CN110684084A - 一种猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法及应用 - Google Patents

一种猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法及应用。基于对PCV3流行毒株的Cap蛋白基因序列的比对分析，在人工合成PCV3‑Cap蛋白编码基因前端添加酵母表达信号肽序列，并对Cap基因的密码子进行优化，利用酿酒酵母转录元件高效构建方法构建重组酿酒酵母表达菌株，经诱导表达产生重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。利用本发明的重组酿酒酵母表达菌株所表达的Cap蛋白制备亚单位疫苗，免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能保护猪体对抗猪圆环病毒的攻击。

Description

一种猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法 及应用
技术领域
本发明属于基因工程疫苗领域，尤其涉及一种猪圆环病毒3型Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法及应用。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的最小的动物病毒之一，该病毒现有三种血清型：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1无致病性，PCV2会引起猪皮炎肾病综合征、肉芽肿性肠炎、断奶仔猪多系统衰竭综合征和母猪繁殖障碍等一系列相关综合侯群称圆环病毒病，PCV3的致病性尚未明确。PCV3病毒包含3个主要开放阅读框(ORF)。其中，ORF2编码衣壳蛋白Cap，Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白。PCV3的基因组结构与PCV1、PCV2相似，但PCV3与PCV2的同源性较低，仅为30％左右。因此，针对于PCV2病毒的疫苗对于PCV3病毒并不能起到有效的免疫保护作用。
2017年，PCV3病毒被首次检出，并陆续有PCV3在我国猪场被检出的报道， PCV3已成为养猪产业的新威胁。疫苗接种仍然是防控PCV3病毒的最有效措施，但目前关于PCV3的有效控制方法还鲜有报道。
病毒样颗粒(VLPs)作为亚单位疫苗的一类，在亚单位疫苗增强免疫原性方面是一个巨大的进步，它由一种或多种具有自组装能力的结构蛋白组成，是和亲本病毒粒子具有相同结构的空心颗粒，它可以模仿天然病毒的组织和构象，但不含病毒基因组，因此具有良好的安全性和高免疫原性。选择合适的表达系统是成功制备VLPs的重要因素，原核表达系统培养廉价易于放大，可以产生大量的外源蛋白，然而靶蛋白的低溶解度和不正确折叠限制了它的实际使用。酵母表达系统也不需要昂贵的培养基，生产成本低，可规模化生产，酵母能和大肠杆菌一样快速生长，外来因子污染风险低，它还具有内质网(ER)作为正确折叠蛋白质的监测系统，能够生产具有可靠品质的病毒样颗粒，但是酵母表达也存在缺陷，例如缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌效率低等。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工合成的猪圆环病毒3型重组Cap蛋白的核苷酸序列。
本发明的目的是提供一种人工合成的猪圆环病毒3型重组Cap蛋白的氨基酸序列。
本发明的目的是提供一种含有猪圆环病毒3型Cap蛋白组成的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
本发明的目的是提供一种重组猪圆环病毒样颗粒组成的亚单位疫苗。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
进一步的，猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如 SEQ IDNO:2所示。
进一步的，猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列的制备步骤包括：
1)在猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列前端添加酵母表达信号肽序列；
2)添加信号肽序列后，对猪圆环病毒3型Cap蛋白的密码子进行优化，得到人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白核苷酸序列。
一种由权利要求1所述的人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白组成的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
进一步的，重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的制备方法包括：
A)构建重组酵母转录单位；
B)构建重组酿酒酵母菌株；
C)诱导表达步骤B)中的重组酵母菌；
D)纯化步骤C)中的表达产物，获得重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
进一步的，步骤A)所述的构建重组酵母转录单位为： POT-GPD-xyn2s-CAP-ADH1。
进一步的，步骤A)构建重组酵母转录单位的方法为利用多基因片段末端互补重叠酶联法，在单管中完成转录单元的装配。
进一步的，步骤B)构建重组酿酒酵母菌株的方法为通过醋酸锂转化将重组质粒整合至酿酒酵母表达菌株的基因组中。
一种重组猪圆环病毒的病毒样颗粒在制备猪圆环病毒亚单位疫苗中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明在PCV3-Cap蛋白的核苷酸序列前端添加了酵母信号肽，可以促进PCV3-Cap的表达和VLPs的形成，克服原有PCV3-Cap蛋白表达无法形成VLPs，的缺陷。
(2)本发明对PCV3-Cap蛋白的核苷酸序列按照酵母喜好进行了密码子优化，有效提高了PCV3-Cap蛋白的酵母表达效率。
(3)本发明选用了GPD启动子构建酵母转录单位，可以提高PCV3-Cap蛋白的酵母表达效率。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1重组酿酒酵母转录单位的构建示意图。
图2转录单位组装PCR验证结果(M：DNA marker 2K PlusⅡ；1-9：转录单位POT-TEF-CAP-ADH1菌落PCR结果；10-18：转录单位POT-GPD-CAP-ADH1菌落PCR结果；19：水对照结果)。
图3酵母转化结果。
图4重组酵母基因型验证结果。
图5重组酿酒酵母Western blot鉴定结果。
图6疫苗抗体水平对比。
具体实施方式
实施例中除特殊注明，其余使用的试剂盒、载体、酶、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。
实施例1.酿酒酵母表达的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的制备
1、获得重组PCV3-Cap蛋白基因序列
(1)从本公司保存的含有PCV3全基因组序列的质粒上获得PCV3的免疫原性基因Cap。
(2)设计引物A1、A2、B1、B2(序列见表1)，利用Overlap PCR在Cap区前添加一段信号肽序列，如下所示：
(5'-ATGATGGTGTCCTTCACCTCCCTCCTCGCCGGCGTCGCCGCCATCTCGGGCGTCTTGGCCGCTCCCGCCGCCGAGGTCGAATCCGTGGCTGTGGAGAAGCGC-3')
(3)然后对添加信号肽后的序列进行优化，具体方式为：在信号肽的5'端加入 BsaⅠ的酶切位点和用于转录单位按顺序正确连接的碱基序列(GATG)，ORF2序列3'端加入His6-Tag(5'-CATCATCACCATCACCAT-3')、BsaⅠ的酶切位点和用于转录单位按顺序正确连接的碱基序列(TAGC)。
表1引物序列
2.重组酿酒酵母转录单位的构建
(1)用BsaⅠ酶切Overlap得到的含有酵母表达信号肽xyn2s的PCV3-ORF3产物；用BsmBⅠ酶切带有启动子(GPD)和终止子(ADH1)的质粒以及POT-RFP，将酶切后的POT质粒、启动子、目的基因和终止子按1：1：1：1的比例混合，利用T4连接酶连接。转化DH5α，在含有100μg/mL氨苄霉素LB培养基上选择，随机挑取白色克隆进行菌落PCR验证(结果见图2)。
(2)将启动子换为TEF，其他条件不变，随机挑取白色克隆进行菌落PCR验证 (结果见图2)。
结果显示，采用GPD启动子的转录效果更好。
3.重组酿酒酵母菌株的构建
(1)制备酿酒酵母转化片段；
用BsmBⅠ酶切带有同源臂(URR1和URR2)和酵母选择性标记(LEU)的质粒， 55℃3h，加入0.9μl10μM的单核苷酸序列Lsm (5'-AAGAGACGCAAGACACTGCGGATA-3')和Rsm (5'-AAGAGACGCAAGACACTGCGGATAC-3')，按以下程序：83℃6min，80℃3min，75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃依次处理90S。用BsaⅠ酶切带有构建好的转录单位的质粒，37℃3h，加入0.9μl10μM的单核苷酸序列Lcom (5'-AAGAGACCCAAGACACTGCGGATA-3')和Rcom (5'-AAGAGACCGAGTCACTGCCAACA-3')，按以下程序：83℃6min，80℃3min， 75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃依次处理90S。将上述处理好的转录单位 (GPD-xyn2s-CAP-ADH1)和含有同源臂(URR1和URR2)和酵母选择性标记(LEU) 的质粒按1：1的比例混合，用T4连接酶过夜连接，用于酵母转化，转化后的结果见图3。
(2)重组酿酒酵母菌株的表达
挑取酿酒酵母单菌落接种到3～5mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1：50的比例转接到5ml新的YPD培养基中，使其初始OD为0.1～0.2，30℃、220rpm培养至OD600为0.5～0.8。2500rpm离心5min 收集5mL菌液的菌体，并用1mL无菌水洗涤细胞，离心收集将菌体合并为一管。在上述离心管中加入100μl 0.1M的LiAc，12000rpm离心20s收集菌体。加入 50ul 0.1MLiAc，12000rpm离心20s收集菌体。在上述离心管中依次加入240μl 50％的PEG4000、36ul 1M LiAc、100μg鲑鱼精DNA、2μg片段DNA，剧烈震荡至完全混匀。30℃200rpm 30min，42℃25min，6000rpm离心15s收集菌体，去除转化液，加入1ml的YPD30℃孵育2h，2500rpm离心5min收集菌体，用50μl 去离子水重悬，温和的吹吸混匀，涂布在SC-LEU固体培养基平板上，于30℃培养箱生长2～3天，直至长出菌落。挑取单菌落在新的SC-LEU固体培养基平板上划线纯化。然后进行基因型验证以及Western blot鉴定，确定菌株表达Cap蛋白，结果见图4和图5。
4.获得重组猪圆环病毒的病毒样颗粒
将3.中表达的重组酿酒酵母菌株培养72小时，然后用蔗糖梯度超离纯化，得到病毒样颗粒。
实施例2.大肠杆菌表达的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的制备
1.将实施例1中1.获得的Cap蛋白按照大肠杆菌密码子的偏好性进行了优化，然后转化至表达宿主E.coli BL21。通过筛选带有卡那抗性的LB平板，得到正确的克隆。
2.重组菌Cap蛋白的诱导表达
1)从抗性平板上挑取单菌落接种于含有LB的培养基中，37℃培养过夜；
2)将步骤1培养得到的菌液以1％的接种量转接到含有50mL LB培养基的500 mL三角瓶中，于37℃振荡培养至OD620nm为0.6；
3)向上述培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，16℃摇床诱导表达8h。
4)收集菌体，并用PBS洗涤两遍，然后PBS重悬菌体沉淀，同时调整OD620nm至30。
5)超声波破碎菌体细胞，12,000rpm低温离心10min，收集上清液。
6)收集的上清液采用镍柱亲和层析纯化。
3.蛋白酶切及Western-Blot检测
将酶切体系混合好后，30℃金属浴反应1h，反应结束后，将酶切产物制成 SDS-PAGE样品。利用蛋白质免疫印迹法验证融合蛋白的酶切情况，确定菌株表达Cap蛋白。
4.表达的重组菌株培养72小时，然后用蔗糖梯度超离纯化，得到病毒样颗粒。对比例1.未添加信号肽的PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的制备
1.将未添加信号肽的PCV3-Cap蛋白的基因序列进行密码子优化，优化方式与实施例1中1(3)的优化方式相同，在序列的5'端加入BsaⅠ的酶切位点和用于转录单位按顺序正确连接的碱基序列(GATG)，ORF2序列3'端加入His6-Tag (5'-CATCATCACCATCACCAT-3')、BsaⅠ的酶切位点和用于转录单位按顺序正确连接的碱基序列(TAGC)。
2.然后按照实施例1中2-3的方式对进行重组酿酒酵母菌株构建，并获得重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
对比例2.未经优化的PCV3-Cap蛋白的重组酿酒酵母菌株构建
将未经密码子优化的PCV3-Cap蛋白的基因序列按照实施例1中2-3的方式对进行重组酿酒酵母菌株构建，但发现未经密码子优化的PCV3-Cap蛋白的基因序列在酿酒酵母中未获得有效表达。
对比例3.毕赤酵母表达的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的制备
将酿酒酵母替换为毕赤酵母，其他均按照实施例1中的试验方法，制备重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
实施例3.重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的疫苗制备与免疫试验
1.疫苗的制备
将实施例1中采用酿酒酵母表达的组猪圆环病毒的病毒样颗粒与氢氧化铝胶进行混合配苗并记为Z；将实施例2中大肠杆菌表达的组猪圆环病毒的病毒样颗粒与氢氧化铝胶进行混合配苗并记为Y，将对比例1中未添加信号肽的 PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒与氢氧化铝胶进行混合配苗并记为Z-1，将对比例3中毕赤酵母表达的组猪圆环病毒的病毒样颗粒与氢氧化铝胶进行混合配苗并记为Z-B，并将上述4种疫苗按照《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验，无任何细菌生长。
2.安全检验
用14-28日龄健康易感仔猪20头，分成4组，分别注射Z、Z-1、Z-B、Y 疫苗，每头颈部肌肉注射疫苗4.0mL，连续观察14日，未出现因注射疫苗引起的任何局部和全身不适反应。
3.口服疫苗及其免疫效价评估
选择14-28日龄健康易感仔猪50头，分为5组，选取其中10头作为对照组，口服不含发酵液的饲料，其余40头随机分为4组，每组10头，分别口服Z疫苗，Z-1疫苗，Z-B疫苗和Y疫苗，每次将1L疫苗发酵液拌料饲喂，间隔7天，再饲喂一次，共饲喂3次；连续饲喂后在第7天，第14天，第21天，每个疫苗分别取10只猪采血检测，间接ELISA评价抗体水平。结果显示，酿酒酵母表达的PCV3-Cap蛋白所制备的疫苗的抗体水平更高。结果见图6。
4.攻毒保护试验
取21日龄健康易感猪100头，对照组10头，攻毒组10头，其余80头随机分为4组，每组20头，对照组和攻毒组每头颈部肌肉注射无菌生理盐水，2.0mL/ 头；疫苗组分别注射Z、Z-1、Z-B、Y疫苗，2.0mL/头；每组隔离饲养。免疫后 35日进行攻毒实验，采用圆环病毒3型毒株攻毒(病毒含量为106.25TCID50/mL)，每头滴鼻1.0mL、肌肉注射2.0mL，每组隔离饲养。攻毒保护实验结果如表2 所示。
表2免疫分组及攻毒保护结果
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等。
由结果可以看出，酿酒酵母表达的PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒疫苗拥有95％的保护率，大肠杆菌表达的PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒疫苗的保护率仅为20％。未添加信号肽和毕赤酵母表达的 PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒的疫苗的保护效率都低于酿酒酵母表达的PCV3-Cap蛋白的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒疫苗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司
<120> 一种猪圆环病毒3型（PCV-3）Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法及应用
<141> 2019-09-05
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgagacaca gagctatctt cagaagaaga ccaagaccaa gaagaagaag aagacacaga 60
agaagatacg ctagaagaag attgttcatc agaagaccaa ctgctggtac ttactacact 120
aagaagtact ctactatgaa cgttatctct gttggtactc cacaaaacaa caagccatgg 180
cacgctaacc acttcatcac tagattgaac gaatgggaaa ctgctatctc tttcgaatac 240
tacaagatct tgaagatgaa ggttactttg tctccagtta tctctccagc tcaacaaact 300
aagactatgt tcggtcacac tgctatcgac ttggacggtg cttggactac taacacttgg 360
ttgcaagacg acccatacgc tgaatcttct actagaaagg ttatgacttc taagaagaag 420
cactctagat acttcactcc aaagccaatc ttggctggta ctacttctgc tcacccaggt 480
caatctttgt tcttcttctc tagaccaact ccatggttga acacttacga cccaactgtt 540
caatggggtg ctttgttgtg gtctatctac gttccagaaa agactggtat gactgacttc 600
tacggtacta aggaagtttg gatcagatac aagtctgttt tgtaa 645
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg
20 25 30
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr
65 70 75 80
Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro
85 90 95
Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp
100 105 110
Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu
115 120 125
Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr
130 135 140
Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
180 185 190
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
195 200 205
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
210

Claims (9)

1.一种人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白，其特征在于：所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白，其特征在于：所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白，其特征在于：所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列的制备步骤包括：
1)在猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列前端添加酵母表达信号肽序列；
2)添加信号肽序列后，对猪圆环病毒3型Cap蛋白的密码子进行优化，得到人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列。
4.一种人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白组成的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
5.根据权利要求4所述的人工合成的猪圆环病毒3型Cap蛋白组成的重组猪圆环病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒的制备方法包括：
A)构建重组酵母转录单位；
B)构建重组酿酒酵母菌株；
C)诱导表达步骤B)中的重组酵母菌；
D)纯化步骤C)中的表达产物，获得重组猪圆环病毒的病毒样颗粒。
6.根据权利要求5所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：步骤A)所述的构建重组酵母转录单位为：POT-GPD-xyn2s-CAP-ADH1。
7.根据权利要求5所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：步骤A)构建重组酵母转录单位的方法为利用多基因片段末端互补重叠酶联法，在单管中完成转录单元的装配。
8.根据权利要求5所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：步骤B)构建重组酿酒酵母菌株的方法为通过醋酸锂转化将重组质粒整合至酿酒酵母表达菌株的基因组中。
9.一种重组猪圆环病毒的病毒样颗粒在制备猪圆环病毒亚单位疫苗中的应用。
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