CN102643348B - 携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备，分别是携带有轮状病毒P[4]223，P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296、G2[87]抗原表位的六个重组蛋白，以及同时同时携带有P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白，经免疫学WesternBlot检测，所述各个重组嵌合蛋白均能与抗轮状病毒全病毒，抗轮状病毒的VP6和抗相应轮状病毒的VP4/VP7抗体发生特异性免疫反应。说明上述各个重组表达的重组嵌合蛋白具有VP6载体蛋白和所插入的轮状病毒抗原表位的良好的免疫反应性，且不具有传染性，没有毒力返祖和肠套叠等副作用，对进一步开发轮状病毒RV重组嵌合疫苗，具有较高的应用价值。

Description

携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备
技术领域
本发明涉及一种重组嵌合蛋白，尤其是一种携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备，属于医学生物技术领域。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，简称RV）是婴幼儿腹泻的主要病原体。世界范围内每年大约有60多万例RV感染患者死亡，其中80%发生在发展中国家。RV属呼肠病毒科（Reoviridae），轮状病毒属（Rotavirus）。RV基因组由11个片段的双链RNA组成，分别编码6个结构蛋白(VP1-VP4,VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。
根据RV组（亚组）抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可将至今已发现的轮状病毒RV分为A～G 七个组， A组是婴幼儿腹泻的主要病原体。根据病毒蛋白编码框（ORF）核苷酸序列同源性差异，可将A组轮状病毒RV 的12个蛋白（基因）分为不同的基因型。根据RV基因型分类标准，A组轮状病毒RV的结构蛋白VP6至少可分为16个基因型（I1-I16型）。VP6蛋白由第6基因片段编码，含397个氨基酸，分子量约为44.8KDa。VP6蛋白是轮状病毒RV中含量最丰富的蛋白，约占病毒总蛋白量的51%。 RV内壳中间层由260个致密的VP6蛋白三聚体共780个蛋白分子构成。
VP6蛋白具有重要的生物学功能，是病毒基因组转录和病毒组装不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫学性质。近年进行的VP6蛋白免疫学研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA单克隆抗体诸如7D9所产生的IgA具有保护作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通过IgA的分泌途径而阻碍了病毒的复制循环过程，或作为一种黏膜的分泌型IgA，将RV感染的上皮细胞排除，从而起到保护作用。研究发现VP6蛋白分子中至少存在两个Th细胞抗原表位和一个交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位 。有研究表明在使用麦芽糖结合VP6蛋白对小鼠进行黏膜免疫后，IFN-γ被认为是CD4+T细胞分泌的唯一有效的抗RV的细胞因子。众多的实验表明，经VP6蛋白免疫后，在动物体内确实能引起抗RV感染的作用。抗VP6蛋白单克隆抗体具有抑制病毒转录活性和保护小鼠免受病毒感染的作用。用重组表达的VP6蛋白免疫小鼠，也可诱导小鼠产生免疫保护作用。
VP6蛋白可自我组装成病毒样颗粒（VLPs）。由于VLPs没有感染性，在研究细胞相互作用，开发诊断制剂和疫苗方面，具有更好的安全性。与单一分子的重组抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激机体产生体液和细胞免疫反应。由于VLPs具有高密度的呈递抗原表位，可产生很强的免疫反应，是许多疫苗研制中很有前景的材料。
至今所有已用于人体的轮状病毒RV疫苗都是减毒活疫苗。1997年始用于人体的多价减毒重组活疫苗Rotashield因后来发现与肠套叠有关联而在使用一年后即停止使用。2006年和2008年分别获准在人群中使用的5价重组减毒活疫苗RotaTeq和单价重组减毒活疫苗Rotarix现也已发现有猪环状病毒DNA污染。Rotarix已在美国人群中停止使用，RotaTeq在人群中尚可正常使用。由于上述用于人类的RV疫苗存在肠套叠和其他病毒核酸污染等风险，且都存在只能降低RV感染引起的死亡率和重症腹泻，不能完全保护RV感染的不足，在Rotarix停用后，RV感染率似有所提高。在尚无理想的治疗轮状病毒RV感染的药物，以及轮状病毒RV疫苗尚不十分理想的今天，进一步研制更安全有效的新型轮状病毒RV疫苗具有重要的经济与社会价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的又在于提供一种携带有轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的还在于提供一种携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的再在于提供一种携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的还在于提供一种携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。
本发明提供的携带轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，P[4]223抗原表位的氨基酸序列为：
Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
本发明提供的携带轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，P[4]56抗原表位的氨基酸序列为：
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。
本发明提供的携带轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，G1[142]的氨基酸序列为：Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。
本发明提供的携带轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中G4[208]的氨基酸序列为：Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp。
本发明提供的携带轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，P[8]296的氨基酸序列为：
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。
本发明提供的携带轮状病毒G2[87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列为：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，G2[87]的氨基酸序列为：
Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr。
本发明提供的携带有轮状病毒P[4]223、P[4]56，G1[142]，G4[208],P[8]296和G2[87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列： 
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
本发明提供的携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白均通过下列步骤制备：
1A、根据抗原表位氨基酸序列，分别设计下列引物：
P[4]223F：CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT；
P[4]223R：CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT；
P[4]56F：CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT；
P[4]56R：CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT；
 G1[142]F：CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC；
 G1[142]R：CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC；
G4[208]F：CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC；
G4[208]R：CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC；
P[8]296F：GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC；
P[8]296R：GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC；
G2[87]F：TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC；
G2[87]R：TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC；
1B、将步骤1A的各引物分别进行下列配对：
将VP4抗原表位P[4]223的两条人工合成的寡核苷酸即正链P[4]223F和负链P[4]223R配成引物对：P[4]223F/P[4]223R；
将VP4抗原表位P[4]56的两条人工合成的寡核苷酸即正链P[4]56F和负链P[4]56R配成引物对：P[4]56F/P[4]56R；
将VP7抗原表位G1[142]的两条人工合成的寡核苷酸即正链G1[142]F和负链G1[142]R配成引物对：G1[142]F/G1[142]R；
将VP7抗原表位G4[208]的两条人工合成的寡核苷酸即正链G4[208]F和负链G4[208]R配成引物对：G4[208]F/G4[208]R；
将VP4抗原表位P8[296]的两条人工合成的寡核苷酸即正链P8[296]F和负链P8[296]R配成引物对：P8[296]F/P8[296]R；
将VP7抗原表位G2[87]的两条人工合成的寡核苷酸即正链G2[87]F和负链G2[87]R配成引物对：G2[87]F/ G2[87]R；
1C、将步骤1B的各引物对分别在下列条件下进行退火，退火混合液中分别含有2μl的正向引物，2μl的反向引物，以及7μl 的PCR缓冲液和59μl的水；将退火混合液于65℃水浴反应5分钟后，再于37℃水浴反应45分钟，反应体系中加入400μl 的TE，并与等体积异丙醇充分混匀，室温放置10分钟后，4℃，15,000rpm离心15min，沉淀用质量浓度为75%的乙醇漂洗，干燥后，用10μl 的TE溶解；分别得到在5’端和3’端分别带Sac I位点，或者BspT104 I位点，或者Kpn I位点，或者Bln I位点、或者Sac II位点，或者Xho I位点的下列六条互补双链：P[4]223互补双链、P[4]56互补双链、G1[142]互补双链、G4[208]互补双链、P[8]296互补双链、G2[87]互补双链： 
1D、将携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、Sac II位点及Xho I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，在下列条件下分别用Sac I，BspT104 I，Kpn I，Bln I，Sac II，Xho I酶切：酶切混合液分别含3μl的Sac I，BspT104 I，Kpn I，Bln I，Sac II或Xho I内切酶（15U），以及10μl 的pETP6F DNA，7μl 的10×缓冲液，50μl的水；将酶切混合液于37℃水浴反应3小时，分别得六条下列酶切质粒片段：Sac I酶切质粒片段、BspT104 I酶切质粒片段、Kpn I酶切质粒片段、Bln I酶切质粒片段、Sac II酶切质粒片段、Xho I酶切质粒片段，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化所得六条带有不同切口的酶切质粒片段；
1E、将步骤1D所得六个酶切质粒片段分别与步骤1C所得六个互补双链进行如下相应的配对：
Sac I酶切质粒片段/P[4]223互补双链；
BspT104 I酶切质粒片段/P[4]56互补双链；
Kpn I酶切质粒片段/G1[142]互补双链；
Bln I酶切质粒片段/G4[208]互补双链；
Sac II酶切质粒片段/P[8]296互补双链；
Xho I酶切质粒片段/G2[87]互补双链；
将上述配对的各片段分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，分别得到下列六个重组质粒：
在Sac I位点携带有P4[223]抗原表位基因的重组质粒pETP6F174S/P[4]223；
在BspT104 I位点携带有P[4]56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]56；
在Kpn I位点携带有G1[142]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/G1[142]；
在Bln I位点携带有G4[208]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/G4[208]；
在Sac II位点携带有P[8]296抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[8]296；
在Xho I位点携带有G2[87]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/G2[87]；
1F、将步骤1E得到的六个重组质粒，在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl的步骤1E的对应重组质粒与100μl BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl LB培养液后，在37℃培养30分钟，培养物涂在含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板，培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，分别得到：
携带P4[223]抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]223；
携带P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56；
携带G1[142-152]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G1[142]；
携带G4[208-221]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]；
携带P[8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8] 296；
携带/G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]。
本发明提供的同时携带有P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备：
2A、同上述1A；
2B、同上述1B；
2C、同上述1C；
2D、同上述1D；
2E、同上述1E；
2F、将步骤2E所得重组质粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104 I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带BspT104 I位点的P[4]56互补双链进行连接，得到在Sac I位点和BspT104 I位点携带有对应的P4[223]和P[4]56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56；
2G、将步骤2F所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56用Kpn I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Kpn I位点的G1[142]互补双链进行连接，得到在Sac I位点、BspT104 I位点和Kpn I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56和G1[142]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]；
2H、将步骤2G所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]用Bln I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Bln I位点的G4[208]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I和Bln I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]和G4[208]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/ G4[208]；
2I、将步骤2H所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]用Sac II酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Sac II位点的P[8]296互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I和Sac II位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]、G4[208]和P[8]296抗原表位基因的重组质粒：
pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296；
2J、将步骤2I所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296用Xho I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Xho I位点的G2[87]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I、Sac II和Xho I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296、G2[87]抗原表位基因的重组质粒：pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296/G2[87]；按常规将该重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定；
2K、将步骤2J得到重组质粒，在与1F相同的条件下转化BL21（DE3）感受态细胞得到携带有不同抗原表位的下列重组蛋白：
携带有P[4]223,P[4]56，G1[142]，G4[208],P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP⑥R。
所述步骤1D或2D的携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、Sac II位点及Xho I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F通过下列步骤构建：
1）人工设计下列引物对：
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F： GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
以及下列引物：
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；
2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：
PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；
PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；
PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；
PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；
PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；
PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；
具体是：
在PCR反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，包含30ng模板DNA，1×105 pmol的dNTPs，10× PCR缓冲液10μl，5U Taq DNA聚合酶，60pmol的引物对PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I和Sac I/BamH I双酶切，即：
A、6174F酶切片段制备：酶切反应体系为：3μl 的6174F片段，3μl的 Nde I (15U)，3μl的 Sac I（15U），8μl 的10×缓冲液，63μl的水；将酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得酶切片段，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用Sac I/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接：将6174F和6174R酶切片段与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，得到携带有Sac I位点（gagctc）的VP6编码基因：
3）运用步骤2）的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2）获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I（ttcgaa）位点，得到携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3）所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I（ggtacc）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ggtacc）位点的VP6编码基因；
5）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bln I/BamH I，在步骤4）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ggtacc）位点的VP6编码基因上插入Bln I（cctagg）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点及Bln I（cctagg）位点的VP6编码基因；
6）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac II/BamH I，在步骤5）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点及Bln I（cctagg）位点的VP6编码基因上插入Sac II（ccgcgg）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Sac II（ccgcgg）位点及Sac II（ccgcgg）位点的VP6编码基因；
7）、用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Bln I（ccgcgg）位点及Sac II（ccgcgg）位点的VP6编码基因上插入Xho I（ctcgag）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Bln I（ccgcgg）位点、Sac II（ccgcgg）位点及Xho I（ctcgag）位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸（M）的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子（TGA TAA）组成，其核苷酸序列为：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8）、将步骤7）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F。
所述步骤2）的轮状病毒TB-Chen株为公知的病毒株。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案获得的各个携带轮状病毒不同抗原表位的重组嵌合蛋白，经免疫学Western Blot检测，所述各个重组嵌合蛋白均能与抗轮状病毒全病毒，抗轮状病毒的VP6和抗相应轮状病毒的VP4/VP7抗体发生特异性免疫反应。说明上述各个重组表达的重组嵌合蛋白具有VP6载体蛋白和所插入的轮状病毒抗原表位的良好的免疫反应性，且不具有传染性，没有毒力返祖和肠套叠等副作用，对进一步开发轮状病毒RV重组嵌合疫苗，具有较高的应用价值。
具体实施方式
实施例1
通过下列步骤构建携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、Sac II位点及Xho I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F：
1）人工设计下列引物对：
P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；
P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；
P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；
P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；
P244F： GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；
P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC；
P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA；
P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT；
P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；
P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；
P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；
P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；
以及下列引物：
PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；
PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；
2）以公知的轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：
PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；
PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；
PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；
PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；
PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；
PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；
具体是：
在PCR反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，包含30ng模板DNA，1×105 pmol的dNTPs，10× PCR缓冲液10μl，5U Taq DNA聚合酶，60pmol的引物对PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I和Sac I/BamH I双酶切，即：
A、6174F酶切片段制备：酶切反应体系为：3μl 的6174F片段，3μl的 Nde I (15U)，3μl的 Sac I（15U），8μl 的10×缓冲液，63μl的水；将酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得酶切片段，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用Sac I/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接：将6174F和6174R酶切片段与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，得到携带有Sac I位点（gagctc）的VP6编码基因：
3）运用步骤2）的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2）获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I（ttcgaa）位点，得到携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3）所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I（ggtacc）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ggtacc）位点的VP6编码基因；
5）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bln I/BamH I，在步骤4）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I（ggtacc）位点的VP6编码基因上插入Bln I（cctagg）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点及Bln I（cctagg）位点的VP6编码基因；
6）用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac II/BamH I，在步骤5）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点及Bln I（cctagg）位点的VP6编码基因上插入Sac II（ccgcgg）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Sac II（ccgcgg）位点及Sac II（ccgcgg）位点的VP6编码基因；
7）、用与步骤2）相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6）所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Bln I（ccgcgg）位点及Sac II（ccgcgg）位点的VP6编码基因上插入Xho I（ctcgag）位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ggtacc）位点、Bln I（ccgcgg）位点、Sac II（ccgcgg）位点及Xho I（ctcgag）位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸（M）的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子（TGA TAA）组成，其核苷酸序列为：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8）、将步骤7）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F。
实施例2
本发明提供的携带有P[4]223抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备：
A、根据抗原表位氨基酸序列，设计下列引物：
P[4]223F：CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT；
P[4]223R：CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT；
B、将步骤A的引物进行下列配对：
将VP4抗原表位P[4]223的两条人工合成的寡核苷酸即正链P[4]223F和负链P[4]223R配成引物对：P[4]223F/ P[4]223R；
C、将步骤B的引物对在下列条件下进行退火，退火混合液中含有2μl的正向引物，2μl的反向引物，以及7μl 的PCR缓冲液和59μl的水；将退火混合液于65℃水浴反应5分钟后，再于37℃水浴反应45分钟，反应体系中加入400μl 的TE，并与等体积异丙醇充分混匀，室温放置10分钟后，4℃，15,000rpm离心15min，沉淀用质量浓度为75%的乙醇漂洗，干燥后，用10μl 的TE溶解；得到在5’端和3’端分别带Sac I位点的互补双链：P[4]223互补双链；
D、将携带有Sac I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，在下列条件下用Sac I酶切：酶切混合液含3μl的Sac I内切酶（15U），以及10μl 的pETP6F DNA，7μl的10×缓冲液，50μl的水；将酶切混合液于37℃水浴反应3小时，得酶切质粒片段：Sac I酶切质粒片段、用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化所得酶切质粒片段；
E、将步骤D所得酶切质粒片段与步骤C所得互补双链进行如下相应的配对：
Sac I酶切质粒片段/P[4]223互补双链；
将配对的Sac I酶切质粒片段/P[4]223互补双链与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，得到在Sac I位点携带有P4[223]抗原表位基因的重组质粒：pETP6F174S/P[4]223；
F、将步骤E得到的重组质粒pETP6F174S/P[4]223，在下列条件下转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 的重组质粒pETP6F174S/P[4]223与100μl 的BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl的 LB培养液后，在37℃培养30分钟，培养物涂含有200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板，于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得到携带有P[4]223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223。
实施例3
A、引物设计为：
P[4]56F：CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT；
P[4]56R：CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT；
 B、引物配对为：将VP4抗原表位P[4]56的两条人工合成的寡核苷酸即正链P[4]56F和负链P[4]56R配成引物对：P[4]56F/P[4]56R；
C、同实施例2
D、将携带有BspT104 I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，在与实施例2步骤D相同条件下用BspT104 I位点酶切，得酶切质粒片段：BspT104 I酶切质粒片段；
E、将步骤D所得酶切质粒片段与步骤C所得互补双链进行如下相应的配对：
BspT104 I酶切质粒片段/P[4]56互补双链；
将配对的BspT104 I酶切质粒片段/P[4]56互补双链与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，得到在BspT104 I位点携带有P[4]56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]56；
F、将步骤E得到的重组质粒pETP6F/P[4]56在与实施例2步骤F相同的条件下转化BL21（DE3）感受态细胞，得到携带有P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56。
实施例4
除引物为：
G1[142]F：CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC；
 G1[142]R：CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC；
酶切时将携带有Kpn I（ ggtacc ）位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，用Kpn I酶切外，其余均同实施例2，得到携带G1[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G1[142]。
实施例5
除引物为：
G4[208]F：CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC；
G4[208]R：CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC；
酶切时将携带有Bln I（ ccgcgg ）位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，用Bln I酶切外，其余均同实施例2，得到携带G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]。
实施例6
除引物为：
P[8]296F：GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC；
P[8]296R：GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC；
酶切时将携带有P[8]296位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，用Sac II酶切外，其余均同实施例2，得到携带P[8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8] 296。
实施例7
除引物为：
G2[87]F：TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC；
G2[87]R：TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC；
酶切时将携带有G2[87]位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，用Xho I酶切外，其余均同实施例2，得到携带G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]。
实施例8
携带有P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备：
A、同实施例2步骤A；
B、同实施例2步骤B；
C、同实施例2步骤C；
D、同实施例2步骤D；
E、同实施例2步骤E；
F、将步骤E所得重组质粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104 I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带BspT104 I位点的P[4]56互补双链进行连接，得到在Sac I位点和BspT104 I位点携带有对应的P4[223]和P[4]56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56；
G、将步骤F所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56用Kpn I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Kpn I位点的G1[142]互补双链进行连接，得到在Sac I位点、BspT104 I位点和Kpn I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56和G1[142]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]；
H、将步骤G所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]用Bln I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Bln I位点的G4[208]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I和Bln I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]和G4[208]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/ G4[208]；
I、将步骤H所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]用Sac II酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Sac II位点的P[8]296互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I和Sac II位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]、G4[208]和P[8]296抗原表位基因的重组质粒：
pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296；
J、将步骤I所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296用Xho I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Xho I位点的G2[87]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I、Sac II和Xho I位点携带有对应的P4[223]、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296、G2[87]抗原表位基因的重组质粒：pETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296/G2[87]；按常规将该重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定；
K、将步骤J得到的重组质粒，在与实施例2步骤F相同的条件下转化BL21（DE3）感受态细胞，得到携带有P[4]223,P[4]56，G1[142]，G4[208],P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R。
本发明所得各个携带轮状病毒不同抗原表位的重组嵌合蛋白，经下列免疫学Western Blot检测：
1）将携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223，携带有轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56，携带有轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G1[142]，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]，携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]，和同时携带P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]六个抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R，以及用作对照的重组轮状病毒NSP2蛋白和用作对照的牛血清白蛋白，各取2μg分别溶于20μl水，分别加入5μl 5×变性缓冲液，混匀后，在100℃变性5min；
2）将上述1）的变性蛋白样品分别用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(10% SDS-PAGE)分离，并在电压15V、电流50mA的条件下，电泳转印25 min，转移到PVDF膜上；将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS/T液中于4°C封闭过夜；
3）用PBS/T洗膜5次，分别加入抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体（5%脱脂奶粉1:400稀释），或抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），或抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），或抗重组轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），或抗重组轮状病毒VP7蛋白豚鼠免疫血清抗体（1%脱脂奶粉1:400稀释），于37℃ 孵育1.5 h；用PBS/T液洗膜5次，每次5 min；
4）加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG（1:2,000如上稀释），于37℃ 孵育1 h；用PBS/T漂洗5次，DAB显色；显色后，用蒸馏水漂洗膜，终止显色，观察并分析结果如下：
携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223，携带有轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56，携带有轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G1[142]，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]，携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]，均能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，均能与抗轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，不能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。
携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223，携带有轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56，和携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，均能与轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。
携带有轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G1[142]，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]，均能与轮状病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应。
同时携带P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]六个抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R，能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与抗轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与轮状病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应，不能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。
用作阴性对照的重组轮状病毒NSP2蛋白只能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应。
用作阴性对照的牛血清白蛋白，不能与上述所有检测抗体发生特异性免疫反应。
结论：上述所有的重组嵌合蛋白均具有载体蛋白和所携带的抗原表位特异的抗原反应性。
序列表
携带轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
P[4]223抗原表位的氨基酸序列：
Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
携带轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
P[4]56抗原表位的氨基酸序列：
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。
携带轮状病毒G1[142]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
G1[142]的氨基酸序列：Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。
携带轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
G4[208]的氨基酸序列：Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp。
携带轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
P[8]296的氨基酸序列：
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。
    携带轮状病毒G2[87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列：
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
G2[87]的氨基酸序列：
Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr。
携带有轮状病毒P[4]223、P[4]56，G1[142]，G4[208],P[8]296和G2[87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列： 
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
引物：
P[4]223F：CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT；
P[4]223R：CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT；
P[4]56F：CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT；
P[4]56R：CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT；
 G1[142]F：CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC；
 G1[142]R：CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC；
G4[208]F：CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC；
G4[208]R：CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC；
P[8]296F：GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC；
P[8]296R：GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC；
G2[87]F：TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC；
G2[87]R：TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC；
携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I（ ggtacc ）位点、Bln I（ ccgcgg ）位点、Sac II（ ccgcgg ）位点及Xho I（ ctcgag ）位点的VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列：
   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat
 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga
 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca
 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg
 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg
 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt
 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa
 501 tagatcacaa cctgcgcat g agctc atggg tacaatgtgg ttgaatgcag
 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt a ttcgaa cat acagcaattt
 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct
 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg
 701 at ggtacc ac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc
 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggca cc
 801  tagg tttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat
 851 ttcaattgat gaga ccgcgg  accccatcag tcgcagca ct cgag catcat
 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt
 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac
1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg
1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg
1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa。
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备
<130> 疫苗开发
<140> 专利申请号
<141> 专利申请日
<160> 393
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                55                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn
                170                 175                 180
Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn
                185                 190                 195
Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile
                200                 205                 210
Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr
                215                 220                 225
Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro
                230                 235                 240
Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro
                245                 250                 255
Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn
                260                 265                 270
Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile
                275                 280                 285
Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met
                290                 295                 300
Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr
                305                 310                 315
Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val
                320                 325                 330
Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val
                335                 340                 345
Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly
                350                 355                 360
Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu
                365                 370                 375
Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met
                380                 385                 390
Leu Val Lys
        393
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro
1               5                   10      12
<210> 3
<211> 397
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                70                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg
                215                 220                 225
Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg
                230                 235                 240
Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp
                245                 250                 255
Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu
                260                 265                 270
Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg
                275                 280                 285
Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser
                290                 295                 300
Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu
                305                 310                 315
His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile
                320                 325                 330
Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn
                335                 340                 345
Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val
                350                 355                 360
Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser
                365                 370                 375
Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser
                380                 385                 390
Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
                395     397
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln
1               5                   10                  15
Pro
16
<210> 5
<211> 393
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                200                 205                 210
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                215                 220                 225
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp
                230                 235                 240
Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro
                245                 250                 255
Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn
                260                 265                 270
Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile
                275                 280                 285
Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met
                290                 295                 300
Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr
                305                 310                 315
Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val
                320                 325                 330
Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val
                335                 340                 345
Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly
                350                 355                 360
Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu
                365                 370                 375
Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met
                380                 385                 390
Leu Val Lys
        393
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met
1               5                   10  11
<210> 7
<211> 395
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                  160                165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                200                 205                 210
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                215                 220                 225
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe
                230                 235                 240
Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu
                245                 250                 255
Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr
                260                 265                 270
Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly
                275                 280                 285
Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln
                290                 295                 300
Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His
                305                 310                 315
Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu
                320                 325                 330
Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr
                335                 340                 345
Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro
                350                 355                 360
Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser
                365                 370                 375
Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg
                380                 385                 390
Ser Met Leu Val Lys
                395
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp
1               5                   10          13
<210> 9
<211> 400
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 1400                150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                200                 205                 210
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                215                 220                 225
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe
                230                 235                 240
Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu
                245                 250                 255
Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly
                260                 265                 270
Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln
                275                 280                 285
Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu
                290                 295                 300
Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala
                305                 310                 315
Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu
                320                 325                 330
Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met
                335                 340                 345
Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val
                350                 355                 360
Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr
                365                 370                 375
Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr
                380                 385                 390
Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
                395                 400
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln
1               5                   10                  15
Val Thr Ala
        18
<210> 11
<211> 397
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp
                170                 175                 180
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser
                185                 190                 195
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                200                 205                 210
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                215                 229                 225
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe
                230                 235                 240
Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu
                245                 250                 255
Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly
                260                 265                 270
Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln
                275                 280                 285
Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu
                290                 295                 300
Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu
                305                 310                 315
His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile
                320                 325                 330
Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn
                335                 340                 345
Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val
                350                 355                 360
Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser
                365                 3700                375
Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser
                380                 385                 390
Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
                395     397
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr
1               5                   10                  15
<210> 13
<211> 475
<212> PRT
<213> 基因表达
<400> 1
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg
                5                   10                  15
Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu
                20                  25                  30
Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu
                35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser
                50                  55                  60
Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
                65                  70                  75
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp
                80                  85                  90
Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln
                95                  100                 105
Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser
                110                 115                 120
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr
                125                 130                 135
Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe
                140                 145                 150
Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr
                1555                160                 165
Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn
                170                 175                 180
Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn
                185                 190                 195
Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp
                200                 205                 210
Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser
                215                 220                 225
Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu
                230                 235                 240
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser
                245                 250                 255
Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp
                260                 265                 270
Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro
                275                 280                 285
Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn
                290                 295                 300
Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn
                305                 310                 315
Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile
                320                 325                 330
Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met
                335                 340                 345
Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp
                350                 355                 360
Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu
                365                 370                 375
Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn
                380                 385                 390
Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu
                395                 400                 405
Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met
                410                 415                 420
Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val
                425                 430                 435
Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr
                440                 445                 450
Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr
                4555                460                 465
Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
                470                 475    
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
cccaccaatt caaaatacta gaaatgtagt tccagagct                          39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ctggaactac atttctagta ttttgaattg gtgggagct                          39
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
cgaatgattc aactacagtg gaaccagttt tagatggtcc ttatcaacct t            51
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
cgaaggttga taaggaccat ctaaaactgg ttccactgta gttgaatcat t            51
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
catgaaatat gaccaaagtc ttaaattaga tatgggtac                          39
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ccatatctaa tttaagactt tggtcatatt tcatggtac                          39
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ctaggcaaac gacaaataca gctacttttg aaacagttgc tgatc                   45
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ctaggatcag caactgtttc aaaagtagct gtatttgtcg tttgc                   45
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ggaaggcagc aaattatcaa tataattact tacgtgacgg tgaacaagta accgcaccgc   60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
ggtgcggtta cttgttcacc gtcacgtaag taattatatt gataatttgc tgccttccgc   60
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
tcgaggcaga agctaaaaat gagatttcag atgatgaatg ggaaaatact c            51
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
tcgagagtat tttcccattc atcatctgaa atctcatttt tagcttctgc c            51
<210> 26
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工基因序列
<400> 1
atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa aattgtcgaa   60
ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat ttaatcaaat gataattact  120
atgaatggaa atgaatttca aactggagga attggtaatc taccaaccag aaattggagt  180
tttgattttg gtttacttgg aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact  240
gcgcgtaaca caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg  300
gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag aaaactatca  360
gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg aatacataga aaactggaac  420
ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt acatttcata aaccaaacat ctttccatat  480
tcagcttcat ttacgttaaa tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg  540
ttgaatgcag gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt  600
gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct tttaccagat  660
gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg atggtaccac atggtatttt  720
aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc gaagtagaat ttctattgaa tggacagata  780
ataaatactt atcaggcacc taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt  840
agattatcat ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcgcagcact cgagcatcat  900
gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt gcttgctgat  960
gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac aagaatatgc aataccagtt 1020
gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg actgatttga ttactaacta ctcaccatct 1080
agagaggata atttacaacg tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa 1140
tgataa                                                            1146
 

Claims (1)

1.一种同时携带有轮状病毒P[4]223、P[4]56，G1[142]，G4[208],P[8]296和G2[87]抗原表位重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列： 
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ala Lys Asn Glu Ile Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。
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