CN102333539A - 重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法。提供用于制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括：构建可以产生包涵体形式的融合肽的大肠杆菌的步骤，所述融合肽由源自血清型A和血清型C的副鸡禽杆菌的外膜蛋白的肽组成；培养所述大肠杆菌并从培养物中收集并纯化包涵体的步骤；和制备包含所述的纯化的包涵体的制剂的步骤，以及提供包含作为活性成分的融合肽的禽传染性鼻炎疫苗。可以在包含融合肽的各个肽之间插入接头序列。对于源自血清型A和C的肽，可以使用区域2或其附近的负责针对感染的保护的氨基酸序列。

Description

重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法。更具体而言，本发明涉及包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法，其中所述融合肽由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)(以下也称作″A.pg″)血清型A的外膜蛋白的一部分和A.pg血清型C的外膜蛋白的一部分组成。
背景技术
禽传染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由A.pg感染引起的最重要的呼吸疾病之一。患有禽传染性鼻炎的鸡显示出下列主要症状：流鼻涕、面肿和溢泪。禽传染性鼻炎引起大量的经济上的损失，因为其导致鸡的繁殖率下降、产蛋的延迟、鸡蛋产量的下降或产蛋的失败。
Page等人将A.pg分类为3种血清型：A、B和C(见例如，非专利文献1)，Sawata等人将A.pg分类为2种血清型：1和2(见例如，非专利文献2)。此后，Kume等人报道：Page等人的血清型A对应于Sawata等人的血清型1，Page等人的血清型C对应于Sawata等人的血清型2(见例如，非专利文献3和4)。现在已经证明：禽传染性鼻炎的主要诱因剂是A.pg血清型A(以下也称作″A.pg-A″)和A.pg血清型C(以下也称作″A.pg-C″)。
为了预防禽传染性鼻炎，目前已经广泛使用了灭活的疫苗，所述疫苗是通过以福尔马林、硫柳汞等灭活A.pg-A或A.pg-C的细胞而获得的。然而，此类灭活的疫苗引起的副作用已经成为了一个问题，因为已经有报道指出，当施用这种疫苗时，在接种的鸡中形成局部坏死斑(见例如，非专利文献5)。有鉴于此，为了尝试开发安全的疫苗，研究了通过遗传重组技术制备的包含保护性抗原的重组疫苗以抵抗感染。
例如，Tokunaga等人分离并鉴定了编码A.pg-A的外膜蛋白的基因(外膜蛋白基因)并且发现：通过在大肠杆菌中表达所述基因的一部分(HPG3.5kbp、HPG4.1kbp)而获得的肽可用作抵抗禽传染性鼻炎感染的保护性抗原。此外，使用所述DNA片段作为探针，他们获得了来自A.pg-C外膜蛋白基因并且比较了来自A.pg-A和A.pg-C的外膜蛋白基因的开放阅读框的核苷酸序列。结果，他们揭示：两个核苷酸序列在整体上具有大约80％的同源性；5′-末端的3.4kbp的区域(以下也称作″区域1″)和3′-末端的大约1.2kbp的区域(以下也称作″区域3″)具有极高的同源性；区域1与区域3之间的大约1.5kbp的区域(以下也称作″区域2″)具有低同源性(见专利文献1)。
Noro等人还报道：由Tokunaga等人发现的外膜蛋白是针对禽传染性鼻炎的重要的保护性抗原。Noro等人以4,801bp和5,157bp的DNA片段(其是来自A.pg-A的外膜蛋白基因的部分)编码的肽来免疫鸡，以显示所述肽可以诱导针对A.pg-A的HI抗体，并且可以具有疫苗效应(见例如，专利文献2)，另外还报道：由大约5.1kbp和5.5kbp的DNA片段(其是来自A.pg-C的外膜蛋白基因的部分)编码的肽具有类似的功能和效应(见例如，专利文献3)。
另一方面，Yamamoto等人使用由2,016bp的DNA片段(其包含来自A.pg-A的主要外膜蛋白基因)编码的多肽，以显示所述多肽的有用性(见例如，专利文献4)，但是他们报道的该DNA片段的3′末端的大约300bp的核苷酸序列与Tokunaga等人和Noro等人显示的那些具有极大的差异。
专利文献1：WO98/12331
专利文献2：日本专利No.4001117
专利文献3：JP 2008-156317
专利文献4：JP 2004-57078
非专利文献1：Am.J.Vet.Res.，23：85-95，1962
非专利文献2：Jpn.J.Vet.Sci.，40：645-652，1978
非专利文献3：m.J.Vet.Res.，41：757-760，1980
非专利文献4：Am.J.Vet.Res.，41：1901-1904，1980
非专利文献5：Avian Dis.，15：109-117，1971
发明内容
(本发明要解决的技术问题)
如上所述，已经揭示了来自A.pg-A和A.pg-C(禽传染性鼻炎的主要诱因剂)的外膜蛋白或其部分肽可用作抵抗禽传染性鼻炎的保护性抗原。因此，通过混合这些抵抗感染的保护性抗原，可以有效实现针对禽传染性鼻炎的免疫。然而，简单的混合方法需要单独生产两种感染性保护性抗原，因此是昂贵的。一般而言，与用于人类的疫苗不同，除非用于动物的疫苗质量高、价格低，否则畜牧业者是不会接受这样的疫苗的。因此，为了产生用于动物的疫苗，需要成本较低的生产方法。
(解决问题的方法)
本发明人经过进行了深入研究，以达到如上所述的目标，结果揭示出：由包含来自A.pg-A和A.pg-C的外膜蛋白基因的区域2(A.pg-A的3,639bp至5,162bp的核苷酸序列；A.pg-C的4,247bp至5,758bp的核苷酸序列：见图1和2)的大约1.6kbp的序列编码的肽片段(由A.pg-A的3,558bp至5,192bp的DNA序列和A.pg-C的4,166bp至5,788bp的DNA序列编码的肽；以下分别也称作″AΔ5-1″和″CΔ5-1″：见图1和2)可用作针对禽传染性鼻炎的保护性抗原。本发明人发现：通过将编码AΔ5-1的DNA片段与编码CΔ5-1的DNA片段连接在一起并表达得到的DNA片段而获得的融合肽(以下也称作″ACΔ5-1″)在融合后也保持各个抗原的免疫原性，并且该融合肽显示出等同于或高于各自单独表达AΔ5-1或CΔ5-1时针对禽传染性鼻炎的感染保护效应。此外，本发明人发现：当单独表达时，CΔ5-1作为可溶性级份被表达，而AΔ5-1作为不可溶级份被表达，形成包涵体，从而完成了本发明。
因此，本发明的目标是提供包含作为活性成分的融合肽的针对禽传染性鼻炎的疫苗及其制备方法，所述融合肽如下获得：将包含来自A.pg-A的外膜蛋白的特定区域的肽片段与包含来自A.pg-C的外膜蛋白的特定区域的肽片段彼此连接。
如本文所使用，由Tokunaga等人(专利文献1)分离并鉴定的来自A.pg-A和A.pg-C的外膜蛋白也联合起来被称作″HMTp210蛋白″，源自A.pg-A和A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段分别也被称作″肽A″和″肽C″。因此，本发明包括下列内容：
[1]制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括：构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成；培养所述宿主并从培养物中收集和纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤。
[2][1]的方法，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
[3][1]的方法，其中肽A具有选自SEQ ID NO：1、27、28、29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO：2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
[4][3]的方法，其中肽A包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；而肽C包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
[5][3]或[4]的方法，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
[6][1]-[5]任一项的方法，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1个肽A。
[7][1]-[6]任一项的方法，其中融合肽包含至少这样的结构：其中肽C与肽A的C末端连接。
[8][1]-[7]任一项的方法，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。
[9][3]的方法，其中融合肽具有选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66和67的氨基酸序列。
[10]包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述融合肽由源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成。
[11][10]的疫苗，其中当由宿主产生时，所述融合肽具有形成包涵体的性质。
[12][10]的疫苗，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
[13][10]的疫苗，其中肽A具有选自SEQ ID NO：1、27、28、29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO：2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
[14][13]的疫苗，其中肽A包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；而肽C包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
[15][13]或[14]的疫苗，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
[16][10]-[15]任一项的疫苗，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1个肽A。
[17][10]-[16]任一项的疫苗，其中融合肽包含至少这样的结构：其中肽C与肽A的C末端连接。
[18][10]-[17]任一项的疫苗，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。
[19][13]的疫苗，其中融合肽具有选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66和67的氨基酸序列。
[20]包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述的肽由包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列内，在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
[21][20]的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的肽。
[22]包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述的肽由包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列内，在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
[23][22]的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ ID NO：3或52所示的氨基酸序列组成的肽。
[24][21]或[23]的疫苗，其中所述的肽包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
发明效果
根据本发明提供了包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法，其中所述融合肽由彼此连接的源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段组成。本发明的禽传染性鼻炎疫苗可以同时提供用于预防由A.pg-A和A.pg-C引起的禽传染性鼻炎的免疫。
根据本发明的方法，可以使CΔ5-1(当单独表达时，其以可溶性级份表达)通过其与AΔ5-1的融合肽的表达而形成包涵体，从而以不可溶级份来表达。结果是：不仅使所述融合肽的纯化变得容易，而且降低了生产成本，因为能够以单次培养来制备针对A.pg-A和A.pg-C的感染保护性抗原。
附图说明
图1显示了AΔ5-1片段在A.pg-A的HMTp210基因(HMTp210A基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1(Tokunaga等)中公开的核苷酸编号。
图2显示了CΔ4c-1、CΔ5-1和CΔ6b-1b片段在A.pg-C的HMTp210基因(HMTp210C基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1(Tokunaga等)中公开的核苷酸编号。
图3是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在上清液和沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M：标记物、泳道1：AΔ5-1/CΔ4c-1(沉淀物级份)、泳道2：AΔ5-1/CΔ4c-1(上清液级份)、泳道3：ACΔ5-1(沉淀物级份)、泳道4：ACΔ5-1(上清液级份)、泳道5：AΔ5-1/CΔ6b-1b(沉淀物级份)、泳道6：AΔ5-1/CΔ6b-1b(上清液级份)。箭头显示了所表达的融合肽。
图4显示了AΔ5-1、AΔ5-2、AΔ5-3、AΔ5-4、AΔ9-2、AΔ9-3、AΔ9-4、CΔ6-2、CΔ6-3和CΔ6-4片段在A.pg-A的HMTp210基因(HMTp210A基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1(Tokunaga等)中公开的核苷酸编号。
图5显示了CΔ5-1、CΔ5-2、CΔ5-4、CΔ9-0、CΔ9-2、CΔ9-4、CΔ6-2和CΔ6-4片段在A.pg-C的HMTp210基因(HMTp210C基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1(Tokunaga等)中公开的核苷酸编号。
图6是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M：标志物、泳道1：ACΔ5-1(沉淀物级份)、泳道2：AΔ5-2/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道3：AΔ5-3/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道4：AΔ5-4/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道5：AΔ9-2/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道6：AΔ9-3/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道7：AΔ9-4/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道8：AΔ6-2/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道9：AΔ6-3/CΔ5-1(沉淀物级份)、泳道10：AΔ6-4/CΔ5-1(沉淀物级份)。箭头显示了所表达的融合肽。
图7是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M：标志物、泳道1：ACΔ5-1(沉淀物级份)、泳道2：AΔ5-1/CΔ5-2(沉淀物级份)、泳道3：AΔ5-1/CΔ5-4(沉淀物级份)、泳道4：AΔ5-1/CΔ9-0(沉淀物级份)、泳道5：AΔ5-1/CΔ9-2(沉淀物级份)、泳道6：AΔ5-1/CΔ9-4(沉淀物级份)、泳道7：AΔ5-1/CΔ6-2(沉淀物级份)、泳道8：AΔ5-1/CΔ6-4(沉淀物级份)。箭头显示了所表达的融合肽。
图8是照片，其显示了在离心生产肽C的大肠杆菌的细胞碎片之后，在上清液和沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M：标志物、泳道1：CΔ5-1-pQE(上清液级份)、泳道2：CΔ5-2-pQE(上清液级份)、泳道3：CΔ5-4-pQE(上清液级份)、泳道4：CΔ9-0-pQE(上清液级份)、泳道5：CΔ9-2-pQE(上清液级份)、泳道6：CΔ9-4-pQE(上清液级份)、泳道7：CΔ6-2-pQE(沉淀物级份)、泳道8：CΔ6-4-pQE(上清液级份)。箭头显示了所表达的融合肽。
具体实施方式
本发明的特征在于制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，包括下列步骤：制备形成包涵体的融合肽，所述融合肽由源自副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)(以下也称作″A.pg″)血清型A的HMTp210蛋白的肽A和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽C组成。更具体地，本发明的特征在于制备禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括：构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段组成；培养所述宿主、从培养物中收集并纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤，以及本发明的特征还在于包含所述融合肽作为活性成分的禽传染性鼻炎疫苗。
可以按照下文的描述获得由编码A.pg-A的HMTp210蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)的基因(以下也称作″HMTp210A基因″)和编码A.pg-C的HMTp210蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)的基因(以下也称作″HMTp210C基因″)的一部分组成的DNA片段。
存在数种A.pg-A和A.pg-C的分离的菌株，任意这些菌株可用于本发明，没有限制。目前已经分离了，例如，A.pg-A的221、O83和W菌株等，以及A.pg-C的53-47、Modesto和HK-1菌株等，其中注意到有一个或数个氨基酸的替换、删除或添加。对于本发明，可以使用任意这些菌株或突变体。
对于A.pg-A和A.pg-C的生长，可以使用适宜地含有下列物质的培养基：聚胨、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、谷氨酸钠、酵母提取物、氯化钠、鸡肉浸液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)、鸡血清等。本文中，为了以小规模/中等规模生长，使用补充了鸡血清的鸡肉汤，其在1,000mL培养基中含有5g聚胨S、1g酪蛋白氨基酸、5g氯化钠、5g L-谷氨酸钠、1g葡萄糖、10g酵母提取物、175mL鸡肉浸液、25mL鸡血清、0.025％β-NAD。培养条件通常可以设定为：37℃的温度，16-24小时，该条件可以根据使用目的、培养模式、接种的细菌的量、培养规模等适宜地变化。
可以通过离心(5,800g，20分钟)将培养物中的细胞收集于沉淀物级份中。可以根据Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual SecondEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，1989)，通过遗传重组技术，从提取自细胞的基因组DNA中制备HMTp210A基因和HMTp210C基因(在不单独指称两个基因的情况下，下文中也联合称作″HMTp210基因″)。也可以使用商售试剂盒。例如，为了提取染色体DNA，可以使用PureGene试剂盒(Gentra Systems)，SepaGene试剂盒(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)，ISOPLANT(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)等。
更具体地，可以使用PureGene试剂盒(Gentra Systems)等从通过离心收集的细胞中提取染色体DNA，可以根据Tokunaga等(专利文献1)制备细胞的基因组DNA文库。使用获得的DNA片段作为模板，可以使用Prime STARHS DNA Polymerase(TAKARA BIO Inc.)根据其中随附的说明书进行PCR以扩增想要的大小的DNA片段。可以基于如Tokunaga等(专利文献1)公开的源自A.pg-A和A.pg-C的HMTp210基因的核苷酸序列来设计用于PCR的引物。可以通过DNA合成服务承包商(例如Sigma Genosys Japan K.K.)容易地获得用于PCR的引物。在设计的时候，可以在上游引物的5’末端和下游引物的5’末端添加适当的限制性酶切位点的核苷酸序列。
可以通过使用DNA合酶将如上所述获得的编码HMTp210A基因的DNA片段和编码HMTp210C基因的DNA片段直接连接在一起或者使用限制性酶切割后将二者连接在一起来获得编码本发明的融合肽的DNA片段。任选地，可以在编码HMTp210A基因的DNA片段和编码HMTp210C基因的DNA片段之间添加编码由适当大小的氨基酸序列组成的接头的DNA片段。对于接头，优选可以使用具有很大的灵活性的氨基酸，例如，中性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸等。可以使用由单一种类的氨基酸或两种或更多种类的氨基酸组成的接头。接头的大小一般可以是5-20个氨基酸，优选是10-15个氨基酸的大小。
根据本发明，可以使用HMTp210A基因和HMTp210C基因的编码融合肽的DNA片段，所述融合肽可以保护免受A.pg-A和A.pg-C感染并形成包涵体。此类DNA片段包括，例如，编码外膜蛋白的区域2的肽的DNA片段，编码在其N-末端和/或C-末端添加了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段，编码在其N-末端或C-末端添加了氨基酸序列并且在其其余的N-末端或C-末端删除了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段，以及编码在其N-末端和/或C-末端删除了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段。所添加或删除的氨基酸序列可以是1-200个，优选30-150个氨基酸的长度。
优选的是这样的DNA片段，其编码源自具有选自SEQ ID NO：1、27、28、29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列的A.pg-A的HMTp210蛋白的肽和源自具有选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的A.pg-C的HMTp210蛋白的肽。也可以使用编码上述肽的突变体的DNA片段，其中删除、添加或替换了一个或数个氨基酸。如本文使用的“上述肽的突变体，其中删除、添加或替换了一个或数个氨基酸”是指上述肽的突变体，其中删除、添加或替换了1、2、3、4或5个氨基酸。可以通过在严格条件下与具有互补于编码上述肽的DNA片段的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段杂交来获得编码此类突变体肽的DNA片段，或者通过导入突变的方法例如定点诱变来获得。这些可以通过使用商售试剂盒来进行。
可以使用源自HMTp210A基因的DNA片段与源自HMTp210C基因的DNA片段的任意组合，只要得到的肽可以形成包涵体。例如，编码融合肽的DNA片段可以是：源自HMTp210A基因的DNA片段的下游与源自HMTp210C基因的DNA片段结合，反之亦可。编码融合肽的DNA片段也可以彼此串联组合。同样，两个或更多个源自HMTp210A基因的DNA片段可以彼此结合，在它们的下游可以再结合两个或更多个源自HMTp210C基因的DNA片段。编码融合肽的DNA可以由比例为1∶1至1∶3的源自HMTp210A基因的DNA片段和源自HMTp210C基因的DNA片段组成。优选地，所述比例是1∶1。可以在克隆进入pBluescript II SK+(Stratagne)或pCR2.1-TOPO(Invitrogen)之后，使用DNA测序仪(ABI Prism 377 AppliedBiosystems)测定所获得的DNA片段的核苷酸序列。
可以将由此获得的A.pg-A和A.pg-C的DNA片段或编码融合肽的DNA片段引入适当的表达载体中，然后可以将所述表达载体导入宿主中以表达每个DNA片段。对于异源蛋白或肽的表达，通常可以使用细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，其中可以使用任意宿主，只要可以产生包涵体。对于宿主细胞的转化，可以使用本领域已知的方法。例如，可以使用磷酸钙，DEAE右旋糖酐，使用脂质体的方法，例如脂质体转染，原生质体的聚乙二醇融合，电穿孔，热激等，根据所用的宿主细胞适当地选择。优选地，可以使用大肠杆菌，其允许大量地表达。
对于在大肠杆菌中的表达，已经开发了具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等的多种表达载体，并且是商业上可获得的，可以视情况使用。此类表达载体包括，例如，pET-11d(Merck)和pQE30(Quiagen)。取决于表达载体，可以选择合适的大肠杆菌例如BL21、HMS174、DH5α、HB101、JM109等作为宿主。可以使用商售的感受态细胞根据其中随附的说明书进行大肠杆菌的转化。因此，可以获得产生需要的多肽的重组大肠杆菌。对于用于培养基的大肠杆菌的培养基(例如LB、SOC、SOB等)，用于选择转化体的试剂(例如氨苄青霉素)和用于诱导表达的试剂(例如吲哚乙酸(IAA)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等)，可以使用商售的那些。培养基的pH可以在适合于大肠杆菌生长的范围内(pH 6至8)。
可以按照下文的描述进行表达需要的肽(目标物)的重组大肠杆菌的筛选。通过离心(9,100g，5分钟)收集在存在表达诱导剂(在本发明的表达系统中使用的是IPTG)的情况下培养和生长的细胞，将其悬浮于固定体积的蒸馏水或PBS中，通过超声或通过匀浆器例如弗氏细胞压碎器或MantonGolin破碎，并进行离心(例如17,800g，15分钟)以分离并回收沉淀物和上清液。可以向蒸馏水中适当地加入表面活性剂(例如Triton X-100)、螯合剂(例如EDTA)、溶菌酶等。可以将回收的固定量的上清液和沉淀物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以考马斯亮蓝染色后，可以通过分子大小和染色的图像来确认目标物的表达。为了确认(或检测)目标物，除了如上所述的基于分子大小的方法之外，还可以使用基于抗原-抗体反应的方法，例如ELISA、Western印迹、斑点印迹等。所有这些方法都普遍被用于检测大肠杆菌中表达的异源蛋白或多肽，可以视情况选择。因此，可以选择在沉淀物中回收的克隆，即，产生可能形成包涵体的融合肽的克隆。
可以按照如下的描述从产生融合肽的克隆中回收包涵体。首先，可以使用离心或适当大小的MF膜(Asahi Kasei Corporation)来收集细胞。可以通过合适的方式将收集的细胞破碎，从而将由融合肽组成的包涵体释放到细胞外。可以通过任意已知的方法进行细胞的破碎，包括，例如，以化学物质、表面活性剂、酶来溶解，或物理处理例如弗氏细胞压碎器或超声。通过组合这些方法中的数种，可以更有效地破碎细胞。
例如，在以去离子水稀释并浓缩通过MF膜收集的细胞以除掉残余的培养物成分和细胞代谢物之后，可以加入适当的缓冲液和溶菌酶，可以将得到的混合物静置于低温(4℃至15℃)过夜，从而溶解细胞的细胞膜。可以将经处理的细胞溶液以500-600kg/cm2的条件置于弗氏细胞压碎器(或MantonGolin)中以破碎细胞。缓冲液可以是任意种类的，只要其在7.5-9的pH范围(在该范围溶菌酶是有活性的)具有缓冲能力，例如Tris缓冲液。可以在缓冲液的通常使用浓度(10-50mM)使用缓冲液。可以在0.3-1.0g/L的浓度使用溶菌酶。例如，可以在加入20mM pH8.5的Tris缓冲液，可以加入溶菌酶(0.6g/L)，可以将混合物在4℃静置过夜以溶解细胞的细胞壁。以弗氏细胞压碎器破碎细胞之后，可以重复以缓冲液或去离子水和MF膜进行稀释和浓缩，以除掉大部分细胞成分。任选地，可以加入表面活性剂，例如Triton-X100。可以通过离心经浓缩的含有包涵体的溶液而以沉淀物的形式回收包涵体。
可以将回收的包涵体溶解于含有变性剂的溶液中。使用的变性剂包括脲、盐酸胍等，其中优选为脲。可以分别在4M-8M和2M-6M的浓度范围内使用此类脲和盐酸胍。对于本发明，优选使用8M的脲。为了溶解变性剂和还原剂，可以使用pH6-9、优选pH7-8的缓冲液。可以使用任何在上述pH范围具有缓冲能力的缓冲液，例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸缓冲液等。可以在40℃或更低的温度进行溶解。可以将溶解时间设定为在观察到包涵体的溶解时，通常是30分钟至1小时。
然后，可以通过将10-20倍体积的缓冲液加入到包涵体的溶液中或通过针对缓冲液透析该溶液来进行融合肽的重折叠，即正常空间结构的重构。对于重折叠，可以使用与用于溶解包涵体相同种类、温度和pH的缓冲液。可以在室温或更低的温度进行重折叠，并且静置1-7天，优选3-4天。
还可以视偶然需要使含有包涵体的溶液经历纯化程序。对于此类纯化程序，可以使用蛋白质化学领域中通常使用的方法的组合，例如，离心、盐析、超滤、等电聚焦、电泳、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水色谱、羟基磷灰石色谱等。可以使用用于蛋白质测定的试剂例如BCA ProteinAssay Reagent Kit(Pierce Biotechnology，Inc)，Protein Assay Kit(BIO-RAD，Inc)等来测定所获得的蛋白或多肽的量。
本发明的融合肽作为禽传染性鼻炎疫苗的有用性可以这样证明：以含有所述融合肽的溶液免疫鸡，并测定获自所述鸡的血清中的针对A.pg-A和A.pg-C的抗体效价；或者，以有毒力的细菌攻击所述经免疫的鸡并观察鸡的存活和临床症状，例如流鼻涕、面肿和溢泪。对于鸡的免疫，任选可以添加如通常的药物制剂中所使用的免疫增强剂(佐剂)。给药模式无特定限制，可以通过例如皮下、皮内、腹腔内或鼻内进行给药，通常是每2-4周给药1-3次。
为了制备作为疫苗的含有本发明的融合肽的药物制剂，可以通过膜过滤器无菌过滤含有所述融合肽的溶液，可以视偶然需要向过滤物中加入免疫增强剂(佐剂)，例如氢氧化铝、磷酸铝、矿物油或非矿物油；稳定剂，例如聚山梨酯80、氨基酸、以及糖，例如乳糖和蔗糖；以及防腐剂，例如福尔马林、硫柳汞、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、苄索氯铵和苯扎氯铵。同样，通过加入有效作为赋形剂的糖例如乳糖或蔗糖，可以配制冻干的制剂。因此，可以制备包含本发明的融合肽作为活性成分的疫苗。
所获得的疫苗可以单独用作禽传染性鼻炎疫苗或者可替代地，与选自针对其它病毒例如禽传染性支气管炎病毒、禽传染性粘液囊病病毒、禽脑脊髓炎病毒和排卵综合征病毒的疫苗；针对细菌例如鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)和鸡瘟沙门菌(Salmonellapollorum)的疫苗；和针对原生动物例如考氏住白细胞虫(Leucocytozooncauleryi)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenera)和巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)的疫苗中的至少一种疫苗组合用作混合疫苗。
通过以下实施例更具体地解释本发明，但是以下实施例不被解释为限制本发明。
实施例1：用于表达融合肽的质粒的构建
根据Tokunaga等(专利文献1)制备A.pg-A 221菌株和A.pg-C 53-47菌株的基因组DNA文库。简而言之，使用PureGene试剂盒(Gentra Systems)从通过离心(Tomy，RD-20PIV，4,400g，20分钟)收集的细胞中提取基因组DNA。使用所获得的DNA作为模板，使用Prime STAR HS DNA Polymerase(TAKARA BIO Inc.)进行PCR以扩增A.pg-A和A.pg-C的HMTp210蛋白基因的DNA片段。PCR条件如下：在98℃反应1分钟后，进行15个循环的“变性(98℃，10秒)、退火(55℃，15秒)和延伸反应(72℃，120秒)”，然后终止反应(72℃，7分钟)。
表1显示了扩增反应中使用的各个DNA片段和PCR引物的名称和序列编号。向5’-引物添加NcoI识别序列并且向3’-引物添加BamHI识别序列，以用于扩增A.pg-A的DNA片段；向5’-引物和3’-引物都添加BamHI识别序列，以用于扩增A.pg-C的DNA片段。图1和2显示了各个DNA片段的相对位置。在表中，DNA片段一栏内标明的SEQ ID NO号表示各个DNA片段编码的氨基酸序列。
表1
  DNA片段   5′-引物   3′-引物
  AΔ5-1(SEQ ID NO：1)   AΔ5-1-P5(SEQ ID NO：14)   AΔ5-1-P3(SEQ ID NO：15)
  CΔ4c-1(SEQ ID NO：2)   CΔ4c-1-P5(SEQ ID NO：16)   CΔ4-5-P3(SEQ ID NO：17)
  CΔ5-1(SEQ ID NO：3)   CΔ5-1-P5(SEQ ID NO：18)   CΔ4-5-P3(SEQ ID NO：17)
  CΔ6b-1b(SEQ ID NO：4)   CΔ6b-1b-P5(SEQ ID NO：19)   CΔ6b-1b-P3(SEQ ID NO：20)
按照下文描述制备表达质粒。首先，以NcoI和BamHI消化AΔ5-1，在通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-UpSystem(Promega)洗脱并回收DNA片段。将获得的片段连接于之前经过NcoI和BamHI消化的表达载体pET-11d(Merck)，得到的质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)。使用Wizard Plus SV Minipreps DNAPurification System(Promega)从该转化体提取表达质粒(pET-11d-AΔ5-1)。
接下来，以BamHI消化CΔ4c-1、CΔ5-1和CΔ6b-1b，在通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。将得到的片段正向连接于之前经过BamHI消化的pET-11d-AΔ5-1，得到的质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)以产生表达质粒pET-11d-AΔ5-1-CΔ4c-1、pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1和pET-11d-AΔ5-1-CΔ6b-1b。在构建的每个表达质粒中，CΔ4c-1、CΔ5-1和CΔ6b-1b被正向插入到紧邻AΔ5-1的下游，这产生了如表2所示的融合肽。
表2
  质粒   融合肽
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ4c-1   AΔ5-1/CΔ4c-1(SEQ ID NO：8)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1   ACΔ5-1(SEQ ID NO：9)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ6b-1b   AΔ5-1/CΔ6b-1b(SEQ ID NO：10)
实施例2：用于表达具有添加的接头的融合肽的质粒的构建
为了附加接头序列，按照实施例1的描述扩增A.pg的HMTp210蛋白基因的DNA片段。表3显示了用于扩增反应中的各个DNA片段和PCR引物的名称和SEQ ID NO号。5’引物中加入了XbaI识别序列，3′-引物中加入了BamHI识别序列。在表中，DNA片段一栏中标明的SEQ ID NO号表示各个DNA片段编码的氨基酸序列。
表3
Figure BPA00001425024600151
按照下文描述制备表达质粒，其中接头连接于紧邻AΔ5-1的下游。首先，以NcoI和BamHI消化实施例1中获得的AΔ5-1，在通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。接下来，使用DNA合成酶向所获得的片段的C-末端添加由编码10个甘氨酸残基的核苷酸序列组成的接头序列(Gly接头：SEQ IDNO：24)以产生DNA片段(AΔ5-1-L)。由于添加了接头序列，所以AΔ5-1的C-末端的Bam HI识别序列丧失，产生了替代其的XbaI识别序列。
接下来，以XbaI和BamHI消化CΔ4c-1、CΔ5-1和CΔ6b-1b，在通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-UpSystem(Promega)洗脱并回收DNA片段。将所获得的片段与AΔ5-1连接，然后以BamHI消化。通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。此外，将所获得的片段插入至之前经过NcoI和BamHI消化的表达载体pET-11d(Merck)。得到的表达质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)以产生表达质粒pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ4c-1、pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ5-1和pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ6b-1b。在构建的每个表达质粒中，将CΔ4c-1、CΔ5-1和CΔ6b-1b正向插入到紧邻接头序列的下游，从而经由源自接头序列的甘氨酸而产生融合肽，如表4所示。
表4
  质粒   融合肽
  pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ4c-1   AΔ5-1/L-CΔ4c-1(SEQ ID NO：11)
  pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ5-1   ACΔ5-1-L(SEQ ID NO：12)
  pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ6b-1b   AΔ5-1/L-CΔ6b-1b(SEQ ID NO：13)
实施例3：用于表达缩短的融合肽的质粒的构建(1)
按照实施例1的描述制备A.pg-A 221菌株的基因组DNA文库。进行PCR以扩增如表5所示的DNA片段。PCR条件如下：在98℃反应1分钟后，进行15个循环的“变性(98℃，10秒)，退火和延伸反应(70℃，120秒)”，然后终止反应(72℃，7分钟)。提取含有这些片段的表达质粒pET-11d-AΔ5-1、pET-11d-AΔ5-2、pET-11d-AΔ5-3、pET-11d-AΔ5-4、pET-11d-AΔ9-2、pET-11d-AΔ9-3、pET-11d-AΔ9-4、pET-11d-AΔ6-2、pET-11d-AΔ6-3和pET-11d-AΔ6-4。表5显示了用于扩增反应中的各个DNA片段和PCR引物的名称和SEQ ID NO号。5’引物中加入了NcoI识别序列，3′-引物中加入了BamHI识别序列。图4显示了各个DNA片段的相对位置。在表中，DNA片段一栏中标明的SEQ ID NO号表示各个DNA片段编码的氨基酸序列。
表5
  DNA片段   5′-引物   3′-引物
  AΔ5-1(SEQ ID NO：1)   AΔ5-1-P5(SEQ ID NO：14)   AΔ5-1-P3(SEQ ID NO：15)
  AΔ5-2(SEQ ID NO：27)   AΔ5-1-P5(SEQ ID NO：14)   AΔ2-P3(SEQ ID NO：38)
  AΔ5-3(SEQ ID NO：28)   AΔ5-1-P5(SEQ ID NO：14)   AΔ3-P3(SEQ ID NO：39)
  AΔ5-4(SEQ ID NO：29)   AΔ5-1-P5(SEQ ID NO：14)   AΔ4-P3(SEQ ID NO：40)
  AΔ9-2(SEQ ID NO：30)   AΔ9-P5(SEQ ID NO：36)   AΔ2-P3(SEQ ID NO：38)
  AΔ9-3(SEQ ID NO：31)   AΔ9-P5(SEQ ID NO：36)   AΔ3-P3(SEQ ID NO：39)
  AΔ9-4(SEQ ID NO：32)   AΔ9-P5(SEQ ID NO：36)   AΔ4-P3(SEQ ID NO：40)
  AΔ6-2(SEQ ID NO：33)   AΔ6-P5(SEQ ID NO：37)   AΔ2-P3(SEQ ID NO：38)
  AΔ6-3(SEQ ID NO：34)   AΔ6-P5(SEQ ID NO：37)   AΔ3-P3(SEQ ID NO：39)
  AΔ6-4(SEQ ID NO：35)   AΔ6-P5(SEQ ID NO：37)   AΔ4-P3(SEQ ID NO：40)
接下来，以BamHI消化实施例1中获得的CΔ5-1，通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。另外，将获得的片段正向连接于之前经过BamHI消化的pET-11d-AΔ5-1、pET-11d-AΔ5-2、pET-11d-AΔ5-3、pET-11d-AΔ5-4、pET-11d-AΔ9-2、pET-11d-AΔ9-3、pET-11d-AΔ9-4、pET-11d-AΔ6-2、pET-11d-AΔ6-3和pET-11d-AΔ6-4。得到的表达质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)以产生表达质粒pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1、pET-11d-AΔ5-2-CΔ5-1、pET-11d-AΔ5-3-CΔ5-1、pET-11d-AΔ5-4-CΔ5-1、pET-11d-AΔ9-2-CΔ5-1、pET-11d-AΔ9-3-CΔ5-1、pET-11d-AΔ9-4-CΔ5-1、pET-11d-AΔ6-2-CΔ5-1、pET-11d-AΔ6-3-CΔ5-1和pET-11d-AΔ6-4-CΔ5-1。在构建的每个表达质粒中，CΔ5-1正向插入至紧邻表达肽A的基因的下游，从而产生表6所示的融合肽。
表6
  质粒   融合肽
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1   ACΔ5-1(SEQ ID NO：9)
  pET-11d-AΔ5-2-CΔ5-1   AΔ5-2/CΔ5-1(SEQ ID NO：41)
  pET-11d-AΔ5-3-CΔ5-1   AΔ5-3/CΔ5-1(SEQ ID NO：42)
  pET-11d-AΔ5-4-CΔ5-1   AΔ5-4/CΔ5-1(SEQ ID NO：43)
  pET-11d-AΔ9-2-CΔ5-1   AΔ9-2/CΔ5-1(SEQ ID NO：44)
  pET-11d-AΔ9-3-CΔ5-1   AΔ9-3/CΔ5-1(SEQ ID NO：45)
  pET-11d-AΔ9-4-CΔ5-1   AΔ9-4/CΔ5-1(SEQ ID NO：46)
  pET-11d-AΔ6-2-CΔ5-1   AΔ6-2/CΔ5-1(SEQ ID NO：47)
  pET-11d-AΔ6-3-CΔ5-1   AΔ6-3/CΔ5-1(SEQ ID NO：48)
  pET-11d-AΔ6-4-CΔ5-1   AΔ6-4/CΔ5-1(SEQ ID NO：49)
实施例4：用于表达缩短的融合肽的质粒的构建(2)
按照实施例1的描述制备A.pg-C 53-47菌株的基因组DNA文库，以产生表7所示的DNA片段。PCR条件如实施例3中所描述。表7显示了扩增反应中使用的各个DNA片段和PCR引物的名称和SEQ ID NO号。5’引物和3’引物中都加入BamHI识别序列。图5显示了各个DNA片段的相对位置。在表中，DNA片段一栏中标明的SEQ ID NO号表示各个DNA片段编码的氨基酸序列。
表7
Figure BPA00001425024600171
接下来，如实施例1所描述，以BamHI消化CΔ5-1、CΔ5-2、CΔ5-4、CΔ9-0、CΔ9-2、CΔ9-4、CΔ6-2和CΔ6-4，通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。将获得的片段正向连接于之前经过BamHI消化的pET-11d-AΔ5-1，以产生表达质粒pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1、pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-2、pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-4、pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-0、pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-2、pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-4、pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-2和pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-4。在构建的每个表达质粒中，将CΔ5-1、CΔ5-2、CΔ5-4、CΔ9-0、CΔ9-2、CΔ9-4、CΔ6-2和CΔ6-4正向插入至紧邻AΔ5-1的下游，以产生表8所示的融合肽。
表8
  质粒   融合肽
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1   ACΔ5-1(SEQ ID NO：12)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-2   AΔ5-1/CΔ5-2(SEQ ID NO：61)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-4   AΔ5-1/CΔ5-4(SEQ ID NO：62)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-0   AΔ5-1/CΔ9-0(SEQ ID NO：63)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-2   AΔ5-1/CΔ9-2(SEQ ID NO：64)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-4   AΔ5-1/CΔ9-4(SEQ ID NO：65)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-2   AΔ5-1/CΔ6-2(SEQ ID NO：66)
  pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-4   AΔ5-1/CΔ6-4(SEQ ID NO：67)
实施例5：用于表达肽C的质粒的构建
按照实施例1的描述制备A.pg-C 53-47菌株的基因组DNA文库，以产生类似于表7所示的DNA片段。PCR条件如实施例3中所描述。扩增反应中使用的各个DNA片段和PCR引物的名称和SEQ ID NO号与表7中相同，只不过3’引物中的限制性酶识别序列从BamHI识别序列改变为HindIII识别序列，从而扩增的片段可以更有效地插入至表达载体pQE30(QIAGEN)。
接下来，以BamHI和HindIII消化CΔ5-1、CΔ5-2、CΔ5-4、CΔ9-0、CΔ9-2、CΔ9-4、CΔ6-2和CΔ6-4，通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用WizardSV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)洗脱并回收DNA片段。将获得的片段连接于之前经过BamHI和HindIII消化的表达载体pQE30。得到的表达质粒用于转化大肠杆菌JM109菌株(QIAGEN)，以产生表达CΔ5-1、CΔ5-2、CΔ5-4、CΔ9-0、CΔ9-2、CΔ9-4、CΔ6-2和CΔ6-4的质粒。从这些表达质粒获得的肽的氨基酸序列是表7中所示的各个DNA片段所编码的，在它们的N-末端添加了源自载体的组氨酸标签序列(MRGSHHHHHHGS)。
实施例6：融合肽的表达(1)
将具有实施例1和2中获得的各个表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)接种至1-5ml含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，并一边在30至37℃摇动，一边摇动培养直至培养液的OD600达到0.5。然后加入终浓度为1mM的IPTG，将培养物培养3个小时。离心(Tomy，MX-300，9,100g，5分钟)之后，弃上清，加入与最初的培养液等量的洗涤缓冲液(PBS)并使细胞悬浮至均一。使用手持超声仪(Tomy，UR-20P)，在冰冷的条件下对悬浮液进行超声处理，功率10，持续10秒；重复10次，并在17,800g离心15分钟。分离上清液并向沉淀物中加入与离心前的经超声的溶液的量等量的洗涤缓冲液，使沉淀物悬浮至均一。向分离的各上清液和沉淀物中加入等量的样品缓冲液(2x SDS)，在沸水中加热5分钟后，按照常规方式进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色。当在沉淀物悬浮液中观察到融合肽时，判定为所述融合肽形成包涵体。图3显示了各个表达模式。
当单独表达时，CΔ4c-1表达为可溶性级份，CΔ5-1表达的级份不是恒定的，而所有的融合肽都稳定表达为包涵体。就表达水平而言，AΔ5-1/CΔ4c-1有一些低，其余的两种融合肽ACΔ5-1和AΔ5-1/CΔ6b-1b具有良好表达，彼此几乎相等。添加了接头的融合肽显示出与未添加接头的融合肽相等的表达水平。
实施例7：融合肽的免疫原性(1)
为了确认融合肽的疫苗功效，使用同源强毒株进行了攻击测试。将实施例6中获得的ACΔ5-1和ACΔ5-1-L的沉淀物悬浮液中的包涵体溶解于8M的脲，使用透析膜将缓冲液替换为PBS(pH 7.4)。向8周龄的SPF鸡的腿中肌肉内施用一次疫苗以进行免疫，所述疫苗是这样制备的：在每剂0.5mL中，将ACΔ5-1以表9所示的抗原的量用油佐剂乳化。作为对照，设定了以含有灭活细胞的商售油佐剂的疫苗(OILVAX NB2AC，Juridical FoundationThe Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)给药的组和未给药的组。免疫后4周，鼻内施用0.2mL含有A.pg-A 221菌株(1.0x 1010CFU/mL)或A.pg-C 53-47菌株(3.0x 109CFU/mL)的溶液，持续1周观察流鼻涕、面肿和溢泪的临床症状。
结果如表9所示，施用了融合肽的鸡显示出针对A.pg-A 221菌株和A.pg-C 53-47菌株的攻击的极好的保护性功效，即使是在0.06μg/剂时，疫苗功效也比1/1,000量的商售油佐剂的疫苗要高。添加了接头的肽也显示出相同的保护性功效。因此，证明融合肽作为疫苗是有用的。
表9
Figure BPA00001425024600201
实施例8：融合肽对异源菌株的功效
为了确认融合肽对用于制备融合肽的A.pg-A 221菌株和A.pg-C 53-47菌株之外的其它菌株(异源菌株)的疫苗功效，如实施例7进行了攻击测试。重复实施例7的程序，只不过使用不同的抗原的量以进行免疫并使用不同的强毒株进行攻击，即A.pg-A 083菌株(1.0x 109CFU/mL)、A.pg-A W菌株(4.1x 109CFU/mL)和A.pg-C Modesto菌株(2.8x 109CFU/mL)。
结果显示于表10，施用了融合肽的鸡显示出针对来自所有菌株A.pg-A083、A.pg-A W和A.pg-C Modesto的攻击的极好的保护性功效。因此，证明融合肽作为疫苗对除了融合肽所衍生自的菌株以外的其它强毒株是有用的。
表10
分析了攻击测试中使用的各个菌株的区域2的核苷酸序列。结果为：对于A.pg-A，观察到083菌株与W菌株之间的完全的同一性以及221菌株与083菌株、221菌株与W菌株之间的1个核苷酸的突变(A/G：SEQ ID NO：25的1227位的谷氨酸被替换为甘氨酸)。对于A.pg-C，观察到：相对于53-47菌株，在Modesto菌株中观察到3个核苷酸AAG(SEQ ID NO：26的1144位谷氨酸)的删除。
实施例9：融合肽ACΔ5-1与各个肽的功效比较
为了比较融合肽ACΔ5-1与融合前的肽A或肽C的疫苗功效，进行了免疫测试。按照实施例7的描述制备疫苗。向4周龄的SPF鸡的腿中肌肉内施用一次疫苗以进行免疫，所述疫苗是这样制备的：在每剂0.5mL中，将ACΔ5-1、肽A或肽C以表11所示的抗原的量用油佐剂乳化。作为对照，设定了未给药的组。免疫后4周，按照Ushijima等人(日本专利申请No.2008-29589)的描述测定抗体效价。特别地，通过ELISA进行抗体测定。
以50mM碳酸氢盐缓冲液将A.pg-A和A.pg-C的区域2内的不同肽稀释至1μg/mL，将每种50μL溶液加入至96孔板中以固定。在4℃过夜吸附之后，除掉溶液，以300μL PBS-T(8.1mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、0.1％Tween 20)洗涤平板，加入300μL补充了5％脱脂乳的PBS-T以进行封闭。除掉封闭溶液。以补充了10％脱脂乳的PBS-T将血清稀释100倍，加入每种50μL溶液，在室温反应1小时。除掉反应溶液之后，以PBS-T洗涤平板3次。以补充了5％脱脂乳的PBS-T将抗-鸡IgG-HRP-标记的抗体稀释20,000倍，向每个孔中加入每种50μL溶液，在室温在黑暗中反应30分钟。除掉反应溶液后，以PBS-T洗涤平板3次。每个加入100μL底物溶液(TMB+底物-色原：DAKO)，在室温反应15分钟。每个加入100μL 3M硫酸以停止反应。以96孔板读数器(MolecularDevices Japan)测定450nm的波长处的吸光率。
结果显示于表11：以融合肽ACΔ5-1免疫的鸡在0.6μg/剂时显示出高抗体效价，并且阳性转化率对于A.pg-A和A.pg-C均为100％。0.06μg/剂的融合肽时，对于A.pg-A和A.pg-C分别观察到了80％和40％的阳性转化率。然而，在0.03μg/剂的肽A或肽C时，对于A.pg-A和A.pg-C，阳性转化率分别是60％和0％。因此证明：融合肽ACΔ5-1的功效高于融合前的肽A或肽C。
表11
Figure BPA00001425024600221
实施例10：融合肽的表达(2)
将具有实施例3和4中获得的各个表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Merck)按照实施例6的描述进行表达并测定表达水平。图6和7显示了各个表达模式。当单独表达时，肽A、AΔ5-4、AΔ9-2、AΔ9-4、AΔ6-2和AΔ6-4以可溶性级份表达，但是，当与CΔ5-1融合后，得到的融合肽稳定地形成包涵体，AΔ6-4除外。AΔ6-4/CΔ5-1，虽然主要形成包涵体，但是有些时候可以以可溶性级份表达，因此其表达是不稳定的。所有的融合肽都具有相同和极好的表达水平。另一方面，当单独表达时，肽C以可溶性级份表达，CΔ6-2除外，但是，与AΔ5-1融合后，得到的融合肽稳定地形成包涵体。所有的融合肽都具有相同和极好的表达水平。
实施例11：融合肽的免疫原性(2)
为了确认实施例10中获得的融合肽的疫苗功效，按照实施例7的描述使用同源强毒株(A.pg-A 221菌株)进行了攻击测试。重复实施例7的程序，只不过使用不同的抗原的量以进行免疫和不同数目的强毒株的细胞进行攻击，即A.pg-A 221菌株、1.2x 109CFU/mL。结果显示于表12：以各个融合肽免疫的鸡显示出针对来自A.pg-A 221菌株的攻击的极好的保护性效应，其中确认：AΔ6-4/CΔ5-1为80％的保护，较长的融合肽为100％的保护。
表12
  疫苗   抗原的量   保护率
  ACΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ5-2/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ5-3/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ5-4/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ9-2/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ9-3/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ9-4/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ6-2/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ6-3/CΔ5-1   6μg/剂   100％
  AΔ6-4/CΔ5-1   6μg/剂   80％
  未经免疫的对照   -   0％
实施例12：肽C的表达
将实施例5中获得的具有各个表达质粒的大肠杆菌JM109(QIAGEN)按照实施例6中的描述进行表达并通过SDS-PAGE测定各自的细胞的表达水平(图8)。由此获得的肽被命名为CΔ5-1-pQE、CΔ5-2-pQE、CΔ5-4-pQE、CΔ9-0-pQE、CΔ9-2-pQE、CΔ9-4-pQE、CΔ6-2-pQ和CΔ6-4-pQE。除了CΔ6-2-pQE之外，所有的肽都以极好的表达水平以可溶性级份表达。
实施例13：肽C的保护性效应的确认
为了确认实施例12中获得的肽C的疫苗效应，按照实施例7的描述进行了攻击测试。向4周龄的SPF鸡的腿中肌肉内施用一次疫苗以进行免疫，所述疫苗是这样制备的：将肽C以表13所示的抗原的量用油佐剂乳化。免疫后4周，鼻内施用0.2mL包含A.pg-C 53-47菌株(5.2x 109CFU/mL)的溶液，并持续观察一周流鼻涕、面肿和溢泪的临床症状。
结果显示于表13：施用了3μg/剂的CΔ5-1-pQE和CΔ9-0-pQE的鸡显示出极好的保护性效应。对于最短的CΔ6-4-pQE，观察到60％的保护性效应。从这些结果预期：对于针对A.pg-C的保护性效应，相对于A.pg-A非同源的区域(区域2)的C末端的序列具有重要意义，并且证明：如果肽至少包括CΔ6-4的区域，则显示出相对高的保护性效应。此外，如实施例9所示，预期相对于单独表达，以融合物表达可以提高免疫原性。
表13
  疫苗   抗原的量   保护率
  CΔ5-1-pQE   3μg/剂   100％
  CΔ9-0-pQE   3μg/剂   100％
  CΔ9-2-pQE   3μg/剂   60％
  CΔ6-4-pQE   3μg/剂   60％
  未经免疫的对照   -   0％
工业实用性
通过使用本发明，可以提供由血清型A和C的副鸡禽杆菌引起的禽传染性鼻炎的疫苗。
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Claims (24)

1.制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括：构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成；培养所述宿主并从培养物中收集和纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤。
2.权利要求1的方法，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
3.权利要求1的方法，其中肽A具有选自SEQ ID NO：1、27、28、29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO：2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
4.权利要求3的方法，其中肽A包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；而肽C包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
5.权利要求3或4的方法，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1个肽A。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中融合肽包含至少这样的结构：其中肽C与肽A的C末端连接。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。
9.权利要求3的方法，其中融合肽具有选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66和67的氨基酸序列。
10.包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述融合肽由源自A.pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成。
11.权利要求10的疫苗，其中当由宿主产生时，所述融合肽具有形成包涵体的性质。
12.权利要求10的疫苗，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
13.权利要求10的疫苗，其中肽A具有选自SEQ ID NO：1、27、28、29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO：2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
14.权利要求13的疫苗，其中肽A包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；而肽C包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
15.权利要求13或14的疫苗，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
16.权利要求10-15任一项的疫苗，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1个肽A。
17.权利要求10-16任一项的疫苗，其中融合肽包含至少这样的结构：其中肽C与肽A的C末端连接。
18.权利要求10-17任一项的疫苗，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。
19.权利要求13的疫苗，其中融合肽具有选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66和67的氨基酸序列。
20.包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述肽由包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列内，在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
21.权利要求20的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列组成的肽。
22.包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述肽由包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列内，在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
23.权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ IDNO：3或52所示的氨基酸序列组成的肽。
24.权利要求21或23的疫苗，其中所述肽包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
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