CN105420249A

CN105420249A - 基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因及其在制备猪戊型肝炎病毒样颗粒中的用途

Info

Publication number: CN105420249A
Application number: CN201510960640.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡雪辉; 涂亚斌
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明公开了一种基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因及其在制备猪戊型肝炎病毒样颗粒中的用途。本发明的经改造后的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，本发明同时公开了该基因表达的重组蛋白及制备病毒样颗粒的方法，具体涉及基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的改造、基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达，以及重组蛋白形成病毒样颗粒的制备和扩大培养条件等操作方法的改进等步骤。本发明简单易行，成本较低，实现了基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白在毕赤酵母中稳定分泌表达，表达的重组衣壳蛋白可自包装形成病毒样颗粒，为猪戊型肝炎病毒的抗体检测及亚单位疫苗的研制提供了基础。

Description

基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因及其在制备猪戊型肝炎病毒样颗粒中的用途

技术领域

本发明涉及一种基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的改造、还涉及含有该基因的表达载体的构建、毕赤酵母中稳定分泌表达及制备猪戊型肝炎病毒样颗粒的方法，本发明属于动物基因工程与动物病毒学技术领域。

背景技术

戊型肝炎(HepatitisE,HE)是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的一种急性病毒性肝炎，是一种人畜共患传染病。HEV是1982年发现的一种新型肝炎病毒，当时称为肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒，1989年正式命名为HEV(Balayan等.EvidenceforavirusinnonAnonBhepatitistransmittedviathefecesoralmute.Intervirology.1983,20(1):23-31)。HE主要经粪-口途径传播,有流行和散发两种形式，HEV是一种无囊膜的病毒，为球形颗粒，直径为27～34nm(Bradley等.Entericallytransmittednon-A,non-Bhepatitis:serialpassageofdiseaseincynomolgusmacaquesandtamarinsandrecoveryofdisease-associated27-to34-nmviruslikeparticles.ProcNatlAcadSciUSA.84(17):6277-6281)。患HE的成年人死亡率达0.5％～4％，孕妇死亡率高达5％～20％(Purcell等.HepatitisE:Anemergingawarenessofanolddisease.J.Hepatol.2008,48:494-503；Péron等.AcuteautochthonoushepatitisEinwesternpatientswithunderlyingchronicliverdisease:Aroleforribavirin？J.Hepatol.2011,54:1323-1324)。我国新疆南部地区在1986～1988年发生HE大流行，导致约12万人发病，707人死亡，其中414人为孕妇。1997年美国学者首次报道了猪HEV(SHEV)对家猪的感染，发现其与人的HEV有很高同源性(Meng等.AnovelvirusinswineiscloselyrelatedtothehumanhepatitisEvirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997,94,9860-9865)。与人和猪感染相关的HEV只存在一个血清型，包括4个基因型，即基因1、2、3型和4型，人感染基因1、2、3和4型，猪感染基因3和4型，基因3和4型被认为是人畜共患病病原(Meng.ZoonoticandfoodbornetransmissionofhepatitisEvirus.SeminLiverDis.2013,33(1):41-49)。目前，研究表明我国HEV感染人占主导地位的是基因4型。Li等报告的研究中分离到24株HEV，其中23株(95.83％)为基因4型，仅1株是基因1型(Li等.SeroprevalenceofhepatitisEvirusinfection,ruralsouthernPeople'sRepublicofChina.EmergInfectDis.2006,12(11):1682-1688)。艾星等报道2006年10月～2007年9月对江苏省农村地区常住人口进行的HEV感染调查中，在67例PCR检测阳性标本中发现，基因4型62例(92.5％)，而基因1型仅为4例(6.0％)(艾星等.江苏省农村散发性戊型肝炎流行病学特征分析.中国人兽共患病学报.2009,25(3):253-256)。香港的Tai等报道,用RT-PCR和测序法分析2001～2007年的171份抗HEVIgM阳性标本时，94.7％(162/171)属于HEV基因4型，仅4.7％(8/171)属于基因1型(Tai等.MolecularepidemiologyofhepatitisEvirusinHongKong.JMedVirol.2009,81(6):1062-1068)。我国东北人HEV感染率很高，有报道表明，吉林省人HEV感染率达到(26.3～32.7％)，所检测到的病毒均属于HEV基因4型(Zhu等.SeroepidemiologyandmolecularcharacterizationofhepatitisEvirusinJilin,China.Infection.2008,36:140-146)，另有报道我国东北人群中HEV感染率高达(42.1～53.3％)(Taniguchi等.EpidemiologyofhepatitisEinNortheasternChina,SouthKoreaandJapan.JInfect.2009,58:232-237)。

有证据表明，猪是基因IV型HEV感染人的主要来源(郑英杰等.猪是基因IV型人戊型肝炎病毒感染的主要来源的证据.中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编.2006,124-129)。广西14市猪HE的分子流行病学分析表明，广西猪场中已较普遍存在HEV感染，所获取的39株广西HEV阳性样品均属于基因Ⅳ型(赵武等.广西14市猪戊型肝炎的分子流行病学分析.基因组学与应用生物学.2010,29(3):464-470)。有研究对山东屠宰场调查显示SHEV核酸阳性率为30.2％(32/106)，对20份样品测序结果显示均属于HEV基因4型(Wang等.GeneticcharacterizationandserologicalprevalenceofswinehepatitisEvirusinShandongprovince,China.VetMicrobiol.2014,172(3-4):415-424)。有报道对广东9个不同地区猪HE进行流行病学调查，结果显示，病毒核酸阳性率为16.67％(48/288)，对10份样品测序结果显示均属于SHEV基因4型(Liang等.ThePrevalenceofHepatitisEVirusInfectionsamongSwine,SwineFarmersandtheGeneralPopulationinGuangdongProvince,China.PLoSOne.2014,9(2):e88106)。日本Ohnishi和Mizuo的临床研究结果表明，HEV基因4型的致病性可能较3型强，表现为4型感染者谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)峰值水平更高、凝血酶原活动度更低、病毒载量更高，且急性重型HE的临床病例均由基因4型所致(Ohnishi等.ComparisonofclinicalfeaturesofacutehepatitiscausedbyhepatitisEvirus(HEV)genotypes3and4inSapporo,Japan.HepatolRes.2006,36(4):301-307；Mizuo等.PossibleriskfactorsforthetransmissionofhepatitisEvirusandforthesevereformofhepatitisEacquiredlocallyinHokkaido,Japan.JMedVirol.2005,76(3):341-349)。

HEVORF2编码的衣壳蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，衣壳蛋白产生的抗体可以在体外中和病毒，因此该蛋白是疫苗研究的主要靶蛋白。Purdy报道以大肠杆菌表达人HEV衣壳蛋白C端439AA蛋白的疫苗可以完全保护食蟹猴抵抗人HEV的攻击(Purdy等.PreliminaryEvidenceThatatrpE-HEVFusionProteinProtectsCynomolgusMacaquesAgainstChallengeWithWild-TypeHepatitisEVirus(HEV).JMedVirol.1993,41(1):90-94)。Tsarev报道以昆虫细胞表达人HEV衣壳蛋白55-kDa蛋白的疫苗可以完全保护食蟹猴抵抗人HEV的攻击(Tsarev等.SuccessfulpassiveandactiveimmunizationofcynomolgusmonkeysagainsthepatitisE.ProcNatlAcadSciUSA.1994,91(21):10198-10202)。Baechlein报道以利什曼原虫表达HEV衣壳蛋白C端496AA的蛋白可以很好对HEV感染的血清学进行检测(Baechlein等.ExpressionofatruncatedhepatitisEviruscapsidproteinintheprotozoanorganismLeishmaniatarentolaeanditsapplicationinaserologicalassay.JVirolMethods.2013,193(1):238-243)。佟玉品报道在酵母中胞内表达纯化的人HEV衣壳蛋白结构区ORF2蛋白具有良好的免疫原性(佟玉品等.酵母表达的戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的免疫原性研究.中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(1):23-26)。张春江报道了人HEV结构区ORF2基因在毕赤酵母中的分泌型表达，但表达量有待于进一步提高(张春江等.戊型肝炎病毒结构区ORF2基因在毕赤酵母中的分泌型表达.药物生物技术,2002,9(4):200-204)。张军报道，大肠杆菌重组颗粒性人戊型肝炎疫苗可以完全预防HEV导致的肝炎，并保护大多数恒河猴不被人HEV感染，另外，疫苗对人基因1型HEV的保护性与人基因4型HEV相近(张军等.大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护.病毒学报.2004,20(1):1-6)。以上文献中ORF2的表达均是基于人HEV基因1型的ORF2基因序列，而与基因4型猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF2氨基酸序列存在较大差异。在本发明提出之前，本发明发明人曾尝试采用基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的原始序列进行酵母表达，但多次尝试后发现无法诱导表达出该衣壳蛋白或表达量很低无法提取纯化。

由于缺乏有效的基因4型猪戊型肝炎病毒(SHEV)的细胞培养和组织培养模型，致使针对猪戊型肝炎的灭活疫苗和减毒活疫苗的研制相当困难。迄今为止，由厦门大学历经14年研制的世界上唯一的人用HEV疫苗于2011年在中国获得一类新药证书(国药准字S20110021)，该疫苗是采用大肠杆菌表达的基因1型人HEV中国分离株的衣壳蛋白研制而成，其表达的衣壳蛋白能形成病毒样颗粒(VirusLikeParticle,VLP)从而产生很好的免疫原性，其价格在110～120元/人/剂量，需要免疫2～3次。上述价格对猪而言过于昂贵，在我国猪用疫苗的价格一般都在几元每头份，绝大多数疫苗的价格都不超过10元/头份。对SHEV的研究迄今不到20年，该病毒在细胞中培养十分困难，因而有关SHEV防控的研究进展非常缓慢，时至今日，还未见SHEV衣壳蛋白在酵母中表达并形成病毒样颗粒的相关报道，也未见SHEV疫苗研制成功的报道。

本发明发明人通过优化设计了多种使基因4型SHEV衣壳蛋白在酵母中稳定表达的技术方案，之后经过大量的研究和筛选工作，最终建立了使基因4型SHEV衣壳蛋白在酵母中较高效分泌表达且能够形成病毒样颗粒的方法。本发明是国内外有关SHEV衣壳蛋白在酵母中分泌表达并形成病毒样颗粒的首次报道。因此，采用本发明方法分泌表达的基因4型SHEV重组衣壳蛋白及其形成的病毒样颗粒将为SHEV的抗体检测及亚单位疫苗的研制打下良好的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因；

本发明的另一目的是提供含上述人工合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的DNA重组载体和宿主细胞；

本发明的再一目的是提供一种制备基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白及形成病毒样颗粒的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的一种人工合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的一种基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因是在不改变天然氨基酸序列的前提下，对进行基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造得到的，其能够使基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白在毕赤酵母中稳定分泌表达。

本发明还提供了一种包含所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的重组表达载体。

优选的，所述的重组表达载体为甲醇调节型重组酵母表达载体，更优选的，所述的重组载体是将SEQIDNO.1所示的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中得到的，所述重组表达载体含有EcoRI和NotI酶切位点，一个强启动子AOX1启动子以及一个G418抗性选择位点。

进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为包含含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的重组载体的宿主细胞。

优选的，所述的宿主细胞为真核生物细胞。更优选的，所述的宿主细胞为甲醇营养型重组酵母细胞GS115。

更进一步的，本发明还提供了所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因在制备基因4型猪戊型肝炎病毒样颗粒中的应用。

本发明提供的一种制备基因4型猪戊型肝炎病毒样颗粒的方法，其特征在于是将SEQIDNO.1所示的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆至表达载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行重组蛋白的诱导表达，收集纯化即得。

在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

1、人工合成基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

2、将合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中，电转化GS115感受态细胞后，用MD板及G418+YPD平板筛选，激活培养后经甲醇诱导表达并进行无菌检验；

3、无菌收集培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白，整个过程中进行蛋白无菌检验；

4、用阳性血清对重组衣壳蛋白其进行免疫检测；

5、用电子显微镜观察重组衣壳蛋白形成病毒样颗粒的情况。

在本发明中，优选的，在步骤(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点。

在本发明中，优选的，所述的甲醇诱导表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5～1％(v/v)。即加入量为每毫升培养液中加5～10微升100％甲醇，进行诱导培养，26～30℃250～300转/min震荡培养96～120h，收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白。

具体的，所述方法包括以下步骤：

1、在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因SHEV-rCap，该人工合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。然后在其5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点；将该人工合成的基因克隆至pUC57中获得pUC-SHEV-rCap。

2、将包含猪圆环病毒Ⅱ型衣壳蛋白基因的质粒pUC-SHEV-rCap和pPIC9K用EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖电泳后胶回收SHEV-rCap和pPIC9K片段，连接HEV-rCap和pPIC9K得到表达载体pPIC9K-SHEV-rCap。

3、毕赤酵母的电转化

以SalI或SacI线性化pPIC9K-SHEV-rCap，与GS115感受态细胞混合后，用BioRadGenePulser电转化，电转化产物涂布MD平板，待长出单菌落后分别转接至不同浓度G418+YPD抗性平板上，26～30℃孵育2～3d。

4、蛋白的诱导表达

从抗性板中挑选单菌落进行活化后诱导培养，检测上清中目的蛋白的表达情况，上清以12000g离心3min，取上清进行纯化，以纯化蛋白进行SDS-PAGE检测。

5、重组衣壳蛋白的免疫学检测

对收获的上清以12000g离心3min，取上清进行纯化，以纯化蛋白进行SDS-PAGE，以猪戊型肝炎病毒阳性血清经过Western-blot检测目的蛋白的反应原性。

6、重组衣壳蛋白形成病毒样颗粒的电镜观察

对收获的上清以12000g离心3min再取上清，经过纯化后，将纯化蛋白以磷酸钨负染，在电镜下观察上清中重组衣壳蛋白形成的病毒样颗粒。

本发明的方法可用于基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白的小量制备，包括以下步骤：

1、用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的具有G418抗性的单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为26～30℃，250转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，细胞处于对数生长期；

2、将(1)的培养菌液在1500g和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在30mL的试管中继续振荡培养；

3、每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加10微升100％甲醇，进行诱导培养，26～30℃250转/min震荡培养96～120h，收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白。

在用于基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白的大量制备时，本发明对扩大培养条件进行改进，挑选合适的培养容器，摸索合适的培养温度，按照1:50～1:100的比例稀释，相应扩大甲醇的添加量，提高震荡培养的速度。具体的改进如下：在扩大培养表达的过程中按照1:50～1:100的比例进行诱导表达，即挑取数个菌落在50～100mLBMGY中激活，26℃250～300转/min震荡培养18～24h，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，少量的甘油不会影响蛋白的表达，为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，稀释之后甲醇的添加量仍然按照小量诱导表达的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至终浓度为0.5％～1％(v/v)，即每毫升培养液加5～10μL100％甲醇；诱导过程中容器的选择，可以使用容量大的三角瓶，能够提高产量，扩大培养使用的三角瓶，培养瓶体积为5L左右，26℃250～300转/min震荡培养96～120h收获上清。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明是国内外有关猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白在酵母中分泌表达并形成病毒样颗粒的首次报道。

(2)本发明分泌表达的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白及其形成的病毒样颗粒将为猪戊型肝炎病毒的抗体检测及亚单位疫苗的研制打下良好的基础。

(3)本发明方法简单易行，成本较低。

附图说明

图1为毕赤酵母表达的本发明基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白的SDS-PAGE结果；

M为预染蛋白Marker，1为纯化的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白；

图2为毕赤酵母表达的本发明基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白Western-blot结果；

图3为毕赤酵母小量表达的本发明的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白形成病毒样颗粒的电镜结果；

图4为毕赤酵母表达的本发明之外的其他蛋白未形成病毒样颗粒的电镜结果对照；

图5为经毕赤酵母大量制备的本发明基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白形成病毒样颗粒的电镜结果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所设定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例1经过改造的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的合成

对基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造，在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因，命名为SHEV-rCap，该人工合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

实施例2基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白的小量制备

1、基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因工程酵母菌种的构建

(1)材料和方法：

毕赤酵母菌PichiapastorisGS115，pPIC9K表达质粒，均购自美国Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI、NotI、SacI购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶购自NEB公司。BMGY、BMMY、YPD培养基，见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒购自Axgen公司。一抗为SHEV阳性血清，为自制，二抗为兔抗猪IgG-HRP抗体，购自Sigma公司；

(2)基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白的表达

(a)将实施例1合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因SHEV-rCap的5’端加入EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点后克隆至pUC57中获得pUC-SHEV-rCap；

(b)表达载体pPIC9K-SHEV-rCap的构建

将包含基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的质粒pUC-SHEV-rCap和pPIC9K分别用EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别胶回收SHEV-rCap和pPIC9K目的片段，将回收的SHEV-rCap和pPIC9K的目的片段连接得到表达载体pPIC9K-SHEV-rCap；

(c)重组毕赤酵母的电转化

使用来源于TaKaRa公司的限制性内切酶SacI将重组质粒pPIC9K-SHEV-rCap线性化后，与毕赤酵母GS115感受态细胞混合，用BioRadGenePulser电转仪电击转化，转化参数为1.5kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入lmL冰浴的山梨醇，温育后，将转化菌液涂布于MD平板上，26～30℃孵育3d，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素G418250、500、1000、2000、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵3d，然后将G4182000mg/LG418+YPD平板上的单菌落再分别依次点种在G4182500、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵育3d；该重组酵母菌株抵抗G418的能力与其整合质粒拷贝数成正比。

(d)蛋白的诱导表达及形成的病毒样颗粒

用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的含有本发明所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因SHEV-rCap的G418抗性单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28℃，250转/min振荡过夜，至OD600≈6，细胞处于对数生长期，得到的培养菌液在1500g和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，防止污染，在30mL的试管中继续振荡培养，每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为1％(v/v)，即加入量为每毫升培养基中加入10微升100％甲醇，进行诱导培养4d，28℃250转/min振荡培养96h收获上清，然后以12000g离心3min取上清进行纯化，纯化蛋白通过SDS-PAGE电泳检测基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白(见图1)，结果表明所表达的重组蛋白的大小与预期一致；电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行Western-blot鉴定(见图2)，一抗为SHEV阳性血清，二抗为兔抗猪lgG-HRP抗体，结果表明表达得到的重组蛋白能够与SHEV阳性血清以及兔抗猪lgG-HRP抗体发生免疫反应；将纯化蛋白以磷酸钨负染，在电镜下观察基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白形成的病毒样颗粒(见图3)，用本实验室酵母分泌表达的其他非病毒蛋白在电镜下观察是否形成病毒样颗粒(见图4)，结果表明本发明的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白能够形成病毒样颗粒，其他非病毒蛋白没有形成病毒样颗粒。

实施例3基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白的大量制备

1、材料：

含有基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因SHEV-rCap的菌种：GS115(pPIC9K-SHEV-rCap)(实施例2制备)；

仪器：摇床、电泳仪；

培养基：YPD、BMGY、BMMY培养基的具体配置方法见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册；

2、方法：

按照1:100的比例进行诱导表达，即用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的G418抗性的数个菌落GS115(pPIC9K-SHEV-rCap)在100mLBMGY中激活，26℃260转/min震荡培养24h，至OD600＝6，细胞处于对数生长期，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，即每毫升加10μL100％甲醇；诱导过程中容器的选择，可以使用容量大的三角瓶，能够提高产量，扩大培养使用的三角瓶，培养瓶体积为5L，26℃260转/min震荡培养120h收获培养上清，目的蛋白存在于培养上清中，上清蛋白经5倍浓缩纯化后，测得纯化蛋白浓度为260μg/mL。而采用基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的原始序列按照相同方法进行酵母表达，但诱导表达出的衣壳蛋白含量很低无法提取纯化。

3、大量制备基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白形成的病毒样颗粒：

将收获的培养上清以12000g离心3min再取上清进行重组衣壳蛋白纯化，将纯化的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白以磷酸钨负染，在电镜下观察到基因4型猪戊型肝炎病毒结构区重组衣壳蛋白形成了病毒样颗粒(见图5)。

Claims

1.一种基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为甲醇调节型重组酵母表达载体。

4.如权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是将权利要求1所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中得到的，所述重组表达载体含有EcoRI和NotI酶切位点，一个强启动子AOX1启动子以及一个G418抗性选择位点。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包含SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为包含权利要求2-4中任意一项所述的重组载体的宿主细胞，优选的，所述的细胞为真核细胞，更优选的，所述的细胞为甲醇营养型重组酵母细胞GS115。

6.权利要求1所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因在制备基因4型猪戊型肝炎病毒样颗粒中的应用。

7.一种制备基因4型猪戊型肝炎病毒样颗粒的方法，其特征在于是将权利要求1所述的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆至表达载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行重组衣壳蛋白的诱导表达，收集纯化即得。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)人工合成基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(2)将合成的基因4型猪戊型肝炎病毒结构区衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中，电转化GS115感受态细胞后，用MD板及G418+YPD平板筛选，激活培养后经甲醇诱导表达并进行无菌检验；

(3)无菌收集培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白，整个过程中进行蛋白无菌检验；

(4)用阳性血清对重组衣壳蛋白其进行免疫检测；

(5)用电子显微镜观察重组衣壳蛋白形成病毒样颗粒的情况。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于在步骤(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的甲醇诱导表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5～1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加5～10微升100％甲醇，进行诱导培养，26～30℃250～300转/min震荡培养96～120h，收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白。