CN110358742A - 猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法。本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白编码基因。本发明还提供猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗，其包含采用所述重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白。本发明通过人工密码子优化，实现了猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白的高水平、高纯度表达，保证了Cap蛋白的天然结构和免疫原性。本发明提供的猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗具有高度的免疫原性和安全性，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。

Description

猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒2b型和2d型的Cap蛋白的重组杆状病毒及其制备方法以及利用该重组杆状病毒制备猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗的方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，PCV2病毒基因组为共价闭合单股环状单链DNA，病毒衣壳呈二十面体对称，直径约17nm，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。因PCV2为无囊膜病毒，故其对外界环境条件有着较强的抵抗力，病毒在pH为3的酸性环境和56℃至70℃的高温下仍保持稳定，对酒精、氯已定、氯仿、碘等脂溶性消毒剂抵抗力较强，对碱性消毒剂、氧化剂、季胺类化合物、氢氧化合物等较敏感。
猪圆环病毒2型的基因组长度介于1766bp和1769bp之间,目前研究较多的为三个主要开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3。其中，ORF2位于基因组互补链上，一般为702bp或705bp，编码233或234个氨基酸，形成病毒的核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白也是PCV2的主要免疫原性蛋白，其C端含有较多的转角结构，亲水指数和抗原指数较高，该区段存在优势抗原表位，N端包含大量碱性氨基酸序列，其与Cap蛋白的核内定位密切相关。由此可见，Cap蛋白在猪圆环病毒的诊断及疫苗研究中具有重要作用。
猪圆环病毒被发现时存在两种亚型，分别为PCV2a和PCV2b。2000年以后，PCV2a作为起初主要造成PMWS的亚型正在逐渐被PCV2b代替。不仅如此，2012年发现的一种PCV2b的变异株(PCV2d)表现出更高的感染性和致病性。猪圆环病毒的疫苗种类繁多，以PCV2b亚型为主。中国专利CN201710295409.4(活的减毒嵌合猪圆环病毒疫苗)公开了一种嵌合猪圆环病毒感染型DNA克隆和活的减毒嵌合病毒，其为将PCV-2b的衣壳基因整合到非致病的PCV1病毒基因组中，该减毒嵌合疫苗保护猪免受PCV2b的攻击，但其在生产和应用过程中的安全性差，在动物体内存在返强的潜在危险。新型变异毒株的出现使得人们不得不重视PCV2造成的经济损失和病毒防疫。目前，临床上PCV2d的检出率不断提高，2018年PCV2d的检出率达33.19％，而目前市场上所有的PCV2疫苗都是针对PCV2a和PCV2b亚型，尚无同时针对PCV2b和PCV2d亚型毒株的疫苗。面对新型毒株的出现，虽然现有疫苗对新型毒株也表现出一定的交叉保护效果，但随着新型毒株的不断变异，依然需要加快PCV2型新疫苗的研发。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在体外通过Tn7转座子作用使外源基因插入到杆状病毒的基因组上，具有操作方便、快速有效的优势，是目前使用最广泛的表达系统。同时随着昆虫细胞大规模悬浮培养技术成熟与应用，杆状病毒表达系统的应用更加广泛。杆状病毒载体表达系统使用P10启动子或PH启动子，将外源目的基因以单拷贝或者多拷贝形式插入到启动子下游，通过同源重组的方法获得重组杆状病毒，这种重组杆状病毒在昆虫细胞或虫体内感染的同时，使外源基因得到高效表达。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种高效表达猪圆环病毒2b型和2d型的Cap蛋白的重组杆状病毒及其制备方法，以及利用该重组杆状病毒制备猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的PCV2的Cap蛋白编码基因，所述Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示的序列。
上述如SEQ ID NO.1所示的序列为PCV2b的Cap蛋白编码基因经密码子优化得到；如SEQ ID NO.2所示的序列为PCV2d的Cap蛋白编码基因经密码子优化得到。上述经密码子优化的编码序列为本发明经大量人工优化和筛选得到，能够在最大程度地保证天然结构以及较高的免疫原性的同时，实现Cap蛋白的高水平、高纯度表达。
作为优选，所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO.5所示的序列或含有如SEQ IDNO.6所示的序列。
上述如SEQ ID NO.5所示的序列为在如SEQ NO.1所示的序列的N端添加GP64信号肽序列、C端添加6×his标签肽序列得到。上述如SEQ ID NO.6所示的序列为在如SEQ NO.2所示的序列的N端添加GP64信号肽序列、C端添加6×his标签肽序列得到。携带上述序列的重组杆状病毒能够高水平表达分泌型Cap蛋白，并且利于Cap蛋白的分离和纯化。
作为优选，所述重组杆状病毒中，所述PCV2的Cap蛋白编码基因在pH启动子下控制转录。Cap蛋白的编码基因序列能够更好地与该启动子配合作用，有利于进一步提高Cap蛋白的表达量。
本发明还提供所述重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将PCV2b和PCV2d的Cap蛋白编码基因分别进行密码子优化，分别得到如SEQ IDNO.1所示和如SEQ ID NO.2所示的序列，在如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示的序列的N端和C端分别添加GP64信号肽和6×his标签肽序列，分别得到如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的序列；
(2)将如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列分别插入转移质粒中，构建得到重组转移质粒；
(3)将所述重组转移质粒转入大肠杆菌内进行同源重组，构建分别携带如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列的重组杆粒；
(4)将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
作为优选，上述步骤(2)中的转移质粒为pFastdual。
作为优选，上述步骤(3)中的大肠杆菌为DH10Bac菌株。
作为优选，上述步骤(4)中的昆虫细胞为sf9昆虫细胞。
本发明还提供所述重组杆状病毒在制备PCV2的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。
所述抗原包括但不限于用于诊断PCV2的血清抗体检测用抗原。
所述抗体包括但不限于用于检测PCV2的抗原的抗体。
本发明还提供一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，其包含PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。
作为优选，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的质量比为1：1。
作为优选，所述PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗中包含的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白为采用本发明所述重组杆状病毒表达得到。
本发明还提供一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法，包括：利用所述重组杆状病毒表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。
具体地，所述PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述重组杆状病毒导入昆虫细胞，培养携带所述重组杆状病毒的昆虫细胞，表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；
(2)分离和纯化PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；
(3)将纯化的PCV-2b和PCV2d的Cap蛋白混合，制备所述二价亚单位疫苗或再与佐剂混合制备所述二价亚单位疫苗。
作为优选，上述步骤(1)中，所述昆虫细胞为sf9昆虫细胞。
作为优选，上述步骤(2)中，所述纯化为采用镍柱亲和层析纯化。
作为优选，上述步骤(3)中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白混合的质量比为1：1。
作为优选，上述步骤(3)中，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂。
进一步优选地，所述佐剂为选自铝盐系列佐剂、Montanide IMS系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的任意一种或多种。
作为本发明的优选实施方式，所述二价亚单位疫苗的佐剂为201佐剂；所述二价亚单位疫苗中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白与所述佐剂的质量比为(2-5)：1。
本发明的有益效果在于：
本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白，通过人工密码子优化，实现了PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的高水平、高纯度表达，得到的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的结构状态与天然结构状态完全一致，最大程度地保留了Cap蛋白的功能和免疫原性。进一步采用信号肽GP64使Cap蛋白能够高效表达并分泌到细胞外，细胞培养上清中杂蛋白较少，结合6×his标签的添加极大地简化了蛋白的提取纯化过程。
本发明利于上述抗原蛋白的制备方法制备PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，该疫苗具有高度的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫猪产生高水平的保护性中和抗体，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。
本发明的PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗较单价疫苗具有更广泛的保护范围，可以减少疫苗接种次数，降低动物因疫苗免疫产生的应激反应，同时降低疫苗免疫成本。
本发明的PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗具有制备方法简单、高效、安全、人畜无害的优势，适于大量生产制备。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组转移载体pFastdual-PCV2d ORF2-1和pFastdual-PCV2b ORF2-1采用BamHI和EcoRI双酶切的鉴定结果；其中，A为pFastdual-PCV2d ORF2-1载体的鉴定结果，泳道1为DNA marker DL15000，泳道2为双酶切产物；B为pFastdual-PCV2bORF2-1载体的鉴定结果，泳道1为DNA marker DL15000，泳道2为双酶切产物。
图2为本发明实施例2中Ac-PCV2d Cap-1、Ac-PCV2d Cap-2以及Ac-PCV2b Cap-1、Ac-PCV2b Cap-2表达的经镍柱亲和层析纯化的PCV2d和PCV2b的Cap蛋白的SDS-PAGE检测结果；其中，A为PCV2d的Cap蛋白的检测结果；B为PCV2b的Cap蛋白的检测结果。
图3为本发明实施例2中Ac-PCV2b Cap-1和Ac-PCV2d Cap-1表达的经镍柱亲和层析纯化的PCV2d和PCV2b的Cap蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果；其中，A为PCV2d的Cap蛋白的检测结果；B为PCV2b的Cap蛋白的检测结果。
图4为本发明实施例4中二价亚单位疫苗免疫小鼠产生的特异性抗体检测结果，其中，A为PCV2d的Cap蛋白的特异性抗体；B为PCV2b的Cap蛋白的特异性抗体。
图5为本发明实施例5中二价亚单位疫苗免疫猪在免疫不同时间产生的特异性抗体的检测结果，其中，A为PCV2d的Cap蛋白的特异性抗体；B为PCV2b的Cap蛋白的特异性抗体。
图6为本发明实施例5中二价亚单位疫苗免疫猪在免疫不同时间产生的保护性中和抗体的检测结果，其中，A为PCV2d的Cap蛋白的保护性中和抗体；B为PCV2b的Cap蛋白的保护性中和抗体。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1携带猪圆环病毒2b和2d型的Cap蛋白编码基因的重组杆状病毒的构建
(一)构建重组转移载体pFastBac-PCV2d ORF2和pFastBac-PCV2b ORF2
1、PCV2d-ORF2和PCV2b-ORF2的密码子优化和合成
参照PCV2d(GenBank No.JQ002671)和PCV2b(GenBank No.KM924367)的ORF2基因序列(Cap蛋白编码基因)，为实现Cap蛋白的高效表达，本发明首先根据杆状病毒的密码子偏爱性对上述数据库中的序列进行密码子优化。本发明发现，采用常规的密码子优化软件或简单遵循昆虫-杆状病毒表达系统密码子的偏爱性进行ORF2基因的密码子优化，得到的Cap蛋白的表达水平和纯度并不能满足大量疫苗生产制备的要求，且不同程度的密码子优化得到的编码序列的表达水平差异较大，而密码子优化位置和优化程度与表达水平之间并无明显的规律。本实施例针对PCV2d-ORF2和PCV2b-ORF2分别以设计的不同密码子优化序列中的2条序列为例进行密码子优化序列筛选过程的示例性说明。其中，针对PCV2b-ORF2的2条密码子优化序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；针对PCV2d-ORF2的2条密码子优化序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。
分别在上述密码子优化序列的氨基端引入AcMNPV GP64信号肽序列，以便表达的目的蛋白分泌到细胞外；在羧基端引入6×His标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础，针对PCV2b-ORF2的2条密码子优化序列(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示)分别得到如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO7所示的序列。针对PCV2d-ORF2的2条密码子优化序列(如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示)分别得到如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的序列。人工合成如SEQ ID NO.5(PCV2b-ORF2-1)和SEQ ID NO.7(PCV2b-ORF2-2)所示的片段(706bp)以及如SEQ ID NO.6(PCV2d-ORF2-1)和SEQ ID NO.8(PCV2d-ORF2-2)所示(709bp)的片段，得到PCV2d-ORF2-1、PCV2d-ORF2-2、PCV2b-ORF2-1和PCV2b-ORF2-2。合成的上述目的基因置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-PCV2d ORF2-1、pUC-PCV2d ORF2-2和pUC-PCV2b ORF2-1、pUC-PCV2b ORF2-2的形式取得。
2、构建重组转移载体pFastdual-PCV2d ORF2和pFastdual-PCV2b ORF2
采用常规重组质粒构建流程和方法构建重组转移载体pFastdual-PCV2d ORF2和pFastdual-PCV2b ORF2，具体方法如下：
(1)酶切：采用BamHI和EcoRI(购自TAKARA)分别对上述步骤1得到的pUC-PCV2dORF2-1、pUC-PCV2d ORF2-2、pUC-PCV2b ORF2-1和pUC-PCV2b ORF2-2进行双酶切，获得人工合成基因PCV2d-ORF2-1、PCV2d-ORF2-2、PCV2b-ORF2-1和PCV2b-ORF2-2；同时用相同的内切酶对转移载体pFastdual进行酶切。双酶切反应体系和条件如表1所示。
表1双酶切反应体系和条件
酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。
(2)连接：将上述得到的PCV2d-ORF2-1、PCV2d-ORF2-2、PCV2b-ORF2-1和PCV2b-ORF2-2基因片段分别与载体pFastdual进行连接反应，连接反应体系和条件如表2所示。
表2连接反应体系和条件
(3)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。
(4)提取重组质粒pFastdual-PCV2d ORF2-1、pFastdual-PCV2d ORF2-2、pFastdual-PCV2b ORF2-1和pFastdual-PCV2b ORF2-2：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，BamHI、EcoRI进行酶切鉴定，结果表明上述重组质粒均构建成功，其中，pFastdual-PCV2d ORF2-1和pFastdual-PCV2b ORF2-1的酶切鉴定结果如图1所示。
(二)构建重组杆状病毒Ac-PCV2d Cap及Ac-PCV2b Cap
1、获得重组穿梭载体
取4μl重组转移质粒pFastdual-PCV2d ORF2-1、pFastdual-PCV2d ORF2-2、pFastdual-PCV2b ORF2-1和pFastdual-PCV2b ORF2-2分别转入100μl大肠杆菌感受态DH10Bac(购自GiBCO BRL)中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入900ul无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落。提取重组杆粒rBac-PCV2d ORF2和rBac-PCV2b ORF2，提取方法如下：无菌挑取阳性白色菌落于三抗LB液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/LCH3COOK，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL无菌水中，立即使用或-20℃保存。
2、获得重组杆状病毒
利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒Ac-PCV2d Cap-1、Ac-PCV2dCap-2以及Ac-PCV2b Cap-1、Ac-PCV2b Cap-2，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。转染方法按照脂质体说明书(lipo2000购自invitrogen)进行。
实施例2目的蛋白PCV2d-Cap和PCV2b-Cap的表达与纯化
1、目的蛋白PCV2d Cap和PCV2b Cap的表达
将实施例1收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High FiveTM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为0.8*106/ml，细胞体积为400ml。72-96h后收获细胞培养上清进行Western blotting检测目的蛋白PCV2d-Cap和PCV2b-Cap的表达，结果表明，重组杆状病毒Ac-PCV2d Cap-1、Ac-PCV2d Cap-2以及Ac-PCV2b Cap-1、Ac-PCV2bCap-2均可以表达PCV2d-Cap和PCV2b-Cap。
2、目的蛋白的纯化
纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：取接毒后72-96h的HighFiveTM细胞培养上清，10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45μm的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(300mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)4℃透析过夜，得到目的蛋白。将重组杆状病毒Ac-PCV2d Cap-1、Ac-PCV2d Cap-2以及Ac-PCV2b Cap-1、Ac-PCV2b Cap-2表达蛋白经上述镍柱亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting检测纯化后的蛋白。其中，Ac-PCV2d Cap-1、Ac-PCV2dCap-2以及Ac-PCV2b Cap-1、Ac-PCV2b Cap-2表达蛋白经上述镍柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE检测结果如图2所示，结果显示，Ac-PCV2d Cap-1和Ac-PCV2d Cap-2表达的Cap蛋白纯度相当，但Ac-PCV2d Cap-2表达的Cap蛋白得率为20μg/ml，而Ac-PCV2d Cap-1表达的Cap蛋白得率提高至50μg/ml；同样地，Ac-PCV2d Cap-1和Ac-PCV2d Cap-2表达的Cap蛋白纯度相当，但Ac-PCV2d Cap-2表达的Cap蛋白得率为20μg/ml，而Ac-PCV2d Cap-1表达的Cap蛋白得率提高至50μg/ml。以上结果表明本发明经特异的人工密码子优化、添加信号肽和标签肽序列得到的如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6所示的PCV2d Cap和PCV2b Cap序列能够显著提高Cap蛋白的表达水平，实现高水平分泌表达。
表达效果最优的Ac-PCV2b Cap-1和Ac-PCV2d Cap-1的表达纯化蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果如图3所示。后续二价亚单位疫苗或对照的单价亚单位疫苗的制备均采用Ac-PCV2b Cap-1和Ac-PCV2d Cap-1的表达纯化的PCV2b Cap和PCV2d Cap蛋白。
实施例3猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗的制备
将实施例2纯化得到的PCV2d-Cap和PCV2d-Cap蛋白测定浓度后过滤，二者等质量混匀，再与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备成二价亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的PCV2d-Cap和PCV2d-Cap抗原含量均为40μg，置于4℃保存待用。
实施例4猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗在小鼠体内的安全性和免疫效果评价
1、小鼠体内安全性评价
购买16-18g雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.3ml实施例3制备的2d型与2b型二价亚单位疫苗；B组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)；连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明实施例3制备的亚单位疫苗对小鼠是安全的。
2、小鼠体内免疫原性评价
购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射0.2ml实施例3制备的二价亚单位疫苗，2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，断尾采血取血清，血清稀释1000倍后，分别用PCV2d-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体，结果如图4所示，结果表明，实施例3制备的二价亚单位疫苗具有良好的免疫原性，可以刺激小鼠产生高水平的特异性抗体。
实施例5猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗在猪体内的安全性和免疫效果评价
1、猪体内的安全性评价
购买约2月龄PCV阴性猪6头，随机分成A、B两组，每组3头。A组每头猪免疫1头份(即2ml)实施例3制备的二价亚单位疫苗，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明实施例3制备的二价亚单位疫苗对本体动物猪是安全的。
2、猪体内的有效性评价
为了进一步评价实施例3制备的二价亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约2月龄PCV阴性猪8头，随机分成A、B两组，每组4头。A组每头猪免疫1头份(即2ml)，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。首免后7天14天，28天和42天进行前腔静脉采血，分别用ELISA进行抗原特异性抗体检测和中和抗体检测。检测结果分别如图4和图5所示。结果表明，实施例3制备的二价亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够激发猪机体产生高水平的特异性抗体(图5)和保护性中和抗体(图6)。
实施例6猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力评价
对实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力进行验证，以猪圆环病毒2b型和2d型的单价亚单位疫苗作为对照，猪圆环病毒2b型和2d型的单价亚单位疫苗即为将实施例2制备的PCV2d-Cap和PCV2d-Cap蛋白分别单独与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备得到。
1、试验材料
(1)试验动物
21-25日龄仔猪42头，对主要病原和相关抗体进行检测，猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒病原阴性。
(2)试验用疫苗
组A：实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗；
组B：猪圆环病毒2b型亚单位疫苗；
组C：猪圆环病毒2d型亚单位疫苗。
(3)攻毒用毒株
猪圆环病毒2d型毒株PCV2d(登录号为NO:JQ002671)，猪圆环病毒2b型-WH株，(CCTCC NO:V201333)。
2、试验方法
(1)试验分组
将试验猪随机分为6组：
组A：猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗，共12头仔猪；
组B：猪圆环病毒2b型亚单位疫苗，共6头仔猪；
组C：猪圆环病毒2d型亚单位疫苗，共6头仔猪；
组D：猪圆环病毒2b型攻毒对照组，共6头仔猪；
组E：猪圆环病毒2d型攻毒对照组，共6头仔猪；
组F：非免疫空白对照组，共6头仔猪，隔离饲养。
(2)攻毒试验
将实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗，猪圆环病毒2b型亚单位疫苗，猪圆环病毒2d型亚单位疫苗，分别每头猪颈部注射，免疫一头份(二价亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap和PCV2d-Cap各40μg；2b型亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap 40μg；2d型亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap 40μg)。免疫28天后攻毒。组A中随机挑选6头，攻猪圆环病毒2d型毒株PCV2d(登录号为NO:JQ002671)，剩余6头攻猪圆环病毒2b型-WH株。组B和组D进行猪圆环病毒2b型-WH株攻毒，组C和组E进行猪圆环病毒2d型毒株PCV2d(登录号为NO:JQ002671)攻毒，攻毒方式均为每头猪颈部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔离饲养。组F不免疫也不攻毒。于攻毒当日，称重所有试验仔猪体重。并于攻毒前3日和攻毒后3日、6日，所有仔猪均注射免疫刺激材料(费氏不完全佐所有剂制备的多孔血蓝蛋白乳剂)，每次每头猪颈部注射2ml。观察28天后，再对试验猪称重，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况。攻毒后28天剖检全部仔猪。
攻毒后仔猪发病判断标准，符合以下三项中的两项，即可判定发病。
A体温症状：仔猪体温升高(≧40℃)，应至少持续3天；
B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0％，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：
相对增重率(％)＝非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重/攻毒对照组仔猪平均日增重×100
C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测淋巴结组织，检测攻毒毒株。
3、试验结果
猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗和猪圆环病毒2b型亚单位疫苗、猪圆环病毒2d型亚单位疫苗攻毒保护对比试验结果(见表3)，试验结果表明，各疫苗均有免疫保护效果，可以抵抗PCV2b和PCV2d的攻击。同时，二价亚单位疫苗的免疫效果优于单价亚单位疫苗的免疫效果。攻毒试验证明，二价亚单位疫苗具有更好的免疫保护作用。
表3亚单位疫苗攻毒保护免疫效力验证
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法
<130> KHP191112808.1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc 60
cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac 120
atgatgagat tcaatattaa taattttctt cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct 180
gtgccctttg aatactacag aataagaaag gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg 240
atcacccacg gtcacagggg agtgggctcc agtgctgtta ttctagatga taactttgta 300
acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc tatgtaaact actcctcccg ccataccata 360
acccagccct tctcctacca ctcccgctac tttaccccca aacctgtcct agattccact 420
attgattact tccaaccaca caaccaaaga aatcagctgt ggctgagact acaaactgct 480
ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa 540
tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca 600
cttaaccct 609
<210> 2
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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atgagattca atattaatga ttttcttccc ccaggagggc gctcaaaccc cctcactgtg 180
ccctttgaat actacagaat aaggaaggtt aaggttgaat tctggccctg ctccccaatc 240
acccagggtg acaggggagt gggctccact gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca 300
aaggccaatg ccctaaccta tgacccctat gtaacctact cctcccgcca taccataacc 360
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aatatccgta taaccatgta tgtacaattc agagaattta atcttaaaga ccccccactt 600
aacccaaagt ga 612
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<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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gataactttg taacaaaggc caatgcccta acctatgacc cctatgtaaa ctactcctcc 420
cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtc 480
cttgatagga caatcgatta cttccaaccc aataacaaaa gaaatcaact ctggctgaga 540
ctacaaacta ctggaaatgt agaccatgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata 600
tacgaccagg actacaatat ccgtataacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt 660
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<210> 7
<211> 706
<212> DNA
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<400> 7
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aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actatcaagc gaaccacagt caaaacgccc 180
tcctgggcgg ttcccgccat accataaccc attaataatt ttcttccccc aggagggggc 240
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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ctacaaacta ctggaaatgt agaccatgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata 600
tacgaccagg actacaatat ccgtataacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt 660
aaagaccccc cacttaaccc aaagtgacca tcatcaccat caccattaa 709

Claims (10)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，其包含一个或多个拷贝的PCV2的Cap蛋白编码基因，所述Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒含有如SEQ IDNO.5所示的序列或含有如SEQ ID NO.6所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述PCV2的Cap蛋白编码基因在pH启动子下控制转录。
4.权利要求1～3任一项所述重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将PCV2b和PCV2d的Cap蛋白编码基因分别进行密码子优化，分别得到如SEQ IDNO.1所示和SEQ ID NO.2所示的序列，在如SEQ ID NO.1所示和如SEQ ID NO.2所示的序列的N端和C端分别添加GP64信号肽和6×his标签肽序列，分别得到如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的序列；
(2)将如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列分别插入转移质粒中，构建得到重组转移质粒；
(3)将所述重组转移质粒转入大肠杆菌内进行同源重组，构建分别携带如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的重组杆粒；
(4)将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
5.权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒在制备PCV2的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。
6.一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，其特征在于，包含PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；
优选地，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的质量比为1：1。
7.根据权利要求6所述的二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白为采用权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒表达得到。
8.一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：利用权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述重组杆状病毒导入昆虫细胞，培养携带所述重组杆状病毒的昆虫细胞，表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；
(2)分离和纯化PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；
(3)将纯化的PCV-2b和PCV2d的Cap蛋白混合，制备所述二价亚单位疫苗或再与佐剂混合制备所述二价亚单位疫苗；
优选地，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白混合的质量比为1：1。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂；
优选地，所述佐剂选自铝盐系列佐剂、MontanideIMS系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的任意一种或多种；
更优选地，所述二价亚单位疫苗的佐剂为201佐剂；所述二价亚单位疫苗中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白与所述佐剂的质量比为(2-5)：1。
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