KR102336158B1

KR102336158B1 - 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물

Info

Publication number: KR102336158B1
Application number: KR1020210008308A
Authority: KR
Inventors: 안동준; 차라미; 최세은; 현방훈; 박봉균
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2021-12-07

Abstract

본 발명은 돼지유행성설사병바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus: PEDV) 및 돼지로타바이러스(Porcine Rotavirus: PRoV)에 대한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 신규 돼지유행성설사병바이러스 유전형 G2b 백신주, 신규 돼지로타바이러스 유전형 G4P[13] 백신주 및 신규 돼지로타바이러스 유전형 G9P[7] 백신주와, 이들의 불활성화된 바이러스들을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물{Vaccine Composition Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Rotavirus}

돼지 설사병(Porcine Diarrhea)은 어린 연령의 자돈들에 있어서 폐사율이 아주 높을 뿐만 아니라 생존한 자돈의 성장률을 약화시키고 타 질병에 대해 감수성을 높이는 등 양돈 산업에 있어서 가축 생산물의 생산성을 저해시키는 가장 중요한 요인이다.

바이러스 감염으로 인한 돼지 설사병의 주요 원인체로는 돼지유행성설사병바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus: PEDV)와 돼지로타바이러스(Porcine Rotavirus: PRoV)가 있다.

PEDV는 코로나비리대과(Family: Coronaviridae), 알파코로나바이러스 속 (Genus: Alphacoronavirus)에 속하는 외피(envelope)를 보유한 RNA 바이러스로, 주로 14일령 이하의 어린 자돈에서 수양성 설사와 이로 인한 탈수 증상 및 구토를 유발하는 돼지유행성설사병(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)의 주요 병원체이다. PEDV는 어린 자돈에서 거의 100%에 이르는 폐사율을 발생시키며, 대한민국, 일본, 중국, 대만, 베트남, 필리핀 등 다수의 아시아국가와, 미국, 캐나다, 멕시코 등의 아메리카 대륙과, 유럽지역 등 전 세계에 걸쳐 양돈 산업에 심각한 경제적 손실을 야기하는 것으로 알려져 있다.

PEDV는 2013년 말에 미국(US)형 PEDV가 대한민국에 유입되어 2013년에 12건, 2014년에 169건 등으로 지속하여 발생하다가 최근 2018년에 221건, 2019년 10월 에는 127건 발생한 것으로 보고되었다.

PEDV 감염 질병은 최근에는 계절적 특성과 상관없이 겨울 이외의 계절에도 빈번하게 발생하고 있다.

PEDV 감염 질병은 멧돼지과 동물, 즉 돼지의 장에 발병하는 소화기성 질환으로 돼지의 연령에 관계없이 그 증상이 나타나지만, 포유자돈(이유기 이전의 어린 연령 돼지)에게 있어 PEDV 감염은 치명적이어서 감염 증상이 심할 경우 폐사를 유발할 수 있다. 또한, PEDV에 감염된 돼지가 생존하더라도 감소된 체중으로 인해 왜소하고 허약한 위축돈 상태로 남아 사료 섭취가 부진하고 도축 출하 시기에 다른 정상 돼지와 같이 출하가 이루어지지 못하여 30일 이상 추가 사육함으로써 사료 비용과 노동력이 낭비되는 등 양돈 농장에 경제적 손실을 야기한다.

PEDV는 돼지 소장의 점막 상피 세포(mucous epithelial cells)에서 1~2일간의 잠복기를 거쳐 증식하며 설사를 유발하게 되는데 이때 소장 점막의 융모 상피 세포가 설사와 함께 탈락한다. 특히, PEDV에 감염된 포유자돈은 소장의 영양분 흡수 기능이 온전하지 못하기 때문에 모돈의 우유를 섭취하더라도 수양성 설사가 지속되어, 극심한 탈수 증상과 함께 체중이 30% 이상 줄면서 결국 폐사에 이르게 된다. 포유자돈에서 PEDV의 소장 내 증식과 소장 상피 세포 탈락을 방지하기 위해서는 PEDV 감염을 방어할 수 있는 PEDV 항체를 보유한 모돈의 초유를 섭취하는 것이 중요하다.

PEDV 감염의 예방을 위하여, 생백신과 불활성화 백신이 단일백신 또는 혼합백신의 형태로 시판되어 양돈 농장에 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 상기 백신들을 접종 받은 모든 모돈돼지에서 충분히 높은 면역원성을 나타내지 못하여 PEDV 감염에 의한 피해가 근절되지 못하고 지속되고 있다. 이러한 피해는 백신의 한계, 즉 기존 백신 제조에 사용된 PEDV 백신주와 현재 양돈 농장에서 유행하는 PEDV 야외주/야생주 간의 바이러스 유전자들의 염기변이 차이, 특히 스파이크 유전자(Spike gene)의 염기변이 차이로부터 발생된 것이며, 이와 더불어 백신 내 포함되는 백신주 및 면역강화제의 조성의 차이로부터 야기된 결과이기도 하다. 이에 최근 대한민국의 양돈 농장에서 유행하고 있는 주요 PEDV로 PEDV 유전형 G2b 야외주를 이용한 새로운 백신 개발이 요구되고 있다.

한편, PEDV 백신은 PEDV 유전형에 따라 나뉘는데 PEDV 유전형 G1에 대한 PEDV 백신은 2000년 초반에 생독백신 및 사독백신이 개발되었고, PEDV 유전형 G2에 대한 PEDV 백신은 사독백신이 단미사료 형태로 개발되어 있기는 하나, PRoV 등의 설사병을 유발하는 다른 바이러스들과 혼합백신 형태로 개발된 적은 없다.

레오비리대과(Family: Reoviridae)에 속하는 PRoV는 돼지, 소, 조류 등 여러 동물에 감염되어 중증 설사증을 유발하는 병원체이다. PRoV는 VP6 캡시드 단백질(Capsid protein)에 대한 반응성에 따라 A~H의 총 8가지 혈청형(Serotype)으로 분류되는데, 인간과 기타 동물에서 중증의 설사 증상을 주로 일으키는 혈청형은 A형인 것으로 알려져 있다.

PRoV 입자 속에 함유된 11개의 이중가닥 RNA는 6개의 구조단백질(VP1-4, VP6, VP7)과 6개의 비구조단백질(NSP1-6)을 암호화(encoding)하고 있으며, 상기 11개의 이중가닥 RNA 게놈의 복잡한 유전적 특징으로 인해 PRoV는 다양한 유전형 및 혈청형을 가질 수 있으므로 PRoV에 대한 백신을 개발하는데 어려움이 많다.

PRoV는 다양한 연령대의 돼지에서 설사를 유발하며, 특히 2~6주령의 어린 자돈에서 심한 식욕 저하, 구토 및 설사를 유발하고, 지속적인 설사 등의 증상은 소장 내 융모 상피 세포를 탈락시켜 충분한 영양의 흡수를 방해하여 어린 자돈의 체중 감소를 일으켜 심한 경우 폐사할 수 있다.

PRoV는 대한민국의 양돈 농장 대부분에 상재해 있고, 2016년에 284개의 양돈 농장에서 병성감정을 수행한 결과 모두 양성으로 진단되었으며 현재까지 양돈 농장에 매년 200건 내외로 꾸준히 PRoV 감염 사례가 보고되고 있다.

PRoV 단독 감염으로 인한 폐사율은 10% 정도이지만, 소화기성 질환 세균 및 다른 바이러스와의 복합 감염이 이어질 경우 폐사율은 더 증가하여 양돈 농장의 피해는 커질 수 밖에 없다.

현재 사용 중인 PRoV 예방 백신은 대부분 2000년대 초반에 개발된 불활성화 백신 또는 생백신으로 대한민국의 양돈 농장에 보급되어 사용하고 있음에도 불구하고 PRoV 감염은 여전히 근절되지 못하였다. 구체적으로, 최근 수집한 대한민국의 양돈 농장의 돼지 설사 시료 총 377개 중 53건이 PRoV에 대한 양성 시료로 판명되었고, 상기 양성 시료는 지역별로 경기도 8건, 강원도 13건, 충청남도 13건, 충청북도 6건, 전라북도 6건, 경상남도 3건, 경상북도 4건 등으로 나타나 특정 지역과 상관없이 전국적으로 PRoV가 발생하는 양상을 나타내었다. 따라서, 현재 유행하는 PRoV에 대한 혈청형/유전형에 적합한 맞춤형 백신의 개발이 시급한 상황이다.

PRoV의 캡시드 단백질(Capsid protein)의 가장 바깥쪽 층(outer layer)에는 백신 개발에 있어 가장 중요한 바이러스의 중화항체 형성에 관여하는 항원으로 VP7 단백질 및 VP4 단백질이 존재하며 이들의 항원성에 따라 PRoV를 VP7 유전자에 기초하여 유전형 G로 분류하거나 VP4 유전자에 기초하여 유전형 P로 분류하는데, 대륙/지역 및 시대별로 PRoV 유전형이 지속해서 변화하는 추세이므로 백신 개발에 어려움이 있다.

한편, 대한민국에서 현재 사용하고 있는 PRoV 백신은 A1(G5 type) 바이러스주와 10(G9 type) 바이러스주를 포함하는 불활성화된 백신 및 약독화된 생백신이기에 대한민국에서 발생하고 있는 PRoV 감염을 예방하는데 한계가 있다. 따라서, 대한민국의 양돈 농장에서 최신 유행하는 PRoV 야외주들의 분리, 및 분리한 야외주들을 백신주들로 확립하는 새로운 백신의 개발이 요구되고 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 최근 유행하는 PEDV 및 PRoV 각각의 유전형에 적합한 백신을 개발하고자 예의 노력한 결과, 대한민국의 양돈 농장에서 최근 유행한 야외주/야생형 바이러스주들을 분리하고 계대배양을 통해 신규 PEDV 유전형 G2b(Genotype G2b) 백신주, 신규 PRoV 유전형 G4P[13] 백신주 및 신규 PRoV 유전형 G9P[7] 백신주를 확립할 수 있었다. 상기 PEDV 백신주 및 PRoV 백신주들은 각각 숙주 세포에서 연속계대배양(Continuously passage cultivation) 시 백신 제조에 필요로 하는 충분한 고역가(high titer)의 바이러스 생성능이 있음을 확인하였고, 상기 PEDV 백신주 및 PRoV 백신주들을 불활성화한 후 면역강화제와 조합하여 임신모돈에 접종 후 태어난 자돈은 PEDV/PRoV의 공격접종 시 PEDV/PRoV의 감염 증상인 설사/폐사가 없는 것으로 확인되어 상기 PEDV 백신주 및 PRoV 백신주들은 우수한 면역원성을 가지고 동시에 PEDV 및 PRoV에 대한 방어 효과가 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

Chen N et al., Virus Res., 242:90-95, 2017 Gerdts V et al., Vet Microbiol., 206:45-51, 2017 Valkσ A et al., 2016. Acta Vet Hung., 65(2):253-261, 2017 Langel SN et al., Virus Res., 226:93-107, 2016 Lee C et al., Virol J., 12:193. doi: 10.1186/s12985-015-0421-2, 2015 Lin CM et al., Virus Res., 226:20-39, 2016 Wicht O et al., J Virol., 88(14):7952-61, 2014 Zhang Q et al., Virol J., 14(1):194, 2017 Naseer O et al., Virology., 507:53-63, 2017 Vlasova AN et al., Viruses., 9(3):48, 2017

본 발명의 주된 목적은 대한민국의 양돈 농장에서 최근 유행하는 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 방어에 효과적인 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 신규 돼지로타바이러스 백신주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 돼지로타바이러스 백신주를 불활성화(불활화)한 백신주 복합물(혼합물)을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백신 제조를 위한 상기 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 돼지로타바이러스 백신주의 용도를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지로타바이러스 유전형 G9P[7](Genotype G9P[7]) 백신주 및 돼지로타바이러스 유전형 G4P[13](Genotype G4P[13]) 백신주로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 백신주와, 돼지유행성설사병바이러스 유전형 G2b(Genotype G2b) 백신주로 이루어진 백신주 복합물을 유효성분으로 포함하는, 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하여 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스 중 어느 하나 이상에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 임신 후기의 모돈에게 투여하는 단계; 및 상기 모돈으로부터 출산(분만)된 자돈에게 상기 모돈의 초유를 수유하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 백신 제조에 있어서, 상기 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 돼지로타바이러스 백신주의 용도, 바람직하게는 돼지의 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 항체 생성을 위한 상기 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 돼지로타바이러스 백신주의 바이러스 항원으로서의 용도, 또는 돼지에서 상기 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 돼지로타바이러스 백신주의 면역반응 유도제로서의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 PEDV 유전형 G2b 백신주, PRoV 유전형 G4P[13] 백신주 및 PRoV 유전형 G9P[7] 백신주를 포함하는 백신 조성물은 최근 대한민국의 양돈 농장에서 유행하고 있는 PEDV 및 PRoV에 대한 예방 효능을 증진시켜 대한민국에서 사육되는 돼지 및 자돈의 설사병 바이러스 감염으로 인한 설사 빈도 및 설사 증세를 감소시키는 효과가 높아 양돈 농장에 생산성 향상 및 경제적 이익을 극대화 할 수 있다. 특히, 상기 백신 조성물을 임신모돈에 접종 시 임신모돈의 PEDV 및 PRoV 감염에 대한 면역력을 향상시키고, 임신모돈의 모체이행항체를 통해 태어난 자돈의 면역원성을 높여 PEDV 및 PRoV 감염으로 인한 자돈들의 설사, 폐사 등의 피해를 최소화 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 PEDV 유전형 G2b 백신주인 PEDV SGP-M1과, 종래 PEDV 바이러스주들(virus strains)의 스파이크 유전자에 대한 상동성 분석 결과를 계통수(phylogenetic tree)로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 PRoV 유전형 G9P[7] 백신주인 PRoV 18KPR02 및 PRoV 유전형 G4P[13] 백신주인 PRoV 18KPR03과, 종래 PRoV 바이러스주들의 VP7 유전자에 대한 상동성 분석 결과를 계통수로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03과, 종래 PRoV 바이러스주들의 VP4 유전자에 대한 상동성 분석 결과를 계통수로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PEDV SGP-M1를 접종한 Vero 세포의 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 계대별로 광학현미경 하에서 관찰할 결과를 사진으로 나타낸 것이고(좌측 패널), 상기 접종한 Vero 세포를 면역형광염색(Immunofluorescence assay, IFA)한 후 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 사진으로 나타낸 것이다(우측 패널).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PRoV 18KPR03을 접종한 TF-104 세포의 CPE 및 PLA(proximity ligation assays: DAB[3,3′-diaminobenzidine] 염색) 염색 결과를 광학현미경 하에서 관찰한 결과를 사진으로 나타낸 것이고(좌측 패널 및 중간 패널), 상기 접종한 TF-104 세포를 IFA한 후 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 사진으로 나타낸 것이다(우측 패널).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PEDV SGP-M1의 연속계대배양(계대수)에 따른 바이러스 역가를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PRoV 18KPR02의 연속계대배양(계대수)에 따른 바이러스 역가를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 PRoV 18KPR03의 연속계대배양(계대수)에 따른 바이러스 역가를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9, 도 10 및 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)와 면역증강제(Montanide 01 gel[Mon] 또는 IMS1313[IMS])를 혼합한 백신 조성물을 돼지의 이근부에 접종한 후, 8주간 1주 간격으로 확보한 혈청 내 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03에 대한 중화항체가 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)와 면역증강제(IMS1313)를 혼합한 백신 조성물을 임신모돈의 이근부에 접종한 후, 5주간 1주 간격으로 확보한 혈청 내 PEDV SGP-M1에 대한 중화항체가 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)와 면역증강제(IMS1313)를 혼합한 백신 조성물을 임신모돈의 이근부에 접종한 후, 5주간 1주 간격으로 확보한 혈청 내 PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03에 대한 중화항체가 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)와 면역증강제(IMS1313)를 혼합한 백신 조성물을 임신모돈의 이근부에 접종 후, 5주가 경과된 시점에서 확보한 임신모돈의 초유(colostrum) 내 PEDV에 대한 IgA 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)를 포함하는 백신 조성물을 경구로 접종받은 임신모돈으로부터 태어난 포유자돈에 야외형 PEDV/PRoV를 공격접종 한 후, 6일간 나타난 공격접종한 포유자돈의 설사 지수(Diarrhea score)의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)를 포함하는 백신 조성물을 경구로 접종받은 임신모돈으로부터 태어난 포유자돈에 야외형 PEDV/PRoV를 공격접종한 후, 6일간 나타난 공격접종한 포유자돈의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18, 도 19 및 도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1 및 불활성화된 2종 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)를 포함하는 백신 조성물을 경구로 접종받은 임신모돈으로부터 태어난 포유자돈에 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 또는 PRoV 18KPR03을 공격접종한 후, 희생시킨 포유자돈들의 혈청 내 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03에 대한 중화항체가를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에 따른 백신주인 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03을 사용하는 백신 조성물의 제조공정/적용예를 도시한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량, 온도, 개수, 퍼센트(%), 배수 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 유전형 G2b(Genotype G2b) 타입주에 속하는 신규 돼지유행성설사병바이러스, 더 구체적으로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주(수탁번호: KCTC14056BP; 수탁명칭: Porcine Epidemic Diarrhea virus SGP-M1; 수탁일자: 2019년 12월 3일)[이하, 본 명세서에서는 PEDV SGP-M1이라고 함]에 관한 것이다.

본 발명의 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 스파이크 유전자(Spike gene)의 염기서열은 서열번호 1로 표기되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포에서 1회 이상, 바람직하게는 20회 이상, 더 바람직하게는 40회 이상, 더욱 바람직하게는 60회 이상, 가장 바람직하게는 80회 이상의 계대수(Passage Number)로 연속계대배양(Continuously passage cultivation) 시 1 X 10^5.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^6.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^6.0~ 1 X 10^9.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 유전형 G2b 타입주에 속하는 신규 돼지유행성설사병바이러스, 바람직하게는 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)를 유효성분으로 함유하는 돼지유행성설사병바이러스의 감염 예방 또는 돼지유행성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는 유전형 G2b 타입주에 속하는 신규 돼지유행성설사병바이러스, 바람직하게는 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 공지의 방법으로 불활성화 처리하여 얻을 수 있다.

공지의 불활성화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활성화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활성화제를 사용하여 불활성화할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는 숙주 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

더 구체적으로, 본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는,

(a) 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 숙주 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 계대배양한 후 수득한 배양물에 불활성화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 반응시키는 단계;

(b) 상기 불활성화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활성화제를 중화시키는 단계;

(c) 중화 후, 수득한 배양물을 숙주 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 배양시키는 단계; 및

(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 1회 이상, 바람직하게는 20회 이상, 더 바람직하게는 40회 이상, 더욱 바람직하게는 60회 이상, 가장 바람직하게는 80회 이상의 계대수로 연속계대배양을 거쳐 1 X 10^5.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^6.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^6.0~ 1 X 10^9.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 가지는 돼지유행성설사병바이러스 백신주일 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 돼지유행성설사병바이러스 백신주 배양물의 상층액일 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활성화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활성화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활성화 반응은 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 20시간 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활성화제의 중화제로서 불활성화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 사용할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, Vero 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등을 사용할 수 있고, 소 신장세포로는 MDBK 세포, GBK 세포, FBK 세포 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Vero 세포를 사용한다.

상기 불활성화는 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 면역원성을 유지하면서, 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 병원성은 제거하는 것은 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 유전형 G9P[7](Genotype G9P[7]) 타입주에 속하는 신규 돼지로타바이러스, 더 구체적으로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주(수탁번호: KCTC18756P; 수탁명칭: Porcine Rotavirus 18KPR02; 수탁일자: 2018년 12월 14일)[이하, 본 명세서에서는 PRoV 18KPR02이라고 함]에 관한 것이다.

본 발명의 수탁번호 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스의 VP4 유전자의 염기서열은 서열번호 2로 표기되고, VP7 유전자의 염기서열은 서열번호 3으로 표기되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 수탁번호 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 TF-104 세포에서 1회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 더 바람직하게는 10회 이상, 더욱 바람직하게는 15회 이상, 가장 바람직하게는 25회 이상의 계대수로 연속계대배양 시 1 X 10^3.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^4.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^4.0~ 1 X 10^9.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 유전형 G4P[13](Genotype G4P[13]) 타입주에 속하는 신규 돼지로타바이러스, 더 구체적으로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주(수탁번호: KCTC18757P; 수탁명칭: Porcine Rotavirus 18KPR03; 수탁일자: 2018년 12월 14일)[이하, 본 명세서에서는 PRoV 18KPR03이라고 함]에 관한 것이다.

본 발명의 수탁번호 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스의 VP4 유전자의 염기서열은 서열번호 4로 표기되고, VP7 유전자의 염기서열은 서열번호 5로 표기되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 수탁번호 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 TF-104 세포에서 1회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 더 바람직하게는 10회 이상, 더욱 바람직하게는 15회 이상, 가장 바람직하게는 29회 이상의 계대수로 연속계대배양 시 1 X 10^3.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^4.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1x10^4.0~1x10^8.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 유전형 G9P[7] 타입주에 속하는 돼지로타바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원) 및 유전형 G4P[13] 타입주에 속하는 돼지로타바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)를 유효성분으로 함유하는 돼지로타바이러스의 감염 예방 또는 돼지로타바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주는 유전형 G9P[7] 타입주에 속하는 돼지로타바이러스 백신주 또는 유전형 G4P[13] 타입주에 속하는 돼지로타바이러스 백신주, 바람직하게는 수탁번호 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주 또는 수탁번호 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주를 공지의 방법으로 불활성화 처리하여 얻을 수 있다.

공지의 불활성화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활성화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활성화제를 사용하여 불활성화될 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주는 숙주 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

더 구체적으로, 본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주는,

(a) 돼지로타바이러스 백신주를 숙주 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 계대배양한 후 수득한 배양물에 불활성화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 반응시키는 단계;

(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 수탁번호 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 1회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 더 바람직하게는 10회 이상, 더욱 바람직하게는 15회 이상, 가장 바람직하게는 25회 이상의 계대수로 연속계대배양을 거쳐 1 X 10^3.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^4.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^4.0~ 1 X 10^9.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 가지는 돼지로타바이러스 백신주일 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 수탁번호 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 1회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 더 바람직하게는 10회 이상, 더욱 바람직하게는 15회 이상, 가장 바람직하게는 29회 이상의 계대수로 연속계대배양을 거쳐 1 X 10^3.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^4.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^4.0~ 1 X 10^8.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 가지는 돼지로타바이러스 백신주일 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 돼지로타바이러스 백신주 배양물의 상층액일 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활성화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활성화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활성화 반응은 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 20시간 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활성화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 사용할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 돼지로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, Vero 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등을 사용할 수 있고, 소 신장세포로는 MDBK 세포, GBK 세포, FBK 세포 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 MA-104 세포 또는 TF-104 세포를 사용한다.

상기 불활성화는 돼지로타바이러스 백신주의 면역원성을 유지하면서, 돼지로타바이러스 백신주의 병원성은 제거하는 것은 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 수탁번호 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원) 및 수탁번호 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 돼지로타바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)와, 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 불활성화시켜 준비한 불활성화된 바이러스(바이러스 항원)로 이루어진 바이러스 복합물(바이러스 혼합물)을 유효성분으로 함유하는 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물, 바람직하게는 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스의 감염 예방, 또는, 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

상기 "돼지"란 용어는 숫돼지, 암돼지, 수자돈, 암자돈, 임신돼지, 수유 중인 돼지, 임신돼지의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 임신중인 암돼지(임신돼지), 수유중인 암돼지, 임신돼지의 태아 등의 돼지과 동물이 모두 포함된다.

상기 자돈은 3일령 내지 11주령, 바람직하게는 3일령 내지 10일령의 돼지인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 “예방”은 동물에서 돼지유행성설사병바이러스 및/또는 돼지로타바이러스에 의해 발생하는 설사, 구토 및 분변에 의한 바이러스 배출, 소장 내의 병변 유발을 완화 및/또는 방지를 포함하는 개념이다.

본 발명에서, 용어 '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에서 용어 “백신”은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 바람직하게는 포유동물과 같은 목적 동물에 주사 또는 경구 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.

상기의 "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(포유동물 등)에서 면역반응을 유발하는 바이러스 항원을 구성하는 핵산, 폴리펩타이드 등의 물질을 이용하여 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들의 특성을 의미한다.

상기 백신 조성물은 목적 동물에 도입 시 면역반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있는데, 이와 같은 면역반응은 백신 접종된 돼지의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화 여부로 검출하되, 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출 가능하다.

돼지유행성설사병바이러스 및/또는 돼지로타바이러스는 분변-경구 방식으로 바이러스 감염 돼지 개체로부터 다수의 비감염 돼지 개체들에게 전파된다. 특히, 바이러스 감염 징후를 유발하는데 필요한 바이러스 수는 바이러스의 유전형 및 바이러스 발생 지역(Origin)의 특성에 따라 바이러스의 병원성 및 돼지 무리 전체에 전파되는 속도와 연관이 있는 것으로 보고된 바 있다.

돼지의 돼지유행성설사병바이러스 및/또는 돼지로타바이러스의 감염 여부는 증상학(Symptomology)에 의해 확인될 수 있다. 돼지유행성설사병바이러스 및/또는 돼지로타바이러스에 감염된 동물의 통상적인 증상으로는 수양성 설사, 우울감, 식욕 부진, 탈수 증세 등이 포함될 수 있으며, 현재까지의 바이러스 감염증의 진단은 상기 증상들을 기준으로 이루어져 왔다.

그러나 혈청학적 연구에 따르면, 돼지유행성설사병바이러스 및/또는 돼지로타바이러스로 감염된 돼지는 임상적 증후가 나타나지 않더라도, 지속감염(Persistent Infection, PI)이 되어 있는 것으로 보고된 바 있다.

따라서, 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스 감염 돼지의 바람직한 확인방법은 증상학에 의존하기보다는 혈청학적 분석방법을 통해 바이러스 자체의 존재를 검출하는 것이다. 예컨대, 바이러스 및/또는 바이러스-감염 돼지의 정확한 검출방법으로는 바이러스 분리법(Virus Isolation), 바이러스 역가 측정(Virus Titration), 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법이 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 바이러스 분리법, 역전사-중합효소 연쇄 반응, 조직면역염색법, 효소결합 면역흡착 검사법이 포함된다(Haines et al., Vet. Pathol., 29(1):27-32, 1992; Homer et al., Vet. Microbiol., 43(1):75-84, 1995).

상기 백신 조성물은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 돼지의 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물에 포함되는 면역반응 유도를 위한 불활성화된 백신주의 정확한 용량은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 돼지에서의 면역 반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 유효량을 의미하며, "유효량"이란 용어는 상기 조성물이 투여되는 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 돼지에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 불활성화된 백신주의 용량을 말한다.

상기 “면역 반응”은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 불활성화된 백신주의 용량은 접종 대상인 포유동물, 바람직하게는 돼지의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.

본원의 명세서에서, "항체"라는 용어는 각각 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 V_H 및 V_L을 통해 다른 분자(항원)에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항체"라는 용어는 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이의 임의의 서브클래스 또는 이의 조합이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 임의의 면역글로불린 분자를 지칭한다. "항체"라는 용어는 달리 명백하게 언급되지 않는 한 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, Fd, scFv 및 sdFv 단편이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 면역글로불린 분자의 기능성 단편을 또한 의미한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 면역강화제(Adjuvant, 어쥬번트), 항생제, 면역조절제 등을 더 포함할 수 있다.

본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 목적 동물, 바람직하게는 돼지에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(어쥬번트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클(Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.

상기 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 면역강화제로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50(셉픽(Seppic), 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(셉픽(Seppic), 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴 및 몬타나이드 01 겔로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트이다. 상기 어쥬번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.

상기 면역강화제는 일반적으로 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역반응의 향상 및 백신의 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 면역강화제를 사용함으로써 면역반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다.

상기 백신 조성물에 포함되는 항생제로는 겐타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 포함되는 상기 불활성화된 바이러스 백신주(들)와 어쥬번트의 혼합비율은 부피 기준으로, 5~9 : 1~5, 바람직하게는 6~9 : 1~4, 더 바람직하게는 7~9 : 1~3, 가장 바람직하게는 8 : 2일 수 있다.

상기 백신 조성물에 포함되는 바이러스 복합물(혼합물)을 구성하는 불활성화된 백신주들인 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03의 바이러스 역가(TCID₅₀/mL 기준) 비율은 바람직하게는 1~15 : 0.1~1.5 : 0.1~1.5, 더 바람직하게는 1~12 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5, 가장 바람직하게는 1~10 : 0.9~1.2 : 0.9~1.2일 수 있다.

상기 백신 조성물은 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동-건조, 동결-건조 또는 탈수 형태(단, 투여 전에 제약상 허용되는 비히클(예컨대, 멸균 식염수, 완충액 등)로 재수화 또는 현탁됨)로 제조될 수 있다.

상기 백신 조성물은 목적 동물, 바람직하게는 돼지에서 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.

상기 백신 조성물은 목적 동물인 임신돼지, 바람직하게는 임신 말기에 있는 임신돼지에 2회 이상 접종하는 것으로, 더 바람직하게는 상기 백신 조성물을 임신돼지에 출산 전 4~5주 전에 1차 접종하고 출산 전 2~3주 전에 2차 접종을 한 후, 출산을 유도하여 얻은 자돈에게 출산 모돈의 초유를 섭취하도록 하여 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스 감염에 대한 효과적인 면역성을 제공할 수 있다.

효과적인 백신의 투여량은 백신의 성분 및 투여/접종 일정에 따라 좌우된다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스 제제가 백신 조성물에 사용되는 경우, 바이러스 투여/접종량 당 1 X 10^3.0TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^4.0TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^4.0~ 1 X 10^9.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 백신의 양이 효과적이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여/접종하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 백신 조성물을 임신 후기의 모돈에게 투여/접종하는 단계; 및 상기 모돈으로부터 출산된 자돈에게 상기 모돈의 초유를 수유하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.

상기 임신 후기는 자돈의 출산 7주 전 내지 2주전일 수 있으며, 상기 백신 조성물은 바람직하게는 자돈의 출산 9주전 내지 2주전에 2회 이상 모돈에게 투여/접종, 더 바람직하게는 출산 9주전, 7주전, 5주전 및 2주전에 모돈에게 4회 투여/접종, 가장 바람직하게는 출산 5주전 및 2주전에 모돈에게 2회 투여/접종할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 각각의 감염증은 수양성 설사, 구토, 우울감, 식욕 부진, 탈수 증세, 분변을 통한 바이러스 배출 및 소장의 병변 유발로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예컨대 경구 또는 근육 경로를 통해 투여될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[실시예 1]: 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 신규 돼지로타바이러스 백신주의 확립

[1-1]: 최근 대한민국에서 유행하는 야생형 돼지유행성설사병바이러스의 분리 및 백신주 확립

2017년 한 해 동안 전국의 가축방역기관이 양돈 농장으로부터 채취한 돼지의 분변 및 장 조직 등의 시료들을 수집하여 야외주인 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 분리하였다.

구체적으로, 각 시료에 적절 용량의 항세균제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GibcoBRL, USA)를 함유하는 1X PBS(phosphate buffered saline, Welgene, South Korea) 용액을 첨가한 후 균질화한 다음, 원심분리하고 여과하여 각 시료의 상층액을 회수하였다. 각 시료로부터 회수한 상층액의 RNA(viral RNA 함유 추정 시료)를 RNA 분리 시약을 이용하여 추출한 다음, RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 분석방법으로 PEDV(Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 항원 검사를 수행하여, 총 17개의 PEDV 양성 시료를 확보하였다.

< RT-PCR 분석방법 >

RT-PCR 분석방법에 필요한 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104), Qiagen Inc., USA), PCR Premix Kit(AccuPower Profi Taq PCR Premix(Cat.No.K-2632), Bioneer Inc. South Korea) 및 cDNA 합성 키트(HelixCript Easy cDNA Synthesis Kit(Cat.No.ECDNA100), Nanohelx Inc., South Korea)를 준비하였다

먼저, RNA 추출 키트를 이용하여 각 시료의 상층액으로부터 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성된 cDNA와, PEDV의 표적 유전자인 스파이크 유전자에 특이적인 프라이머 쌍(아래 표 1 참조)을 PCR Premix Tube(시험약에 Taq Polymerase 포함)에 첨가한 후, 하기 반응조건에서 PCR을 수행하여 PEDV에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.

RT-PCR 반응조건

(1) RT: 상기 cDNA 합성 키트 및 각 시료의 상층액으로부터 분리한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

(2) PCR: 상기 합성된 cDNA를 이용하여, [95℃: 5분], [(95℃: 45초; 50℃: 45초; 68℃: 60초) x 40cycle], 및 [68℃: 5분]으로 PCR 반응을 수행하였다.

상기 RT-PCR 반응생성물을 1%(W/V) 겔 상에서 전기영동한 후, 상기 반응생성물의 증폭된 핵산의 분자량을 확인하여 PEDV에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.

표 1은 PEDV의 Spike 유전자의 염기서열 확인용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.

표적 유전자	프라이머 쌍	프라이머 서열 (5' to 3')	PCR 산물 크기	서열목록
Spike	Spike_Forward primer	ACT CTG GTG TCA TGG TAC	1,560bp	서열번호 6
Spike	Spike_Reverse primer	ATT GCG CCT CAA AGA AGA CG	1,560bp	서열번호 7

다음으로, 최근 대한민국에서 유행하는 PEDV의 유전자의 상동성 분석을 위해, 상기 17개의 PEDV 양성 시료 외에 2013~2018년에 수집한 116개의 PEDV 양성 시료와 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 각 유전형별 대표 바이러스 5~6개를 참고 시료(reference sample)로 이용하여 스파이크 유전자(spike gene)의 전체 염기서열(full-length base sequence)에 기초하여 유전자 계통도에 따른 계통수(phylogenetic tree) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 17개의 PEDV 양성 시료 모두가 PEDV 유전형 G2b 타입주(G2b type strain)인 것을 확인하였다.

상기 17개의 PEDV 양성 시료들로 판명된 돼지의 분변 및 장 조직 등의 시료들에 함유된 야외주를 분리하기 위해, 상기 돼지의 분변 및 장 조직 등의 시료들을 시료별로 적절 용량의 항세균제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GibcoBRL, USA)를 함유하는 1X PBS 용액에서 균질화시킨 후, 원심분리하고 여과하여 회수한 상층액을 접종 시료로 준비하였다(총 17개의 접종 시료).

야외주의 분리는 PEDV 감수성이 존재하는 원숭이 신장세포인 Vero 세포(Vero cell, ATCC^® CCL-81™, ATCC, USA)를 이용하여 실시하였다. 구체적으로, 37℃/5% CO₂ 습윤조건 하의 배양기(incubator)에서 24시간 동안 세포 배양용 플라스크(25cm²)에 배양한 Vero 세포를 혈청이 부재한 세포 배양 배지(alpha-MEM[alpha-Minimum Essential Medium], Sigma-Aldrich)로 2회 세척한 후, 상기 준비한 접종 시료 각각을 1~2mL의 용량으로 적정 수의 Vero 세포에 접종하였다. 그다음, 접종한 Vero 세포가 담긴 세포 배양 배지에 바이러스 배양 배지(0.02% 효모 추출물, 0.3% TPB(Tryptose phosphate broth) 및 5μg/mL 트립신을 함유하는 alpha-MEM)를 부피 기준으로, 세포 배양 배지: 바이러스 배양 배지 = 1 : 5로 보충하여 37℃/5% CO₂ 습윤조건 하의 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 접종 시료별로 배양기간 중 특이적인 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)가 광학현미경, 또는 PEDV 특이적 단클론항체를 처리하여 형광현미경(면역형광염색(Immunofluorescence assay, IFA) 후) 하에서 관찰되고 전체 세포수 중에서 80% 이상 세포변성효과를 야기한 접종 시료를 함유하는 배양액(supernatant)을 회수하여 미접종된 Vero 세포에 접종한 후 매회 계대배양한 후 위와 같이 광학현미경/형광현미경 하에서 관찰하였다.

그 결과, 상기 준비한 접종 시료를 접종하지 않은 Vero 세포인 음성대조군(negative control; NC)은 세포변성효과가 없었던 반면, 상기 준비한 접종 시료 17개를 접종한 Vero 세포 중에서 10회 계대배양 시 안정적으로 지속하여 세포변성효과를 야기하고 Vero 세포에서 1 X 10^4.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낸 계대배양한 PEDV 1종을 백신주로 확립하여 Porcine Epidemic Diarrhea virus SGP-M1로 명명하고(이하, 본 명세서에서는 PEDV SGP-M1이라고 함), 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC14056BP로 2019년 12월 3일에 수탁(기탁)하였다.

결국, PEDV 스파이크 유전자 염기서열 분석 결과에 따르면, PEDV 유전형 G2b 타입주인 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 PEDV SGP-M1은, 기존에 알려져 있던 PEDV 바이러스주들인 9종의 G2a 타입주, 7종의 G1 타입주 및 12종의 INDELS 타입주뿐만 아니라, 119종의 G2b 타입주와도 스파이크 유전자 염기서열 상 유의적인 차이가 있는, 신규 바이러스주인 것을 확인하였다(도 1: 신규 바이러스주인 KCTC14056BP로 수탁(기탁)된 PEDV SGP-M1 위주로 표기하였음).

[1-2]: 최근 대한민국에서 유행하는 야생형 돼지로타바이러스의 분리 및 백신주 확립

대한민국의 양돈 농장에서 2014~2018년의 기간 동안 수집한 총 377개의 돼지 설사변/분변 시료를 적절 용량의 항세균제-항진균제(Gentamicin, Antibiotic-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GibcoBRL, USA)를 함유하는 1X PBS에 균질화시킨 후 원심분리하고 여과하여 얻은 상층액의 RNA(viral RNA 함유 추정 시료)를 RNA 분리 시약을 이용하여 추출한 다음, RT-PCR 분석방법으로 PRoV(Porcine Rotavirus) 항원 검사를 수행하여 총 53개의 PRoV 양성 시료들을 확보하였다.

< RT-PCR 분석방법 >

먼저, RNA 추출 키트를 이용하여 각 시료의 상층액으로부터 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성된 cDNA와, PRoV의 표적 유전자인 VP 7 유전자 및 VP 4 유전자 각각에 특이적인 프라이머 쌍(아래 표 2 참조)을 선택적으로 PCR Premix Tube(시험약에 Taq Polymerase 포함)에 첨가한 후, 하기 반응조건으로 PCR을 수행하여 PRoV에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.

RT-PCR 반응조건

(2) PCR: 상기 합성된 cDNA를 이용하여,

VP 7 유전자의 염기서열을 증폭시키는 경우, [95℃: 5분], [(95℃: 45초; 53℃: 30초; 68℃: 60초) x 40cycle], 및 [68℃: 5분] 조건하에서 PCR 반응을 수행하였고,

VP 4 유전자의 염기서열을 증폭시키는 경우, [95℃: 5분], [(95℃: 45초; 55℃: 30초; 68℃: 60초) x 40cycle], 및 [68℃: 5분]으로 PCR 반응을 수행하였다.

상기 RT-PCR 반응생성물을 1%(W/V) 겔 상에서 전기영동한 후, 상기 반응생성물의 증폭된 핵산의 분자량을 확인하여 PRoV에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.

표 2는 PRoV의 VP7 유전자 및 VP4 유전자의 염기서열 확인용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.

표적 유전자	프라이머 쌍	프라이머 서열 (5' to 3')	PCR 산물 크기	서열목록
VP7	VP7_Forward primer	GCG GTT AGC TCC TTT TAA TG	1,000bp	서열번호 8
VP7	VP7_Reverse primer	AAT GAC CGT GAT CTT TTG GA	1,000bp	서열번호 9
VP4	VP4_Forward primer	GCT TCG CTC ATT TAT AGA CAA	874bp	서열번호 10
VP4	VP4_Reverse primer	CGC ACC ATT TAT AAC CTA ATC	874bp	서열번호 11

다음으로, 최근 대한민국에서 유행한 PRoV의 유전자의 상동성 분석을 위해, 상기 53개의 PRoV 양성 시료들과 NCBI에 등록된 각 유전형별 대표 바이러스를 참고 시료로 이용하여, VP7 유전자 및 VP4 유전자에 대해 계통수 분석을 수행하였다.그 결과, 대한민국의 양돈 농장에서 최근 유행한 53개의 야외주/야생형 PRoV 시료의 유전적 변이에 기초하여 VP7(G type) 유전자 및 VP4(P type) 유전자 각각의 염기서열을 분석한 결과, 전체 야외주/야생형 바이러스주들 중에서 G4 타입주와 G9 타입주가 각각 21 바이러스주(검출비율: 39.6%)로 가장 높은 검출비율로 나타났고, 그 외 G3 타입주(검출비율: 11.3%), G5 타입주(검출비율: 5.7%), G8 타입주(검출비율: 1.9%) 및 G11 타입주(검출비율: 1.9%) 등이 낮은 검출비율로 나타났다.

결국, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 PRoV 양성 시료들 중에서 가장 높은 검출비율(39.6%)로 나타난 것은 PRoV 유전형 G4 및 PRoV 유전형 G9로 각각 21개의 바이러스주가 검출되었고, PRoV 유전형 P는 상기 PRoV 양성 시료들 중에서 P[7] 타입, P[6] 타입, P[13] 타입, P[23] 타입 등의 다양한 유전형으로 존재하는 것을 확인하였다.

상기 PRoV 양성 시료들로 판명된 돼지의 설사변/분변에 함유된 야생형 바이러스주(야외주)를 분리하기 위해, 상기 PRoV 양성 시료들 중에서 가장 높은 비율로 존재하는 PRoV 유전형 G4(39.6% 검출비율) 및 PRoV 유전형 G9(39.6% 검출비율)를 함유하는 PRoV 양성 시료(설사변/분변)를 적절 용량의 항세균제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GibcoBRL, USA)를 함유하는 1X PBS 용액에서 균질화시킨 후, 원심분리하고 여과하여 회수한 상층액을 접종 시료로 준비하였다(총 42개의 접종 시료: PRoV 유전형 G4(21개) 및 PRoV 유전형 G9(21개)).

야외주의 분리는 PRoV 감수성이 존재하는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포(TF-104 cell)를 이용하여 실시하였다. 구체적으로, 37℃/5% CO₂ 습윤조건 하의 배양기에서 세포 배양용 플라스크(25cm²)에 배양한 TF-104 세포를 혈청이 부재한 세포 배양 배지(alpha-MEM, Sigma-Aldrich)로 2회 세척한 후, 상기 준비한 접종 시료 각각을 1~2mL의 용량으로 적정 수의 TF-104 세포에 접종하였다. 그다음, 바이러스 배양 배지(0.02% 효모 추출물, 0.3% TPB(Tryptose phosphate broth), 7.5% NaHCO₃(Sodium bicarbonate) 및 10μg/mL 트립신을 함유하는 alpha-MEM)를 부피 비로, 세포 배양 배지: 바이러스 배양 배지 = 1 : 5 로 보충하여 37℃/5% CO₂ 습윤조건 하의 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 접종 시료별로 배양기간 중 특이적인 세포변성효과(CPE)가 관찰되고 전체 세포수 중에서 80% 이상 세포변성효과를 야기한 접종 시료를 함유하는 배양액은 회수하여 매회 계대배양하였다.

그 결과, 상기 준비한 접종 시료를 접종하지 않은 TF-104 세포인 음성대조군(negative control; NC)은 세포변성효과가 없었던 반면, 상기 준비한 접종 시료를 42개 접종한 TF-104 세포 중에서 10회 계대배양 시 안정적으로 지속하여 세포변성효과를 야기하고 TF-104 세포에서 1 X 10^4.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낸 계대배양된 2종의 PRoV를 백신주들로 확립하였다.

2종의 PRoV 중에서 1종은 PRoV 유전형 G9P[7]로서 Porcine Rotavirus 18KPR02로 명명하고(이하, 본 명세서에서는 PRoV 18KPR02이라고 함), 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18756P로 2018년 12월 14일에 수탁(기탁)하였다. 또 다른 1종은 PRoV 유전형 G4P[13]으로 Porcine Rotavirus 18KPR03로 명명하고(이하, 본 명세서에서는 PRoV 18KPR03이라고 함), 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18757P로 2018년 12월 14일에 수탁(기탁)하였다.

결국, PRoV VP7 유전자 염기서열 분석 결과에 따르면, PRoV 유전형 G9P[7] 타입주인 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 Porcine Rotavirus 18KPR02 및 PRoV 유전형 G4P[13] 타입주인 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 Porcine Rotavirus 18KPR03은, 기존에 알려져 있던 PRoV 바이러스주들인 9종의 G3 타입주, 8종의 G5 타입주, 2종의 G8 타입주, 3종의 G10 타입주 및 5종의 G11 타입주뿐만 아니라, 27종의 G9 타입주 및 24종의 G4 타입주와도 VP7 유전자 염기서열 상 유의적인 차이가 있는, 신규 바이러스주인 것을 확인하였다(도 2: 신규 바이러스주들인 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 PRoV 18KPR02 및 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 PRoV 18KPR03 위주로 표기하였음).

또한, PRoV VP4 유전자 염기서열 분석 결과에 따르면, PRoV 유전형 G9P[7] 타입주인 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 Porcine Rotavirus 18KPR02 및 PRoV 유전형 G4P[13] 타입주인 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 Porcine Rotavirus 18KPR03은, 기존에 알려져 있던 PRoV 바이러스주들인 7종의 P5 타입주, 19종의 P6 타입주, 2종의 P19 타입주, 14종의 P23 타입주, 4종의 P26 타입주 및 2종의 P27 타입주뿐만 아니라, 25종의 P7 타입주 및 8종의 P13 타입주와도 VP4 유전자 염기서열 상 유의적인 차이가 있는, 신규 바이러스주인 것을 확인하였다(도 3: 신규 바이러스주들인 KCTC18756P로 수탁(기탁)된 PRoV 18KPR02 및 KCTC18757P로 수탁(기탁)된 PRoV 18KPR03 위주로 표기하였음).

[실시예 2]: 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 신규 돼지로타바이러스 백신주의 고역가 함량 생산

[2-1]: 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주인 PEDV SGP-M1의 고역가 함량 생산

실시예 1에서 확립한 백신주인 PEDV SGP-M1가 Vero 세포 배양에서 백신 생산에 필요한 고역가의 바이러스를 효과적으로 생산할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1과 같은 방법으로 상기 백신주를 Vero 세포에 접종한 후 80계대수로 추가 연속계대배양(Continuously passage cultivation)하고 얻은 배양액을 접종 시료로서 Vero 세포에 접종한 후, PEDV 특이적 단클론항체를 처리하여 면역형광염색(Immunofluorescence assay, IFA)을 실시하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, PEDV SGP-M1을 접종한 대부분의 Vero 세포는 면역형광염색 시 형광(PEDV 항원에 대한 양성반응)을 나타내어 상기 백신주는 Vero 세포에서 추가 연속계대배양하더라도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다.

아울러, 상기 백신주를 Vero 세포에서 추가 연속계대배양하여 계대별로 수확한(harvest) 바이러스 배양액(supernatant)의 바이러스 역가를 Reed-Muench법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)에 단층으로 미리 배양한 숙주 세포인 Vero 세포를 1X PBS로 세척한 후, 바이러스 배양 배지(0.02% 효모 추출물, 0.3% TPB(Tryptose phosphate broth) 7.5% NaHCO₃ 및 10μg/mL 트립신을 함유하는 alpha-MEM)를 이용하여 바이러스 역가 측정을 하고자 하는 상기 백신주 배양액을 10진 희석하여 각 바이러스 역가별로 백신주 접종액을 준비하였고, 상기 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.1mL씩 백신주 접종액을 첨가하여 각 웰에 배양된 Vero 세포를 접종하였다. 상기 접종 후 접종액을 완전히 제거하고 새로운 바이러스 배양 배지를 각 웰에 0.1mL씩 첨가한 후, 37℃/5% CO₂ 습윤조건 하의 배양기에서 배양하면서 세포변성효과(CPE)를 관찰하여 최대 바이러스 희석 배수의 역수를 TCID₅₀(Tissue Culture Infective Dose 50%)로 하여 바이러스 역가를 산출하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, PEDV SGP-M1은 연속계대배양이 진행될수록 바이러스 역가가 크게 증가하였으며, 80계대수(P-80)에서 1 X 10^8.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내었다. 또, 그 이후 PEDV SGP-M1을 연속계대배양하여 80계대수를 초과하더라도 1 X 10^8.0TCID₅₀/mL 이상의 고역가로 바이러스가 생산되는 것을 확인하였다.

[2-2]: 신규 돼지로타바이러스 백신주인 PRoV 18KPR03 및 PRoV 18KPR02의 고역가 함량 생산

실시예 1에서 확립한 PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03 각각의 백신주가 TF-104 세포 배양에서 백신 생산에 필요한 고역가의 바이러스를 효과적으로 생산할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1과 같은 방법으로 각각의 백신주를 TF-104 세포에 접종한 후 30계대수로 추가 연속계대배양하고 얻은 배양액을 접종 시료로서 TF-104 세포에 접종한 후, PRoV 특이적 단클론항체를 처리하여 PLA(proximity ligation assays: DAB[3,3′-diaminobenzidine] 염색) 또는 면역형광염색(IFA)를 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 예로서 제시된 백신주인 PRoV 18KPR03을 접종한 대부분의 TF-104 세포는 면역형광염색 시 형광(PRoV 항원에 대한 양성반응)을 나타내어 상기 백신주는 TF-104 세포에서 추가 연속계대배양하더라도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다(PRoV 18KPR02도 유사한 증식능을 나타냄).

아울러, 상기 PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03 각각의 백신주를 TF-104 세포에서 연속계대배양하여 계대별로 수확한 바이러스 배양액의 바이러스 역가 측정을 위 [2-1]에서 기술된 방법과 동일한 Reed-Muench법을 이용하여 측정하였다(다만, 숙주 세포는 TF-104 세포를 사용함).

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03은 연속계대배양이 진행될수록 바이러스 역가가 크게 증가하였다. 즉, PRoV 18KPR02는 바이러스 역가가 25계대수(P-25)에서 1 X 10^8.0TCID₅₀/mL 이상이었으며, 25계대수를 초과하더라도 1 X 10^8.0TCID₅₀/mL 이상의 고역가로 바이러스가 생산되는 것을 확인하였다. 또, PRoV 18KPR03은 바이러스 역가가 29계대수(P-29)에서 1 X 10^7.0TCID₅₀/mL 이상이었으며, 29계대수를 초과하더라도 1 X 10^7.0TCID₅₀/mL 이상의 고역가로 바이러스가 생산되는 것을 확인하였다.

[실시예 3]: 불활성화된 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 불활성화된 신규 돼지로타바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물의 면역강화제의 배합에 따른 돼지에서의 면역원성 및 안정성 평가

본 발명에 따른 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03 각각의 불활성화된 백신주들을 준비하였다. 각각의 바이러스 백신주를 불활성화시키기 위해 불활성화 백신 제조에 일반적으로 쓰이는 BEI 처리법(BEI[Binary ethyleneimine] treatment method)으로 각 바이러스 종마다 적합한 BEI 처리농도와 처리시간으로 불활성화 처리된 백신주를 제조한 다음, 백신주의 불활성화 여부를 확인하기 위하여 불활성화 처리된 백신주를 숙주 세포(Vero 세포 또는 TF-104 세포)에 접종한 후 세포변성효과(CPE)의 유무를 FA 염색법(FA staining; fluorescent antibody staining)을 통해 확인하였다. 여기서, BEI는 2-BEA(2-Bromoethylamine Hydrobromide, Sigma-Aldrich, USA)를 0.2N NaOH 용액에 0.1M이 되도록 용해하여 37℃ 항온 수조에서 1시간 처리하여 0.1M BEI로 제조한 것이다(4℃ 보관).

먼저, PEDV SGP-M1의 경우, 1mM BEI 최종 처리농도에서 1) 37℃, 20hrs, 2) 실온, 48hrs의 처리 조건으로 불활성화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃, 20hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활성화되는 것을 Vero 세포 접종을 통해 확인하였다.

또, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03의 경우, 1mM BEI 최종 처리 농도에서 1) 37℃, 20hrs, 2) 실온, 48hrs의 처리 조건으로 불활성화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃ 20hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활성화되는 것을 TF-104 세포 접종을 통해 확인하였다.

아울러, 불활성화 처리된 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03 각각의 시료에 함유된 BEI의 중화를 위해서 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)를 첨가하여 37℃에서 약 1시간 동안 반응시킨 후에 불활성화/안정화 공정을 마무리하였다. 바이러스 백신주의 불활성화 여부의 확인은 불활성화 처리된 바이러스 백신주를 세포에 접종하여 3일간 배양 후 세포변성효과의 유무를 확인하거나, 항체반응을 통해 바이러스 백신주를 접종한 세포의 세포염색반응으로 바이러스 검출을 통해 바이러스 백신주의 활성(감염성) 여부를 확인하였다.

그 결과, 불활성화/안정화 공정을 마친 PEDV SGP-M1을 Vero 세포에 접종하고, 불활성화/안정화 공정을 마친 PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03을 TF-104 세포에 접종한 후 72시간 동안 배양하더라도 세포변성효과가 없는 것으로 나타나 불활성화 처리가 안정적으로 완료된 것을 확인하였다(데이터 미제시).

본 발명에 따른 백신 조성물로서, 상기 불활성화된 백신주들을 PEDV SGP-M1 : PRoV 18KPR02 : PRoV 18KPR03 = 10 : 1.0 : 1.0의 바이러스 역가(TCID₅₀/mL 기준)로 혼합한 바이러스 혼합물과 Montanide 01 gel, IMS1313 각각의 면역강화제를 바이러스 : 면역강화제 = 8 : 2(부피 기준)이 되도록 배합하여 준비한 백신 조성물을 PEDV 음성 및 PRoV 음성의 건강한 자돈 8두에 접종하였다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 실험 그룹 당 2주 간격으로 상기 백신 조성물을 2.0mL의 부피로 각각의 돼지 이근부에 2주 간격으로 총 2회 근육접종하고(1차 접종), 1차 접종 이후 2주 간격으로 총 4회 혈액을 채취하여 수집한 혈청의 중화시험으로 PEDV 중화항체가(neutralization antibody titer)를 측정하여 총 8주 동안의 PEDV 중화항체가 변화를 확인하였다.

실험 그룹	백신 조성물	돼지 두수	면역강화제	면역 유도 접종량: 백신주(TCID₅₀/dose)	접종경로(접종용량)	관찰기간
실험군 1	PEDV SGP-M1 + PRoV 18KPR02 + PRoV 18KPR03	3	Montanide 01 gel	PEDV SGP-M1(1.0 X 10⁷) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁶) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁶)	이근부(2ml)	56일
실험군 2	PEDV SGP-M1 + PRoV 18KPR02 + PRoV 18KPR03	3	IMS1313	PEDV SGP-M1(1.0 X 10⁷) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁶) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁶)	이근부(2ml)	56일
음성대조군	NC(negative control)	2	-	-	-	56일

그 결과, 도 9, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 백신 조성물에 의한 PEDV 및 PRoV에 대한 돼지의 중화항체가의 생성능은 면역강화제(IMS1313[IMS], Montanide 01 gel[Mon])의 종류와 상관없이 우수하게 나타났다. 아울러, 관찰기간 동안 설사 등의 병원성 증상이 나타나거나 접종부위의 발적, 부종 등의 이상 증상은 모든 실험 그룹의 돼지들에서 나타나지 않음을 확인하였다.

[실시예 4]: 불활성화된 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 불활성화된 신규 돼지로타바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물의 임신모돈에서의 바이러스 방어능 평가

[4-1]: 불활성화된 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 불활성화된 신규 돼지로타바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물의 임신모돈에서의 안전성 및 면역원성 평가

본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물 또는 상업백신(Commercial vaccine K+J: K vaccine[항-PRoV 백신] + J vaccine[항-PEDV 백신])을 임신모돈에 면역 유도용으로 높은 역가(High titer) 및 낮은 역가(Low titer)로 접종량을 달리하여 접종한 후, 임신모돈에서 태어난 자돈들에게 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03를 경구투여로 공격접종하여 실험 그룹별 자돈의 건강 상태(설사 여부 등)를 확인하였다(표 4 참조).

실험 그룹	백신 조성물	돼지	면역강화제	면역 유도 접종량: 백신주(TCID₅₀/dose)	접종경로(접종용량)	자돈 공격접종: 백신주(TCID₅₀/mL)
실험군 3(High titer)	PEDV SGP-M1 + PRoV 18KPR02 + PRoV 18KPR03	2	IMS1313	PEDV SGP-M1(1.0 X 10⁷) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁷) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁷)	이근부(2ml)	PEDV SGP-M1(1.0 X 10³) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁴) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁴)
실험군 4(Low titer)	PEDV SGP-M1 + PRoV 18KPR02 + PRoV 18KPR03	2	IMS1313	PEDV SGP-M1(1.0 X 10⁶) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁶) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁶)	이근부(2ml)	PEDV SGP-M1(1.0 X 10³) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁴) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁴)
비교군 1	Commercial vaccine(K+J vaccine)(상업백신 K+J)	1	-	-	이근부(2ml)	PEDV SGP-M1(1.0 X 10³) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁴) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁴)
음성대조군	Negative control	1	-	-	-	PEDV SGP-M1(1.0 X 10³) + PRoV 18KPR02(1.0 X 10⁴) + PRoV 18KPR03(1.0 X 10⁴)

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 백신 조성물을 접종량을 달리하여 접종한 실험군 3 및 실험군 4의 임신모돈으로부터 채취한 혈청의 PEDV SGP-M1에 대한 중화항체가는 상업백신(K+J vaccine)을 접종한 임신모돈인 비교군 1보다 현저하게 높게 형성되는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 불활화된 PEDV SGP-M1의 함량을 증가시켜 접종한 실험군 3은 이상 증상없이 실험군 4보다 임신모돈의 혈청 내 PEDV SGP-M1에 대한 중화항체가가 더욱 높게 형성되는 것을 확인하였다. 아울러, PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03를 경구투여로 공격접종한 실험 그룹별 자돈은 설사 등이 나타나지 않아 자돈의 건강 상태가 매우 양호한 것을 확인할 수 있었다.

또, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 백신 조성물을 접종량을 달리하여 접종한 실험군 3 및 실험군 4의 임신모돈으로부터 채취한 혈청의 PRoV(PRoV 18KPR02, PRoV 18KPR03)에 대한 중화항체가가 상업백신을 접종한 임신모돈인 비교군 1보다 높게 형성되는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 불활화된 PRoV(PRoV 18KPR02, PRoV 18KPR03)의 함량을 증가시켜 접종한 실험군 3은 이상 증상없이 실험군 4보다 임신모돈의 혈청 내 PRoV(PRoV 18KPR02, PRoV 18KPR03)에 대한 중화항체가가 더욱 높게 형성되는 것을 확인하였다.

한편, 임신모돈의 초유 내 존재하는 PEDV에 대한 알파형 단클론항체(IgA)는 야외형 PEDV 항원에 대한 장내 면역 방어 작용에 있어 중요한 요인으로, 임신모돈 뿐만 아니라 출산자돈의 면역력 강화에도 큰 영향을 끼친다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신 조성물의 방어능을 확인하는데 있어 하나의 중요 지표로 초유 내 PEDV에 대한 알파형 단클론항체의 양을 측정하였다.

구체적으로, 임신모돈의 출산 5주 전과 출산 2주 전에, 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물 또는 상업백신(K+J vaccine)을 임신모돈에 2회 접종하고, 임신모돈의 혈청 내 중화항체가와 초유 내 PEDV에 대한 항체 형성 유무를 IgA 값으로 측정하여 확인하였다. 또, 실험기간 중에 발생할 수 있는 병원 증상 및 이상 증상의 유무를 관찰하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 임신모유의 초유 내 존재하는 PEDV에 대한 알파형 단클론항체의 값이 음성대조군(Negative control)을 제외한 모든 실험 그룹에서 높게 유지되고 있음을 확인하였다.

아울러, 백신을 접종한 모든 실험 그룹의 임신모돈들에서 임신기간 중 설사 등의 병원성 증상이 나타나거나 접종 부위의 발적, 부종 등의 이상 증상은 없었다. 특히, 관찰기간 동안 유·사산 없이 모든 임신모돈들은 정상적으로 자돈을 출산하였으므로, 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물의 안전성을 확인하였다.

[4-2]: 불활성화된 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주 및 불활성화된 신규 돼지로타바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물의 포유자돈에서의 방어능 평가

본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 함유하는 백신 조성물을 임신모돈에 접종한 후, 태어난 5일령 포유자돈 중 건강한 개체를 선별하여 실험 그룹을 표 5와 같이 분류하고 야외형 PEDV 및 야외형 PRoV를 각각 1.0 X 10³TCID₅₀/mL로 공격접종하였다. 공경접종 이후 6일간 일별로 각 개체의 임상 증상(설사 등)의 유무, 체중 변화, 활동성 등을 지속적으로 확인하였고, 직장 내 분변 및 타액 샘플을 채취하였으며, 실험이 종료되는 시점에 부검하여 모든 실험 그룹의 포유자돈으로부터 가검물을 채취하였다. 실험기간 중 포유자돈에서 설사 증상이 발생한 경우, 육안으로 확인하여 설사 정도를 확인하였고, 설사 유발인자인 PEDV 및 PRoV의 유무 확인은 설사변에 배출되는 PEDV 항원 및 PRoV 항원의 유무로 확인하였다.

설사 정도의 확인은 0~3점의 설사 점수화(Diarrhea scoring)로 하였다. 여기서, 설사 점수 0점은 정상 분변(설사 부재)을 나타내고, 설사 점수 1점은 약한 정도의 설사 강도를 나타내며, 설사 점수 2점은 중간 정도의 설사 강도를 나타내고, 설사 점수 3점은 강한 정도의 설사 강도(수양성 설사)가 있음을 의미하였다.

설사 유발인자인 PEDV 및 PRoV의 유무 확인은, 먼저 수집한 포유자돈의 소장 조직(Duodenum, Jejunum, Ileum) 단편을 준비한 후 10% 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록으로 제작한 다음, 마이크로톰을 이용하여 상기 파라핀 블록을 5~8μm 두께로 자르고 슬라이드 상으로 옮긴 뒤 Xylene으로 탈파라핀하여 파라핀을 제거한 조직단편의 슬라이드를 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색법으로 염색한 후, 조직 검사를 통해 이루어졌다.

실험 그룹	백신 조성물[TCID₅₀/dose]	포유자돈 두수	접종경로(용량)	관찰기간
실험군 5 (High titer)	PEDV(PEDV SGP-M1)[1.0 X 10⁷] + PRoV(PRoV 18KPR02[1.0 X 10⁷]/ PRoV 18KPR03[1.0 X 10⁷])	10	Oral(3mL)	6일
실험군6 (Low titer)	PEDV(PEDV SGP-M1)[1.0 X 10⁶] + PRoV(PRoV 18KPR02[1.0 X 10⁶]/ PRoV 18KPR03[1.0 X 10⁶])	10	Oral (3mL)	6일
비교군 2	Commercial vaccine(K+J)(상업백신 K+J)	5	Oral(3mL)	6일
음성대조군	Negative Control(백신 비접종군)	3	-	6일

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 고역가 함량(High titer)의 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 함유하는 백신 조성물을 접종한 실험군 5에서 태어난 포유자돈들은 실험기간 동안 공격접종에 의한 설사증상을 나타내지 않았고, 정상 분변을 배출하였다.

저역가 함량(Low titer)의 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 함유하는 백신 조성물을 접종한 실험군 6에서 태어난 포유자돈들에 공격접종 후 48시간 경과 시 +1 이상의 설사 점수를 나타내는 포유자돈이 존재하였으나, 이후 설사 증상이 호전되는 양상을 보였다. 상업백신을 접종한 비교군 2에서 태어난 포유자돈들에 공격접종 후 48시간 경과 시 +1 이상의 설사 점수를 나타내는 포유자돈이 2두 존재하였으며, 이들 2두 중 1두는 실험기간 종료 전까지 지속적으로 설사 증상을 보였다. 음성대조군(Negative Control, 백신 비처리군)의 포유자돈들은 공격접종 후 24시간 경과 시 +2 이상의 설사 점수를 모든 포유자돈들이 나타내었고, 실험종료까지 설사 증상이 지속되었다.

한편, 본 발명에 따른 백신 조성물을 접종한 포유자돈들의 체중 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 함유하는 백신 조성물 및 상업백신을 접종한 포유자돈들은 실험 종료 시까지 체중이 꾸준히 증가하는 양상을 보였다. 반면, 음성대조군(Negative Control)의 포유자돈들은 실험종료 시까지 중등도 이상의 설사로 인해 체중이 지속하여 감소(-23%)하였다.

실험기간 종료 후, 모든 실험 그룹의 포유자돈들로부터 수집한 혈액(혈청) 및 소장 시료에 대한 중화항체가 및 조직검사 소견에 대해 분석하여, 바이러스 공격접종에 대한 본 발명에 따른 백신 조성물의 방어능을 평가하였다.

각 실험 그룹의 포유자돈들로부터 확보한 소장(십이지장, 공장, 회장) 시료들에 대한 H&E 염색 결과, 음성대조군의 포유자돈들의 소장 시료는 소장 전 영역에 걸쳐 소장 융모 및 상피 세포가 탈락되거나 소실되고 소장의 길이 또한 짧아진 것을 확인할 수 있었다. 이에 비해 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물을 접종한 실험군 5 및 실험군 6의 포유자돈들의 소장 시료는 소장 전반에 걸쳐 융모 및 장 상피 세포에서 모두 정상 소견을 보였다.

아울러, 각 실험 그룹의 포유자돈들로부터 확보한 혈액 시료에 대해 공격접종 바이러스인 PEDV(SGP-M1) 및 PRoV(PRoV 18KPR02/PRoV 18KPR03)에 대한 중화항체가를 확인하였다.

그 결과, 도 18, 도 19 및 도 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물을 접종한 실험군 5 및 실험군 6은 높은 중화항체 형성능으로 인해 우수한 면역원성이 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 포함하는 백신 조성물을 접종한 실험군 5(고역가 함량(High titer) 접종군) 및 실험군 6(저역가 함량(High titer) 접종군)은 비교군 2(상업백신(Commerical vaccine) 접종군)보다 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03에 대한 중화항체 형성능이 우수하였다(SPSS 소프트웨어를 통한 통계적 유의성 검정 결과, 실험군 vs. 비교군의 중화항체가 평균값이 유의한 차이를 나타내었음(P<0.05)).

종합하면, 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV SGP-M1, 불활성화된 PRoV 18KPR02 및 불활성화된 PRoV 18KPR03을 함유하는 백신 조성물은 돼지, 특히 임신모돈 및 자돈(포유자돈 등)에서 PEDV 및 PRoV의 공격접종에 대한 충분한 방어능이 있음을 확인하였다. 특히, 상기 백신 조성물에 포함된 PEDV SGP-M1, PRoV 18KPR02 및 PRoV 18KPR03을 고역가 함량으로 불활화하여 돼지 접종에 사용할 경우, 면역원성 및 안정성의 측면에서 기존 상업백신보다 우수함을 확인할 수 있었다.

통계처리

통계분석은 두 그룹 간 유의성 검사로 t-test 검정법을 이용하였고, 음성대조군(또는 비교군)과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001인 경우 유효한 차이로 간주하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14056BP

20191203

한국생명공학연구원

KCTC18756P

20181214

한국생명공학연구원

KCTC18757P

20181214

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Vaccine Composition Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Rotavirus <130> YPD202008-0010 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike Gene of Porcine Epidemic Diarrhea virus SGP-M1(KCTC14056BP) <400> 1 atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60 caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180 gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240 tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300 gactctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acgataacac taatgctact 360 gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420 gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480 catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540 tattattttt attttaaaaa 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ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440 gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500 tttgttactc tgccatcatt taatgatcat ttttttgtta acattactgt atctgcttcc 1560 tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620 tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680 tatggttatg tgtctatatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740 gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800 atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860 caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac catttgaagg tgtcacggac 1920 gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980 ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattacac atctgagtct 2040 ggacagttgt tagcctttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100 tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160 tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220 ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280 agtattggct acgtcccatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccat ggttactggg 2340 aatattagta ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400 aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460 caattactca cccagtacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520 gctaggcttg agtctgttga agttaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580 ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640 tctgtgtatg atcctgcacg tggcagggtg gtacaaaaaa ggtctgttat tgaagacctg 2700 ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760 tctaatggtc gttctgtggc agatctagtc tgtgcacagt attactctgg tgtcatggta 2820 ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880 atggtgctag gaggttttac ttctgcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagct 2940 agactcaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000 gagtctttta actctgctat tggtaatata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060 attagtcaaa cttccagggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120 gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180 caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactctcgac tggacattct ttcagccgat 3240 gttcaggttg accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300 accctcacta agtatactga ggttcaggct agcaggaagt tagcacagca aaaggttaat 3360 gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420 ttctctctgg tacaggcagc acctcagggc ctgctgtttt tacatacagt acttgtaccg 3480 agtgattttg tagatgttat tgccatcgct ggcttatgcg ttaacggtga aattgccttg 3540 actctacgtg agcctggctt agtcttgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600 gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660 gttcaaattg agagttgtgt ggtcacctat gtcaatttga ctagagacca actaccagat 3720 gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattttagc ttctctgccc 3780 aatagaactg gtccaagtct tcctttagat gtttttaatg ccacttatct taatctcact 3840 ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatattac agaggagctc 3900 caaagtctta tatataatat caacaacaca 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gtggtagaat atatacatat aatggaacca 540 cgccaaatgc aacaacaggt tactattcaa ctactaatta tgacacagta aatatgacat 600 cattttgtga cttttacata ataccaagaa accaagaaga aaaatgtact gagtatatta 660 atcatggatt acctcccata caaaatacga ggaatgttgt accagtatca ttatcggcta 720 gagaaatagt gcacacaaga gctcaagtta acgaagatat tgttgtttca aaaacttcac 780 tctggaaaga aatgcaatac aatagagaca taaccataag attcaaattt gacagaacga 840 ttattaaagc tggaggat 858 <210> 3 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7 Gene of Porcine Rotavirus 18KPR02(KCTC18756P) <400> 3 atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acctttctga tatcaataat tttattgaac 60 tatatattaa aatcactaac tagtgcgatg gactttataa tctacagatt tcttttactt 120 attgttattg tatcaccatt tgttaaaaca caaaattatg gaattaattt accaattact 180 ggctccatgg atacagcata tgccaattcg tcacagcagg agacgttctt aacttcaacg 240 ttatgcttat attatcctac agaagcatca actcagattg gagacaccga atggaagaac 300 actctgtctc aattattctt gactaagggg tggccaactg gatcagttta ttttaaagaa 360 tatactgaca tcgcttcatt ctcaattgat ccacaacttt 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taatccacca atagagtatt ggacattatt 240 cgctcctaat gataaaggtg tagtagctga attgacaaac aatacggaca tatggttagt 300 gattatattg attgaaccaa atgtacctcg agaatcaaga acgtacacta tatttggtca 360 acaagtaaat ctagtggttg agaacacatc acaaacaaaa tggaagtttg ctgactttag 420 tagaggaagt caaaatggta gttacatgtc taatgataca cttttaacag atactaaact 480 gcaagctgca atgaaatatg gggcaagact atttacgttt accggaaata caccgaatgc 540 agcaccacag gactacggat atgcaaccaa caattacagc gcgattaaaa tacaatcatt 600 ttgtgatttt tacatagtgc cacgcatgcc acgagaggtg tgtagaaatt atattaatca 660 tggtcttcca ccaatgcaaa atactagaaa cgtagtatca gttgcattat cagctaggga 720 aacggtaaca caacgagcaa gtgttaatga agatattgtt gtgtccaaaa cttcattatg 780 gaaagaaatg caatataata gagacatcat aattagattt aaatttgcta atcaaataat 840 caaatctgga ggattaggtt ataaatggtc cg 872 <210> 5 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7 Gene of Porcine Rotavirus 18KPR03(KCTC18757P) <400> 5 atgtatggta ttgaatatac cacagttcta ttttatttga tatctttcgt tcttatgagt 60 catattctga aaactataac aaaagtaatg gactatttaa tttatagaat aacgtttata 120 attgttgtat tgtcagcatt atccaatgca caaaattatg gaataaattt gccaatcact 180 ggatctatgg atacagccta tgctaattca acgcagaatg aaaatttctt gtcatcaact 240 ctatgtttgt actatcctac tgaagcccga acgcagataa gtgatgatga atggaaggat 300 acactatcac aattgtttct aactaaagga tggccaacag gctcagttta ttttaacgag 360 tattcaaatg ttttagaatt ctccgtcgat ccaaagttat attgtgatta taatgtcgta 420 ttaattagat ttgcttcagg ggaagaatta gatatatctg aactggctga tctaatatta 480 aatgagtggt tatgtaatcc aattgacatc acgctgtatt actatcaaca aacaggagag 540 gcaaacaaat ggatatcaat gggatcatca tgtactgtta aagtgtgtcc attaaatacg 600 caaactttag gagttggatg tcaaactacg aataaaaaca cctttgaaac agtggctgaa 660 aatgagaaat tggctatagt tgacgttgtc gatggtgtga atcataaatt agatattgca 720 tctacaacat gtacgatacg aaactgtaat aaactgggac caagagagaa tgtagctata 780 atacaggttg gtggttctaa catactcgat ataacagctg atcctacaac ttctccacaa 840 acggaacgaa tgatgcgtgt aaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tacagtagtt 900 gattacatta atcagatagt gcaaacaatg tccaaa 936 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike_Forward primer <400> 6 actctggtgt catggtac 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike_Reverse primer <400> 7 attgcgcctc aaagaagacg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7_Forward primer <400> 8 gcggttagct ccttttaatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7_Reverse primer <400> 9 aatgaccgtg atcttttgga 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP4_Forward primer <400> 10 gcttcgctca tttatagaca a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP4_Reverse primer <400> 11 cgcaccattt ataacctaat c 21

Claims

수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주의 불활성화된 바이러스, 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주의 불활성화된 바이러스 및 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 불활성화된 바이러스로 이루어진 바이러스 복합물을 유효성분으로 포함하는, 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 IMS1313, 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel) 및 카보폴(Cabopol)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 상기 바이러스 복합물과 어쥬번트를 부피 기준으로, 5~9 : 1~5로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주, 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주 및 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 각각을 불활성화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 각각의 불활성화된 바이러스는 원숭이 신장세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제4항에 있어서,
상기 불활성화 처리는 상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주, 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주 및 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 각각에 BEI(Binary ethyleneimine)을 처리하는 것이고,
상기 중화화 처리는 상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주, 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주 및 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주 각각에 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 처리하는 것임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 돼지의 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대 배양 후, 1x10^4.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내고,
상기 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대 배양 후, 1x10^4.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내며,
상기 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 Vero 세포에서 연속계대 배양 후, 1x10^5.0TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주는 돼지로타바이러스 유전형 G9P[7] 타입주에 속하고,
상기 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주는 돼지로타바이러스 유전형 G4P[13] 타입주에 속하며,
상기 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주는 돼지유행성설사병바이러스 유전형 G2b 타입주에 속하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수탁번호 KCTC18756P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주의 VP4 유전자의 염기서열은 서열번호 2로 표기되며, VP7 유전자의 염기서열은 서열번호 3으로 표기되고,
상기 수탁번호 KCTC18757P로 수탁된 돼지로타바이러스 백신주의 VP4 유전자의 염기서열은 서열번호 4로 표기되며, VP7 유전자의 염기서열은 서열번호 5로 표기되고,
상기 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 스파이크 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표기되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 돼지는 숫돼지, 암돼지, 수자돈, 암자돈, 임신돼지, 수유 중인 돼지 및 임신돼지의 태아로 구성되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 임신 후기의 모돈에게 투여하는 단계; 및 상기 모돈으로부터 출산된 자돈에게 상기 모돈의 초유를 수유하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지로타바이러스 및 돼지유행성설사병바이러스 감염증에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 자돈은 3일령 내지 11주령의 돼지인 것을 특징으로 하는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 임신 후기는 자돈의 출산 2주전 내지 9주전인 것을 특징으로 하는, 방법.