CN113058032A - 一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用。所述三联亚单位疫苗中的免疫原性成分包括猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白，以及猪圆环病毒2型Cap蛋白。本发明通过对猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白进行多种优化，显著提升了其在CHO细胞中的表达水平，以及表达后的免疫原性，并配以猪圆环病毒2型Cap蛋白制备得到三联免疫疫苗，对于猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒的免疫效果显著提高。

Description

一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域，尤其涉及一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟是一种急性烈性高度接触性传染病，CSF的爆发严重制约着养猪业的健康发展。目前，CSF在多个地区的养猪场仍然不断发生，且流行形式主要以散发为主，临床症状不典型。猪瘟兔化弱毒疫苗具有良好的免疫原性和安全性，在目前猪瘟预防和控制中发挥了重要的作用，但是由于弱毒疫苗诱导的免疫应答不能与野毒株感染相区分，直接影响了猪瘟的根除与净化。因此需要研制一种标记疫苗来快速简便的区分疫苗免疫和野毒感染动物，进而为根除猪瘟提供有效的监测方法。猪瘟病毒主要免疫原性蛋白是E2蛋白，能产生中和抗体，研究表明，体外单独表达E2蛋白免疫猪能抵抗猪瘟强毒株的攻击。

猪伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种动物传染病。不同日龄生猪均可感染，感染后产能明显下降，已严重阻碍生猪产业健康发展。另外，感染PRV对育肥猪或种猪致死率不高，甚至表现为隐形感染，猪是唯一感染PRV后仍可存活的物种，成为PR的重要传染源。该病毒感染谱广，包括牛、羊、犬、猫等在内的哺乳类动物皆可被其感染，且死亡率极高。因此，猪的伪狂犬病防控对于公共卫生学具有极其重要意义。伪狂犬病毒共有11种糖蛋白，其中gG为分泌蛋白，其余10种糖蛋白均锚定于病毒囊膜，在病毒感染、穿膜、融合细胞等过程中行使功能。PRV能够诱导机体产生保护性中和抗体的主要病毒抗原成分有糖蛋白gB、gC和gD。gB能诱导机体产生依赖补体和不依赖补体的两种中和抗体。抗gC抗体在体外不依赖补体能够通过抑制病毒吸附而中和病毒感染力。康复猪血清中大部分中和抗体均针对gC。gD是保护性抗体的一种主要靶抗原，可诱导机体产生非补体依赖中和抗体，抗gD抗体中和PRV的能力最强。gB、gC和gD是开发亚单位疫苗的首选蛋白。

PCV2是引起PCVAD的病原体，其可感染各种年龄的猪，尤其严重危害仔猪的生长。感染PCV2会引发很严重的免疫抑制，从而诱发其他多种病毒或多种细菌的混合感染或继发感。接种PCV2疫苗是预防其感染引起猪圆环病毒相关疾病最有效的手段，能降低PCV2病毒在猪体内复制，减轻淋巴组织的损伤和病毒血症。流行病学调查显示，目前PCV2优势流行基因型为PCV2d亚型。动物实验证实现有的商品化疫苗不能完全抵抗PCV2d的流行，虽然现有疫苗对目前流行毒株有一定的交叉保护，但它们之间的抗原性还是存在差异。而Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫原性的蛋白，Cap蛋白对研究PCV2基因工程疫苗具有重要意义。

目前，临床上猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒病混合感染较为常见，一旦出现混合感染，会导致病猪症状更为严重，死亡率也会较高，且容易出现扩散性传播，给养猪业造成严重的经济损失。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明通过将优化后的猪瘟病毒E2蛋白序列、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白转化至CHO细胞中进行表达，和猪圆环病毒2型Cap蛋白一起制备成三联亚单位疫苗，显著提高了针对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒的免疫原性。

第一方面，本发明提供一种免疫原性组合物，包括：猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白，以及猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述猪瘟病毒E2蛋白为将如SEQ ID NO.1所示的序列通过CHO细胞株表达得到；

所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白为将如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的序列通过CHO细胞表达得到；

所述猪圆环病毒2型Cap蛋白为将如SEQ ID NO.4所示的序列通过昆虫-杆状病毒系统表达得到。

进一步地，所述猪瘟病毒E2蛋白、所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白、以及猪圆环病毒2型Cap蛋白的摩尔比为1:1:1:1。

第二方面，本发明提供一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗，包括所述免疫原性组合物和佐剂。

进一步地，所述猪瘟病毒E2蛋白的含量为40～60μg/mL；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的含量为40～60μg/mL；所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白的含量分别为40～60μg/mL和40～60μg/mL。

进一步地，所述佐剂为201佐剂，所述佐剂和所述免疫原性组合物的质量比为1:2～4。

第三方面，本发明提供所述三联亚单位疫苗的制备方法，包括：

将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至CHO细胞中表达得到猪瘟病毒E2蛋白；

将如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至CHO细胞中表达得到猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白；

将如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，通过昆虫-杆状病毒系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白；

将猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白配以佐剂制备成亚单位疫苗。

本发明进一步提供所述免疫原性组合物在制备用于免疫猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒的药物中的应用。

进一步地，所述生物材料为pMC12.4载体。

进一步地，所述生物材料为CHO细胞。

本发明利用CHO细胞表达系统表达的猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD，重组杆状病毒系统表达的PCV2d Cap蛋白制成猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗，目前国内尚无重组CHO细胞表达的猪瘟E2、猪伪狂犬病毒gB和gD与重组杆状病毒表达的PCV2d Cap三联亚单位疫苗。

本发明提供的猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗具有如下有益效果：

(1)本发明使用的CHO表达系统和昆虫-杆状病毒真核表达系统高效、安全、人畜无害，且表达的猪瘟E2、猪伪狂犬病毒gB和gD、PCV2d Cap蛋白的结构与功能与天然状态完全一致，免疫原性强。

(2)本发明提供的猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗制备方法简单，蛋白产量大、纯度高，抗原免疫性更强，可有效激活机体的免疫反应，对猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒病起到理想的免疫保护作用。

(3)本方案所提供的猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗，与单价疫苗相比，可以减少人工成本、减少疫苗接种次数，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应。

附图说明

图1为本发明提供的CSFV-E2序列模式图；

图2为本发明提供的PRV-gB序列模式图；

图3为本发明提供的PRV-gD序列模式图；

图4为本发明提供的pMC12.4-E2、pMC12.4-gB和pMC12.4-gD的酶切鉴定结果；

图5为本发明提供的CHO-E2、CHO-gB和CHO-gD发酵产物的SDS-PAGE检测结果；

图6为本发明提供的CHO-E2蛋白、CHO-gB蛋白和CHO-gD蛋白的纯化和鉴定结果；其中，A为CHO-E2蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果；B为CHO-gB蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果；C为CHO-gD蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测结果；其中IP为原样，W为洗杂液，E为洗脱液；

图7为本发明提供的猪圆环病毒2d型Cap蛋白在电子显微镜下的观察结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(一)分别表达猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白的重组CHO细胞株的构建

1、基因的合成

1.1CSFV E2基因的合成

CSFV E2蛋白是CSFV的主要保护性抗原，能引起动物产生特异性免疫反应。本方案将E2蛋白的C端跨膜区去除，为了更适合在CHO细胞中表达从而进行相应的密码子优化。在优化后的E2序列的N端添加IL-2信号肽序列，两端均带上His标签。合成CSFV-E2片段，序列模式图见图1，序列见SEQ ID NO:1。合成的片段置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-E2的形式取得。

1.2PRV gB基因的合成

gB全长914个氨基酸，本方案表达gB的第1-454位氨基酸，即去除C端跨膜区和胞内区的gB。对gB基因进行了密码子优化，使之更适合在CHO细胞中表达，同时在优化后的gB序列N端添加IL-2信号肽序列，N端和C端均添加His标签，序列模式图见图2，序列见SEQ IDNO:2。合成的片段置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-gB的形式取得。

1.3PRV gD基因的合成

gD全长402个氨基酸，本方案表达gD的第1-379位氨基酸。对gD基因进行了密码子优化，使之更适合在CHO细胞中表达，同时在优化后的gD序列N端添加IL-2信号肽序列，两端均添加His标签，序列模式图见图3，序列见SEQ ID NO:3。合成的片段置于质粒载体pUC-18(Invitrogen公司)上，即以pUC-gD的形式取得。

2、载体构建及鉴定

采用常规重组质粒构建流程和方法构建重组转移载体pMC12.4-E2、pMC12.4-gB和pMC12.4-gD：

(1)目的片段的PCR扩增及载体酶切：分别以pUC-E2、pUC-gB、pUC-gD质粒为模板，利用P1/P2引物对分别扩增E2、gB和gD目的片段，分别回收目的片段。采用BamHI、NotI两个酶(购自TAKARA)切位点，对扩增得到的目的片段和pMC12.4同时进行双酶切。

目的片段扩增：

引物信息：

P1：5’-ACGGGATCCGCCGCCACCATGTACAGGATG-3’；

P2：5’-AATGCGGCCGCTCATCAGTGATGGTGATGGTG-3’。

PCR扩增体系及程序如下：

表1 PCR扩增体系及反应程序

酶切片段如下：

表2酶切体系

酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

(2)连接

表3连接体系

(3)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。

(4)提取重组质粒pMC12.4-E2：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，BamHI、NotI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见附图4。

3、CHO-K1细胞转染

3.1无内毒素质粒提取及质粒线性化处理

按照OMEGA无内毒素质粒大提试剂盒(D6926-01)提取重组质粒pMC12.4-E2、pMC12.4-gB和pMC12.4-gD。

3.2CHO-K1细胞转染

(1)取对数生长期的CHO-K1细胞，常温下1000r/min离心5min，弃上清。用20mLCHO-2培养基重悬细胞，常温下1000r/min离心5min，弃上清。用适量CHO-2培养基重悬细胞，显微镜下用台盼蓝染色计数法计数和计算细胞活率，调整细胞密度为1.3～1.5×10⁷cells/mL，细胞活率应98％以上。

(2)取无内毒素质粒5μg，加入至1.5mL EP管中，添加0.7mL CHO-K1细胞，轻弹EP管管壁，混合均匀后，室温静置15min。

(3)将质粒与细胞混合液转移至电转杯中，按预定条件(280v20ms)进行电击操作。电击完成后，立刻将细胞转移至细胞摇瓶，并补加适量CHO-2培养基，悬浮培养48h后，将细胞悬液常温下1000r/min离心5min，弃上清，用适量CHO-2培养基重悬细胞，待细胞密度达到0.6×10⁶cells/mL，加压筛选单克隆细胞株。

3.3加压筛选单克隆

(1)取转染后细胞，用CHO-2培养基(含50μM MSX)稀释细胞至5cells/ml，按200μl/孔加入到96孔板中。放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h，记录单个细胞的孔。

(2)待记录孔中形成细胞集落，弃培养基，PBS洗一次，加入100μL 0.25％trypsin-EDTA室温消化2min，加入2ml CHO-2(含50μM MSX)终止消化，并用移液器将细胞吹散，将细胞转移至12孔板继续培养。待12孔板细胞长满单层，取上清进行Elisa检测，筛选阳性单克隆细胞株，高效表达的阳性单克隆细胞株继续扩大培养，冻存，获得F0代细胞株，建立一级种子细胞库。以此类推建立二级种子库以及工作种子库。

经细胞转染及阳性单克隆筛选，最终分别选择一株高效表达E2、gB和gD的重组CHO细胞株进行后续的发酵培养。

4、摇瓶发酵

将细胞用CHO-2培养基(含50μM MSX)稀释至3.5～5×10⁵cells/mL，在37℃、100r/min含5％CO₂水平摇床中培养。培养3日，测定葡萄糖含量。补加葡萄糖至6g/L，并补加5％补料培养基继续培养。当细胞密度达到10～12×10⁶cells/ml时，将温度降至33℃，之后每天测定葡萄糖含量并补加葡萄糖至6g/L，隔天补加5％补料培养基。每隔24h取样，每次取1mL，显微镜下用台盼蓝染色计数和计算细胞活率，SDS-PAGE和Western Blotting检测细胞上清。降温培养9日，收获上清并进行SDS-PAGE，具体结果见图5。

5、蛋白纯化

收获的蛋白抗原通过孔径为0.65μm的中空纤维进行澄清过滤，再经镍柱亲和层析纯化获得纯化抗原，纯化抗原经0.22μm除菌过滤置2～8℃保存。

5.1镍柱亲和层析纯化：

(1)柱子清洗及平衡用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对层析柱清洗2个柱体积，然后用注射用水冲洗至pH值为7.0～7.2，再用平衡缓冲液平衡至电导率柱前后一致，pH值稳定在7.4，紫外检测UV280基线平稳。

(2)上样将澄清过滤后的蛋白液上样，设定上样线性流速为70cm/h，压力控制小于2bar。

(3)洗杂用洗杂缓冲液洗脱未结合的杂蛋白，待UV280值下降至低于0.100AU。

(4)洗脱用洗脱缓冲液洗脱E2蛋白，紫外检测UV280值升高时开始收集洗脱样品，待UV280值降至最低时停止收集蛋白。

(5)清洗柱子和纯化系统样品收集完成后，进样口更换为无菌0.5mol/L NaOH溶液对层析柱清洗3个柱体积，再用注射用水清洗3个柱体积，最后进样口更换为20％乙醇溶液，洗涤3个柱体积，关闭阀门，层析填料保存于20％乙醇溶液中。

纯化后的猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白经SDS-PAGE及Western-Blotting检测(附图6)，蛋白纯度均≥90％，BCA法测定蛋白浓度，E2和gB蛋白得率均为2～3g/1L，gD蛋白得率为1～2g/1L。

(二)猪圆环病毒2d型Cap蛋白抗原制备

猪圆环病毒2d型Cap蛋白制备：参照及专利“一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用”(申请号202010512055.6)，进行制备。在电镜下观察，经纯化得到的Cap蛋白可形成病毒样颗粒(附图7)。

(三)猪瘟-猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗的制备

纯化得到的CSFV E2、PRV gB、PRV gD和PCV2d Cap蛋白测定浓度后过滤，再与无菌201佐剂(购自SEPPIC公司)按照4:1的比例乳化制备成三联亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的CSFV E2和PCV2d Cap抗原含量均为25μg，置于4℃保存待用。

(四)猪瘟-猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗的安全检验试验用21～28日龄健康易感仔猪5头，各颈部肌肉接种4.0ml(2头份)，设PBS对照组5头。接种后连续观察14日，接种猪均应不出现由疫苗引起的不良反应。

(五)猪瘟-猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗的效力检验试验

1、试验动物：

21-28日龄仔猪50头，对主要病原和相关抗体进行检测，猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒病原阴性。

2、试验用疫苗：

组1：猪瘟-猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗(E2、gB、gD、Cap蛋白含量均为50μg/头份)；

组2：重组CHO细胞株表达的猪瘟病毒E2亚单位疫苗(E2蛋白含量为50μg/头份)；

组3：重组CHO细胞株表达的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗(gB、gD蛋白含量均为50μg/头份)；

组4：猪圆环病毒2d型重组杆状病毒亚单位疫苗(Cap蛋白含量为50μg/头份)。

3、攻毒用毒株：

猪瘟石门系血毒(购自中国兽医药品监察所)，猪圆环病毒2型毒株PCV2(GenBankNo.JQ002671)，猪伪狂犬病毒JF株(由武汉科前生物股份有限公司分离保存)。

4、试验方法：

(1)试验分组

将试验猪随机分为8组：

组A：猪瘟-猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗，共15头仔猪；

组B：重组CHO细胞株表达的猪瘟病毒E2亚单位疫苗，共5头仔猪；

组C：重组CHO细胞株表达的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，共5头仔猪；

组D：猪圆环病毒2d型重组杆状病毒亚单位疫苗，共5头仔猪；

组E：猪瘟病毒攻毒对照组，共5头仔猪；

组F：猪猪伪狂犬病毒攻毒对照组，共5头仔猪；

组G：猪圆环病毒2型病毒攻毒对照组，共5头仔猪；

组H：空白对照组，共5头仔猪。

各组仔猪进行隔离饲养。

(2)中和抗体或ELISA抗体测定

组A、B、C、D每头仔猪肌肉注射相应疫苗2.0ml，21日后用相同方式和剂量进行二免。二免后21日，各组采血并分离血清，分别测定中和抗体或ELISA抗体水平。A组中随机选取5头，连同B、E组，测定猪瘟病毒中和抗体；A组剩余10头重随机选取5头，连同C、F组，测定猪伪狂犬病毒中和抗体；A组剩余的5头，连同D、G组，测定猪圆环病毒2型ELISA抗体。

(3)攻毒试验：

二免21日采血分离血清后进行攻毒。组A中随机挑选5头仔猪连同组B和组E，每头仔猪肌肉注射猪瘟石门系血毒1mL(不低于10⁵最小致死量)，均隔离饲养观察，连续观察14日。组A中随机剩余仔猪中再随机挑选5头仔猪连同组C和组F，每头仔猪滴鼻接种猪伪狂犬病毒JF株病毒液1ml(病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml)，均隔离饲养观察，连续观察14日。组A中剩余5头仔猪连同组D和组G，每头猪用猪圆环病毒2型病毒液(GenBank No.JQ002671)，病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml，滴鼻3.0mL、肌肉注射2.0mL，攻毒后28日，剖杀取腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结进行猪圆环病毒2型分离。

5、发病及保护标准

5.1猪瘟石门系血毒攻毒后判定标准

发病判定标准：

(1)死亡。

(2)体温反应体温≥41℃，至少持续3日。

(3)临床症状精神萎靡、食欲废绝等。

符合(1)项或同时符合(2)与(3)项，即可判为发病。

保护判定标准：

(1)健活

(2)体温反应不出现发热症状，若出现发热症状，体温≥41℃，持续不超过2日。

(3)临床症状不出现精神萎靡、食欲废绝等。

同时符合(1)、(2)和(3)项，即可判为保护。

5.2猪伪狂犬病毒攻毒后判定标准

发病判断标准

(1)死亡

(2)体温反应 出现发热症状，体温≥41℃，至少持续3日。

(3)神经症状 出现倒地划水、极度烦躁等典型神经症状。

(4)呼吸症状 出现呼吸困难等临床症状。

出现(1)项或同时出现(2)、(3)、(4)中任意两项，即可判为发病。

保护判定标准

(1)健活

(2)体温反应 不出现发热症状，若出现发热症状，体温≥41℃，持续不超过2日。

(3)神经症状 不出现倒地划水、极度烦躁等典型神经症状。

(4)呼吸症状 不出现呼吸困难等临床症状。

同时符合(1)、(2)和(3)项，即可判为保护。

5.3猪圆环病毒2型攻毒后判定标准

发病判定标准：同时出现如下(1)和(2)项，或出现其中任意一项，即判为发病。

(1)相对增重率攻毒试验组(免疫组、攻毒对照组)仔猪与空白对照组(非免疫、非攻毒组)仔猪相比，若相对增长率≥5.0％，则判该仔猪生长发育不良，有猪圆环病毒2型引起的临床症状。

a空白对照组平均日增重＝(攻毒后28日空白对照组仔猪体重之和－攻毒当日对照组仔猪体重之和)/(28日×5头)

b攻毒试验组仔猪平均日增重＝(攻毒后28日试验组仔猪体重之和－攻毒当日攻毒试验组仔猪体重之和)/(28日×5头)

c攻毒试验仔猪平均日增重＝(攻毒后28日该仔猪体重－攻毒当日该仔猪体重)/28日

(2)病毒血症 攻毒后28日，前腔静脉采血分离血清，用猪圆环病毒2型特异性PCR检测为阳性反应。

保护判定标准 同时出现(1)和(2)项，则判为保护。

(1)相对增重率 免疫组仔猪与空白对照组(非免疫、非攻毒组)仔猪相比，若相对增长率＜5.0％，则判该仔猪生长发育良好，无猪圆环病毒2型引起的临床症状。

(2)病毒血症 攻毒后28日，前腔静脉采血分离血清，用猪圆环病毒2型特异性PCR检测为阴性反应。

5.4试验结果

二免后21日，不同疫苗组猪瘟病毒中和抗体检测与攻毒结果如表4所示，结果表明，猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗与重组CHO细胞株表达的猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫效果相当，均能够为仔猪提供抵抗猪瘟病毒80％及以上的保护。不同疫苗组猪伪狂犬病毒中和抗体检测与攻毒结果如表5所示，结果表明，猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗与重组CHO细胞株表达的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗免疫效果相当，均能够保护仔猪抵抗猪伪狂犬病毒。不同疫苗组猪圆环病毒2型ELISA抗体检测与攻毒结果如表6所示，结果表明，猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗与猪圆环病毒2d型重组杆状病毒亚单位疫苗免疫效果相当，均能够保护仔猪抵抗猪圆环病毒2型的攻击。

综上，各疫苗均有免疫保护效果，可以抵抗猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒或猪圆环病毒2型的攻击。同时，三联亚单位疫苗的免疫效果与单一亚单位疫苗的免疫效果相当。攻毒试验证明，三联亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用，临床上可以实现一针多防的作用。

表4不同疫苗组猪瘟病毒中和抗体检测与攻毒结果

注：“+”表示出现死亡或体温≥41℃，至少持续3日、精神萎靡和食欲废绝等。“－”表示无体温反应、精神状态及食欲正常、未死亡。

表5不同疫苗组猪伪狂犬病毒中和抗体检测与攻毒结果

注：“+”表示出现死亡或神经症状、呼吸症状。其中神经症状包括倒地划水、极度烦躁等典型神经症状；呼吸系统症状包括呼吸困难等症状。“－”表示无神经症状或无呼吸症状、未死亡。

表6不同疫苗组猪圆环病毒2型ELISA抗体检测与攻毒结果

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> KHP201118706.6

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccgccacca tgtacaggat gcaactcctg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc 60

acaaacagtc accatcatca ccaccatcgc ctggcctgca aggagaacta ccgctacgcc 120

atcagcagca ccaacgagat cggcctgctg ggcgccgagg gcctgaccac cacctggcag 180

gagtacaacc aggacctgca gctgaacgac ggcaccgtga aggccatctg cgaggccggc 240

agcttcaagg tgatcgccct gaacgtggtg agccgccgct acctggccag cctgcacaag 300

gaggccagcc tgaccagcgt gaccttcgag ctgctgttcg acggcaccag ccccagcacc 360

gaggagatgg gcgacgactt cggcttcggc ctgtgcccct tcgacaccag ccccgtggtg 420

aagggcaagt acaacaccac cctgctgaac ggcagcgcct tctacctggt gtgccccatc 480

ggctggaccg gcgtgatcga gtgcaccgcc gtgagcccca ccaccctgcg caccgaggtg 540

gtgaagacct tccgccgcga caagcccttc ccccaccgca tggactgcat gaccaccacc 600

gtggagaacg aggacctgtt ctactgcaag ctgggcggca actggacctg cgtgaagggc 660

gagcccgtgg tgtacaccgg cggccccgtg aagcagtgca agtggtgcgg cttcgacttc 720

aacgagcccg acggcctgcc ccactacccc atcggcaagt gcatcctggc caacgagacc 780

ggctaccgca tcgtggacag caccgactgc aaccgcgacg gcgtgatcat cagcaccgag 840

ggcagccacg agtgcctgat cggcaacacc accgtgaagg tgcacgccag cgacgagcgc 900

ctgggcccca tgccctgccg ccccaaggag atcgtgagca gcgccggccc cgtgcgcaag 960

accagctgca ccttcaacta cgccaagacc ctgcgcaaca agtactacga gccccgcgac 1020

agctacttcc agcagtacat gctgaagggc gagtaccagt actggttcga cctggacgtg 1080

actgaccgcc actcagatta cttcgcagaa catcaccatc accatcactg a 1131

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgccacca tgtacaggat gcaactcctg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc 60

acaaacagtc atcaccatca ccatcacatg cccgctggtg gcggtctttg gcgcgggccc 120

cgcgggcatc ggcccgggca ccacggcggt gctggcctcg gacgtctttg gcctgctcca 180

caccacgctg cagctgcgcg gggcgccgtc gcgctagcgc tgctgctgct ggcgctcgcc 240

gcgaccccga cgtgcggcgc ggcggccgtg acaagggctg ctagcgcttc ccccgccccc 300

ggcaccggcg ctacacctga cggcttctcc gccgaggaaa gcctggaaga gatcgacggc 360

gccgtgagcc ctggcccttc cgacgccccc gatggagagt atggagacct ggacgctagg 420

accgctgtga gggctgccgc caccgagcgg gacaggtttt atgtgtgccc tcctcctagc 480

ggcagcaccg tcgtgaggct cgaacctgag caagcctgcc ccgaatactc ccagggaagg 540

aacttcacag agggcatcgc cgtgctcttc aaggagaaca tcgcccccca caaattcaag 600

gcccacattt attacaagaa cgtgatcgtg acaacagtgt ggagcggttc tacctacgcc 660

gccattacca ataggttcac agacagggtg cctgtgcctg tccaggaaat taccgacgtg 720

attgacagga ggggcaagtg tgtcagcaag gccgagtacg tgaggaacaa ccacaaagtc 780

accgccttcg acagggacga aaaccccgtg gaagtcgacc tcaggcctag caggctcaac 840

gccctgggaa ccaggggctg gcataccacc aacgatacct ataccaagat cggcgctgct 900

ggcttttatc acaccggcac atccgtgaac tgcatcgtgg aagaagtgga ggctaggtcc 960

gtgtacccct atgactcctt cgctctgtcc accggagaca tcgtgtacat gagccccttc 1020

tatggactga gggaaggagc ccatggcgaa catatcggct acgcccctgg caggttccaa 1080

caggtggagc attactaccc cattgacctg gacagccggc tgagggcttc cgagtccgtg 1140

acaaggaatt tcctgaggac ccctcacttc accgtggcct gggactgggc ccccaagacc 1200

aggagggtgt gttccctcgc caaatggcgg gaagccgagg aaatgatcag ggacgagacc 1260

cgggacggtt cttttaggtt caccagcagg gccctgggag ctagctttgt gtccgatgtg 1320

acccagctgg acctccagcg ggtccacctg ggagactgtg tgctgcggga ggcttccgag 1380

gctatcgacg ccatttacag gcggcggtac aataacacac acgtgctcgc cggagataag 1440

cctgaagtgc atcaccatca ccatcactga 1470

<210> 3

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgccacca tgtacaggat gcaactcctg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc 60

acaaacagtc atcaccatca ccatcacatg ctgctcgcag cgctattggc ggcgctggtc 120

gcccggacga cgctcggctc gatatcgcga gccgatgtgg atgccgtgcc tgcccctaca 180

tttccccctc ccgcttaccc ctataccgag agctggcagc tgaccctcac cacagtcccc 240

agccctttcg tcggccctgc cgatgtgtac cacaccaggc ccctggaaga cccctgtggc 300

gtggtggctc tgatcagcga ccctcaggtg gacaggctgc tgaatgaggc tgtggcccat 360

aggcggccca catatagggc ccatgtggcc tggtacagga tcgccgacgg ctgcgctcac 420

ctgctgtact tcatcgagta cgctgactgc gaccctaggc agatcttcgg aaggtgcagg 480

aggcggacca cccctatgtg gtggacaccc agcgccgact acatgttccc caccgaagac 540

gagctcggcc tgctgatggt ggcccccggc aggtttaacg agggccagta taggaggctg 600

gtgagcgtgg acggcgtgaa catcctgacc gacttcatgg tggccctgcc tgagggccag 660

gagtgtcctt tcgctcgggt ggaccagcac aggacctaca agttcggcgc ctgttggtcc 720

gacgacagct tcaagagggg cgtcgacgtg atgaggttcc tgaccccctt ttaccagcag 780

ccccctcacc gggaggtggt gaactattgg tatcgtaaga acggacggac actgcccagg 840

gcttacgctg ccgccacacc ctatgctatc gaccctgctc ggccttccgc cggcagccct 900

aggcccaggc ccaggcctag gcctcggcct aggcctaaac ccgaacccgc tcctgctacc 960

cctgctcctc ctggacggct gcctgagcct gctacaaggg accatgctgc tggaggaagg 1020

cccacaccta ggcctcctcg gcctgagacc cctcataggc cctttgcccc tcccgctgtg 1080

gtgcctagcg gatggcccca gcctgctgaa ccttttcccc ctcggaccac cgccgccccc 1140

ggcgtgagca ggcaccggtt cgaatcggtg atcgtcggca cgggcaccgc gatgggcgcg 1200

ctcctggtgg gcgtgtgcgt ctaccatcac catcaccatc actga 1245

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccaccatgg taagcgctat tgttttatat gtgcttttgg cggcggcggc gcattctgcc 60

tttgcggcgg atctaccccg ccaccgttac cgctggagaa ggaaaaatgg catcttcaac 120

acccgcctct cccgcaccat cggttatact gtcaagaaaa ccacagtcag aacgccctcc 180

tggaatgtgg acatgatgag atttaatatt aatgattttc ttcccccagg agggggctca 240

aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagga aggttaaggt tgaattctgg 300

ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagtgggct ccactgctgt tattctagat 360

gataactttg taacaaaggc caatgcccta acctatgacc cctatgtaaa ctactcctcc 420

cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtc 480

cttgatagga caatcgatta cttccaaccc aataacaaaa gaaatcaact ctggctgaga 540

ctacaaacta ctggaaatgt agaccatgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata 600

tacgaccagg actacaatat ccgtataacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt 660

aaagaccccc cacttaaccc aaagtgacat catcaccatc accattaa 708

<210> 5

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcaatatcgt caaccgatga gatagggcta 60

cttggggccg gaggtctcac caccacctgg aaggaataca accacgattt gcaactgaat 120

gacgggaccg tcaaggccag ttgcgtggca ggttccttta aagtcacagc acttaatgtg 180

gtcagtagga ggtatttggc gtcattgcat aagaaggctt tacccacttc cgtgacattc 240

gagctcctgt tcgacgggac caacccatca actgaggaaa tgggagatga cttcaggtcc 300

gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gttaagggaa agtacaatac gaccttgttg 360

aacggtagtg ctttctatct tgtctgccca atagggtgga cgggtgtcat agagtgcaca 420

gcagtgagcc caacaactct gaggacagaa gtggtaaaga ccttcaggag agacaagccc 480

tttccgcaca gaatggattg tgtgaccacc acagtggaaa atgaagattt attctattgt 540

aagttggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggcgagccag tggtctacac agggggggta 600

gtaaaacaat gtagatggtg tggcttcgac ttcgatgggc ctgacggact cccgcattac 660

cccataggta agtgcatttt ggcaaatgag acaggttaca gaatagtaga ttcaacggac 720

tgtaacagag atggcgttgt aatcagcaca gaggggagtc atgagtgctt gatcggtaac 780

acgactgtca aggtgcatgc atcagatgaa agactgggcc ctatgccatg cagacctaaa 840

gagattgtct ctagtgctgg tcctgtaatg aaaacctcct gtacattcaa ctacacaaaa 900

actttgaaga acaggtacta tgagcccagg gacagctact tccagcaata tatgcttaag 960

ggtgagtatc agtactggtt tgacctggat gcgactgacc gccactcaga ttacttcgca 1020

gaa 1023

<210> 6

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcccgctg gtggcggtct ttggcgcggg ccccgcgggc atcggcccgg gcaccacggc 60

ggtgctggcc tcggacgtct ttggcctgct ccacaccacg ctgcagctgc gcggggcgcc 120

gtcgcgctag cgctgctgct gctggcgctc gccgcgaccc cgacgtgcgg cgcggcggcc 180

gtgacgcggg ccgcctcggc ctcgcccgcg cccgggacgg gcgccacccc agacggcttc 240

tccgcggagg agtccctcga ggagatcgac ggggccgtca cccccggccc ctcgaacgcc 300

cccgacggcg agtacggcga cctggtcgcg cgcacggccg tgcgcgcggc cgcgaccgag 360

cgggaccgct tctacgtctg cccgccgccg tccggctcca cggtggtgcg cctggagccc 420

gagcaggcct gccccgagta ctcgcagggg cgcaacttca cggaggggat cgccgtgctc 480

ttcaaggaga acatcgcccc gcacaagttc aaggcccaca tctactacaa gaacgtcatc 540

gtcacgaccg tgtggtccgg gagcacgtac gcggccatca cgaaccgctt cacggaccgc 600

gtgcccgtcc ccgtgcagga gatcacggac gtgatcgacc gccgcggcaa gtgcgtctcc 660

aaggccgagt acgtgcgcaa caaccacaag gtgaccgcct tcgactgcga cgagaacccc 720

gtcgaggtgg gcctgcgccc ctcgcgcctg aacgcgctcg gcacccgcgg ctggcacacc 780

accaacgaca cctacaccaa gatcggcgcc gcgggcttct accacacggg cacctccgtc 840

aactgcatcg tcgaggaggt ggaggcgcgc tccgtgtacc cctacgactc cttcgccctg 900

tccacggggg acatcgtgta catgtccccc ttctacggcc tgcgcgaggg ggcccacggg 960

gagcacatcg gctacgcgcc cgggcgcttc cagcaggtgg agcactacta ccccatcgac 1020

ctggactcgc gcctccgcgc ctccgagagc gtgacgcgca actttctgcg cacgccgcac 1080

ttcacggtgg cctgggactg ggcccccaag acgcggcgcg tgtgcagcct ggccaagtgg 1140

cgcgaggccg aggagatgat ccgcgacgag acgcgcgacg ggtccttccg cttcacgtcg 1200

cgggccctgg gcgcctcctt cgtcagcgac gtcacgcagc tcgacctgca gcgcgtgcac 1260

ctgggcgact gcgtcctccg cgaggcctcg gaggccatcg acgccatcta ccggcggcgc 1320

tacaacaaca cgcacgtgct ggccggcgac aagcccgagg tg 1362

<210> 7

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag 120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180

ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg 240

ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300

atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg 360

cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac 420

tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480

gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg 540

gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac 600

aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc 660

ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720

aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg 780

cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccagcccc ggcccaggcc ccggccgaag 840

cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc cccggccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg 900

gaccacgccg ccggggggcg ccccacgccg cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc 960

cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg 1020

ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc 1080

accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg tgcgtctac 1119

Claims (10)

1.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括：猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白，以及猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述猪瘟病毒E2蛋白为将如SEQ ID NO.1所示的序列通过CHO细胞株表达得到；

所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白为将如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的序列通过CHO细胞表达得到；

所述猪圆环病毒2型Cap蛋白为将如SEQ ID NO.4所示的序列通过昆虫-杆状病毒系统表达得到。

2.根据权利要求1所述免疫原性组合物，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白、所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白、以及猪圆环病毒2型Cap蛋白的摩尔比为1:1:1:1。

3.一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述免疫原性组合物和佐剂。

4.根据权利要求3所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白的含量为40～60μg/mL；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的含量为40～60μg/mL；所述猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白的含量分别为40～60μg/mL和40～60μg/mL。

5.根据权利要求3或4所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为201佐剂，所述佐剂和所述免疫原性组合物的质量比为1:2～4。

6.权利要求3-5任一项所述三联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至CHO细胞中表达得到猪瘟病毒E2蛋白；

将如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至CHO细胞中表达得到猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白；

将如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，通过昆虫-杆状病毒系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白；

将猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白配以佐剂制备成亚单位疫苗。

7.权利要求1或2所述免疫原性组合物在制备用于免疫猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒的药物中的应用。

8.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所述的核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为pMC12.4载体。

10.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为CHO细胞。

Images