CN103169961A - 利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap颗粒样疫苗的方法，该方法以GenBank中PCV2-TJ毒株基因序列为模板，运用常规PCR方法扩增得到PCV-2衣壳蛋白Cap的成熟编码序列。将此基因与毕赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3连接，构建pP-secSUMO3-Cap重组质粒，并用热激法转化大肠杆菌JM109进行扩增。阳性重组质粒经纯化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115。抗生素ZeocinTm浓度梯度筛选高拷贝菌株，分别提取这些高拷贝菌株的基因组DNA，以此为模板做PCR反应鉴定阳性克隆。通过仔猪攻毒试验，验证该颗粒样疫苗具有良好的免疫保护作用。

Description

利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法

技术领域

本发明提供了一种利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型(PCV-2)颗粒样疫苗的方法，属于生物技术领域，目的用于加强猪对猪II型圆环病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

技术背景

猪圆环病毒2型(Porcine circovirusII，PCV-2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(circovirus)，PCV-2基因组全长1767bp或1768bp，共包含11个开放阅读框(ORF)，其中ORF1、Cap是两个最大的开放阅读框，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和衣壳蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的结构蛋白，具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选蛋白。目前，国内外已有相关方面的大量报道，洛阳普莱柯已用家蚕生物反应器成功的表达出了PCV-2Cap蛋白，也有人成功的利用原核表达系统成功的表达出了PCV-2Cap蛋白。但因其生产成本高或蛋白免疫原性差等因素严重的影响了PCV-2Cap蛋白的大规模生产和应用。

发明内容

鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用酵母表达系统生产猪圆环病毒2型颗粒样疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)猪圆环病毒2型衣壳蛋白的Cap基因的扩增；

以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物P1、P2，分别在P1、P2的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该目的基因片段大小为722bp；

(2)以常规方法利用限制性内切酶FokI和SalI双酶切步骤(1)中PCR产物，实现与pP-secSUMO3酵母表达质粒的连接，构建重组Cap基因的酵母表达质粒，并命名为pP-secSUMO3-Cap；

(3)重组质粒pP-secSUMO3-Cap的扩增、提取：具体操作为，大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pP-secSUMO3质粒DNA1μl，常规CaCl₂法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于低盐LB平板中，20-22h后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(Promega公司)抽提获得质粒；

(4)以限制性内切酶SacI单酶切pP-secSUMO3-Cap，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母GS115的感受态菌液混合进行电转化；将转化后的菌株涂布于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上，筛选出高拷贝菌株。

(5)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；

(6)取上述重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化，回收猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，包装猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

(7)利用纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，辅以佐剂ISA206，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗

技术效果

本发明利用PCV-2感染的PK15细胞培养物中克隆的Cap基因，构建出一种新型的Cap蛋白分泌型酵母表达系统。本系统采用SUMO3为融合标签，一方面可以增强Cap蛋白可溶性和提高Cap蛋白表达量，另一方面可以正确有效地切割目的蛋白与融合标签，保证表达Cap蛋白的不含任何多余的氨基酸；本系统具有因子分泌信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产。真核表达获得的蛋白的活性和免疫原性要远远高于原核表达的蛋白，利用本发明的真核表达系统表达的全长PCV2 Cap蛋白，具有表达量高的优点，并且可以形成病毒样颗粒。本发明真核表达系统生产PCV2 Cap蛋白的方法安全可靠，成本较低，适合大规模生产，为大量生产猪圆环2型特异性血清学检测抗原和猪圆环病毒2型疫苗的抗原成分蛋白Cap蛋白提供了基础。利用本系统生产的猪圆环病毒2型颗粒样疫苗可以诱导高水平的免疫抗体，并且可以提供良好的保护。

附图说明

图1PCV2 Cap基因PCR扩增结果注：M，DNA分子量标准；1，PCV2 ORF2基因的PCR产物；2，阴性对照。

图2表达载体pP-secSUMO3-Cap的酶切电泳鉴定结果；注：M，DNA分子量标准；1，重组空载体SUMO3质粒的Hind III和SalI双酶切产物；2，重组质粒pP-secSUMO3-Cap的Hind III和SalI双酶切产物。

图3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；注：1，重组空载体SUMO3质粒电转酵母后表达产物；2，3，4重组质粒pP-secSUMO3-CAP电转酵母后表达产物；M，蛋白marker分子量标准。

具体实施方式

1、实例1毕赤酵母表达系统表达重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白

(1)以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物P1、P2，分别在P1、P2的5‘端分别加入FokI和SalI酶切位点：

P 1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该目的基因片段大小为722bp；

(2)以常规方法利用限制性内切酶FokI和SalI双酶切目的基因，实现与pP-secSUMO3酵母表达质粒的连接，构建重组Cap基因的酵母表达质粒，并命名为pP-secSUMO3-Cap；

(3)重组菌株pP-secSUMO3-Cap的扩增、提取：具体操作为，大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pP-secSUMO3-Cap质粒DNA1μl，常规CaCl2法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于含不同浓度梯度的Zeocin(抗生素，Invitrogen公司)的低盐LB平板中，20-22h后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(Promega公司)抽提质粒；上述低盐LB平板的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，pH7.5，最后筛选出高拷贝菌株；

(4)以限制性内切酶SacI单酶切含pP-secSUMO3-Cap，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母GS115的感受态菌液混合进行电转化；电转化详细操作为：取GS115感受态菌液80μl与10μl线性化质粒DNA混合，冰浴5分钟后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪(伯乐公司)，1500V电压电击，立即加入1ml的1M山梨醇溶液，转移至一无菌管中，30℃静置1小时30分钟后，分别取50、100、200、400μl涂布于含100μg/mlZeocin的YPDS板上，30℃避光培养3天后，同时以不含Cap的空质粒pP-secSUMO3电转化GS115作对照，挑取单克隆至1mlYPD中，30℃振荡培养至对数生长期，-20℃冻存；上述YPDS平板的配方为：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％，山梨醇1M，琼脂2％；

(5)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；电转化后的单克隆冻存菌10μl经活化后，以1∶100接种于100mlYPD培养液中，30℃振荡培养，每隔24小时取菌液1ml，高速离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20℃保存待测；电泳前，取500μl培养上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃30分钟，12000rpm离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶于20μl 6×载样缓冲液中，100℃3分钟变性后，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶，50mA电泳；

(6)取上述重组阳性表达酵母菌培养上清经镍柱纯化分离，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，分子量约为28KD，包括全长234个氨基酸。具体操作为：取2L重组阳性酵母菌及(命名为酵母菌B1-3)及2L转化空载体pP-secSUMO3的酵母菌(定名为酵母菌SC3-1，作为对照组)第4天培养上清，分别经8000rpm离心15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓缩(分别定名为B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液)，通过HIS标签纯化柱分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，即可获得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，并包装成猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

(7)采用Western blot鉴定表达的重组PCV2 Cap蛋白。取冻干样品进行SDS-PAGE电泳，然后在进行转膜，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对PCV2Cap蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组PCV2 Cap蛋白的表达。结果说明表达的重组PCV2-Cap蛋白能够同猪圆环2型抗体特异性结合，说明重组PCV2 Cap蛋白具有特异的猪圆环2型免疫原性。

(8)利用纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，辅以佐剂ISA206，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗

准备不同浓度的抗原稀释物，并与ISAQ206佐剂混合乳化。ISA206佐剂经121℃、60分钟高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例1∶1.5混合。使用胶体磨乳化，乳化时先将佐剂加入筒内，在搅拌状态下(200rpm)缓缓将抗原水相加入佐剂中，加完后，继续搅拌5分钟。12000rpm，乳化3分钟，得到PCV2 Cap蛋白颗粒样疫苗成品。

(9)制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合规定。疫苗保存于4℃。

2、实例2重组PCV2 Cap衣壳蛋白颗粒样疫苗的效力检测：

按照实例1中乳化方法制备含不同剂量重组Cap蛋白的颗粒样疫苗(分别包含重组衣壳蛋白0.5μg/头份、1μg/头份、2μg/头份、5μg/头份、10μg/头份)，筛选10～14日龄的无猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪蓝耳病病毒等主要病原的猪。将符合条件的仔猪随机分成7组，每组10头，5组给予包含不同量重组Cap蛋白的颗粒样疫苗，1组做为攻毒对照组，另一组做为阴性对照组。疫苗组进行两次免疫，间隔2周，攻毒组注射相同剂量的PBS，接种方式采血滴鼻1ml，颈部肌肉注射2.5ml，隔离饲养。在第二次免疫后21天对疫苗组和功毒对照组进行攻毒，阴性对照组不攻毒，单独隔离饲养。攻毒后21天进行剖杀。所有猪在第一次免疫前、攻毒前和剖杀前收集血样。

收集的血样，通过Elisa法进行PCV2血清抗体检测。攻毒后21天剖检全部猪只，观察各组织器官的病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。A临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，至少持续3天，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长缓慢；B病理变化：腹股沟淋巴结和气管淋巴结肿大、肺脏轻度水肿、肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；C病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。

表1是所有猪的血样Elisa检测PCV2抗体的结果

表2是各组试验动物在剖杀前观察临床表现和剖杀后进行病理变化检测和淋巴结PCR检测病毒的结果

结果分析：根据试验动物临床症状、剖解病理变化和病原PCR检测结果可知，攻毒对照组全部发病，免疫1组有4头发病，免疫2-5组均没有发病，保护率均为100％，免疫2-5组颗粒样疫苗效果好于免疫1组，可以推断必须包含1μg/头份抗原或者更多抗原的颗粒样疫苗才可以给动物提供足够的保护，同时该动物试验也说明本实验室生产的PCV2 Cap颗粒样疫苗能很好的保护畜群对抗PCV2。

Claims (8)

1.猪圆环病毒2型衣壳蛋白CAP颗粒样疫苗是通过以下方法制得的：

(1)Cap蛋白基因的扩增

以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物，在两条引物的5端分别加入FokI和SalI酶切位点：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该基因片段大小为722bp；

(2)分泌型表达载体的构建、筛选、鉴定：

通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-secSUMO3-Cap。

(3)Cap蛋白的表达：

阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin Tm浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌。将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap。

(4)利用纯化的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述引物P1、P2为：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述的聚合酶链式反应(PCR)的条件为：

50μl的PCR体系如下：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，20mmol/L引物各1μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌三蒸水33μl，DNA模板1μl；PCR的反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃40s，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述酵母表达载体是pP-secSUMO3。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，毕赤酵母菌株GS115。

6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述步骤(4)中所述佐 剂为水性佐剂或油性佐剂。

7.根据权利要求1～5任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。

8.根据权利要求1～6任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗。 

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