CN113855795B

CN113855795B - 禽戊型肝炎病毒orf2亚单位疫苗

Info

Publication number: CN113855795B
Application number: CN202111351847.0A
Authority: CN
Inventors: 赵鹏; 赵慧; 王一新; 常爽
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-11-16
Also published as: CN113855795A

Abstract

本发明公开了一种禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗，其包括第一重组蛋白和第二重组蛋白；所述第一重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用两株不同来源且差异较大的病毒，通过原核表达制备病毒的ORF2蛋白，将其混合制备成亚单位疫苗，解决了目前临床防治禽戊型肝炎病毒存在的困境，也进一步扩大了疫苗的抗体保护范围。

Description

禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗。

背景技术

禽戊型肝炎(Avian hepatitis E)是由禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的。主要导致30-72周龄的蛋鸡和肉鸡的死淘率升高和产蛋率下降。发病鸡临床症状主要表现为肝脾肿大、腹腔积液、卵巢退化等，目前在世界范围内的鸡群中广泛流行和存在。肉鸡和蛋鸡均能够被感染，主要通过粪口途径进行传播。

禽戊型肝炎病毒属于肝炎病毒科，正戊肝炎病毒属B种。是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈圆球状，为二十面体对称结构，直径约为27～32nm。a-HEV基因组约为6.4-7.2kb，包括三个开放阅读框(open reading frame,ORF)和5'和3'末端两个短的非编码区，分别为ORF1、ORF2和ORF3。其中，ORF2与病毒感染入侵宿主细胞有着密切的联系，在衣壳蛋白组装的过程中发挥作用，也是制备亚单位疫苗的良好表位。世界范围内分离到的a-HEV主要流行4个基因型：澳大利亚和韩国的基因1型、美国的基因2型、中国和欧洲的基因3型、匈牙利的基因4型(Sridhar etal，2017)。经调查研究表明，基因3型和4型为人畜共患病原体，基因1型和2型主要局限于人类，曾导致大规模戊型肝炎的爆发。

目前，avian HEV尚无高效体外细胞培养体系，这严重制约了病毒的培养和疫苗研制，因此迄今还未开发出商品化的灭活疫苗或者弱毒活疫苗。有别于灭活疫苗和病毒载体疫苗，重组蛋白亚单位疫苗则是通过基因工程的方式在工程细胞内表达纯化病原体抗原蛋白，然后制备成疫苗。这是一种新技术路线研制的疫苗，可以在缺乏有效病毒培养体系时发挥必要替代作用。

专利CN110013549A公开了一种戊型肝炎亚单位疫苗，其通过筛选到一株免疫原性好的戊型肝炎病毒(QD07株)，从中获得了一种新型的戊型肝炎病毒抗原蛋白，将其在大肠杆菌中进行可溶性表达，制备亚单位疫苗。但是，由于avian HEV的高变性，使得不同菌株同源性较低，很难实现只免疫单一疫苗即可达到较好保护效果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗。本发明利用两株不同来源且差异较大的病毒，通过原核表达制备病毒的ORF2蛋白，将其混合制备成亚单位疫苗，解决了目前临床防治禽戊型肝炎病毒存在的困境，也进一步扩大了疫苗的抗体保护范围。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗，其包括第一重组蛋白和第二重组蛋白；

所述第一重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述第一重组蛋白和第二重组蛋白的重量比为1:1。

进一步的，所述禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗还包括佐剂。

优选的，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂中的一种或几种。

更优选的，所述佐剂弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

本发明的第二方面，提供上述禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将第一重组蛋白和第二重组蛋白按重量比1:1混合均匀，得到抗原组合物；

(2)将抗原组合物与佐剂混合，乳化。

本发明的第三方面，提供上述禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗在制备预防或治疗由禽戊型肝炎病毒引起的疾病的制品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次选择两株不同来源且差异较大的禽戊型肝炎病VaHEV株和YT-aHEV株作为模板，并进行重组表达得到ORF2重组蛋白；将VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白混合制备得到禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗。本发明制备的禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗有效解决了目前临床防治禽戊型肝炎病毒存在的困境，提高了免疫后机体的抗体产生效果。

附图说明

图1：病鸡感染VaHEV株后剖检图；图中，A:肝脏肿大；B:肝脏出血肿大；C:脾脏肿大。

图2：ORF2蛋白的表达及纯化；图中：

A：ORF2扩增凝胶电泳图；M:marker；1，2：YT-aHEV ORF2扩增片段：3，4：VaHEV ORF2扩增片段；

B：ORF2重组质粒的酶切片段；M:marker；1:EcoR I和Xhol I酶切后的YT-aHEVORF2重组质粒和PMD18-T载体；

C：ORF2蛋白胶SDS-PAGE结果图；M：marker；1：VaHEV ORF2上清；2：VaHEV ORF2包涵体；3:YT-aHEV ORF2上清；4：YT-aHEV ORF2包涵体；

D：YT-aHEV ORF2蛋白纯化图；M:marker；1.2.3:洗脱液；4.5.6：洗涤液；7.8.9.10：上样流穿液；红色框内为目的条带。

图3：感染YT-aHEV的LMH细胞中蛋白表达情况的间接免疫荧光检测结果；实验鸡血清抗体50倍稀释(左)；鸡血清抗体100倍稀释(右)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，由于avian HEV的高变性，使得不同菌株同源性较低，很难实现只免疫单一疫苗即可达到较好保护效果。

基于此，本发明选择两株不同来源且差异较大的禽戊型肝炎病毒，混合制备了亚单位疫苗。这不仅解决了禽戊型肝炎疫苗的空白，也进一步扩大了疫苗的抗体保护范围。

本发明所选择的两株禽戊型肝炎病毒分别为VaHEV株和YT-aHEV株，其中：VaHEV株是从河北省某蛋鸡群鉴定的一株avian HEV，其全基因组序列已上传至NCBI GenBank，登录号为：MG976720.1；基于全基因组的遗传进化分析结果显示，VaHEV与所有目前已知的avianHEVs不同，VaHEV处于一个单独的进化分支，属于新亚型。病鸡表现为产蛋高峰期明显推迟，产蛋率下降约20％，病鸡胚胎孵化率下降18％以上。病死鸡剖检可见脾脏肿大，肝脏出血肿大(图1)。

YT-aHEV株为从山东省某肉种鸡群分离的一株avian HEV，属于经典的基因3型，已完成全基因组测序及分析(NCBI GenBank，登录号为：MZ736614.1)。相关发病鸡群表现典型的肝脾肿大与出血现象，发病高峰期为20周龄左右。

对上述两株不同来源的avian HEV进行同源性分析，结果显示两者之间全基因组核苷酸序列同源性仅为82.2％，三个ORFs的核苷酸序列同源性分别为82.3％，81.7％，85.1％，氨基酸序列同源性分别为86.3％，90.9％，72.4％。

本发明以YT-aHEV肉鸡株和VaHEV蛋鸡株为模板，设计了ORF2片段的引物，并进行扩增和重组蛋白的表达，将VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白混合，制备得到禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：重组蛋白的制备

针对VaHEV(蛋鸡来源)和YT-aHEV(肉鸡来源)的毒株序列，分别设计了ORF2的扩增引物。其中，VaHEV株对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：

Va-ORF2-F：5’-GGATTCATGTCGCTGCGTGGATTGCTG-3’；(SEQ ID NO.3)

Va-ORF2-R：5’-CTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGGAATGT-3’。(SEQ ID NO.4)

YT-aHEV对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：

YT-ORF2-F：5’-GGATTCATGTCGCTGCGTGGATTGCTG-3’；(SEQ ID NO.5)

YT-ORF2-R：5’-CTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGAAATGT-3’。(SEQ ID NO.6)

Va-ORF2-F、Va-ORF2-R引物的扩增长度为1818bp，其序列如SEQ ID NO.7所示；YT-ORF2-F、YT-ORF2-R引物的扩增长度为1821bp，其序列如SEQ ID NO.8所示。

分别以Va-HEV株和YT-aHEV株全基因组质粒为模板，以Va-ORF2-F、Va-ORF2-R、YT-ORF2-F、YT-ORF2-R为引物，配制PCR体系，反应条件为预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min。扩增ORF2基因片段，扩增产物进行凝胶电泳分析(图2，A)。扩增产物切胶回收目的片段，回收产物与酶切正确的片段(图2，B)连接在PET-32a(+)表达载体上并转化入宿主菌Trans5α化学感受态细胞，挑取单个菌落，摇菌过夜，并进行菌液PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆送北京擎科生物科技有限公司进行序列测定。

取测序正确的菌液接种于1.5ml液体LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，220rpm，摇床培养过夜，次日将菌液加入200ml LB培养基中，37℃摇床摇菌约2h，检测A₆₀₀OD值为0.8左右。加入IPTG，30℃摇床继续诱导6h，收集菌体，经超声破碎，离心保留沉淀并溶解，取40μl溶解液与10μl 5×上样缓冲液混匀煮沸5min，-20℃迅速冷却，10％SDS-PAGE电泳鉴定分析，确定电泳条带正确后(图2，C)，再用镍柱对目的蛋白进行纯化(图2，D)。

通过上述方法分别制备得到VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白，其中，VaHEV的ORF2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；YT-aHEV的ORF2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗的制备

通过BCA蛋白定量法，对实施例1纯化好的VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白进行定量，在波长562nm处，测定样品的吸光值，绘制标准曲线，计算样品浓度。将VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白按照重量比1:1混合后，然后将混合后的蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1体积混合乳化，用三通注射器将二者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)。保存于2-8℃，备用。

对比例1：

将实施例1制备的YT-aHEV的ORF2重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照1：1体积混合乳化，YT-aHEV的ORF2重组蛋白的重量与实施例2中混合后的重组蛋白的重量相同，用三通注射器将二者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)，制备得到亚单位疫苗A。

对比例2：

将实施例1制备的VaHEV的ORF2重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照1：1体积混合，VaHEV的ORF2重组蛋白的重量与实施例2中混合后的重组蛋白的重量相同，用三通注射器将二者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)，制备得到亚单位疫苗B。

试验例1：

将1日龄SPF雏鸡随机分为4组，试验组各5只，空白对照组2只。试验1组为免疫亚单位疫苗A，试验2组为免疫亚单位疫苗B，试验3组为免疫实施例2制备的禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗；空白对照组选用生理盐水。通过对鸡颈部皮下注射的方式进行免疫试验，且每次免疫时将蛋白和佐剂进行1：1混匀。第一次免疫完成后间隔两周后进行第二次免疫，且每次免疫完成后一周采血备用。两次免疫完成后用间接ELISA对保存的鸡血清进行aHEV抗体检测(抗体检测所使用的试剂盒：Big Liver and Spleen Disease Antibody test kit；厂家：Biocheck；生产系列编号：DRF070)，计算S/P值。S/P值大于0.2判为抗体阳性。

通过ELISA试剂盒检测结果表明，SPF鸡两次免疫ORF2亚单位疫苗，均会产生抗体；与单独使用YT-aHEV的ORF2重组蛋白和单独使用VaHEV的ORF2重组蛋白制备的亚单位疫苗相比，实施例2制备的禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗在诱导抗体产生方面具有更好的效果(表1)。

试验过程中鸡只生理状态正常，无发病或死亡情况，表明本发明所制备的亚单位疫苗使用安全。

表1：免疫后抗体检测结果

试验例2：

对感染YT-aHEV的LMH细胞中蛋白的表达情况以间接免疫荧光方法检测。以免疫了YT-aHEV ORF2蛋白后采集的鸡血清作为一抗，分别用50×和100×两种不同稀释度，利用FITC标记的兔抗鸡lgG抗体作为二抗。aHEV在感染LMH细胞时的荧光强度表示蛋白的表达有无，在100×稀释下LMH细胞中可发现表达蛋白的特异性绿色荧光，说明鸡血清中产生了ORF2抗体(图3)。证明免疫了YT-aHEV ORF2蛋白后，能够产生可识别病毒的特异性抗体。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 605

<212> PRT

<213> VaHEV ORF2

<400> 1

Met Ser Ser Arg Gly Leu Leu Leu Met Leu Ala Met Cys Cys Gly Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Ser Gln Ala Leu Pro Ala Arg Asp Trp Arg Gly Gln Pro

20 25 30

Arg Arg Asp Asn Ser Ala Gln Trp Ser Ala Gln Glu Arg Pro Glu Gly

35 40 45

Ala Val Gly Pro Ala Ala Ser Thr Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Thr

50 55 60

Arg Thr Val Pro Asp Val Asp Gln Ala Gly Ala Val Leu Val Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Val Thr Ser Pro Leu Gly Ser Ala Thr Leu Gly Ser Thr

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Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Pro Val Ser Pro Leu Met Pro Leu Gln

100 105 110

Asp Gly Thr Thr Ser Asn Ile Met Ser Thr Glu Ser Ser Asn Tyr Ala

115 120 125

Gln Tyr Arg Val Arg Gly Leu Thr Val Arg Trp Arg Pro Val Val Pro

130 135 140

Asn Ala Val Gly Pro Phe Ser Ile Thr Met Ala Tyr Trp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Thr Ser Thr Ala Thr Ser Ile Asp Met Asn Ser Ile Lys Ser Thr Asp

165 170 175

Val Arg Val Val Leu Gln Pro Gly Thr Ala Cys Leu Leu Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Glu Arg Leu Asp Tyr Lys Asn Asn Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr

195 200 205

Val Ser Val Pro Gln Glu Asp Ala Thr Ser Gly Met Leu Met Val Cys

210 215 220

Val His Gly Thr Pro Trp Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Val Tyr Thr Ala

225 230 235 240

Pro Leu Gly Met Val Asp Phe Ala Ile Glu Leu Gln Leu Arg Asn Leu

245 250 255

Ser Pro Gly Asn Thr Tyr Ala Ser Val Ala Arg Val Lys Val Thr Ser

260 265 270

Pro His Thr Ile Lys Ala Asp Pro Thr Gly Ala Thr Ile Thr Thr Thr

275 280 285

Ala Ala Ala Arg Phe Met Ala Asp Val Arg Trp Gly Leu Gly Thr Ala

290 295 300

Asp Asp Gly Glu Ile Gly His Gly Ile Leu Gly Val Leu Phe Asn Leu

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Leu Gly Gly Leu Pro Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ser

325 330 335

Gly Gln Tyr Met Tyr Gly Arg Pro Val Gly Asn Ala Asn Gly Glu Pro

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Asp Val Lys Leu Tyr Met Ser Val Glu Asp Ala Val Asn Asp Lys Pro

355 360 365

Ile Met Val Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Thr Ser Pro Val Thr Cys

370 375 380

Gln Asp Tyr Gly Asn Gln His Val Asp Asp Arg Pro Ser Pro Ala Pro

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Lys Ala Thr Val Asp Gly Val Pro Val Lys Thr Val Asp Ala Ser Ser

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Gly Ser Asn Ser Phe Ala Ala Leu Pro Ala Phe Gly Lys Pro Ala Val

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Trp Glu Pro Gln Gly Ala Gly Tyr Phe Tyr Gln Tyr Asn Asn Thr His

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515 520 525

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Leu Leu Asp Arg Leu Ser Lys Thr Phe Pro Ser Pro Pro

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<213> YT-aHEV ORF2

<400> 2

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Arg Arg Asp Asn Pro Ala Gln Trp Ser Ala Gln Gln Arg Pro Glu Gly

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<212> DNA

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atgtcgtcgc gtggattgct gctcatgctt gcaatgtgct gcggggtgtc aaggggctcc 60

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aattgcagct ctgtagtttg gtatgcatca accaacatgt tgggccagaa atctgataca 1620

tctatcctct tagaggtccg gccgatccag gctagtgatc agccttggtt tttggcacac 1680

catactggtg gcgatgattg caccacatgt ttgccgttgg gactaagaac atgttgccgt 1740

caggcaccag aggaccagtc accagagacg cgccggttgc tagaccgact tagtaagaca 1800

ttcccctcac caccttag 1818

<210> 8

<211> 1821

<212> DNA

<213> YT-aHEV ORF2

<400> 8

atgtcgctgc gtggattgct gctcatgctt gctatgtgct gcggggtgtc aaggggctcc 60

caaacgctcc cagcaggaag caggcgcggt caacgccgcc gtgacaaccc agcccagtgg 120

agcgctcaac aacgccccga aggagccgtc ggccccgccc ctcttaccga cgttgtcacc 180

gcggcaggta ctcgcacggt accagacgta gaccaggcag gggctgtgct ggtccgtcag 240

tataatctcg tgaccagccc gcttgggctg gccacccttg gcagcactaa tgccctgctt 300

tacgctgcgc cggtgtcacc gttaatgcca cttcaggacg gtacaacatc caatataatg 360

agcacggaat ctagcaatta tgctcagtac cgtgtgcagg gtctgaccgt tcgctggcgg 420

ccagttgtgc ctaatgcggt tggcgggtct tctattagca tggcttattg gccccaaaca 480

acattttacc cccacagcat agatatgaat tctattacat ccaccgacgt tcgtgtcgtg 540

cttcaaccag gttcggccgg cttgttaacc ataccgcatg aacgtttggc atacaagaat 600

aacggctggc ggtctgttga gacagtgtcg gtcccacaag aagacgcaac gtctggaatg 660

ctcatggttt gtgtccacgg tacaccctgg aacagttaca caaatagtgt gtgcaccggg 720

ccgctcggta tggttgactt tgctataaag cttcagttga ggaatttatc tcctggtaac 780

actaatgcta gggtcacccg tgtcaaggtg acagcccctc acactatcaa ggctgacccg 840

tcaggcgcca ccataacaac tgccgctgcg gctcggttta tggctgatgt gcgctggggt 900

ctgggtgtgg cggaagatgg tgagattggc catggtatcc ttggcgtcct gtttaatttg 960

gctgatacag tgttgggcgg cctcccgtcg acattgcttc gcgcggctag cggccagtat 1020

atgtacggcc gacctgttgg taacgctaat ggtgagcccg aagtgaaact gtatatgtcg 1080

gtagaggatg ctgtcaacga taagcccatc atggtccctc acgacattga cctcgggact 1140

agcactgtta cctgccagga ttatgggaat cagcatgttg atgaccgccc gtctccagcc 1200

ccggcaccga aacgcgcctt aggcacctta cggtccggag acgttttgcg catcaccggt 1260

tcgatgcagt acgtgactaa tgccgaactg ctgccgcaaa gtgtgtcgca gggctatttt 1320

ggggctggca gcaccatgat ggtgcataat ttaatcactg gtgtgcgtgc ccctgctagt 1380

tcagtcgact ggaccaaagc aacggtggat ggggttatgg tcaagactgt cgatgccagc 1440

tccggcagca acaggtttgc cgctttgccc gcgttcggta aaccagctgt gtggggacct 1500

cagggcgctg gctattttta ccagtataac agtacccatc aggagtggat ttacttcctt 1560

caaaatggga gttccgtggt ctggtacgca tacaccaata tgttgggcca gaagtctgac 1620

acgtcgatcc tctttgaggt acggccaatt caggctagcg accagccctg gtttctggcg 1680

catcataccg gcggtgatga ttgcaccacc tgtctaccgc tggggctcag gacatgctgc 1740

cgccaggcac ctgaagacca atcaccagag acgcgccggc ttctagaccg acttagtagg 1800

acattcccct caccacccta a 1821

Claims

1.一种禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗，其特征在于，包括第一重组蛋白和第二重组蛋白；

所述第一重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗由如下方法制备而成：

（1）将第一重组蛋白和第二重组蛋白按重量比1:1混合均匀，得到抗原组合物；

（2）将抗原组合物与佐剂按照1:1体积混合，乳化；

所述佐剂为弗氏完全佐剂。

2.权利要求1所述的禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗在制备预防或治疗由禽戊型肝炎病毒引起的疾病的制品中的应用。