CN117018174A - 用于副鸡禽杆菌a型的酿酒酵母口服疫苗及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及用于用于副鸡禽杆菌A型的酿酒酵母口服疫苗及应用。本发明对A型副鸡禽杆菌的HA抗原序列进行了分解，组合，筛选和密码子的优化，选择出了可在酵母表面展示同时表达量高的两种蛋白，然后进一步做免疫原性的筛选，发现A‑HA‑5的免疫效果更好。进一步的，申请人继续对A‑HA‑5进行密码子优化，最终筛选出在酿酒酵母表面蛋白展示浓度高，且免疫原性高的蛋白，作为副鸡禽杆菌A型口服疫苗。本发明首次提供了可口服的副鸡禽杆菌A型疫苗，口服疫苗后进行攻毒，7天观察疫苗的保护率可以达到100%，可以有效的预防A型副鸡禽杆菌的感染。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及用于副鸡禽杆菌A型的酿酒酵母口服疫苗及应用。
技术背景
副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)引起鸡的传染性鼻炎(infectious coryza,IC)，是一种鸡的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。该菌为一种革兰氏阴性的细小杆菌，长1-3μm，没有运动性，不形成芽孢，毒力菌株往往具有荚膜。本菌生长要求较为苛刻，在普通的培养基上不生长，分离培养需用鲜血琼脂培养基或巧克力琼脂培养基，需要在培养基中添加血清和V因子(NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。本菌兼性厌氧，在固体培养基上生长16-24小时后，可形成针尖大小，圆形，半透明的露滴状凸起的菌落，毒力菌株菌落在45°斜射光下会见到蓝灰色的光泽。在固体培养基上生长时需要厌氧环境或5-10％的CO2，液体培养时无须厌氧或CO2环境，不形成荚膜。
副鸡禽杆菌血清A型在我国的存在时间最长，传播范围最广。灭活疫苗是目前预防鸡传染性鼻炎的主要方式,但随着病原菌的不断变异,现有疫苗株对流行株的保护力差,免疫失败的情况时有发生。研究表明，副鸡禽杆菌有多种毒力因子,而血凝素蛋白是其中最具潜力的疫苗抗原。为了预防鸡传染性鼻炎，目前已经商品化的疫苗全部是灭活疫苗，有A型和C型的二联灭活疫苗，A\B\C三种血清型的三价灭活疫苗。由于副禽禽杆菌生长条件的限制，培养成本较高，导致常规的灭活疫苗成本居高不下，而且鸡场技术人员免疫工作量较大。同时，该菌为革兰氏阴性细菌，含有LPS、其他毒性物质等附加物质，灭活疫苗制备容易造成产生较为副作用，若灭活疫苗内毒素去除不好，会对蛋鸡的产蛋或者生长会有影响。由于现有灭活疫苗均为油佐剂制备的疫苗，在免疫中，还有可能会形成囊肿，影响鸡的生长，严重的会在接种部位形成局灶性坏死斑。
酿酒酵母展示作为口服疫苗的递送载体安全无毒，口服无应激；可以耐受一定的胃酸消化分解，为生物大分子透过提供保护，酵母细胞壁内层主要有β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖这两种重要的免疫调节剂组成，因此具有安全性和益生性。而且酵母细胞壁的外层由高度糖基化的甘露聚糖蛋白组成，内外两层后200nm，在维持细胞形态的同时保持细胞渗透性，对发酵条件具有更强的耐受性，更适于大规模培养。天津大学陈琛以酿酒酵母作为载体表达非洲猪瘟外源蛋白，并进行口服饲喂免疫猪，能诱导较高水平的体液免疫和黏膜免疫。研究人员以酿酒母作为宿主,红点石斑鱼坏死病毒(RGNNV)的重组衣壳蛋白当作模型抗原,经研究发现与免疫纯化重组衣壳蛋白的小鼠相比，免疫全重组酵母疫苗的小鼠产生的lgG抗体滴度提高了9倍～27倍。酿酒酵母表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗的研究，已经被证明具有较好的免疫效果，免疫效果通过ELISA检测口服免疫实验猪血清中的特异性IgA和IgG的水平进行评价，与口服原始酵母的对照组相比，实验组血清中的特异性抗体的水平明显升高。
外源蛋白表达体系包含许多关键的步骤：如(1)选择具有适当的折叠和翻译后修饰功能的宿主菌；(2)选择一个合适的载体(附加型或整合型)、启动子(组成型、诱导型或阻遏型)和选择性标记；(3)对基因进行密码子优化；(4)如果要对蛋白进行亲和纯化或检测核糖体蛋白的活性，则需要加上表位标签；(5)选择信号肽使核糖体蛋白靶向性的由胞内释放到胞外的介质中；(6)优化发酵条件等(田晓娟,酵母表达系统研究概述.陇东学院学报,2018.29(01):p.72-76.)。
密码子偏好性优化策略是目前最常用的密码子优化策略，主要是将供体密码子与宿主基因组中具有最高频率的同义密码子进行替换，利用宿主中最丰富的密码子来编码优化序列中的氨基酸(Villalobos,A.,etal.,Gene Designer:a synthetic biology toolfor constructing artificial DNA segments.BMC Bioinformati cs,2006.7:p.285.)。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过tRNA在翻译水平上改变蛋白的翻译速度(Sabi,R.and T.Tuller,Modelling the efficiency of codon-tRNA interactionsbased on codonusage bias.DNA Res,2014.21(5):p.511-26.)。但也有部分实验结果表明，利用密码子偏好性的优化策略来进行蛋白表达时，非但没有增加蛋白的表达含量，反而使蛋白的含量降低(Zhu,D.,et al.,Comparis on of two codon optimizationstrategies enhancing recombinant Sus scrofa lysozyme production in Pichi apastoris.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2015.61(2):p.43-9.)。因此需结合实际情况进行密码子优化序列的选择。
申请人通过对副鸡禽杆菌A型菌的免疫原性基因进行了初步筛选，选择A型菌中血凝素蛋白Hmtp210基因高变区序列共489个氨基酸，并对其高变区的序列进行了预测，进行了不同长度氨基酸的组合，根据酿酒酵母密码子，对其序列进行优化，将其关键的抗原免疫区高效地展示在酿酒酵母表面，以口服途径免疫鸡只，提高免疫鸡的黏膜免疫屏障，从而有效防范A型副鸡禽杆菌的侵入。
发明内容
本发明的目的在于提供用于A型副鸡禽杆菌的酿酒酵母口服疫苗，所述的口服疫苗，是将编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸，导入酿酒酵母中获得。
本发明的另一个目的在于提供上述酿酒酵母口服疫苗在制备治疗或预防副鸡禽杆菌A型感染的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用于A型副鸡禽杆菌的酿酒酵母口服疫苗，所述的口服疫苗，是将编码SEQ IDNO.11蛋白的多核苷酸，导入酿酒酵母中获得。
以上所述的口服疫苗，优选的，编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.5所示。
以上所述的口服疫苗，优选的，编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸为SEQ IDNO.14所示。
以上所述的口服疫苗，优选的，所述的酿酒酵母为EBY100。
本发明的保护内容还包括：
用于A型副鸡禽杆菌的酿酒酵母口服疫苗在制备治疗或预防副鸡禽杆菌A型感染的药物中的应用。
以上所述的应用，包括以本发明提供的口服疫苗作为唯一有效成分，或有效成分之一，用于制备成治疗或预防副鸡禽杆菌A型感染的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明首次提供了可口服的副鸡禽杆菌A型疫苗，口服疫苗后进行攻毒，7天观察疫苗的保护率可以达到100％。
2.本发明对A型副鸡禽杆菌的HA抗原序列进行了分解，组合，筛选和密码子的优化，选择出了可在酵母表面展示同时表达量高的两种蛋白，然后进一步做免疫原性的筛选，发现A-HA-5的免疫效果更好。进一步的，申请人继续对A-HA-5进行密码子优化，最终筛选出在酿酒酵母表面蛋白展示浓度高，且免疫原性高的蛋白，作为副鸡禽杆菌A型口服疫苗。
3.本发明制备的疫苗免疫方式简单，口服拌料容易规模化实施，避免注射引起的应激反应，可以有效的预防A型副鸡禽杆菌的感染。
附图说明
图1是副鸡禽杆菌的构建及酵母展示示意图；
示意图显示通过BamHI/XhoI插入编码抗原的基因。
图2是A群副鸡禽杆菌6个目的基因的扩增片段核酸电泳图；泳道：M为2000Marker，1为A-HA-1，2为A-HA-2，3为A-HA-3，4为A-HA-4，5为A-HA-5，6为A-HA-6。
图3是A型副鸡禽杆菌不同片段基因重组酿酒酵母的间接免疫荧光鉴定示意图。
图4是免疫攻毒后口服空白对照组鸡的图片。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。限于篇幅，本发明以商业化酿酒酵母EBY100为例进行口服疫苗的制备，现有技术中任何可口服的酿酒酵母，均适用于本发明。
实施例1：
重组酿酒酵母的获得
1.副鸡禽杆菌关键抗原的设计及穿梭载体的构建
1.1参考副鸡禽杆菌A型的基因组序列，获得A-HA(ACCESSION：WP_130261416)的氨基酸序列489个氨基酸，通过对抗原可变区域序列分析，申请人将A-HA的基因连续地分为3个不同的抗原区，分别命名为PART1，PART2，PART3。进一步的，将这些抗原区进行了截短，或整合，同时进行密码子的优化，最后发现有6种可以在酿酒酵母表面进行展示，而其余的无法展示，或表达量特别小，可展示的序列分别为：
1.A-HA-1:PART1全长蛋白，蛋白为SEQ ID NO.7所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.1所示；
2.A-HA-2：PART1截短蛋白，蛋白为SEQ ID NO.8所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.2所示；
3.A-HA-3：PART2全长蛋白，蛋白为SEQ ID NO.9所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.3所示；
4.A-HA-4：PART3全长蛋白，蛋白为SEQ ID NO.10所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.4所示；
5.A-HA-5：PART1截短蛋白+PART2全长蛋白，蛋白为SEQ ID NO.11所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.5所示；
6.A-HA-6：PART2全长蛋白+PART3全长蛋白，蛋白为SEQ ID NO.12所示，优化后的编码该蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.6所示；
上述基因均由南京擎科生物技术有限公司合成到pUC57克隆载体上。
1.2以1.1制备的克隆载体为模板，分别扩增上述6个基因的片段，引物序列及扩增的碱基数见表一：分别凝胶回收6个基因片段，结果如图2所示。
表一 目的基因扩增引物及载体通用鉴定引物
PCR反应程序：在95℃反应1分钟后，进行30个循环的“变性(95℃，10秒)、退火(58℃，15秒)和延伸反应(72℃，60秒)，然后修复延伸反应(72℃，7分钟)。
1.3以BamHI/XhoI双酶切pYD1载体，回收载体骨架；配制5ul重组反应体系：
1.4转化及筛选鉴定
冰浴10分钟，立即加入到DH5α感受态细胞中，冰浴20分钟，42℃热激90s,加入SOB液体培养基置于摇床振荡培养45分钟，涂布含100ug/ml的氨苄抗生素的LB固体培养基上；以通用引物扩增鉴定含目的基因的阳性克隆子，鉴定正确的转化子分别命名为：pYD1-A-HA-1、pYD1-A-HA-2、pYD1-A-HA-3、pYD1-A-HA-4、pYD1-A-HA-5、pYD1-A-HA-6。
2.重组酵母的转化和表达鉴定
2.1重组酵母的转化
分别提取测序正确的重组质粒(pYD1-A-HA-1、pYD1-A-HA-2、pYD1-A-HA-3、pYD1-A-HA-4、pYD1-A-HA-5、pYD1-A-HA-6)各5μg,以ddH2O溶解洗脱。按操作手册制备酿酒酵母的电转感受态，每个重组质粒2ug分别加入到一管含100ul感受态的酿酒酵母EBY100中，冰浴5min,置于2mm的电转杯中，2500V脉冲电击约5ms左右，加入YPD复苏1个小时，涂布SC-TRP1固体培养基中，30℃生化培养箱倒置培养，抗原序列插入位点如图1所示。
2.2重组酵母的表达
在每个抗原的平板上，分别活化一株生长良好的酵母EBY100单克隆，挑取单克隆酵母到40mL YNB-CAA(含2％葡萄糖和10mg/mL L-亮氨酸)液体培养基中，30℃，200rpm震荡培养，至OD600≈2左右时，低速离心去掉生长培养基，以等体积40mL YNB-CAA(含2％半乳糖和10mg/mL L-亮氨酸)诱导培养基重悬，置于20℃，200rpm震荡培养36～48h；分别收集菌体进行蛋白鉴定。
2.3间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence)鉴定
取约1.0OD600nm的菌液，PBS洗涤2次，以500ul PBS重悬，以V5鼠单抗为一抗，DyLight488荧光偶联的山羊抗鼠IgG(H+L)为二抗，在荧光显微镜下观察酿酒酵母表面荧光,以空EBY100为阴性对照，aga1融合的副鸡禽杆菌基因与酵母菌株自身表达的aga2通过二硫键共价展示到酿酒酵母表面，6个重组酵母均能高效展示副鸡禽杆菌的蛋白(图3)，细胞显示的荧光越亮，说明单个细胞展示抗原的数量越多。
2.4重组酿酒酵母外源蛋白平均荧光强度值测定
将诱导表达的酵母菌液，用PBS稀释至.1.0OD/ml的菌液，取100μl菌液，以V5鼠单抗为一抗，DyLight488荧光偶联的山羊抗鼠IgG(H+L)为二抗，在多功能酶标仪(瑞士SPARK10M，488nm激发光)上检测相对荧光强度，结果如表2所示。口服免疫组A-HA-1和口服免疫组A-HA-5相对荧光强度值均高于其它组。说明本发明选取的6种蛋白的确都可以展示在酵母表面，但仅有A-HA-1和A-HA-5的表达量较高，而A-HA-1的表达量最高。
表2重组酿酒酵母相对荧光强度值
实施例2：酿酒酵母口服组合物制备及免疫评价
口服菌液制备：分别对6株重组酿酒酵母扩大培养及诱导表达600mL，测定OD600nm及活菌涂板计数，3000rpm离心5min,PBS洗涤菌体1次，PBS重悬并浓缩至10mL，保持酵母菌的总浓度9.0*109cfu/mL。
试验动物：6周龄SPF鸡80只，由SPF鸡胚孵育获得，鸡胚购自北京梅里亚维通SPF鸡实验动物中心。试验动物分8组，每组10只SPF鸡，打上相应的脚标。其中六组为免疫组，第七组为酵母空载体组，剩下一组为空白对照组。
免疫分组如下：
(1)免疫组：将重组酿酒酵母菌发酵液菌体采用PBS重悬并浓缩至10mL，酵母菌的总浓度9.0*109cfu/mL。每羽份配料如下：将10mL菌液与150g饲料均匀混合，置于在料槽口自然采食，拌料口服。
(2)酵母空载体组：将酿酒酵母空载体组培养，调整酵母菌的总浓度9.0*109cfu/mL。
(3)对照组：按照同比例拌料PBS。
每周在第1、3和5天进行拌料口服，免疫4周。第30天分别眶下窦接种副鸡禽杆菌A型Apg-221(CVCC255)(购自中国兽医药品监察所，属于商业菌株)，剂量约为1.5×106CFU。攻毒后连续观察一周，记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等，评价重组酿酒酵母的免疫保护力。于攻毒后第3日、第7日对免疫组的60只鸡继续拌料同等的重组酿酒酵母菌。观察免疫组及对照组健康状况，记录攻毒后免疫组或对照组死亡状况，表3为攻毒后第7天的观察结果。
表3本发明鸡传染性鼻炎重组酿酒口服疫苗免疫鸡的攻毒保护效果
结果如表3所示：用本发明筛选的6个重组酿酒酵母制备的口服疫苗，以相同的饲喂剂量免疫试验鸡，免疫后用A血清型的Apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续发病。重组酿酒酵母口服疫苗免疫组1和口服免疫组5均具有较好的保护效果，其中免疫组1攻毒后只有个别试验鸡表现出鼻炎症状，保护率为90％，口服免疫组5则完全没有相关症状，保护率为100％。；口服免疫组2、3、4和6组攻毒后保护率较差，分别为50％、40％、30％和60％，酵母空载体组和空白对照组所有试验鸡都表现出严重的鼻炎症状。攻毒后空白组发病图片如图4所示。
综合实施例1和2的结果，虽然从蛋白表达上来说，A-HA-1的表达量最高，但从保护比例上看，A-HA-5的效果最好，说明其免疫原性要显著高于A-HA-1，因此，申请人选择A-HA-5做进一步的优化。
实施例3：不同密码子优化后平均荧光强度值测定
针对A-HA-5的氨基酸序列，根据经验，继续进行密码子的优化，分别获得了2种不同的核苷酸序列，分别命名为A-HA-5a(SEQ ID NO.13所示)和A-HA-5b(SEQ ID NO.14所示)，再加上实施例1中的A-HA-5，申请人将3组不同的基因分别导入酿酒酵母中进行表达，获得重组酿酒酵母菌株A-HA-5、A-HA-5a和A-HA-5b。
表4不同密码优化后目的基因扩增引物
将构建的好的重组酿酒酵母菌株A-HA-5、A-HA-5a和A-HA-5b分别诱导表达，获得重组酵母菌液，用PBS稀释至.1.0OD/ml的菌液，取100μl菌液，以V5鼠单抗为一抗，DyLight488荧光偶联的山羊抗鼠IgG(H+L)为二抗，在多功能酶标仪(瑞士SPARK10M，488nm激发光)上检测相对荧光强度，结果如表5所示。口服免疫组A-HA-5b相对荧光强度值高于口服免疫组A-HA-5a和A-HA-5的相对荧光强度值，较之于A-HA-5强度值提高了22.15％。单位OD值内的相对荧光强度能反应外源基因在酿酒酵母中的表达量。
表5不同的优化基因策略重组菌的相对荧光强度值
实施例4：
不同密码子优化后免疫保护效力评价
将A-HA-1、A-HA-5、A-HA-5a和A-HA-5b四组重组酿酒酵母菌分别扩大培养及诱导表达600mL，测定OD600nm及活菌涂板计数，3000rpm离心5min,PBS洗涤菌体1次，PBS重悬并浓缩至10mL，将重组酿酒酵母A-HA-1、A-HA-5、A-HA-5a和A-HA-5b各自的菌液浓度分别调为9.0*109cfu/mL和6.0*109cfu/mL。每种重组酿酒酵母菌分别用2个不同的菌液浓度进行免疫SPF鸡。
每羽份配料如下，将每种重组酿酒酵母10mL菌液分别与150g SPF鸡专用粉剂饲料均匀混合，以自然采食的方式进行。每周在第1、3和5天进行拌料口服，免疫4周。第30天分别眶下窦接种副鸡禽杆菌A型Apg-221(CVCC255)(购自中国兽医药品监察所，属于商业菌株)，剂量约为A型(221株)1.5×106CFU。连续观察一周，记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等。评价各个不同的重组酿酒酵母饲喂后的免疫保护力。于攻毒后第3日、第7日对免疫组1-8组继续拌料同等的重组酿酒酵母菌，酵母空载体组继续拌料空载体酵母。观察免疫组及对照组健康状况，记录攻毒后免疫组或对照组死亡状况，表6为攻毒后第7天的观察结果。。
表6不同的优化基因策略重组酿酒酵母免疫保护效力
根据表6结果表明，低剂量重组酿酒酵母A-HA-5b的饲喂菌液浓度，与高剂量重组酿酒酵母A-HA-1、A-HA-5和A-HA-5a具有同等的免疫保护效力；若降低重组酿酒酵母A-HA-1、A-HA-5和A-HA-5a的饲喂浓度，则对A型菌株攻毒后的保护效力会降低。
Claims (6)
1. 用于A型副鸡禽杆菌的酿酒酵母口服疫苗，所述的口服疫苗是将编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸，导入酿酒酵母中获得。
2. 根据权利要求1所述的口服疫苗，所述的编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸为SEQID NO. 5所示。
3. 根据权利要求1所述的口服疫苗，所述的编码SEQ ID NO.11蛋白的多核苷酸为SEQID NO. 14所示。
4.根据权利要求1所述的口服疫苗，所述的酿酒酵母为EBY100。
5.权利要求1所述的口服疫苗在制备治疗或预防副鸡禽杆菌A型感染的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，为权利要求1所述的口服疫苗作为唯一有效成分，或有效成分之一，用于制备成治疗或预防副鸡禽杆菌A型感染的药物。
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| Title |
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| SANDT, C.H.等: "YadA-like family protein [Avibacterium paragallinarum]，NCBI Reference Sequence: WP_268387799.1，2042 aa linear", NCBI GENBANK * |
| 迟恒等: "口服酵母载体疫苗在畜禽疫病防控中的应用", 动物医学进展, vol. 42, no. 3, pages 111 - 114 * |
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