CN108273054A - 猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用。所述的双价疫苗中，其有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。实验证明，本发明的双价疫苗经过加强免疫后能够诱导机体产生高水平的针对O型和A型口蹄疫病毒的中和抗体，保护免疫猪能够抵抗O型和A型口蹄疫强毒攻击，均5/5保护，即保护率为100％。本发明的提出为保障我国畜牧业健康可持续发展，实现口蹄疫国家中长期防控目标提供了技术支撑和疫苗储备。

Description

猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，影响恶劣。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国将其列为一类动物传染病。为了净化和消灭口蹄疫，我国制定了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》和《国家口蹄疫防控计划(2016-2020)》，把FMD被列为优先解决的动物疫病之一。要实现此目标，必须要有安全、高效、可鉴别诊断的疫苗，而灭活疫苗始终存在病毒逃逸的生物安全隐患，多次免疫后难以区分免疫动物和感染动物，不利于口蹄疫净化，也不利于我国活畜及产品出口。因此，采用分子生物学技术研制安全、高效的FMD基因工程新型疫苗是实现国家口蹄疫防治规划的技术保障和物质基础，也是提高我国口蹄疫防控能力，保障我国畜牧业健康可持续发展，推动农业产业结构调整，促进农民增收，提高活畜及产品的出口能力，提升我国的政治声誉等的重要途径，符合国家兴农富国的战略需求。

近年来，我国口蹄疫流行态势也发生了变化，由单一血清型(O型)发展为多个血清型(O、Asia 1和A型)并存的复杂局面。尽管经过几年的强制免疫，Asia 1连续一年以上没有出现新的病例，农业部宣布Asia 1退出强制免疫。但作为素有FMDV“放大器”之称的猪，从过去仅感染O型FMD发展到既感染O型FMD也感染A型FMD。更为严重的是，O型出现了三个拓扑型，A型2个拓扑型均为传入性的，拓扑型间抗原变异较大，意味着要针对不同拓扑型的毒株研制新的灭活疫苗。因此，通过经典方法研制口蹄疫灭活疫苗已经不能满足新形势下口蹄疫防控的要求。

利用新技术快速研制安全高效的口蹄疫新型疫苗迫在眉睫，不仅可以大大缩短疫苗研制的周期，快速投放市场用于紧急防控，而且可以根据疫情需要，做到“料敌先机”，提前研制疫苗做到精准防控，防止新毒株传入我国。此外，新疫苗的研究还将引领动物疫苗研发新方向，建立新的技术领域，促进动物疫苗的升级换代，带动新型疫苗生产企业快速发展，形成新的经济增长点。为保障我国畜牧业健康可持续发展，实现口蹄疫国家中长期防控目标提供技术支撑和疫苗储备。

利用反向疫苗学技术研制口蹄疫表位疫苗已成为可能，本实验室已经利用该技术研制出了多种口蹄疫表位疫苗均具有较好的免疫效果。为了进一步提升表位疫苗的免疫效果，减小与灭活疫苗的差距。本研究对表位进行了重新的设计和/或改进，改进了表位抗原的展示方式。尤其是充分利用了宿主动物免疫球蛋白(IgG)Fc能与免疫细胞表面的Fc受体结合或补体受体的细胞结合，激发免疫细胞产生免疫效应的免疫学功能，提升表位疫苗的免疫效果。如Fc能与许多细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、中性粒了细胞和血小板等)表面Fc受体结合，发挥调理作用，增强巨噬细胞的吞噬作用；其次，Fc与细胞表面Fc受体结合后能够活化细胞，发挥细胞毒作用。

基于IgG的Fc具有良好的免疫学功效，本发明以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型、O型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制猪口蹄疫A型、O型Fc多肽双价疫苗。为了充分发挥表位抗原和Fc的免疫学功能，最大程度确保融合蛋白的天然形式，本发明还通过筛选原核表达系统，优化表达条件，确保融合蛋白以可溶性形势表达。将纯化的O型和A型多表位Fc融合蛋白按照相应比例混合后与Montanide ISA 206佐剂配伍制备疫苗，采用加强免疫方式免疫猪，通过特异性抗体效价和攻毒保护实验评价疫苗对猪的免疫效力。结果显示，经过重新设计抗原表位，筛选表达系统，优化表达条件，实现了Fc展示抗原表位重组蛋白的可溶性表达，最大程度展示了抗原表位。实验证明，本发明的二价疫苗经过加强免疫后能够诱导机体产生高水平的针对O型和A型口蹄疫病毒的中和抗体，保护免疫猪能够抵抗O型和A型口蹄疫强毒攻击，均5/5保护，即保护率为100％。

发明内容

本发明的目的在于提供猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，所述疫苗的有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明所述的疫苗中，优选的，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的质量比为2：1。

在本发明所述的疫苗中，优选的，还包含佐剂。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)获得编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；

(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别插入原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，命名为pMEO-Fc和pMEA-Fc，-20℃保存备用；

(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒pMEO-Fc和pMEA-Fc分别转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物加入新制备的含卡那霉素的无菌LB培养液中，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，离心收获培养物；

(4)分别向pMEO-Fc和pMEA-Fc的原培养物中加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理，离心收集上清，弃沉淀；

(5)从收集的上清中获得纯化后的蛋白，即猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽；

(6)将纯化后的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽混合后，加入油佐剂乳化成疫苗制剂。

其中，优选的，编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.4所示。

其中，优选的，将猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽按照2:1(w/w)混合后，与油佐剂Montanide ISA206按照1:1(w/w)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒O型Fc多肽100μg，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。

其中，优选的，步骤(5)中使用Ni-NTA组氨酸纯化柱进行蛋白的纯化。

更进一步的，本发明还提出了所述的疫苗在制备预防猪口蹄疫病毒O型以及A型药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪A型口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制得到了猪口蹄疫病毒A型Fc多肽。

2、公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开了一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原，以及由该抗原制备得到的疫苗。但该申请所公开的猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的缺点在于其在大肠杆菌中以包涵体形式表达，后期需要经变性处理，甚至还需要复性处理，工艺复杂，回收率低、损失大，成本较高。为了进一步提升表位疫苗的免疫效果，本发明利用分子生物学、生物信息学、生物化学结合蛋白质工程等多种技术对猪口蹄疫病毒O型广谱多表位基因进行改造和修饰，同时选择原核表达系统，优化表达条件，实现了猪口蹄疫病毒O型广谱多表位基因重组蛋白的高通量可溶性表达，通过亲和层析纯化技术获得了高纯度的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽。

3、将上述纯化后的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽混合后，加入油佐剂乳化成疫苗制剂。实验证明，本发明的双价疫苗经过加强免疫后能够诱导机体产生高水平的针对O型和A型口蹄疫病毒的中和抗体，保护免疫猪能够抵抗O型和A型口蹄疫强毒攻击，均5/5保护，即保护率为100％。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的设计与合成

1、猪口蹄疫病毒A型多表位基因的设计

根据猪口蹄疫病毒A型3个拓扑型毒株(AF/72，A/HB/WH/09，A/GDMM/2013)的主要抗原基因，选择VP1基因编码区140-160氨基酸序列和200-213氨基酸序列作为抗原表位，然后将其选择合适的顺序进行串联，即140-160(A/GDMM/2013)-GGSSGG-140-160(A/HBWH/09)-GPLS-140-160(AF/72)-GGGS-200-213(A/GDMM/2013)，为了防止串联表位后形成新的表位，在相邻表位间引入间隔子序列以保证表位的独立性，间隔子分别为GGSSGG、GPLS和GGGS。得到的猪口蹄疫病毒A型多表位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、基因克隆及其蛋白表达，纯化

将口蹄疫病毒A型多表位基因连接至猪IgG的Fc基因的N端，构建融合基因MEA-Fc，融合基因MEA-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。为了保证新合成基因的定向插入，在融合基因的5′-端和3′-端引入特异性酶切位点BamHI和XhoI，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成的融合基因和原核表达载体pET-28a(+)分别用BamHI和XhoI酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化pET-28a(+)，构建重组表达质粒pMEA-Fc，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过BamHI和XhoI双酶切和序列测定确定阳性重组子，-20℃保存备用。

3、重组蛋白的表达及其生物活性鉴定

将阳性重组表达质粒pMEA-Fc转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模表达重组蛋白，即从LAB平板挑单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于30℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4-0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG后于30℃诱导表达4-6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，超声破碎(冰浴，30min)，20000g离心20min收集上清(4℃)，弃沉淀。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白MEA-Fc大小与预期相符，能与FMDV(A型)灭活疫苗免疫牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白，即猪口蹄疫病毒A型Fc多肽MEA-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，具有生物活性。

实施例2猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的基因的克隆及其蛋白表达，纯化

1、猪口蹄疫病毒O型广谱多表位融合基因的优化

利用生物信息学密码优化软件结合免疫学和生物化学等多学科技术，对公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开的编码猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的核苷酸序列进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，命名为MEO-Fc。对优化前后基因进行序列比对分析(Clustal W软件和DNAMEN Version 9)，结果显示，优化前后基因序列在1-684bp区域发生了较大的突变，IgG的Fc段基本上没有发生大的突变，整个基因同源性为77.26％，优化后GC％在基因中的分布和含量更趋于合理；整个基因核苷酸突变顺序由高到低依次是T→C为92个、A→G为60个、C→G为55个、A→C为43个、G→T为27个。编码的氨基酸序列优化前后没有发生任何的突变，同源性为100％，保证了其抗原性未发生改变。

2、编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的基因的克隆及其蛋白表达，纯化

为了保证定向插入，在SEQ ID NO.4所示的融合基因MEO-Fc的5'-端和3'-端引入特异性酶切位点如BamHI和XhoI，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的基因MEO-Fc插入原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pMEO-Fc，转化JM109感受态进行阳性筛选，通BamHI和XhoI双酶切和序列测定确定阳性重组子，-20℃保存备用。

重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：将阳性重组表达质粒pMEO-Fc转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模表达重组蛋白，即从LAB平板挑单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1％(v/v)加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集上清(4℃)，弃沉淀。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白MEO-Fc大小与预期相符，能与FMDV(O型)灭活疫苗免疫牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白，即猪口蹄疫病毒O型Fc多肽MEO-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，具有生物活性。

实施例3、猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗的制备

1、疫苗制备

将实施例1和2分别纯化的两种重组蛋白MEA-Fc以及MEO-Fc经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，将两种蛋白按照MEA-Fc：MEO-Fc＝2:1(w/w)混合后，与油佐剂Montanide ISA206(Seppic,France)按照1:1(w/w)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒O型Fc多肽MEO-Fc 100μg，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽MEA-Fc 200μg。

2、免疫效力试验：

实验用猪为体重40kg左右，O型和A型口蹄疫病毒抗体<1:4(液相阻断ELISA结果)，3ABC蛋白抗体阴性(3ABC抗体化学发光检测试剂盒结果)。用本发明的双价疫苗按每头份1ml经肌肉途径接种10头猪(含MEO-Fc 100μg，MEA-Fc 200μg)，作为实验组。初免21天后，所有猪用同等剂量的疫苗加强免疫1次。加强免疫后14天，连同条件相等6头对照猪在中国农业科学院兰州兽医研究所ABSL-3实验室。其中5头实验组猪连同3头对照组猪，按照国家标准用A型口蹄疫病毒(A/GDMM/2013毒株)进行攻击，另外5头实验组猪连同3头对照组猪，按照国家标准用O型口蹄疫病毒(O/Mya98/BY/2010毒株)进行攻击，连续观察10天，计算保护率，评价疫苗效力。

结果显示，通过优化密码子、重新构建重组质粒、优化诱导及培养条件后，实现了O型和A型口蹄疫多表位Fc融合蛋白的可溶性表达。疫苗免疫猪后能够诱导高水平的O型和A型口蹄疫特异性抗体(表1)；攻毒后实验组均5/5保护，对照组均3/3发病(表2)。提示这种以可溶性形式表达的蛋白保证了表位抗原和Fc的免疫功能，显著提升了表位疫苗的免疫效力。此外，用本发明的双价疫苗免疫猪后能够产生针对A型和O型的保护性中和抗体，说明O型口蹄疫多表位Fc融合蛋白和A型口蹄疫多表位Fc融合蛋白混合使用不存在相互干扰。

表1猪口蹄疫O型、A型多表位双价疫苗免疫猪后血清抗体效价

表2猪口蹄疫O型、A型多表位双价疫苗免疫猪后攻毒保护实验结果

此外，疫苗免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现不良反应，食欲正常，精神状态良好，说明疫苗对猪十分安全。

总之，本发明实现了猪口蹄疫O型、A型多表位Fc重组蛋白的可溶性表达，保证了抗原表位和Fc的天然形式和免疫学功能。试制的疫苗不仅具有良好的免疫功效，而且十分安全，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国猪O型、A型口蹄疫防控提供物质储备和技术支撑。

对比例

为了说明优化后的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽相较于优化前的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽具有更好的免疫效果，本发明进行了如下对比实验：

1、疫苗制备

实验组疫苗：将实施例2纯化的重组蛋白MEO-Fc经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，与油佐剂Montanide ISA206(Seppic，France)按照1:1(w/w)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒O型Fc多肽MEO-Fc200μg。

对照疫苗：按照CN102675471A公开的方法制备得到纯化后的重组抗原以及纯化后的3D蛋白全长，分别经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，纯化的3D蛋白片段与重组抗原按1：2(V/V)配置后，加入等体积的油佐剂Montanide ISA206(Seppic，France)乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含重组抗原200μg，3D蛋白全长100μg。

2、免疫效力试验：

实验用猪为体重40kg左右，O型口蹄疫病毒抗体<1:4(液相阻断ELISA结果)，3ABC蛋白抗体阴性(3ABC抗体化学发光试剂盒结果)。实验组疫苗按每头份1ml经肌肉途径接种5头猪(含200μg可溶性抗原)，对照疫苗免疫5头猪，按每头份1ml经肌肉途径接种5头猪(含200μg抗原+100μg 3D)。初免21天后，所有猪用同等剂量的疫苗加强免疫1次。加强免疫后14天，测定每头猪的抗体效价，连同条件相等3头空白对照猪在中国农业科学院兰州兽医研究所ABSL-3实验室，按照国家标准用O型口蹄疫病毒(O/Mya98/BY/2010毒株)对猪进行攻击，连续观察10天，统计保护率。

两种疫苗猪体免疫效力实验比对结果如表3所示。

表3两种疫苗猪体免疫效力实验比对结果

组别	免疫次数	免疫期(天)	抗体效价(LPB-ELISA)	保护率(％)
					对照疫苗	2	35	1:360 1:90 1:90 1:128 >1:512	5/5(100％)
实验组疫苗	2	35	1:360 1:360 >1:512 >1:512 >1:512	5/5(100％)
					空白对照	0	35	<1:4 <1:4 <1:4	0/3(0)

从上述结果可以看出，通过优化密码子、重新构建重组质粒、优化诱导及培养条件后，实现了靶标蛋白的可溶性表达及纯化。尽管两种疫苗均能保护免疫猪抵抗强毒攻击，5/5保护。与对照疫苗相比，用可溶性蛋白试制的疫苗免疫猪后能够诱导更高水平的口蹄疫特异性抗体；而且成份更为简单，即不含3D蛋白成份，降低了疫苗总蛋白含量，在提高免疫效力的同时降低了疫苗成本。此外，可溶性蛋白只需直接纯化就可以使用，而包涵体蛋白经变性处理，甚至还需要复性处理，工艺复杂，回收率低、损失大，成本高。再者，疫苗总蛋白含量降低有助于减轻副反应，即免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示改进后的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗免疫原性更强，免疫猪后产生的特异性抗体效价更高，个体间差异最小，接种后对免疫动物安全无害。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用

<130> KLPI171089

<160> 5

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 318

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus

<400> 1

aagtactccg cacctcaaaa ccggcgaggt gactcgggtc ctctcgcggc gagactcgct 60

gcacagctcc ctgcctccgg tggttctagc ggcggtaagt actctgcgcc tgcaacacgg 120

cgaggtgact tggggtctct cgcggcgagg ctcgccgcac agcttcctgc ctccggcccg 180

ctgagcaagt actccacagg taatgcaggc agacggggtg atctagggtc tcttgcggcg 240

agggtcgccg cacagcttcc cgctggcggt ggcagcagac acaagcagaa aattattgcc 300

cctgcaaagc agctcctg 318

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 2

aagtactccg cacctcaaaa ccggcgaggt gactcgggtc ctctcgcggc gagactcgct 60

gcacagctcc ctgcctccgg tggttctagc ggcggtaagt actctgcgcc tgcaacacgg 120

cgaggtgact tggggtctct cgcggcgagg ctcgccgcac agcttcctgc ctccggcccg 180

ctgagcaagt actccacagg taatgcaggc agacggggtg atctagggtc tcttgcggcg 240

agggtcgccg cacagcttcc cgctggcggt ggcagcagac acaagcagaa aattattgcc 300

cctgcaaagc agctcctggg tggctctagc ggcggtgggc cctcggtctt catcttccct 360

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cagacccccg aggtcacgtg cgtggtggtg 420

gacgtcagca aggagcacgc cgaggtccag ttctcctggt acgtggacgg cgtagaggtg 480

cacacggccg agacgagacc aaaggaggag cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagc 540

gtcctgccca tccagcacca ggactggctg aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac 600

aacgtagacc tcccagcccc catcacgagg accatctcca aggctatagg gcagagccgg 660

gagccgcagg tgtacaccct gcccccaccc gccgaggagc tgtccaggag caaagtcacc 720

gtaacctgcc tggtcattgg cttctaccca cctgacatcc atgttgagtg gaagagcaac 780

ggacagccgg agccagaggg caattaccgc accaccccgc cccagcagga cgtggacggg 840

accttcttcc tgtacagcaa gctcgcggtg gacaaggcaa gatgggacca tagagaaaca 900

tttgagtgtg cggtgatgca cgaggctctg cacaaccact acacccagaa gtccatctcc 960

aagactccgg gtaaa 975

<210> 3

<211> 325

<212> PRT

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 3

Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Ser Gly Pro Leu 15

Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ser Ser 30

Gly Gly Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly 45

Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Pro 60

Leu Ser Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu 75

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Gly Gly 90

Gly Ser Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu 105

Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 120

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val 135

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln 150

Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr 165

Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 180

Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe 195

Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg 210

Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225

Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr 240

Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val 255

Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg 270

Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr 285

Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Arg Glu Thr 300

Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315

Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys 325

<210> 4

<211> 1006

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 4

aaatacgatg agagcccggt gaccaacgtg cgtggtgatc tgcaagttct ggcccagaaa 60

gccgcccgca cactgccggg tggtcctagc ggcggtaaat atgccggcgg tagcctgccg 120

aatgttcgcg gtgacctgca agtgctggcc cagaaagcag cacgcccgtt accgggtggt 180

agtagcggcg gtaaatatag cgatgcacgc gtgagcaacg tgcgcggtga tctgcaggtg 240

ctggcccaaa aagccgaacg tgcactgcct ggtggcagta gtggcggccg ccataaacag 300

aaaatcgtgg ccccggtgaa acagttactg accgcagcac gtgcaaccga attcaagtac 360

gacgagagtc cggtgaccaa tgtgcgcggt gacctgcaag ttctggcaca aaaagcagca 420

cgtaccctgc cgggtggtag tagcggcggc aaatacgcag gtggcagctt accgaacgtg 480

cgcggtgacc tgcaagttct ggcacaaaaa gccgcccgtc ctttacctgg tggcagcagc 540

ggtggcaaat acagtgatgc ccgcgtgagc aatgtgcgtg gcgacctgca agttctggca 600

caaaaagccg agcgtgcact gccgggcggc agtagtggtg gtcgccacaa acagaagatc 660

gtggcaccgg tgaagcagct gctgaaatta ggtggtagca gcggcggtgg cccgagcgtg 720

ttcattttcc cgccgaaacc taaggacacc ctgatgatca gccagacccc ggaagtgacc 780

tgcgttgtgg ttgacgttag caaagagcac gccgaagtgc agttcagttg gtatgtggat 840

ggtgtggagg tgcacaccgc agaaacacgc ccgaaagaag aacagtttaa cagcacctac 900

cgcgtggtta gcgtgctgcc gatccagcac caggattggc tgaaaggcaa agaatttaaa 960

tgcaaagtga ataatgtgga tctgccggcc ccgattacac gcacca 1006

<210> 5

<211> 335

<212> PRT

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 5

Lys Tyr Asp Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln 15

Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Pro Ser 30

Gly Gly Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp 45

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly 60

Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val Arg 75

Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro 90

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro 105

Val Lys Gln Leu Leu Thr Ala Ala Arg Ala Thr Glu Phe Lys Tyr 120

Asp Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu 135

Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly 150

Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln 165

Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Ser Ser 180

Gly Gly Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val Arg Gly Asp 195

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Gly Gly 210

Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys 225

Gln Leu Leu Lys Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His 270

Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 285

Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 300

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys 315

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala 330

Pro Ile Thr Arg Thr 335

Claims (8)

1.一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的质量比为2：1。

3.如权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述的疫苗中还包含佐剂。

4.一种制备权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获得编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；

(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别插入原核表达载体pET-28a中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，命名为pMEO-Fc和pMEA-Fc，-20℃保存备用；

(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒pMEO-Fc和pMEA-Fc分别转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物加入新制备的含卡那霉素的无菌LB培养液中，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，离心收获培养物；

(4)分别向pMEO-Fc和pMEA-Fc的原培养物中加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理，离心收集上清，弃沉淀；

(5)从收集的上清中获得纯化后的蛋白，即猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽；

(6)将纯化后的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽混合后，加入油佐剂乳化成疫苗制剂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽按照2:1(w/w)混合后，与油佐剂Montanide ISA206按照1:1(w/w)乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒O型Fc多肽100μg，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中使用Ni-NTA组氨酸纯化柱进行蛋白的纯化。

8.权利要求1-3任一项所述的疫苗在制备预防猪口蹄疫病毒O型以及A型药物中的应用。