KR20140076137A - 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트 - Google Patents

돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 갖고 다른 페스티바이러스(BVDV나 BDV)에는 결합하지 않는 프라이머 세트와 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지를 감별하는 방법에 관한 것이다.

Description

돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트{Differentiating method between swine infected by wild type classical swine fever virus and recombinant classical swine fever-vaccinated swine, and primer set}
본 발명은 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법 및 이를 위한 프라이머 세트에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 갖고 다른 페스티바이러스(BVDV나 BDV)에는 결합하지 않는 프라이머 세트와 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지를 감별하는 방법에 관한 것이다.
돼지열병(classical swine fever)은 고열·식욕결핍·설사나 변비·피부청색증 및 뒷다리를 잘 못쓰거나 비틀거리는 증상을 나타내며 한번 발생하면 치료방법이 없고 감염된 돼지는 전부 죽게 되는 돼지의 질병으로서, 세계동물보건기구(OIE)에서 A급으로 분류하고 있고, 가축전염병예방법에서도 제1종 가축 전염병으로 취급하는 악성 전염병이다.
돼지열병 병원체는 Flaviviridae의 Pestivirus에 속하는 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus : CSFV)로서, 그 감염 경로는 주로 소화기와 호흡기이고, 침입한 바이러스는 편도, 림프절, 실질장기의 세포 등에서 증식하며 바이러스 혈증을 일으키고, 태반 감염도 된다. 또한, 병든 돼지의 분변으로 많은 양의 바이러스가 배출되기도 한다.
돼지열병은 감염돼지의 이동, 차량, 축산도구, 사람(신발의복) 등 다양한 경로를 통하여 전파되는데, 이와 같은 돼지열병이 발생할 경우 양돈업의 생산성 저하 및 경제적 피해를 야기시킨다.
한국공개특허 제2010-0121288호에는 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Flc-LOM-BErns 바이러스 KFCC 11442P, 그의 제조방법이 개시되어 있고, 또한, 한국공개특허 제2010-0121289호에는 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Flc-LOM 바이러스 KFCC 11441P 및 그의 제조방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기 종래기술들은 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 및 그의 제조방법 만을 개시하고 있을 뿐, 상기 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스를 백신으로 사용하여 돼지열병 야외 바이러스와 유전적으로 감별할 수 있는 감별방법에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다.
상기한 바와 같이, 돼지열병을 효과적으로 예방하기 위하여 감염 농가를 직접 방문하지 않고, 도축장에 출하되는 돼지의 혈액을 검사하여 야외 감염과 백신접종을 효율적으로 감별할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자 들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 연구를 수행하던 중, 프라이머 세트의 특이적 결합성을 이용하여 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지를 효과적으로 감별할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 프라이머 세트의 특이적 결합성을 이용하여, 돼지열병 야외 바이러스와 유전자 재조합 돼지열병 바이러스의 항원을 효과적으로 감별할 수 있는, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지를 효과적으로 감별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 돼지열병 바이러스에만 결합하고 다른 페스티바이러스(BVDV나 BDV)에는 결합하지 않는 특이적 결합성, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 이용하여 감별하는 단계를 포함하는, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 구성되는, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신접종 돼지를 감별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의한 감별방법은, 유전자적 감별을 통하여 돼지열병 야외 바이러스와 유전자 재조합 돼지열병 바이러스의 감별이 용이하고, 돼지열병 백신 바이러스의 변이를 쉽게 추적할 수 있으므로, 돼지열병 야외 바이러스가 감염된 돼지를 조기에 감별하여 제거함으로써, 돼지열병의 청정화에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 BVDV Erns 유전자가 삽입된 Flc-LOM BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 유전자 구성 모식도를 나타낸다.
도 2는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 BPErns 단백질 발현 유무를 확인한 그림을 나타낸다(anti-CSFV E2 mab 및 BVDV Erns 단백질에 특이적으로 반응하는 anti-BVDV Erns mab이용).
도 3은 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 END 세포변성효과의 음성(END -ve)여부를 확인한 그림을 나타낸다.
도 4는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 돼지열병 바이러스에만 결합하고 다른 Pestivirus(BVDV나 BDV)에는 결합하지 않는 특이적 결합성을 나타낸다.
도 5는 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP에 대한 특이적 결합성을 나타낸다.
도 6은 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 감도 테스트 결과를 나타낸다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 바이러스 야외 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법에 있어서, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 돼지열병 바이러스에만 결합하고 다른 페스티바이러스(BVDV나 BDV)에는 결합하지 않는 특이적 결합성, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 이용하여 감별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법에 관한 것이다.
본 발명의 감별방법에서, 상기 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성은, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스를 포함한 모든 돼지열병 바이러스에 결합하지만, 같은 Pestivirus속의 소바이러스성설사증 바이러스 및 보더병 바이러스에는 결합하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 감별방법에서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성은, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에만 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 감별방법에서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP는 약독화 돼지열병 생백신 제조용 돼지열병 바이러스인 CSFV의 전체 유전자(full-length genome)를 추출하여 전장 cDNA(full-length cDNA)로 작성한 후, 상기 cDNA의 Erns 유전자를 제거하고, 소바이러스성 설사증 바이러스(bovine viral diarrhea virus; BVDV)의 Erns 유전자로 치환하여 재조합된 full-length infectious cDNA를 작성하여 클로닝 한 후, 이를 시험관내에서 genomic RNA로 전사한 다음, 돼지신장세포에 투입(transfection)하여 CSFV의 Erns 유전자가 제거되고, BVDV의 Erns 유전자가 삽입된 유전자 재조합 돼지열병 바이러스로서, 이에 대해서는 한국공개특허 제2010-0121288호에 상세히 개시되어 있다.
본 발명의 감별방법에서, 상기 돼지열병 야외 바이러스는 돼지열병 생백신주로 사용하고 있는 바이러스를 제외한 것을 말한다.
또한, 본 발명의 감별방법에서, 상기 백신은 생백신인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 태양은, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 구성되는, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신접종 돼지를 감별하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 백신의 바이러스는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 상기 돼지열병 야외 바이러스는 돼지열병 생백신주로 사용하고 있는 바이러스를 제외한 것을 말한다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트에서, 상기 백신은 생백신인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이하의 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
< 실시예 1> BVDV Erns 유전자로 치환된 Flc - LOM - BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 제조
본 실시예는 한국공개특허 제2010-0121288호에 개시되어 있는 바와 같이, 돼지열병 Erns 유전자를 BVDV Erns 유전자로 치환하여 바이러스 제조하여, BVDV Erns 단백질을 발현하는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 확인한 후, 상기 유전자 재조합 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 생물학적 특성을 조사하였다.
(1). 돼지열병 Erns 유전자를 BVDV Erns 유전자로 치환한 바이러스의 제조
돼지열병 생백신 바이러스인 Flc-LOM strain에서 genomic RNA를 추출하여 전체 RNA에 대한 full-length cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA에서 Erns 유전자(735bp)를 제거하고, 국내에서 분리한 소바이러스성 설사증 바이러스(bovine viral diarrhea virus) KD26-1 strain의 Erns 유전자(735 bp)를 삽입하여 cDNA를 작성하였다 (하기 표 1 및 표 2 참조).
Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 Erns 유전자 치환 위치
치환 대상 유전자명 치환에 사용한 유전자 치환 유전자 위치*
Erns BVDV KD26-1
Erns (735bp)
(서열번호 5)		 1115~1849
*치환 유전자 위치 : Flc-LOM BErns RNA 염기서열 기준
Flc-LOM-BErns KCTC 12304BP 및 BVD 바이러스의 Erns 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 RT-PCR용 프라이머
프라이머 명칭 프라이머 염기서열 증폭위치*
 증폭크기
(bp)
BErns F - 5' ggaagaaatta-gaaaaagcattgctggcatgggcaat 3' (서열번호 6)
R - 5' gatagggcata-tgctccaaaccacgtcttactc 3'
(서열번호 7)		 1115~1140

1828~1849		 735
* 증폭위치 : Flc-LOM-BErns 염기서열 기준
이때, RT-PCR 조건은 30분/42℃, 15분/94℃, (40싸이클: 60초/94℃, 60초/53℃, 60초/72℃), 10분/72℃로 하여 Erns 유전자를 증폭시켰다.
Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 제조하기 위하여, NEB로부터 구입한 pACYC177 플라스미드의 T7 프로모터의 downstream에 클로닝하여 Flc-LOM- BErns 재조합 플라스미드를 작성하였는 바, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 Flc-LOM-BErns 재조합 플라스미드를 in vitro에서 전사하여 RNA를 생성하였으며, 리포펙션(lipofectin)에 RNA를 혼합하여 돼지신장세포(porcine kidney 15 : PK15)에 투입(transfection)하였다.
RNA가 투입된 세포에서 바이러스가 생성되었으며, 이를 증식시켜 수득한 유전자 재조합 돼지열병 바이러스를 2012년 11월 2일자로, 한국생명자원센터 (KCTC)에 기탁번호 KCTC12304BP로 기탁하였다.
(2). BVDV Erns 단백질을 발현하는 Flc - LOM - BErns 바이러스 KCTC 12304 BP 의 확인
96웰 마이크로 플레이트에 단층배양된 돼지신장세포(porcine kidney 15 : PK15)세포가 단층배양되도록 24시간 동안 배양한 후, 세포배양 상층액을 제거하고, 희석된 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 100㎕씩 접종하였다.
37℃ 이산화탄소 배양기에서 4일간 배양한 후 배양 상층액을 모두 제거한 다음, 아세톤/메탄올(1:1) 용액을 100㎕ 씩 96 웰에 첨가한 후, 5분간 고정하였다. 고정액을 제거한 후 돼지열병 바이러스에 특이적으로 반응하는 anti-CSFV E2 mab 및 BVDV Erns 단백질에 특이적으로 반응하는 anti-BVDV Erns mab를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
10mM 인산 완충액(pH7.2)으로 2회 세척한 후, biotin-labeled anti-mouse IgG를 40분간 실온에서 반응시킨 다음, Avidin-biotin complex HRP conjugate를 40분간 실온에서 추가 반응시켰다. Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP가 증식된 돼지 신장세포가 anti-CSFV E2 mab 및 anti-BVDV Erns mab과 반응하여 염색되도록 DAB(diaminobenzidin)를 이용하여 발색한 결과, Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP는 anti-CSFV E2 mab 및 anti-BVDV Erns mab에 특이적으로 염색됨으로써, BVDV Erns 유전자가 정확하게 치환되어 Erns 단백질로 발현되고 있음을 확인하였다(도 2 참조).
(3). Flc - LOM - BErns 바이러스 KCTC 12304 BP 의 생물학적 특성
(3-1). END - ve 생물학적 마커의 생성
Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 작성한 후, END(Exaltation of Newcastle Disease virus) 현상에 의한 초대 돼지고환세포(Primary Swine testicle cell; ST cell)의 세포변성 효과(cytopathic effect : CPE)의 유무(+ve, -ve)를 다음과 같이 확인하였다.
96웰 마이크로 플레이트에 초대 돼지고환세포가 단층 배양되도록 24시간 동안 배양하였다. Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 8 반복으로 10배 단계로 계단 희석하였다. 초대 돼지고환세포가 단층배양된 96웰 마이크로 플레이트의 세포배양 상층액을 제거하고, 각 희석 단계별로 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 100㎕씩 접종하였다.
37℃ 이산화탄소 배양기에서 4일간 배양 후 배양상층액을 모두 제거한 후, 104.0 PFU의 Newcastle disease virus(NDV)를 100㎕씩 첨가하여 2시간 감작하였다. 추가로 100㎕의 세포배양 배지를 추가하여 3일간 배양한 후 세포변성 효과가 출현하는 유무를 관찰한 결과, 기존의 Flc-LOM 바이러스는 세포변성 효과가 뚜렷이 보이는 END +ve의 생물학적 마커가 확인되었으나, Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP는 END -ve의 생물학적 마커가 확인됨으로써, Flc-LOM 바이러스와는 다른 특성을 보였다 (도 3 참조).
(3-2). 안전성 및 면역원성 확인
Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 40-50 일령 자돈 5마리에 근육접종을 하고, 대조군으로 4 마리의 자돈에 멸균된 인산완충액을 주사하였다.
바이러스 접종 후 혈중내 바이러스 함량, 분변 및 비즙에 바이러스 배출 유무를 21일간 관찰한 결과, 접종 후 5-10일 사이에 일시적으로 혈액, 비즙 및 분변에서 바이러스가 관찰되었으나, 임상증상 발현 등의 부작용은 관찰되지 않았다.
또한, Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 접종한 후의 백혈구 변화 관찰에서 접종군 및 대조군 모두 정상범위(10,000-30,000/㎣)로 나타났으며, 직장내 체온 변화도 모두 정상으로 확인되어 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP의 안전성이 우수함이 확인되었다. 또한 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 접종한 후의 부작용 현상은 관찰되지 않았다.
또한, 돼지에서의 면역원성을 확인하기 위해 돼지열병 항체가 음성인 45일령 돼지에 접종하였다. Flc-LOM-BErns 접종군 1차 접종 3주후 평균 128배의 바이러스 중화 항체가를 보였으며, 2차 접종 2주 후 평균 256배 이상의 항체가를 나타내었다.
2차 접종 2주후 돼지열병 강병원성 바이러스인 SW03 strain을 100MLD 근육으로 공격접종하여 방어효과를 조사한 결과, 대조군은 모두 폐사하였으나, Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP 접종군은 100% 생존하여 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 이용한 돼지열병 백신의 방어효과가 우수함을 확인하였다.
< 실시예 2> Flc - LOM - BErns 바이러스 KCTC 12304 BP 를 백신주로 사용시의 항원 감별 진단법
국내에서 돼지열병은 현재 생백신을 사용하고 있기 때문에, 백신주와 야외주를 감별하는 것이 중요하다. 이에 따라 Flc-LOM-BErns를 백신주로 사용할 경우의 야외주와 감별하는 항원 감별 진단법을 개발하였다.
본 항원 감별 진단법은 2개의 유전자를 단독으로 증폭시켜 그 증폭여부에 따라 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP와 돼지열병 야외 바이러스를 RT-PCR로 감별하는 방법이다.
(1) 항원 감별 진단을 위한 RT - PCR 용 프라이머의 제작
항원 감별 진단을 위한 RT-PCR용 프라이머는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 바탕으로 제작하였는데, 프라이머 D1 (서열번호 1, 2)은 유전자 재조합 돼지열병 백신 바이러스 뿐만 아니라 돼지열병 바이러스 유전형 1, 2, 3에 모두 결합하기 위하여, 정방향 프라이머에는 1개, 역방향 프라이머에는 2개의 멀티코돈을 넣어 제작하였다.
프라이머 D2 (서열번호 3, 4)는 유전자 재조합 돼지열병 바이러스만 결합하도록 제작하였다.
이때, 프라이머 D1은 78번부터~505번까지의 뉴클레오티드를 증폭시키고, 5'NCR과 Npro gene을 일부 포함하도록 하였으며, 프라이머 D2는 1699번부터 2184번까지의 뉴클레오티드를 증폭시키고, Erns 및 E1 gene을 일부 포함하도록 작성하였으며, 하기 표 3과 같다.
항원 감별 진단을 위하여 사용한 RT-PCR용 프라이머
프라이머 명칭 프라이머 염기서열 증폭위치*
D1 F: 5'-CGA CGG CCG AAM TGG GCT A-3' (서열번호 1)
R: 5'-TGT TGA YTG TGG GTG TAC CWC-3'(서열번호2)		 78-96

484-505
D2 F: 5'-CCA GGA TAC TGC TCA TTA CC-3' (서열번호 3)
R: 5'-ACG TCT TCA GTC CTG AGT TC-3' (서열번호 4)		 1699-1718

2165-2184
* 증폭위치 : Flc-LOM-BErns 염기서열 기준
(2) 항원 감별을 위한 RT - PCR
하기 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 하나의 프라이머 세트(D1)로 하는 428 bp 크기의 서열번호 8의 5'NCR 유전자, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 하나의 프라이머 세트(D2)로 하는 486 bp 크기의 서열번호 9의 E-rns-E1 유전자를 이용하여 각각 RT-PCR을 수행하였다.
이때, RT-PCR은 30분/42℃, 10분/94℃, (35 싸이클: 30초/94℃, 30초/53℃, 45초/72℃), 10분/72℃의 조건으로 수행하였으며, 증폭된 유전자는 아가로스젤에서 전기영동법으로 확인하였다.
(3). Flc - LOM - BErns 바이러스 KCTC 12304 BP 와 돼지열병 야외 감염 바이러스의 감별
상기와 같이 증폭된 유전자를 확인한 결과, 하기 표 4와 같이, D1 프라이머 세트는 현재 돼지열병 진단용으로 사용하고 있는 것으로 돼지열병에 특이적으로 결합하여 BErns 뿐만이 아니라, 돼지열병 바이러스들은 모두 검출이 되었으나, BVDV에는 결합하지 않았다 (도 4 참조).
또한, D2 프라이머 세트는 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP에 특이적으로 결합하는 것으로, 돼지열병 뿐만 아니라 BVDV에도 결합하지 않았으며, 오직 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP에만 결합하였다 (도 5 참조).
특이적 결합 유무
프라이머 유전자 Flc-LOM-
BErns KCTC 12304BP		 돼지열병
바이러스		 BVDV
D1 5'NCR O O X
D2 Erns-E1 O X X
따라서, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP를 생백신주로 사용할 경우, 돼지열병 야외 바이러스와 항원 감별을 할 수 있음을 알 수 있고, 상기 프라이머 세트 D1은 10 TCID50 정도의 검출 감도를 보이며, 프라이머 세트 D2 역시 유사한 검출 감도를 나타내어, 진단용 프라이머로 사용가능함을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).
본 발명에 의한 감별방법은, 유전자적 감별을 통하여 돼지열병 야외 바이러스와 유전자 재조합 돼지열병 바이러스의 감별이 용이하고, 돼지열병 백신 바이러스의 변이를 쉽게 추적할 수 있으므로, 돼지열병 야외 바이러스가 감염된 돼지를 조기에 감별하여 제거함으로써, 돼지열병의 청정화에 효과적으로 사용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12304BP 20121102
<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, Republic of Korea <120> Differentiating method between swine infected by wild type classical swine fever virus and recombinant classical swine fever-vaccinated swine, and primer set <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_D1 <400> 1 cgacggccga amtgggcta 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_D1 <400> 2 tgttgaytgt gggtgtaccw c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_D2 <400> 3 ccaggatact gctcattacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_D2 <400> 4 acgtcttcag tcctgagttc 20 <210> 5 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bovine Viral Disease Virus gene <400> 5 gaaaaagcat tgctggcatg ggcaataata actatagttt tgtttcaagt tacaatggga 60 gaaaacataa cacagtggaa cctacaagac aatgggacgg aagggataca acgggcaatg 120 tttcaaaggg gtgtgaatag aagtctacat ggaatctggc cagagaaaat ctgtactggt 180 gtcccttccc atctagccac cgatatggaa ctaaaaacaa tccatggtat gatggatgca 240 agtgagaaga ccaactacac gtgttgcaga cttcaacgcc atgagtggaa caagcatggt 300 tggtgcaact ggtacaatat tgaaccctgg attctagtca tgaatagaac ccaagccaat 360 cttactgagg gacaaccacc aagggagtgc gcagtcactt gcaggtatga tagggatagt 420 gacttaaacg tagtaacaca agctagagat agccccacac tcttgacagg ttgcaagaaa 480 ggaaagaact tctcctttgc aggcatactg acgcggggtc cctgcaactt tgaaatagct 540 gcgagtgatg tattattcaa agaacatgac tgcactagta tgttccagga tactgctcat 600 taccttgttg acgggatgac caactcctta gaaaatgcca gacaaggaac cgctaaactg 660 acaacctggt taggcaagca gctcgggata ctagggaaaa agttggaaaa caagagtaag 720 acgtggtttg gagca 735 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_BErns <400> 6 ggaagaaatt agaaaaagca ttgctggcat gggcaat 37 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_BErns <400> 7 gatagggcat atgctccaaa ccacgtctta ctc 33 <210> 8 <211> 428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'NCR <400> 8 cgacggccga actgggctgg ccatgcccgc agtaggacta gcaaacggag ggactagccg 60 tagtggcgag ctccctgggt ggtctaagtc ctgagtacag gacagtcgtc agtagttcga 120 cgtgagcaga agcccacctc gatatgctat gtggacgagg gcatgcccaa gacacacctt 180 aaccctagcg ggggtcgcta gggtgaaatc acaccacgtg atgggagtac gacctgatag 240 ggtgctgcag aggcccacta ttaggctagt ataaaaatct ctgctgtaca tggcacatgg 300 agttgaatca ttttgaactt ttatacgaaa caaacaaaca aaaaccaaag ggagtggagg 360 aaccggtata cgatgccacg gggaaaccat tgtttggaga cccgagtgag gtacacccac 420 aatcaaca 428 <210> 9 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-rns-E1 <400> 9 ccaggatact gctcattacc ttgttgacgg gatgaccaac tccttagaaa atgccagaca 60 aggaaccgct aaactgacaa cctggttagg caagcagctc gggatactag ggaaaaagtt 120 ggaaaacaag agtaagacgt ggtttggagc atatgcccta tcaccttact gtaatgtaac 180 aagcaaaata gggtacatat ggtacactaa caactgcacc ccggcttgcc tccccaagaa 240 tacaaagata ataggccccg gtaaatttga cactaatgcg gaggacggaa agattctcca 300 tgagatgggc ggccacctat cagaatttct gctgctctct ctggttgttc tgtctgactt 360 cgcccctgaa acagccagcg cgttatacct cattttgcac tacgtgattc ctcaatccca 420 agaagaacct gaaggctgtg acacaaacca gctgaatcta acagtggaac tcaggactga 480 agacgt 486

Claims (8)

  1. 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법에 있어서,
    서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 돼지열병 야외 바이러스에 대한 특이적 결합성, 및
    서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성을 이용하여 감별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신 접종 돼지의 감별방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돼지열병 야외 바이러스에 대한 특이적 결합성이, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스 및 상기 돼지열병 야외 바이러스에 모두 결합하는 것을 특징으로 하는 감별방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에 대한 특이적 결합성이, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스에만 결합하는 것을 특징으로 하는 감별방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 바이러스가 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP인 것을 특징으로 하는 감별방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 백신이 생백신인 것을 특징으로 하는 감별방법.
  6. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 및
    서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 구성되는,
    실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 돼지열병 야외 바이러스 감염 돼지와 유전자 재조합 돼지열병 백신접종 돼지를 감별하기 위한 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자 재조합 돼지열병 백신의 바이러스가 Flc-LOM-BErns 바이러스 KCTC 12304BP인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 백신이 생백신인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
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