CN111558037A

CN111558037A - 一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111558037A
Application number: CN202010512055.6A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 周明光; 张华伟; 曾小燕; 朱娴静; 孙芳; 郝根喜; 邵伟
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2020-08-21

Abstract

本发明涉及一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用，所述二价亚单位疫苗包括猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白均为利用昆虫‑杆状病毒表达载体系统表达得到。本发明通过昆虫‑杆状病毒表达载体系统进行猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白的表达，表达效率更高，同时，组合而成的猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗可以同时进行猪圆环病毒2型和3型的免疫，且相较于将两者单独使用，显著提升了猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫效果。本发明提供的猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗产量高，纯度高，作为制备疫苗的抗原免疫性更强，安全性更高。

Description

一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域，尤其涉及一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)为单股环状DNA病毒，是最小的动物DNA病毒之一，会引起仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸系统混合疾病、猪繁殖障碍症、猪皮炎肾病综合征等，对养猪业造成严重的危害。早期确定有两种类型，包括圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。在2015年美国一猪场的母猪群暴发皮炎肾病综合，临床症状和组织学病变都与圆环病毒相关疾病一致，但是PCV2、PRRSV、IAV等均为阴性。美国学者RachelPalinski等采用宏基因组测序后发现基因型不同以往的圆环病毒，因此将其命名为PCV3。

猪圆环病毒病毒粒子呈正二十面体对称结构，无囊膜，直径为17-20nm，基因组为单股DNA。猪圆环病毒2型基因组长度介于1766bp和1769bp之间,猪圆环病毒3型病毒全长1999-2001bp。针对PCV2和PCV3，目前研究较多的为三个主要开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3。ORF2位于基因组互补链上，形成病毒的核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白也是PCV的主要免疫原性蛋白，其C端含有较多的转角结构，亲水指数和抗原指数较高，该区段存在优势抗原表位，N端包含大量碱性氨基酸序列，其与Cap蛋白的核内定位密切相关。由此可见，Cap蛋白在疾病诊断及疫苗研究中具有重要作用，对PCV2和PCV3的研究聚焦在Cap蛋白上。现有技术中，PCV2与PCV3 Cap蛋白aa同源性仅为30％，两者间存在交叉免疫保护可能性较低，目前市场上尚无同时针对PCV2和PCV3毒株的疫苗。

现有技术常采用重组大肠杆菌表达系统进行亚单位疫苗的制备，这种方式不能进行糖基化修饰，胞内形成包涵体，产物免疫原性差，而灭活疫苗诱导的免疫反应水平较低，且免疫反应持续时间较短，需要多次接种。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在体外使用Tn7转座子作用使外源基因插入到杆状病毒的基因组上，操作方便，快速有效，是目前使用最广泛的表达系统。杆状病毒载体表达系统使用P10启动子或PH启动子，将外源目的基因以单拷贝或者多拷贝形式插入到启动子下游，通过同源重组的方法获得重组杆状病毒，这种重组杆状病毒在昆虫细胞或虫体内感染的同时，使外源基因得到高效表达。同时昆虫细胞大规模悬浮培养技术成熟与应用，使得杆状病毒表达系统的应用更加广泛。

发明内容

为了至少解决一个现有技术存在的问题，本发明提供一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用。通过昆虫-杆状病毒表达载体系统表达猪圆环病毒2型和3型的Cap蛋白，可以同时进行猪圆环病毒2型和3型的免疫，且取得了更好的免疫效果。

第一方面，本发明提供一种二价亚单位疫苗，包括猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白；

所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白均为利用昆虫-杆状病毒表达载体系统表达得到。

进一步地，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白的摩尔比为1:0.9～1.1。

本发明发现，在使用昆虫-杆状病毒表达载体系统表达得到的猪圆环病毒2型抗原成分免疫原性较差，而在和猪圆环病毒3型抗原成分组合使用时，免疫原性得到显著提高。

进一步地，通过Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒进行所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达；通过Ac-PCV3 Cap重组杆状病毒进行所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达；

所述Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

所述Ac-PCV3 Cap重组杆状病毒包含如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

本发明用于表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列经过优化，优化有的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；在优化后，猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达水平显著提高。

进一步地，通过pFastBac载体进行所述Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒和所述Ac-PCV3Cap重组杆状病毒的构建。

进一步地，在所述二价亚单位疫苗中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白含量为30～50μg/ml；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的含量为30～50μg/ml。

优选地，所述猪圆环病毒2型的Cap蛋白含量为40μg/ml；所述猪圆环病毒3型的Cap蛋白的含量为40μg/ml。

进一步地，所述二价亚单位疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自铝盐系列佐剂、Montanide IMS系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的一种或多种。

优选地，所述佐剂为201佐剂，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和所述猪圆环病毒3型Cap蛋白质量总和与所述201佐剂的质量比为2～5:1。

第二方面，本发明提供所述二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

通过昆虫-杆状病毒表达系统表达得到猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的Cap蛋白，配以佐剂制备成二价亚单位疫苗。

本发明进一步提供所述二价亚单位疫苗在猪对于猪圆环病毒2型的免疫和猪对于猪圆环病毒3型的免疫中的应用。

进一步地，所述二价亚单位疫苗在使用时用量为猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型的Cap蛋白各30～50μg/一头份。

作为一种优选的实施方式，所述二价亚单位疫苗的制备方法包括：

(1)合成PCV2和PCV3的ORF2的基因序列；

(2)构建pFastdual-PCV2 ORF2和pFastdual-PCV3 ORF2重组转移载体；

(3)转入大肠杆菌感受态DH10Bac，培养后提取重组杆粒rBac-PCV2 ORF2和rBac-PCV3 ORF2作为重组穿梭载体；

(4)利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中。

(5)蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的表达与纯化

(6)将蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap和佐剂以3:1的比例混合后制备得到二价亚单位疫苗。

进一步地，步骤(1)的基因序列在其氨基端引入AcMNPV GP64信号肽序列，在羧基端引入6*His标签肽序列。

进一步地，步骤(6)最终制得的二价亚单位疫苗中蛋白PCV2 Cap含量为30～50μg/ml，蛋白PCV3 Cap含量为30～50μg/ml，佐剂优选为201佐剂。

本发明具备如下有益效果：

1.本发明使用的昆虫-杆状病毒真核表达系统高效、安全、人畜无害，所表达的PCV2 Cap及PCV3 Cap蛋白的核苷酸序列经过优化，可以通过昆虫-杆状病毒真核表达系统表达得到目的蛋白，并且得到的蛋白在结构与功能上与天然状态完全一致，免疫原性强。

2.本发明的PCV2型和PCV3型二价亚单位疫苗制备方法简单，蛋白产量大、纯度高，抗原免疫性更强，可有效激活机体的免疫反应，对PCV2和PCV3起到理想的免疫保护作用。

3.本发明提供的PCV2型和PCV3型二价亚单位疫苗，与单价疫苗相比，可以减少人共成本、减少疫苗接种次数，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的人工合成基因PCV2和PCV3的ORF2的KpnI、XhoI酶切鉴定结果；其中，A中1为DNA marker Dl5000，2为pFastdual-PCV2 ORF2，B中为DNA markerDl5000，2为pFastdual-PCV3 ORF2；

图2为本发明实施例1提供的目的蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的SDS-PAGE和WesternBlot鉴定结果；其中，A为目的蛋白PCV2 Cap，B为目的蛋白PCV3 Cap；

图3为本发明实施例1提供的未经优化和优化后的目的蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果；

图4为本发明实施例2提供的用PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体的结果图；其中，A为目的蛋白PCV2 Cap，B为目的蛋白PCV3 Cap；

图5为本发明实施例2提供的ELISA进行PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的特异性抗体检测结果图，其中，A为目的蛋白PCV2 Cap，B为目的蛋白PCV3 Cap；

图6为本发明实施例2提供的抗原特异性抗体检测和中和抗体检测结果图；其中，A为目的蛋白PCV2 Cap，B为目的蛋白PCV3 Cap。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(一)构建重组转移载体pFastBac-PCV2 ORF2和pFastBac-PCV3 ORF2

1.目的基因PCV2-ORF2，PCV3-ORF2的获取

根据杆状病毒密码子的偏爱性，参照PCV2(GenBank No.JQ002671)和PCV3(GenBank No.MG778698)的ORF2基因序列，人工合成708bp的PCV2-ORF2和696bp的PCV3-ORF2。并在其氨基端引入AcMNPV GP64信号肽序列，以便表达的目的蛋白分泌到细胞外；在羧基端引入6*His标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础。合成的目的基因PCV2-ORF2和PCV3-ORF2置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-PCV2 ORF2和pUC-PCV3 ORF2的形式取得。合成的基因序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(SEQ ID NO.1中第7到第66位为GP64信号肽序列，第688到第705位为6*His标签肽序列，SEQ ID NO.2中第7到第66位为GP64信号肽序列，第676到第693位为6*His标签肽序列)。

2.重组转移载体pFastdual-PCV2 ORF2和pFastdual-PCV3 ORF2的构建

采用常规重组质粒构建流程和方法构建重组转移载体pFastdual-PCV2 ORF2和pFastdual-PCV3 ORF2：

①酶切：本方案采用KpnI、XhoI两个酶(购自TAKARA)切位点，对人工合成基因PCV2ORF2和PCV3 ORF2从pUC-PCV2 ORF2和pUC-PCV3 ORF2上进行双酶切；同时用相同的内切酶对转移载体pFastdual进行酶切。体系如下：

表1酶切体系

酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

②连接：

表2连接体系

③转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。

④提取重组质粒pFastdual-PCV2 ORF2和pFastdual-PCV3 ORF2：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，KpnI、XhoI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见附图1。

(二)、重组杆状病毒Ac-PCV2 Cap及Ac-PCV3 Cap的构建

①获得重组穿梭载体：

取4ul重组转移质粒pFastdual-PCV2 ORF2和pFastdual-PCV3 ORF2分别转入100ul大肠杆菌感受态DH10Bac(购自GiBCO BRL)中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入900ul无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落、提取重组杆粒rBac-PCV2 ORF2和rBac-PCV3 ORF2，提取方法：无菌挑取阳性白色菌落于三抗LB液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L CH₃COOK，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL无菌水中，立即使用或-20℃保存。

②获得重组杆状病毒：

利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。转染方法按照脂质体说明书(lipo2000购自invitrogen)进行。

(三)、目的蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的表达与纯化

①目的蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的表达：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High FiveTM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为0.8*106/ml，细胞体积为400ml。72-96h后收获细胞培养上清进行Western blotting检测目的蛋白PCV2 Cap和PCV3 Cap的表达。

②目的蛋白的纯化：

纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：取接毒后72-96h的HighFiveTM细胞培养上清，10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45um的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(400mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)4℃透析过夜，得到目的蛋白。进行SDS-PAGE和Westernblotting检测纯化后的蛋白。检测结果见附图2。

(四)、猪圆环病毒2型与3型二价疫苗的制备

纯化得到的PCV2 Cap和PCV3 Cap蛋白测定浓度后过滤，二者等量混匀，再与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的比例乳化制备成亚单位二价疫苗，使每毫升疫苗中的PCV2 Cap和PCV3 Cap抗原含量均为40ug，置于4℃保存待用。

(五)、参照上述步骤(1)至步骤(3)，针对未经过优化的PCV2 Cap和PCV3 Cap蛋白的表达，未经优化的PCV2 Cap和PCV3 Cap的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

检测结果见附图3，优化的PCV2 Cap和PCV3 Cap蛋白相较于未优化前，表达量明显上升。

实施例2

(一)、猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在小鼠体内评价

1.猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在小鼠体内进行安全性评价

购买16-18g雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.3ml 2型与3型二价疫苗；B组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)；连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明该疫苗对小鼠是安全的。

2.猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在小鼠体内进行免疫原性评价

购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射0.2ml，2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，断尾采血取血清，血清稀释1000倍后，分别用PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体，结果见附图4。

(二)、猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在猪体内评价

1.猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在猪体内进行安全性评价

购买约2月龄PCV阴性猪6头，随机分成A、B两组，每组3头。A组每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对本体动物猪是安全的。

2.猪圆环病毒2型与3型二价疫苗在猪体内进行有效性评价

为了进一步评价上述制备二价亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约2月龄PCV阴性猪8头，随机分成A、B两组，每组4头。A组每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。首免后7天14天,28天和42天进行前腔静脉采血，分别用ELISA进行抗原特异性抗体检测和中和抗体检测。特异性抗体检测结果见附图5，中和抗体检测结果见附图6。结果表明该疫苗良好的免疫原性，能够激发机体产生保护性中和抗体。

3.猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力评价

对制备的猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗的攻毒保护免疫效力进行验证，以猪圆环病毒2型和3型的单价亚单位疫苗作为对照，猪圆环病毒2型和3型的单价亚单位疫苗即为PCV2-Cap和PCV3-Cap蛋白分别单独与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备得到。

1、试验材料

(1)试验动物

21-25日龄仔猪42头，对主要病原和相关抗体进行检测，猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒病原阴性。

(2)试验用疫苗

组A：猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗；

组B：猪圆环病毒2型亚单位疫苗；

组C：猪圆环病毒3型亚单位疫苗。

(3)攻毒用毒株

猪圆环病毒2型毒株PCV2(GenBank No.JQ002671)，猪圆环病毒3型(GenBankNo.MG778698)。

2、试验方法

(1)试验分组

将试验猪随机分为6组：

组A：猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗，共12头仔猪；

组B：猪圆环病毒2型亚单位疫苗，共6头仔猪；

组C：猪圆环病毒3型亚单位疫苗，共6头仔猪；

组D：猪圆环病毒2型攻毒对照组，共6头仔猪；

组E：猪圆环病毒3型攻毒对照组，共6头仔猪；

组F：非免疫空白对照组，共6头仔猪，隔离饲养。

(2)攻毒试验

将制备的猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗，猪圆环病毒2型亚单位疫苗，猪圆环病毒3型亚单位疫苗，分别每头猪颈部注射，免疫一头份(二价亚单位疫苗一头份：PCV2-Cap和PCV3-Cap各40μg；2型亚单位疫苗一头份：PCV2-Cap 40μg；3型亚单位疫苗一头份：PCV3-Cap 40μg)。免疫28天后攻毒。组A中随机挑选6头，攻猪圆环病毒2型毒株PCV2(GenBank No.JQ002671)，剩余6头攻猪圆环病毒3型株(GenBank No.MG778698)。组B和组D进行猪圆环病毒2型攻毒，组C和组E进行猪圆环病毒3型毒株PCV3(GenBank No.MG778698)攻毒，攻毒方式均为每头猪颈部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔离饲养。组F不免疫也不攻毒。于攻毒当日，称重所有试验仔猪体重。并于攻毒前3日和攻毒后3日、6日，所有仔猪均注射免疫刺激材料(费氏不完全佐所有剂制备的多孔血蓝蛋白乳剂)，每次每头猪颈部注射2ml。观察28天后，再对试验猪称重，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况。攻毒后28天剖检全部仔猪。

攻毒后仔猪发病判断标准，符合以下三项中的两项，即可判定发病。

A体温症状：仔猪体温升高(≧40℃)，应至少持续3天；

B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0％，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：

相对增重率(％)＝非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重/攻毒对照组仔猪平均日增重×100

C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测淋巴结组织，检测攻毒毒株。

3、试验结果

猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫苗和猪圆环病毒2型亚单位疫苗、猪圆环病毒3型亚单位疫苗攻毒保护对比试验结果(见表3)，试验结果表明，各疫苗均有免疫保护效果，可以抵抗PCV2和PCV3的攻击。同时，二价亚单位疫苗的免疫效果优于单价亚单位疫苗的免疫效果。攻毒试验证明，二价亚单位疫苗具有更好的免疫保护作用。

同时，本实施例还发现猪圆环病毒2型亚单位疫苗在单独使用时免疫效果一般，组内仍有一头猪发病，而猪圆环病毒2型和3型二价亚单位疫在免疫后，组内无猪发病。

表3亚单位疫苗攻毒保护免疫效力验证

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> KHP201112266.1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccatgg taagcgctat tgttttatat gtgcttttgg cggcggcggc gcattctgcc 60

tttgcggcgg atctaccccg ccaccgttac cgctggagaa ggaaaaatgg catcttcaac 120

acccgcctct cccgcaccat cggttatact gtcaagaaaa ccacagtcag aacgccctcc 180

tggaatgtgg acatgatgag atttaatatt aatgattttc ttcccccagg agggggctca 240

aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagga aggttaaggt tgaattctgg 300

ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagtgggct ccactgctgt tattctagat 360

gataactttg taacaaaggc caatgcccta acctatgacc cctatgtaaa ctactcctcc 420

cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtc 480

cttgatagga caatcgatta cttccaaccc aataacaaaa gaaatcaact ctggctgaga 540

ctacaaacta ctggaaatgt agaccatgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata 600

tacgaccagg actacaatat ccgtataacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt 660

aaagaccccc cacttaaccc aaagtgacat catcaccatc accattaa 708

<210> 2

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaccatgg taagcgctat tgttttatat gtgcttttgg cggcggcggc gcattctgcc 60

tttgcggcgg atctaagacg acgacgccac agaaggcgct atgtcagaag aaaactattc 120

attaggaggc ccacagctgg cacatactac acaaagaaat actccaccat gaacgtcatt 180

tccgttggaa cccctcagaa taacaagccc tggcacgcca accacttcat tacccgccta 240

aacgaatggg aaaccgcgat tagctttgaa tactataaga tactaaagat gaaagttaca 300

ctcagccctg taatttctcc ggctcagcaa acaaaaacta tgttcgggca cacagccata 360

gatctagacg gcgcctggac cacaaacact tggctccaag acgaccctta tgcagaaagt 420

tccactcgta aagttatgac ttctaaaaaa aaacacagcc gttacttcac ccccaaacca 480

attctggcgg gaactaccag cgctcaccca ggacaaagcc tcttcttttt ctccagaccc 540

accccatggc tcaacacata tgaccccacc gttcaatggg gagcactgct ttggagcatt 600

tatgtcccgg aaaaaactgg aatgacagac ttctacggca ccaaagaagt ttggattcgt 660

tacaagtccg ttctccatca tcaccatcac cattaa 696

<210> 3

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180

acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480

tttaccccga aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540

aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccaa agtga 705

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg tcagaagaaa actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120

aagaaatact ccaccatgaa cgtcatttcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ccgcgattag ctttgaatac 240

tataagatac taaagatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca 300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360

ctccaagacg acccttatgc agaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa 420

cacagccgtt acttcacccc caaaccaatt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga 480

caaagcctct tctttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540

caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc 600

tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctaa 645

Claims

1.一种二价亚单位疫苗，其特征在于：所述二价亚单位疫苗包括猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白；

2.根据权利要求1所述的二价亚单位疫苗，其特征在于，在所述二价亚单位疫苗中所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型Cap蛋白的摩尔比为1:0.9～1.1。

3.根据权利要求1或2所述的二价亚单位疫苗，其特征在于，通过Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒进行所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达；通过Ac-PCV3 Cap重组杆状病毒进行所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达；

所述Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

所述Ac-PCV3 Cap重组杆状病毒包含如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的二价亚单位疫苗，其特征在于，通过pFastBac载体进行所述Ac-PCV2 Cap重组杆状病毒和所述Ac-PCV3 Cap重组杆状病毒的构建。

5.根据权利要求3所述二价亚单位疫苗，其特征在于，在所述二价亚单位疫苗中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白含量为30～50μg/ml；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的含量为30～50μg/ml。

6.根据权利要求1-5任一项所述二价亚单位疫苗，其特征在于，还包括佐剂，所述佐剂选自铝盐系列佐剂、Montanide IMS系列佐剂、Montanide GEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述二价亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为201佐剂，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和所述猪圆环病毒3型Cap蛋白质量总和与所述201佐剂的质量比为2～5:1。

8.权利要求1-7任一项所述二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

9.权利要求1-7任一项所述二价亚单位疫苗在猪对于猪圆环病毒2型的免疫，和/或，猪对于猪圆环病毒3型的免疫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述二价亚单位疫苗在使用时用量为猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪圆环病毒3型的Cap蛋白各30～50μg/一头份。