CN102643335A - 重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备 - Google Patents

重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备，重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。

Description

重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备
  
技术领域
本发明涉及一种载体蛋白，尤其是一种重组的轮状病毒TB-Chen株VP6载体蛋白及其制备，属于医学生物技术领域。 
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，简称RV）是婴幼儿腹泻的主要病原体。世界范围内每年大约有60多万例RV感染患者死亡，其中80%发生在发展中国家。RV属呼肠病毒科（Reoviridae），轮状病毒属（Rotavirus）。RV基因组由11个片段的双链RNA组成，分别编码6个结构蛋白(VP1-VP4, VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。 
根据RV组（亚组）抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可将至今已发现的轮状病毒RV分为A～G 七个组， A组是婴幼儿腹泻的主要病原体。根据病毒蛋白编码框（ORF）核苷酸序列同源性差异，可将A组轮状病毒RV 的12个蛋白（基因）分为不同的基因型。根据RV基因型分类标准，A组轮状病毒RV的结构蛋白VP6至少可分为16个基因型（I1-I16型）。VP6蛋白由第6基因片段编码，含397个氨基酸，分子量约为44.8KDa。VP6蛋白是轮状病毒RV中含量最丰富的蛋白，约占病毒总蛋白量的51%。 RV内壳中间层由260个致密的VP6蛋白三聚体共780个蛋白分子构成。 
VP6蛋白具有重要的生物学功能，是病毒基因组转录和病毒组装不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫学性质。近年进行的VP6蛋白免疫学研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA单克隆抗体诸如7D9所产生的IgA具有保护作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通过IgA的分泌途径而阻碍了病毒的复制循环过程，或作为一种黏膜的分泌型IgA，将RV感染的上皮细胞排除，从而起到保护作用。研究发现VP6蛋白分子中至少存在两个Th细胞抗原表位和一个交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位 。有研究表明在使用麦芽糖结合VP6蛋白对小鼠进行黏膜免疫后，IFN-γ被认为是CD4+T细胞分泌的唯一有效的抗RV的细胞因子。众多的实验表明，经VP6蛋白免疫后，在动物体内确实能引起抗RV感染的作用。抗VP6蛋白单克隆抗体具有抑制病毒转录活性和保护小鼠免受病毒感染的作用。用重组表达的VP6蛋白免疫小鼠，也可诱导小鼠产生免疫保护作用。 
VP6蛋白可自我组装成病毒样颗粒（VLPs）。由于VLPs没有感染性，在研究细胞相互作用，开发诊断制剂和疫苗方面，具有更好的安全性。与单一分子的重组抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激机体产生体液和细胞免疫反应。由于VLPs具有高密度的呈递抗原表位，可产生很强的免疫反应，是许多疫苗研制中很有前景的材料。 
轮状病毒TB-Chen株是从临床胃肠炎患者中分离得到的公知轮状病毒株，是我国第一株完成了全基因组分析的A组人轮状病毒RV株，轮状病毒TB-Chen株全称为：RVA/Human-wt/CHN/TB-Chen/1996/G2P[4]。这是一个公知的具有很好基础研究和开发应用价值的病毒株。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白。 
本发明的另一个目的在于提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白的制备方法。 
本发明提供的是这样一种重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点：Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag），其中： 
重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列如下：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
所述重组轮状病毒VP6载体蛋白通过下列步骤构建： 
1）根据轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对：
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
以及下列引物：
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；
2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：
PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；
PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；
PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；
PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；
PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；
PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；
PCR扩增反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及30ng模板DNA，1×105 pmol的dNTPs，10μl的 10× PCR缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；分别得到：
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段：6174F和6174R；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段：6197F和6197R；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段：6244F和6624R；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段：6275F和6275R；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段：6298F和6298R；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段：6308F和6308R；
用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；
3）将步骤2）所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切：
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F：Nde I/Sac I；
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174R：Sac I/BamH I；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F：Nde I/BspT104 I；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197R：BspT104 I/BamH I；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F：Nde I/Kpn I；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6624R：Kpn I/BamH I；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275F：Nde I/Bln I；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275R：Bln I/BamH I；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F：Nde I/Sac II；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298R：Sac II/BamH I；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F：Nde I/Xho I；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308R：Xho I/BamH I；
酶切反应体系为：分别含有3μl 的上述各基因片段，以及3μl的内切酶I (15U)，3μl的内切酶II（15U），和8μl的10×缓冲液及63μl的水；将各酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得对应的六个酶切片段，分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化六个酶切片段；
4）将步骤3）所得六个酶切片段对分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，最终在同一个VP6蛋白上构建出携带有Sac I（ gagctc ），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个酶切位点的VP6载体蛋白编码基因；
5）、将步骤4）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F；
6）按常规将步骤5）所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒pET6F在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 重组质粒pET6F与100μl BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl的LB培养液后，在37℃培养30分钟；培养物涂在含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板上，将培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得携带有Sac I（ gagctc ），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）6个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F。
所述步骤2）的轮状病毒TB-Chen株为公知的病毒株。 
所述步骤4）所得VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸（M）的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子（TGA TAA）组成。 
所述步骤6）所得重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，分子量为43.2Kd，其编码基因由1146个核苷酸组成。 
本发明提供的带有六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。 
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。 
实施例1 
1）人工设计下列引物对：
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F： GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
以及下列引物：
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；
2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：
PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；
PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；
PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；
PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；
PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；
PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；
具体是：
在PCR反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，包含30ng模板DNA，1×105 pmol的dNTPs，10× PCR缓冲液10μl，5U Taq DNA聚合酶，60pmol的引物对PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F,和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I和Sac I/BamH I双酶切，即：
A、6174F酶切片段制备：酶切反应体系为：3μl 的6174F片段，3μl的Nde I (15U)，3μl的Sac I（15U），8μl的10×缓冲液，63μl的水；将酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得酶切片段，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用Sac I/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接：将6174F和6174R酶切片段与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，得到携带有Sac I位点（ gagctc ）的VP6编码基因：
3）运用步骤2）的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2）获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I（ ttcgaa ）位点，得到携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3）所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I（ ggtacc ）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ ggtacc ）位点的VP6编码基因；
5）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bln I/BamH I，在步骤4）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ ggtacc ）位点的VP6编码基因上插入Bln I（ cctagg ）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点及Bln I（ cctagg ）位点的VP6编码基因；
6）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac II/BamH I，在步骤5）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点及Bln I（ cctagg ）位点的VP6编码基因上插入Sac II（ ccgcgg ）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点、Sac II（ ccgcgg ）位点及Sac II（ ccgcgg ）位点的VP6编码基因；
7）、用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点、Bln I（ ccgcgg ）位点及Sac II（ ccgcgg ）位点的VP6编码基因上插入Xho I（ ctcgag ）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点、Bln I（ ccgcgg ）位点、Sac II（ ccgcgg ）位点及Xho I（ ctcgag ）位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸（M）的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子（TGA TAA）组成，其核苷酸序列为：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
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 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8）、将步骤7）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F；
9）按常规将步骤8）所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒pET6F在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 重组质粒pET6F与100μl BL21（DE3）感受态细胞混匀，并上放置30分钟，转42℃放置70秒钟，加入500μl LB培养液后，在37℃培养30分钟；培养物涂含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板，将培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，该重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
本发明所得重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，经下列免疫学Western Blot检测： 
1）将重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，用作对照的重组轮状病毒NSP2蛋白，用作对照的牛血清白蛋白，各取2μg，分别溶于20μl水，分别加入5μl 5×变性缓冲液，混匀，在100℃变性5min；
2）将1）的变性蛋白样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(10% SDS-PAGE)分离，并在电压15V、电流50mA的条件下，电泳转印25 min，转移到PVDF膜上，将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS/T液中于4°C封闭过夜；
3）用PBS/T洗膜5次，分别加入抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），于37℃孵育1.5 h；用PBS/T液洗膜5次，每次5 min；
4）加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG（1:2,000如上稀释）/ HRP标记的兔抗人IgG（1:800如上稀释），37℃ 孵育1 h；PBS/T漂洗5次，DAB显色；显色后，蒸馏水漂洗膜，终止显色，观察并分析结果如下：
重组VP6载体蛋白rVP6F能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。
重组VP6载体蛋白rVP6F能与抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。 
重组VP6载体蛋白不能与抗重组轮状病毒NSP2 蛋白豚鼠免疫血清抗体发生免疫反应。 
用重组VP6载体蛋白rVP6F按常规免疫豚鼠得到的血清抗体，能与轮状病毒全病毒中的VP6蛋白发生特异性免疫反应。 
用重组VP6载体蛋白rVP6F免疫得到的豚鼠免疫血清抗体，能与重组轮状病毒VP6蛋白发生特异性免疫反应。 
抗重组轮状病毒NSP2 蛋白豚鼠免疫血清抗体只与重组轮状病毒NSP2 蛋白发生免疫反应。 
抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体，或抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体与用作阴性对照的重组轮状病毒NSP2蛋白和牛血清白蛋白均无免疫反应。 
结论：本发明提供的重组VP6载体蛋白rVP6F具有特异的抗原反应性和免疫原性。 
  
序列表
重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
重组轮状病毒VP6载体蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
引物： 
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT。
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备
<130> 疫苗开发
<140> 专利申请号
<141> 专利申请日
<160> 380
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa aattgtcgaa   60
ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat ttaatcaaat gataattact  120
atgaatggaa atgaatttca aactggagga attggtaatc taccaaccag aaattggagt  180
tttgattttg gtttacttgg aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact  240
gcgcgtaaca caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg  300
gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag aaaactatca  360
gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg aatacataga aaactggaac  420
ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt acatttcata aaccaaacat ctttccatat  480
tcagcttcat ttacgttaaa tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg  540
ttgaatgcag gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt  600
gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct tttaccagat  660
gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg atggtaccac atggtatttt  720
aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc gaagtagaat ttctattgaa tggacagata  780
ataaatactt atcaggcacc taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt  840
agattatcat ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcgcagcact cgagcatcat  900
gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt gcttgctgat  960
gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac aagaatatgc aataccagtt 1020
gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg actgatttga ttactaacta ctcaccatct 1080
agagaggata atttacaacg tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa 1140
tgataa                                                            1146
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                200                 205                 210
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                215                 220                 225
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe
                230                 235                 240
Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu
                245                 250                 255
Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly
                260                 265                 270
Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln
                275                 280                 285
Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His
                290                 295                 300
Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu
                305                 310                 315
Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr
                320                 325                 330
Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro
                355                 340                 345
Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser
                350                 355                 360
Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg
                365                 370                 375
Ser Met Leu Val Lys
                380
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
catgagctca tgggtacaat gtgg                                          24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
catgagctca tgcgcaggtt gtga                                          24
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
gattattcga acatacagca atttgagcat                                    30
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
tatgttcgaa taatcaaatc cagcaac                                       27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
gatggtacca catggtattt taatcca                                       27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
tgtggtacca tcagctgaat taattac                                       27
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
gcacctaggt ttggtacaat tgta                                          24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
aaacctaggt gcctgataag tatttat                                       27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
agaccgcgga ccccatcagt cgca                                          24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ggtccgcggt ctcatcaatt gaaatga                                       27
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
gcactcgagc atcatgctac tgta                                          24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
atgctcgagt gctgcgactg atgg                                          24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
atcatatgga ggttctgtac tc                                            22
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
taggatcctt atcatttaac aagcatgctt ctaat                              35

Claims (2)

1.一种重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点：Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag），其中：
重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列如下：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
2.如权利要求1所述的重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于通过下列步骤构建：
1）根据轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对：
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
以及下列引物：
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；
2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：
PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；
PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；
PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；
PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；
PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；
PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；
PCR扩增反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及30ng模板DNA，1×105 pmol的dNTPs，10μl的 10× PCR缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；分别得到：
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段：6174F和6174R；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段：6197F和6197R；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段：6244F和6624R；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段：6275F和6275R；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段：6298F和6298R；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段：6308F和6308R；
用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；
3）将步骤2）所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切：
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F：Nde I/Sac I；
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174R：Sac I/BamH I；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F：Nde I/BspT104 I；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197R：BspT104 I/BamH I；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F：Nde I/Kpn I；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6624R：Kpn I/BamH I；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275F：Nde I/Bln I；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275R：Bln I/BamH I；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F：Nde I/Sac II；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298R：Sac II/BamH I；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F：Nde I/Xho I；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308R：Xho I/BamH I；
酶切反应体系为：分别含有3μl 的上述各基因片段，以及3μl的15U内切酶I ，3μl的15U内切酶II，和8μl的10×缓冲液及63μl的水；将各酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得对应的六个酶切片段，分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化六个酶切片段；
4）将步骤3）所得六个酶切片段对分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，最终在同一个VP6蛋白上构建出携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个酶切位点的VP6载体蛋白编码基因；
5）、将步骤4）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F；
6）按常规将步骤5）所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒pET6F在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 重组质粒pET6F与100μl的 BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl的LB培养液后，在37℃培养30分钟；培养物涂在含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板上，将培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F。
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