CN110606873B

CN110606873B - 猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110606873B
Application number: CN201910847250.1A
Authority: CN
Inventors: 张华伟; 周明光; 朱娴静; 罗修鑫; 徐高原; 陈波; 郝根喜; 方玉林; 汤细彪; 陈章表; 金建云
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-09-09
Also published as: CN110606873A

Abstract

本发明提供一种猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用。通过克隆猪圆环病毒2d型和3型Cap蛋白表位基因，利用昆虫‑杆状病毒表达载体系统成功表达获得纯度高的2d型和3型Cap蛋白。利用表达的两种蛋白，首次开发了猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗，所制备的二联苗免疫性强，安全性高，对2d型与3型猪圆环病毒均能起到理想的免疫保护作用，为猪圆环病毒的防控提供有效手段。

Description

猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单链负股环状DNA病毒，为最小的动物病毒之一。会引起仔猪增生性坏死性肺炎(proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)、猪呼吸道疾病复合症(porcinerespiratory disease complex，PRDC)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis andnephropathy，PDNS)、断奶仔猪多系统消耗综合征(Post weaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)等。存在三个基因型，包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。因PCV为无囊膜病毒，故其对外界环境条件有着较强的抵抗力，病毒在pH3的酸性环境和56℃～70℃的高温下仍保持稳定，对酒精、氯已定、氯仿、碘等脂溶性消毒剂抵抗力较强，对碱性消毒剂、氧化剂、季胺类化合物、氢氧化物等较敏感。

目前研究较多的猪圆环病毒基因组为三个主要开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3。ORF2位于基因组互补链上，形成病毒的核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白是圆环病毒的主要免疫原性蛋白，该蛋白在疾病诊断及疫苗研究中具有重要作用，因此，对PCV的研究主要聚焦在Cap蛋白上。

德国Boehringer Ingelheim公司利用杆状病毒表达系统表达ORF2蛋白，研制了PCV2亚单位疫苗，大大改善了仔猪PMWS症状。该疫苗的安全性及有效性都得到了试验肯定，并在包括我国在内的多个国家注册。PCV2与PCV3 Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，两者间存在交叉免疫保护可能性较低，因此，现有的疫苗不能完全保护圆环病毒所有基因型的感染。此外，尚未获得能够进行体外培养并且稳定连续传代的PCV3，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。随着新型毒株的不断变异，依然需要加快新疫苗研发的步伐。目前市场上尚无同时针对PCV2d和PCV3亚型毒株的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)来自猪圆环病毒2d型Cap蛋白C端如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

第二方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i′)来自猪圆环病毒3型Cap蛋白C端如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

ii′)在i′)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii′)i′)或ii′)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

第三方面，本发明提供编码上述多肽的核酸分子。

第四方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第五方面，本发明提供一种组合物，其包含上述两种多肽以及药学上可接受的载体。

第六方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第七方面，本发明提供一种猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗，其包含上述免疫原性组合物，任选包含佐剂。

优选地，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂，本发明的水性佐剂包括但不限于IMS系列佐剂、铝盐系列佐剂、Montanide系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、卵磷脂类佐剂或细胞因子类佐剂等。

更优选地，所述二联亚单位疫苗的佐剂为201佐剂(SEPPIC公司)。

所述二联亚单位疫苗中，蛋白PCV2d Cap和蛋白PCV3 Cap与所述佐剂的质量比为(2-5)：1。蛋白PCV2d Cap与蛋白PCV3 Cap按等质量比混合。第八方面，本发明提供所述二联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)参照GenBank上公布的PCV2d和PCV3的ORF2基因序列，登录号分别为JQ002671.1和MG778698.1，根据杆状病毒密码子的偏爱性，人工合成PCV2d-ORF2和PCV3-ORF2目的基因，并在其5′端引入编码AcMNPV GP64信号肽的核酸序列，在3′端引入6×His标签序列；合成的目的基因的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；

(2)将目的基因PCV2d-ORF2、PCV3-ORF2分别构建到载体pFastBacDual的BamHI和EcoRI的酶切位点之间，得到转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2、pFastBacDual-PCV3ORF2；

(3)将转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2、pFastBacDual-PCV3 ORF2分别转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选(三轮筛选)纯化得到阳性重组穿梭载体(Bacmid)，分别命名为rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV3 ORF2；

(4)将rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV3 ORF2分别转染sf9昆虫细胞，培养转染的细胞，待细胞病变，收集细胞培养上清即得重组杆状病毒；

(5)将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High Five中，培养转染的细胞，待细胞病变，收集细胞培养上清检测目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达情况，并采用镍柱亲和层析法分离纯化目的蛋白；任选将目的蛋白与佐剂混合，即得。

前述的方法，步骤(5)包括：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01-0.05MOI，细胞密度为0.5×10⁶/mL～1×10⁶/mL，72～96h后收获细胞培养上清进行Western blot检测目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达情况。

所述悬浮培养的条件为：27℃，120rpm。

第九方面，本发明提供所述多肽，或所述组合物，或所述二联亚单位疫苗，或者按照所述方法制备的二联亚单位疫苗在制备用于治疗或预防猪圆环病毒(特别是2型、3型PCV)感染的药物中的应用。

第十方面，本发明提供所述多肽或所述组合物的以下任一应用：

1)用于制备猪圆环病毒(特别是2型、3型PCV)感染检测试剂或试剂盒。

2)用于制备治疗或预防猪圆环病毒(特别是2型、3型PCV)感染的药物。

本发明还提供所述二联亚单位疫苗在治疗或预防猪圆环病毒(特别是2型、3型PCV)感染中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统对PCV2d和PCV3的Cap蛋白进行表达，为猪圆环病毒2d型与3型二联疫苗的制备提供技术基础。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在体外通过Tn7转座子作用使外源基因插入到杆状病毒的基因组上，操作方便，快速有效，是目前使用最广泛的表达系统。同时昆虫细胞大规模悬浮培养技术成熟与应用，使得杆状病毒表达系统的应用更加广泛。杆状病毒载体表达系统使用P10启动子或PH启动子，将外源目的基因以单拷贝或多拷贝形式插入到启动子下游，随后将重组Bacmid转染入sf9细胞，获得重组病毒。这种重组杆状病毒在昆虫细胞或虫体内感染的同时，使外源基因得到高效表达。

(二)本发明使用的昆虫-杆状病毒真核表达系统高效、安全、人畜无害，且表达的PCV2d Cap与PCV3 Cap蛋白的结构与功能与天然状态完全一致，最大程度地保留了其免疫原性。

(三)本发明提供的PCV2d型和PCV3型二联亚单位疫苗，与单价疫苗相比，可以减少人共成本、减少疫苗接种次数，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应。

(四)PCV2d型和PCV3型二联亚单位疫苗制备方法简单，蛋白产量大、纯度高，抗原免疫性更强，可有效激活机体的免疫反应，对PCV2d和PCV3均能起到理想的免疫保护作用。

本发明利用昆虫-杆状病毒表达载体系统表达PCV2d和PCV3的Cap蛋白，蛋白产量高，纯度高，作为制备疫苗的抗原免疫性更强，安全性更高。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组质粒pFastBacDual-PCV2d ORF2(A)和pFastBacDual-PCV3 ORF2(B)的酶切鉴定结果；其中，M为DNA分子量标准，1为pFastBacDual-PCV2d ORF2酶切产物；2为pFastBacDual-PCV3 ORF2酶切产物。

图2为本发明实施例1中目的蛋白PCV2d Cap(A)和PCV3 Cap(B)的Western blot检测结果；其中，M为蛋白分子量标准，1为目的蛋白PCV2d Cap，2为目的蛋白PCV3Cap。

图3为本发明实施例3中分别用PCV2d Cap蛋白(A)和PCV3 Cap蛋白(B)的包被板做ELISA检测特异性抗体的结果。

图4为本发明实施例3中分别用ELISA进行抗原PCV2d Cap蛋白(A)和PCV3 Cap蛋白(B)特异性抗体检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白的表达纯化

本实施例提供两种重组杆状病毒，分别命名为Ac-PCV2d Cap及Ac-PCV3 Cap，Ac-PCV2d Cap包含猪圆环病毒2d型的Cap蛋白基因序列(SEQ ID NO:1)，Ac-PCV3Cap包含猪圆环病毒3型的Cap蛋白基因序列(SEQ ID NO:2)，基因序列均来源于人工合成，经过密码子优化，优化后的Cap蛋白基因序列表达的蛋白质氨基酸序列、结构和功能不变，且更适宜在昆虫-杆状病毒表达系统中高效表达。

(一)构建重组转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2和pFastBacDual-PCV3 ORF2

\1、获取目的基因PCV2d-ORF2，PCV3-ORF2

参照PCV2d(GenBank:JQ002671.1)和PCV3(GenBank:MG778698.1)的ORF2基因序列，根据杆状病毒密码子的偏爱性，人工合成708bp的PCV2d-ORF2和657bp的PCV3-ORF2，并在其氨基端引入AcMNPV GP64信号肽序列，以便表达的目的蛋白分泌到细胞外；在羧基端引入6×His标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础。合成的目的基因PCV2d-ORF2和PCV3-ORF2置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-PCV2d ORF2和pUC-PCV3ORF2的形式获得。

2、构建重组转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2和pFastBacDual-PCV3 ORF2

采用常规酶切连接流程和方法构建重组转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2和pFastBacDual-PCV3 ORF2。

(1)酶切：采用BamHI、EcoRI(购自TAKARA)两个酶切位点，对人工合成基因PCV2dORF2和PCV3 ORF2从pUC-PCV2d ORF2和pUC-PCV3 ORF2上进行双酶切；同时用相同的内切酶对转移载体pFastBacDual(购自Invitrogen)进行酶切。酶切体系如下：

pUC-PCV2d ORF2或pUC-PCV3 ORF2/pFastBacDual	3μg
		BamHI	2μl
EcoRI	2μl
		10×酶切缓冲液	3μl
水	补齐至30μl

酶切条件：37℃，3h。酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

(2)连接：

片段PCV2d ORF2/PCV3 ORF2	6μl
		载体pFastBacDual	2.5μl
T4连接酶	0.5μl
		10×缓冲液	1μl

连接条件：22℃，2h。

(3)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。

(4)提取重组质粒pFastBacDual-PCV2d ORF2和pFastBacDual-PCV3 ORF2：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，BamHI、EcoRI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图1。

(二)构建重组杆状病毒Ac-PCV2d Cap及Ac-PCV3 Cap

(1)获得重组穿梭载体rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV3 ORF2：

取4μl重组转移质粒pFastBacDual-PCV2d ORF2和pFastBacDual-PCV3 ORF2分别转入100μl感受态细胞DH10Bac(购自GiBCO BRL)中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入900μl无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落、提取重组杆粒rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV3 ORF2。提取方法：无菌挑取阳性白色菌落于三抗LB液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L CH₃COOK，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，12000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温12000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μl无菌水中，立即使用或-20℃保存。

(2)获得重组杆状病毒：

利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。转染方法按照脂质体说明书(Cellfectin II Reagent购自Invitrogen)进行。

(三)目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达与纯化

1、目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为0.8×10⁶/mL，细胞体积为400ml。72-96h后收获细胞培养上清进行Western blot检测目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达。

悬浮培养的条件为：27℃，120rpm。

2、目的蛋白的纯化：

纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：取接毒后72-96h的HighFive^TM细胞培养上清，10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45μm的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(300mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)4℃透析过夜，得到目的蛋白。进行Western blot检测纯化后的蛋白。检测结果见图2。

实施例2猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗的制备

纯化得到的PCV2d Cap和PCV3 Cap蛋白测定浓度后过滤，二者按等质量比混匀，再与无菌201佐剂按照3:1的质量比乳化制备成二联亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的PCV2dCap和PCV3 Cap抗原含量均为40μg，置于4℃保存待用。同时，将PCV2d Cap和PCV3 Cap蛋白按等质量比混匀后，按抗原和Gel01水佐剂4:1的质量比进行疫苗制备，同样放置于4℃保存待用。

1、不同佐剂制备的疫苗稳定性对比试验

将制备的两种猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白亚单位疫苗分别放置在37℃、25℃、4℃观察。定期抽样观察该疫苗的稳定性，试验结果见表1、表2、表3，试验结果表明，201佐剂的稳定性很好，在37℃、25℃、4℃条件下均为最佳。

表1 37℃条件下观察稳定性天数

表2 25℃条件下观察稳定性天数

表3 4℃条件下观察稳定性天数

注：表1～表3中，“-”表示颗粒均匀的乳剂；“-+”表示在疫苗液面上层有乳白色/或有油析出/或分层；“+”表示疫苗乳液有沉淀，液面上层有大量乳白色物/或破乳。

2、不同佐剂制备的疫苗抗体消长规律试验

购买2月龄猪9头，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体，随机分成A、B、C三组。A组每头猪免疫2ml无菌201佐剂制备的PCV 2d型与3型Cap蛋白亚单位疫苗，颈部肌肉注射；B组每头猪免疫2ml无菌Gel01佐剂制备的PCV 2d型与3型Cap蛋白亚单位疫苗，颈部肌肉注射；C组不免疫作为空白对照。免疫前和免疫后第7天、第14天、第28天、第42天对每组仔猪采血，用ELISA法检测抗体水平。不同佐剂制备的亚单位疫苗免疫后抗体检测结果见表4和表5。试验结果表明，201佐剂比Gel01佐剂更能刺激机体产生抗体，具有更好的效果，因此将201佐剂用作二联亚单位疫苗的佐剂。

表4不同佐剂免疫后PCV2抗体检测结果

表5不同佐剂免疫后PCV3抗体检测结果

实施例3猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗的免疫保护效果评价及安全性评价

猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗在小鼠体内评价：

1、猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗在小鼠体内进行安全性评价

购买6-8周雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.3ml实施例2制备的PCV 2d型与3型二联疫苗(201佐剂)；B组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)；连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明该疫苗对小鼠是安全的。

2、猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗在小鼠体内进行免疫原性评价购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射0.2ml实施例2制备的PCV 2d型与3型二联疫苗(201佐剂)，2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，断尾采血取血清，血清稀释1000倍后，分别用PCV2d Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体，结果见图3。

猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚疫苗在猪体内评价：

1、猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗在猪体内进行安全性评价

购买约2月龄猪6头，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体，随机分成A、B两组，隔离饲养，每组3头。A组每头猪免疫2ml实施例2制备的PCV 2d型与3型二联疫苗(201佐剂)，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对本体动物猪是安全的。

2、猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗在猪体内进行有效性评价

为了进一步评价上述制备二联亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，购买约2月龄猪8头，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体，随机分成A、B两组，隔离饲养，每组4头。A组每头猪免疫2ml实施例2制备的PCV 2d型与3型二联疫苗(201佐剂)，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。首免后7天，14天，28天和42天进行前腔静脉采血，分别用ELISA进行抗原特异性抗体检测，检测结果见图4。结果表明该疫苗良好的免疫原性，能够激发机体产生保护性中和抗体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用

<130> KHP191114308.8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccatgg taagcgctat tgttttatat gtgcttttgg cggcggcggc gcattctgcc 60

tttgcggcgg atctaccccg ccaccgttac cgctggagaa ggaaaaatgg catcttcaac 120

acccgcctct cccgcaccat cggttatact gtcaagaaaa ccacagtcag aacgccctcc 180

tggaatgtgg acatgatgag atttaatatt aatgattttc ttcccccagg agggggctca 240

aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagga aggttaaggt tgaattctgg 300

ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagtgggct ccactgctgt tattctagat 360

gataactttg taacaaaggc caatgcccta acctatgacc cctatgtaaa ctactcctcc 420

cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtc 480

cttgatagga caatcgatta cttccaaccc aataacaaaa gaaatcaact ctggctgaga 540

ctacaaacta ctggaaatgt agaccatgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata 600

tacgaccagg actacaatat ccgtataacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt 660

aaagaccccc cacttaaccc aaagtgacat catcaccatc accattaa 708

<210> 2

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaccatgg taagcgctat tgttttatat gtgcttttgg cggcggcggc gcattctgcc 60

tttgcggcgg atctagcgcc caccgccggc acctactaca ccaagaagta ctccaccatg 120

aacgtgatca gcgtgggcac ccctcagaac aacaagcctt ggcacgctaa ccacttcatc 180

acccgcctga acgagtggga gaccgccatc agcttcgagt actacaagat cctgaagatg 240

aaggtgaccc tgagccctgt gatcagccct gctcagcaga ccaagaccat gttcggtcac 300

accgccatcg acctggacgg tgcctggacc accaacacct ggctgcagga cgacccttac 360

gctgaaagca gcacccgtaa ggttatgacc tccaagaaga agcactcccg ctacttcacc 420

cctaagccta tcctggctgg tactaccagc gctcaccctg gccagtccct gttcttcttc 480

tcccgtccta ccccttggct gaacacctac gaccctaccg tgcagtgggg cgctctgctg 540

tggagcatct acgtgcctga aaagaccggt atgaccgact tctacggtac taaggaagtg 600

tggatcaggt acaagagcgt gctgggtagc ggtagccatc atcaccatca ccattaa 657

<210> 3

<211> 203

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 3

Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr

1 5 10 15

Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg

20 25 30

Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe

35 40 45

Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr

50 55 60

Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile

65 70 75 80

Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp

85 90 95

Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn

100 105 110

Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg

115 120 125

Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln

130 135 140

Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly

145 150 155 160

Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr

165 170 175

Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu

180 185 190

Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

195 200

<210> 4

<211> 187

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 4

Ala Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn

1 5 10 15

Val Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn

20 25 30

His Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu

35 40 45

Tyr Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser

50 55 60

Pro Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu

65 70 75 80

Asp Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala

85 90 95

Glu Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg

100 105 110

Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro

115 120 125

Gly Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr

130 135 140

Tyr Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val

145 150 155 160

Pro Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp

165 170 175

Ile Arg Tyr Lys Ser Val Leu Gly Ser Gly Ser

180 185

Claims

1.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含如SEQ ID NO:3和4所示的多肽以及药学上可接受的载体。

2.猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗，其特征在于，其包含权利要求1所述的免疫原性组合物，任选包含佐剂。

3.根据权利要求2所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为兽医学可接受的铝盐系列佐剂、Montanide系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、卵磷脂类佐剂或细胞因子类佐剂中至少一种。

4.根据权利要求3所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为201佐剂。

5.权利要求2所述二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于PCV2d和PCV3的ORF2基因序列，根据杆状病毒密码子的偏爱性，人工合成PCV2d-ORF2和PCV3-ORF2目的基因，并在其5′端引入编码AcMNPV GP64信号肽的核酸序列，在3′端引入6×His标签序列；合成的目的基因的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；

(2)将目的基因PCV2d-ORF2、PCV3-ORF2分别构建到载体pFastBacDual的BamHI和EcoRI的酶切位点之间，得到转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2、pFastBacDual-PCV3 ORF2；

(3)将转移载体pFastBacDual-PCV2d ORF2、pFastBacDual-PCV3 ORF2分别转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选纯化得到阳性重组穿梭载体，分别命名为rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV3 ORF2；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)包括：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High Five中，接毒剂量为0.01-0.05MOI，细胞密度为0.5×10⁶/mL～1×10⁶/mL，72～96h后收获细胞培养上清进行Westernblot检测目的蛋白PCV2d Cap和PCV3 Cap的表达情况。

7.权利要求1所述免疫原性组合物，或权利要求2-4任一项所述二联亚单位疫苗，或者按照权利要求5或6所述方法制备的二联亚单位疫苗在制备用于治疗或预防猪圆环病毒感染的药物中的应用。