CN114854697A - 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪轮状病毒G4‑G5‑G9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途，本发明采用当前PoRV流行的3种基因型毒株作为种毒，通过BEI灭活，与佐剂ISA201VG乳化后制备成PoRV三价灭活疫苗。本研究制备的三价灭活疫苗具有免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠的的特点，能够用于PoRV疫情爆发时紧急预防接种。

Description

一种猪轮状病毒G4-G5-G9型三价灭活疫苗及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一种猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途。
背景技术
猪轮状病毒(Rotaviruse，RV)为没有囊膜的双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。会引起仔猪以呕吐、厌食、脱水、腹泻和酸碱平衡紊乱为主要症状的疾病。小于4周龄仔猪的发病率可以达到或超过80％，其中可造成7％-20％的死亡率。
轮状病毒现已鉴定出11中蛋白，分别为内衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3和VP6)、外衣壳蛋白(VP7和VP4)和非结构蛋白(NSP1、NSP2、NS34、NS35和NS28)。轮状病毒具有不同的血清群和血清型，根据VP6分为7个抗原性存在差异的血清群(型)(A-G)及两个亚群(Ⅰ和Ⅱ)；A亚群轮状病毒是引起人类和动物胃肠道疾病的主要病原，其病毒粒子表面共有三种抗原，分别为群抗原、中和抗原和血凝素抗原。VP6蛋白是群抗原，VP7蛋白是中和抗原，VP4蛋白是血凝素抗原。依据VP4的不同可将PoRV分为不同的P型；依据VP7的不同可将轮状病毒分为不同的G型。目前存在27和G血清型和37个P血清型，不同血清型之间的交叉反应性较差。因此确定病毒的G型和P型是非常重要的。
为了解我国猪轮状病毒(PoRV)在猪群中的流行情况，本公司采用RT-PCR和抗原快速检测试纸条对2016～2020年间收集的684份疑似腹泻发病的仔猪粪便或仔猪肠组织进行PoRV病原学检测。病原学检测结果显示，2016～2020年每年PoRV的阳性率分别为13.17％、14.38％、15.31％、15.91％和19.69％，呈缓慢升高的趋势。随机选取不同年份50份强阳性病料进行PoRVVP7基因测序和BLAST序列比对。结果显示近年来PoRV在我国猪场有G9型(27/50，54％)、G5型(14/50，28％)、G4型(7/50，14％)和G1型(2/50，4％)。显示G9基因型可能已经代替G5基因型，成为中国乃至亚洲最新流行的毒株。
作为重要病原之一，猪轮状病毒在全世界各、个养猪国家引起了仔猪病毒性腹泻。由猪轮状病毒所引起的病毒性感染无论是单独感染或者交叉感染在猪群中均普遍存在，由此造成仔猪的患病甚至死亡给猪养殖业造成了巨大的经济损失。而目前没有效果显著的药物用来治疗由猪轮状病毒感染引起的疾病，因此做好对猪轮状病毒感染的预防尤为重要，而接种疫苗能有效防控该疾病的爆发。目前，国内临床应用最广泛的是中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株病毒+NX株)。该疫苗使用猪轮状病毒G5型，而我国目前G9型才是主要流行毒株，G4型的阳性率也在上升，因此研制猪轮状病毒多价疫苗，才能对多种血清型产生保护作用。
发明内容
针对目前市场上缺少免疫效果好、安全可靠的猪轮状病毒灭活疫苗，本发明的目的在于提供一种猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出免疫保护率高、产量高、稳定性好、成本低、安全可靠的疫苗。
本发明的构思是采用当前PoRV流行的3种基因型毒株作为种毒，通过BEI灭活，与佐剂ISA201 VG乳化后制备成PoRV三价灭活疫苗。本研究制备的三价灭活疫苗具有免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠的的特点，能够用于PoRV疫情爆发时紧急预防接种。
本发明的目的在于提供一种猪轮状病毒G4型毒株：一株猪轮状病毒KQ06株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202222，该KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示。
一株猪轮状病毒HN01株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202221，该HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01株的VP7基因序列如SEQ IDNO：5所示。
上述的CH09株、KQ06株和HN01株均与P[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于P[23]基因型。
上述的猪轮状病毒KQ06株在制备猪轮状病毒疫苗中的应用，所述疫苗选自灭活疫苗。
上述的猪轮状病毒HN01株在制备猪轮状病毒疫苗中的应用，所述疫苗选自灭活疫苗。
本发明的目的在于提供一种组合物，包含所述的猪轮状病毒KQ06株，所述的猪轮状病毒HN01株，保藏号为CCTCC NO：V202191的猪轮状病毒CH09株，以及药学上可接受的载体。
进一步的，猪轮状病毒G4-G5-G9型三价灭活疫苗，所述三价灭活疫苗是将所述的猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，经纯化、灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。
本发明的目的在于提供一种猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将所述的猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，经纯化、灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到所述的三价灭活疫苗。
优选的，所述易感细胞为PK-15细胞，培养条件为：悬浮型PK-15细胞培养72小时，细胞密度达到6.0～6.5×106个/ml且细胞活率为95％以上时，以0.5MOI的接毒剂量接种细胞密度为2.0×106个/ml的悬浮型PK-15细胞，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，培养24小时收获病毒液；
收获的猪轮状病毒KQ06株、HN01株、CH09株的病毒液滴度不低于109.0TCID50/ml。
优选的，所述的纯化包括以下步骤：猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株离心后上清分别首先经0.45μm滤膜过滤澄清，经过PBS洗滤后收获澄清液，再通过Q Focurose 6FF进行层析纯化。
进一步的，纯化前收获的猪轮状病毒KQ06株、HN01株、CH09株的病毒液滴度不低于108.0TCID50/ml。
优选的，灭活时选用的灭活剂为0.005mol/L的BEI，灭活工艺为：纯化抗原中加入0.5mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，混合均匀置37℃灭活24小时，后加入过滤除菌的1.0mol/L Na2S2O3溶液至终浓度0.005mol/L终止灭活，充分混合均匀后置2～8℃保存。
优选的，所述佐剂为ISA201 VG佐剂，灭活后步骤包括：将灭活后的猪轮状病毒含液分别用PBS稀释至配苗浓度，再按体积比为1∶1:1混合均匀，预热至32℃，作为水相，将ISA201VG佐剂预热至32℃，作为油相，按水相∶油相＝1∶1的体积比例，将水相缓慢加至ISA201 VG佐剂中，100～120r/min乳化60分钟，定量分装，加盖密封，置2～8℃保存，配苗浓度：病毒含量为108.0TCID50/ml。
本发明的有益效果为：
1.本发明选用当前流行的基因型毒株来制备疫苗，保证了疫苗种毒的优势；
2.本发明所制备的PoRV三价灭活疫苗稳定性好，经克隆纯化后保持了病毒的纯净性和稳定性。
3.本发明所制备的PoRV三价灭活疫苗安全性高，免疫原性好，三株疫苗毒对机体抗体的产生具有协同效应，G4\G5\G9型三价灭活疫苗产生的中和抗体显著高于单价灭活疫苗；
4、本发明采用纯悬浮技术工艺，所生产的病毒毒价更高，操作更方便。
本发明将为临床上针对猪轮状病毒病的防控以及猪轮状病毒在猪群中的清除提供物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为10株分离毒株在MA104病变图；
图2为10株分离毒株RT-PCR鉴定结果；
图3为不同毒种CSFV荧光检测结果图；
图4为不同毒种BVDV荧光检测结果图；
图5为不同毒种PPV荧光检测结果图；
图6为猪轮状病毒克隆毒株间接免疫荧光鉴定结果图；
图7为克隆毒株电镜鉴定结果图(25000倍)；
图8为三株分离毒株VP7基因核苷酸进化树分析结果图；
图9为三株分离毒株VP4基因核苷酸进化树分析结果图；
图10为猪轮状病毒抗原两步纯化工艺检测结果图(点样5μl/孔)；
图11为灭活后抗原电镜负染观察结果图(50000倍)；
图12为试制疫苗免疫攻毒后的临床和解剖观察图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例中采用的仪器、试剂等，如无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂，可通过商业途径获得。
实施例1猪轮状病毒的分离鉴定、克隆纯化与生物学特性研究
1.1病毒的分离鉴定
病料来源于我国规模化猪场具有腹泻临床症状发病猪的小肠，取阳性小肠组织，用剪刀剪碎，加入10.0ml的PBS，用组织研磨器或研钵研磨后转移到15ml离心管中，-70℃以下反复冻融3次，取4个1.5ml的离心管，每个离心管中加1.0ml小肠组织液，以12000r/min离心5分钟，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后接种已长成单层的MA104细胞(接种前倒掉细胞培养液，用无血清DMEM培养基洗3次)，37℃吸附1小时，吸弃接种物，补加5ml的细胞维持液，继续培养，每日观察，如出现细胞病变及时收毒；如无细胞病变出现，培养72小时收获，并继续盲传，盲传3代后仍无病变者弃去。
结果有10份样品在盲传第1代出现病变，主要表现为细胞固缩、破碎，最后细胞崩解脱落(图1)。收取病变的上清液继续在长成单层的MA104细胞上进行传代，均出现细胞病变，能够稳定传代。提取F5代RNA作为模板，利用特异性引物进行RT-PCR(PoRV-VP7-F/R)扩增(如表1和表2，及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)，获得特异性片段后进行VP7基因的测序分析，结果显示，10份样品均为猪轮状病毒(图2)，测序结果显示其中有5份为PoRV G9型，3份为PoRV G5型，2份为PoRV G4型。将10株分离毒株在MA104上进行连续传代，测定10株分离毒株F3-F5代的TCID50，结果如表3所示，将每个基因型选取病毒滴度最高的一株进行克隆纯化。
表1 猪轮状病毒的分型引物
Figure BDA0003588254980000041
表2 RT-PCR反应体系及反应程序
Figure BDA0003588254980000042
表3 10株分离毒株在MA104细胞上的增殖滴度(TCID50/ml)
Figure BDA0003588254980000043
1.2病毒的克隆纯化
为了获得增殖滴度高、纯粹性好的病毒，分别选取三种基因型中病毒滴度最高的一株病毒进行了克隆纯化。用含5μg/ml胰酶的无血清DMEM将分离的PoRV按照10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀释，取500μL的病毒液接种MA104细胞(接种前用PBS洗2次)已长成单层的6孔细胞培养板，于37℃5％CO2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用PBS洗2次，覆盖含5μg/ml胰酶、0.8％低熔点琼脂糖的无酚红DMEM，于37℃5％CO2培养箱中继续培养2d～3d，在显微镜下看到明显的空斑出现后，用0.1‰的中性红于37℃染色1h，吸弃染色液，挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接种MA104细胞(接种前用PBS洗2次)已长成单层的24孔细胞培养板，于37℃5％CO2培养箱吸附1h后补加0.8ml含5μg/ml胰酶的无血清DMEM，于37℃5％CO2培养箱中培养至完全发生病变后，收集病变的细胞培养物，冻融3次后，测定各克隆毒的TCID50，选择毒价高的克隆如上再纯化2次。
在第一轮空斑纯化时每个毒株挑取了10个克隆，接种24孔板培养的细胞后选取病变典型的克隆毒测定了TCID50，挑取TCID50高的克隆毒再进行下一轮空斑纯化，如此共纯化3次。选取第三轮空斑纯化毒株中毒价最高的克隆毒(将其记为第一代毒，F1代)在MA104细胞上进行传代。将三株克隆毒分别命名为G9-CH09、G5-KQ06、G4-HN01，一直传到F20代，并测定F1、F5、F10、F15和F20代病毒的含量，结果三株病毒随着传代次数的增加毒价升高明显，到F10代均不低于108.5TCID50/ml，说明在MA104细胞上的增殖能力强(表4)。
表4 3株克隆毒MA104细胞上的增殖滴度(TCID50/ml)
Figure BDA0003588254980000051
将分离的猪轮状病毒G9-CH09株在2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猪轮状病毒PoRV CH09株，保藏编号为CCTCC NO：V202191，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
将分离的猪轮状病毒G5-KQ06株在2022年3月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猪轮状病毒PoRV KQ06株，保藏编号为CCTCC NO：V202222，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
将分离的猪轮状病毒G4-HN01株在2022年3月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猪轮状病毒PoRV HN01株，保藏编号为CCTCC NO：V202221，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
1.3 克隆毒的检验
1.3.1 克隆毒的纯净性检验
1.3.1.1 无菌及支原体检验结果
取三株克隆毒的F5、F10、F15、F20代毒种，按现行《中国兽药典》附录分别进行无菌及支原体检验，结果如表5、表6所示，各代次毒种均无菌生长，支原体检测亦均为阴性。
表5 不同代次三株克隆毒种无菌检验结果统计
Figure BDA0003588254980000052
Figure BDA0003588254980000061
注：“－”表示无菌生长。
表6 不同代次猪轮状病毒G9-CH09株、G5-KQ06株和G4-HN01株毒种支原体检验结果统计
Figure BDA0003588254980000062
注：“—”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
3.3.1.2 外源病毒致细胞病变试验和红细胞吸附试验结果
将三株克隆毒的F5、F10、F15、F20代毒种，分别进行致细胞病变试验和红细胞吸附试验，检验结果如表6所示，均为阴性。表明各代次毒种无致细胞病变外源病毒污染，无红细胞吸附外源病毒污染。
表7 不同代次PEDV HB17株毒种致细胞病变试验和红细胞吸附试验结果统计
Figure BDA0003588254980000063
Figure BDA0003588254980000071
注：“－”表示检测结果阴性。
3.3.1.3 荧光抗体检测结果
将三株克隆毒的F10代毒种进行荧光抗体检查。检测结果显示，G9-CH09株、G5-KQ06株和G4-HN01株毒种均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒外源病毒污染(图3、图4和图5)。
1.3.2克隆毒的间接免疫荧光检测
将MA104细胞接种于24孔板内，待细胞长成单层弃去培养液，用含5μg/ml的无血清DMEM洗两遍，每孔接300μl G9-CH09株、G5-KQ06株和G4-HN01株克隆毒的F10代病毒液，同时设细胞对照，置于37℃二氧化碳细胞培养箱孵育1h，弃病毒液，然后加1ml/孔含5μg/ml的无血清DMEM；24h后弃去培养液，用PBS洗一遍，然后加入冰冷的无水乙醇，-20℃固定30min；弃固定液，PBS洗三遍，加入5％BSA 37℃封闭1h；弃封闭液加入PoRV-VP6蛋白单克隆抗体37℃孵育1h；弃一抗，PBS洗三遍，加入Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h；弃二抗，PBS洗三遍，加入PBS在荧光显微镜下观察。结果可见三株克隆毒均出现绿色的特异荧光，MA104细胞对照孔内未见荧光，背景干净，结果表明所分离的病毒为PoRV(图6)。
1.3.3克隆毒的电镜检测
取1L病毒悬液，10000r/min，离心10min，取上清，30000r/min超速离心2h；弃上清，用4ml PBS重悬沉淀；经不同蔗糖密度梯度离心后，选取30％～40％蔗糖层脱糖后，用200μlPBS重悬，吸取25μl滴于铜网上，做负染色，置于透射电镜下观察。如图7结果显示3株克隆毒株的病毒粒子直径约为70～120nm，四周有明显的呈放射状的棒状突起。
1.43株克隆毒的生物学特性分析
提取G9-CH09株、G5-KQ06株和G4-HN01株的基因组，分别利用VP7和VP4引物，扩增VP7和VP4基因全长，并进行测序；G9型CH09株的VP4基因序列如SEQ ID NO：2所示，CH09株的VP7基因序列如SEQ ID NO：1所示；G5型KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示；G4型HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。
用DNAStar和MEGA7.0分析国内外多株不同地方PoRV分离株VP7和VP4基因并制作其遗传进化树(图8和图9)。VP7基因核苷酸进化树结果显示，CH09株处于G9基因型分支，KQ06株处于G5基因型分支，HN01株处于G4基因型分支；VP4基因核苷酸进化树结果显示，CH09株、KQ06株和HN01株均与P[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于P[23]基因型。
实施例2猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗的制备及检验
一种猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1猪轮状病毒(G9-CH09、G5-KQ06和G4-HN01株)病毒液在PK-15细胞上的培养工艺
为便于猪轮状病毒的工业化生产，通过对悬浮型PK-15细胞在摇瓶上传代密度与摇床转速的摸索，确定了悬浮型PK-15细胞在摇瓶的培养工艺为：以1.0×106个/ml的初始密度进行稀释传代，在37℃、130r/min、5％CO2水平摇床中培养72小时后，细胞密度可达6.0～6.5×106个/ml且细胞活率为95％以上时；此外，通过摸索猪轮状病毒在摇瓶中接毒时细胞密度、胰酶浓度、接毒量、收毒时间等工艺条件，确定了猪轮状病毒在摇瓶中增殖的最佳工艺条件为：悬浮型PK-15细胞培养72小时，细胞密度达到6.0～6.5×106个/ml后，以0.5MOI的接毒剂量接种细胞密度为2.0×106个/ml的悬浮型PK-15细胞，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，培养24小时收获病毒液。本实施例中，用于悬浮培养PK-15细胞的培养基(PK无血清培养基)购自浙江壹生科生物科技有限公司，货号ZJ02F1170。
2 PK-15细胞悬浮培养病毒液与MA104贴壁培养病毒液的对比
按上述PK-15细胞培养条件，取在MA104上扩增繁殖的F1代PoRV在悬浮型PK-15细胞上进行连续传代。分别测定用MA104细胞和PK-15细胞扩增繁殖的F1-F20代病毒的病毒滴度。结果显示，三株PoRV在悬浮型PK-15细胞贴壁型MA104细胞上的病毒滴度明显比在贴壁型MA104细胞上的病毒滴度高，因此选用悬浮型PK-15细胞进行PoRV的扩增繁殖不仅能保证较高的病毒滴度，还能利用发酵罐进行大规模的生产，达到生产效益最大化。
表8 3株克隆毒F1-F20的增殖滴度(TCID50/ml)
Figure BDA0003588254980000081
Figure BDA0003588254980000091
3 猪轮状病毒抗原纯化工艺的研究
30L猪轮状病毒G9-CH09株离心后上清首先经0.45μm滤膜过滤澄清，经过10L PBS洗滤后收获38L澄清液。再通过Q Focurose 6FF进行层析纯化，经2步纯化后得到浓缩10倍的纯化病毒液3L。如图10纯化过程中分别取样检测蛋白浓度以及病毒效价。
表9 猪轮状病毒KQ06株抗原两步纯化方案检测结果
Figure BDA0003588254980000092
从表9结果可以得知，猪轮状病毒G9-CH09抗原经0.45μm中空纤维澄清后，病毒效价由108.5TCID50/ml降至108.1TCID50/ml，病毒回收率为96.47％，杂蛋白去除率28.22％；经离子交换层析纯化后病毒效价为108.59TCID50/ml，恢复至原体积的病毒效价为107.67TCID50/ml，病毒回收率为90.24％，杂蛋白去除率91.9％。
4猪轮状病毒抗原灭活工艺的研究
选取甲醛和BEI两种灭活剂对PoRV G9-CH09株纯化抗原进行灭活试验。通过3个不同终浓度的甲醛对病毒液进行4个不同时间的灭活来筛选合适的灭活条件。将40％的甲醛溶液缓慢加入到纯化抗原中，使甲醛溶液终浓度分别为0.1％、0.3％和0.4％，充分混匀，置37℃分别于灭活后12、18、24和30小时结束灭活并分别取样，经无菌检验合格后灭活检验，检验结果如表10所示。此外，通过3个不同终浓度的BEI对病毒液进行4个不同时间的灭活来筛选合适的灭活条件。取1mol/L的BEA和1.0mol/L的NaOH等体积混合，置37℃下水浴，每隔10分钟振摇1次，1小时后终止环化，即为0.5mol/L的BEI(二乙烯亚胺)。向纯化抗原中加入浓度为0.5mol/L的BEI至终浓度为0.00125mol/L、0.0025mol/L和0.005mol/L，混合均匀置37℃，分别于灭活后18、24、30、36小时后加入过滤除菌的1.0mol/L Na2S2O3溶液终止灭活(终浓度为5mmol/L)，并分别取样，经无菌检验合格后进行灭活检验，检验结果如表11所示。终浓度为0.1％甲醛溶液37℃灭活30小时、0.3％甲醛溶液37℃灭活24小时或终浓度为0.4％甲醛溶液37℃灭活18小时，终浓度为0.0025mol/L BEI 37℃灭活36小时或终浓度为0.005mol/L BEI 37℃灭活24小时，均可将PoRV G9-CH09株纯化抗原液完全灭活。
表10 不同浓度不同时间甲醛灭活猪轮状病毒G9-CH09株抗原检验结果
Figure BDA0003588254980000093
Figure BDA0003588254980000101
表11 不同浓度不同时间BEI灭活猪轮状病毒G9-CH09株纯化抗原检验结果
Figure BDA0003588254980000102
采用蔗糖密度梯度离心的方法对终浓度为0.4％甲醛溶液37℃灭活18小时的抗原和终浓度为0.005mol/L BEI 37℃灭活24小时的抗原，分别进行超速离心纯化，负染后进行电镜观察。电镜结果显示，纯化抗原经甲醛溶液或BEI灭活剂灭活后，均可在电镜下找到成熟完整的猪轮状病毒粒子，直径约70～75nm，四周有呈放射状排列的棒状突起(VP4蛋白)，病毒粒子形状似车轮状。两种灭活剂灭活后的抗原在相同视野下，病毒粒子数目大致相同，但BEI灭活的PoRV抗原病毒粒子完整性更好，棒状突起脱落较少或不明显(红色箭头标识)；而甲醛溶液灭活的PoRV抗原的病毒粒子多数呈不完整形态，且四周放射状排列的棒状突起(VP4蛋白)出现明显脱落(白色箭头标识)，病毒粒子直径减小(图11)。可见，CH09株纯化抗原经BEI灭活后，病毒粒子的完整性更好。
因此，本研究进一步将PoRV KQ06株和HN01株纯化抗原也选用甲醛和BEI两种灭活剂进行了不同条件的灭活试验，结果与PoRV CH09株灭活条件一样，终浓度为0.1％甲醛溶液37℃灭活30小时、0.3％甲醛溶液37℃灭活24小时或终浓度为0.4％甲醛溶液37℃灭活18小时，终浓度为0.0025mol/L BEI 37℃灭活36小时或终浓度为0.005mol/L BEI 37℃灭活24小时，均可将PoRV纯化抗原液完全灭活。
同时，本研究将终浓度为0.4％甲醛溶液在37℃灭活18小时和终浓度为0.005mol/L BEI溶液在37℃灭活24小时的抗原，分别制备成灭活疫苗(均为107.7TCID50/头份)。分别免疫3～5日龄健康易感仔猪，免疫21日后采血检测中和抗体。结果显示，PoRV G4-HN01、G5-KQ06、G9-CH09株纯化抗原经0.4％甲醛灭活后制备的疫苗免疫后21日，平均中和抗体效价分别为1:94.4±22.3、1:91.0±25和1:101.2±22.2；而经0.005mol/L BEI灭活后制备的疫苗免疫后21日，平均中和抗体效价分别为1:103.2±20.6、1:105.6±19.6和1:118±24.8。两种不同灭活剂PoRV纯化抗原制备疫苗诱导中和抗体水平不同，BEI灭活组显著高于甲醛灭活组。
表12 不同灭活剂灭活PoRV抗原制备疫苗免疫仔猪中和抗体检测
Figure BDA0003588254980000103
Figure BDA0003588254980000111
为保证猪轮状病毒G9-CH09株纯化抗原的灭活效果和免疫原性，确定猪轮状病毒G9、G5和G4抗原的灭活工艺为：纯化抗原中加入0.5mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，混合均匀置37℃灭活24小时，后加入过滤除菌的1.0mol/L Na2S2O3溶液(终浓度0.005mol/L)终止灭活，充分混合均匀后置2～8℃保存。
5猪轮状病毒G4\G5\G9型三价灭活疫苗制备
将灭活好的猪轮状病毒含液分别用PBS稀释至配苗浓度(病毒含量应为108.0TCID50/ml)，再按1∶1:1(体积比)混合均匀，预热至32℃，此为水相。将ISA201 VG佐剂预热至32℃，此为油相。按水相∶油相＝1∶1的比例(体积比)将水相缓慢加至ISA201 VG佐剂中，100～120r/min乳化60分钟。定量分装，加盖密封、粘贴标签，置2～8℃保存。
6安全检验用3～5日龄健康易感仔猪5头，每头猪颈部肌肉接种2.0ml(2倍免疫剂量)的疫苗，连续观察14日，试验结果表明，仔猪免疫疫苗后，精神、呼吸、行为和采食均正常，接种部位未发生红肿、硬结、溃烂等，该灭活疫苗具有良好的安全性。
表13 试制疫苗的安全性检验
Figure BDA0003588254980000121
注：“—”：临床观察(精神、呼吸、行为和采食均正常)；
“a”：精神不振；“b”：呼吸异常；“c”：异常行为；“d”：采食不佳
“无”：接种部位无异常；“△”：红肿”；“o”：硬结；“l”：溃烂
6.1效力检验
6.1.1抗猪轮状病毒特异性血清制备
选择3～4kg家兔，第1次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01、G9-CH09和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏完全佐剂乳化)；第2次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01、G9-CH09和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)；第3次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01、G9-CH09和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)，第4次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01、G9-CH09和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为3.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)，共免疫4次，每次间隔14日。第4次免疫后14日无菌采血，分离血清，56℃灭活30分钟，0.22μm滤膜过滤后分装，置-70℃以下保存，或冻干后置-70℃以下保存。
6.1.2抗体检测法
用3～5日龄健康易感仔猪20头，分为免疫组和空白对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照组，采血分离血清，用中和抗体效价为1：32的猪轮状病毒G4/G5/G9型特异性血清进行中和后分别检测血清中的PoRVG4/G5/G9型的中和抗体。如表14试验结果显示G4\G5\G9型三价灭活疫苗免疫仔猪21日后，仔猪均能产生针对不同PORV基因型的高水平中和抗体，其中三个实验批次的PoRV G4型中和抗体平均值分别为106.8±19.5、103.8±24.4、107±19.5；三个实验批次的PoRV G5型中和抗体平均值分别为113.8±28.7、111.6±30.7、119.8±27.3；三个实验批次的PoRV G9型中和抗体平均值分别为114.8±39.3、122.0±37.6、118±31.8。而PoRV G4、PoRV G5和PoRVG9单价灭活疫苗(表12：BEI灭活剂灭活PoRV抗原制备疫苗免疫仔猪中和抗体检测)产生的三种中和抗体平均值分别为1:103.2±20.6、1:105.6±19.6和1:118±24.8。试验结果表明，三株疫苗毒对机体抗体的产生具有协同效应，G4\G5\G9型三价灭活疫苗产生的中和抗体显著高于单价灭活疫苗。
表14 试制疫苗免疫仔猪PoRV中和抗体检测结果
Figure BDA0003588254980000131
Figure BDA0003588254980000141
6.1.3免疫攻毒法用3～5日龄健康易感仔猪30头，分为免疫组和攻毒对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的攻毒对照组，每头口服10.0ml的猪轮状病毒组织毒(含100ID50)，在攻毒后连续观察7日，免疫组仔猪均5头保护，攻毒对照组仔猪至少4头发病(图12)。试验结果表明G4\G5\G9型三价灭活疫苗对仔猪抵抗猪轮状病毒G4、G5和G9型的感染均具有良好的免疫保护效果。
表15 试制疫苗免疫仔猪PoRV攻毒保护检测结果
Figure BDA0003588254980000142
Figure BDA0003588254980000151
注：“/”表示不出现腹泻、呕吐、脱水等临床症状；“+”表示小肠水样内容物，小肠肠壁透明；“*”表示小肠绒毛萎缩，“－”表示无上述症状。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种猪轮状病毒G4-G5-G9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
<141> 2022-04-09
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacaacttat tgatttagct ttattaccat tagatatgtt ttctatgttc actggcatta 1560
aaagcactat tgatgctgct aaatctatgg ctactagtgt gatgaagaaa tttaaaagat 1620
ccaatctagc atcatctata tcaactttaa cagattcact atctgacgct gcttcatcaa 1680
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ttataaatca agaaaatcca ataattcgta atagaataga acaacattat atg 2273
<210> 5
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 2283
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)

1.一株猪轮状病毒KQ06株，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202222，该KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一株猪轮状病毒HN01株，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202221，该HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。
3.如权利要求1所述的猪轮状病毒KQ06株或权利要求2所述的猪轮状病毒HN01株在制备猪轮状病毒疫苗中的应用，所述疫苗选自灭活疫苗。
4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的猪轮状病毒KQ06株，权利要求2所述的猪轮状病毒HN01株，保藏号为CCTCC NO：V202191的猪轮状病毒CH09株，以及药学上可接受的载体。
5.猪轮状病毒G4-G5-G9型三价灭活疫苗，所述三价灭活疫苗是将权利要求4所述的猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，经纯化、灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。
6.如权利要求5所述的三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4所述的猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，经纯化、灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到所述的三价灭活疫苗。
7.如权利要求6所述的三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述易感细胞为PK-15细胞，培养条件为：悬浮型PK-15细胞培养72小时，细胞密度达到6.0～6.5×106个/ml且细胞活率为95％以上时，以0.5MOI的接毒剂量接种细胞密度为2.0×106个/ml的悬浮型PK-15细胞，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，培养24小时收获病毒液；
收获的猪轮状病毒KQ06株、HN01株、CH09株的病毒液滴度不低于109.0TCID50/ml。
8.如权利要求7所述的三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的纯化包括以下步骤：猪轮状病毒KQ06株、猪轮状病毒HN01株、猪轮状病毒CH09株离心后上清分别首先经0.45μm滤膜过滤澄清，经过PBS洗滤后收获澄清液，再通过Q Focurose 6FF进行层析纯化。
9.如权利要求6～8任一项所述的三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活时选用的灭活剂为0.005mol/L的BEI，灭活工艺为：纯化抗原中加入0.5mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，混合均匀置37℃灭活24小时，后加入过滤除菌的1.0mol/LNa2S2O3溶液至终浓度0.005mol/L终止灭活，充分混合均匀后置2～8℃保存。
10.如权利要求9所述的三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂为ISA201VG佐剂，灭活后步骤包括：将灭活后的猪轮状病毒含液分别用PBS稀释至配苗浓度，再按体积比为1∶1∶1混合均匀，预热至32℃，作为水相，将ISA201VG佐剂预热至32℃，作为油相，按水相∶油相＝1∶1的体积比例，将水相缓慢加至ISA201VG佐剂中，100～120r/min乳化60分钟，定量分装，加盖密封，置2～8℃保存，配苗浓度：病毒含量为108.0TCID50/ml。
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