CN110013549A - 一种戊型肝炎亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种戊型肝炎亚单位疫苗，其中抗原蛋白时氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的戊型肝炎病毒ORF2蛋白。本发明的戊型肝炎ORF2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种戊型肝炎亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种戊型肝炎亚单位疫苗。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)引起的以肠道传播为 主的传染性疾病，具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,是一种经肠道传 播的严重危害人类健康的病毒性肝炎。目前戊型肝炎在我国以及许多发展中国 家中流行，在少数发达国家呈散发性流行。HEV是一种人畜共患病毒，已有报 道显示HEV在自然条件下能感染鸡、鹿和兔等多种动物。戊型肝炎在一些爆 发性发病鸡群中会使产蛋率下降20％以上。产蛋肉种鸡和30～72周龄产蛋母 鸡HS综合征死亡率比正常死亡率高，40～50周龄发病率最高。病鸡可能出现 鸡冠、肉垂苍白、沉郁、食欲不振、肛门口羽毛污染或有糊状粪便。

现有的戊型肝炎疫苗为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。 传统的灭活疫苗具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价高，但也存在制 造疫苗使用的毒株培养困难，与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影 响了攻毒保护效果的缺点，从而制约了灭活疫苗的应用。而且，使用全病毒抗 原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免 疫产生，会导致干扰疫情的监测。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒 株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种戊型肝炎亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种亚单位疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是戊型肝 炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

更优选的，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，编码基因的 核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

本发明使用的戊型肝炎病毒ORF2蛋白，是使用重组大肠杆菌发酵制备的；

更进一步的，本发明的ORF2蛋白进行了灭活处理；具体是使用甲醛溶液 进行灭活；

本发明所提供的亚单位疫苗的制备方法，包括如下的步骤：

1)油相制备：

取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再 加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：

将大肠杆菌表达的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配成制苗 用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入抗原液95份， 搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3)乳化：

取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入 水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。

本发明的戊型肝炎ORF2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度 高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化 生产戊型肝炎疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

具体实施方式

本发明从全国各地临床发生戊型肝炎的养殖场分离HEV，并对其临床流行 病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好的戊型肝炎病毒(QD07株)， 从中获得了一种新型的戊型肝炎病毒抗原蛋白(ORF2蛋白)，将其在大肠杆菌 中获得进行可溶性的表达，制备亚单位疫苗。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：ORF2基因的扩增及序列分析

2018年自大连地区的部分肉种鸡发生疑似戊型肝炎，经临床调查和实验室 检测，初步诊断为戊型肝炎。经调查上述的发病鸡群之前已经注射过戊型肝炎 疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有戊型肝炎病毒在疫苗的选择压力下发生 了突变，从发病鸡病料样品中分离出戊型肝炎病毒QD07株，作为扩增的模板。

1、扩增戊型肝炎病毒ORF2基因

根据NCBI中发表的戊型肝炎病毒ORF2基因序列，设计并合成了引物,引 物的序列信息如下：

primer1：5′-ATGTCGGTGCGTGGATTGTTGCTC-3′；

primer2：5′-CTAGGGTGGTGAGGGAAACGT-3′。

提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩 增目的片段，经序列测定核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列 为SEQ ID NO:2。与NCBI中已公布的戊型肝炎病毒ORF2基因进行核苷酸序 列比对分析，结果核苷酸同源性约为83.4％～91.7％；推导的氨基酸第39位(Q 变H)、198位(Y变F)、240位(G变P)、294位(T变A)、306位(D变E)、 317位(L变I)、398位(S变T)、442位(A变D)、468位(T变N)、506 位(F变I)发生变异，氨基酸序列同源性分析约为78.6％～97.1％。结果表明， 分离的病毒为新的戊型肝炎病毒，含有新的ORF2基因。

2、优化并合成戊型肝炎病毒ORF2基因

分析所获得的戊型肝炎病毒ORF2基因的抗原特性，将ORF2基因的结构 域进行剪切，将N端330aa剪切掉，把C端5aa剪切掉，并将N端加入3个脯 氨酸3个精氨酸，帮助蛋白进行空间折叠和进行可溶性表达，同时将C(剪切 修饰后的第61位、255位、256位)突变为R来帮助蛋白进行可溶性表达，表 达出具有正确空间结构的蛋白，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的 氨基酸的序列为SEQ ID NO:4，能很好地表达出抗原位点。通过以上的优化突 变达到蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达。

设计合成用于ORF2蛋白表达的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，送上海生物 工程有限公司公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增， 目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-ORF2。

引物primer3和primer4的序列信息如下：

primer3：5′-TTGAATTCCCCCCGCCGAGAAGAAGGA-3′；

primer4:5′-AAGCGGCCGCCTACGTCCTACTAAGCCG-3′。

实施例2：戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组表达

1.ORF2蛋白的制备方法

包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组ORF2蛋白的诱 导和提取纯化。

a.构建表达载体：

将阳性克隆质粒pMD18-T-ORF2和表达载体pET28a载体分别用EcoRI和 NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别 获得约5400bp和850bp片段,在16℃定向连接构建pET28a表达载体；测序验 证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，转化入BL21感受态细胞。

b.构建表达菌株、蛋白提取纯化：

转化后，37℃培养18h。挑取单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素)中， 37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴 煮5min，12000r/min离心2min离心取上清作为模板，进行PCR鉴定,PCR反 应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行32个 循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约850bp 条带。检测结果表明，含ORF2基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。 将PCR检测阳性的菌株分别接种30mL LB培养基中，37℃摇床培养至 OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h,培养物离心后用1/20体积 的PBS重悬，破碎后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。同时，将没有改造前 的基因(即含SEQ ID NO:1基因)转入pET28a表达载体，作为未改造对照菌 株进行了表达，破碎后取沉淀进行SDS-PAGE检测。结果，改造后的菌株(含 核苷酸序列为SEQ ID NO:3)表达了可溶性的蛋白，蛋白存在于上清中，纯度 为43％；未改造对照菌表达的蛋白以不可溶的包涵体形式存在。

将诱导后的菌体破碎后取上清进行纯化，按照说明书进行Ni-NTA纯化蛋 白及透析。将蛋白表达量高的阳性的表达菌株命名为BL21-ORF2。

实施例3：亚单位疫苗的制备

一、亚单位疫苗制备

1.制苗用ORF2蛋白的制备

将BL21-ORF2菌株接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养 18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于LB液 体培养基中，37℃振荡培养18小时，经镜检后，置2～8℃保存。按发酵罐容 积60％(V/V)加入LB液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂， 通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至37℃，接种ORF2蛋白生产用 二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度37℃，维持DO 值(溶氧量)在20％。培养4小时后的菌液补加乳糖,诱导表达培养6h；发酵 培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌体沉淀破碎后，取 上清经Ni-NTA纯化蛋白。

2.灭活

将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混 合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶 口附近粘附的蛋白液未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保 存。

3.半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。

(3)灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种LB固体培养基，置于37℃ 继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。

5.亚单位疫苗成品制备

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分 按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加 热至80℃后，再加司本-80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备 用。

(2)水相制备将灭活的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配 成制苗用抗原液。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用抗 原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时 徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。

乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

二、亚单位疫苗成品检验

(1)性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。检验均合格。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴 外，均应不扩散。检验结果合格。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底 析出的水相应不超过0.5ml。检验结果合格。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果合格。

(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果 合格。

(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果 合格。

(4)安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗 2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡 采食、饮水及临床情况。结果均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

(5)效力检验

5.1最小免疫剂量和使用剂量的测定用本发明制备的戊型肝炎亚单位疫 苗以不同剂量分别颈部皮下接种50周龄的SPF鸡，免疫剂量分别为0.3ml/只、 0.1ml/只、0.03ml/只，同时设未免疫疫苗的对照组。免疫后28日攻毒戊型肝炎 病毒临床分离株(YB07株)，点眼滴鼻0.2ml/只(病毒含量为10^7.0LD₅₀/0.1ml)， 连续观察14日，记录产蛋和发病死亡情况。结果表明，对照组6/10发病死亡， 产蛋率下降40％；0.03ml/只～0.3ml/只免疫组鸡均10/10健活，产蛋率无变化 (表1)。

因此将戊型肝炎亚单位疫苗最小免疫剂量确定为0.03ml/只。为保证疫苗质 量，将疫苗的使用剂量确定为3.3倍最小免疫剂量即0.1ml/只。

表1：最小免疫剂量的攻毒保护结果

注：“-”表示未进行相关试验。

5.2对地方流行毒株的攻毒保护：

50周龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射本发明的戊型肝炎亚单位疫苗， 0.1ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫 组和对照组均点眼攻毒10株各地方分离株，点眼滴鼻0.2ml/只(病毒含量为 10^7.0LD₅₀/0.1ml)，攻毒后观察14日，记录发病死亡情况，产蛋率变化。

结果表明，ORF2蛋白制备的戊型肝炎亚单位疫苗能抵御各地方病毒分离 株的攻击(参见表2)；结果表明本发明制备的ORF2蛋白亚单位疫苗具有良好 的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗戊型肝炎的攻击。

而且，使用实施例1筛选的YB07病毒株进行攻毒实验，结果表明本发明 ORF2蛋白制备的亚单位疫苗的免疫效果最好。

表2对地方流行毒株的攻毒保护

5.3与市售疫苗的比较试验用目前市售戊型肝炎疫苗和本发明制备的亚 单位疫苗分别免疫50周龄SPF鸡，每只颈部皮下注射本发明的戊型肝炎亚单 位疫苗，0.1ml/只，另取同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免 疫组和对照组均点眼攻毒0.2ml/只(戊型肝炎病毒含量为10^7.0LD₅₀/0.1ml)，攻 毒后观察14日，记录发病死亡情况，产蛋率变化。

结果，本发明制备的ORF2蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以完 全保护(10/10)免疫鸡抵抗戊型肝炎的攻击，产蛋率无变化；市售戊型肝炎疫 苗免疫鸡的攻毒保护率为5/10，产蛋率下降22％；不免疫对照组发病死亡率为 6/10，产蛋率下降40％。结果表明本发明亚单位疫苗的免疫效果更好。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种戊型肝炎亚单位疫苗

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1821

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcggtgc gtggattgtt gctcatgctt gcaatgtgct gcggggtgtc aaggggctcc 60

caaacggccc cagccggagg caggcgtggc caacgccgcc gtgacaactc agcccactgg 120

agcgctcaac aacgccccga aggagccgtc ggccccgccc ctcttacaga cgttgtcacc 180

gcggcaggta cacgcacggt accagatgta gaccaggccg gggctgtgct ggtgcgccag 240

tacaatttag tgactagccc gctagggctg gccacccttg gcagcacgaa tgccctgctc 300

tatgcggcac cggtctcacc gttgatgcca ctccaggatg gcacgacatc taatattatg 360

agcactgagt ctagtaatta tgctcagtat cgtgtgcagg gcctgaccgt ccgttggcgg 420

ccggtagtgc ccaatgcggt tggcggtttc tccatcagta tggcctactg gccccagacg 480

acgtcaaccc ccaccagcat tgatatgaac tccatcacat caactgatgt tcgggtcgtg 540

cttcagccag gttcggccgg attactgact ataccgcatg agcgcctggc gttcaagaac 600

aacggttggc gttctgtgga aacggtgtct gtcccgcagg aagatgctac gtccggcatg 660

ctcatggttt gtgttcatgg aaccccttgg aacagttata ctaacagtgt gtacactccg 720

ccactcggca tggttgattt tgccataagg ttgcagttga ggaatctgtc ccctggcaac 780

accaatgcta gggtgactcg cgtcaaggtt acggccccgc acaccattaa ggccgacccg 840

acgggcgcta ctataacaac tgctgccgcg gccagattcc atgctgatgt ccgatggggc 900

ctcggagttg cggaagaggg tgaagtgggc catggtatac ttggggtcat cttcaatttg 960

gccgatactg tcctcggtgg cttaccatcg acactgttgc gtgcagcaag tggtcagtat 1020

atgtatggca ggcctgttgg gaatgccaat ggtgagcctg aagtgaagct gtatatgtct 1080

gtggaggatg ctgttaatga caaacccata atggtccccc acgacattaa ccttgggact 1140

agcactgtta cctgccagga ttatgggaac caacatgtgg acgaccgccc gaccccggcc 1200

ccggccccaa agcgtgccct tggcacctta cggtcgggtg atgtcctgcg gatatctggt 1260

tctatgcagt atgtgaccaa tgctgagttg ttgccgcaga gcgtgtccca gggttacttt 1320

ggcgatggta gcaccatgat ggtgcataac cttatgaccg gtgtgcgcgc ccctgctagt 1380

tcggtcgact ggacaaaagc gaacgtggac ggggttcagg ttaagacagt tgatgccagc 1440

tccggtagta acagatttgc tgctttgccc gcatttggca aaccagccgt gtgggggcct 1500

cagggtgctg ggtatatcta tcagtacaac agcacccacc aggagtggat ttatttcctc 1560

cagaatggta gctccgtggt ttggtacgca tatactaaca tgttgggcca gaagtccgac 1620

acatccattc tctttgaagt gcggcccatt caagctagtg accagccctg gttcctggcg 1680

caccacacag gtggtgatga ttgcactacc tgcctgccgc ttggactcag gacttgttgt 1740

cgccaggcgc ctgaggatca atcgcctgat acgcgtcgac ttctggaccg gcttagtagg 1800

acgtttccct caccacccta g 1821

<210> 2

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Met Leu Ala Met Cys Cys Gly Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Ser Gln Thr Ala Pro Ala Gly Gly Arg Arg Gly Gln Arg

20 25 30

Arg Arg Asp Asn Ser Ala His Trp Ser Ala Gln Gln Arg Pro Glu Gly

35 40 45

Ala Val Gly Pro Ala Pro Leu Thr Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Thr

50 55 60

Arg Thr Val Pro Asp Val Asp Gln Ala Gly Ala Val Leu Val Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Val Thr Ser Pro Leu Gly Leu Ala Thr Leu Gly Ser Thr

85 90 95

Asn Ala Leu Leu Tyr Ala Ala Pro Val Ser Pro Leu Met Pro Leu Gln

100 105 110

Asp Gly Thr Thr Ser Asn Ile Met Ser Thr Glu Ser Ser Asn Tyr Ala

115 120 125

Gln Tyr Arg Val Gln Gly Leu Thr Val Arg Trp Arg Pro Val Val Pro

130 135 140

Asn Ala Val Gly Gly Phe Ser Ile Ser Met Ala Tyr Trp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Thr Ser Thr Pro Thr Ser Ile Asp Met Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp

165 170 175

Val Arg Val Val Leu Gln Pro Gly Ser Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro

180 185 190

His Glu Arg Leu Ala Phe Lys Asn Asn Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr

195 200 205

Val Ser Val Pro Gln Glu Asp Ala Thr Ser Gly Met Leu Met Val Cys

210 215 220

Val His Gly Thr Pro Trp Asn Ser Tyr Thr Asn Ser Val Tyr Thr Pro

225 230 235 240

Pro Leu Gly Met Val Asp Phe Ala Ile Arg Leu Gln Leu Arg Asn Leu

245 250 255

Ser Pro Gly Asn Thr Asn Ala Arg Val Thr Arg Val Lys Val Thr Ala

260 265 270

Pro His Thr Ile Lys Ala Asp Pro Thr Gly Ala Thr Ile Thr Thr Ala

275 280 285

Ala Ala Ala Arg Phe His Ala Asp Val Arg Trp Gly Leu Gly Val Ala

290 295 300

Glu Glu Gly Glu Val Gly His Gly Ile Leu Gly Val Ile Phe Asn Leu

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Leu Gly Gly Leu Pro Ser Thr Leu Leu Arg Ala Ala

325 330 335

Ser Gly Gln Tyr Met Tyr Gly Arg Pro Val Gly Asn Ala Asn Gly Glu

340 345 350

Pro Glu Val Lys Leu Tyr Met Ser Val Glu Asp Ala Val Asn Asp Lys

355 360 365

Pro Ile Met Val Pro His Asp Ile Asn Leu Gly Thr Ser Thr Val Thr

370 375 380

Cys Gln Asp Tyr Gly Asn Gln His Val Asp Asp Arg Pro Thr Pro Ala

385 390 395 400

Pro Ala Pro Lys Arg Ala Leu Gly Thr Leu Arg Ser Gly Asp Val Leu

405 410 415

Arg Ile Ser Gly Ser Met Gln Tyr Val Thr Asn Ala Glu Leu Leu Pro

420 425 430

Gln Ser Val Ser Gln Gly Tyr Phe Gly Asp Gly Ser Thr Met Met Val

435 440 445

His Asn Leu Met Thr Gly Val Arg Ala Pro Ala Ser Ser Val Asp Trp

450 455 460

Thr Lys Ala Asn Val Asp Gly Val Gln Val Lys Thr Val Asp Ala Ser

465 470 475 480

Ser Gly Ser Asn Arg Phe Ala Ala Leu Pro Ala Phe Gly Lys Pro Ala

485 490 495

Val Trp Gly Pro Gln Gly Ala Gly Tyr Ile Tyr Gln Tyr Asn Ser Thr

500 505 510

His Gln Glu Trp Ile Tyr Phe Leu Gln Asn Gly Ser Ser Val Val Trp

515 520 525

Tyr Ala Tyr Thr Asn Met Leu Gly Gln Lys Ser Asp Thr Ser Ile Leu

530 535 540

Phe Glu Val Arg Pro Ile Gln Ala Ser Asp Gln Pro Trp Phe Leu Ala

545 550 555 560

His His Thr Gly Gly Asp Asp Cys Thr Thr Cys Leu Pro Leu Gly Leu

565 570 575

Arg Thr Cys Cys Arg Gln Ala Pro Glu Asp Gln Ser Pro Asp Thr Arg

580 585 590

Arg Leu Leu Asp Arg Leu Ser Arg Thr Phe Pro Ser Pro Pro

595 600 605

<210> 3

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccccgccga gaagaaggac actgttgcgt gcagcaagtg gtcagtatat gtatggcagg 60

cctgttggga atgccaatgg tgagcctgaa gtgaagctgt atatgtctgt ggaggatgct 120

gttaatgaca aacccataat ggtcccccac gacattaacc ttgggactag cactgttacc 180

agacaggatt atgggaacca acatgtggac gaccgcccga ccccggcccc ggccccaaag 240

cgtgcccttg gcaccttacg gtcgggtgat gtcctgcgga tatctggttc tatgcagtat 300

gtgaccaatg ctgagttgtt gccgcagagc gtgtcccagg gttactttgg cgatggtagc 360

accatgatgg tgcataacct tatgaccggt gtgcgcgccc ctgctagttc ggtcgactgg 420

acaaaagcga acgtggacgg ggttcaggtt aagacagttg atgccagctc cggtagtaac 480

agatttgctg ctttgcccgc atttggcaaa ccagccgtgt gggggcctca gggtgctggg 540

tatatctatc agtacaacag cacccaccag gagtggattt atttcctcca gaatggtagc 600

tccgtggttt ggtacgcata tactaacatg ttgggccaga agtccgacac atccattctc 660

tttgaagtgc ggcccattca agctagtgac cagccctggt tcctggcgca ccacacaggt 720

ggtgatgatt gcactacctg cctgccgctt ggactcagga ctagaagacg ccaggcgcct 780

gaggatcaat cgcctgatac gcgtcgactt ctggaccggc ttagtaggac gtag 834

<210> 4

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Pro Pro Arg Arg Arg Thr Leu Leu Arg Ala Ala Ser Gly Gln Tyr

1 5 10 15

Met Tyr Gly Arg Pro Val Gly Asn Ala Asn Gly Glu Pro Glu Val Lys

20 25 30

Leu Tyr Met Ser Val Glu Asp Ala Val Asn Asp Lys Pro Ile Met Val

35 40 45

Pro His Asp Ile Asn Leu Gly Thr Ser Thr Val Thr Arg Gln Asp Tyr

50 55 60

Gly Asn Gln His Val Asp Asp Arg Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys

65 70 75 80

Arg Ala Leu Gly Thr Leu Arg Ser Gly Asp Val Leu Arg Ile Ser Gly

85 90 95

Ser Met Gln Tyr Val Thr Asn Ala Glu Leu Leu Pro Gln Ser Val Ser

100 105 110

Gln Gly Tyr Phe Gly Asp Gly Ser Thr Met Met Val His Asn Leu Met

115 120 125

Thr Gly Val Arg Ala Pro Ala Ser Ser Val Asp Trp Thr Lys Ala Asn

130 135 140

Val Asp Gly Val Gln Val Lys Thr Val Asp Ala Ser Ser Gly Ser Asn

145 150 155 160

Arg Phe Ala Ala Leu Pro Ala Phe Gly Lys Pro Ala Val Trp Gly Pro

165 170 175

Gln Gly Ala Gly Tyr Ile Tyr Gln Tyr Asn Ser Thr His Gln Glu Trp

180 185 190

Ile Tyr Phe Leu Gln Asn Gly Ser Ser Val Val Trp Tyr Ala Tyr Thr

195 200 205

Asn Met Leu Gly Gln Lys Ser Asp Thr Ser Ile Leu Phe Glu Val Arg

210 215 220

Pro Ile Gln Ala Ser Asp Gln Pro Trp Phe Leu Ala His His Thr Gly

225 230 235 240

Gly Asp Asp Cys Thr Thr Cys Leu Pro Leu Gly Leu Arg Thr Arg Arg

245 250 255

Arg Gln Ala Pro Glu Asp Gln Ser Pro Asp Thr Arg Arg Leu Leu Asp

260 265 270

Arg Leu Ser Arg Thr

275

Claims (7)

1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，抗原是戊型肝炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:4。

3.如权利要求2所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白是使用重组大肠杆菌发酵制备的。

5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白进行了灭活处理。

6.如权利要求5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白是使用甲醛溶液进行灭活。

7.权利要求1-6任一项所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：

1)油相制备：

取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：

将大肠杆菌表达的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配成制苗用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3)乳化：

取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。