CN112494643A

CN112494643A - 一种猪csfv-pcv二联dna疫苗及其制备方法

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Publication number: CN112494643A
Application number: CN202011450863.0A
Authority: CN
Inventors: 宁蓬勃; 郭抗抗; 王忠良; 杜付玉; 张伟洁; 何骏; 游鑫; 刘敏; 龚春梅; 张象涵; 夏玉琼
Original assignee: Zhejiang University Of Science And Technology Shaoxing Biomedical Research Institute Co ltd; Xidian University
Current assignee: Zhejiang University Of Science And Technology Shaoxing Biomedical Research Institute Co ltd; Xidian University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112494643B

Abstract

本发明公开了一种猪CSFV‑PCV二联DNA疫苗，包括表达载体，在所述表达载体上插入编码CSFV结构蛋白E2的基因E2、编码CSFV结构蛋白Erns的基因Erns、编码PCV‑2免疫蛋白Cap的基因Cap和编码PCV‑1Rep蛋白的基因Rep。该疫苗仅需通过皮下注射途径免疫动物就能在体内表达出E2、Erns、Cap和Rep蛋白，并诱导机体产生较高水平的抗体，从而预防和控制CSFV和/或PCV‑2的感染流行及混合交叉感染，避免CSFV和PCV‑2混合感染导致的其它疾病的发生；且疫苗有助于猪场中CSFV和PCV‑2毒株的净化。本发明同时公开了该疫苗的制备方法，制备工艺简便，使用安全。

Description

一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种针对猪瘟病毒和/或猪圆环病毒感染流行及混合感染的猪CSFV-PCV二联DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)可引起猪的急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞，猪瘟病毒在世界范围内广泛存在，对全球猪养殖业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒(PorcineCircovirus,PCV)可引起猪多系统衰竭综合征、猪呼吸病综合征、猪皮肤和肾病综合征等多种疾病。这两种猪病毒性疾病的防控是当前生猪养殖业猪病防控的重点工作。

疫苗接种是预防CSFV及PCV的重要手段。然而一个严峻形势是，近些年来CSFV和PCV的混合感染给疫病防控带来新的困难。一方面PCV感染能够破坏猪的免疫系统，对CSFV疫苗的体液免疫应答有一定程度的抑制作用，导致CSFV疫苗诱导的免疫应答水平低下，造成猪瘟疫苗免疫失败。另一方面，目前市面上的CSFV疫苗以减毒活疫苗为主，PCV疫苗则主要是全病毒灭活苗及杆状病毒表达Cap蛋白的重组疫苗，若将CSFV活疫苗和/或PCV疫苗与其它疫苗进行混合联用，容易导致病毒变异，存在较大安全隐患；另外，不同全病毒疫苗之间相互联用，会干扰可能的免疫应答，影响各自疫苗发挥作用；此外，将联苗分开单独包装，待使用时再进行混合或者分次注射，既提高了成本，又增加了免疫繁琐程度，不能适应市场发展需求。更重要的是，市面上的CSFV和PCV-2单价疫苗并不能解决近些年来CSFV和PCV的混合交叉感染问题。目前研究报道的一种猪瘟-猪圆环二联疫苗，将E2与Cap蛋白进行抗原混合制备成二联疫苗，其蛋白需要进行表达、提取和纯化，通过体外表达出的蛋白活性较低，不能较好诱发机体的免疫应答，且制备工艺复杂，成本较高。

因此，提供一种既能有效预防猪瘟病毒和/或猪圆环病毒的感染流行，又能有效预防混合交叉感染的疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，通过皮下注射途径免疫动物就能在体内表达出E2、Erns、Cap和Rep蛋白，并诱导机体产生较高水平的抗体，从而预防CSFV和PCV-2的混合交叉感染，避免CSFV和PCV-2混合感染导致的其它疾病的发生。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，包括表达载体，在所述表达载体上插入编码CSFV结构蛋白E2的基因E2、编码CSFV结构蛋白Erns的基因Erns、编码PCV-2免疫蛋白Cap的基因Cap和编码PCV-1Rep蛋白的基因Rep。

现已知猪圆环病毒PCV有两个血清型，即PCV-1和PCV-2，其中PCV-1为非致病性的病毒，PCV-2为致病性的病毒，猪对PCV-2具有较强的易感性。本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗由猪瘟病毒CSFV结构蛋白E2的基因E2和结构蛋白Erns的基因Erns与PCV-2免疫蛋白Cap的基因Cap以及PCV-1的Rep基因连接后，再重组到表达载体上，制备成二联DNA疫苗。该二联DNA疫苗通过皮下注射途径免疫动物就能在体内表达出E2、Erns、Cap和Rep蛋白，并诱导机体产生较高水平的抗体，从而起到预防CSFV和PCV-2的混合交叉感染、避免CSFV和PCV-2混合感染导致的其它疾病的发生的效果。

作为本发明优选的技术方案，其中所述E2基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述Erns基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述Cap基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述Rep基因核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

作为本发明优选的技术方案，所述基因E2、Erns、Cap和Rep插入到表达载体上得到重组质粒，所述重组质粒用于对所述基因E2、Erns、Cap和Rep的融合表达。

所述基因之间以及基因和表达载体之间通过P2A进行连接。所述表达载体为甲病毒质粒，优选为甲病毒质粒pSCA1。pSCA1质粒载体缺乏与生成潜力相关的病毒结构，没有基因组整合和恶性转化宿主细胞的危险，应用较为安全。

作为本发明优选的技术方案，猪CSFV-PCV二联DNA疫苗还包含CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs，且所述重组质粒在猪CSFV-PCV二联DNA疫苗中的浓度为0.25～1μg/μL。该浓度下可有效刺激动物机体产生抗体，获得理想的免疫效果。

作为本发明优选的技术方案，猪CSFV-PCV二联DNA疫苗还包含药学上所接受的免疫佐剂，优选为弗氏不完全佐剂，且免疫佐剂的加入量是所述重组质粒、CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs缓冲液的体积和的1-3倍。免疫佐剂可显著增强猪CSFV-PCV二联DNA疫苗的免疫效果。

本发明的另一目的是，提供一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将E2、Erns、Cap和Rep基因连接后，与表达载体重组得到的重组质粒再转化至感受态细胞；

(2)提取感受态细胞质粒，进行酶切鉴定；

(3)对步骤(2)酶切鉴定正确的菌落进行扩大培养，得培养物；

(4)提取所述培养物的质粒DNA；

(5)将步骤(4)提取的质粒DNA转染PK15细胞，并检测所述重组质粒的E2、Erns、Cap和Rep在PK15细胞中mRNA水平的表达；

(6)经步骤(5)鉴定的重组质粒，与2mol/L CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs混合均匀，得猪CSFV-PCV二联DNA疫苗；

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述E2、Erns、Cap和Rep基因通过linker连接后，再重组到表达载体上。所述linker优选P2A，且P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤(6)所述重组质粒，与2mol/L CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs混合均匀，其中重组质粒:CaCl₂:ddH₂O:2×Hebs＝(50～200)μg:0.15μL:100μL:100μL，加入顺序为重组质粒、CaCl₂、ddH₂O、2×Hebs，且2×Hebs在液面下快速加入。

作为本发明优选的技术方案，还包括步骤(7)加入弗氏不完全佐剂，所述弗氏不完全佐剂的加入量是所述重组质粒、CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs的体积和的1～3倍。

本发明的又一目的是提供上述猪CSFV-PCV二联DNA疫苗在制备抗猪瘟病毒和/或猪圆环病毒疫苗中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，取得的有益效果：

1、本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗具有成本低廉、结构稳定和低温保存、储存期长、安全有效等特点，制备工艺简单，免疫方式简便快捷，仅需通过皮下注射途径免疫动物就能在体内表达出E2、Erns、Cap和Rep蛋白，并诱导机体产生较高水平的抗体，从而预防和控制CSFV和PCV-2的混合交叉感染，避免CSFV和PCV-2混合感染导致的其它疾病的发生。

2、本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗仅刺激动物体内产生E2、Erns、Cap和Rep蛋白的抗体，这有助于猪场中CSFV和PCV-2毒株的净化。

3、本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗所用载体为PSCA1质粒，载体缺乏与生成潜力相关的病毒结构，没有基因组整合和恶性转化宿主细胞的危险，不存在生物安全问题，应用较为安全。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明重组质粒示意图。

图2附图为本发明重组质粒经Bam H I单酶切鉴定示意图。(M：DL10000 Marker；1：pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep质粒酶切鉴定)

图3附图为本发明重组质粒pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep基因在PK15细胞中mRNA水平的表达示意图。(***是代表不同时间点同一基因之间的表达具有显著性差异，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。)

图4附图为本发明不含佐剂的50μg组、100μg组和200μg组疫苗组小鼠产生高水平的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(***是代表疫苗组与PBS组之间具有显著性差异，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。)

图5附图为本发明不含佐剂的50μg组、100μg组和200μg疫苗组不同时间小鼠体内的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(*、**、***均是代表50μg、100μg和200μg的疫苗组之间具有显著性的差异，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。)

图6附图为本发明同一剂量组不同时间小鼠体内的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(***代表同一剂量的PSCA1重组疫苗组的不同天数之间具有显著性的差异，***P<0.001。)

图7附图为本发明50μg组与50μg+佐剂组小鼠体内的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(**、***均是代表50μg剂量组与50μg+佐剂组之间具有显著性的差异，***P<0.001，**P<0.01。)

图8附图为本发明100μg组与100μg+佐剂组小鼠体内的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(*、**、***均是代表100μg剂量组与100μg+佐剂组之间具有显著性的差异，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。)

图9附图为本发明200μg组与200μg+佐剂组小鼠体内的CSFV和PCV-2抗体水平示意图。(*、**、***均是代表200μg剂量组与200μg+佐剂组之间具有显著性的差异，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。)

图10附图为本发明7个实验组对小鼠体重的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗及其制备方法。

实施例涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，对此不作限定。例如：无内毒素质粒小提中量试剂盒可选购自天根生化科技有限公司、TAKARA反转录试剂盒购自宝日医生物技术有限公司、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒购自天根生化科技有限公司、CSFV和PCV-2抗体ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

主要仪器洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司、7300定量PCR仪购自Applied Biosystems、高速低温离心机购自德国Eppendorf、Nanodrop2000紫外分光光度计购自Thermo Fisher Scientific。

实施例1疫苗制备

(1)重组质粒

将编码CSFV结构蛋白E2的基因E2(如SEQ ID NO：1所示)、编码CSFV结构蛋白Erns的基因Erns(如SEQ ID NO：2所示)、编码PCV-2免疫蛋白Cap的基因Cap(如SEQ ID NO：3所示)和编码PCV-1Rep蛋白的基因Rep(如SEQ ID NO：4所示)使用P2A(如SEQ ID NO：5所示)依次进行连接后，再通过BamH I和Sma I双酶切位点重组到甲病毒质粒pSCA1上，得到重组质粒pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep(参见附图1)，再转化至DH5α感受态细胞。

(2)重组质粒的酶切鉴定

将带有重组质粒pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep的DH5α进行扩大培养，并进行涂板，在平板上挑取单菌落接种到6mL LB+Amp液体培养基中，在37℃恒温振荡器中振荡培养培养12h，之后按照质粒提取试剂盒的要求从试管中提取质粒进行鉴定。具体步骤如下：

①用移液枪取菌液1.5mL于EP管中，12 000r/min转速下离心1min，倒掉上层清液；再加入菌液1.5mL于EP管中，重复离心操作，倒掉上层清液；随后，再重复上述操作2次，收集更多菌体。

②取250μL的Buffer S1加入到EP管中，室内静置2min，加入过程中尽量把沉淀吹散。

③用移液枪吸取250μL的Buffer S2溶液到上述的EP管中，轻轻翻转5次左右，让溶液混匀，促进菌体完全裂解，液体呈透亮状时即可。时间宜控制在5min内，以免质粒被破坏。

④吸取350μL的Buffer S3溶液到EP管中，翻转6-8次，室内放置5min，完全中和溶液，12 000r/min转速下离心10min。

⑤吸取上一步骤中的上清(不要吸入离心后的沉淀)于制备管中，静置2min，以12000r/min转速离心1min弃去滤液。

⑥将制备管置回离心管，加500μL的Buffer W1，12 000r/min离心1min，弃滤液。

⑦将制备管置回离心管，加700μL的Buffer W2，12 000r/min离心1min，弃滤液。重复该步骤一次。

⑧把制备管再次放回离心管中，12 000r/min转速下离心1min；

⑨将制备管转到一个新的离心管中，吸取70μL的去离子水悬空加入制备膜中间，室内静置2min，12 000r/min转速下离心1min，为提高洗脱的效率，去离子水一般提前加热到60℃。

⑩对提取的质粒进行BamH I和Sma I双酶切(酶切结果参见附图2)。

酶切条件为：37℃的水浴，2-4h。最后将鉴定正确的阳性重组菌送上海生工进行测序，并对测序结果进行比对分析。

(3)扩大培养经步骤(2)鉴定的含重组质粒的大肠杆菌

将鉴定正确的菌落进行扩大培养，以提取重组质粒制备二联DNA疫苗，具体步骤如下：

①将30mL含有目的质粒的细菌培养物于摇床中，37℃、180rpm/min培养到对数晚期(DNA600约0.6)。

②将含相应抗生素的500mL LB+Amp培养基(预加温至37℃)加入25mL对数晚期的培养液，于37℃剧烈振摇培养10-12h(摇床转速220rpm)，待培养液的OD600值约为0.4，得培养物。

(4)提取重组质粒DNA

利用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取步骤(3)所得培养物的重组质粒DNA，其具体操作步骤如下：

①将培养物在4000rpm离心5min并用500μL的P1溶液彻底悬浮细菌沉淀，再加入500μL的P2溶液翻转混匀裂解菌体，加入500μL的P4溶液翻转混匀，室温放置10min后12000rpm离心10min，取上清液。

②向过滤柱中加入上一步收集的上清液，12000rpm离心2min，取滤液并加入3/10倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

③向吸附柱中加入500μL的BL平衡液12000rpm离心1min以平衡柱子，再将滤液-异丙醇混合液加入吸附柱中12000rpm离心1min，500μL的PD去蛋白液洗涤一次，600μL的PW漂洗液洗涤两次，离心完全去除漂洗液，室温开盖风干10min。

④用200μL TB洗脱缓冲液洗脱吸附柱中的质粒DNA，获得的重组质粒利用Nanodrop检测其纯度和浓度。

(5)重组质粒转染PK15细胞，检测重组质粒的E2、Erns、Cap和Rep在PK15细胞中mRNA水平的表达

①接种细胞。转染前一天将PK15细胞接种至六孔板内。细胞接种数量为1×10⁶个细胞/孔。转染时细胞汇合度为80％。转染前2h对细胞进行换液。

②将4μg的质粒DNA加至250μL无血清的OPTI-MEM培基中，混匀。

③将8μL的Lipo2000加至另外250μL无血清的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置5min。

④将DNA悬液和Lipo2000悬液混合，总体积500μL，轻轻混匀，室温静置15min。

⑤将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

⑥转染4-6h后，细胞换为含有血清的培养基，每孔为2mL含有血清的培养基。

⑦细胞转染后继续分组培养0h、12h和24h，分别提取细胞总RNA，检测E2、Erns、Cap和Rep基因的表达。

⑧细胞内总RNA的提取采用Trizol法，其具体操作过程如下：

培养瓶中转染细胞用PBS洗涤2-3次后加入1mL的Trizol，枪头轻柔吹打直至细胞完全裂解，将Trizol裂解液装入新的1.5mL无酶离心管中于直接进行下一步的提取；

向Trizol裂解液中加入200μL的氯仿，吹打混匀静置10min后在4℃下12000rpm离心10min，溶液分为三层，从上至下依次为RNA层、DNA层、蛋白质层，吸去最上层的RNA溶液加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，4℃、12000rpm离心10min；

离心后的沉淀即为所需的RNA样品，加入1mL的无水乙醇洗涤沉淀两次，4℃、12000rpm离心1min去除无水乙醇，室温倒置10min风干；

向风干后装有RNA沉淀的离心管中加入15μL的RNase Free ddH₂O，于55℃水浴中静置10min溶解RNA，利用分光光度计检测RNA的纯度及浓度，分装RNA于-80℃保存备用或进行下一步反转录以获得cDNA。

⑨荧光定量PCR检测重组质粒E2、Erns、Cap和Rep基因在PK15细胞中mRNA水平的表达

反转录：PK15细胞总RNA的反转录按照TAKARA反转录试剂盒严格进行。配置反应液，于PCR仪中42℃、2min以去除基因组DNA。体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNAEraser 1μL、Total RNA<1μg、RNase Free ddH₂O加至10μL，反应条件为：42℃2min、4℃∞，以去除基因组的DNA。随后于去除了基因组DNA的RNA样品中加入反转录试剂，于PCR仪中37℃15min、85℃5s，使RNA反转录得到cDNA，获得的cDNA利用紫外分光光度计检测其纯度和浓度，于-80℃中保存。体系如下：已去除基因组DNA的RNA 10μL、Prime Script RT EnzymeMix I 1μL、RT Primer Mix 1μL、5×Prime Script Buffer 2 4μL、RNase Free ddH₂O 4μL。

实时荧光定量PCR反应：使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒进行RT-qPCR，并按照试剂盒说明书进行实验，具体步骤如下：

正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-free ddH₂O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；在冰上将反转得到的cDNA模板以说明书中推荐的体系与正向引物、反向引物、Mix、ROX、ddH₂O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中；盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5-10s，确保所有组分均在管底；将反应体系放置于RT-qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，运行程序，待程序结束后导出Ct值，并利用2^-ΔΔCt(Livak)法计算最终结果。

引物序列如下：

E2-F：TCCCCCGGGCGGCTAGCCTGCAAGGAAG，SEQ ID NO：6；

E2-R：CGCGGATCCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG，SEQ ID NO：7；

Erns-F：TCCCCCGGGGAAAATATAACTCAATGGAACCTG，SEQ ID NO：8；

Erns-R：CGCGGATCCGGCATAGGCACCAAACCAG，SEQ ID NO：9；

Cap-F：GCATCTTCAACACCCGCCTA，SEQ ID NO：10；

Cap-R：ATCTCATCATGTCCACCGCC，SEQ ID NO：11；

Rep-F：TAGCCGAGCAGTTCCCTGTA，SEQ ID NO：12；

Rep-R：AGCTGTCTTCCAATCACGCT，SEQ ID NO：13。

结果显示，E2、Erns、Cap和Rep基因在PK15细胞内的表达呈现出直线上升的趋势，且不同时间点的表达均呈现出显著性差异(参见附图3)。

(6)猪CSFV-PCV二联DNA疫苗制备

经步骤(5)鉴定的重组质粒制备成二联DNA疫苗，方法如下：

设置三个不加佐剂试验组：将不同质量的pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep重组质粒分别加入EP管中，每管加入2mol/L的CaCl₂ 0.15μL，再取100μL ddH₂O放入EP管中混匀，然后将100μL的2×Hebs(缓冲盐溶液)在EP管液面下快速加入，边加边混匀，制得重组质粒浓度为50μg/200μL、100μg/200μL和200μg/200μL的不加佐剂的猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，分别标记为50μg组、100μg组、200μg组。

同时设置三个佐剂试验组：将不同质量的pSCA1-E2-Erns-Cap-Rep重组质粒分别加入EP管中，每管加入2mol/L的CaCl₂ 0.15μL，再取100μL ddH₂O放入EP管中混匀，然后将100μL的2×Hebs(缓冲盐溶液)在EP管液面下快速加入，边加边混匀后得混合液，再加入与混合液等体积的弗氏不完全佐剂，混匀形成油包水乳化剂，制得重组质粒浓度为50μg/200μL、100μg/200μL和200μg/200μL的含佐剂的猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，分别标记为50μg+佐剂组、100μg+佐剂组、200μg+佐剂组。

实施例2免疫效果验证

(1)小鼠的接种免疫与采血分离血清

健康的BALB/c小鼠42只，随机分成7组，每组6只，分组为PBS组、50μg组、100μg组、200μg组、50μg+佐剂组、100μg+佐剂组、200μg+佐剂组。

通过皮下免疫方式接种小鼠，同组内免疫剂量与免疫方法、部位相同，持载体总量不变，体积为200μL/只，分点注射，小鼠每点注射量每次为100μL/点。在免疫后的0d，即在初免后的6h内，断尾采血，分离血清。7d后进行二免。14d后进行三免，断尾采血分离血清。21d后进行四免加强免疫，于28d断尾采血分离血清。

血清分离步骤如下：在采取血液标本后，室温血液自然凝固10-20min，离心20min左右(2000-3000rpm)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

(2)测定免疫小鼠血清CSFV抗体和PCV-2抗体含量(ELISA法)

小鼠分离的血清参照默沙克CSFV和PCV-2抗体ELISA试剂盒说明书进行抗体检测，具体操作步骤如下：

①加样：首先在标准品孔内分别加入各个浓度的标准品50μL；在血清样本孔先后加入40μL样本稀释液、10μL样本；同时设有空白孔(不加样本和酶)。

②温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

③配液：浓缩洗涤液按1:29稀释。

④洗涤：30min后，从恒温箱取出酶标板，揭除封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复五次，拍干。

⑤加酶：在标准孔、样品孔内均加入50μL酶标试剂。

⑥温育：操作同步骤②。

⑦洗涤：操作同步骤④。

⑧显色：在每孔依序注入显色液A、B各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

⑨终止：每孔加终止液50μL，终止反应。

⑩测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

(3)检测结果

①PBS组、50μg组、100μg组、200μg组刺激小鼠体内CSFV和PCV-2抗体水平

检测PBS组、50μg组、100μg组、200μg组小鼠体内CSFV和PCV-2的抗体水平，检测结果(参见附图4)。结果显示50μg组、100μg组、200μg组小鼠体内CSFV和PCV-2抗体水平均显著高于PBS组，说明本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗能够有效刺激机体产生CSFV和PCV-2的抗体。

②不同免疫剂量疫苗组刺激小鼠体内CSFV和PCV-2的抗体水平

检测50μg组、100μg组、200μg组小鼠在免疫0d、免疫14d、免疫21d、免疫28d时体内CSFV和PCV-2的抗体水平，检测结果(参见附图5)。结果显示在21d的50μg组、100μg组和200μg组之间小鼠体内CSFV和PCV-2抗体水平均具有显著性的差异，说明本发明猪CSFV-PCV二联DNA疫苗具有一定的剂量依赖性。

③同一剂量组不同时间小鼠体内CSFV和PCV-2的抗体水平呈上升趋势

对同一剂量组不同时间点的小鼠体内抗体水平进行比较，结果显示，随着时间点的延长，小鼠体内CSFV和PCV-2的抗体水平均呈现上升趋势(参见附图6)。

④弗氏不完全佐剂增强免疫效果

对50μg组、100μg组、200μg组以及50μg+佐剂组、100μg+佐剂组、200μg+佐剂组免疫效果进行对比，结果显示添加弗氏不完全佐剂组免疫效果均显著强于不加弗氏不完全佐剂疫苗组的免疫效果，比对结果(参见附图7-9)。

实施例3安全性检测

在实施例2小鼠的接种免疫与采血分离血清步骤中，免疫之前进行每只小鼠体重的测量，在免疫后的0d，即在初免后的6h内，进行体重称量。7d后进行二免。14d后进行三免，进行体重称量。21d后进行四免加强免疫，于28d进行体重称量。以监测疫苗对小鼠体重的影响，检测结果(参见附图10)显示，疫苗对小鼠的体重没有影响，不影响小鼠的生长。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西安电子科技大学

<120> 一种猪CSFV-PCV 二联DNA疫苗及其制备方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcggctag cctgcaagga agattacagg tacgcaatat catcgaccaa tgagataggg 60

ctactcgggg ccgaaggtct caccaccacc tggaaagaat acaaccacga tttgcaactg 120

aatgacggga ccgttaaggc catttgcgtg gcaggttcct ttaaagtcat agcacttaat 180

gtggtcagta ggaggtattt ggcatcattg cataaggagg cttcactcac ttccgtgaca 240

tttgagctcc tgttcgacgg gaccaaccca tcaactgagg aaatgggaga tgacttcggg 300

ttcgggctgt gcccgttcga tacgagtcct gttgtcaagg gaaagtacaa tacaaccttg 360

ttgaacggta gtgctttcta tcttgtctgc ccaatagggt ggacgggtgt catagagtgc 420

acagcagtga gcccaacaac tctgagaaca gaagtggtaa agaccttcag gagagacaag 480

ccctttccgc acagaatgga ttgtgcgacc accacagtgg aaaatggaga tttattctac 540

tgtaagttgg ggggcaactg gacatgtgtg aaaggtgaac cagtggtcta cacggggggg 600

ctagtaaaac aatgcagatg gtgtggcttc gacttcaatg agcccgacgg actcccgcac 660

taccccatag gtaagtgcat cttggtaaat gagacaggtt acagaatagt agattcaacg 720

gactgtaaca gagatggcgt tgtaatcagc acagatggga gtcatgagtg cttgatcggt 780

aacacaactg tcaaggtgca tgcatcagat gaaagactgg gccctatgcc atgcagaccc 840

aaagagattg tctctagtgc aggacctgta aggaaaactt cctgtacatt caactacgca 900

aaaactttga agaacaagta ctatgagccc agggacagct acttccagca atatatgctt 960

aagggcgagt atcagtactg gtttgacctg gacgtgactg accgccactc agattacttc 1020

gcagaatttg tcgtcttggt agtggtagca ctgttaggag gaagatatgt cctgtggcta 1080

atagtgacct acatagttct aacagaacaa ctcgccgctg gt 1122

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaaatataa ctcaatggaa cctgagtgac aacggcacta atggtatcca gcatgctatg 60

taccttagag gggttagcag gagcttgcat gggatctggc cggaaaaaat atgcaaagga 120

gtccccacct acctggccac agacacggaa ctgaaagaaa tacagggaat gatggatgcc 180

agcgagggga caaactatac gtgctgtaag ttacagagac atgaatggaa caaacatgga 240

tggtgtaact ggtacaatat agacccctgg atacagttga tgaatagaac ccaagcaaac 300

ttggcagaag gccctccggc caaggagtgc gctgtgactt gcaggtacga taaagatgct 360

gacatcaacg tggtcaccca ggccagaaac aggccaacaa ccctgaccgg ttgcaagaaa 420

ggaaaaaatt tttcttttgc gggtacagtt atagagggcc catgtaattt caatgtttcc 480

gtggaggata tcttgtatgg ggatcatgag tgcggcagtt tgcttcagga cacggctctg 540

tacctagtgg atggaatgac caacactata gagaatgcca gacagggagc agcgagggta 600

acatcttggc tcgggaggca actcagcact gccgggaaga ggttggaggg tagaagcaaa 660

acctggtttg gtgcctatgc c 681

<210> 3

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtatccaa ggaggcgtta ccggagaaga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 60

atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gttaccgctg gagaaggaaa 120

aatggcatct tcaacacccg cctatcccgc accttcggat atactatcaa gcgaaccaca 180

gtcagaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattca atattaatga ctttcttccc 240

ccaggagggg gctcaaaccc ccgctctgtg ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt 300

aaggttgaat tctggccctg ctccccgatc acccagggtg acaggggagt gggctccagt 360

gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctcaccta tgacccctat 420

gtaaactact cctcccgcca taccataacc cagcccttct cctaccactc ccgctacttt 480

acccccaaac ctgtcctaga ttccactatt gattacttcc aaccaaacaa caaaagaaac 540

cagctgtggc tgagactaca aactgctgga aatgtagacc acgtaggcct cggcactgcg 600

ttcgaaaaca gtatatacga ccaggaatac aatatccgtg taaccatgta tgtacaattc 660

agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaccct 696

<210> 4

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaagcaaga aaagcggccc gcaaccccat aagaggtggg tgttcaccct taataatcct 60

tccgaggagg agaaaaacaa aatacgggag cttccaatct ccctttttga ttattttgtt 120

tgcggagagg aaggtttgga agagggtaga actcctcacc tccaggggtt tgcgaatttt 180

gctaagaagc agacttttaa caaggtgaag tggtattttg gtgcccgctg ccacatcgag 240

aaagcgaaag gaaccgacca gcagaataaa gaatactgca gtaaagaagg ccacatactt 300

atcgagtgtg gagctccgcg gaaccagggg aagcgcagcg acctgtctac tgctgtgagt 360

acccttttgg agacggggtc tttggtgact gtagccgagc agttccctgt aacgtatgtg 420

agaaatttcc gcgggctggc tgaacttttg aaagtgagcg ggaagatgca gcagcgtgat 480

tggaagacag ctgtacacgt catagtgggc ccgcccggtt gtgggaagag ccagtgggcc 540

cgtaattttg ctgagcctag cgacacctac tggaagccta gtagaaataa gtggtgggat 600

ggatatcatg gagaagaagt tgttgttttg gatgattttt atggctggtt accttgggat 660

gatctactga gactgtgtga ccggtatcca ttgactgtag agactaaagg cggtactgtt 720

ccttttttgg cccgcagtat tttgattacc agcaatcagg ccccccagga atggtactcc 780

tcaactgctg tcccagctgt agaagctctc tatcggagga ttactacttt gcaattttgg 840

aagactgctg gagaacaatc cacggaggta cccgaaggcc gatttgaagc agtggaccca 900

ccctgtgccc ttttcccata taaaataaat tactga 936

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcccccgggc ggctagcctg caaggaag 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca ccagcggcga gttgttctg 29

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcccccgggg aaaatataac tcaatggaac ctg 33

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatccg gcataggcac caaaccag 28

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcatcttcaa cacccgccta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctcatcat gtccaccgcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagccgagca gttccctgta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctgtcttc caatcacgct 20

Claims

1.一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，其特征在于，包括表达载体，在所述表达载体上插入编码CSFV结构蛋白E2的基因E2、编码CSFV结构蛋白Erns的基因Erns、编码PCV-2免疫蛋白Cap的基因Cap和编码PCV-1Rep蛋白的基因Rep。

2.根据权利要求1所述一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，其特征在于，其中所述E2基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述Erns基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述Cap基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述Rep基因核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，其特征在于，所述基因E2、Erns、Cap和Rep插入到表达载体上得到重组质粒，所述重组质粒用于对所述基因E2、Erns、Cap和Rep的融合表达。

4.根据权利要求3所述的一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，其特征在于，还包含CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs，且所述重组质粒在猪CSFV-PCV二联DNA疫苗中的浓度为0.25～1μg/μL。

5.根据权利要求4所述的一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗，其特征在于，还包括药学上所接受的免疫佐剂。

6.一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)提取感受态细胞质粒，进行酶切鉴定；

(3)对步骤(2)酶切鉴定正确的菌落进行扩大培养，得培养物；

(4)提取所述培养物的质粒DNA；

(5)将步骤(4)提取的质粒DNA转染PK15细胞，并检测所述E2、Erns、Cap和Rep在PK15细胞中mRNA水平的表达；

(6)经步骤(5)鉴定的重组质粒，与2mol/L CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs混合均匀，得猪CSFV-PCV二联DNA疫苗。

7.根据权利要求6所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述E2、Erns、Cap和Rep基因通过linker连接。

8.根据权利要求6所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中步骤(6)所述重组质粒、2mol/L CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs的比例关系是重组质

粒:CaCl₂:ddH₂O:2×Hebs＝(50～200)μg:0.15μL:100μL:100μL。

9.根据权利要求6所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，还包括步骤(7)加入弗氏不完全佐剂，

所述弗氏不完全佐剂的加入量是所述重组质粒、2mol/L CaCl₂、ddH₂O和2×Hebs缓冲液体积和的1～3倍。

10.权利要求1所述一种猪CSFV-PCV二联DNA疫苗在制备抗猪瘟病毒和/或猪圆环病毒疫苗中的应用。