 재조합 단백질을 각각 3회 근육 및 foot-pad에 접종하여 면역을 시키고, 최종 면역하고 2주 후에 비장을 채취하여 B 림프구를 얻었다. 그 다음, 5% CO2가 유지되는 37℃ 인큐베이터에서 배양된 골수종(myeloma) 세포(SP2/O-Ag14)와 상기 B 림프구가 융합되도록, PEG 1500(Sigma, USA)를 사용하여 유도하였다. 융합이 완료된 세포(하이브리도마 세포)를 HAT(Hypoxanthin Aminopterin Thymidine, GibcoBRL, USA)가 우태아 혈청에 10% 첨가된 DMEM 선택 배지에 적당히 희석한 후 96웰 조직배양 플레이트에 상기 융합된 세포를 분주하여 2주 동안 배양하여, 단클론항체가 포함된 상층액을 얻었다.
그 다음, 하이브리도마 세포들로부터 생성된 각 단클론항체의 성상 분석 및 재조합 단백질과의 반응성 확인을 하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA, 및 세포에 바이러스를 감작시켜 IFA(Indirect fluorescence antibody assay, 간접형광항체법) 또는 PLA(Peroxidase-linked assay)법을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 각 실험 방법은 하기와 같다.
1. 웨스턴 블롯
상기 하이브리도마 세포들로부터 생성된 두 종류의 단클론항체의 성상 분석을 위해, 돼지열병 Erns P1~P4 부위 단백질 및 Erns 전체 단백질, BVDV Erns 단백질을 웰당 2.5㎍ 농도로 SDS polyacrylamide gel에 내린 후, 상기 하이브리도마 세포들로부터 생성된 두 종류의 단클론항체를 반응시켰다.
2. ELISA
상기 하이브리도마 세포들로부터 생성된 두 종류의 단클론항체와 재조합 단백질의 반응성 확인 및 재조합 단백질을 ELISA 항원으로 사용할 수 있는지 여부를 확인하고자 수행하였다. 돼지열병 Erns P3 부위 단백질 및 BVDV Erns 단백질을 각각 1㎍/well의 농도로 carbonate buffer를 이용하여 ELISA 플레이트에 코팅하고(4℃ overnight) 5% horse serum + PBST(0.1% tween 20 + PBS) 용액으로 블로킹(실온에서 2시간 동안)하였다. ELISA 플레이트의 세척 후에 상기 하이브리도마 세포들로부터 생성된 두 종류의 단클론항체를 결합시키고 2차로 anti-mouse HRP를 붙인 후 TMB로 발색하였다.
3. IFA 또는 PLA법
상기 하이브리도마 세포들로부터 생성된 두 종류의 단클론항체의 반응성 분석을 위해 수행하였다. 돼지열병 바이러스는 CPK 세포에, 소바이러스성설사증 바이러스는 MDBK 세포에 10TCID50 의 역가로 96웰 플레이트에 접종하고 3일 후에 배양 상층액을 버리고 PBS로 1회 세척한 다음, 차가운 80% 아세톤을 100㎕씩 전 웰에 가하고 -20℃에 10분간 두어 고정하였다. 고정액을 완전히 비우고 PBS로 1회 세척하고 고정한 96웰 플레이트에 단클론항체를 PBS에 희석하여 고정한 세포와 37℃에서 40분간 반응시키고 다시 PBS로 3회 세척 후 2차 항체로 anti-mouse FITC를 붙여서 형광현미경으로 형광 여부를 확인하였다(IFA). PLA법은 단클론항체 반응까지 동일하고 2차 항체를 Biotinylated anti-mouse IgG를 사용하며, 이후 AB 용액을 웰당 100㎕씩 분주하고 37℃에서 40분간 반응시키고, PBS로 3회 세척 후 DAB 기질 용액을 분주하고 실온에서 10분간 반응시킨 후, 증류수로 3회 세척 후 현미경으로 염색 여부를 확인하였다. 염색될 경우에는 갈색으로 확인할 수 있었다.
| 단클론 항체명 |
Virus | Western Blotting | FA (PLA) | ELISA | ||||||||
| CSFV- Erns |
BVDV- Erns |
LOM | BErns | KD26-1 | 44-1 | 723 | MDBK | CPK | CSFV-Erns | BVDV-Erns | ||
| C-Erns 1 | CSFV | ++++ | ++ | ++++ | - | - | - | - | - | - | +++ | - |
| B-Erns 1 | BVDV | - | - | - | - | ++++ | ++++ | ++++ | - | - | - | ++ |
이를 통하여, 다수의 하이브리도마 세포주들 중에서 특히 돼지열병 바이러스 Erns ELISA에 적합하고, 반응성이 탁월한 단클론항체인 'C-Erns 1'을 생성하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCTC18432P)를 선별해냈으며, 또한 BVDV Erns ELISA에 적합하고, 반응성이 월등히 좋은 단클론항체인 'B-Erns 1'을 생성하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCTC18435P)를 선별해냈다. 돼지열병 바이러스 Erns 및 BVDV Erns 재조합 단백질을 플레이트에 코팅하고 상기 C-Erns 1 및 B-Erns 1 항체를 이용하여 간접효소면역분석법(Indirect ELISA)을 수행한 결과, 돼지열병 바이러스 Erns에 대한 단클론항체 C-Erns 1은 BVDV Erns에 양성 반응을 보이지 않음을 확인하였고, BVDV Erns에 대한 단클론항체 B-Erns 1은 돼지열병 바이러스(CSFV) Erns에 양성 반응을 보이지 않음을 확인하였다(도 3).
[
실시예
3]
돼지열병
바이러스
Erns
C-ELISA
키트
및
BVDV
Erns
C-ELISA
키트의
제작 및 수행
실시예 1-1에서 제조된 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 실시예 2에서 제조된 단클론항체 C-Erns 1를 이용하여, 야외주 감염 혈청 검출용 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트를 제작하고, 실시예 1-3에서 제조된 BVDV Erns 재조합 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 실시예 2에서 제조된 단클론항체 B-Erns 1을 이용하여, 생마커백신 접종 혈청 검출용 BVDV Erns C-ELISA 키트를 제작하였다. 이들을 이용하여 돼지열병 바이러스 야외주 감염 혈청과 돼지열병 생마커백신 접종 혈청을 감별할 수 있도록 각 키트의 C-ELISA 조건을 설정하였다. 먼저, 돼지열병 야외주 감염 혈청 및 생마커백신 접종 혈청, 음성 혈청을 이용하여 재조합 단백질 코팅 농도, 혈청 희석배수, 2차 항체 농도, 컷오프(cut-off) 값을 설정하였다.
돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트의 컷오프 값은 야외 혈청 400두를 이용하여 테스트한 결과 민감도가 가장 좋게 나타났던 20으로 설정하였다(표 2).
| 계 | Cut-off 30 | Cut-off 25 | Cut-off 20 | |||||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | |||
| 중화시험 | 양성 | 297 | 275 | 21 | 279 | 17 | 284 | 13 |
| 음성 | 103 | 2 | 101 | 2 | 101 | 2 | 101 | |
| 민감도(%) | 92.3 | 93.6 | 95.6 | |||||
| 특이도(%) | 98.1 | 98.1 | 98.1 | |||||
BVDV Erns C-ELISA 키트의 컷오프 값은 야외 혈청(BVDV Erns 항체 음성) 127두 및 생마커백신주 혈청(BVDV Erns 항체 양성) 9두에 대하여 OD값(흡광도)을 2회씩 측정하여 평균낸 후, 하기 수학식 2를 이용하여 S/N 값을 구한 결과, 야외 혈청의 S/N 값은 0.54~1.52 사이에 분포했고, 생마커백신주 혈청의 S/N 값은 0.23~0.47 사이에 분포하는 것을 알 수 있었다. 따라서, BVDV Erns C-ELISA 키트의 컷오프 값은 0.5로 설정하였다.
돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA는 다음과 같이 수행한다. 먼저, 실시예 1-1에서 제조된 돼지열병 바이러스 Erns 재조합 단백질을 ELISA 플레이트인 polysorb plate에 0.0125μg/well의 농도로 100μl씩 코팅하고 실온에서 2시간 블로킹(blocking)한다. 블로킹 용액은 PBST(0.1% Tween 20)에 5% horse serum을 포함하여 제조한다. 블로킹한 ELISA 플레이트는 PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 돼지 가검 혈청을 10배 희석하여 100μl씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 반응시킨다. 반응 후 PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척하고, 실시예 2에서 제조된 돼지열병 바이러스 Erns 단클론항체(C-Erns 1)에 HPR 컨쥬게이션 시켜 5μg/well 농도로 웰당 100μl씩 분주하고 37℃ 인큐베이터에 1시간 반응시킨다. 반응 후, PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척한 후 발색제(TMB)를 넣고 10분간 발색여부를 확인하고, 450nm에서 ELISA reader로 OD값을 측정한다. 양성, 음성 판정은 하기 수학식 1을 이용하여 %PC 값을 계산한 후 20 이상이면 양성으로 판정한다(도 4).
[수학식 1]
%PC = [(음성대조시료 평균 흡광도(NC)-검사시료 흡광도(OD))/음성대조시료 평균 흡광도(NC)]*100
BVDV Erns C-ELISA는 다음과 같이 수행한다. 실시예 1-3에서 제조된 BVDV Erns 재조합 단백질을 ELISA 플레이트인 maxisorb plate에 0.025μg/well의 농도로 100μl씩 코팅하고 실온에서 2시간 블로킹한다. 블로킹 용액은 PBST(0.1% Tween 20)에 5% horse serum을 포함하여 제조한다. 블로킹한 ELISA 플레이트는 PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 돼지 가검 혈청을 10배 희석하여 100μl씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다. 반응 후 PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 실시예 2에서 제조된 BVDV Erns 단클론항체(B-Erns 1)에 HPR 컨쥬게이션 시켜 12μg/well의 농도로 웰당 100μl씩 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다. 반응 후, PBST(0.1% Tween 20)로 3회 세척한 후 발색제(TMB)를 넣고 10분간 발색여부를 확인하고, 450nm에서 ELISA reader로 OD값을 측정한다. 양성, 음성 판정은 하기 수학식 2를 이용하여 S/N 값을 계산한 후 0.5 이하이면 양성으로 판정한다(도 5).
[수학식 2]
S/N = 검사시료 흡광도(sample OD)/음성대조시료 평균 흡광도(negative OD)
[
실시예
4] C-ELISA
키트의
민감도 및 특이도 측정
진단 키트용 항체 패널 77종(표 3)을 이용하여, 실시예 3에서 개발한 C-ELISA 키트의 민감도 및 특이도를 평가하였다. 민감도는 양성을 얼마나 검출할 수 있는지를 의미하고, 특이도는 음성을 얼마나 검출할 수 있는지를 의미한다. 민감도는 하기 수학식 3을 이용하여 계산하고, 특이도는 하기 수학식 4를 이용하여 계산하였다.
[수학식 3]
민감도 = 개발된 키트의 양성 검출수/중화시험 결과 양성 개체수 * 100
[수학식 4]
특이도 = 개발된 키트의 음성 검출수/중화시험 결과 음성 개체수 * 100
그 결과, C-Erns 1 단클론항체를 이용한 본 발명의 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트는 민감도 100%, 특이도 91.4%로 확인되었다(표 4). 이로써, 본 발명의 C-ELISA 키트는 종래기술인 3.39-1 단클론항체를 이용한 돼지열병 바이러스 Erns ELISA 키트 및 외국에서 판매되고 있는 Prionix 키트보다 우수한 민감도 및 특이도를 나타냄을 확인할 수 있었다(표 4).
또한, BVDV Erns C-ELISA 키트는 민감도 87.5%, 특이도 100%로 확인되었다(표 5).
| 혈 청 | 수 량 |
| 돼지열병 야외 혈청 | 21 |
| 생백신(LOM주) 혈청 | 21 |
| E2 마커백신 혈청 | 4 |
| 생마커백신 혈청 | 9 |
| BVDV 혈청 | 8 |
| BDV 혈청 | 1 |
| 음성 혈청 | 13 |
| 총 계 | 77 |
| 계 | C-Erns 1을 이용한 CSFV Erns C-ELISA | 3.39-1을 이용한 CSFV Erns C-ELISA | Prionix | |||||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | |||
| 중화시험 | 양성 | 42 | 42 | 10 | 40 | 2 | 39 | 3 |
| 음성 | 35 | 3 | 32 | 3 | 32 | 5 | 30 | |
| 민감도(%) | 100 | 95.2 | 92.6 | |||||
| 특이도(%) | 91.4 | 91.4 | 85.7 | |||||
| 계 | BVDV Erns C-ELISA | |||
| 양성 | 음성 | |||
| 중화시험 | 양성 | 16 | 14 | 2 |
| 음성 | 61 | 0 | 61 | |
| 민감도(%) | 87.5 | |||
| 특이도(%) | 100 | |||
또한, 야외 혈청을 이용하여, 실시예 3에서 개발한 C-ELISA 키트의 민감도 및 특이도를 평가하였다. 야외 혈청으로는 도축장 돼지열병 내륙(LOM 백신 항체 양성) 452두, 제주도(돼지열병 항체 음성) 268두를 이용하였다(표 6).
총 720두를 검사한 결과, C-Erns 1 단클론항체를 이용한 본 발명의 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트는 민감도 90.0%, 특이도 99.3%로 확인되었다(표 7). 이로써, C-Erns 1 단클론항체를 이용한 본 발명의 C-ELISA 키트는 종래기술인 3.39-1 단클론항체(한국 등록특허공보 제10-0791538호)를 이용한 돼지열병 바이러스 Erns ELISA 키트보다 우수한 민감도 및 특이도를 나타냄을 다시 한 번 확인할 수 있었다(표 7).
또한, BVDV Erns C-ELISA 키트의 특이도는 100%로 확인되었다(표 8).
| 혈 청 | 수 량 | CSFV Erns | BVDV Erns |
| 내륙 혈청 | 452 | + | - |
| 제주도 혈청 | 268 | - | - |
| 총 수량 | 720 |
| 계 | C-Erns 1을 이용한 CSFV Erns C-ELISA | 3.39-1을 이용한 CSFV Erns C-ELISA | ||||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | |||
| 중화시험 | 양성 | 452 | 407 | 44 | 236 | 216 |
| 음성 | 268 | 2 | 266 | 0 | 268 | |
| 민감도(%) | 90.0 | 52.2 | ||||
| 특이도(%) | 99.3 | 100 | ||||
| 계 | BVDV Erns C-ELISA | |||
| 양성 | 음성 | |||
| 중화시험 | 양성 | 0 | 0 | 0 |
| 음성 | 720 | 0 | 720 | |
| 민감도(%) | - | |||
| 특이도(%) | 100 | |||
[
실시예
5]
돼지열병
생마커백신주의
야외 농장 적용 혈청을 이용한
돼지열병
바이러스 Erns C-ELISA 키트의 평가
돼지열병 생마커백신주의 야외 농장 적용 혈청(생마커백신주를 농장 돼지에게 접종한 후 얻어진 혈청)을 이용하여 실시예 3에서 개발한 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트의 항체 감별 가능성을 평가하였다. 4개 농장에서 돼지열병 생마커백신(Flc-LOM-BErns)주 접종군 139두(실험군-돼지열병 바이러스 Erns 항체 음성), LOM주 접종군 100두(대조군-돼지열병 바이러스 Erns 항체 양성)의 혈청을 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트로 분석(%PC 컷오프값: 20)한 결과, 실험군(돼지열병 생마커백신 접종군)은 음성, 대조군(돼지열병 생백신(LOM주) 접종군)은 양성으로 확인되어, 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트의 항체 감별 가능성을 확인하였다(도 6a, 도 6b).
[
실시예
6]
돼지열병
생마커백신주
접종으로 인한 항체와
야외주
감염으로 인한 항체의 감별방법
야외주 감염 혈청 검출용 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트와 돼지열병 생마커백신 검출용 BVDV Erns C-ELISA 키트의 두 가지 ELISA 키트를 이용한, 돼지열병 생마커백신 접종 개체 및 야외주 감염 개체의 감별 시스템을 구축하였다.
먼저, E2 indirect ELISA를 수행하여 검사 대상 시료 내의 돼지열병 바이러스(야외주이든, 백신주이든) 항체 존재여부를 신속하게 확인하였다. 그 다음, E2 항체 존재여부가 양성인 것으로 확인되면, 상기 E2 항체가 돼지열병 바이러스 야외주 감염으로 인해 생성된 것인지, 또는 생마커백신주 접종으로 인해 생성된 것인지 감별해낼 수 있는 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 키트를 수행하였다. 돼지열병 바이러스 Erns C-ELISA 결과가 양성이면, 검사 대상 시료는 돼지열병 바이러스 야외주 감염 혈청이고, 음성이면, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 혈청인 것으로 1차적으로 판정할 수 있으나, 1차 판정된 결과가 모호하거나 감별의 정확성을 높일 필요가 있는 경우에, BVDV Erns C-ELISA 키트를 수행하여 2차 판정을 하였다. 1차 판정 결과가 양성이었던 검사 대상 시료의 BVDV Erns C-ELISA 결과는 음성으로 나타났고, 1차 판정 결과가 음성이었던 검사 대상 시료의 BVDV Erns C-ELISA 결과는 양성으로 나타났다. 따라서, 1차 판정 및 2차 판정을 거치는 본 발명에 따른 감별방법은 매우 효과적임을 확인할 수 있었다(표 9, 표 10).
| E2 | CSFV Erns | BVDV Erns | |
| 돼지열병 생마커백신 접종 개체 | 양성 | 음성 | 양성 |
| 돼지열병 야외바이러스 감역 개체 | 양성 | 양성 | 음성 |
| 돼지열병 항체 음성 개체 | 음성 | 음성 | 음성 |
| 항체유무검사 | 야외주와 백신주 감별 검사 | ||
| CSFV E2 ELISA | 1차 검사 | 2차 정밀검사 | |
| CSFV Erns ELISA | BVDV Erns ELISA | ||
| 야외주 감염 혈청/LOM 백신 혈청 | + | + | - |
| - (항체가가 낮은 경우) |
|||
| 생마커백신 혈청 | + | - | + |
| 음성혈청/BVDV 감염 혈청 | - | - | |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> A Kit Using Antibodies for Differentiating Recombinant CSFV
Vaccinated Swine and Wild Type CSFV Infected Swine, and
Differentiating Method Using Thereof
<130> YPD201512-0025
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns P3
<400> 1
Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys His Ala Asp Val Asn Val
1 5 10 15
Val Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Lys Asn Phe Ala Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn
35 40 45
Phe Asn Val Ser
50
<210> 2
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns P2
<400> 2
Gln Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Gly Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys
1 5 10 15
Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn
20 25 30
Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn Arg Thr Gln Ala Asn Leu Ala
35 40 45
Glu Gly Pro Pro Ala Lys Glu Cys
50 55
<210> 3
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns P4
<400> 3
Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu
1 5 10 15
Leu Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile
20 25 30
Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg
35 40 45
Gln Leu Arg Ile Ala Gly Arg Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys Thr Trp
50 55 60
Phe Gly Ala Tyr Ala
65
<210> 4
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns full DNA sequence
<400> 4
gaaaatataa ctcaatggaa cctgagtgac aacggcacta atggtgtcca gcatgctatg 60
taccttagag ggattagcag aagcttgcat gggatctggc cggaaaaaat atgcaaagga 120
gtccccacct acctggccac agacacggaa ctgaaagaaa tacagggaat gatggatgcc 180
agcgagggga caaactatac gtgctgtaag ttacagagac atgaatggaa caaacatgga 240
tggtgtaact ggtacaatat agacccctgg atacagttga tgaatagaac ccaagcaaac 300
ttggcagaag gccctccggc caaggagtgc gctgtgactt gtaggtacga taaacatgct 360
gacgtcaacg tggtcaccca ggccagaaac aggccaacaa ccctgaccgg ctgcaagaaa 420
ggaaaaaatt tttcttttgc aggtacagtt atagagggcc catgtaattt caatgtttcc 480
gtggaggata tcttgtatgg ggatcatgag tgcggcagtt tgctccagga cacggctctg 540
tacctagtag atggaatgac caacactata gagaatgcca gacagggagc agcgagggta 600
acatcttggc tcgggaggca actcagaatt gccgggagga ggttggaggg tagaagcaaa 660
acctggtttg gtgcctatgc c 681
<210> 5
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns P3 DNA sequence
<400> 5
gagtgcgctg tgacttgtag gtacgataaa catgctgacg tcaacgtggt cacccaggcc 60
agaaacaggc caacaaccct gaccggctgc aagaaaggaa aaaatttttc ttttgcaggt 120
acagttatag agggcccatg taatttcaat gtttcc 156
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P1 primer (forward)
<400> 6
cgcccatggc tgaaaatata actcaatgga acctg 35
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P1 primer (reverse)
<400> 7
acggtcgact atttctttca gttccgtgtc t 31
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P2 primer (forward)
<400> 8
cgcccatggc tcagggaatg atggatgcca gcgagg 36
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P2 primer (reverse)
<400> 9
attgtcgacg cactccttgg ccggagggcc tt 32
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P3 primer (forward)
<400> 10
cgaccatggc tgagtgcgct gtgacttgta ggtacg 36
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P3 primer (reverse)
<400> 11
ccggtcgacg gaaacattga aattacatgg gccctct 37
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P4 primer (forward)
<400> 12
cgcccatggc tgtttccgtg gaggatatct tgta 34
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erns-P4 primer (reverse)
<400> 13
attgtcgacg gcataggcac caaaccag 28
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns primer (forward)
<400> 14
ccaggatccg aaaatataac tcaatggaa 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOM-Erns primer (reverse)
<400> 15
ctcctcgagg gcataggcac caaaccagg 29
<210> 16
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV Erns (08Q44-1) full DNA sequence
<400> 16
gaaaacataa cacaatggaa tctacaagac aacgggacag aagggataca acgggcaatg 60
ttcaaaaggg gggttaacag aagtttacac ggcatctggc cagagaaaat ctgtacaggt 120
gtcccttccc atctagccac cgatgtggaa ctaaaggcaa ttcatggtat gatggatgca 180
agtgaaaaga ccagctacac gtgttgtaga ctccaacgcc acgagtggaa caagcatggt 240
tggtgcaact ggtacaatat cgaaccttgg attctaatca tgaacaaaac ccaagccaac 300
ctcaccgaag gtcagccgcc aagagaatgt gcggtcactt gcagatatga cagggatagt 360
gacttaaatg tggtaacaca agctagagat agccccacac cattgacagg ctgcaagaag 420
ggaaaaaatt tttcttttgc aggcatattg atgcggggtc cctgcaactt tgaaatagct 480
gcgagtgatg tgttgtacaa agaacatgac tgtaccagtg tgttccagga tactgctcat 540
tacctcgttg acgggatgac caactccttg gaaagtgcca gacaagggac tgctaaactg 600
acaacctggt tgggcaagca gctagggata ctaggaaaaa aattggaaaa caagagtaag 660
acatggtttg gagcatatgc g 681
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 08Q44-1-Erns primer (forward)
<400> 17
gccccatggc tgaaaacata acacaatgga atcta 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 08Q44-1-Erns primer (reverse)
<400> 18
acggtcgact tacgcatatg ctccaaacca tgtct 35
Claims (26)
- 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 항체는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질의 P3 부위(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 곤충세포를 이용한 베큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 통해 발현된 것임을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 제4항에 있어서, 상기 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질은, 소바이러스성설사병 바이러스 08Q44-1주로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 제4항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 곤충세포를 이용한 베큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 통해 발현된 것임을 특징으로 하는, 단클론항체.
- 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는, 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 단클론항체를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
- 제7항에 있어서, 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는, 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 단클론항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 키트는 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 이용하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체는, 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질의 P3 부위(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질은, 소바이러스성설사병 바이러스 08Q44-1주로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 키트.
- 하기 단계를 포함하는, 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와, 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법:
(a) 돼지로부터 혈액을 채취하여 검사 대상 시료를 준비하는 단계;
(b) 기탁번호 KCTC18432P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된, 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계;
(c) 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계의 분석 결과가 양성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 음성인 경우, 상기 검사 시료에 돼지열병 바이러스 야외주 감염 혈청이 존재하는 것으로 판정하고, 상기 (b) 단계의 분석 결과가 음성이고, 상기 (c) 단계의 분석 결과가 양성인 경우, 상기 검사 대상 시료에 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 혈청이 존재하는 것으로 판정하는 단계. - 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계 이전에,
돼지열병 바이러스 E2 단백질 또는 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하여, 상기 (a) 단계에서 준비된 검사 대상 시료를 분석하는 사전 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 감별방법. - 제13항에 있어서, 상기 사전 단계의 분석 결과가 양성인 경우, 상기 검사 시료에 돼지열병 바이러스 백신주 접종 혈청 또는 야외주 감염 혈청이 존재하는 것으로 판정하고, 분석 결과가 음성인 경우, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 혈청 및 야외주 감염 혈청이 모두 존재하지 않는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분석 및 상기 (c) 단계의 분석은 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제13항에 있어서, 상기 사전 단계에서 돼지열병 바이러스 E2 단백질을 이용하고 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체는 이용하지 않는 경우, 상기 사전 단계의 분석은 간접 효소면역분석법(Indirect ELISA)를 통해 수행되고, 상기 사전 단계에서 돼지열병 바이러스 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용하는 경우, 상기 사전 단계의 분석은 경쟁적 효소면역분석법(C-ELISA)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제15항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분석은, 항원-항체 반응이 완료된 후 시료의 흡광도를 측정하여, 하기 식으로 표현되는 %PC 값을 산출하고, 산출된 %PC 값이 미리 정해진 컷오프(cut-off) 값 이상이면 양성, 컷오프 값 이하이면 음성으로 판단하는 것임을 특징으로 하는, 감별방법:
%PC = [(음성대조시료 평균흡광도-검사대상시료 흡광도)/음성대조시료 평균 흡광도)]×100. - 삭제
- 제17항에 있어서, 상기 미리 정해진 컷오프 값은 20인 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제15항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분석은, 항원-항체 반응이 완료된 후 시료의 흡광도를 측정하여, 하기 식으로 표현되는 S/N 값을 산출하고, 산출된 S/N 값이 미리 정해진 컷오프(cut-off) 값 이하이면 양성, 컷오프 값 이상이면 음성으로 판단하는 것임을 특징으로 하는, 감별방법:
S/N = 검사대상시료 흡광도/음성대조시료 평균 흡광도. - 삭제
- 제20항에 있어서, 상기 미리 정해진 컷오프 값은 0.5인 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 삭제
- 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계의 단클론항체는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 Erns 재조합 단백질의 P3 부위(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계의 단클론항체는 기탁번호 KCTC18435P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계의 소바이러스성설사병 바이러스(BVDV)의 Erns 재조합 단백질은, 소바이러스성설사병 바이러스 08Q44-1주로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 감별방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160046441A KR101652962B1 (ko) | 2016-04-15 | 2016-04-15 | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160046441A KR101652962B1 (ko) | 2016-04-15 | 2016-04-15 | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101652962B1 true KR101652962B1 (ko) | 2016-09-02 |
Family
ID=56943135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160046441A KR101652962B1 (ko) | 2016-04-15 | 2016-04-15 | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101652962B1 (ko) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108318682A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-07-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法 |
| CN113512110A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-19 | 石河子大学 | Bvdv高特异性纳米抗体及其制备方法及应用 |
| CN114163521A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-11 | 广东海大集团股份有限公司 | 一种鉴别猪瘟病毒2.1亚型强毒株及其抗体的单克隆抗体 |
| CN114527273A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-24 | 金河佑本生物制品有限公司 | 一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法 |
| CN114874995A (zh) * | 2022-03-27 | 2022-08-09 | 浙江大学 | 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 |
| CN116554282A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-08-08 | 浙江大学 | 用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070116382A (ko) * | 2006-06-05 | 2007-12-10 | 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) | 돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별진단방법 |
| KR20100121288A (ko) | 2009-05-08 | 2010-11-17 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) | 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Ｆｌｃ―ＬＯＭ―ＢＥｒｎｓ ｖｉｒｕｓ 및 이의 제조방법 |
| KR20110090518A (ko) * | 2010-02-04 | 2011-08-10 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 ｋｄ２６_ｅ２ｌｏｍ을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신 |
| KR20120103882A (ko) * | 2011-03-11 | 2012-09-20 | 베트올 (주) | 돼지열병바이러스의 탐지용 항원, 이를 이용한 항체 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트 |
| KR20140076137A (ko) * | 2012-12-12 | 2014-06-20 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트 |
-
2016
- 2016-04-15 KR KR1020160046441A patent/KR101652962B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070116382A (ko) * | 2006-06-05 | 2007-12-10 | 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) | 돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별진단방법 |
| KR100791538B1 (ko) | 2006-06-05 | 2008-01-07 | 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) | 돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별진단방법 |
| KR20100121288A (ko) | 2009-05-08 | 2010-11-17 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) | 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Ｆｌｃ―ＬＯＭ―ＢＥｒｎｓ ｖｉｒｕｓ 및 이의 제조방법 |
| KR20110090518A (ko) * | 2010-02-04 | 2011-08-10 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 유전자 마커 및 혈청학적 마커를 이용하여 백신바이러스와 야외감염 바이러스를 감별할 수 있도록 재조합한 키메릭 페스티바이러스 ｋｄ２６_ｅ２ｌｏｍ을 포함하는 돼지열병 예방용 생백신 |
| KR20120103882A (ko) * | 2011-03-11 | 2012-09-20 | 베트올 (주) | 돼지열병바이러스의 탐지용 항원, 이를 이용한 항체 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트 |
| KR20140076137A (ko) * | 2012-12-12 | 2014-06-20 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108318682A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-07-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法 |
| CN113512110A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-19 | 石河子大学 | Bvdv高特异性纳米抗体及其制备方法及应用 |
| CN113512110B (zh) * | 2021-04-13 | 2022-10-14 | 石河子大学 | Bvdv纳米抗体及其制备方法及应用 |
| CN114163521A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-11 | 广东海大集团股份有限公司 | 一种鉴别猪瘟病毒2.1亚型强毒株及其抗体的单克隆抗体 |
| CN114163521B (zh) * | 2021-10-19 | 2022-06-28 | 广东海大集团股份有限公司 | 一种鉴别猪瘟病毒2.1亚型强毒株及其抗体的单克隆抗体 |
| CN114527273A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-24 | 金河佑本生物制品有限公司 | 一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法 |
| CN114874995A (zh) * | 2022-03-27 | 2022-08-09 | 浙江大学 | 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 |
| CN114874995B (zh) * | 2022-03-27 | 2024-03-22 | 浙江大学 | 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 |
| CN116554282A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-08-08 | 浙江大学 | 用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101652962B1 (ko) | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 | |
| KR101848194B1 (ko) | Csfv 항체에 대한 개선된 진단 시험 | |
| CN112979788B (zh) | 特异性结合HBeAg的结合蛋白、诊断HBV感染的试剂和试剂盒 | |
| WO2012163263A1 (en) | Reagents and methods for prrsv detection | |
| AU2012298229B2 (en) | Improved vaccine diagnostics | |
| CN115286712A (zh) | 新型冠状病毒Delta突变株特异性抗体及其应用 | |
| KR102086089B1 (ko) | 재조합 n 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 아까바네바이러스 블러킹 효소결합면역측정법 | |
| CN113121678B (zh) | 一种抗hiv-1 p24的重组抗体 | |
| JP2007145775A (ja) | ノロウイルスｇｉの高感度検出方法 | |
| Kim et al. | Development and clinical evaluation of a rapid diagnostic kit for feline leukemia virus infection | |
| CN109900903B (zh) | 一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用 | |
| KR101080071B1 (ko) | 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법 | |
| CN112979787B (zh) | 结合HBeAg的结合蛋白及其应用 | |
| CN114249819A (zh) | 猫泛白细胞减少症病毒抗体、含有猫泛白细胞减少症病毒抗体的试剂盒及应用 | |
| KR101741206B1 (ko) | 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 | |
| CN112979816B (zh) | 针对ckmb的结合蛋白及其应用 | |
| CN112979801B (zh) | 一种可特异性结合hrp-ii的结合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN117229393B (zh) | 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用 | |
| KR102241521B1 (ko) | 구제역 바이러스 o형에 면역 반응성을 나타내는 항체를 이용한 구제역 백신 접종으로 생성된 항체를 검출하는 방법 | |
| KR102241520B1 (ko) | 구제역 바이러스 o형에 면역반응성을 나타내는 항체 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 조성물 | |
| CN113004411B (zh) | 可特异性结合ckmb的结合蛋白、其应用以及检测ckmb的方法 | |
| CN112920272B (zh) | 抗cTnI的蛋白和检测cTnI的方法 | |
| KR102339120B1 (ko) | 슈말렌베르그 바이러스(sbv)의 검출 방법 및 키트 | |
| KR20090078137A (ko) | 노로바이러스 검출용 항체, 및 이를 이용한 노로바이러스검출방법 | |
| CN109613238B (zh) | 检测口蹄疫a型武汉株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |