CN114107229A

CN114107229A - 猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN114107229A
Application number: CN202111428954.9A
Authority: CN
Inventors: 承南; 肖澄; 周琳; 缪芬芳; 董彦鹏; 胡静雅; 胡芳; 朱盼盼; 巫泉
Original assignee: Jiangsu Nannong Hi Tech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Nannong Hi Tech Co ltd
Priority date: 2021-11-28
Filing date: 2021-11-28
Publication date: 2022-03-01

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法。本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白编码基因。本发明还提供猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗，其包含采用所述重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白。本发明通过人工密码子优化，实现了猪圆环病毒2b型或2d型的Cap蛋白的高水平、高纯度表达，保证了Cap蛋白的天然结构和免疫原性。本发明提供的猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗具有高度的免疫原性和安全性，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。

Description

猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒2b型和2d型的Cap蛋白的重组杆状病毒及其制备方法以及利用该重组杆状病毒制备猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗的方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，PCV2病毒基因组为共价闭合单股环状单链DNA，病毒衣壳呈二十面体对称，直径约17nm，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。因PCV2为无囊膜病毒，故其对外界环境条件有着较强的抵抗力，病毒在pH为3的酸性环境和56℃至70℃的高温下仍保持稳定，对酒精、氯已定、氯仿、碘等脂溶性消毒剂抵抗力较强，对碱性消毒剂、氧化剂、季胺类化合物、氢氧化合物等较敏感。

猪圆环病毒2型的基因组长度介于1766bp和1769bp之间,目前研究较多的为三个主要开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3。其中，ORF2位于基因组互补链上，一般为702bp或705bp，编码233或234个氨基酸，形成病毒的核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白也是PCV2的主要免疫原性蛋白，其C端含有较多的转角结构，亲水指数和抗原指数较高，该区段存在优势抗原表位，N端包含大量碱性氨基酸序列，其与Cap蛋白的核内定位密切相关。由此可见，Cap蛋白在猪圆环病毒的诊断及疫苗研究中具有重要作用。

猪圆环病毒被发现时存在两种亚型，分别为PCV2a和PCV2b。2000年以后，PCV2a作为起初主要造成PMWS的亚型正在逐渐被PCV2b代替。不仅如此，2012年发现的一种PCV2b的变异株(PCV2d)表现出更高的感染性和致病性。猪圆环病毒的疫苗种类繁多，以PCV2b亚型为主。中国专利CN201710295409.4(活的减毒嵌合猪圆环病毒疫苗)公开了一种嵌合猪圆环病毒感染型DNA克隆和活的减毒嵌合病毒，其为将PCV-2b的衣壳基因整合到非致病的PCV1病毒基因组中，该减毒嵌合疫苗保护猪免受PCV2b的攻击，但其在生产和应用过程中的安全性差，在动物体内存在返强的潜在危险。新型变异毒株的出现使得人们不得不重视PCV2造成的经济损失和病毒防疫。目前，临床上PCV2d的检出率不断提高，2018年PCV2d的检出率达33.19％，而目前市场上所有的PCV2疫苗都是针对PCV2a和PCV2b亚型，尚无同时针对PCV2b和PCV2d亚型毒株的疫苗。面对新型毒株的出现，虽然现有疫苗对新型毒株也表现出一定的交叉保护效果，但随着新型毒株的不断变异，依然需要加快PCV2型新疫苗的研发。

由于转座子序列的存在，据报道Bac-to-Bac^TM重组体可能不稳定，导致重组杆状病毒中目标基因的缺失以及病毒繁殖过程中重组蛋白表达的减少和最终丧失(Pijlman等al.,J.Gen.Virol.,84:2669-2678,2003)。如果目标蛋白具有细胞毒性或最初过度表达，则这种效果可能特别明显。由于存在转座子序列，重组杆状病毒本质上是不稳定的，因此无法通过库存纯化来可靠地修复此类库存。FlashBac ULTRA技术没有这些缺点。它有助于产生100％纯度和稳定的重组杆状病毒原液。使用FlashBac Ultra技术获得的重组杆状病毒不包含任何可能导致重组杆状病毒不稳定的遗传元件，例如转座子。此外，FlashBac ULTRA生成重组杆状病毒比使用其他载体更直接，并且操作简单。另外flash BAC ULTRA除了chiA(几丁质酶)和v-cath(组织蛋白酶)之外，还有另外三个病毒基因(p10、p74和p26)缺失。chiA的缺失提高了分泌途径的功效，而v-cath的缺失降低了重组蛋白被降解的机会。p10的缺失增加了多角体蛋白启动子的活性，从而提供了更大的核和细胞稳定性，确保了更长的蛋白质表达时间，并消除了限制细胞资源的主要竞争者。去除p74进一步增加了重组杆状病毒在环境中的生物安全性，使它们无法穿过昆虫肠壁。与p26一起，这些基因的缺失消除了重组病毒基因组中不必要的遗传负担，提供了更有效的杆状病毒表达载体。这进一步提高了重组蛋白的产量和质量，使flash BAC ULTRA是最难表达蛋白质的最佳选择。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种高效表达猪圆环病毒2b型和2d型的Cap蛋白的重组杆状病毒及其制备方法，以及利用该重组杆状病毒制备猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的PCV2的Cap蛋白编码基因，所述Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示的序列。

上述如SEQ ID NO.1所示的序列为PCV2b的Cap蛋白编码基因经密码子优化得到；如SEQ ID NO.2所示的序列为PCV2d的Cap蛋白编码基因经密码子优化得到。上述经密码子优化的编码序列为本发明经大量人工优化和筛选得到，能够在最大程度地保证天然结构以及较高的免疫原性的同时，实现Cap蛋白的高水平、高纯度表达。

上述如SEQ ID NO.3所示的序列为在如SEQ NO.1所示的序列的N端添加KOZAK序列和蜂毒信号肽。上述如SEQ ID NO.4所示的序列为在如SEQ NO.2所示的序列的N端添加KOZAK序列和蜂毒信号肽。携带上述序列的重组杆状病毒能够高水平表达分泌型Cap蛋白，并且利于Cap蛋白的分离和纯化。

作为优选，所述重组杆状病毒中，所述PCV2的Cap蛋白编码基因在PH启动子和P10启动子下控制转录。Cap蛋白的编码基因序列能够更好地与该启动子配合作用，有利于进一步提高Cap蛋白的表达量。

本发明还提供所述重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将PCV2b和PCV2d的Cap蛋白编码基因分别进行密码子优化，分别得到如SEQ IDNO.1所示和如SEQ ID NO.2所示的序列，在如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示的序列的N端添加KOZAK序列和蜂毒信号肽，分别得到如SEQ ID NO 3.和SEQ ID NO.4所示的序列；

(2)将如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列分别插入转移质粒中，构建得到重组转移质粒；

(3)将所述转移载体和杆状病毒DNA转染入昆虫细胞，获得重组杆状病毒。

作为优选，上述步骤(2)中的转移质粒为pOET5。

作为优选，上述步骤(3)中的昆虫细胞为sf9昆虫细胞。

本发明还提供所述重组杆状病毒在制备PCV2的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。

所述抗原包括但不限于用于诊断PCV2的血清抗体检测用抗原。

所述抗体包括但不限于用于检测PCV2的抗原的抗体。

本发明还提供一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，其包含PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。

作为优选，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的质量比为1：1。

作为优选，所述PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗中包含的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白为采用本发明所述重组杆状病毒表达得到。

本发明还提供一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法，包括：利用所述重组杆状病毒表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。

具体地，所述PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)将所述重组杆状病毒导入昆虫细胞，培养携带所述重组杆状病毒的昆虫细胞，表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；

(2)分离和纯化PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；

(3)将纯化的PCV-2b和PCV2d的Cap蛋白混合，制备所述二价亚单位疫苗或再与佐剂混合制备所述二价亚单位疫苗。

作为优选，上述步骤(1)中，所述昆虫细胞为sf9昆虫细胞。

作为优选，上述步骤(2)中，所述纯化为离子交换纯化。

作为优选，上述步骤(3)中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白混合的质量比为1：1。

作为优选，上述步骤(3)中，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂。

进一步优选地，所述佐剂为选自铝盐系列佐剂、Montanide I M S系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的任意一种或多种。

作为本发明的优选实施方式，所述二价亚单位疫苗的佐剂为201佐剂；所述二价亚单位疫苗中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白与所述佐剂的质量比为(2-5)：1。

本发明的有益效果在于：

本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白，通过人工密码子优化，实现了PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的高水平、高纯度表达，得到的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的结构状态与天然结构状态完全一致，最大程度地保留了Cap蛋白的功能和免疫原性。本发明利于上述抗原蛋白的制备方法制备PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，该疫苗具有高度的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫猪产生高水平的保护性中和抗体，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。本发明的PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗较单价疫苗具有更广泛的保护范围，可以减少疫苗接种次数，降低动物因疫苗免疫产生的应激反应，同时降低疫苗免疫成本。

本发明的PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗具有制备方法简单、高效、安全、人畜无害的优势，适于大量生产制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中重组转移载体pOET5-PCV2b(P10+PH)和pOET5-PCV2d(P10+PH)的PCR鉴定结果；其中，泳道1为DNA marker；1,2为pOET5-PCV2b(P10+PH)载体的鉴定结果；3,4为pOET5-PCV2d(P10+PH)载体的PCR鉴定结果。

图2为本发明实施例2中Flash BAC ULTR-pOET5-PCV2d、Flash BAC ULTR-pOET5-PCV2b表达的经离子交换纯化的PCV2d和PCV2b的Cap蛋白的SDS-PAGE检测结果；其中，1为PCV2b的Cap蛋白的检测结果；2为PCV2d的Cap蛋白的检测结果。

图3为本发明实施例2中Flash BAC ULTR-pOET5-PCV2b、Flash BAC ULTR-pOET5-PCV2d表达的经离子交换纯化的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的Western blotting检测结果；其中，1为PCV2b的Cap蛋白的检测结果；2为PCV2d的Cap蛋白的检测结果。

图4为本发明实施例4中二价亚单位疫苗免疫小鼠产生的特异性抗体检测结果，其中，A为PCV2b的Cap蛋白的特异性抗体；B为PCV2d的Cap蛋白的特异性抗体。

图5为本发明实施例5中二价亚单位疫苗免疫猪在免疫不同时间产生的特异性抗体的检测结果，其中，A为PCV2b的Cap蛋白的特异性抗体；B为PCV2d的Cap蛋白的特异性抗体。

图6为本发明实施例5中二价亚单位疫苗免疫猪在免疫不同时间产生的保护性中和抗体的检测结果，其中，A为PCV2b的Cap蛋白的保护性中和抗体；B为PCV2d的Cap蛋白的保护性中和抗体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1携带猪圆环病毒2b和2d型的Cap蛋白编码基因的重组杆状病毒的构建

(一)构建重组转移载pORT5-PCV2b(PH启动子+P10启动子)和pOET5-PCV2d(PH启动子+P10启动子)

1、PCV2b-ORF2和PCV2d-ORF2的密码子优化和合成

为实现Cap蛋白的高效表达，本发明首先根据昆虫细胞密码子偏爱性对序列进行密码子优化。

分别在上述密码子优化序列的氨基端引入KOZAK序列和蜂毒信号肽，针对PCV2b-ORF2和PCV2b-ORF2d的2条密码子优化并加KOZAK序列和蜂毒信号肽序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，并分别得到如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。合成的上述目的基因置于质粒载体pUC-19和pET32a(金斯瑞公司)上，即以pUC19-PCV2b、pET32a-PCV2d的形式取得。

2、构建重组转移载体pOET5-PCV2b(PH启动子+P10启动子)和pOET5-PCV2d(PH启动子+P10启动子)

采用常规重组质粒构建流程和方法构建重组转移载体pOET5-PCV2b(PH启动子+P10启动子)和pOET5-PCV2d(PH启动子+P10启动子)，具体方法如下：

2.1 pOET5-PCV2b(PH启动子)和pOET5-PCV2d(PH启动子)的构建

2.1.1用下表所述引物对pUC19-PCV2b、pET32a-PCV2d进行扩增

2bBamHI上	CCCGGATCCATCAAAATGAAATTTCTAGTAAACG
		2bHindIII下	CCCAAGCTTTTATTCATTCAGCGTTAAATGAGGAGTTT
2dBamHI上	CCCGGATCCATCAAAATGAAATTTCTAGTAAACG
		2dHindIII下	AACAAGCTTTCACTTCGGGTTTAGCGGTGGATCT

2.1.2酶切：采用BamHI和HindIII(购自赛默飞)对转移载体和PCR产物进行双酶切，

酶切反应体系和条件如表1所示。

表1

pOET5或PCR产物	0.5μg
		BamHI	1μl
HindIII	1μl
		10X FastDigest Green Buffer	2μl
水	补齐至20μl
		37℃酶切15min

2.1.3将酶切产物用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

2.1.4将酶切胶回收产物用T4连接酶进行连接。

2.1.5转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，涂平板。

提取转移质粒pOET5-2b(PH启动子)和pOET5-2d(PH启动子)：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，PCR鉴定，将阳性菌落送去测序，选取测序正确的重组质粒。

2.2pOET5-PCV2b(PH启动子+P10启动子)和pOET5-PCV2d(PH启动子+P10启动子)的构建

2.2.1用下表所述引物对pUC19-PCV2b、pET32a-PCV2d进行扩增

2bNotI上	CTTGCGGCCGCTTATTCATTCAGCGTTAAATGAGGAGTTTTTAGA
		2bEcoRI下	GCGGAATTCATCAAAATGAAATTTCTAGTAAACG
2dNotI上	TTTGCGGCCGCTCACTTCGGGTTTAGCGGTGGAT
		2dECoRI下	GCGGAATTCATCAAAATGAAATTTCTAGTAAACG

2.2.2酶切：采用NotI和EcoRI(赛默飞)对PCR产物和pOET5-2b(PH启动子)和pOET5-2d(PH启动子)转移载体按下表所述条件进行酶切

PCR产物或转移载体	0.5μg
		NotI	1μl
EcoRI	1μl
		10X FastDigest Green Buffer	2μl
水	补齐至20μl
		37℃酶切15min

2.2.3将酶切产物用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

2.2.4将酶切产物用T4连接酶进行连接。

2.1.5转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，涂平板。

提取转移质粒pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)和pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒送去测序，有测序正确的重组质粒表明构建成功。

(二)构建重组杆状病毒Flash BAC ULTR-pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)、FlashBAC ULTR-pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)

利用脂质体转染法，将提取的转移载体和杆状病毒DNA转染到sf9昆虫细胞中，4d后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒Flash BAC ULTR-pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)、Flash BAC ULTR-pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于4℃避光保存。转染方法按照说明书(baculoCOMPLETE)进行。

实施例2目的蛋白PCV2b-Cap和PCV2d-Cap的表达与纯化

1.目的蛋白PCV2b Cap和PCV2d Cap的表达

将实施例1收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High FiveTM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为0.8*106/ml，细胞体积为400ml。72-96h后收获细胞培养上清进行Western blotting检测目的蛋白PCV2b-Cap和PCV2d-Cap的表达，结果表明，重组杆状病毒Flash BAC ULTR-pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)、Flash BACULTR-pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)均可以表达PCV2b Cap和PCV2d Cap。

2、目的蛋白的纯化

表达效果最优的Flash BAC ULTR-pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)、Flash BACULTR-pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)表达纯化蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果如图3所示。后续二价亚单位疫苗或对照的单价亚单位疫苗的制备均采用Flash BACULTR-pOET5-2b(PH启动子+P10启动子)、Flash BAC ULTR-pOET5-2d(PH启动子+P10启动子)表达纯化的PCV2b Cap和PCV2d Cap蛋白。

实施例3猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗的制备

将实施例2纯化得到的PCV2b-Cap和PCV2d-Cap蛋白测定浓度后过滤，二者等质量混匀，再与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备成二价亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的PCV2d-Cap和PCV2d-Cap抗原含量均为40μg，置于4℃保存待用。

实施例4猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗在小鼠体内的安全性和免疫效果评价

1、小鼠体内安全性评价

购买16-18g雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.3ml实施例3制备的2d型与2b型二价亚单位疫苗；B组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)；连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明实施例3制备的亚单位疫苗对小鼠是安全的。

2、小鼠体内免疫原性评价

购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射0.2ml实施例3制备的二价亚单位疫苗，2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，断尾采血取血清，血清稀释1000倍后，分别用PCV2d-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体，结果如图4所示，结果表明，实施例3制备的二价亚单位疫苗具有良好的免疫原性，可以刺激小鼠产生高水平的特异性抗体。

实施例5猪圆环病毒2d型与2b型二价亚单位疫苗在猪体内的安全性和免疫效果评价

1.猪体内的安全性评价

购买约2月龄PCV阴性猪6头，随机分成A、B两组，每组3头。A组每头猪免疫1头份(即2ml)实施例3制备的二价亚单位疫苗，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明实施例3制备的二价亚单位疫苗对本体动物猪是安全的。

2.猪体内的有效性评价

为了进一步评价实施例3制备的二价亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约2月龄PCV阴性猪8头，随机分成A、B两组，每组4头。A组每头猪免疫1头份(即2ml)，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。首免后7天14天，28天和42天进行前腔静脉采血，分别用ELISA进行抗原特异性抗体检测和中和抗体检测。检测结果分别如图4和图5所示。结果表明，实施例3制备的二价亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够激发猪机体产生高水平的特异性抗体(图5)和保护性中和抗体(图6)。

实施例6猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力评价

对实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力进行验证，以猪圆环病毒2b型和2d型的单价亚单位疫苗作为对照，猪圆环病毒2b型和2d型的单价亚单位疫苗即为将实施例2制备的PCV2b-Cap和PCV2d-Cap蛋白分别单独与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备得到。

1、试验材料

(1)试验动物

21-25日龄仔猪42头，对主要病原和相关抗体进行检测，猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒病原阴性。

(2)试验用疫苗

组A：实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗；

组B：猪圆环病毒2b型亚单位疫苗；

组C：猪圆环病毒2d型亚单位疫苗。

(3)攻毒用毒株

猪圆环病毒2d型毒株PCV2d、猪圆环病毒2b型-WH株。

2、试验方法

(1)试验分组

将试验猪随机分为6组：

组A：猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗，共12头仔猪；

组B：猪圆环病毒2b型亚单位疫苗，共6头仔猪；

组C：猪圆环病毒2d型亚单位疫苗，共6头仔猪；

组D：猪圆环病毒2b型攻毒对照组，共6头仔猪；

组E：猪圆环病毒2d型攻毒对照组，共6头仔猪；

组F：非免疫空白对照组，共6头仔猪，隔离饲养。

(2)攻毒试验

将实施例3制备的猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗，猪圆环病毒2b型亚单位疫苗，猪圆环病毒2d型亚单位疫苗，分别每头猪颈部注射，免疫一头份(二价亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap和PCV2d-Cap各40μg；2b型亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap 40μg；2d型亚单位疫苗一头份：PCV2d-Cap 40μg)。免疫28天后攻毒。组A中随机挑选6头，攻猪圆环病毒2d型毒株PCV2d(登录号为NO:JQ002671)，剩余6头攻猪圆环病毒2b型-WH株。组B和组D进行猪圆环病毒2b型-W H株攻毒，组C和组E进行猪圆环病毒2d型毒株PC V2d(登录号为NO:JQ002671)攻毒，攻毒方式均为每头猪颈部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔离饲养。组F不免疫也不攻毒。于攻毒当日，称重所有试验仔猪体重。并于攻毒前3日和攻毒后3日、6日，所有仔猪均注射免疫刺激材料(费氏不完全佐所有剂制备的多孔血蓝蛋白乳剂)，每次每头猪颈部注射2ml。观察28天后，再对试验猪称重，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况。攻毒后28天剖检全部仔猪。

攻毒后仔猪发病判断标准，符合以下三项中的两项，即可判定发病。

A体温症状：仔猪体温升高(≧40℃)，应至少持续3天；

B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0％，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：

相对增重率(％)＝非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重/攻毒对照组仔猪平均日增重×100

C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测淋巴结组织，检测攻毒毒株。

3、试验结果

猪圆环病毒2b型和2d型二价亚单位疫苗和猪圆环病毒2b型亚单位疫苗、猪圆环病毒2d型亚单位疫苗攻毒保护对比试验结果(见表3)，试验结果表明，各疫苗均有免疫保护效果，可以抵抗PCV2b和PCV2d的攻击。同时，二价亚单位疫苗的免疫效果优于单价亚单位疫苗的免疫效果。攻毒试验证明，二价亚单位疫苗具有更好的免疫保护作用。

表3亚单位疫苗攻毒保护免疫效力验证

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰，也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏南农高科技股份有限公司

<120> 猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacatatc cgcgaagacg ttacaggcgt agacggcatc gcccccggtc tcatctaggg 60

caaatcctta gacgtaggcc ctggttagtg cacccaaggc accggtatcg atggcggaga 120

aaaaatggta tctttaacac gcgactctcg aggacgttcg gatatacgat aaagcgcacg 180

acagttaaga ctccttcctg ggctgtagat atgatgcgtt ttaacatcaa tgatttcctt 240

ccgccagggg gaggttcaaa tccaagatcg gttccgtttg aatactaccg catccgcaag 300

gtcaaagtcg agttttggcc atgcagtcct ataactcagg gggaccgagg cgtaggcagc 360

agcgcggtga ttttggacga caattttgta accaaggcaa cagcgctcac ttatgatccc 420

tatgtcaact atagtagtcg gcacaccata acccagccct tctcatacca ttcccgttat 480

ttcacaccga agcctgtgtt ggactctact attgactact ttcaacccaa caacaaacga 540

aatcaactct ggttgcgcct gcaaaccgcc ggaaacgtag atcacgtcgg tctaggcata 600

gcatttgaga actcaattta tgatcaggag tacaatattc gggttaccat gtacgtgcag 660

ttcagggaat ttaatctaaa aactcctcat ttaacgctga atgaataa 708

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgtacc cccgtagacg cttccggcgt cgaagacacc ggcctaggtc gcatcttgga 60

caaatactac gtcgtagacc gtggttggtg catccccggc acaggtatcg ctggcgaaga 120

aagaacggga tttttaatac ccgccttagc cgaacaattg ggtacactgt aaagaaaact 180

acggtgagga ccccctcatg gaatgtcgat atgatgaggt tcaacattaa tgactttctc 240

ccgcccggag gaggctcgaa cccattgact gtcccgtttg agtattatcg tatcaggaaa 300

gtcaaggtgg agttctggcc ctgttctcct atcacacagg gtgaccgcgg cgtcgggtct 360

accgctgtaa tactggatga caattttgtg actaaggcaa acgcgctaac atacgatcct 420

tatgttaatt attcctcccg gcatacgata actcaaccat tctcatacca cagtcgatac 480

tttacgccaa aaccagtttt agatggtact attgactact tccaacctaa taacaaacga 540

aatcagatat ggcttcggct gcagacaacg ggtaacgttg accatgttgg gctcggcacg 600

gcctttgaaa acagcatata tgaccaagat tacaacatca gaatcaccat gtatgtacag 660

ttccgcgaat ttaatttaaa agatccaccg ctaaacccga agtga 705

<210> 3

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcaaaatga aatttctagt aaacgttgcc ttagtcttta tggtggttta catatcttat 60

atctatgcta tgacatatcc gcgaagacgt tacaggcgta gacggcatcg cccccggtct 120

catctagggc aaatccttag acgtaggccc tggttagtgc acccaaggca ccggtatcga 180

tggcggagaa aaaatggtat ctttaacacg cgactctcga ggacgttcgg atatacgata 240

aagcgcacga cagttaagac tccttcctgg gctgtagata tgatgcgttt taacatcaat 300

gatttccttc cgccaggggg aggttcaaat ccaagatcgg ttccgtttga atactaccgc 360

atccgcaagg tcaaagtcga gttttggcca tgcagtccta taactcaggg ggaccgaggc 420

gtaggcagca gcgcggtgat tttggacgac aattttgtaa ccaaggcaac agcgctcact 480

tatgatccct atgtcaacta tagtagtcgg cacaccataa cccagccctt ctcataccat 540

tcccgttatt tcacaccgaa gcctgtgttg gactctacta ttgactactt tcaacccaac 600

aacaaacgaa atcaactctg gttgcgcctg caaaccgccg gaaacgtaga tcacgtcggt 660

ctaggcatag catttgagaa ctcaatttat gatcaggagt acaatattcg ggttaccatg 720

tacgtgcagt tcagggaatt taatctaaaa actcctcatt taacgctgaa tgaataa 777

<210> 4

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcaaaatga aatttctagt aaacgttgcc ttagtcttta tggtggttta catatcttat 60

atctatgcta tggcgtaccc ccgtagacgc ttccggcgtc gaagacaccg gcctaggtcg 120

catcttggac aaatactacg tcgtagaccg tggttggtgc atccccggca caggtatcgc 180

tggcgaagaa agaacgggat ttttaatacc cgccttagcc gaacaattgg gtacactgta 240

aagaaaacta cggtgaggac cccctcatgg aatgtcgata tgatgaggtt caacattaat 300

gactttctcc cgcccggagg aggctcgaac ccattgactg tcccgtttga gtattatcgt 360

atcaggaaag tcaaggtgga gttctggccc tgttctccta tcacacaggg tgaccgcggc 420

gtcgggtcta ccgctgtaat actggatgac aattttgtga ctaaggcaaa cgcgctaaca 480

tacgatcctt atgttaatta ttcctcccgg catacgataa ctcaaccatt ctcataccac 540

agtcgatact ttacgccaaa accagtttta gatggtacta ttgactactt ccaacctaat 600

aacaaacgaa atcagatatg gcttcggctg cagacaacgg gtaacgttga ccatgttggg 660

ctcggcacgg cctttgaaaa cagcatatat gaccaagatt acaacatcag aatcaccatg 720

tatgtacagt tccgcgaatt taatttaaaa gatccaccgc taaacccgaa gtga 774

<210> 5

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Ile Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Thr Pro His Leu Thr Leu Asn Glu

225 230 235

<210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Gly Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Ile Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

Claims

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，其包含一个或多个拷贝的PCV2的Cap蛋白编码基因，所述Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示的序列。

2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒含有如SEQ IDNO.3所示的序列或含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述PCV2的Cap蛋白编码基因在pH启动子和p10启动子下控制转录。

4.权利要求1～3任一项所述重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将PCV2b和PCV2d的Cap蛋白编码基因分别进行密码子优化，分别得到如SEQ IDNO.1所示和SEQ ID NO.2所示的序列，在如SEQ ID NO.1所示和如SEQ ID NO.2所示的序列的N端添加Kozak序列，分别得到如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列；

(3)将所述重组质粒转染到昆虫细胞，获得重组杆状病毒；

(4)重组杆状病毒表达的PCV2b和PCV2d蛋白序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

5.权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒在制备PCV2的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。

6.一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗，其特征在于，包含PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白的质量比为1：1。

7.根据权利要求6所述的二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白为采用权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒表达得到。

8.一种PCV2b和PCV2d的二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：利用权利要求、1～3任一项所述的重组杆状病毒表达PCV2b和PCV2d的Cap蛋白。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)分离和纯化PCV2b和PCV2d的Cap蛋白；

(3)将纯化的PCV2b和PCV2d的Cap蛋白混合，制备所述二价亚单位疫苗或再与佐剂混合制备所述二价亚单位疫苗；优选地，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白混合的质量比为1：1。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂；所述佐剂选自铝盐系列佐剂、MontanideIMS系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的任意一种或多种；所述二价亚单位疫苗的佐剂为201佐剂；所述二价亚单位疫苗中，所述PCV2b和PCV2d的Cap蛋白与所述佐剂的质量比为(2-5)：1。