CN107875379A

CN107875379A - 一种猪轮状病毒vp6和vp7联合疫苗

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Publication number: CN107875379A
Application number: CN201711133245.1A
Authority: CN
Inventors: 陈艺燕; 周佩佩
Original assignee: QINGDAO HONGHAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGDAO HONGHAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明提供一种猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗，其中包括疫苗抗原蛋白和疫苗佐剂；所述的抗原蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VP7蛋白。本发明在筛选获得了新型的VP6抗原基因的基础上，重组表达该VP6抗原蛋白，与现有的vp7蛋白一起作为抗原蛋白制成基因工程亚单位疫苗。本发明基因工程亚单位疫苗对已有的猪轮状病毒和新筛选的轮状病毒株具有良好的免疫效果。

Description

一种猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗。

背景技术

猪轮状病毒(RV)引起猪腹泻及幼猪死亡,给养殖户带来巨大的经济损失。应用疫苗免疫已经成为降低相关发病率、病死率和减轻经济负担的一个重要途径。养猪场等动物养殖场是该病的其主要疫源地。目前临床主要应用减毒苗来进行防疫,但由于轮状病毒的多型性；以及减毒苗与野毒株基因重组,引起回复突变；养殖动物长期排毒,污染水源、食品；这些因素都给该病的防疫造成巨大困难。近年来国外深入开展了新型轮状病毒疫苗的研究工作,并取得了巨大进展。其中主要为基因工程疫苗的研究，通过基因工程方法表达轮状病毒的抗原，免疫动物或人，从而达到免疫保护的目的。基因工程疫苗主要包括核酸疫苗、合成肤疫苗、重组表达抗原疫苗以及轮状病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗等。

但在目前使用的轮状病毒重组抗原亚单位疫苗研究中，由于轮状病毒基因组的多样性，导致制备的疫苗不能有效的预防不同基因背景的轮状病毒。且轮状病毒血清群和血清型众多,且不同毒株的生物学特性不同,故对轮状病毒的分离鉴定及相关特性的研究,无论是对该病毒的基础性研究亦或是对该病的应用性研究均具有十分重要的意义。

而且，国内猪轮状病毒疫苗的研发力度不够，而我国猪轮状病毒的感染率又非常高，因此国内需加快猪轮状病毒的研发进程。国内己有哈尔滨兽医研究所研制生产的猪传染性胃肠炎一轮状病毒二联弱毒苗和福建省生物药品厂同中国农大联合开发的TGE-PED-RV三联弱毒苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗，能够有效预防目前流程的猪轮状病毒和新筛选的病毒株，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的联合疫苗，其中包括疫苗抗原蛋白和疫苗佐剂；所述的抗原蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VP7蛋白。

所述的抗原蛋白经过了灭活处理；优选是甲醛溶液灭活；

所述的疫苗佐剂为白油Span佐剂或氢氧化铝佐剂

编码VP6重组表达蛋白的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:1；

编码VP7蛋白的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:4。

作为优选，所述的亚单位疫苗中，VP6蛋白和VP7蛋白的含量为150-300μg/ml。

本发明在筛选获得了新型的VP6抗原基因的基础上，重组表达该VP6抗原蛋白，与现有的vp7蛋白一起作为抗原蛋白制成基因工程亚单位疫苗。本发明基因工程亚单位疫苗对已有的猪轮状病毒和新筛选的轮状病毒株具有良好的免疫效果。

附图说明

图1:VP6扩增产物电泳图；

图2：本发明筛选的VP6的blastp的结果图；其中Query为本发明的VP6；

图3：VP6的重组表达产物SDS电泳图；

图4：VP7基因扩增产物电泳图。

具体实施方式

首先对本发明所涉及的术语解释如下：

1、猪轮状病毒(RV)：

轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotavirus)的成员。本属病毒略呈圆形，由11各双股RNA片断组成，有双层衣壳，直径65～75纳米。其中央为核酸构成的核心，内衣壳由32个呈放射状排列的圆柱形壳粒组成，外衣壳为连接于壳粒末端的光滑薄膜状结构，使该病毒形成车轮状外观，故命名为轮状病毒。各种动物和人的轮状病毒内衣壳具有共同的抗原，即群特异性抗原，可用补体结合、免疫荧光、免疫扩散和免疫电镜检查出来。轮状病毒可分为A、B、C、D、E、F等6个群，其中C群和E群主要感染猪，而A群和B群也可感染猪。

2、VP6抗原基因：VP6蛋白是RV病毒的特异性抗原，位于病毒的内壳，占病毒颗粒的51％。VP6蛋白主要刺激机体产生粘膜免疫抗体，在黏膜免疫中具有非常重要的作用。

3、基因工程重组亚单位疫苗：(Subunit vaccine)又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：VP6基因的筛选及序列分析

近年来对猪轮状病毒(RV)的基因序列分析表明不同毒株的基因组序列之间存在差异，同时存在明显的“漂移”和“转变”现象，导致RV的多种血清型的存在。产生此现象的一个原因是当两个或以上的RV病毒同时侵袭一个宿主细胞时，基因片段之间相互作用，在转录复制过程中发生交换、交叉或重排，引起病毒的变异。因此，不同毒株间的节段重排和基因组内部的突变导致了突变株的产生。而突变株有一定的几率使已有的疫苗的免疫效果降低或完全没有效果。而通过血清交叉中和试验可以检测已有疫苗抗血清是否能有效中和筛选的突变株，从而确定筛选分离的毒株是否发生了变异。

2015年以来在山东省多个养猪场出现了猪轮状病毒的爆发，但发病的个体之前已经注射了猪轮状病毒疫苗；为了确定不是由于疫苗失效导致的发病，对发病个体进行病毒的分离，并检测分离的病毒是否发生病变。

一、猪轮状病毒的分离

1、腹泻样品的采集与处理

无菌采集的仔猪腹泻的肠组织样品，加入PBS缓冲液用研体进行研磨，再加入青、链霉素。处理后的样品在-20℃过夜，经多次东荣后，4℃、12000rpm离心10min。取上清液，经0.22mμ滤膜过滤除菌后，置于-20℃保存备用。

2、分离待筛选病毒株

用含10％小牛血清的DMEM细胞生长液培养MA104细胞，当细胞生长为致密单层后，取保存的病毒液1ML，加入胰蛋白酶使其浓度为30-70μg/ml，置于37℃细胞培养箱中孵育；取生长为致密单层的细胞用PBS清洗后，接入孵育的病毒液，吸附后，加入含胰蛋白酶的DMEM病毒培养液于37℃培养，待病变细胞达到70％以上后进行收毒。将分离的病毒株进行传代培养，待病毒含量≥

10^5.0TCID₅₀/0.1ml后，进行血清交叉中和试验筛选变异的病毒株。

3、血清交叉中和筛选

使用中国农科院哈尔滨兽医研究所的PRV弱毒苗免疫仔猪来制备猪抗PRV血清，将收集的猪抗PRV血清放在37℃培养箱中充分析出那，在3000rpm离心5-10min，将血清吸出。然后将血清55℃灭活后用于病毒过血清交叉中和筛选。

采用基础营养液DMEM将处理好的猪抗PRV血清进行倍比稀释后，将待筛选的病毒株分别稀释到200TCID₅₀/0.1ml，然后分别与不同稀释度的血清等体积混合。将混合液放入培养箱中进行孵育60min获得血清和待筛选病毒的混合液。

弃掉长满BHK-21的单层细胞的96孔板中的营养液，用纯DMEM洗涤后，再将上面制备的血清和待筛选病毒的混合液分别加入到96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养3-4d后，观察细胞病变，记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价R。依据R值的大小判定所筛选的病毒是否与疫苗所用的病毒株是否为同一亚型，R＞80％为同一个亚型；R在25％和80％之间为同型的不同亚型；而R＜25％为不同的型。

按照上述的方法，筛选除了R值为0.278-0.396的几个病毒株，初步确定为发生了突变的猪轮状病毒。对病毒株的VP6基因序列进行分析后，最终确定了与现有的猪轮状病毒抗原性发生差异的病毒株，命名为RV-QDH-01株。

对发生变异的病毒株的主要VP4、VP6和VP7抗原进行了序列分析，发现相比于目前流行病毒株的VP6基因，RV-QDH-01株的VP6基因的氨基酸序列存在着序列上的差异。

二、RV-QDH-01株的VP6基因的筛选及序列分析

1、病毒的繁殖

取生长良好的MA104单层细胞清洗后接种胰蛋白酶处理过的病毒液，待CPE达到70％或以上时收取病毒；

2、核酸的提取

将感染病毒的细胞培养物反复冻融，2000rpm离心5min去除碎片，取上清SDS-蛋白酶法提取核酸，提取的核酸用DEPC水溶解备用；

3、PT-PCR扩增VP6基因

3.1反转录模板CDNA的合成

使用上游引物：GGCTTTTAAACGAAGTCTTC

下游引物：GGTCACATCCTCTCACTA，反转录反应液体积20μl，组成如下：

模板RNA溶液 6μl；

40pmol/μl的下游引物 1μl；

充分混均后，95℃水浴变性5min，冰浴中放置5min后，依次加入：

混合均匀后进行RT-PCR获得cDNA作为扩增基因的模板。

扩增片段所用PCR反应程序：94℃变性1min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸3min，35个循环；4℃保温。得到的DNA产物进行凝胶电泳(图1)，条带清晰则割胶回收。

4、PCR产物的回收纯化

将得到的DNA割胶回收(回收过程中离心均为室温，12000rpm)

(1)打开恒温水浴锅，设定温度为50℃；

(2)取割胶回收试剂盒中的吸附柱，检查吸附柱的吸附膜是否完好。将吸附柱放入收集管后向吸附柱中加入500μl平衡液BL，离心1min后拔出吸附柱，倒掉废液。吸附柱放回收集管后加入500μl蒸馏水，重复以上步骤，放置备用；

(3)取一个灭菌的离心管，称取质量，在紫外灯下将单一的目的条带从琼脂糖凝胶切下放入其中，再称取质量。得到胶的质量，换算成体积。如果凝胶中为0.1g，则体积视为100μl；

(4)向胶块中加入适量体积的溶胶液PN(3倍)，以浸没胶块为宜。50℃水浴10min，期间适时的翻转离心管，促进胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补充一些溶胶液，继续水浴几分钟，直到胶块溶胶完全溶解。室温放置，待溶液冷却到室温；

(5)将得到的溶液全部加入到吸附柱中，室温放置2min，离心1min，倒掉收集管中的废液；

(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，静置2‐5min，离心1min，倒掉收集管中的废液；

(7)空管离心2min，尽量除尽漂洗液，丢弃收集管，换上灭菌的离心管，空管离心2min。换个离心管，离心2min。换掉离心管，室温放置5min，彻底晾干；

(8)向吸附柱中悬空加入30‐40μl的洗脱液EB，室温放置3min，离心2min，将管中的溶液加入戏附中，再次离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的溶液即为回收的DNA溶液。‐40℃保存备用；

(9)用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA，条带长度与PCR产物条带长度相同。

5、大肠杆菌培养及转导转化

(1)配置试剂

X‐gal：DMF＝0.025g：1mL，DMF为N‐二甲基甲酰胺，溶解混匀后用离心管封装，外面包裹上锡箔纸、封口膜，‐40℃保存(见光分解)。

IPTG：dH₂O＝0.2g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌。‐40℃保存。

葡糖糖(1M)：称取18g葡糖糖充分溶解于60mL的去离子水中，定容至100mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，‐40℃保存。

Amp：dH₂O＝0.1g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，外面包裹上锡箔纸、封口膜，‐40℃保存。

(2)连接：取割胶回收到的DNA 4μl加到灭过菌的小PCR管中，再加1μlpMD18‐TVctor，最后加入5μl的Solution1。插在浮子上16℃水浴过夜。第二天早上8:00拿出，放入4℃保存备用。

(3)转化：

取20μl IPTG，100μL：X‐gal加入到每一个平板中，之后盖上上盖，用保鲜膜封好，放入恒温培养箱烘干、备用；

从‐80℃取出买来的大肠杆菌感受态细胞，擦进冰里融化3min，从4℃中取出连接好的DNA，用预冷过的枪头全部加入到对应的感受态中，冰上摆动混匀后，冰浴30min；

拿至42℃水浴锅，水浴90s，然后立即取出，冰浴2min，之后每管加入900μlSOC，用封口膜封好管口，插在浮子上，放入37℃的恒温摇床1h，之后拿出5000rmp/min，离心30s，弃500μl上清，将剩下的菌液摇匀，培养皿盖子上做好相应标记，取50μl或100μl菌液涂于平板上，保鲜膜包好后置于37℃恒温培养箱中，先正向放置培养1h，然后倒置培养，放置过夜(12h左右)，视情况拿出置于4℃继续培养，剩余菌液4℃保存，白色的为转化成功的，蓝色的则是不成功的；

6、PCR扩增VP6基因

在未加入Amp的液体培养基SOB中加入一定Amp，摇匀。取出一定数量的灭菌EP管，每管中加入1mL含Amp的SOB，拿出转化好的大肠杆菌，用牙签挑取单个大肠杆菌放入管中混匀。每个菌种做3个平行，菌在SOB中混匀后，丢弃牙签，盖上离心管，用封口膜封好后，恒温摇床中摇匀3h；

拿出菌液PCR引物M13，RV‐M48，跑菌落PCR，退后温度为58℃，35个循环，普通PCR；跑1％琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆菌株送测序公司测序。

测序结果表明，所筛选的VP6基因的核苷酸片段为1194bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1，其编码397个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。从氨基酸大小上来分析，所筛选的VP6基因没有发生插入缺失突变。但对蛋白进行blastp分析，结果表明与已有的VP6基因存在明显的差异。与NCBI中公布的猪轮状病毒VP6基因相比，同源性最高的也存在18个氨基酸的差异。图2是blastp的结果图，表明分离的VP6基因发生了遗传上的变异。

实施例2：VP6抗原的表达

1、目的基因的克隆和重组表达质粒的构建

将10μl人工合成质粒DNA加入到E.coli Top10混合后冰浴30min，然后在42℃热休克90s，然后立即冰浴2‐3min。然后均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上37℃培养过夜。挑取含阳性菌落摇菌，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定(NcoⅠ/Xho I)，鉴定正确的重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序。用NcoⅠ和Xho I分别双酶切重组克隆质粒和表达载体pGEX-4T-1，回收基因片段和pGEX-4T-1载体片段，用T4DNA酶16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌Top 10中，挑取阳性菌落，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-1-vp6送生工生物工程(上海)有限公司测序确定插入了正确的目的片段。

2、目的基因的诱导表达和Western blotting鉴定

通过热激法将重组表达质粒pGEX-4T-1-vp6转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜。挑取含阳性质粒的单菌落,加入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养至菌液A600达0.4‐0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃振荡诱导培养4h后离心，收集菌体。取1ml菌液,4℃，3000g/min离心5min，弃上清,加入70μl1×TE缓冲液,重悬沉淀,加入2μl 5×Loading Buffer,4.5μl DTT,95℃煮沸10min,4℃1000g离心10min,取上清液经Ni²⁺‐NTA金属螯合层析柱纯化后获得VP6抗原蛋白，SDS电泳确定为单一纯化条带(图3)。

实施例3：VP6抗原获得抗体血清对病毒株的中和效果

按照实施例2所记载的方法重组表达NCBI中编号为Sequence ID:AFD33516.1的VP6重组蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)，与实施例2制备的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6抗原蛋白作为免疫抗原来免疫小鼠来制备抗体血清，并将血清进行中和实验来检测免疫性能。

将纯化好的重组蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：

(1)加测蛋白用的PBS 0.15ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中作为对照，进行调零；

(2)加测蛋白用PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y，通过公式y＝0.0142x+0.0658得出蛋白浓度。

取8‐12周龄的BALB/C小鼠3‐5只，用纯化后的重组表达的VP6蛋白加入弗氏完全佐剂进行腹腔注射免疫。首次免疫每只小鼠注射重组蛋白量为20‐40μg；每隔一周免疫一次，共免疫三次，其中最后一次时加入弗氏不完全佐剂进行免疫。30d后进行血清的收集。其中本发明VP6抗原制备的作为阳性抗体血清，而氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白作为阳性对照血清；阴性对照血清为只注射佐剂的获得的血清；每个血清有3个或以上的平行样。

其中待检测的病毒为目前使用的猪轮状病毒NX株和本发明筛选的RV-QDH-01株。按照实施例1中记载的方法进行血清中和检测。结果表明，本发明筛选的VP6蛋白作为抗原制备的阳性抗体血清对RV-QDH-01株的中和能力明显好于氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白制备的阳性对照血清(p＜0.05)；而对于NX株的中和效果，阳性抗体血清相比于阳性对照血清效果要差一些，但并没有产生显著区别。

上述的结果表明本发明扩增的VP6蛋白具有抗原的变异性，从而导致已有的疫苗的免疫效果降低。

实施例4:VP7蛋白基因的克隆

为了使制备的疫苗更好的对已有的猪轮状病毒具有更好的免疫效果，按照文献(时洪艳，猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析，中国预防兽医学报，2008,30(2)，136‐140)中记载的方法扩增猪轮状病毒强毒OSU(购买自美国ATCC菌种库)的VP7基因，扩增获得VP7基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4(图4)，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

将VP7蛋白进行重组表达后，与实施例2获得的VP6蛋白一起制备疫苗。

实施例5：猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗的制备

将重组表达的VP6蛋白和VP7蛋白纯化后，用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：

1)用PBS缓冲液0.10ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液3.90ml于比色皿中作为对照，进行调零；

2)加测蛋白用的PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y，通过公式y＝0.0142x+0.0658得出蛋白浓度x。

将纯化后的VP6蛋白、VP7蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

对灭活的蛋白溶液进行半成品检验，经过检验合格后的半成品VP2蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将VP6蛋白、VP7蛋白使用生理盐水分别稀释，取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟获得VP6蛋白和VP7蛋白的含量分别为150-300μg/ml基因工程亚单位疫苗。

对制备的疫苗进行疫苗成品检验，包括如下的步骤：

(1)性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

(4)安全检验用50日龄仔猪3只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照3只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

实施例6：基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价

将50日龄的仔猪9只分为两组，第一组为免疫组，共6只乳猪，用实施例5制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行免疫；以10ml/只的剂量用肌肉注射的途径免疫乳猪，免疫4次，每隔10天重复免疫一次。在二免后10d、30d、40d、50d采集的血清用ELISA标准试剂盒进行检测。ELISA试验检测结果的S/P值＞0.4判为阳性。而对照组3只乳猪，注射不添加抗原蛋白的白油Span佐剂。

同时使用氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白制备的疫苗作为阳性对照组。

结果表明用制备的疫苗第2次肌肉注射后14d，ELISA ALV-Ab检测试剂盒测得免疫乳猪血清的S/P值([待检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性对照孔读数-已知阴性对照孔读数])都大于0.4，呈强阳性。上述的结果表明制备的疫苗能有效的诱导乳猪体内产生中和抗体。

在血清中和抗体效价方面，每个注射疫苗乳猪的血清中和抗体效价均≥1:128，显著高于阳性对照组；而阴性对照组中和抗体效价均为阴性。

表1：VP6和VP7联合疫苗免疫后乳猪血清的抗体效价

实施例7：猪轮状病毒的攻毒实验

实施例5免疫后的乳猪，在第三次免疫后10d用猪轮状病毒OSU和本发明筛选的RV-QDH-01株进行攻毒实验，在攻毒25d后用荧光定量PCR方法检测血清中的病毒量；具体的操作步骤参照如下的文献中记载的步骤(陈小金等，猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立，中国兽医科学，2010，40(02),174-179)进行。

检测结果如表2所示，结果表明，用本发明筛选的VP6蛋白和VP7蛋白制备的阳性血清进行免疫的乳猪中的检测OSU株病毒的量与阳性对照血清中OSU株病毒的量不存在显著的差异。但对于RV-QDH-01株；本发明疫苗的免疫乳猪获得的血清中的病毒量基本无法检出，但在阳性对照血清中还存在可检出的病毒量。以上结果表明说明RV-QDH-01株病毒并未在本发明筛选的VP6蛋白制备的疫苗免疫的乳猪中增值；从而能有效的抵抗猪轮状病毒的侵袭。

表2：OSU株和RV-QDH-01株的攻毒细胞病毒量检测表

对攻毒后的乳猪继续攻毒实验，在第三次免疫后10d用猪轮状病毒OSU和本发明筛选的RV-QDH-01株进行攻毒实验。在最后一次免疫后10d、20d、30d用OSU株和RV-QDH-01株进行联合攻毒；在最后攻毒10天后统计攻毒保护率(发病率)。结果表明，用本发明的疫苗进行免疫的乳猪在持续攻毒后40d也没有明显的产生乳猪腹泻或死亡现象。而阳性对照组(氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白作为抗原制备的疫苗)的3头乳猪都出现了不同情况的腹泻症状。上述结果表明现有疫苗株不能对RV-QDH-01株提供完全保护，而本发明的疫苗则保护率良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛宏昊生物科技有限公司

<120> 一种猪轮状病毒VP6和VP7联合疫苗

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

atggatgtcc tgtactcctt gtcaaaaact cttaaagatg ctagagacaa aattgtcgac 60

ggcacattat actccaatgt gagggatcta atccaacaat ttaatcaaat gataattacc 120

atgaatggaa atgagttcca aactggagga attggtaatc taccaattag gaattggaac 180

tttgattttg gactacttgg aacaacttca ctaaatttag acgctaacta cgttgagacc 240

gctcgcaata ccattggtta ttttgtagat tttgtagata atgtatgcat ggatgaaatg 300

gttagagagt cacaaagaaa tgcgattgcg ccgcagtcgg attcacttag aaagttgtta 360

ggtattaaat ttaagagaat aaattttgcc aattcatcag aatatataga gaactggaat 420

ctgcaacaca gaagacaaag aacaggtttt acatttcata atccaaacat tttcccttat 480

tcagcgtcat tttcattgaa tagatcacag ccagctcatg agaacttgat gggtacgatg 540

tggctcaatg cgggctcaga aatccaggtc gctggatttg accattcgtg tgcaattaac 600

gcaccagcta acacacaaca atttgagcct attgtacagc tccgaagagt attgactaca 660

gctacaataa ctcttttacc agatgcagaa agatttagct ttcctagagt gattaattca 720

gctgacggag cgactacatg gtacttcaat ccagtgattc tcagaccaaa tcacgttgag 780

gtagagtttc tactcaatgg gcagataata aatacttacc aagcaagatt tggaacaatt 840

atagctagaa atcttgatac aatcagattg tcgtttcagt tcatgagacc accaaatatg 900

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325

Claims

1.一种基因工程亚单位疫苗，其中包括疫苗抗原蛋白和疫苗佐剂；所述的抗原蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VP7蛋白。

2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的抗原蛋白经过了灭活处理。

3.如权利要求2所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的抗原蛋白经过了灭活处理；是用甲醛溶液灭活。

4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为白油Span佐剂或氢氧化铝佐剂。

5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的VP6蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

6.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的VP7蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

7.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的VP6蛋白含量为150-300μg/ml。

8.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的VP7蛋白含量为150-300μg/ml。