CN107875380A - 一种猪轮状病毒vp6亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的提供一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗，其中使用的抗原是其氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6重组表达蛋白。本发明在筛选获得了新型的VP6抗原基因的基础上，重组表达该VP6抗原蛋白，并制成基因工程亚单位疫苗。本发明基因工程亚单位疫苗对猪轮状病毒具有显著的免疫效果。

Description

一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗。

背景技术

猪轮状病毒(RV)引起猪腹泻及幼猪死亡,给养殖户带来巨大的经济损失。应用疫苗免疫已经成为降低相关发病率、病死率和减轻经济负担的一个重要途径。养猪场等动物养殖场是该病的其主要疫源地。目前临床主要应用减毒苗来进行防疫,但由于轮状病毒的多型性；以及减毒苗与野毒株基因重组,引起回复突变；养殖动物长期排毒,污染水源、食品；这些因素都给该病的防疫造成巨大困难。近年来国外深入开展了新型轮状病毒疫苗的研究工作,并取得了巨大进展。其中主要为基因工程疫苗的研究，通过基因工程方法表达轮状病毒的抗原，免疫动物或人，从而达到免疫保护的目的。基因工程疫苗主要包括核酸疫苗、合成肤疫苗、重组表达抗原疫苗以及轮状病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗等。

但在目前使用的轮状病毒重组抗原亚单位疫苗研究中，由于轮状病毒基因组的多样性，导致制备的疫苗不能有效的预防不同基因背景的轮状病毒。且轮状病毒血清群和血清型众多,且不同毒株的生物学特性不同,故对轮状病毒的分离鉴定及相关特性的研究,无论是对该病毒的基础性研究亦或是对该病的应用性研究均具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明在筛选获得了新型的VP6抗原基因的基础上，重组表达该VP6抗原蛋白，并制成基因工程亚单位疫苗。

本发明所提供的猪轮状病毒VP6亚单位疫苗，其中使用的抗原是其氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6重组表达蛋白

编码VP6重组表达蛋白的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:1；

本发明的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，为氢氧化铝胶苗；

本发明所提供的亚单位疫苗中，抗原蛋白的含量优选不少于200μg/ml。

本发明在筛选获得了新型的VP6抗原基因的基础上，重组表达该VP6抗原蛋白，并制成基因工程亚单位疫苗。本发明基因工程亚单位疫苗对猪轮状病毒具有显著的免疫效果。

附图说明

图1:VP6扩增产物电泳图；

图2：本发明筛选的VP6的blastp的结果图；其中Query为本发明的VP6；

图3：VP6的重组表达产物SDS电泳图。

具体实施方式

首先对本发明所涉及的术语解释如下：

1、猪轮状病毒(RV)：

轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotavirus)的成员。本属病毒略呈圆形，由11各双股RNA片断组成，有双层衣壳，直径65～75纳米。其中央为核酸构成的核心，内衣壳由32个呈放射状排列的圆柱形壳粒组成，外衣壳为连接于壳粒末端的光滑薄膜状结构，使该病毒形成车轮状外观，故命名为轮状病毒。各种动物和人的轮状病毒内衣壳具有共同的抗原，即群特异性抗原，可用补体结合、免疫荧光、免疫扩散和免疫电镜检查出来。轮状病毒可分为A、B、C、D、E、F等6个群，其中C群和E群主要感染猪，而A群和B群也可感染猪。

2、VP6抗原基因：VP6蛋白是RV病毒的特异性抗原，位于病毒的内壳，占病毒颗粒的51％。VP6蛋白主要刺激机体产生粘膜免疫抗体，在黏膜免疫中具有非常重要的作用。

3、基因工程重组亚单位疫苗：(Subunit vaccine)又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：VP6基因的筛选及序列分析

近年来对猪轮状病毒(RV)的基因序列分析表明不同毒株的基因组序列之间存在差异，同时存在明显的“漂移”和“转变”现象，导致RV的多种血清型的存在。产生此现象的一个原因是当两个或以上的RV病毒同时侵袭一个宿主细胞时，基因片段之间相互作用，在转录复制过程中发生交换、交叉或重排，引起病毒的变异。因此，不同毒株间的节段重排和基因组内部的突变导致了突变株的产生。而突变株有一定的几率使已有的疫苗的免疫效果降低或完全没有效果。而通过血清交叉中和试验可以检测已有疫苗抗血清是否能有效中和筛选的突变株，从而确定筛选分离的毒株是否发生了变异。

2015年以来在山东省多个养猪场出现了猪轮状病毒的爆发，但发病的个体之前已经注射了猪轮状病毒疫苗；为了确定不是由于疫苗失效导致的发病，对发病个体进行病毒的分离，并检测分离的病毒是否发生病变。

一、猪轮状病毒的分离

1、腹泻样品的采集与处理

无菌采集的仔猪腹泻的肠组织样品，加入PBS缓冲液用研体进行研磨，再加入青、链霉素。处理后的样品在-20℃过夜，经多次东荣后，4℃、12000rpm离心10min。取上清液，经0.22mμ滤膜过滤除菌后，置于-20℃保存备用。

2、分离待筛选病毒株

用含10％小牛血清的DMEM细胞生长液培养MA104细胞，当细胞生长为致密单层后，取保存的病毒液1ML，加入胰蛋白酶使其浓度为30-70μg/ml，置于37℃细胞培养箱中孵育；取生长为致密单层的细胞用PBS清洗后，接入孵育的病毒液，吸附后，加入含胰蛋白酶的DMEM病毒培养液于37℃培养，待病变细胞达到70％以上后进行收毒。将分离的病毒株进行传代培养，待病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml后，进行血清交叉中和试验筛选变异的病毒株。

3、血清交叉中和筛选

使用中国农科院哈尔滨兽医研究所的PRV弱毒苗免疫仔猪来制备猪抗PRV血清，将收集的猪抗PRV血清放在37℃培养箱中充分析出那，在3000rpm离心5-10min，将血清吸出。然后将血清55℃灭活后用于病毒过血清交叉中和筛选。

采用基础营养液DMEM将处理好的猪抗PRV血清进行倍比稀释后，将待筛选的病毒株分别稀释到200TCID₅₀/0.1ml，然后分别与不同稀释度的血清等体积混合。将混合液放入培养箱中进行孵育60min获得血清和待筛选病毒的混合液。

弃掉长满BHK-21的单层细胞的96孔板中的营养液，用纯DMEM洗涤后，再将上面制备的血清和待筛选病毒的混合液分别加入到96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养3-4d后，观察细胞病变，记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价R。依据R值的大小判定所筛选的病毒是否与疫苗所用的病毒株是否为同一亚型，R＞80％为同一个亚型；R在25％和80％之间为同型的不同亚型；而R＜25％为不同的型。

按照上述的方法，筛选除了R值为0.278-0.396的几个病毒株，初步确定为发生了突变的猪轮状病毒。对病毒株的VP6基因序列进行分析后，最终确定了与现有的猪轮状病毒抗原性发生差异的病毒株，命名为RV-QDH-01株。

对发生变异的病毒株的主要VP4、VP6和VP7抗原进行了序列分析，发现相比于目前流行病毒株的VP6基因，RV-QDH-01株的VP6基因的氨基酸序列存在着序列上的差异。

二、RV-QDH-01株的VP6基因的筛选及序列分析

1、病毒的繁殖

取生长良好的MA104单层细胞清洗后接种胰蛋白酶处理过的病毒液，待CPE达到70％或以上时收取病毒；

2、核酸的提取

将感染病毒的细胞培养物反复冻融，2000rpm离心5min去除碎片，取上清SDS-蛋白酶法提取核酸，提取的核酸用DEPC水溶解备用；

3、PT-PCR扩增VP6基因

3.1反转录模板CDNA的合成

使用上游引物：GGCTTTTAAACGAAGTCTTC

下游引物：GGTCACATCCTCTCACTA，反转录反应液体积20μl，组成如下：

模板RNA溶液 6μl；

40pmol/μl的下游引物 1μl；

充分混均后，95℃水浴变性5min，冰浴中放置5min后，依次加入：

混合均匀后进行RT-PCR获得cDNA作为扩增基因的模板。

扩增片段所用PCR反应程序：94℃变性1min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸3min，35个循环；4℃保温。得到的DNA产物进行凝胶电泳(图1)，条带清晰则割胶回收。

4、PCR产物的回收纯化

将得到的DNA割胶回收(回收过程中离心均为室温，12000rpm)

(1)打开恒温水浴锅，设定温度为50℃；

(2)取割胶回收试剂盒中的吸附柱，检查吸附柱的吸附膜是否完好。将吸附柱放入收集管后向吸附柱中加入500μl平衡液BL，离心1min后拔出吸附柱，倒掉废液。吸附柱放回收集管后加入500μl蒸馏水，重复以上步骤，放置备用；

(3)取一个灭菌的离心管，称取质量，在紫外灯下将单一的目的条带从琼脂糖凝胶切下放入其中，再称取质量。得到胶的质量，换算成体积。如果凝胶中为0.1g，则体积视为100μl；

(4)向胶块中加入适量体积的溶胶液PN(3倍)，以浸没胶块为宜。50℃水浴10min，期间适时的翻转离心管，促进胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补充一些溶胶液，继续水浴几分钟，直到胶块溶胶完全溶解。室温放置，待溶液冷却到室温；

(5)将得到的溶液全部加入到吸附柱中，室温放置2min，离心1min，倒掉收集管中的废液；

(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，静置2‐5min，离心1min，倒掉收集管中的废液；

(7)空管离心2min，尽量除尽漂洗液，丢弃收集管，换上灭菌的离心管，空管离心2min。换个离心管，离心2min。换掉离心管，室温放置5min，彻底晾干；

(8)向吸附柱中悬空加入30‐40μl的洗脱液EB，室温放置3min，离心2min，将管中的溶液加入戏附中，再次离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的溶液即为回收的DNA溶液。‐40℃保存备用；

(9)用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA，条带长度与PCR产物条带长度相同。

5、大肠杆菌培养及转导转化

(1)配置试剂

X‐gal：DMF＝0.025g：1mL，DMF为N‐二甲基甲酰胺，溶解混匀后用离心管封装，外面包裹上锡箔纸、封口膜，‐40℃保存(见光分解)。

IPTG：dH₂O＝0.2g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌。‐40℃保存。

葡糖糖(1M)：称取18g葡糖糖充分溶解于60mL的去离子水中，定容至100mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，‐40℃保存。

Amp：dH₂O＝0.1g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，外面包裹上锡箔纸、封口膜，‐40℃保存。

(2)连接：取割胶回收到的DNA 4μl加到灭过菌的小PCR管中，再加1μlpMD18‐TVctor，最后加入5μl的Solution1。插在浮子上16℃水浴过夜。第二天早上8:00拿出，放入4℃保存备用。

(3)转化：

取20μl IPTG，100μL：X‐gal加入到每一个平板中，之后盖上上盖，用保鲜膜封好，放入恒温培养箱烘干、备用；

从‐80℃取出买来的大肠杆菌感受态细胞，擦进冰里融化3min，从4℃中取出连接好的DNA，用预冷过的枪头全部加入到对应的感受态中，冰上摆动混匀后，冰浴30min；

拿至42℃水浴锅，水浴90s，然后立即取出，冰浴2min，之后每管加入900μlSOC，用封口膜封好管口，插在浮子上，放入37℃的恒温摇床1h，之后拿出5000rmp/min，离心30s，弃500μl上清，将剩下的菌液摇匀，培养皿盖子上做好相应标记，取50μl或100μl菌液涂于平板上，保鲜膜包好后置于37℃恒温培养箱中，先正向放置培养1h，然后倒置培养，放置过夜(12h左右)，视情况拿出置于4℃继续培养，剩余菌液4℃保存，白色的为转化成功的，蓝色的则是不成功的；

6、PCR扩增VP6基因

在未加入Amp的液体培养基SOB中加入一定Amp，摇匀。取出一定数量的灭菌EP管，每管中加入1mL含Amp的SOB，拿出转化好的大肠杆菌，用牙签挑取单个大肠杆菌放入管中混匀。每个菌种做3个平行，菌在SOB中混匀后，丢弃牙签，盖上离心管，用封口膜封好后，恒温摇床中摇匀3h；

拿出菌液PCR引物M13，RV‐M48，跑菌落PCR，退后温度为58℃，35个循环，普通PCR；跑1％琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆菌株送测序公司测序。

测序结果表明，所筛选的VP6基因的核苷酸片段为1194bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1，其编码397个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。从氨基酸大小上来分析，所筛选的VP6基因没有发生插入缺失突变。但对蛋白进行blastp分析，结果表明与已有的VP6基因存在明显的差异。与NCBI中公布的猪轮状病毒VP6基因相比，同源性最高的也存在18个氨基酸的差异。图2是blastp的结果图，表明分离的VP6基因发生了遗传上的变异。

实施例2：VP6抗原的表达

1、目的基因的克隆和重组表达质粒的构建

将10μl人工合成质粒DNA加入到E.coli Top10混合后冰浴30min，然后在42℃热休克90s，然后立即冰浴2‐3min。然后均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上37℃培养过夜。挑取含阳性菌落摇菌，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定(NcoⅠ/Xho I)，鉴定正确的重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序。用NcoⅠ和Xho I分别双酶切重组克隆质粒和表达载体pGEX-4T-1，回收基因片段和pGEX-4T-1载体片段，用T4DNA酶16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌Top 10中，挑取阳性菌落，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-1-vp6送生工生物工程(上海)有限公司测序确定插入了正确的目的片段。

2、目的基因的诱导表达和Western blotting鉴定

通过热激法将重组表达质粒pGEX-4T-1-vp6转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜。挑取含阳性质粒的单菌落,加入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养至菌液A600达0.4‐0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃振荡诱导培养4h后离心，收集菌体。取1ml菌液,4℃，3000g/min离心5min，弃上清,加入70μl 1×TE缓冲液,重悬沉淀,加入2μl 5×Loading Buffer,4.5μl DTT,95℃煮沸10min,4℃1000g离心10min,取上清液经Ni²⁺‐NTA金属螯合层析柱纯化后获得VP6抗原蛋白，SDS电泳确定为单一纯化条带(图3)。

实施例3：VP6抗原获得抗体血清对病毒株的中和效果

按照实施例2所记载的方法重组表达NCBI中编号为Sequence ID:AFD33516.1的VP6重组蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)，与实施例2制备的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6抗原蛋白作为免疫抗原来免疫小鼠来制备抗体血清，并将血清进行中和实验来检测免疫性能。

将纯化好的重组蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：

(1)加测蛋白用的PBS 0.15ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中作为对照，进行调零；

(2)加测蛋白用PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y，通过公式y＝0.0142x+0.0658得出蛋白浓度。

取8‐12周龄的BALB/C小鼠3‐5只，用纯化后的重组表达的VP6蛋白加入弗氏完全佐剂进行腹腔注射免疫。首次免疫每只小鼠注射重组蛋白量为20‐40μg；每隔一周免疫一次，共免疫三次，其中最后一次时加入弗氏不完全佐剂进行免疫。30d后进行血清的收集。其中本发明VP6抗原制备的作为阳性抗体血清，而氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白作为阳性对照血清；阴性对照血清为只注射佐剂的获得的血清；每个血清有3个或以上的平行样。

其中待检测的病毒为目前使用的猪轮状病毒NX株和本发明筛选的RV-QDH-01株。按照实施例1中记载的方法进行血清中和检测。结果表明，本发明筛选的VP6蛋白作为抗原制备的阳性抗体血清对RV-QDH-01株的中和能力明显好于氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VP6蛋白制备的阳性对照血清(p＜0.05)；而对于NX株的中和效果，阳性抗体血清相比于阳性对照血清效果要差一些，但并没有产生显著区别。

上述的结果表明本发明扩增的VP6蛋白具有抗原的变异性，从而导致已有的疫苗的免疫效果降低。

实施例4：VP6蛋白制成亚单位疫苗

将重组表达的VP6蛋白纯化后，用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：

1)用PBS缓冲液0.10ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液3.90ml于比色皿中作为对照，进行调零；

2)加测蛋白用的PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y为0.184，通过公式y＝0.0142x+0.0658得出蛋白浓度x＝0.94mg/ml，即为940μg/ml。

将此纯化的重组表达的蛋白溶液与氢氧化铝胶佐剂进行配苗，制备成VP6蛋白基因工程亚单位疫苗；制成的疫苗中于每毫升氢氧化铝胶苗中含有融合蛋白200-400μg/ml。

以10ml/只的剂量用肌肉注射的途径免疫乳猪，免疫4次，每隔10天重复免疫一次。在二免后10d、30d、40d、50d采集的血清用ELISA标准试剂盒进行检测。ELISA试验检测结果的S/P值＞0.4判为阳性。

结果表明用制备的疫苗第2次肌肉注射后10d，ELISA ALV-Ab检测试剂盒测得免疫乳猪血清的S/P值([待检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性对照孔读数-已知阴性对照孔读数])都大于0.4，呈强阳性。上述的结果表明VP6蛋白制备的疫苗能有效的诱导乳猪体内产生中和抗体。

实施例5：亚单位疫苗免疫后乳猪血液中轮状病毒数量检测

实施例4免疫后的乳猪，用NX株和本发明筛选的RV-QDH-01株进行攻毒实验，收集的血清进行间接免疫荧光试验(IFA)进行检测外，还采用荧光定量PCR方法检测血清中的病毒量；具体的操作步骤参照如下的文献中记载的步骤(陈小金等，猪轮状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立，中国兽医科学，2010，40(02),174-179)进行。

检测结果表明，用本发明筛选的VP6蛋白制备的阳性血清进行免疫的乳猪中的检测NX株病毒的量与阳性对照血清中NX株病毒的量虽然偏多，但不存在显著的差异。但对于RV-QDH-01株；本发明VP6蛋白制备的疫苗的免疫乳猪获得的血清中的病毒量基本无法检出，但在阳性对照血清中还存在可检出的病毒量。以上结果表明说明RV-QDH-01株病毒并未在本发明筛选的VP6蛋白制备的疫苗免疫的乳猪中增值；从而能有效的抵抗猪轮状病毒的侵袭。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛宏昊生物科技有限公司

<120> 一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

atggatgtcc tgtactcctt gtcaaaaact cttaaagatg ctagagacaa aattgtcgac 60

ggcacattat actccaatgt gagggatcta atccaacaat ttaatcaaat gataattacc 120

atgaatggaa atgagttcca aactggagga attggtaatc taccaattag gaattggaac 180

tttgattttg gactacttgg aacaacttca ctaaatttag acgctaacta cgttgagacc 240

gctcgcaata ccattggtta ttttgtagat tttgtagata atgtatgcat ggatgaaatg 300

gttagagagt cacaaagaaa tgcgattgcg ccgcagtcgg attcacttag aaagttgtta 360

ggtattaaat ttaagagaat aaattttgcc aattcatcag aatatataga gaactggaat 420

ctgcaacaca gaagacaaag aacaggtttt acatttcata atccaaacat tttcccttat 480

tcagcgtcat tttcattgaa tagatcacag ccagctcatg agaacttgat gggtacgatg 540

tggctcaatg cgggctcaga aatccaggtc gctggatttg accattcgtg tgcaattaac 600

gcaccagcta acacacaaca atttgagcct attgtacagc tccgaagagt attgactaca 660

gctacaataa ctcttttacc agatgcagaa agatttagct ttcctagagt gattaattca 720

gctgacggag cgactacatg gtacttcaat ccagtgattc tcagaccaaa tcacgttgag 780

gtagagtttc tactcaatgg gcagataata aatacttacc aagcaagatt tggaacaatt 840

atagctagaa atcttgatac aatcagattg tcgtttcagt tcatgagacc accaaatatg 900

acaccagcag tagcggcatt atttccgaac gcgcagccat ttgaacatca tgctacggta 960

ggactcacac ttagaattga atctgcagtt tgtgcatctg tacttgccga tgcaagcgaa 1020

acgatgctag caaatctgac atctgttagg caagaatacg cgataccagt tggaccggtt 1080

ttcccaccag gtatgaattg gactgatttg atcactaact atccaccatc tagagaggat 1140

aacctgcagc gtgtatttac agtggcttcc attagaagca tgcttgtcaa atga 1194

<210> 2

<211> 397

<212> PRT

<213> 2

<400> 2

Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp

1 5 10 15

Lys Ile Val Asp Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Arg Asp Leu Ile Gln

20 25 30

Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Gly Thr Thr Ser Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr

65 70 75 80

Ala Arg Asn Thr Ile Gly Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys

85 90 95

Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Ala Ile Ala Pro Gln

100 105 110

Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Leu Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn

115 120 125

Phe Ala Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln His Arg

130 135 140

Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Asn Pro Asn Ile Phe Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Ser Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Asn Leu

165 170 175

Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly

180 185 190

Phe Asp His Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe

195 200 205

Glu Pro Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

225 230 235 240

Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro

245 250 255

Asn His Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr

260 265 270

Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Leu Asp Thr Ile

275 280 285

Arg Leu Ser Phe Gln Phe Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val

290 295 300

Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Val

305 310 315 320

Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Ala Ser Val Leu Ala

325 330 335

Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Leu Thr Ser Val Arg Gln Glu

340 345 350

Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr

355 360 365

Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Pro Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg

370 375 380

Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys

385 390 395

<210> 3

<211> 300

<212> PRT

<213> 3

<400> 3

Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp

1 5 10 15

Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln

20 25 30

Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr

65 70 75 80

Ala Arg Asn Thr Ile Gly Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys

85 90 95

Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln

100 105 110

Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn

115 120 125

Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg

130 135 140

Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu

165 170 175

Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly

180 185 190

Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe

195 200 205

Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

225 230 235 240

Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro

245 250 255

Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr

260 265 270

Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile

275 280 285

Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met

290 295 300

Claims (6)

1.一种猪轮状病毒VP6亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原是其氨基酸序列为SEQ ID NO:2的VP6蛋白。

2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的编码VP6蛋白的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗为氢氧化铝胶苗。

4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗中VP6蛋白的含量优选不少于200μg/ml。

5.权利要求1所述的亚单位疫苗在制备预防猪轮状病毒的生物制品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生物制品为免疫试剂盒。