PT2255826E

PT2255826E - Composições de vacina de neisseria compreendendo uma combinação de antigénios

Info

Publication number: PT2255826E
Application number: PT101778900T
Authority: PT
Inventors: Biemans Ralph; Goraj Carine; Poolman Jan; Denoel Philippe; Feron Christiane; Weynants Vincent; Jacques Berthet Francois-Xavier
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2016-06-08
Also published as: CA2493124A1; EP2258385A2; EP2258384A2; EP1961427A3; US20160082097A1; EP1961427A2; EP1524993A2; EP2258384A3; KR20120036996A; TW200408406A; JP2012107036A; IL166433A; WO2004014417A3; MXPA05000842A; WO2004015099A2; EP2255826A2; CN1674933B; DK1524993T3; JP5414651B2; DE20321889U1

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES DE VACINA DE NEISSERIA COMPREENDENDO UMA COMBINAÇÃO DE ANTIGÉNIOS"

Campo Técnico A presente invenção refere-se ao campo das composições e vacinas imunogénicas de Neisseria, sua preparação e à utilização destas composições em medicina. Mais particularmente, refere-se a composições de vacina compreendendo uma combinação de antigénios que possuem qualidades que permitem às vacinas da invenção estimular uma surpreendente boa resposta imunitária como medido num ensaio de proteção ou num ensaio bactericida em soro.

Antecedentes

As estirpes de bactérias Neisseria são os agentes causais para várias patologias humanas, contra as quais existe uma necessidade de se desenvolverem vacinas eficazes. Em particular Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis causam patologias que podem ser tratadas por vacinação.

Neisseria gonorrhoeae é o agente etiológico de gonorreia, uma das doenças sexualmente transmitidas, mais frequentemente reportadas no mundo com uma incidência anual estimada de 62 milhões de casos (Gerbase et ai., 1998 Lancet 351; (Supl. 3) 2-4). As manifestações clínicas da gonorreia incluem inflamação das membranas mucosas do trato urogenital, infeções da garganta ou reto e olho neonatal. As infeções gonocócicas ascendentes em mulheres podem levar à infertilidade, gravidez ectópica, doença inflamatória pélvica crónica e formação de abcesso do tubo ovárico. Septicemia, artrite, endocardite e meningite, estão associadas com gonorreia complicada. 0 elevado número de estirpes gonocócicas com resistência a antibióticos contribui para morbidez aumentada e complicações associadas com gonorreia. Uma alternativa atrativa ao tratamento de gonorreia com antibióticos seria a sua prevenção utilizando a vacinação. Não existe atualmente vacina para infeções de N. gonorrhoeae.

Neisseria meningitidis é um importante patogénio, particularmente em crianças e jovens adultos. Septicemia e meningite são as formas mais ameaçadoras à vida da doença invasiva meningocócica (IMD). Esta doença tornou-se um problema de saúde em todo o mundo devido à sua elevada morbidez e mortalidade.

Treze serogrupos de N. meningitidis foram identificados com base nas diferenças antigénicas nos polissacáridos capsulares, sendo os mais comuns os A, B e C que são responsáveis por 90% de doença em todo o mundo. O serogrupo B é a causa mais comum de doença meningocócica na Europa, EUA e vários países na América Latina.

As vacinas com base no polissacárido capsular de serogrupos A, C, W e Y, foram desenvolvidas e foram apresentadas para controlar surtos de doença meningocócica (Peltola et ai., 1985

Pediatrics 76; 91-96). Contudo, o serogrupo Β é fracamente imunogénico e induz apenas uma resposta de anticorpo transiente de um isotipo predominantemente IgM (Ala Aldeen D e Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157) . Não existe, deste modo, uma vacina amplamente eficaz atualmente disponível contra o serogrupo B de meningococos que é responsável pela maior parte da doença na maioria dos países temperados. Isto é particularmente problemático uma vez que a incidência da doença do serotipo B está a aumentar na Europa, Austrália e América, principalmente em crianças com menos de 5. 0 desenvolvimento de uma vacina contra o serogrupo B de meningococos apresenta particulares dificuldades, uma vez que a cápsula de polissacáridos é fracamente imunogénica graças à sua semelhança imunológica com a molécula de adesão de células neurais humanas. As estratégias para a produção de vacina concentraram-se, deste modo, nas estruturas expostas à superfície da membrana meningocócica externa mas foram dificultadas pela variação marcada nestes antigénios entre as estirpes.

Outros desenvolvimentos levaram à introdução de vacinas preparadas a partir de vesículas de membrana externa que irão conter várias proteínas que constituem o conteúdo normal da membrana bacteriana. Um destes é a vacina cubana VA-MENGOC-BC® contra N. meningitidis dos serogrupos B e C (Rodriguez et ai., 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440) . Esta vacina foi concebida para combater um surto da doença meningocócica invasiva em Cuba, o qual não foi eliminado por um programa de vacinação utilizando uma vacina de polissacárido capsular AC. Os serogrupos prevalecentes foram o B e o C e a vacina VA-MENGOC-BC® foi bem-sucedida no controlo do surto com uma eficiência estimada da vacina de 83% contra as estirpes de serogrupo B de N. meningitidis (Sierra et ai., 1990 Em Neisseria,

Walter Gruyter, Berlim, m. Atchman et al., (eds) p. 129-134, Sierra et al. , 1991, NIPH Ann 14; 195-210) . Esta vacina foi eficaz contra um surto específico, no entanto, a resposta imunitária estimulada não protege contra outras estirpes de N. meningitidis.

Os estudos subsequentes eficazes conduzidos na América Latina durante epidemias causadas por estirpes meningocócicas do serogrupo B homólogo e heterólogo apresentaram alguma eficácia em crianças mais velhas e adultos mas a sua eficácia foi significativamente inferior em crianças mais novas que estão em grande risco de infeção (Milagres et al., 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424) . É questionável o quão eficaz esta vacina seria em países com doença endémica multiestirpes, tal como o RU. Os estudos de imunogenicidade contra estirpes heterólogas demonstraram apenas uma atividade bactericida limitada de reação cruzada em soro, especialmente em crianças (Tappero et al. , 1999, JAMA 281; 1520-1527) .

Uma segunda vacina de vesícula de membrana externa foi desenvolvida na Noruega utilizando um isolado de serotipo B típico dos prevalentes na Escandinávia (Fredriksen et al., 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Esta vacina foi testada em ensaios clínicos e verificou-se uma eficácia protetora após 29 meses de 57% (Bjune et al., 1991, Lancet, 338; 1093-1096).

No entanto, a utilização de vesículas de membrana externa em vacinas é associada com alguns problemas. Por exemplo, o OMV contém lipopolissacáridos tóxicos e estes podem conter antigénios imunodominantes que são específicos para a estirpe ou são expressos de modo variável. Vários processos foram descritos que podem ser utilizados para ultrapassar alguns dos problemas da preparação de vacinas de vesículas de membrana externa. 0 documento W001/09350 descreve os processos que abordam estes problemas, por exemplo, por redução da toxicidade e modificação dos antigénios presentes nas vesículas de membrana externa. 0 documento WOOl/52885 descreve a possibilidade de combinar vesículas de membrana externa com outros antigénios e uma lista de mais 2000 proteínas potenciais de Neisseria é incluída a partir da qual é especulado que podem ser desenvolvidas vacinas com eficácia contra uma vasta gama de serotipos. O documento WOOO/71725 divulga composições compreendendo uma primeira molécula biológica de uma bactéria Neisseria e uma segunda molécula biológica de uma bactéria Neisseria, e inclui mais de 35 milhões de diferentes pares de sequências.

Existem diversos problemas com as vacinas anti-meningocócicas atualmente disponíveis. As vacinas de membrana externa à base de proteína tendem a ser específicas e eficazes contra apenas algumas estirpes. As vacinas polissacarídicas são também subótimas, uma vez que estas tendem a estimular respostas imunitárias pobres e curtas, particularmente contra o serogrupo B (Lepow et ai., 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96).

As infeções por Neisseria representam um considerável problema de cuidados de saúde para o qual não existem vacinas disponíveis no caso de N. gonorrhoeae ou estão disponíveis vacinas com limitações da sua eficácia e capacidade de proteção contra estirpes heterólogas no caso de N. meningitidis. Existe claramente uma necessidade de desenvolvimento de vacinas superiores contra infeções por Neisseria que melhorarão a eficácia das vacinas atualmente disponíveis e permitem a proteção contra uma vasta gama de estirpes.

Descrição das Figuras

Figura 1. - Deteção de TbpA e Hsf em OMV preparadas a partir de uma estirpe recombinante de N. meningitidis regulada positivamente para a expressão de tbpA e hsf. Separação de preparações de OMV (10 mg) por análise de SDS-PAGE (géis de gradiente 4-20%) corados com azul brilhante de Coomassie.

Figura 2. - Deteção de domínio de passagem de Hsf recombinante produzida em E. coli, 10 pg de proteína de passagem de Hsf purificada (Pista 2 & 3) foram separados por SDS-PAGE num gel a 12% em comparação com um marcador de peso molecular (Pista 1) .

Figura 3. - Análise de pureza do Hap de passagem como detetado por (A) coloração de Coomassie, (B) coloração por prata, (C) transferência de Western com anti-His5 e (D) anti-E. coli. 10 mg de antigénios purificados foram separados por SDS-PAGE num gel de gradiente de acrilamida a 4-20%.

Figura 4. - Regiões de semelhança de sequências partilhadas pelas proteínas FrpA e FrpC isoladas a partir de N. meningitidis estirpe FAM20. (A) Organização do domínio das proteínas FrpA e FrpC de N. meningitidis estirpe FAM20 RTX. (B) Produtos de amplificação FrpA/C obtidos a partir de N. meningitidis estirpe H44/76.

Figura 5. - Expressão do antigénio Frp23 recombinante (região conservada FrpA/C com 23 repetições) em E. coli. Análise SDS-PAGE de extratos de células totais de E. coli BL21DE3 não induzidas (NI) e induzidas (I) transformadas com vetores de controlo (pET24d) ou construções recombinantes (Frp3, Frpl3 e

Frp23 respetivamente). Os géis foram corados com azul de Coomassie (A) ou transferidos para nitrocelulose e imunodetetados com soro de murganho anti-His6.

Figura 6. - Sequência de ADN preferida do fragmento de FHAB2 22/32 expressa em E. coli.

Figura 7. - Purificação de FHAB 2/32 recombinante a partir de extratos de E. coli B121DE3 induzidas. (A) Passos principais no processo de purificação. (B) Análise de SDS-PAGE das frações de proteina amostradas em diferentes passos do processo de purificação.

Figura 8. - Atividades de bloqueio de adesão de anti-soros dirigidos contra os antigénios de N. meningitidis FHAB2/32, Hap, domínio de passagem de Hap, Hsf e domínio de passagem de Hsf.

Figura 9. - Um gel corado com Coomassie apresentando os níveis de expressão de Hsf, TbpA e NspA nas preparações de vesícula de membrana externa derivadas de diferentes estirpes de N. meningitidis. Pista 1 - marcadores de peso molecular; pista 2 - vesículas de membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76, em que polissacáridos capsulares foram regulados negativamente; pista 3 - vesículas de membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76, em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente; pista 4 - vesículas de membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e o NspA foi regulado positivamente; pista 5 - vesículas de membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76, em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e Hsf foi regulado positivamente; pista 6 - vesículas de membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA foi regulado positivamente; pista 7 - vesículas de membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA e Hsf foram regulados positivamente; pista 8 - vesículas de membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA e NspA foram regulados positivamente.

Descrição detalhada A presente invenção divulga combinações particulares de antigénios de Neisseria, os quais, quando combinados, levam a uma surpreendente melhoria da eficácia da vacina contra infeção por Neisseria. Deste modo, a invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo GNA1870, NadA e Lipo28, em que os referidos antigénios, quando presentes numa vesícula de membrana externa, foram regulados positivamente na vesícula de membrana externa, com a condição de que a composição imunogénica não seja uma das seguintes composições divulgadas no documento WO 2004/032958: uma mistura de (1) uma proteína "NadA"; (2) uma proteína "741"; (3) uma proteína "936"; (4) uma proteína "953"; e (5) uma proteína "287"; uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio; uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio, em combinação com OMV preparadas a partir da estirpe H44/76; ou uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio, em combinação com OMV preparadas a partir da estirpe 394/98 .

As infeções por Neisseria progridem ao longo de vários estádios. Por exemplo, o ciclo de vida do meningococos envolve colonização nasofaríngica, ligação às mucosas, cruzamento da corrente sanguínea, multiplicação no sangue, indução do choque tóxico, cruzamento da barreira hemato-encefálica e multiplicação no fluido cerebrospinal e/ou nas meninges. Diferentes moléculas na superfície da bactéria estarão envolvidas em diferentes passos do ciclo de infeção. Direcionando a resposta imunitária contra uma quantidade eficaz de uma combinação particular de antigénios, envolvidos em diferentes processos de infeção por Neisseria, pode ser conseguida uma vacina de Neisseria com uma eficácia surpreendentemente elevada.

Em particular, combinações de determinados antigénios de diferentes classes, alguns das quais estão envolvidos em adesão a células hospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos na aquisição de ferro, alguns dos quais são autotransportadores e alguns dos quais são toxinas, podem estimular uma resposta imunitária que protege contra múltiplos estádios de infeção. Estas combinações de antigénios podem levar, surpreendentemente, a uma melhorada eficácia de vacina (de um modo preferido, sinergicamente melhorada) contra infeção por Neisseria, em que mais do que uma função da bactéria é direcionada pela resposta imunitária, de um modo ótimo. A eficácia de vacinas pode ser avaliada através de uma variedade de ensaios. Os ensaios de proteção em modelos animais são bem conhecidos na técnica. Além disso, o ensaio bactericida de soro (SBA) é, normalmente, o marcador imunológico mais consensual para estimar a eficácia de uma vacina meningocócica (Perkins et al., J Infect Dis. 1998, 177:683-691).

Algumas combinações de antigénios (por exemplo, combinações de determinadas proteínas de autotransporte e determinadas proteínas de aquisição de ferro) podem levar a uma proteção melhorada em ensaios em modelo animal e/ou títulos de SBA sinergicamente elevados. Sem desejar estar ligado à teoria, esta combinação sinérgica de antigénios é possível através de várias características da resposta imunitária à combinação de antigénios. Os próprios antigénios são normalmente expostos na superfície das células de Neisseria e tendem a ser conservados mas também não tendem a estar presentes em quantidade suficiente à superfície da célula para que uma resposta bactericida ótima ocorra utilizando anticorpos estimulados contra o antigénio isolado. A combinação dos antigénios da invenção pode resultar numa formulação que estimula uma combinação vantajosa de anticorpos bactericidas que interage com as células de Neisseria para lá de um limiar crítico. Neste nível crítico, anticorpos suficientes de qualidade suficiente ligam-se à superfície da bactéria para permitir a morte eficiente pelo complemento, e são observados efeitos bactericidas muito elevados, como uma consequência.

Como um ensaio bactericida em soro (SBA) reflete de forma próxima a eficácia dos candidatos a vacinas, a obtenção de bons títulos em SBA através de uma combinação de antigénios é uma boa indicação da eficácia protetora de uma vacina contendo essa combinação de antigénios. A invenção refere-se à utilização de uma combinação de dois antigénios isolados ou enriquecidos numa mistura com outros antigénios. Quando combinados, esta combinação dos antigénios interage vantajosamente e, de um modo preferido, estimula sinergicamente uma resposta imunitária que é superior em termos de atividade bactericida (por exemplo, como medido pelo ensaio bactericida em soro ou SBA) e, de um modo preferido, mais elevada do que a resposta aditiva estimulada pelos antigénios individualmente, de um modo mais preferido, por um fator de, pelo menos, 1,2, 1,5, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, de um modo muito preferido, por um fator de, pelo menos, dez.

Uma vantagem adicional da invenção, é que a combinação dos antigénios da invenção de diferentes famílias de proteínas numa composição imunogénica pode permitir a proteção contra uma vasta gama de estirpes. São aqui divulgadas composições imunogénicas compreendendo uma pluralidade (duas ou mais) de proteínas selecionadas de, pelo menos, duas diferentes categorias de proteína, possuindo diferentes funções em Neisseria. Exemplos destas categorias de proteínas são adesinas, proteínas de autotransporte, toxinas, proteínas integrais da membrana externa e proteínas de aquisição de Fe. As combinações de vacina da invenção, mostram uma melhoria surpreendente na eficácia da vacina contra estirpes homólogas de Neisseria (estirpes a partir das quais os antigénios são derivados) e, de um modo preferido também contra as estirpes heterólogas de Neisseria.

Os antigénios da presente invenção são todos isolados, o que significa que estes são modificados pela mão do homem. De um modo preferido, estes são purificados em algum grau, de um modo muito preferido, a mais de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99% puros (antes combinação com os outros componentes das composições imunogénicas da invenção).

Quando uma proteina é aqui especificamente mencionada, é, de um modo preferido, uma referência a uma proteina nativa, de comprimento total e às suas variantes naturais (i. e., a uma proteina nativa obtenível a partir de uma Neisseria, de um modo preferido, estirpe meningocócica) mas pode também incluir seus fragmentos antigénicos (particularmente no contexto de vacinas de subunidade). Estes são fragmentos (especificamente aqui descritos com frequência) contendo ou compreendendo, pelo menos, 10 aminoácidos, de um modo preferido, 20 aminoácidos, de um modo mais preferido, 30 aminoácidos, de um modo mais preferido, 40 aminoácidos ou de um modo ainda mais preferido, 50 aminoácidos, tomados de forma contígua a partir da sequência de aminoácidos da proteína. Adicionalmente, fragmentos antigénicos denotam fragmentos que são imunologicamente reativos com anticorpos produzidos contra as proteínas de comprimento total de Neisseria ou com anticorpos produzidos por infeção de um mamífero hospedeiro com Neisseria. Os fragmentos antigénicos também incluem fragmentos que, quando administrados numa dose eficaz, estimulam uma resposta imunitária protetora contra infeção por Neisseria, de um modo mais preferido, é protetora contra infeção contra N. meningitidis e/ou N. gonorrhoeae, de um modo ainda mais preferido, é protetora contra infeção por N. meningitidis serogrupo B.

Também incluídas na invenção estão proteínas de fusão recombinantes de proteínas de Neisseria da invenção ou seus fragmentos. Estes podem combinar diferentes proteínas de Neisseria ou seus fragmentos no mesmo polipéptido.

Alternativamente, a invenção também inclui a fusão de proteínas individuais de proteínas de Neisseria ou seus fragmentos, como uma proteína de fusão com sequências heterólogas, tais como um fornecedor de epitopos de células T ou marcadores de purificação, por exemplo: β-galactosidase, glutationa-S-transferase, proteínas verdes fluorescentes (GFP) , marcadores de epitopo, tais como FLAG, marcador myc, poli-histidina ou proteínas da superfície virai, tais como hemaglutinina do vírus influenza, toxoide do tétano, toxoide de difteria, CRM197.

Antigénios da invenção

As referências NMB referem-se a números de referência para sequências que podem ser encontradas em www.neisseria.org. 1. Adesinas

As adesinas incluem FhaB (documento WO98/02547, NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445; NMB 1994), Hsf também conhecida como NhhA (NMB 0992) (documento W099/31132), Hap (NMB 1985) (documento W099/55873), NspA (documento W096/29412), MafA (NMB 0652) e MafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20; 914-921 (2002)), Omp26 (NMB 0181), NMB 0315, NMB 0995, NMB 1119 e PilC (Mol. Microbiol. 1997, 23; 879-892). Estas são proteínas que estão envolvidas na ligação de Neisseria à superfície de células hospedeiras. Hsf é um exemplo de uma adesina, assim como o de uma proteína de autotransporte. As composições imunogénicas aqui divulgadas podem, deste modo, incluir combinações de Hsf e outras proteínas de autotransporte, em que Hsf contribui para a sua capacidade como uma adesina. Estas adesinas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras adesinas de Neisseria. 2. Proteínas de autotransporte

As proteínas de autotransporte são tipicamente constituídas por uma sequência sinal, um domínio de passagem e um domínio de ancoragem para ligação à membrana externa. Exemplos de proteínas de autotransporte incluem Hsf (documento W099/31132) (NMB 0992), HMW, Hia (van Ulsen et al. , Immunol. Med. Microbial. 2001 32; 53-64), Hap (NMB 1985) (documento W099/55873; van Ulsen et al. , Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64), UspA, UspA2, NadA (NMB 1994) (Comanducci et al. , J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454), AspA (Infection and Immunity 2002, 70(8); 4447-4461; NMB 1029), proteína tipo Aida-1, SSh-2 e Tsh. NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445) é outro exemplo de uma proteína de autotransporte, sendo ainda uma adesina. As composições imunogénicas aqui divulgadas podem, deste modo, incluir combinações de NadA e adesinas, em que NadA contribui na sua capacidade como uma proteína de autotransporte. Estas proteínas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras proteínas de autotransporte de Neisseria. 3. Proteínas de aquisição de ferro

As proteínas de aquisição de ferro incluem TbpA (NMB 0461) (documento WO92/03467, US5912336, WO93/06861 e EP586266), TbpB (NMB 0460) (documento WO93/06861 e EP586266), LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32:1117), LbpB (NMB 1541) (documento WO/99/09176), HpuA (U73112.2) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749), HpuB (NC_0 03116.1) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749), P2086 (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), Lipo28, também conhecido como GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), HmbR, HemH, Bcp (NMB 0750), proteína ABC transportador-permease de Ferro (III) (Tettelin et al.r Science 287; 1809-1815 2000),

Ferro (III) ABC transportador - periplásmico (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000), recetor dependente de TonB (NMB 0964 e NMB 0293) (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000) e proteína relacionada com a proteína de ligação a transferrina (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000). Estas proteínas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras proteínas de aquisição de ferro de Neisseria. 4. Toxinas

As toxinas incluem NM-ADPRT (NMB 1343) (13th International

Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al., p 135), VapD (NMB 1753), lipopolissacárido (LPS; também denominado lipooligossacárido ou LOS) imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. FrpA e FrpC contém uma região que é conservada entre estas duas proteínas e um fragmento preferido das proteínas seria um polipéptido contendo este fragmento conservado, de um modo preferido, compreendendo aminoácidos 227-1004 da sequência de FrpA/C. Estes antigénios podem ser derivados de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras toxinas de Neisseria.

Numa forma de realização alternativa divulgada, as toxinas podem incluir antigénios envolvidos na regulação da toxicidade, por exemplo, OstA, o qual funciona na síntese de lipopolissacáridos.

LPS LPS (lipopolissacárido, também conhecido como LOS-lipooligossacárido) é a endotoxina na membrana externa de Neisseria. A porção polissacarídica do LPS é conhecida por induzir anticorpos bactericidas. A heterogeneidade na porção polissacarídica do LPS produz diversidade estrutural e antigénica entre diferentes estirpes de Neisseria (Griffiss et ai., Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800).

Isto foi utilizado para subdividir as estirpes de meningococos em 12 imunotipos (Scholtan et ai., J Med Microbiol 1994, 41:236-243). Os imunotipos L3, L7, & L9 são imunologicamente idênticos e são estruturalmente semelhantes (ou mesmo iguais) e foram, deste modo, designados L3,7,9 (ou, para os objetivos desta descrição, genericamente como "L3"). A LPS L3,7,9 (L3), L2 e L5 meningocócicas podem ser modificadas por sialilação ou pela adição de ácido citidina 5'-monofosfato-N-acetilneuramínico. Embora L2, L4 e L6 LPS sejam distinguíveis imunologicamente, elas são estruturalmente semelhantes e em que L2 é aqui mencionada, seja L4 ou L6 podem ser opcionalmente substituídas dentro do âmbito da invenção. Ver Μ. P. Jennings et ai., Microbiology 1999, 145, 3013-3021 e Mol Microbiol 2002, 43:931 43 para posterior ilustração de estrutura e heterogeneidade de LPS.

Quando o LPS, de um modo preferido, LPS meningocócica, é incluído nas vacinas da invenção, é dos imunotipos L3 e é apresentado numa vesícula de membrana externa (de um modo preferido, em que a vesícula é extraída com uma baixa percentagem de detergente, de um modo mais preferido, 0-0,5%, 0,02-0,4%, 0,04-0,3%, 0,06-0,2%, 0,08-0,15% ou 0,1%, de um modo ainda mais preferido, desoxicolato [DOC]) mas pode também ser parte de uma vacina de subunidade. O LPS pode ser isolado utilizando processos bem conhecidos incluindo o processo de água-fenol a quente (Wesphal e Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965). Ver também

Galanos et ai., 1969, Eur J Biochem 9: 245-249, e Wu et ai., 1987, Anal Bio Chem 160:281-289. O LPS pode ser utilizado isolado ou conjugado com uma fonte de epitopos de células T, tais como a toxoide do tétano, toxoide da Difteria, proteínas da membrana externa CRM-197 ou OMV. Técnicas para conjugar isolados LOS são também conhecidas (ver, por exemplo, o documento EP 941738 aqui incorporado por referência).

Quando LOS (em particular, o LOS da invenção) está presente numa formulação de vesícula, o LOS é, de um modo preferido, conjugado in situ por métodos que permitem a conjugação de LOS com uma ou mais proteínas da membrana externa também presentes na preparação de vesícula (e. g., PorA ou PorB em meningococos) .

Este processo pode aumentar vantajosamente a estabilidade e/ou imunogenicidade (proporcionar auxílio de células T) e/ou a antigenicidade do antigénio LOS na formulação de vesícula proporcionando, assim, o auxílio de células T para o imunogénio de oligossacárido independente de T na sua conformação mais protetora - como LOS no seu ambiente natural na superfície da membrana meningocócica externa. Adicionalmente, a conjugação do LOS na vesícula, pode resultar numa destoxificação do LOS (sendo a porção de Lípido A integrada de forma estável na membrana externa estando, por isso, menos disponível para provocar toxicidade). Assim, os métodos de destoxificação aqui mencionados de isolar vesículas de mutantes htrB- ou msbB-, ou adicionando péptido não tóxico funcional equivalente de polimixina B [uma molécula com elevada afinidade para o Lípido A] à composição (ver documento WO 93/14115, WO 95/03327, Velucchi et al.r (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12, e EP 976402 para mais detalhes de equivalentes funcionais de péptido não-tóxico de polimixina B -particularmente a utilização do péptido SAEP 2 (da sequência KTKCKFLKKC, em que as 2 cisteínas formam uma ligação persulfureto)) podem não ser necessários (mas os quais podem ser adicionados em combinação para segurança adicional). Assim, a requerente verificou que uma composição compreendendo vesículas em que o LOS presente nas vesículas foi conjugado de um modo intravesícuia com proteínas da membrana externa também presentes na vesícula, pode formar a base de uma vacina para o tratamento ou prevenção de doenças provocadas pelo organismo a partir das quais as vesículas foram derivadas, em que essa vacina é substancialmente não tóxica e é capaz de induzir uma resposta bactericida dependente de T contra LOS no seu ambiente nativo.

Esta divulgação proporciona ainda, deste modo, uma tal preparação de vesícula meningocócica conjugada com LOS intravesícuia.

Essas preparações de vesícula podem ser isoladas a partir da bactéria em questão (ver documento WO 01/09350) e, depois, submetidas a químicas de conjugação conhecidas para ligar grupos (e. g., NH2 ou COOH) na porção oligossacárido de LOS aos grupos (e. g., NH2 ou COOH) nas proteínas de vesícula de membrana externa. Podem ser utilizadas técnicas de ligação reticulada utilizando glutaraldeído formaldeído ou misturas de glutaraldeído/formaldeído, mas é preferido que sejam utilizadas químicas mais seletivas, tais como EDAC ou EDAC/NHS (J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of watersoluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) p 173-176). Outras químicas de conjugação ou tratamentos capazes de criar ligações covalentes entre LOS e moléculas de proteína que podem ser utilizadas, são descritas no documento EP 941738.

De um modo preferido, as preparações de vesícula são conjugadas na ausência de polissacárido capsular. As vesículas podem ser isoladas a partir de uma estirpe que não produz o polissacárido capsular (naturalmente ou via mutação, como descrito a seguir) ou podem ser purificados a partir da maior parte e, de um modo preferido, de todos os polissacáridos contaminantes capsulares. Deste modo, a reação de conjugação de LOS intravesícuia é muito mais eficiente.

De um modo preferido, mais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% do LOS presente nas vesículas é reticulado/conjugado. A conjugação intravesícuia deve, de um modo preferido, incorporar 1, 2 ou todos os 3 dos seguintes passos do processo: o pH da conjugação deve ser superior a pH 7,0, de um modo preferido, superior a, ou igual a pH 7,5 (de um modo ainda mais preferido, inferior pH 9); condições de 1-5%, de um modo preferido, 2-4% de um modo ainda mais preferido, cerca de 3% de sacarose devem ser mantidas durante a reação; o NaCl deve ser minimizado na reação de conjugação, de um modo preferido, inferior a 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M e, de um modo ainda mais preferido, não presente de todo. Todas estas caracteristicas do processo asseguram que as vesículas permanecem estáveis e em solução ao longo do processo de conjugação. O processo de conjugação de EDAC/NHS é um processo preferido para a conjugação intra-vesícuia. EDAC/NHS é preferido ao formaldeído que pode reticular-se numa extensão tão elevada que afeta adversamente a filterabilidade. O EDAC reage com ácidos carboxílicos (tal como KDO em LOS) para produzir um intermediário éster ativo. Na presença de um nucleófilo de amina (tais como lisinas nas proteínas da membrana externa, tais como PorB), é formada uma ligação amida com libertação de um subproduto de isoureia. No entanto, a eficiência de uma reação mediada por EDAC pode ser aumentada através da formação de um intermediário éster Sulfo-NHS. O éster Sulfo-NHS sobrevive em solução aquosa durante mais tempo do que o éster ativo formado a partir da reação de EDAC isoladamente com um carboxilato. Assim, podem ser obtidos rendimentos mais elevados de formação de ligação amida utilizando este processo de dois passos. A conjugação de EDAC/NHS é discutida em J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates Techniques. Greg T.

Hermanson (1996) p 173-176. De um modo preferido, é utilizado 0,01-5 mg EDAC/mg de vesícula na reação, de um modo mais preferido, 0,05-1 mg EDAC/mg de vesícula. A quantidade de EDAC utilizada depende da quantidade de LOS presente na amostra que, por sua vez, depende da % de desoxicolato (DOC) utilizada para extrair as vesículas. A % de DOC mais baixa (e. g. , 0,1%), são utilizadas quantidades mais elevadas de EDAC (1 mg/mg e ainda mais), contudo a % de DOC superior (e. g. 0,5%), são utilizadas quantidades inferiores de EDAC (0,025-0,1 mg/mg) para evitar demasiada ligação reticulada intervesícula.

Um processo preferido da divulgação é, deste modo, um processo para produzir conjugado LOS intravesícuia (de um modo preferido meningocócica) compreendendo os passos de conjugar vesículas na presença de EDAC/NHS a um pH entre o pH 7,0 e pH 9,0 (de um modo preferido, cerca de pH 7,5), em 1-5% (de um modo preferido, cerca de 3%) de sacarose e opcionalmente em condições substancialmente desprovidas de NaCl (como descrito acima), e isolando as vesículas conjugadas a partir da mistura de reação. A reação pode ser seguida por géis de separação de Western da mistura de reação utilizando mAb anti-LOS (e. g. anti-L2 ou anti-L3) para demonstrar o aumento do peso molecular de LOS para uma maior proporção do LOS nas vesículas à medida que o tempo de reação passa.

Podem ser recuperadas vesículas num rendimento de 99% utilizando essas técnicas.

Observou-se que EDAC era um excelente agente de reticulação intravesí cuia, uma vez que reticulava LOS com OMP de um modo suficiente para melhorar a imunogenicidade dependente de LOS T, mas não reticulou a um tal grau elevado que tivessem ocorrido problemas, tais como fraca filtrabilidade, agregação e ligação reticulada intervesícuia. A morfologia das vesículas produzidas é semelhante à das vesículas não conjugadas (por microscopia eletrónica). Adicionalmente, o protocolo acima descrito evitou a ocorrência de uma reticulação elevada excessiva (que pode diminuir a imunogenicidade de OMP protetoras naturalmente presentes na superfície da vesícula, e. g., TbpA ou Hsf). É preferido que a estirpe meningocócica a partir da qual as vesículas são derivadas seja uma estirpe mutante que não possa produzir polissacárido capsular (e. g., uma das estirpes mutantes descritas a seguir, em particular siaD~) . É também preferido que composições imunogénicas eficazes contra a doença meningocócica compreendam ambas as vesículas L2 e uma L3, em que os LOS L2 e L3 são ambos conjugados com proteínas de vesícula de membrana externa. Além disso, é preferido que a estrutura de LOS na vesícula conjugada com intravesícuia seja consistente com ter sido derivada de uma estirpe meningocócica IgtB- (como descrito a seguir). De um modo muito preferido, as composições imunogénicas compreendem vesículas conjugadas com intravesícuias: derivadas de uma estirpe meningocócica mutante e que não pode produzir polissacárido capsular e é IgtB”; compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que não podem produzir polissacárido capsular; compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que são IgtB”; ou de um modo ainda mais preferido compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que não podem produzir polissacárido capsular e são IgtB”.

Uma estirpe meningocócica L3 típica que pode ser utilizada para a presente invenção é a estirpe H44/76 menB. Uma estirpe L2 típica é a estirpe B16B6 menB ou a estirpe de meningococos de tipo C, 39E.

Como referido acima, as vesículas da invenção podem ser destoxifiçadas até um grau pelo ato de conjugação e podem, deste modo, não necessitar de serem ainda mais destoxifiçadas, contudo, podem ser utilizados outros métodos de destoxificação para segurança adicional, por exemplo, utilizando vesículas derivadas de uma estirpe meningocócica que é htrB~ ou msbB~ ou adicionando um péptido não tóxico funcional equivalente de polimixina B [uma molécula com afinidade elevada para o Lípido A] (de um modo preferido, SEAP 2) à composição de vesícula (como descrito acima).

No modo acima, são divulgadas vesículas meningocócicas e composições imunogénicas compreendendo vesículas que possuem como um importante antigénio LOS que é substancialmente não tóxico, desprovido de problemas autoimunitários, possui um carácter dependente de T, está presente no seu ambiente natural e é capaz de induzir uma resposta de anticorpo bactericida contra mais de 90% de estirpes meningocócicas (no caso de composições L2+L3).

De um modo preferido, a conjugação de LOS intravesícuia deve incorporar 1, 2 ou todos os 3 dos seguintes passos do processo: o pH da conjugação deve ser superior a pH 7,0, de um modo preferido, superior a, ou igual a pH 7,5 (de um modo ainda mais preferido, a pH 9) ; devem ser mantidas condições de 1-5%, de um modo preferido, 2-4%, de um modo ainda mais preferido, cerca de 3% de sacarose durante a reação; o NaCl deve ser minimizado na reação de conjugação, de um modo preferido, a 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M e, de um modo ainda mais preferido, não presente de todo. Todas estas características do processo asseguram que as vesículas permanecem estáveis e em solução ao longo do processo de conjugação.

Embora o LOS possa ser conjugado nas vesículas com as proteínas da membrana externa através de várias técnicas e químicas, o processo de conjugação de EDAC/NHS é um processo preferido para a conjugação intravesícuia. É preferido EDAC/NHS ao formaldeído que pode reticular-se até uma extensão demasiado elevada afetando desse modo adversamente a filtrabilidade. EDAC reage com ácidos carboxílicos para produzir um intermediário éster ativo. Na presença de um nucleófilo de amina, é formada uma ligação amida com libertação de um subproduto de isoureia. No entanto, a eficiência de uma reação mediada por EDAC pode ser aumentada através da formação de um intermediário éster Sulfo-NHS. 0 éster Sulfo-NHS sobrevive em solução aquosa durante mais tempo do que o éster ativo formado a partir da reação de EDAC isoladamente com um carboxilato. Assim, podem ser realizados rendimentos superiores de formação de ligação amida utilizando este processo de dois estágios. A conjugação EDAC/NHS é discutida em J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) p 173-176.

Um processo preferido é, deste modo, um processo para produzir LOS conjugado a intravesícuia (de um modo preferido, meningocócico) compreendendo os passos de conjugar vesículas na presença de EDAC/NHS a um pH entre pH 7,0 e pH 9,0 (de um modo preferido, cerca de pH 7,5), em 1-5% (de um modo preferido, cerca de 3%) de sacarose e opcionalmente em condições substancialmente desprovidas de NaCl (como descrito acima) e isolando as vesículas conjugadas a partir da mistura de reação. A reação pode ser seguida em géis de separação da mistura de reação utilizando mAb anti-LOS (e. g. , anti-L2 ou anti-L3) para demonstrar o aumento do peso molecular de LOS para uma proporção maior do LOS nas vesículas à medida que o tempo de reação passa.

Podem ser recuperados rendimentos de 99% de vesículas utilizando essas técnicas. Observou-se que EDAC era um excelente agente de reticulação intravesícuia uma vez que reticula LOS com OMP suficientemente para imunogenicidade dependente de LOS T melhorada, mas não o reticulou até a um grau elevado em que ocorram problemas, tais como fraca filtrabilidade e ligação reticulada intervesícuia. Uma reticulação demasiado elevada também seria impedida para evitar qualquer diminuição na imunogenicidade de OMP protetoras naturalmente presentes na superfície da vesícula e. g., TbpA. 5. Proteínas integrais da membrana externa

Outras categorias de proteínas de Neisseria podem também ser candidatas para inclusão nas vacinas de Neisseria da invenção e podem ser capazes de combinar com outros antigénios de um modo surpreendentemente eficaz. As proteínas associadas à membrana, particularmente as proteínas de membrana integrais e, mais vantajosamente, as proteínas da membrana externa, especialmente as proteínas integrais da membrana externa, podem ser utilizadas nas composições da presente invenção. Um exemplo dessas proteínas é a PldA, também conhecida como OmplA (NMB 04 64) . (documento WO00/15801), a qual é uma proteína fosfolipase de

Neisseria da membrana externa. Outros exemplos são TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541) e TspB (proteína de estimulação de células T) (documento WO 00/03003; NMB 1548, NMB 1628 ou NMB 1747) . Outros exemplos incluem PilQ (NMB 1812) (documento WO99/61620), OMP85 - também conhecida como D15 -(NMB 0182) (documento WO00/23593), NspA (U52066) (W096/29412),

PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995), HpuB (NC_0 03116.1) , TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290), OstA (NMB 0280), MltA também conhecida como GNA33 e Lipo30 (NMB0033), HtrA (NMB 0532; documento WO 99/55872), HimD (NMB 1302), HisD (NMB 1581), GNA 1870 (NMB 1870), HlpA (NMB 1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, TbpA (NMB 0461) (documento WO92/03467 (ver também acima em proteínas de aquisição de ferro) e LbpA (NMB 1541) .

Composições imunogénicas

Uma composição imunogénica é uma composição compreendendo, pelo menos, um antigénio que é capaz de produzir uma resposta imunitária quando administrado a um hospedeiro. De um modo preferido, essas preparações imunogénicas são capazes de produzir uma resposta imunitária protetora contra Neisseria, de um modo preferido, infeção por Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae. A invenção refere-se a composições imunogénicas compreendendo, pelo menos, dois antigénios que, de um modo preferido, estimulam uma ou mais de uma resposta sinergística, bactericida, protetora ou de bloqueio de adesão.

Ensaios de bactericida de SBA da invenção

Uma tal resposta sinergística pode ser caracterizada pelo SBA estimulado pela combinação de antigénios sendo, pelo menos, 50%, duas vezes, três vezes, de um modo preferido, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes e, de um modo ainda mais preferido, dez vezes mais elevado do que o SBA estimulado por cada antigénio separadamente. De um modo preferido, o SBA é medido contra uma estirpe homóloga a partir da qual os antigénios são derivados e, de um modo preferido, também contra um painel de estirpes heterólogas. (Ver a seguir para um painel representativo, por exemplo, BZ10 (B:2b:P1.2) pertencendo ao grupo A-4; B16B6 (B:2a: Pi.2) pertencendo ao complexo ET-37; e H44/76 (B:15:Pi.7,16)) . O SBA é o marcador imunológico normalmente mais aceite para estimar a eficácia de uma vacina meningocócica (Perkins et al., J Infect Dis. 1998, 177:683-691). O SBA pode ser apurado mais satisfatoriamente através de um qualquer método conhecido. O SBA pode ser realizado utilizando soros obtidos de modelos animais (ver exemplos 17-20) ou de indivíduos humanos.

Um método preferido para conduzir o SBA com soros humanos é o seguinte. Uma amostra de sangue é retirada antes da primeira vacinação, dois meses após a segunda vacinação e um mês após a terceira vacinação (sendo três vacinações num ano um calendário de vacinação primária humana típica, administradas, por exemplo, aos 0, 2 e 4 meses, ou 0, 1 e 6 meses) . Esses calendários de vacinação primária humana podem ser realizados em crianças com menos de 1 ano de idade (por exemplo, ao mesmo tempo que são realizadas as vacinações de Hib) ou crianças com 2-4 anos de idade ou adolescentes, também podem ser vacinados para testar SBA com esse calendário de vacinação primária. Uma outra amostra de sangue pode ser retirada 6 a 12 meses após a vacinação primária e um mês após uma dose de reforço, se aplicável. 0 SBA será satisfatório para um antigénio ou preparação de vesícula com atividade bactericida homóloga se um mês após a terceira dose de vacina (do calendário de vacinação primária) (e crianças de 2-4 anos de idade ou adolescentes, mas, de um modo preferido, em crianças no seu primeiro ano de vida) a percentagem de indivíduos com um aumento de quatro vezes em termos de título de SBA (diluição de anticorpo) (em comparação com o título da pré-vacinação) contra a estirpe de meningococos a partir das quais os antigénios da invenção foram derivados for superior a 30%, de um modo preferido, superior a 40%, de um modo mais preferido, superior a 50% e, de um modo ainda mais preferido, superior a 60% dos indivíduos.

Obviamente que uma preparação de antigénio ou de vesícula com atividade bactericida heteróloga também pode constituir preparação em vesícula com atividade bactericida homóloga se também puder estimular satisfatoriamente o SBA contra a estirpe meningocócica a partir das quais é derivada. O SBA será satisfatório para uma preparação de antigénio ou vesícula com atividade bactericida se um mês após a terceira dose de vacina (do calendário de vacinação primário) (em crianças com 2-4 anos de idade ou adolescentes, mas de um modo preferido em crianças no primeiro ano de vida) a percentagem de indivíduos com um aumento de quatro vezes em termos de título de SBA (diluição do anticorpo) (em comparação com o título de pré-vacinação) contra três estirpes heterólogas de meningococos for superior a 20%, de um modo preferido, superior a 30%, de um modo mais preferido, superior a 35% e, de um modo ainda mais preferido, superior a 40% dos indivíduos. Esse teste é uma boa indicação se as preparações de antigénio ou vesícula com atividade bactericida heteróloga poderem induzir anticorpos de cruzamento bactericida contra várias estirpes meningocócicas. As três estirpes heterólogas podem, de um modo preferido, possuir diferentes padrões de complexo de tipo electroforético (ET) ou tipagem de sequência multilocus (MLST) (ver Maiden et al., PNAS USA 1998, 95:3140-5) uns em relação aos outros e, de um modo preferido, à estirpe a partir das quais a preparação de antigénio ou de vesícula com atividade bactericida heteróloga é feita ou derivada. Um especialista será rapidamente capaz de determinar três estirpes com diferentes complexos ET que refletem a diversidade genética observada entre meningococos, particularmente entre estirpes de meningococos de tipo B que são reconhecidos como sendo a causa de carga de doença significativa e/ou que representam linhagens hipervirulentas de MenB reconhecidas (ver Maiden et al., supra). Por exemplo, três estirpes que podem ser utilizadas são as seguintes: BZ10 (B:2b:P1.2) pertencendo ao grupo A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) pertencendo ao complexo ET-37; e H44/76 (B:15:Pl.7,16) pertencendo ao complexo ET-5 ou quaisquer outras estirpes pertencendo ao mesmo Grupo ET. Essas estirpes podem ser utilizadas para testar uma preparação de antigénio ou de vesícula com atividade bactericida heteróloga produzida ou derivada de, por exemplo, a estirpe meningocócica CU385 (B:4:P1.15) que pertence ao complexo ET-5. Outra estirpe da amostra que pode ser utilizada é a partir do clone epidémico da Linhagem 3 (e. g., NZ124 [B:4:Pl.7,4]). Outra estirpe de ET-37 é NGP165 (B: 2a:Pl.2).

Processos para medir a atividade de SBA são conhecidos na técnica. Por exemplo, um método que pode ser utilizado é descrito no documento WO 99/09176 no Exemplo 10C. Em termos gerais, uma cultura da estirpe a ser testada é cultivada (de um modo preferido, em condições de esgotamento de ferro - através da adição de um quelante de ferro, tal como EDDA ao meio de crescimento) na fase log do crescimento. Isto pode ser suspenso num meio com BSA (tal como meio de Hanks com 0,3% de BSA) de modo a obter uma suspensão de células de trabalho ajustada para, aproximadamente, 20000 CFU/mL. Uma série de misturas de reação pode ser preparada misturando uma série de diluições de duas vezes dos soros a serem testados (de um modo preferido, inactivados pelo calor, a 56 2C, durante 30 min) [por exemplo,

num volume de 50 mL/poço] e a suspensão da estirpe meningocócica a 20000 CFU/mL a ser testada [por exemplo, num volume de 25 mL/poço] . Os frascos de reação devem ser incubados (e. g. , a 37 2C, durante 15 minutos) e agitados (e. g. , a 210 rpm) . A mistura de reação final [por exemplo, num volume de 100 mL] contém, adicionalmente, uma fonte complementar [tal como 25% do volume final de soro de coelho bebé pré-testado] e é incubado como acima [e. g. , 37 2C, durante 60 min] . Pode ser utilizada uma placa de microt itulação de 96 poços de fundo em U de poliestireno estéril para este ensaio. Pode ser retirada uma fração [e. g., 10 mL] de cada poço utilizando uma pipeta multicanal, e vertida para placas de agar Mueller-Hinton (de um modo preferido, contendo 1% de Isovitalex e 1% de Soro de Cavalo inactivado pelo calor) e incubados (por exemplo, durante 18 horas, a 37 2C, em C02 a 5%). De um modo preferido, podem ser contadas colónias individuais até 80 CFU por fração. Podem ser utilizadas como controlos as seguintes três amostras de teste: tampão + bactéria + complemento; tampão + bactéria + complemento inativado; soro + bactéria + complemento inativado. Os títulos de SBA podem ser calculados de uma forma direta utilizando um programa que processa os resultados para produzir uma medição da diluição que corresponde a 50% da morte das células através de um cálculo de regressão.

Ensaios de proteção animal

Em alternativa, a resposta sinérgica pode ser caracterizada pela eficácia da combinação de antigénios num ensaio de proteção animal. Por exemplo, podem ser utilizados os ensaios descritos no exemplo 12 ou 13. De um modo preferido, o número de animais protegidos pela combinação de antigénios é significativamente melhorado em comparação com a utilização dos próprios antigénios, particularmente a doses subótimas de antigénio.

Uma vacina de sucesso para a prevenção de infeção por N. gono pode necessitar de mais do que um dos seguintes elementos: produção de anticorpos do soro e/ou da mucosa para facilitar a morte mediada pelo complemento dos gonococos e/ou para aumentar a fagocitose e a morte microbiana pelos leucócitos, tal como leucócitos polimorfonucleares e/ou para prevenir a ligação dos gonococos aos tecidos hospedeiros; indução de uma resposta imunitária mediada pela célula pode também participar na proteção. O melhoramento da eficácia de uma preparação de vacina de vesículas gono da invenção pode ser avaliado através da análise da resposta imunitária induzida aos anticorpos do soro e/ou da mucosa que possuem propriedades de antiaderência, e/ou opsonizantes, e/ou atividade bactericida, como descrito por outros (McChesney D et ai, Infect. Immun. 36: 1006, 1982;

Boslego J et ai.: Efficacy trial of a purified gonococci pilus vaccine, em Program and Abstracts of the 24th InterScience

Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984; Siegel M et al. , J. Infect. Dis 145: 300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20,1995) .

Foi recentemente descrito um modelo de murganho de infeção genital por N. gono (Plante M, J. Infect. Dis., 182: 848-55, 2000) . A melhoria da eficiência de uma vacina de vesículas gono da invenção também pode ser avaliada através da sua capacidade para prevenir ou para reduzir a colonização por N. gono neste modelo de murganho da infeção.

Ensaio de bloqueio da adesão

Em alternativa, a resposta sinergística pode ser caracterizada pela eficácia da combinação de antigénios num ensaio de bloqueio de adesão. Por exemplo, o ensaio descrito no exemplo 11 pode ser utilizado. De um modo preferido, a extensão de bloqueio induzido pelos anti-soros produzidos contra a combinação de antigénios é significativamente melhorada em comparação com a utilização de anti-soros produzidos contra os próprios antigénios, particularmente a doses subótimas de anticorpo.

Composições de subunidade A composição imunogénica da invenção pode ser uma composição de subunidade.

As composições de subunidade são composições em que os componentes foram isolados e purificados para, pelo menos, 50%, de um modo preferido, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90% puros antes de misturar os componentes para formar a composição antigénica.

As composições de subunidade podem ser soluções aquosas de proteínas solúveis em água. Estas podem compreender detergente, de um modo preferido, detergente não iónico, zwiteriónico ou iónico, de modo a solubilizar partes hidrofóbicas dos antigénios. Estas podem compreender lípidos, de modo que se possam formar estruturas de lipossoma, permitindo a apresentação de antigénios com uma estrutura que se estende pela membrana lipídica.

Preparações de vesícula de membrana externa N. meningitidis serogrupo B (menB) excreta vesículas de membrana externa em quantidades suficientes para permitir o seu fabrico numa escala industrial. As vesículas de membrana externa podem também ser preparadas através do processo de extração com detergente das células bacterianas (ver, por exemplo, documento EP 11243). A composição imunogénica da invenção também pode compreender uma preparação de vesícula de membrana externa possuindo, pelo menos, dois antigénios que foram regulados positivamente, de modo recombinante ou por outros meios que incluem a cultura em condições de depleção de ferro. Exemplos de antigénios que seriam regulados positivamente numa tal preparação de vesícula de membrana externa incluem; NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA (elevado), TbpA (baixo), LbpA, TbpB, LbpB, PilQ, AspA, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NMADPRT, MafA, MafB e PldA. Essas preparações também iriam compreender um ou ambos os LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. 0 fabrico de preparações de vesícula das estirpes de Neisseria pode ser conseguido através de qualquer um dos métodos bem conhecidos para um especialista na técnica. De um modo preferido, são utilizados os métodos divulgados nos documentos EP 301992, US 5597572, EP 11243 ou US 4271147, Frederikson et ai., (NIPH Annals [1991], 14:67-80), Zollinger et ai., (J.

Clin. Invest. [1979], 63:836-848), Saunders et ai., (Infect.

Immun. [1999], 67:113-119), Drabick et ai., (Vaccine [2000], 18:160-172) ou documento WO 01/09350 (Exemplo 8) . Em geral, as OMV são extraídas com um detergente, de um modo preferido, desoxicolato, e os ácidos nucleicos são removidos opcionalmente enzimaticamente. A purificação é alcançada por ultracentrifugação opcionalmente seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. Se 2 ou mais vesículas diferentes da invenção são incluídas, estas podem ser combinadas num único recipiente para formar uma preparação multivalente da invenção (embora uma preparação seja também considerada multivalente se as diferentes vesículas da invenção forem composições separadas em recipientes separados que são administrados ao mesmo tempo [a mesma visita a um profissional] a um hospedeiro). As preparações de OMV são, normalmente, esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 mm, e são, de um modo preferido, armazenadas numa solução de sacarose (e. g., 3%) a qual é conhecida por estabilizar as preparações de vesícula. A regulação positiva das proteínas nas preparações de vesícula de membrana externa pode ser conseguida pela inserção de uma cópia extra de um gene na estirpe de Neisseria a partir da qual a preparação de OMV é derivada. Alternativamente, o promotor de um gene pode ser permutado para um promotor mais forte na estirpe de Neisseria a partir da qual a preparação de OMV é derivada. Essas técnicas são descritas no documento W001/09350. A regulação positiva de uma proteína conduzirá a um nível superior da proteína que está presente em OMV em comparação com o nível da proteína presente em derivados de OMV a partir de N. meningitidis não modificada (por exemplo, a estirpe H44/76) . De um modo preferido, o nível será 1,5, 2, 3, 4, 5, 7, 10 ou 20 vezes superior.

Quando se pretende que o LPS seja um antigénio adicional no OMV, pode ser utilizado, de um modo preferido, um protocolo utilizando uma concentração baixa de detergente de extração (por exemplo, desoxicolato ou DOC) na preparação do método de OMV de modo a preservar níveis elevados de LPS ligado, enquanto se remove o LPS particularmente tóxico, fracamente ligado. A concentração de DOC utilizado é, de um modo preferido, 0-0,5% DOC, 0,02-0,4% DOC, 0,04-0,3% de DOC, de um modo mais preferido, 0,06%-0,2% DOC ou 0,08-0,15% de DOC, de um modo ainda mais preferido, em torno de, ou exatamente, 0,1% DOC. "Sequência de promotor mais forte" refere-se a um elemento de controlo regulador que aumenta a transcrição para um gene que codifica o antigénio de interesse. "Regulação positiva da expressão" refere-se a qualquer meio para aumentar a expressão de um antigénio de interesse, em relação à da vesícula não modificada (i. e., de ocorrência natural). Entende-se que a quantidade de "regulação positiva" irá variar dependendo do antigénio particular de interesse, mas não excederá uma quantidade que irá romper a integridade da membrana da vesícula. A regulação positiva de um antigénio refere-se à expressão que é, pelo menos, 10% mais elevada do que a da vesícula não modificada. De um modo preferido, é, pelo menos, 50% superior. De um modo mais preferido é, pelo menos, 100% (2 vezes) superior. De um modo muito preferido é 3, 4, 5, 7, 10, 20 vezes superior. Alternativa ou adicionalmente, regular positivamente a expressão pode referir-se a tornar a expressão não condicional nas alterações metabólicas ou nutricionais, particularmente no caso de TbpA, TbpB, LbpA e LbpB. De um modo preferido, o nível de expressão é avaliado quando as vesículas foram derivadas de bactérias cultivadas em condições limitadas de ferro (por exemplo, na presença de um quelante de ferro).

Novamente, para fins de clareza, as expressões "modificar uma estirpe bacteriana para produzir menos do referido antigénio" ou regulação negativa referem-se a quaisquer meios para reduzir a expressão de um antigénio (ou a expressão de um produto genético funcional) de interesse, em relação à não modificada (i. e., vesícula de ocorrência natural), de um modo preferido, por deleção, de modo que a expressão seja, pelo menos, 10% inferior àquela da vesícula não modificada. De um modo preferido, é, pelo menos, 50% inferior e, de um modo ainda mais preferido, completamente ausente. Se a proteína regulada negativamente for uma enzima ou uma proteína funcional, a regulação negativa pode ser conseguida através da introdução de uma ou mais mutações resultando numa redução de 10%, 20%, 50%, 80% ou, de um modo preferido, 100% na atividade enzimática ou funcional.

Os passos de engenharia necessários para modular a expressão de proteínas de Neisseria, podem ser realizados de vários modos conhecidos pelo especialista na técnica. Por exemplo, podem ser inseridas sequências (e. g. , promotores ou grelhas de leitura aberta) e podem ser interrompidos promotores/genes através da técnica de inserção de transposões. Por exemplo, para regular positivamente a expressão de um gene, pode ser inserido um promotor forte através de um transposão até 2 kb a montante do codão de iniciação do gene (de um modo mais preferido, 200-600 pb a montante, de um modo ainda mais preferido, aproximadamente 400 pb a montante). Também pode ser utilizada mutação ou deleção pontual (particularmente para a regulação negativa da expressão de um gene) .

Esses métodos, todavia, podem ser bastante instáveis ou incertos e, deste modo, é preferido que o passo de modificação seja realizado através de um evento de recombinação homóloga. De um modo preferido, o evento ocorre entre uma sequência (uma região recombinogénica) de, pelo menos, 30 nucleótidos no cromossoma bacteriano e uma sequência (uma segunda região recombinogénica) de, pelo menos, 30 nucleótidos num vetor transformado na estirpe. De um modo preferido, as regiões têm 40-1000 nucleótidos, de um modo mais preferido, 100-800 nucleótidos, de um modo ainda mais preferido, 500 nucleótidos). Estas regiões recombinogénicas devem ser suficientemente semelhantes às que são capazes de hibridar uma com a outra em condições altamente restringentes.

Os métodos utilizados para realizar os eventos de modificação genética aqui descritos (tais como a regulação positiva ou regulação negativa de genes por eventos de recombinação e a introdução de outras sequências de genes num genoma de Neisseria) são descritos no documento W001/09350. Os promotores típicos fortes preferidos que podem ser integrados em Neisseria são porA, porB, lgtF, Opa, pllO, 1st e hpuAB. São preferidos PorA e PorB como promotores constitutivos, fortes.

Foi estabelecido que a atividade do promotor PorB está contida num fragmento que corresponde aos nucleótidos -1 a -250 a montante do códão de iniciação de porB.

Regulação positiva da expressão de antigénios por cultura em meios de limitação de ferro A regulação positiva de alguns antigénios numa preparação de vesícula de membrana externa da invenção é, de um modo preferido, alcançada isolando vesículas de membrana externa de uma estirpe parental de Neisseria cultivada em condições de limitação de ferro. Uma baixa concentração de ferro no meio irá resultar no aumento da expressão de proteínas envolvidas na aquisição de ferro incluindo TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB e P2086. A expressão destas proteínas é, assim, regulada positivamente sem a necessidade de modificar de modo recombinante os genes envolvidos, por exemplo, inserindo um promotor mais forte ou inserindo uma cópia adicional do gene. A invenção também iria compreender a regulação positiva de proteínas de aquisição de ferro através de cultura em meio sem limitação de ferro em que o gene também foi modificado de modo recombinante. A limitação de ferro é alcançada pela adição de um quelante de ferro ao meio de cultura. Quelantes de ferro adequados incluem 2,2-Dipiridil, EDDHA (ácido etilenodiamina-di (o-hidroxifenilacético) e Desferal (mesilato de deferoxamina, Sigma). Desferal é o quelante de ferro preferido e é adicionado ao meio de cultura a uma concentração entre 10 e 100 μΜ, de um modo preferido, 25-75 μΜ, de um modo mais preferido, 50-70 μΜ, de um modo ainda mais preferido, a 60 μΜ. O teor em ferro do meio vem principalmente dos constituintes de extrato de levedura e peptona de soja e a quantidade presente pode variar entre lotes. Por isso, diferentes concentrações de Desferal podem ser ótimas para alcançar a regulação positiva de proteínas de aquisição de ferro em diferentes lotes de meio. 0 especialista na técnica pode facilmente ser capaz de determinar a concentração ótima. Em termos básicos, pode ser adicionado quelante de ferro suficiente ao meio para regular positivamente a expressão da proteína regulada por ferro desejada, mas não o suficiente para afetar adversamente a cultura das bactérias.

De um modo preferido, a regulação positiva das proteínas de aquisição de ferro através de cultura em condições limitadas em ferro é combinada com a regulação positiva recombinante de outros antigénios de modo que a vesícula de membrana externa da invenção seja alcançada.

Regulação Negativa/Remoção de Antigénios Imunodominantes Variáveis e não Protetores

Muitos antigénios de superfície são variáveis entre estirpes bacterianas e como uma consequência são protetores apenas contra um conjunto limitado de estripes intimamente relacionadas. São aqui divulgadas vesículas de membrana externa da invenção em que a expressão de outras proteínas é reduzida, ou, de um modo preferido, é(são) eliminado(s) o(s) gene(s) que codifica(m) a(s) proteína (s) de superfície variável (eis) . Esses resultados de deleção resultam numa estirpe bacteriana que produz vesículas que, quando administradas numa vacina, possuem um potencial mais forte para reactividade cruzada contra várias estirpes devido a uma influência mais elevada exercida por proteínas conservadas (retidas nas membranas externas) no sistema de vacina imunitário.

Exemplos desses antigénios variáveis em Neisseria que podem ser regulados negativamente nas composições imunogénicas de vesícula da invenção incluem PorA, PorB, Opa.

Outros tipos de gene que podem ser regulados negativamente ou desligados são genes que, in vivo, podem facilmente ser ligados em (expressos) ou desligados pela bactéria. As proteínas da membrana externa codificadas por esses genes não estão sempre presentes nas bactérias, a presença dessas proteínas nas preparações das vesículas pode também ser prejudicial para a eficácia da vacina para as razões referidas acima. Um exemplo preferido para regular negativamente ou remover é a proteína Opc de Neisseria. A imunidade anti-Opc induzida por uma Opc contendo vacina de vesícula iria apenas possuir capacidade protetora limitada como o organismo infectante pode facilmente tornar-se Opc~.

Por exemplo, estes genes variáveis ou não protetores podem ser regulados negativamente na expressão ou desligados terminalmente. Isto possui a vantagem de concentrar o sistema imunitário em antigénios melhores que estão presentes em quantidades inferiores na superfície exterior das vesículas. Por regulação negativa também se entende que as ansas imunodominantes variáveis expostas à superfície das proteínas acima descritas da membrana externa podem ser alteradas ou eliminadas de modo a tornar a proteína da membrana externa resultante menos imunodominante. Métodos para a regulação negativa da expressão são divulgados no documento W001/09350. Combinações preferidas de proteínas a serem reguladas negativamente nas composições imunogénicas de vesículas da invenção incluem PorA e OpA; PorA e OpC; OpA e OpC; PorA e OpA e OpC. São conhecidos quatro genes Opa diferentes por existirem no genoma meningocócico (Aho et al., 1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37), deste modo, quando se refere que a Opa é regulada negativamente na expressão entende-se que, de um modo preferido, 1, 2, 3 ou (de um modo preferido) todos os 4 genes presentes em meningococos são assim regulados negativamente. Essa regulação positiva pode ser realizada geneticamente como descrito no documento WO 01/09350 ou por pesquisa de estirpes de meningococos estáveis, naturais, rapidamente encontradas que não possuem expressão ou baixa expressão a partir dos loci de Opa. Essas estirpes podem ser encontradas utilizando a técnica descrita em Poolman et al., (1985 J. Med. Micro. 19:203-209) em que as células que são Opa~ possuem um fenótipo diferente do das células que expressam Opa que pode ser observado vendo o aspeto das células nas placas ou sob um microscópio. Uma vez encontrada, a estirpe pode ser apresentada como sendo Opa~ estável realizando uma transferência de Western nos conteúdos de células após uma fermentação corrida para estabelecer a falta de Opa.

Quando a regulação positiva de alguns antigénios na vesícula de membrana externa é alcançada por cultura em condições de limitação de ferro, a proteína FrpB variável (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)) irá também ser regulada positivamente. A requerente verificou que é vantajoso regular negativamente a expressão de FrpB nestas circunstâncias por regulação negativa da expressão da proteína inteira como descrito no documento W001/09350 ou eliminando a(s) região(ões) variável(eis) de FrpB. Isto irá assegurar que a resposta imunitária estimulada pela composição imunogénica é dirigida a antigénios que estão presentes numa vasta gama de estirpes. A regulação negativa de FrpB é, de um modo preferido, combinada com a regulação negativa de PorA e OpA; PorA e OpC; OpA e OpC; PorA e OpA e OpC nas composições imunogénicas de vesícula da invenção.

Numa forma de realização alternativa da invenção, a FrpB é regulada negativamente em vesículas de membrana externa que foram preparadas a partir de estirpes de Neisseria não cultivadas em condições de limitação de ferro.

Destoxificação de LPS

As vesículas nas composições imunogénicas da invenção podem ser destoxifiçadas através dos métodos para a destoxificação de LPS que são divulgados no documento W001/09350. Em particular, os métodos para a destoxificação de LPS da invenção envolvem a regulação positiva/deleção de enzimas htrB e/ou msbB que são divulgadas no documento W001/09350. Os genes msbB e htrB de Neisseria são também denominados lpxLl e lpxL2, respetivamente (documento WO 00/26384) e mutações de deleção destes genes são caracterizadas fenotipicamente pelo mutante LOS msbB- perdendo uma cadeia acilo secundária, e o mutante LOS htrB- perdendo ambas as cadeias acilo secundárias. Os documentos W093/14155 e WO 95/03327 descrevem equivalentes de péptido funcionais não tóxicos de polimicina B que podem ser utilizados em composições da invenção.

Esses métodos são, de um modo preferido, combinados com métodos de extração de vesículas envolvendo níveis baixos de DOC, de um modo preferido, 0-0,3% de DOC, de um modo mais preferido, 0,05%-0,2% de DOC, de um modo ainda mais preferido, cerca de, ou exatamente, 0,1% de de DOC.

Outros métodos de destoxificação de LPS incluem adicionar às preparações de vesículas um péptido não típico funcional equivalente de polimixina B (de um modo preferido, SAEP 2) como descrito acima.

Polissacáridos de reação cruzada O isolamento de vesículas de membrana externa bacteriana de bactérias Gram-negativas encapsuladas resulta, frequentemente, na co-purificação de polissacárido capsular. Em alguns casos, este material "contaminante" pode demonstrar ser útil uma vez que o polissacárido pode aumentar a resposta imunitária conferida pelos outros componentes de vesículas. Noutros casos todavia, a presença de material polissacárido contaminante, em preparações de vesículas bacterianas, pode demonstrar ser prejudicial para a utilização das vesículas numa vacina. Por exemplo, foi demonstrado, pelo menos no caso de N. meningitidis, que o polissacárido capsular do serogrupo B não confere imunidade protetora e é suscetível de induzir uma autorresposta adversa imunitária em humanos. Consequentemente, as vesículas de membrana externa da invenção podem ser isoladas a partir de uma estirpe bacteriana para a produção de vesículas, a qual foi modificada de modo que sejam isentos de polissacárido capsular. As vesículas serão, então, adequadas para utilização em humanos. Um exemplo particularmente preferido dessa preparação de vesículas é de um serogrupo B de N. meningitidis desprovido de polissacárido capsular.

Isto pode ser conseguido utilizando a produção de estirpes de vesículas modificadas em que os genes necessários para a biossíntese capsular e/ou exportação foram debilitados. A inactivação do gene que codifica a biossíntese capsular do polissacárido, ou exportação, pode ser conseguida por mutação (mutação, deleção ou inserção pontual) da região de controlo, da região codificante ou de ambas (de um modo preferido, utilizando as técnicas de recombinação homóloga descritas acima) ou através de quaisquer outros modos de diminuição da função enzimática desses genes. Além disso, a inactivação de genes da biossíntese capsular pode também ser conseguida através a sobre-expressão anti-sentido ou mutagénese de transposão. Um método preferido é a deleção de algum, ou de todos, os genes cps de Neisseria meningitidis necessários para a biossíntese e exportação de polissacárido. Para este objetivo, o plasmídeo de substituição pMF121 (descrito em Frosh et ai., 1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218) pode ser utilizado para distribuir uma mutação que elimina o grupo de genes cpsCAD (+ galE). A segurança dos anticorpos criados para LPS L3 ou L2 foi questionada, devido à presença de uma estrutura semelhante ao grupo de oligossacárido de lacto-N-neotetraose (Gaipi-4GlcNAcpi-303ΐβ1-401οβ1-) presente em glicosfingolípidos humanos. Mesmo se um grande número de pessoas tiver sido vacinada com segurança com vacinas de vesículas extraídas com desoxicolato contendo uma quantidade residual de L3 LPS (G. Bjune et ai., Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierra et ai., NIPH ann (1991), 14, 195-210), a deleção da parte terminal do LOS sacarídico é vantajosa na prevenção de qualquer reação cruzada com estruturas presentes na superfície de tecidos humanos. Numa forma de realização preferida, a inactivação do gene lgtB resulta numa estrutura de LPS intermediária, em que os resíduos de galactose terminal e o ácido siálico estão ausentes (a mutação deixa uma estrutura 401οΝΑοβ1-303ΐβ1-401οβ1- em L2 e L3 LOS). Esses intermediários podem ser obtidos numa estirpe L3 e uma estirpe L2 LPS. Uma versão alternativa e menos preferida (curta) da LPS pode ser obtida desligando o gene lgtE. Uma outra versão alternativa e menos preferida do LPS pode ser obtida desligando o gene lgtA. Se for selecionada uma mutação de lgtA- é preferido que também desligue a expressão de lgtC para prevenir o imunotipo não imunogénico LI a ser formado.

Os mutantes LgtB~ são mais preferidos uma vez que a requerente verificou que esta é a truncagem ótima para resolver a questão da segurança enquanto ainda retém um epitopo de oligossacárido protetor de LPS que pode ainda induzir uma resposta de anticorpo bactericida.

Deste modo, as composições imunogénicas da invenção compreendendo preparações de L2 ou L3 (sejam purificadas ou em vesículas isoladas) ou preparações de vesículas meningocócicas em geral, são vantajosamente derivadas a partir de uma estirpe de Neisseria (de um modo preferido, meningocócica) que foi geneticamente modificada para regular negativamente permanentemente a expressão do produto de gene funcional a partir do gene lgtB, IgtA ou lgtE, de um modo preferido, desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminado a totalidade ou parte do promotor e/ou a grelha de leitura aberta do gene.

Quando as composições imunogénicas acima da invenção são derivadas de uma estirpe de meningococos B, é ainda preferido que o polissacárido capsular (que também contém estruturas de sacárido de tipo humano) seja também removido. Embora muitos genes possam ser desligados para alcançar este objetivo, a requerente demonstrou, vantajosamente, que é preferido que a estirpe de produção de vesículas tenha sido geneticamente modificada para regular negativamente de modo permanente a expressão do produto do gene funcional a partir do gene siaD (i. e., regulando negativamente a atividade de oí-2-8 polisialiltransferase) , de um modo preferido, desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminando a totalidade ou parte do promotor e/ou da grelha de leitura aberta do gene. Essa inactivação é descrita no documento WO 01/09350. A referida mutação siaD (também conhecida como synD) é a mais vantajosa de muitas mutações que podem resultar na remoção do epitopo semelhante ao humano a partir do polissacárido capsular, porque é uma das únicas mutações que não possui efeito na biossíntese dos epitopos protetores de LOS, sendo assim vantajosos num processo que tem como objetivo utilizar em último caso LOS como um antigénio protetor e tem um efeito mínimo no crescimento da bactéria. Um aspeto preferido da invenção é, deste modo, uma preparação imunogénica de vesícula como descrito acima que é derivada de um lgtE- siaD-, um lgtA- siaD- ou, de um modo preferido, uma estripe lgtB- siaD- de meningococos B. A própria estirpe é um outro aspeto da invenção.

Embora a mutação siaD- seja preferida pelas razões acima descritas, podem ser utilizadas outras mutações que desligam a síntese capsular do polissacárido de meningococos B. Assim, a estripe de produção de vesículas pode ser modificada geneticamente para regular negativamente, de um modo permanente, a expressão do produto do gene funcional de um ou mais dos seguintes genes: genes ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (equivalente a synX e siaA), synB (equivalente a siaB) ou synC (equivalente a siaC), de um modo preferido, desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminado a totalidade ou parte do promotor e/ou grelha de leitura aberta do gene. A mutação lgtE- pode ser combinada com uma ou mais destas mutações. De um modo preferido, a mutação lgtB- é combinada com uma ou mais dessas mutações. Um outro aspeto da invenção é deste modo uma preparação imunogénica de vesículas como acima descrito que é derivado de uma tal estirpe mutante combinada de meningococos B.

Um locus de Neisseria contendo vários genes igt, incluindo lgtB e lgtE, e a sua sequência são conhecidos na técnica (ver M. P. Jennings et al.f Microbiology 1999, 145, 3013-3021 e as referências aí citadas, e J. Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]).

Quando é utilizado LOS de comprimento total (não truncado) no produto final, é desejável que LOS não seja sialilado (como tal, LOS produz uma resposta imunitária contra as estirpes mais perigosas, invasivas de meningococos B que são também não sialilados). Nesse caso a utilização de uma estirpe de cápsula negativa que possui um gene synA eliminado (equivalente a synX e siaA), synB (equivalente a siaB) ou synC (equivalente a siaC) é vantajosa, como tal uma mutação também torna menB LOS incapaz de ser sialilada.

Nas preparações de vesículas, particularmente nas preparações extraídas com baixas concentrações de DOC de LPS, podem ser utilizadas como um antigénio na composição imunogénica da invenção. É assim vantajoso regular negativamente/eliminar/inativar a função enzimática de lgtE, IgtA (particularmente em combinação com lgtC) ou, de um modo preferido, genes lgtB/produtos de genes de modo a remover estruturas lacto-N-neotetraose de tipo humano. O locus de Neisseria (e suas sequências) compreendendo os genes lgt para a biossíntese de estrutura de oligossacárido de LPS é conhecido na técnica (Jennings et al., Microbiology 1999 145; 3013-3021 e as referências ai citadas, e J. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]). A regulação positiva/deleção de lgtB (ou produto do gene funcional) é preferida uma vez que deixa o epitopo protector de LPS intacto.

Nas preparações de vesícula de N. meningitidis serogrupo B da invenção, a regulação positiva/deleção de ambos siaD e lgtB é preferida, (embora uma combinação de lgtB- com qualquer um de ctrA-, ctrB-, ctrC-, ctrD-, synA- (equivalente a synX- e siaA-) , synB- (equivalente a siaB-) ou synC- (equivalente a siaC-) numa estirpe de produção de vesícula de meningococos B possa também ser utilizada) conduzindo a uma preparação de vesículas com segurança ótima e retenção de epitopo protetor de LPS.

Um outro aspeto da invenção é, deste modo, uma preparação imunogénica de vesícula como descrita acima que é derivada dessa estirpe mutante combinada de meningococos B.

As composições imunogénicas da invenção podem compreender pelo menos, uma, duas, três, quatro ou cinco preparações de vesícula de membrana externa diferentes. Quando são incluídas duas ou mais preparações de OMV, pelo menos, um antigénio da invenção é regulado positivamente em cada OMV. Essas preparações de OMV podem ser derivadas de estirpes de Neisseria da mesma espécie e serogrupo ou, de um modo preferido, de estirpes de Neisseria de diferente classe, serogrupo, serotipo, subserotipo ou imunotipo. Por exemplo, uma composição imunogénica pode compreender uma ou mais preparações de vesículas da membrana ou manbranas externas que contêm LPS de imunotipo L2 e uma ou mais preparações da vesícula de membrana externa que contém LPS de imunotipo L3. As preparações de L2 ou L3 de OMV são, de um modo preferido, derivadas de uma estirpe estável que possui variabilidade de fase minima no locus do gene da síntese de oligossacárido de LPS.

Vesículas de membrana externa combinadas com composições de subunidade

As composições imunogénicas da invenção podem também compreender uma composição de subunidade e uma vesícula de membrana externa. Existem vários antigénios que são particularmente adequados para inclusão numa composição de subunidade devido à sua solubilidade. Exemplos dessas proteínas incluem; FhaB, NspA, domínio de passagem de Hsf, domínio de passagem de Hap, domínio de passagem de AspA, AspA, OMP85, TbpB, LbpB, PilQ. A preparação de vesícula de membrana externa deve possuir, pelo menos, um antigénio diferente selecionado da seguinte lista que foi regulada positivamente de modo recombinante na vesícula de membrana externa: NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA (elevado) , TbpA (baixo), LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC, PilQ, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, MafA, MafB e PldA; e compreendem um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3 .

As composições imunogénicas da invenção que contêm LPS possuirão, de um modo preferido, o LPS conjugado com uma fonte de epitopos T-auxiliares, de um modo preferido, proteínas e, no caso de LPS em OMV, de um modo preferido, proteínas da membrana externa. Uma forma de realização particularmente preferida contém LPS que foi (de um modo preferido, intravesícuias) conjugado a OMP in situ na preparação de vesícula de membrana externa (por exemplo, como descrito acima).

As composições imunogénicas da invenção podem compreender antigénios (proteínas, LPS e polissacáridos) derivados de Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y, W-135 ou Neisseria gonorrhoeae.

De um modo preferido, as composições imunogénicas ou vacinas da invenção não consistem em e/ou compreendem as combinações particulares das SEQ ID listadas na tabela que se estende a partir da página 3, linha 18 até à página 52, linha 2 do documento WO 00/71725 e/ou qualquer combinação individual descrita nos exemplos 1-11 do documento WO 00/71725.

De um modo preferido, quaisquer combinações individualizadas divulgadas no documento WO 01/52885 não são reivindicadas nesta invenção.

Outras combinações A composição imunogénica da invenção pode ainda compreender polissacáridos capsulares bacterianos ou oligossacáridos. Os polissacáridos capsulares ou oligossacáridos podem ser derivados de um ou mais de: Neisseria meningitidis serogrupo A, C, Y e/ou W-135, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococos do Grupo A, Streptococos do Grupo B, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.

Um outro aspeto da invenção são combinações de vacina compreendendo a composição antigénica da invenção com outros antigénios que são vantajosamente utilizados contra determinados estados de doença, incluindo aqueles associadas com vírus ou bactérias Gram-positivas.

Numa combinação preferida, as composições antigénicas da invenção são formuladas com 1, 2, 3 ou, de um modo preferido, todas os 4 dos seguintes polissacáridos capsulares ou oligossacáridos meningocócicos que podem ser simples ou conjugados com uma proteína transportadora: A, C, Y ou W-135. De um modo preferido, as composições imunogénicas da invenção são formuladas com A e C; ou C; ou C e Y. Uma tal vacina contendo proteínas de N. meningitidis, de um modo preferido, serogrupo B, pode ser vantajosamente utilizada como uma vacina geral para meningococos.

Numa outra forma de realização preferida, as composições antigénicas da invenção, de um modo preferido, formuladas com 1, 2, 3 ou todos os 4 dos polissacáridos capsulares simples ou conjugados meningocócicos ou oligossacáridos A, C, Y ou W-135 (como descrito acima), são formulados com um polissacárido capsular conjugado com H. influenzae b ou oligossacárido, e/ou um ou mais polissacáridos capsulares ou oligossacáridos simples ou conjugados de pneumococos. Opcionalmente, a vacina pode também compreender uma ou mais antigénios de proteínas que podem proteger um hospedeiro contra infeção por Streptococcus pneumoniae. Uma tal vacina pode ser utilizada vantajosamente como uma vacina geral para meningite.

Ainda noutra forma de realização preferida, a composição imunogénica da invenção é formulada com polissacáridos capsulares ou oligossacáridos derivados de um ou mais de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae,

Streptococci do Grupo A, Streptococci do Grupo B, Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epldermldls. Os antigénios polissacaridicos capsulares de pneumococos são, de um modo preferido, selecionados de serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (de um modo ainda mais preferido, a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) . Uma outra forma de realização preferida pode conter os polissacáridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae. Uma outra forma de realização preferida iria conter os polissacáridos capsulares de Tipo 5, Tipo 8 ou 336 de Staphylococcus aureus. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de Tipo I, Tipo II ou Tipo III de Staphylococcus epidermidis. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II ou Tipo III do Grupo B de estreptococos. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de estreptococos do Grupo A, de um modo preferido, compreendendo ainda, pelo menos, uma proteína M e, de um modo mais preferido, múltiplos tipos de proteína M.

Esses polissacáridos capsulares podem ser não conjugados ou conjugados com uma proteína transportadora, tal como o toxoide do tétano, fragmento C do toxoide do tétano, toxoide de difteria, CRM197, pneumolisina, Proteína D (documento US6342224). O conjugado polissacarídico pode ser preparado através de qualquer técnica de acoplamento conhecida. Por exemplo, o polissacárido pode ser acoplado através de um ligante tioéter. Este método de conjugação baseia-se na ativação do polissacárido com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O polissacárido ativado pode ser assim acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador a um grupo amino na proteína transportadora. De um modo preferido, o éster de cianato é acoplado com hexanodiamina e o polissacárido derivado de amino é conjugado com a proteína transportadora utilizando a química de heteroligação envolvendo a formação da ligação tioéter. Esses conjugados são descritos na publicação do pedido PCT publicado WO93/15760, Uniformed Services University.

Os conjugados podem também ser preparados por métodos de aminação redutora direta como descrito nos documentos US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos nos documentos EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508. Um outro método envolve o acoplamento de um polissacárido ativado com brometo de cianogénio derivado com hidrazida de ácido adípico (ADH) ao transportador proteico por condensação de carbodiimida (Chu C. et al., Infect. Immunity, 1983 245 256) . Quando são incluídos oligossacáridos, é preferido que estes estejam conjugados.

Antigénios de proteínas de pneumococos preferidos são aquelas proteínas de pneumococos que são expostas à superfície exterior dos pneumococos (capazes de serem reconhecidas pelo sistema imunitário de um hospedeiro durante, pelo menos, parte do ciclo de vida dos pneumococos) ou são proteínas que são segregadas ou libertadas pelos pneumococos. De um modo muito preferido, a proteína é uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2 componentes, ou lipoproteína de Streptococcus pneumoniae ou os seus fragmentos. Proteínas particularmente preferidas incluem, mas não estão limitadas a: pneumolisina (de um modo preferido, destoxifiçadas por tratamento químico ou mutação) [Mitchell et al., Nucleic Acids Res. 11 de julho de 1990; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from

Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al., Biochim Biophys Acta 23 de janeiro de 1989; 1007 (1) : 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", documentos WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.,) WO 99/03884 (NAVA)]; PspA e suas variantes de deleção transmembranar (documento US 5804193 - Briles et al.); PspC e as suas variantes de deleção de transmembrana (documento WO 97/09994 - Briles et al.,); PsaA e as suas variantes de deleção transmembranar (Berry & Paton, Infect Immun dezembro de 1996; 64 (12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adesine essential for virulence of Streptococcus pneumoniae") ; proteínas de ligação a colina de pneumococos e as suas variantes de deleção transmembranar; CbpA e as suas variantes de deleção transmembranar (documentos WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfato - desidrogenase (Infect Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (documento WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína tipo Μ, (documento EP 0837130) e adesina 18627, (documento EP 0834568). Outros antigénios de proteína de pneumococos preferidos, são aqueles divulgados no documento WO 98/18931, particularmente aqueles selecionados nos documentos WO 98/18930 e PCT/US99/30390 . A composição imunogénica/vacina da invenção pode também compreender, opcionalmente, preparações de vesícula de membrana externa produzidas a partir de outras bactérias Gram-negativas, por exemplo, Moraxella catarrhalis ou Haemophilus influenzae.

Preparações de vesícula de Moraxella catarrhalis

As composições imunogénicas da invenção podem compreender ainda preparações de OMV derivadas de Moraxella catarrhalis. Preparações modificadas de OMV podem ser derivadas de Moraxella catarrhalis como descrito no documento W001/09350. Um ou mais dos seguintes genes (que codificam antigénios protetores) são preferidos para a regulação positiva: OMP106 (documentos WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (documento PCT/EP99/03824),

PilQ (documento PCT/EP99/03823), OMP85 (documento PCT/EP00/01468), lipo06 (documento GB 9917977.2), lipolO (documento GB 9918208.1), lipoll (documento GB 9918302.2), lipol8 (documento GB 9918038.2), P6 (documento PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, et al., (1993) Infect. Immun. 61:2003- 2010), D15 (documento PCT/EP99/03822) , OmplAl (documento PCT/EP 99/06781), Hly3 (documento PCT/EP99/03257), LbpA e LbpB (documento WO 98/55606), TbpA e TbpB (documentos WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspAl e UspA2 (documento WO 93/03761), e Omp21. Estes são também preferidos como genes que podem ser introduzidos heterologamente noutras bactérias Gram-negativas.

Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação negativa: CopB, OMP106, OmpBl, TbpA, TbpB, LbpA e LbpB.

Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação negativa: htrB, msbB e lpxK.

Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para a regulação positiva: pmrA, pmrB, pmrE e pmrF.

Preparações de vesículas de Haemophilus influenzae

As composições imunogénicas da invenção podem compreender ainda preparações de OMV derivados de Haemophilus influenza. Preparações modificadas de OMV podem ser derivadas de Haemophilus influenzae como descrito no documento W001/09350. Um ou mais dos seguintes genes (que codificam antigénios protetores) são preferidos para a regulação positiva: D15 (documento WO 94/12641), P6 (documento EP 281673), TbpA (documento WO96/40929; documento WO95/13370), TbpB (documento WO96/40929; WO95/13370), P2, P5 (documento WO 94/26304), OMP26 (documento WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 e Hif (todos os genes neste operão devem ser regulados positivamente de modo a regular positivamente a pilina). Estes são também preferidos como genes que podem ser introduzidos heterologamente noutras bactérias Gram-negativas.

Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação negativa: P2, P5, Hif, IgAl-protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, htrB, msbB e lpxK.

Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação positiva: pmrA, pmrB, pmrE e pmrF. A composição imunogénica/vacina da invenção pode também compreender, opcionalmente, antigénios que proporcionam proteção contra uma ou mais infeções por Difteria, tétano e Bordetella pertussis. A componente de pertussis pode ser células totais mortas de B. pertussis (Pw) ou pertussis acelular (Pa) que contenha, pelo menos, um antigénio (de um modo preferido, 2 ou todos os 3) de PT, FHA e pertactina de 69 kDa. Tipicamente, os antigénios que proporcionaram proteção contra a Difteria e o tétano podem ser o toxoide da Difteria e o toxoide do tétano. Os toxoides podem ser toxinas quimicamente inativadas ou toxinas inativadas pela introdução de mutações pontuais. A composição imunogénica/vacina pode também compreender, opcionalmente, um ou mais antigénios que podem proteger um hospedeiro contra Haemophillus influenzae não tipável, RSV e/ou um ou mais antigénios que podem proteger um hospedeiro contra o virus influenza. Essa vacina pode ser vantajosamente utilizada como uma vacina global para otite média.

Antigénios de proteína de H. influenzae não tipáveis preferidos incluem proteína Fimbrina (documento US 5766608) e fusões compreendendo péptidos destes (e. g., Fusão LB1) (documento US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmwl, Hmw2, Hap e D15.

Antigénios de vírus influenza preferidos incluem vírus totais, vivos ou inativados, vírus da gripe separados, cultivados em ovos ou em células MDCK, ou células Vero ou virossomas da gripe totais (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como as proteínas HA, NP, NA ou M, ou as suas combinações.

Antigénios RSV preferidos (Vírus do Sincício Respiratório) incluem a glicoproteína F, a glicoproteína G, a proteína HN, a proteína M ou os seus derivados.

As composições imunogénicas da invenção podem incluir proteínas de Moraxella catarrhalis incluindo TbpA (documento W097/13785; W099/52947); TbpB (documento W097/13785; W099/52947; Mathers et ai., FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236;

Myers et al., Infect Immun 1998 66; 4183-4192), LbpA, LbpB (Du et al., Infect Immun 1998 66; 3656-3665), UspAl, UspA2 (Aebi et al., Infect Immun. 1997 65; 4367-4377), OMP106 (documento US6214981), receptor dependente de Ton-B (documento WOOO/78968). CopB (Sethi et al., Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671), e receptor HasR (documento WOOO/78968); proteínas de Haemophilus influenzae incluindo HMW (St Geme et al., Infect Immun 1998 66; 364-368), Hia (St Geme et al., J. Bacteriol. 2000 182; 6005-6013), Tbpl (documento WO96/40929; WO95/13370), Tbp2 (documento WO96/40929; WO95/13370; Gray-Owen et al., Infect

Immun 1995 63; 1201-1210), LbpA, LbpB (Schryvers et al., 1989,29:121-130), HasR, receptor dependente de TonB- (Fleishmann et al., Science 1995 269; 496-512), proteína de ligação à hemoglobina, HhuA (Cope et al Infect Immun 2000 68; 4092-4101),

HgpA (Maciver et al., Infect Immun 1996 64; 3703-3712), HgbA,

HgbB e HgbC (Jin et al., Infect Immun 1996 64; 3134-3141), HxuA (Cope et al., Mol Microbiol 1994 13; 863-873), HxuC (Cope et al., Infect Immun 2001 69; 2353-2363); proteínas de Neisseria meningitidis incluindo Tbpl, Tbp2, FbpA, FbpB, BfrA, BfrB (Tettelin et al., Science 2000 287; 1809-1815), LbpA, LbpB e

HmbR.

Formulações de Vacina

Uma forma de realização preferida da invenção é a formulação da composição imunogénica da invenção numa vacina que pode também compreender um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. O fabrico de preparações de vesícula de membrana externa a partir de qualquer das estirpes acima mencionadas modificadas pode ser conseguido através de qualquer um dos métodos bem conhecidos do especialista na técnica. De um modo preferido, são utilizados os métodos divulgados nos documentos EP 301992, US 5597572, EP 11243 ou US 4271147. De um modo muito preferido, é utilizado o método descrito no documento WO 01/09350. A preparação da vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque).

As composições antigénicas da presente invenção podem ser adjuvantadas na formulação de vacina da invenção. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tais como hidróxido de alumínio gel (alúmen) ou fosfato de alumínio, mas podem também ser um sal de cálcio (particularmente carbonato de cálcio), ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacáridos cationicamente ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.

Os sistemas de adjuvante Thl adequados que podem ser utilizados incluem, Monofosforil lípido A, particularmente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado e uma combinação de monofosforil lípido A, de um modo preferido, monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) em conjunto com um sal de alumínio (de um modo preferido, fosfato de alumínio). Um sistema melhorado envolve a combinação de uma monofosforil lípido A e um derivado de saponina particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada no documento WO 94/00153 ou uma composição menos reactogénica, em que QS21 é parada com colesterol como divulgado no documento W096/33739. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21 3D-MPL e tocoferol numa emulsão óleo em água é descrita no documento WO95/17210 e é uma formulação preferida. A vacina pode compreender uma saponina, de um modo mais preferido, QS21. Pode também compreender uma emulsão óleo em água e tocoferol. CpG não metiladas contendo oligonucleótidos (documento WO 96/02555) são também indutores preferidos de uma resposta TH1 e são adequados para utilização na presente invenção. A preparação de vacina da presente invenção pode ser utilizada para proteger ou tratar um mamífero suscetível a infeção, através de uma administração da referida vacina através de via sistémica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através da administração a mucosas nos tratos oral/alimentar, respiratório, geniturinário. Deste modo, é aqui divulgado um método de imunização de um hospedeiro humano contra uma doença causada pela infeção de uma bactéria gram-negativa, cujo método compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotectora da preparação OMV da presente invenção. A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é selecionada numa quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos secundários adversos significativos em vacinas típicas. Esta quantidade irá variar dependendo de quais imunogénicos específicos são empregues e como são apresentados. Geralmente, espera-se que cada dose compreenda 1-100 pg de antigénio proteico ou preparação OMV, de um modo preferido, 5-50 pg e, mais tipicamente, no intervalo de 5-25 pg.

Uma quantidade ótima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos convencionais envolvendo a observação de respostas imunitárias apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

As vacinas da invenção são, de um modo preferido, imunoprotectoras e não tóxicas e adequadas para utilização pediátrica ou em adolescentes.

Por utilização pediátrica entende-se a utilização em crianças com menos de 4 anos de idade.

Por imunoprotectora entende-se que o SBA e/ou modelo de proteção animal e/ou o ensaio de bloqueio de adesão acima descritos são satisfatoriamente conseguidos.

Por não tóxico entende-se que não existe mais do que um nível satisfatório de atividade de endotoxina na vacina como medido pelo bem conhecido LAL e ensaios de pirogenicidade.

Polinucleótidos "Polinucleótido" refere-se, geralmente, a qualquer polirribonucleótido ou polidesoxirribonucleótido, os quais podem ser ARN ou ADN não modificados ou ARN ou ADN modificados. "Polinucleótidos" incluem, sem limitação, ADN de cadeia simples e dupla, ADN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, ARN de cadeia simples e dupla, e ARN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo ADN e ARN que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla. Adicionalmente, "polinucleótido" refere-se a regiões de cadeia tripla compreendendo ARN ou ADN ou ambos ARN e ADN. 0 termo polinucleótido também inclui ADN ou ARN contendo uma ou mais bases modificadas e ADN ou ARN com estruturas modificadas para estabilidade ou por outras razões. As bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases não usuais como inosina. Foram feitas várias modificações ao ADN e ARN; deste modo, "polinucleótido" inclui formas de polinucleótidos quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas como tipicamente se encontram na natureza, assim como as formas químicas de ADN e ARN características de vírus e células. "Polinucleótido" também inclui polinucleótidos relativamente curtos, frequentemente referidos como oligonucleótidos.

Outros aspetos da invenção

Outro aspeto da presente divulgação envolve um método para tratamento ou prevenção de doença de Neisseria compreendendo a administração de uma dose protetora (ou quantidade eficaz) da vacina da invenção a um hospedeiro em sua necessidade. A infeção por Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y ou W135 e/ou Neisseria gonorrhoeae pode ser vantajosamente prevenida ou tratada. A invenção inclui a utilização da vacina da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de prevenção de infeção por Neisseria. De novo a infeção por Neisseria inclui a infeção por Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y, W-135 e/ou Neisseria gonorrhoeae.

Outro aspeto da divulgação é uma estirpe de Neisseria geneticamente manipulada a partir da qual pode ser derivada uma vesícula de membrana externa da invenção (possuindo, pelo menos, duas proteínas da invenção recombinantemente reguladas positivamente, como acima descrito). Estas estirpes de Neisseria podem ser Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae. A estirpe pode também ter sido manipulada (como acima descrito) para regular negativamente a expressão de outras proteínas de Neisseria incluindo a expressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito de LgtB, LgtE, SiaD, OpC, OpA, PorA, FrpB, msbB e HtrB. As combinações preferidas para a regulação negativa incluem a regulação negativa (de um modo preferido, deleção) de, pelo menos, LgtB e SiaD, regulação negativa de, pelo menos, PorA e OpC, regulação negativa de, pelo menos, PorA e OpA e regulação negativa de, pelo menos, PorA, OpA e OpC.

Outros aspetos da invenção são métodos de preparar a composição imunogénica ou vacina da invenção. Estes incluem um método compreendendo um passo de misturar em conjunto, pelo menos, dois antigénios ou proteínas de Neisseria isolados, que podem estar presentes na forma de vesículas derivadas das estirpes de Neisseria da invenção, para preparar uma composição imunogénica da invenção e um método de preparação da vacina da invenção compreendendo um passo de combinação da composição imunogénica da invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Estão também incluídos na invenção, métodos de preparação de uma composição imunogénica da invenção compreendendo um passo de isolar as vesículas de membrana externa da invenção a partir da cultura de Neisseria. Este método pode envolver um outro passo da combinação de, pelo menos, duas preparações de vesículas de membrana externa, de um modo preferido, em que, pelo menos, uma preparação de vesícula de membrana externa contém LPS do imunotipo L2 e, pelo menos, uma preparação de vesícula de membrana externa contém LPS de imunotipo L3. A invenção também inclui estes métodos, em que as vesículas de membrana externa são isoladas por extração com uma concentração de DOC de 0-0,5%. As concentrações de DOC de 0,3%-0,5% são utilizadas para minimizar o conteúdo em LPS. Em preparações de OMV em que LPS é para ser conservado como um antigénio, as concentrações de DOC de 0-0,3%, de um modo preferido, 0,05%-0,2%, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 0,1% são utilizadas para extração.

Vacinas de Células Fantasma ou Completas Mortas A requerente pretende que as melhorias acima na preparação de vesículas e vacinas possam ser facilmente estendidas a preparações e vacinas de células fantasma ou células completas mortas (com vantagens idênticas). As estirpes da invenção Gram-negativa modificadas a partir das quais as preparações de vesículas são feitas podem, também, ser utilizadas para preparar preparações de células fantasma e completas mortas. Os métodos para fazer preparações fantasma (células vazias com envelopes intactos) de estirpes Gram-negativas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, o documento WO 92/01791) . Os métodos de células completas mortas para produzir preparações de células inactivadas para utilização em vacinas são também bem conhecidas. As expressões "preparações de vesículas [ou OMV]" e "vacinas de vesículas [ou OMV]" assim como os processos descritos ao longo deste documento são deste modo aplicáveis aos termos "preparação fantasma" e "vacinas fantasmas", e "preparação de células completas mortas" e "vacina de células completas mortas", respetivamente, para os objetivos desta invenção.

Anticorpos e imunização passiva

Outro aspeto da invenção é um método de preparação de uma imunoglobulina para utilização na prevenção ou tratamento de infeção por Neisseria, compreendendo os passos de imunização de um recetor com a vacina da invenção e isolamento de imunoglobulina do recetor. Uma imunoglobulina preparada por este método é um outro aspeto da invenção. É aqui divulgada uma composição farmacêutica compreendendo a imunoglobulina da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável que podem ser utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença de Neisseria. Um método para o tratamento ou prevenção de infeção por Neisseria compreendendo um passo de administrar a um doente uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é um outro aspeto da divulgação.

Os inóculos para a produção de anticorpo policlonal são tipicamente preparados por dispersão da composição antigénica num diluente fisiologicamente tolerável, tais como solução salina ou outros adjuvantes adequados para utilização humana para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimuladora de inoculo é administrada a um mamífero e o mamífero inoculado é, então, mantido durante um tempo suficiente para a composição antigénica para induzir os anticorpos protetores.

Os anticorpos podem ser isolados na extensão desejada por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade (Harlow and Lane Antibodies; a laboratory manual 1988).

Os anticorpos podem incluir preparações anti-soro a partir de uma variedade de animais normalmente utilizados e. g., cabras, primatas, macacos, suínos, cavalos, cobaios, ratos ou homem. Os animais são sangrados e os soros são recuperados.

Uma imunoglobulina produzida de acordo com a presente divulgação pode incluir anticorpos completos, fragmentos ou subfragmentos de anticorpo. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe e. g., IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dupla para dois ou mais antigénios da invenção. Estes podem também ser fragmentos e. g. F (ab')2, Fab', Fab, Fv e semelhantes incluindo fragmentos hibridos. Uma imunoglobulina também inclui proteínas naturais, sintéticas ou geneticamente manipuladas que atuam como um anticorpo por ligação aos antigénios específicos para formar um complexo.

Uma vacina da presente invenção pode ser administrada a um recetor que atua, então, como uma fonte de imunoglobulina, produzida em resposta à exposição de vacinas específicas. Um indivíduo assim tratado será dador do plasma a partir do qual poderão ser obtidas hiperimunoglobulinaa via metodologia de fracionamento de plasma convencional. A hiperimunoglobulina será administrada ao outro indivíduo de modo a transmitir resistência contra ou tratar infeção por Neisseria. As hiperimunoglobulinas da presente divulgação são particularmente úteis para tratamento ou prevenção de doença de Neisseria em crianças, indivíduos imunocomprometidos ou quando o tratamento é necessário e não existe tempo para o indivíduo produzir anticorpos em resposta à vacinação.

Um aspeto adicional da divulgação é uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais (ou os seus fragmentos; de um modo preferido humano, ou humanizado) reativo contra, pelo menos, dois constituintes da composição imunogénica da invenção, a qual pode ser utilizada para tratar ou prevenir a infeção por bactérias Gram negativas, de um modo preferido, Neisseria, de um modo mais preferido, Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae e, de um modo ainda mais preferido, Neisseria meningitidis serogrupo B.

Estas composições farmacêuticas compreendem anticorpos monoclonais que podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe, e. g. , IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quimérico ou anticorpos híbridos com especificidade para dois ou mais antigénios da invenção. Estes podem também ser fragmentos e. g., F (ab')2, Fab', Fab, Fv, e semelhantes, incluindo fragmentos híbridos.

Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler e Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow e Lane 1988) . Alternativamente, os fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos por rastreio de uma biblioteca de apresentação de fagos adequada (Vaughan TJ et ai., 1998 Nature Biotechnology 16; 535) . Os anticorpos monoclonais podem ser humanizados ou parcialmente humanizados por métodos conhecidos.

Os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende" são aqui pretendidos pela requerente para serem opcionalmente substituíveis com as expressões "consistindo em", "consistem em", e "consiste em", respetivamente, em cada caso. Método de Aplicação Industrial da Invenção

Os exemplos a seguir são realizados utilizando técnicas convencionais, as quais são bem conhecidas e de rotina para os especialistas na técnica, exceto se descrito de outro modo em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam a invenção.

Exemplo 1: Métodos para a construção de estirpes de Neisseria meningitidis serogrupo B utilizadas nas preparações de vesículas de membrana externa 0 documento W001/09350 proporciona métodos detalhados para preparar vesículas de membrana externa e manipular as estirpes bacterianas a partir das quais as vesículas de membrana externa são derivadas. Quando as vesículas de membrana externa são para reter lipoproteínas, tais como TbpB e ou lipopolissacáridos, os métodos de isolamento com níveis de desoxicolato baixos ou inexistentes são preferidos.

Exemplo 2; Regulação positiva do antigénio proteico Hsf numa estirpe recombinante de Neisseria meningitidis serogrupo B sem genes cps funcionais mas que expressam PorA.

Como descrito nos exemplos do documento W001/09350, em determinados países, a presença de PorA em vesículas de membrana externa pode ser vantajosa e pode fortalecer a eficácia da vacina de vesículas recombinantes melhoradas. No exemplo que se segue, utilizou-se um vetor pCMK(+) modificado para regular positivamente a expressão da antigénio proteico Hsf numa estirpe sem genes cps funcionais mas que expressa PorA. 0 vetor pCMK(+) original contém um promotor quimérico porA/lacO reprimido em hospedeiros E. coli que expressam laclq mas é transcricionalmente ativo em Neisseria meningitidis. No pCMK(+) modificado, o promotor porA nativo foi utilizado para conduzir a transcrição do gene hsf. A codificação do gene para Hsf foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleótidos iniciadores HSF Ol-Ndel e HSF 02-NheI, apresentados na tabela a seguir. Devido à sequência do iniciador de HSF 01-JVdeI a proteína Hsf expressa irá conter dois resíduos de metioninas na extremidade 5' . As condições utilizadas para amplificação por PCR foram as descritas pelo fornecedor (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Os ciclos térmicos foram os seguintes: 25 vezes (94 2C 1 min., 48 2C 1 min., 72 2C 3 min.) e 1 vez (72 2C, 10 min., 4 2C até recuperação). O amplicão correspondente foi subsequentemente clonado nos correspondentes sítios de restrição do vector de distribuição pCMK(+). Neste plasmídeo recombinante, designado pCMK(+)-Hsf, removeu-se o lacO presente no promotor quimérico porA/lacO através de uma estratégia de PCR recombinante. O plasmídeo pCMK(+)-Hsf foi utilizado como um molde para amplificar por PCR 2 fragmentos de ADN separados: - fragmento 1 contém a região 5' recombinogénica porA, o gene de resistência a Canamicina e o promotor porA. Os oligonucleótidos iniciadores utilizados, RPl(SacII) e RP2, estão apresentados na tabela a seguir. 0 iniciador RP1 é homólogo da sequência mesmo a montante do operador lac. — fragmento 2 contém a sequência Shine-Dalgarno do gene porA, o gene hsf e a região recombinogénica 3' porA. Os oligonucleótidos iniciadores utilizados, RP3 e RP4(ApaI), são apresentados na tabela a seguir. 0 iniciador RP3 é homólogo da sequência mesmo a jusante do operador lac. A extremidade 3' do fragmento 1 e a extremidade 5' do fragmento 2 tem 48 bases de sobreposição. 500 ng de cada PCR (1 e 2) foram utilizados para

uma reação de PCR final utilizando os iniciadores RP1 e RP4. O amplicão final obtido foi subclonado no vetor pSL1180 digerido com SacII e Apal. O plasmídeo modificado pCMK(+)-Hsf foi purificado em larga escala utilizando o QIAGEN maxiprep kit e 2 pg deste material foram utilizados para transformar uma estirpe de Neisseiria meningitidis serogrupo B sem genes cps funcionais. De modo a preservar a expressão de porA, a integração resultante de um única "recombinação cruzada" foi selecionada por uma combinação de procedimentos de rastreio de PCR e transferência de Western. Os clones resistentes a canamicina testaram positivos por PCR especifico para porA- e transferência de western, foram armazenados a -70 2C como stocks de glicerol e utilizados para outros estudos. As bactérias (correspondente a cerca de 5,108 bactérias) foram ressuspensas em 50 mL de tampão PAGE-SDS, congeladas (-20 2C)/fervidas (100 2C) três vezes e, então, foram separadas por electroforese PAGE-SDS num gel a 12,5%. A expressão de Hsf foi examinada em derivados de lisados de células bacterianas completas (WCBL) de NmB [Cps-, PorA+] ou NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. A coloração com Coomassie detectou um aumento significativo na expressão de Hsf (no que respeita ao nível de Hsf endógeno) . Este resultado confirma que o vetor pCMK(+)-Hsf modificado é funcional e pode ser utilizado com sucesso para regular positivamente a expressão de proteínas da membrana externa, sem abolir a produção da proteína principal PorA do antigénio da membrana externa.

Oligonucleótidos utilizados neste trabalho:

Exemplo 3 ;_Regulação positiva do gene_tbpA de N. meningitidis serogrupo B por substituição do promotor.

0 objetivo da experiência foi substituir a região do promotor endógeno do gene tbpA pelo promotor forte porA, de modo a regular positivamente a produção do antigénio TbpA. Para esse objetivo, foi construído um plasmídeo de substituição do promotor utilizando metodologias de clonagem de E. Coli. Uma região de ADN (731 pb) localizada a montante da sequência codificante de tbpA foi verificada na base de dados privada Incyte PathoSeq da estirpe de Neisseria meningitidis ATCC 13090. Este ADN contém a sequência codificante para o antigénio TbpB. Os genes são organizados num operão. O gene tbpB será removido e substituído pela cassete do promotor CmVporA. Para esse fim, um fragmento de ADN de 3218 bp, correspondente a 509 bp da região de flanco 5' do gene tbpB, a sequência codificante de 2139 bp de tbpB, a sequência intergénica de 87 bp e os primeiros 483 nucleótidos da sequência codificante de tbpA foi amplificado por PCR a partir do ADN genómico de Neisseria meningitidis serogrupo B utilizando os oligonucleótidos BAD16 (5'- GGC CTA GCT AGC CGT

CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC- 3') e BAD17 (5'-GGC CAA GCT TCC GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') contendo sequências de incorporação e NheI e HindIII sítios de restrição (sublinhado) . Este fragmento de PCR foi limpo com um High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Alemanha) e diretamente clonado num vetor pGemT (Promega, EUA) . Este plasmídeo foi submetido a mutagénese por PCR circular (Jones & Winistofer (1992)) de modo a (i) inserir sítios de restrição adequados permitindo a

clonagem de uma cassete do promotor CmR/PorA e (ii) para remover 209 bp da sequência de flanco 5' tbpB e da sequência codificante de tbpB. O PCR circular foi efectuado utilizando os oligonucleótidos BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT

CTC AAG AAA CCG-3') & 0 BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G -3') contendo os sítios de restrição adequados Xmal, BglII e XhoI (sublinhado). A cassete de promotor CmR/PorA foi amplificada a partir do plasmídeo pUC D15/Omp85 previamente descrito, utilizando os iniciadores BAD21 (5'- GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') & BAD20 (5'- TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3' ) contendo os sítios de restrição adequados Xmal, SpeI, BglII e XhoI (sublinhado) . Este fragmento de PCR foi clonado no plasmídeo do PCR circular. Este plasmídeo será utilizado para transformar as estirpes Neisseria meningitidis serogrupo B (cps-) e [cps- porA-] . A integração por dupla "recombinação cruzada" na região a montante de tbpA dirigirá a inserção do promotor porA diretamente a montante do ATG de tbpA.

Exemplo 4: Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B regulada positivamente para a expressão de dois antigénios: TbpA e Hsf. 0 objetivo da experiência foi regular positivamente a expressão de TbpA e Hsf, simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de TbpA foi regulada positivamente pela substituição da sua região de promotor endógeno pelo forte promotor porA (substituição do promotor). Neste contexto, o gene tbpB, localizado a montante de tbpA é removido e a proteína TbpB deixa de estar presente na membrana externa. A expressão de Hsf foi regulada positivamente por inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente no locus porA (distribuição de genes) . Ambas as estirpes foram descritas numa patente separada referida como documento W001/09350. Os marcadores de seleção utilizados em ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram a combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante Nm.B cps-/TbpA+/PorA+ pelo protocolo do Genomic tip 500-G da Qiagen. Dez pg de ADN foram digeridos o/n com a enzima de restrição Drain e utilizados para transformar Neisseria meningitidis serogrupo B pelo protocolo de transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram a NmB cps-/Hsf+/PorA+ recombinante (recombinação homóloga por 1 recombinação cruzada no locus porA) ou NmB cps-/Hsf+/PorA-recombinante (Troca alélica/recombinação homóloga por 2 recombinação cruzada no locus porA) . Estas foram plagueadas de um dia para o outro em agar GC contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas até OD6so= 0,1 no meio líguido GC com 10 mM de MgCÍ2 e incubadas 6 horas, a 37 2C, sob agitação vigorosa com 10 pg de ADN genómico digerido com Drain. Neisseria meningitidis recombinante resultante de um duplo evento de recombinação cruzada (rastreio por PCR) foi selecionada em meio GC contendo 200 pg/mL de canamicina e 5 pg/mL de cloranfenicol e analisada pela expressão de TbpA e Hsf nas preparações de OMV. Como representado na Figura 1, a produção de TbpA e Hsf foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe recombinante TbpA/Hsf NmB guando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-. O nível de sobre-expressão de cada proteína no duplo recombinante é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. O nível de sobre-expressão de TbpA e Hsf foi comparável nas estirpes PorA+ e PorA- (dados não apresentados). Todos juntos, estes dados demonstram gue: (i) a expressão de TbpA e Hsf pode ser conjunta e concomitantemente positivamente regulada em N. meningitidis e (ii) as vesículas recombinantes enriquecidas em TbpA e Hsf podem ser obtidas e utilizadas para imunização.

Exemplo 5: Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B positivamente regulada para a expressão de dois antigénios: TbpA e NspA. 0 objetivo da experiência foi regular positivamente a expressão de TbpA e NspA simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de TbpA foi regulada positivamente substituindo a sua região de promotor endógeno pelo forte promotor porA (substituição do promotor). A expressão de NspA foi regulada positivamente pela inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente no locus porA (distribuição de genes). Ambas as estirpes individuais foram descritas numa patente separada, documento W001/09350. Os marcadores de selecção utilizados em ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram a combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante NmB cps-/TbpA+/PorA+ pelo protocolo do Genomic tip 500-G da Qiagen. Dez pg de ADN foram digeridos de um dia para o outro com a enzima de restrição Aatll e utilizada para transformar Neisseria meningitidis serogrupo B pelo protocolo de transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram NmB cps-/NspA+/PorA- recombinantes. Estas foram plaqueadas de um dia para o outro no agár GC contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas para a OD650 = 0 , 1 em meio GC líquido com 10 mM de MgCÍ2, e incubadas 6 horas, a 37 2C, sob agitação vigorosa com 10 yg de ADN genómico digerido com AatlI. Neisseria meningitidis recombinante resultante de um evento de duplo "recombinação cruzada" (rastreio por PCR) foram selecionadas no meio GC contendo 200 yg/mL de canamicina e 5 yg/mL cloranfenicol e analisadas para a expressão de TbpA e NspA em preparações de OMV. A produção de TbpA e NspA foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe TbpA/NspA recombinante NmB quando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-. O nível de sobre-expressão de cada proteína nos recombinantes duplos é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. Todos juntos, estes dados demonstram que: (i) a expressão de TbpA e NspA pode ser conjunta e concomitantemente regulada positivamente em N. meningitidis e (ii) as vesículas recombinantes enriquecidas para TbpA e NspA podem ser obtidas e utilizadas para imunização.

Exemplo 6: Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B regulada positivamente para a expressão de dois antigénios: NspA e D15/Omp85. O objetivo da experiência foi a regulação positiva da expressão de NspA e D15/Omp85 simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de D15/Omp85 foi regulada positivamente por substituição da região do seu promotor endógeno pelo promotor forte porA (substituição do promotor). A expressão de NspA foi regulada positivamente pela inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente ao locus porA (distribuição de genes). Ambas as estirpes foram descritas numa patente separada, documento W001/09350. Os marcadores de selecção utilizados em ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram uma combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante NmB cps-/D15-Omp85/PorA+ pelo protocolo da Qiagen Genomic tip 500-G. Dez pg de ADN foram digeridos de um dia para o outro com a enzima de restrição Aatll e utilizada para transformar Neisseria meningitidis sorogrupo B pelo protocolo transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram NmB cps-/NspA+/PorA-recombinantes. Estas foram plaqueadas de um dia para o outro em GC agar contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas até OD6so = 0,1 em meio líquido GC com 10 mM de MgCÍ2, e incubadas 6 horas, a 37 2C, sob agitação vigorosa com 10 pg de ADN genómico digerido com AatlI. A Neisseria meningitidis recombinante resultante de um duplo evento de recombinação cruzada (rastreio por PCR) foram selecionados em meio GC contendo 200 pg/mL de canamicina e 5 pg/mL de cloranfenicol e analisado para a expressão de NspA e D15/Omp85 em preparações de OMV. A produção de NspA e D15/Omp85 foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe recombinante NspA/D15-Omp85 NmB quando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-, O nível de sobre-expressão de cada uma das proteínas no duplo recombinante é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. Todos juntos, estes dados demonstram que: (i) a expressão de NspA e Omp85 pode ser conjunta e concomitantemente regulada positivamente na N. meningitidis e (ii) vesículas recombinantes enriquecidas para NspA e Omp85 podem ser obtidos e utilizados para imunização.

Exemplo 7: Produção e purificação de formas de Hsf recombinantes em E. coli A análise de computador da proteína tipo Hsf de Neisseria meningitidis divulga, pelo menos, quatro domínios estruturais. Considerando a sequência de Hsf da estirpe H44/76 como uma referência, o Domínio 1, compreendendo o aminoácido 1 a 51, codifica um péptido sinal dependente de see característico da família de autotransportadores, o Domínio 2, compreendendo os aminoácidos 52 a 473, codificam o domínio de passagem para provavelmente serem expostos à superfície e acessíveis ao sistema imunitário, o Domínio 3, compreendendo os aminoácidos 474 a 534, que codificam um domínio putativo de espiral superenrolada necessário para uma oligomerização de proteína e uma charneira (pescoço), o Domínio 4, compreendendo os resíduos 535 ao terminal C, é deduzido como codificando cadeias beta para provavelmente montar uma estrutura tipo barril e para ser ancorado na membrana externa (Henderson et al., (1998), Trends

Microbiol. 6: 370-378; Hoiczyk et al., (2000), EMBO 22: 5989-5999). Uma vez que os domínios 2 e 3 são para provavelmente serem expostos à superfície, são bem conservados (mais do que 80% em todas as estirpes testadas; como descrito em Pizza et al., (2000), Science 287: 1816-1820), estes representam interessantes candidatos a vacinas. Para esse fim, o domínio 2 (referido como domínio de passagem de Hsf) e o domínio 2 + 3 (referido como pescoço de Hsf + domínio de espiral superenrolada) foram expressos em, e purificados, a partir de E. coli. Os fragmentos de ADN que codificam os aminoácidos 52-473 (Hsf de passagem) e 52-534 (Hsf n+cc) foram amplificados por PCR utilizando oligonucleótidos que adicionam os sítios de restrição terminais Real (iniciador direto) e Xhol (iniciador inverso). Os amplicões purificados foram digeridos com Real/Xhol nas

condições recomendadas pelo fornecedor e foram subsequentemente clonados nos sítios Ncol (compatíveis com Real) /Xhol do vetor de expressão de E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Os plasmídeos recombinantes foram selecionados e utilizados para preparar plasmídeos recombinantes purificados. Para o estudo de expressão, estes vetores (pET-Hsf pas & pET-Hsf ncc) foram introduzidos na estirpe de Escherichia coli B121DE3 (Novagen), em que, o gene para a polimerase de T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável por isopropil-beta-D tiogalactósido (IPTG). As culturas líquidas (700 mL) da estirpe recombinante de E. coli Novablue (DE3) [pET-24bBASB029] foram cultivadas, a 37 2C, sob agitação até a densidade óptica a 600 nm (D0600) atingir 0,6. Nesse ponto, foi adicionado IPTG a uma concentração final de 1 mM e a cultura foi cultivada por mais 4 horas. A cultura foi, então, centrifugada a 10000 rpm e o precipitado foi congelado a -20 2C durante, pelo menos, 10 horas. Após descongelar, o precipitado (680 mL de cultura) foi ressuspenso durante 30 minutos, a 22 2C, em 20 mM tampão fosfato pH 7,0 antes da lise das células por duas passagens através de um disruptor Rannie. As células lisadas foram precipitadas 30 min, a 15000 rpm, (Beckman J2-HS centrífuga, JA-20 rotor) a 4 2C. O sobrenadante foi aplicado a uma coluna Q-Sepharose de fluxo rápido (Pharmacia) equilibrada em 20 mM de Tris-HCl tampão pH, 8,0. Após passagem do fluxo, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão a 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. A proteína recombinante foi eluída a partir da coluna com 250 mM de NaCl em tampão a 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. As frações positivas para o antigénio, foram misturadas e dialisadas de um dia para o outro contra tampão 20 mM de fosfato a pH 7,0. Foram adicionados 0,5 M de NaCl e 20 mM de Imidazole à amostra dialisada. A amostra foi então aplicada numa coluna Ni-NTA Agarose (Qiagen) equilibrada em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0 contendo 500 mM de NaCl e 20 mM de Imidazole. Após passagem do fluxo, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão 20 mM de fosfato pH 7,0 contendo 500 mM de NaCl e 20 mM de Imidazole. Os contaminantes foram eluidos com 100 mM de Imidazole em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0. A proteína recombinante foi eluída a partir da coluna com 250 mM de Imidazole em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0. As frações positivas para o antigénio foram misturadas e dialisadas versus tampão a 10 mM de fosfato pH 6,8 contendo 150 mM de NaCl. Como apresentado na figura 2, uma proteína tipo Hsf de passagem enriquecida (pureza estimada em mais do que 90% puro em SDS-PAGE corada com CBB), migra até por volta dos 47 kDa (massa molecular relativa estimada), foi eluída a partir da coluna. Este polipéptido foi reativo contra um anticorpo monoclonal de murganho produzido contra o motivo de 5-histidinas. Em conjunto, estes dados indicam que os genes de Hsf de passagem e Hsf ncc podem ser expressos e purificados numa forma recombinante em E. coli.

Exemplo 8: Produção e purificação de Hap de passagem recombinante em E. coli A análise computorizada da proteína tipo Hap de Neisseria meningitidis divulga, pelo menos, três domínios estruturais. Considerando a sequência do tipo Hap da estirpe H44/7 6 como uma referência, o Domínio 1, compreendendo o aminoácido 1 a 42, codifica um péptido sinal dependente de see característico da família de autotransportadores, o Domínio 2, compreendendo os aminoácidos 43 a 950, codificam o domínio de passagem para provavelmente ser exposta à superfície e estar acessível ao sistema imunitário, o Domínio 3, compreendendo os resíduos 951 até ao terminal C (1457), é deduzido como codificando cadeias beta para provavelmente montar uma estrutura tipo barril e para ser ancorado na membrana externa. Uma vez que o domínio 2 é para provavelmente, ser exposto à superfície, é bem conservado (mais do que 80% em todas as estirpes testada) e pode ser produzido como antigénios de subunidade em E. coli, representa um interessante candidato a vacinas. Uma vez que os domínios 2 e 3 são, provavelmente, para ser expostos à superfície, são bem conservados (mais do que 80% em todas as estirpes testadas; como descrito em Pizza et al. , (2000), Science 287: 1816-1820), estes representam interessantes candidatos a vacinas. Para esse objetivo, o domínio 2 (referido como domínio de Hap de passagem foi expresso em e purificado a partir de E. coli. Um fragmento de ADN que codifica os aminoácidos 43-950 (Hap de passagem) foi amplificado por PCR utilizando oligonucleótidos que adicionam os sítios de restrição terminais Nco I (iniciador direto) e XhoI (iniciador inverso). Os amplicões purificados foram digeridos com Ncol/Xhol nas condições recomendadas pelo fornecedor e foram subsequentemente clonadas nos sítios Ncol/Xhol do vetor de expressão em E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Os plasmídeos recombinantes foram selecionados e purificados em larga escala. Para o estudo de expressão, estes vetores (pET-Hap de passagem) foram introduzidos na estirpe de Escherichia coli B121DE3 (Novagen), em que, o gene para a polimerase T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável por isopropilo-beta-D-tiogalactósido (IPTG).

Cultura de E. coli BL21[pET-Hap de passagem] em fermentador:

Uma alíquota da fração (100 pL) da cultura mãe foi espalhada em placas FEC013AA (Peptona de soja A3 20 g/L, extrato de levedura a 5 g/L, NaCl a 5 g/L, Agar a 18 g/L, H20 destilada até 1 L) e cultivada 20 horas a 37 2C. A camada bacteriana foi recolhida e ressuspensa em água estéril contendo NaCl a 0,9%. Esta solução foi utilizada para inocular um fermentador de 20 L utilizado no modo descontinuo em meio FEC011AC (Peptona de Soja 24 g/L, Extrato de levedura 48 g/L, MgS04/7H20 0,5 g/L, K2HP04 2 g/L,

NaH2P04/2H20 0,45 g/L, Glicerol (87%) 40 g e H20 destilada até 1 L) . Temperatura (30 2C) , pH (6,8, NaOH a 25% /H3P04 a 25%), pressão (500 mbar) foram mantidos constantes e o arejamento foi fixo em 20 L/min. Nestas condições a pressão de dissolução de oxigénio foi mantida a 20% fixando a agitação em (100 a 1000 rpm) . O indutor (IPTG, 1 mM) foi adicionado após 8 horas de crescimento (DO = 27,8). As amostras (6 L) foram recolhidas após 6 horas (DO = 49,2) e 16H30 (DO = 48,6), a biomassa foi recolhida por centrifugação e os precipitados correspondentes armazenados a -20 2C.

Purificação de Hap de passagem: O HAP de passagem foi purificado a partir de um fermentador em modo descontinuo. Foi desenvolvido um esquema de purificação (ver a seguir).

Prensa Francesa (Tris a 50 mM/EDTA a 5 mM, pH 8,0)

I 30' a 10000 rpm (JA10)

I

solubilizar precipitado em Pi a 20 mM/ureia a 8 M, pH 7,0 1 H em agitação à TA l 30' a 10000 rpm (JA10)

I

SP-Sepharose-XL

Pi a 20mM/Ureia a 8 M; eluição +/-50 mM de NaCl

I

Sepharose-FF-Cu++ quelante

Pi a 20 mM/NaCl a 0,5 Μ/Ureia a 8 M; eluição + /- 100 mM de imidazole

I

Diálise (PBS pH 6,8/arginina a 0,5 M)

I filtração estéril A maior parte do Hap de passagem é recuperada no precipitado da centrifugação após rutura das células. A solubilização foi tornada possível com ureia 8 M. Apesar da cauda de His N-terminal, IMAC não esteve operacional como l2 passo, mas bem após um primeiro passo no permutador catiónico SP-XL. Nesta SP-Sepharose-XL, a proteína é eluída quantitativamente no meio de um gradiente linear de NaCl (0-250 mM) . A IMAC foi realizada com Sepharose FF Quelante carregada com Cu++, como for FHAb. Desta vez, contrariamente a FHAb, a IMAC mostra um significativo fator de purificação. Em SDS-PAGE ο HAP2/3 parece puro após IMAC. O pico de HAP2/3 foi no entanto muito largo em gradiente 0-200 mM de imidazole, de modo que se tentou a eluição por passos de imidazole (10 mM-100 mM) ; o modo do gradiente parece, no entanto, mais eficiente em termos de pureza. Como passo final, tentou-se a troca do tampão ureia-para-arginina através de permeação em gel, no entanto, neste caso a proteína eluiu em dois picos. Estes dois picos mostram um perfil comparável em SDS-PAGE; deste modo pode ser colocada a hipótese de que é devido a um rearranjo parcial do HAP de passagem. Voltou-se, então, à diálise clássica como passo final para a troca de tampão. A análise de SDS-PAGE mostra uma boa pureza do material final (ver na figura 3) . A pureza do HAP de passagem é ainda confirmada por WB anti-his. É reconhecido por anti-FL coli. É encontrado um peso molecular de 96,1 KD.

Exemplo 9: Produção e purificação de formas de FrpA/C recombinantes em E. coli

Neisseria meningitidis codifica duas proteínas RTX, referidas como FrpA & FrpC segregadas após limitação de ferro (Thompson et ai., (1993) J. Bacteriol . 175:811-818; Thompson et ai., (1993) Infect. Immun. 61:2906-2911). A família de

proteínas RTX (Repetição de ToXina) tem, em comum, uma série de 9 aminoácidos repetidos próximo do seu C-terminal com o consenso: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa. (LXGGXGN/dDX) . Supõe-se gue as repetições em E. coli HlyA são o sítio de ligação de Ca2+. Como representado na Figura 4, as proteínas meningocócicas FrpA e FrpC, como caracterizadas na estirpe FAM20, partilham uma extensa semelhança de aminoácidos na sua região central e C-terminal, mas uma semelhança muito limitada (se alguma) no N-terminal. Além disso, a região conservada entre FrpA e FrpC exibe algum polimorfismo devido a repetição (13 vezes em FrpA e 43 vezes em FrpC) de um motivo de 9 aminoácidos. Para avaliar o potencial da vacina de FrpA & FrpC, produziu-se recombinantemente em E. coli regiões de proteína conservadas entre FrpA e FrpC. Com esse objetivo, um segmento de ADN cobrindo os aminoácidos 277 a 1007 (no gue respeita à seguência peptídica de FAM20 de N. meningitidis) foi amplificado por PCR a partir do genoma de N. meningitidis serogrupo B H44/76 utilizando (o iniciador direto FrpA-19 (5'-CTCGAGACCATGGGCAAA TAT CATGTCTACGACCCCCTCGC-3' ) e o iniciador reverso FrpA-18 (3'-GTG CATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3'). Três amplicões de respectivamente -1530 pb (3 repetições), -2130 pb (13 repetições) e 2732 pb (23 repetições) foram obtidos e digeridos com as endonucleases de restrição Nco I e Sal I. Estes fragmentos foram, então, inseridos nos sítios Ncol/Xhol (compatíveis com Sail) de pET24d e os plasmídeos recombinantes (pET-Frp3, pET-Frpl3 e pETFrp23, respetivamente) foram selecionados e utilizados para transformar células de E. coll BL21DE3. Como representado na figura 5, todas as três construções produziram domínios conservados recombinantes de FrpA/C após indução. Além disso, o aumento do número de repetições aumentou a solubilidade da proteína recombinante, como determinado por análise de fracionamento de células (dados não apresentados).

Purificação do domínio conservado de FrpA/C contendo 23 repetições do nonapéptido LXGGXGN/DDX (911 aa no total): Foram cultivados 3,5 litros de E. coll B121DE3[pET-Frp23] e induzidos durante 4 horas por adição de 2 mM de IPTG quando a DO atingiu 0,6. As células foram recolhidas por centrifugação e o precipitado correspondente foi rebentado por pressão, clarificado por centrifugação e o correspondente sobrenadante aplicado numa coluna de afinidade com o ião metálico Ni2+ (Ni-NTA-agarose, Qiagen GmBh). Foi utilizado imidazole para eluição e foi finalmente removido por diálise extensa contra 10 mM de fosfato de Na com pH 6,8, 150 mM de NaCl.

Exemplo 10; Produção e purificação de formas de FHA recombinante em E. coli

Clonagem de uma FhaB truncada de N. meningitidis 0 ADN genómico foi extraído a partir de IO10 células de estirpe de N. meningitidis serogrupo B H44/76 utilizando o kit de extração do ADN genómico da QIAGEN (Qiagen Gmbh) . Este material (1 pg) foi, então, submetido a amplificação de ADN por Reacção de Polimerização em Cadeia utilizando os seguintes iniciadores específicos do gene FhaB: JKP: 5ΆΑΤ GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3' e 57 JKP 5'CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3' . Um fragmento de ADN de cerca de 4200 pb, que codifica os primeiros 1433 aminoácidos N-terminais da proteína, foi obtido, digerido pelas endonucleases de restrição Ndel/Spel e inserido nos sítios correspondentes do MCS de pMG (derivado de pMG, Proc Natl Acad Sci USA Jan de 1985; 82 (1) : 88-92) utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edição, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989).). A sequência de ADN do fragmento FhaB clonado foi determinada utilizando o Big Dye Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) e urn sequenciador de ADN ABI 373A/PRISM (ver fig. 1) . 0 plasmideo pMG-FhaB recombinante (1 pg) foi, então, submetido a amplificação de ADN por Reacção de Polimerização em Cadeia utilizando os iniciadores específicos FhaB (XJKP03 5'AATGGAATACATATGAATAAAGGTTTAC ATCGCATTATCTTTAG3' e XJKP5702 5'GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAG ATAGG3'). Foi obtido um fragmento de ADN de 4214 pb, digerido pelas endonucleases de restrição Ndel/Xhol e inserido nos sítios correspondentes do vetor de clonagem/expressão pET-24b (Novagen) utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edição, Eds: Sambrook, Fritsch &

Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). A sequenciação de confirmação do pET-24b recombinante contendo o FhaB truncado (pET24b/FhaB2/3) foi efetuada utilizando o kit Big Dyes (Applied biosystems) e análise num sequenciador de ADN ABI 373/A nas condições descritas pelo fornecedor. A sequência de nucleótidos resultante é apresentada na Figura 6.

Expressão e purificação de proteína FhaB recombinante truncada em Escherichia coli. A construção do vetor de clonagem/expressão pET24b/FhaB2/3 foi descrita acima. Este vetor comporta o gene FhaB truncado isolado a partir da estirpe H44/76 em fusão com uma cadeia de 6 resíduos de Histidina (no C-terminal do produto recombinante) , colocado sob o controlo do forte promotor do bacteriófago T7 gene 10. Para o estudo da expressão, este vetor foi introduzido na estirpe de Escherichia coli Novablue (DE3) (Novagen), nas quais, o gene para a polimerase T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável pelo isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) . As culturas líquidas (100 mL) da estirpe de E. coli Novablue (DE3) [pET24b/FhaB2/3] recombinante foram cultivadas a 37 2C, sob agitação, até a densidade ótica a 600 nm (DO 600) atingir 0,6. Nesse ponto, foi adicionado IPTG a uma concentração final de 1 mM e a cultura foi cultivada por mais 4 horas. A cultura foi então centrifugada a 10000 rpm e o precipitado foi congelado, a -20 2C, durante, pelo menos, 10 horas. Após descongelar, o precipitado foi ressuspenso durante 30 min, a 25 2C, em tampão A (cloridrato de guanidina 6 M, NaH2P04 0, 1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0), passado três vezes através de uma agulha e clarificado por centrifugação (20000 rpm, 15 min). A amostra foi então aplicada a uma taxa de fluxo de 1 mL/min numa coluna

Hitrap com Ni2+ (Pharmacia Biotech). Após passagem do fluxo, a coluna foi lavada sucessivamente com 40 mL de tampão B (Ureia

8 M, NaH2P04 0, 1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0), 40 mL de tampão C (Ureia 8 M, NaH2P04 0, 1 M, Tris 0,01 M, pH 6,3) . A proteína FhaB2/3/His6 recombinante foi então eluída da coluna com 30 mL de tampão D (Ureia 8 M, NaH2P04 0, 1 M, Tris 0,01 M, pH 6,3) contendo 500 mM de imidazole e foram recolhidas frações de 3 mL. Como apresentado na figura 7, uma proteína FhaB-2/3/His6 altamente enriquecida, que migra por volta dos 154 kDa (massa molecular relativa estimada), foi eluída da coluna. Este polipéptido foi reativo contra um anticorpo monoclonal de murganho produzido contra o motivo 5-histidina. Em conjunto, estes dados indicam que a FhaB2/3 pode ser expressa e purificada sob uma forma recombinante em E.coli.

Imunização de murganhos com FhaB2/3/His recombinante A proteína FhaB2/3/His6 recombinante parcialmente purificada expressa em E. coli foi injetada três vezes em murganhos Balb/C nos dias 0, 14 e 29 (10 animais/grupo) . Os animais foram injetados pela via subcutânea com cerca de 5 pg de antigénio em duas diferentes formulações: adsorvidas em 100 pg de A1P04 ou formuladas em emulsão SBAS2 (emulsão SB62 contendo 5 pg de MPL e 5 pg de QS21 por dose). Um grupo de controlo negativo consistindo em murganhos imunizados com apenas a emulsão SBAS2 foi, também, adicionado na experiência. Os murganhos foram sangrados nos dias 29 (15 dias Pós II) e 35 (6 dias Pós III) de modo a detetar anticorpos anti-FhaB específicos. Os anticorpos anti-FhaB específicos foram medidos em soros misturados (de 10 murganhos/grupo) por ELISA na FhaB2/3/His recombinante purificada.

Exemplo 11: Atividades de blogueio de adesão de soros de murganho e de coelho produzidas contra os antigénios FHA, Hap e Hsf

As proteínas homólogas com as tipo FHAB, tipo Hsf e tipo Hap meningocócicas foram descritas previamente como sendo importantes determinantes de virulência e para mediar a adesão bacteriana de Bordetella pertussis (FHA) e Haemophilus influenza (Hap e Hsf) . A adesão a células epiteliais e endoteliais é conhecida como sendo crucial para a colonização das nasofaringes e cruzamento da barreira hemato-encefálica pelos meningococos. Deste modo, a interferência com a adesão de N. meningitidis representa uma abordagem valiosa para controlar a colonização e infeção meningocócica. Aqui testou-se se os anti-soros dirigidos contra os antigénios meningocócicos FHAB 2/3- tipo Hap e tipo Hsf foram capazes de interferir com a adesão de Neisseria meningitidis a células endoteliais. Foi utilizado o seguinte procedimento experimental:

Inibição da adesão a HUVEC: a estirpe meningocócica de teste utilizada neste estudo foi um derivado não capsulado, não piliado, Opa- e Opc- da estirpe NmA8013. As células meningocócicas (2.10E5 unidades formadoras de colónias (CFU) do derivado NmA8013) foram incubadas durante 30 minutos, a 37 2C, num meio composto por 400 pL de RPMI, 50 pL de soro fetal de bovino e 50 pL do soro a ser testado para as propriedades de bloqueio de adesão. Esta mistura foi depois colocada num poço contendo monocamadas confluentes das células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) cujo meio de cultura foi previamente removido. As bactérias e as células HUVEC foram incubadas durante 4 horas a 37 2C, sob 5% de C02. As monocamadas de células foram, depois, lavadas três vezes com soro RPMI fresco e subsequentemente raspadas da placa. As CFU associadas às células HUVEC foram depois determinadas por diluição em série e plaqueamento do lisado de células em placas GC. As placas foram incubadas durante 48 horas, a 37 2C, para permitir a recuperação e crescimento de meningococos associados a células.

Atividades de adesão-bloqueio de soros de murganho e de coelho produzidos contra FHAB2/3rd recombinante, antigénios Hap & hsf: anticorpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf de comprimento total (descrito no documento W099/58683) e anti-Hap de comprimento total (documento W099/55873), assim como anti-soros dirigidos contra os correspondentes Hsf & domínio de passagem de Haps, interferem com a adesão meningocócica a células HUVEC endoteliais. A Figura 8 mostra que anticorpos específicos induzidos por FHA 2/3 formulados em AIPO4 foram capazes de inibir a adesão de Neisseria meningitidis B a células HUVEC em comparação com apenas o adjuvante. Quando comparado com o adjuvante SBAS2 isolado (sem antigénio, grupo 4), o abs anti-FHA 2/3 (formulação SBAS2) é ainda eficaz, mas menos potente do que AIPO4. 0 adjuvante SBAS2 isolado (sem antigénio) não induz anticorpos capazes de interferir com a adesão. Comparados com o grupo 4, os anticorpos anti-Hap (grupo 1) podem ter um ligeiro efeito de inibição. No grupo 5; quando é testada a mistura de anticorpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf e anti-Hap, inibição da adesão é mais forte do que com anti-FHA 2/3 isolado, sugerindo um efeito sinergético dado pelos anticorpos anti-Hap e anti-Hsf. Numa segunda experiência de inibição (Fig 2), um antissoro específico de coelho dirigido contra anti OMV que sobre-expressam

Hsf (como uma proteína candidata) foi capaz de inibir parcialmente a fixação de Neisseria meningitidis B às células endoteliais em comparação com o controlo negativo (grupo 3 vs 4). Foi demonstrado que este anti-soro de coelho continha um título de anticorpo anti-Hsf específico. Os anticorpos contra Hsf rec (Hsf de passagem e Hsf de comprimento total) são também capazes de inibir a adesão de bactérias em células HUVEC. Isto é verdade com soros de murganho (grupos 5-6) assim como com soros de coelho (numa extensão laser) (grupos 7-8). Nesta segunda experiência, anticorpos específicos anti-rec FHA 2/3 (grupo 1) já testados na primeira experiência confirmam o seu efeito inibidor muito elevado. Estes resultados indicam que estes antigénios específicos (Hap, FHA2/3 e Hsf), isolados ou em combinação, são antigénios de vacina interessantes.

Exemplo 12: Efeito protetor de OMV recombinantes no modelo de exposição em murganho Várias OMV recombinantes foram avaliadas em murganhos Balb/C para o seu efeito protetor após exposição letal. Este modelo de imunização ativa envolveu injeção intraperitoneal de meningococos de várias estirpes (ressuspensas em meio TSB sem ferro) em murganhos adultos Balb/C ou 0F1 (6 - 8 semanas de idade), após uma série de imunização pela via subcutânea. 0 dextrano de ferro, utilizado como uma fonte externa de ferro parece ser necessário para manter a bacteremia e induzir a mortalidade num animal infetado. Embora este modelo IP em murganho tenha mostrado ser eficaz para avaliar a virulência, a proteção imunitária e o papel do ferro na infeção, estes não incorporam a fase de transporte faringico, que precede a bacteremia e a meningite em humanos. Este modelo foi utilizado para rastrear os vários candidatos OMV que sobre-expressam NspA, TbpA ou Hsf. Nas experiências que se seguem, murganhos Balb/C (consanguíneos) ou OF 1 (não relacionados) foram imunizados três vezes nos dias 0, 14 e 28 pela via subcutânea com 3 (PV00N049) a 5 pg (experiências PV00N035 e PV00N043) de OMV rec., que sobre-expressam Hsf, NspA ou TbpA formulados em Al(OH)3 (100 pg Ai (OH) 3/animal) (PV00N035 e PV00N043) ou em AIPO4 (100 pg de

AlP04/animal). Depois, os animais são sangrados nos dias 28 (dia 14 após II) e 35 (dia 7 após III) para avaliação específica de Ab. No dia 35, 10 mg de dextrano de ferro são injetados intraperitonealmente uma hora antes da exposição. As exposições foram efetuadas com as estirpes H44/76 (B:15:Pl.7,16) ou CU-385 (B:4:PI.19, 15) , com cerca de l,10e7 CFU/animal (ver a tabela de resultados para as doses exatas de exposição). A estirpe heteróloga preparada com a estirpe CU-385 é mais restringente do que quando se utiliza a estirpe homóloga. As mortalidades foram registadas desde os dias 1 a 5. A tabela 1 ilustra a seguir que quando em comparação com OMV porA (-) e com OMV por A ( + ) numa menor extensão, existe já uma melhor proteção observada com OMV TbpA ( + ) (1/10 e 3/5 para porA(-) e 9/10 e 3/5 para porA ( + ) ) , com OMV NspA ( + ) (4/10 e 4/5) e com OMV Hsf ( + ) (3/10, 2/10 e 3/5) . Isto é a observação global que se pode fazer nestas três experiências. Estes dados mostram que os antigénios TbpA, Hsf e NspA, expressos à superfície das vesículas, são de interesse para uma futura vacina menB.

Tabela 1: Atividade protetora no modelo de murganho de vesículas de membrana externa recombinante. A tabela resume os resultados obtidos durante três experiências (PV00N35, PV00N043 & PV00N049) OMV (vesículas)

Exemplo 13: Efeito protetor de antigénios de subunidade recombinantes no modelo de exposição em murganho Várias proteínas recombinantes purificadas foram avaliadas em murganhos Balb/C para o seu efeito protector após exposição letal. Este modelo de imunização activa envolveu a injecção intraperitoneal de meningococos de várias estirpes (ressuspensas em meio TSB sem ferro) em murganhos adultos Balb/C ou OF 1 (6-8 semanas de idade) após uma série de imunizações por via subcutânea. 0 ferro dextrano, utilizado como uma fonte externa de ferro parece ser necessário para manter a bacteriemia e induzir a mortalidade num animal infetado. Embora este modelo IP em murganho tivesse mostrado ser eficaz para avaliar a virulência, proteção imunitária e o papel do ferro na infeção, estes não incorporam a fase de transporte faríngico, a qual precede a bacteriemia e meningite em humanos. Este modelo foi utilizado para rastrear vários candidatos a vacinas de subunidade menB como as moléculas recombinantes FrpC, TbpA, FHA2/3 e Hap.

Nesta experiência, os murganhos 0F1 (não relacionados) foram imunizados três vezes nos dias 0, 14 e 28 pela via subcutânea com 5 pg (PV00N050) destas proteínas formuladas em A1P04 (100 pg) na presença de 10 pg de MPL (por animal).

Depois, os animais são sangrados nos dias 28 (dia 14 após II) e 35 (dia 7 após III) para avaliação específica de Ab, enquanto são expostos no dia 35. No dia da exposição, 10 mg de ferro dextrano são injetados intraperitonealmente uma hora antes da exposição. As exposições foram efetuadas com as estirpes CU-385 (B:4:PI.19,15) , as quais são heterólogas neste caso, de facto, as sequências dos antigénios que vêm da H44/76 (B: 15 : Pl. 7, 16) , exceto para o TbpA do qual a sequência vem da estirpe B16B6 (B:2a:P1.2).

Os resultados ilustrados na tabela 2 indicam que FrpC, TbpA, FHAB2/3rd, Hap induzem proteção significativa neste modelo: de 2 a 4 em 5 murganhos sobreviveram após exposição, em comparação com apenas 1/5 com o adjuvante isolado. Em todos os grupos, menos um, os títulos do anticorpo específico foram elevados (título de anti-TbpA específico foi moderado). Todos estes dados apoiam que o domínio conservado de FrpC, FrpA, FrpA/C, TbpA, FHAB2/3rd, Hap apresenta como antigénios de subunidade, isolados ou em combinação, são de interesse para o desenvolvimento de uma vacina menB.

Tabela 2: Atividade protetora no modelo de murganho de vesículas de membrana externa recombinante. A tabela resume os resultados obtidos durante uma experiência (PV00N050).

Antigénios de subunidade

Exemplo 14: Método para mostrar o efeito sinergético de

combinações de antigénios de vacina

Diferentes OMV recombinantes disponíveis (OMV porA (+) rmp-LbpB, OMV porA (-) TbpA ( + ) Hsf ( + ) , OMV porA (-) TbpA ( + ) , OMV porA (-) NspA ( + ) , OMV porA (-) Hsf ( + ) , OMV porA (-) TbpA (+) NspA (+)) podem ser testados isolados ou em combinação para determinar estatisticamente as melhores combinações, em termos de deteção de um efeito sinergético destas combinações de candidatos a vacinas. Este trabalho pode também ser efetuado com combinações de antigénios de subunidade, assim como combinação de antigénios de subunidade + OMV recombinantes. 32 grupos de 5 murganhos OFl/grupo podem ser injetados e testados para atividade bactericida & opsónica no soro, proteção ativa e passiva no modelo de murganho (se houver necessidade de utilizar quantidades subótimas de antigénios individuais). Uma indicação de combinações de antigénios sinergísticas, é se o nível de proteção conferido após imunização combinada é superior ao da soma dos antigénios individuais.

Exemplo 15: Análise SDS-PAGE do conteúdo em Hsf e TbpA das Vesículas de membrana Externa coradas com azul de Coommassie 15 pg de proteína em preparações de vesícula de membrana externa com regulação positiva de Hsf ou TbpA ou de Hsf e TbpA, foram diluídas num tampão de amostra contendo β-mercaptoetanol e aquecidas, a 95 2C, durante 10 minutos. As amostras foram, depois, separadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (Novex 4-20% de Tris-glicina 1,5 mm 2Dwell SDS Page), coradas em azul de Coomassie durante uma hora e descoloradas em várias lavagens de descoloração. Os resultados são apresentados na Figura 9, os quais mostram que os níveis de Hsf e TbpA são consideravelmente maiores em preparações de vesícula de membrana externa, derivadas de N. meningitidis em que o seu nível de expressão foi melhorado.

Exemplo 16: Imunogenicidade de OMV com regulação positiva de Hsf e/ou TbpA

Grupos de 20 murganhos foram imunizados três vezes com OMV pela via intramuscular nos dias 0, 21 e 28. Cada inoculação foi constituída por 5 pg (conteúdo em proteína) de OMV formulados em AIPO4 com MPL. As OMV foram derivadas da estirpe de N. meningitidis H44/76, manipulada de modo que os polissacáridos capsulares e PorA fossem regulados negativamente. Uma comparação foi efetuada com OMV em que Hsf, TbpA, Hsf e TbpA ou nenhum foram regulados positivamente. No dia 41, foram retiradas amostras de sangue para análise por ELISA ou por ensaio bactericida em soro. ELISA para detetar anticorpos contra Hsf

Microplacas de 96 poços (Nunc, Maxisorb) foram revestidas de um dia para o outro, a 4 2C, com 100 pL de 1 pg/mL de antigénio específico em PBS. Após lavagem com NaCl a 150 mM de Tween 20 a O, 05%, as placas foram saturadas com 100 pL de PBS-BSA a 1% sob agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Entre cada passo (efetuados sob agitação, à temperatura ambiente, durante 30 min e com PBS-BSA a 0,2% como tampão diluente) , os reagentes em excesso foram removidos por lavagem com NaCl-Tween 20. Cem microlitros de amostras diluídas em soro foram adicionados por micropoço. Os anticorpos ligandos foram reconhecidos por uma Ig anti-murganho biotinilada (Prosan) (1/2000). O complexo antigénio-anticorpo foi divulgado por incubação com estreptavidina-conjugado de peroxidase biotinilada (Amersham) (1/4000). 0rtoFenilenoDiamina/H202 (4 mg/10 mL de tampão citrato 0,1 M pH 4,5 + 5 pL de H202) é utilizada para divulgar o ensaio. As placas foram incubadas, durante 15 min, à temperatura ambiente no escuro antes da interrupção da reacção por adição de 50 pL de 1 N de HC1. A absorvência foi lida a 490 nm.

Os resultados apresentados na tabela acima mostram que títulos de anticorpo elevados e equivalentes contra Hsf foram produzidos por imunização com OMV com regulação positiva de Hsf ou Hsf e TbpA. Virtualmente, nenhum anticorpo contra Hsf pode ser detetado em soros produzidos após inoculação com adjuvante isolado ou OMV em que nem Hsf nem TbpA foram regulados positivamente ou OMV, em que apenas TbpA foi regulado positivamente.

Exemplo 17: Atividade Bactericida no Soro de anti-soros

produzidos contra OMV com regulação positiva de Hsf e/ou TbpA A atividade bactericida no soro de anti-soros dos murganhos inoculados com OMV com regulação positiva de Hsf, TbpA, Hsf e TbpA ou sem regulação positiva foram comparados em ensaios utilizando a estirpe homóloga H44/76 ou as estirpes heterólogas Cu385. 0 ensaio bactericida em soro foi apresentado para mostrar boa correlação com a proteção e é, deste modo, uma boa indicação de quão eficaz uma composição candidata será na estimulação de uma resposta imunitária protetora.

As estirpes de tipo selvagem de Neisseria meningitidis de serogrupo B (estirpe H44/76 =B:15.PI.7,16 L3,7,9 e estirpe CU385 =B: 4 Pl.19,15 L3,7,9) foram cultivadas de um dia para o outro em placas de Petri com MH + 1% de Polyvitex + 1% de soro de cavalo, a 37 2C, + 5% de CO2. Estas foram subcultivadas durante 3 horas num meio TSB liquido suplementado com 50 μΜ de Desferal (Quelante de ferro) a 37 2C, sob agitação, para atingir uma densidade ótica de, aproximadamente, 0,5 a 470 nm.

Os soros misturados ou individuais foram inativados durante 40 min a 56 2C. As amostras de soro foram diluídas 1/100 em HBSS-BSA a 0,3% e, depois, serialmente diluídas em duas vezes (8 diluições) num volume de 50 pL em microplacas de fundo redondo.

As bactérias, com a DO apropriada, foram diluídas em HBSS-BSA a 0,3% para produzir 1,3 10e4 CFU por mL. Foram adicionados 37,5 pL desta diluição às diluições do soro e as microplacas foram incubadas durante 15 minutos, a 37 2C, sob agitação. Depois, 12,5 pL de complemento de coelho foram adicionados a cada poço. Após 1 hora de incubação, a 37 2C, e sob agitação, as microplacas foram colocadas em gelo para parar a mortalidade.

Utilizando o método de inclinação, 20 pL de cada poço foram plaqueados em placas de Petri de MH + 1% de Polyvitex + 1% de soro de cavalo e incubadas de um dia para o outro, a 37 2C + CO2. As CFU foram contadas e a percentagem de mortalidade foi calculada. O titulo do soro bactericida é a última diluição produzindo > 50% de mortes. H44/76 CU385 O MV GMT % de GMT % de responsivos responsivos

Os resultados semelhantes aos apresentados na tabela acima, foram obtidos em duas outras experiências semelhantes.

Um aumento dramático nos títulos bactericidas (GMT) contra a estirpe homóloga e as estirpes heterólogas foi observado após vacinação com OMV em que Hsf e TbpA foram regulados positivamente. Por comparação, os GMT bactericidas medidos em murganhos vacinados com OMV com Hsf ou TbpA regulados positivamente foram semelhantes aos obtidos com murganhos vacinados com OMV de controlo. 0 benefício da dupla regulação positiva foi também claramente observado na percentagem de murganhos que produziram um nível significativo de anticorpos bactericidas (títulos superiores a 1/100), particularmente nas experiências utilizando as estirpes heterólogas.

Exemplo 18: Efeito da mistura de soros anti-Hsf e anti-TbpA na atividade bactericida

Os grupos de 20 murganhos foram imunizados três vezes com OMV pela via intramuscular nos dias 0, 21 e 28. Cada inoculação foi constituída por 5 pg (conteúdo em proteína) de OMV formulados em AIPO4 com MPL. As OMV foram derivadas da estirpe N. meningitidis H44/76, manipulada de modo que os polissacáridos capsulares e PorA fossem regulados negativamente. Um grupo de murganhos foi imunizado com OMV de controlo em que não existiu regulação positiva de proteínas. Num segundo grupo, a expressão de Hsf foi regulada positivamente, num terceiro grupo a expressão de TbpA foi regulada positivamente e num quarto grupo, a expressão de ambos Hsf e TbpA foi regulada positivamente.

Os soros foram agrupados, utilizando soros de murganhos no mesmo grupo ou por mistura de soros isolados a partir do grupo com Hsf isolado ou TbpA isolado foram regulados positivamente. A atividade bactericida no soro foi medida para cada um dos soros misturados e os resultados são apresentados na tabela abaixo.

Os resultados na tabela acima mostram que a mistura de anti-soros anti-Hsf e anti-TbpA resultou numa muito maior atividade bactericida no soro do que foi conseguido pelos anti-soros individualmente. 0 efeito sinergístico parece ser conseguido pela presença de anticorpos contra Hsf e TbpA.

Exemplo 19: Proteínas Hsf truncadas podem combinar sinergisticamente com TbpA

Uma série de construções de Hsf truncada foram preparadas utilizando procedimentos convencionais de biologia molecular. Estes incluem uma construção que codifica os aminoácidos 1 a 54 a qual contém a sequência sinal de Hsf e os aminoácidos 134 a 592 de Hsf (TrlHsf). Um segundo Hsf truncado continha os aminoácidos 1-53 da sequência sinal de Hsf seguida pelos aminoácidos 238-592 de Hsf (Tr2Hsf). Estas duas construções de Hsf truncada e o Hsf de comprimento total foram introduzidos em N. meningitidis B estirpe MC58 siaD-, Opc-, PorA-, de modo que a sua expressão possa ser regulada positivamente e as vesículas de membrana externa fossem produzidas utilizando os métodos acima descritos.

As preparações de vesícula de membrana externa foram adsorvidas em A1(0H)3 e injetadas em murganhos nos dias 0, 21 e 28. No dia 42, os murganhos foram sangrados e os soros preparados. Os soros foram misturados com soros de murganhos vacinados com OMV que regularam positivamente TbpA e os ensaios de soros bactericidas foram efetuados como acima descrito.

Resultados

Os resultados apresentados na tabela acima divulgam que a primeira truncagem (TrlHsf) estimula uma resposta imunitária que é capaz de combinação com anti-soros contra TbpA para produzir uma maior atividade bactericida no soro do que quando o Hsf de comprimento total é utilizado. No entanto, a extensão da truncagem é importante e a truncagem produzida em Tr2 tem um efeito prejudicial em comparação com o Hsf de comprimento total. A atividade bactericida melhorada de TrlHsf foi observada contra ambas as estirpes utilizadas.

Exemplo 20: Atividade bactericida no soro de anticorpos contra TbpA, Hsf e uma terceira proteína meningocócica A estirpe de N. meningitidis H66/76 em que PorA e os

polissacáridos capsulares foram regulados negativamente como acima descrito, foi utilizada como a estirpe de fundo para regular positivamente TbpA e Hsf, LbpB, D15, PilQ ou NspA utilizando o procedimento acima descrito. As vesículas de membrana externa foram preparadas a partir de cada estirpe como acima descrito. FHAb, FrpC, FrpA/C e Hap recombinantes foram preparados utilizando técnicas aqui descritas anteriormente e conhecidas na técnica (como descrito nos documentos PCT/EP99/02766, W092/01460 e WO98/02547).

As preparações de vesícula de membrana externa e proteínas recombinantes foram adsorvidas em Ai(OH)3 e injetadas em murganhos nos dias 0, 21 e 28. No dia 42, os murganhos foram sangrados e os soros preparados. Os soros contra TbpA e Hsf que regularam positivamente as OMV foram misturados com soros de murganhos vacinados com OMV contendo LbpB, D15, PilQ ou NspA OMV ou recombinante FHAb, FrpC, FrpA/C ou Hap regulados positivamente e o ensaio de soros bactericidas foram efetuados como acima descrito.

Resultados

Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Em ensaios utilizando a estirpe homóloga H44/76, a adição de anticorpos contra um terceiro antigénio meningocócico, com a exceção de FrpC, não produz um título bactericida no soro mais elevado do gue o produzido utilizando anticorpos contra TbpA e Hsf isolado.

No entanto, a adição de anticorpos contra um terceiro antigénio foi vantajosa em ensaios bactericidas no soro utilizando uma estirpe heteróloga. Os anticorpos contra D15 (OMP85), Hap, FrpA/C e LbpB foram particularmente eficazes no aumento do título bactericida no soro contra a estirpe CU385. Título do Soro Bactericida

Mix de Antisoros H44/76 CU385

Exemplo 21: Efeito de FrpB KO em vesículas de membrana externa e na sua capacidade para estimular uma resposta imunitária bactericida em estirpes homólogas e heterólogas

Duas estirpes de N. meningitidis H44/76 foram utilizadas para preparar preparações de vesícula de membrana externa como descrito no documento W001/09350, utilizando uma extração com 0,1% de DOC, de modo que o conteúdo em LOS foi cerca de 20%. A estirpe B1733 é siaD (-), PorA (-), tem regulação positiva de Trl Hsf (exemplo 19) e lgtB está anulado. A estirpe B 1820 B1733 é siaD (-) , PorA(-), tem regulação positiva de Trl Hsf, lgtB está anulado e FrpB está também anulado. Ambas as estirpes foram cultivadas em meios suplementados com 60 μΜ de Desferal de modo que as proteínas reguladas pelo ferro, tais como LbpA/B e TbpA/B são reguladas positivamente.

As preparações de vesículas foram adsorvidas em Al(OH)3 e 5 pg foram injetados intramuscularmente em grupos de 30 murganhos no dia 0 e dia 21. As amostras de sangue foram retiradas no dia 28.

Os ensaios bactericidas nos soros foram efetuados em três estirpes L3 (a estirpe homóloga do tipo selvagem H44/76 e duas estirpes L3 heterólogas; NZ124 e M97250687), como descrito no exemplo 17.

Resultados

GMT indica média geométrica do título dos soros no SBA. SC indica o número de murganhos seroconversores (título de SBA>1/100).

Os resultados mostram, claramente, que vesículas FrpB KO (B1820) induzem uma melhor resposta heteróloga bactericida cruzada do que as vesículas FrpB( + ) (B 1733) . Os títulos de SBA foram mais elevados e a maior proporção de murganhos soroconvertidos nas estirpes M97250687 e NZ124. Os resultados na estirpe homóloga não foram tão bons como quando FrpB foi removido. Estes dados sugerem que FrpB conduz a resposta imunitária, mas uma vez que esta proteína da membrana externa é altamente variável, os anticorpos contra esta proteína são apenas capazes de induzir a morte da estirpe homóloga. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a.

<12 0> COMPOSIÇÃO DE VACINA DE NEISSERIA COMPREENDENDO UMA COMBINAÇÃO DE ANTIGÉNIOS <130> B45315D4 <160> 24 <150> GB 0218037.0 <151> 2002-08-02 <150> GB 0218036.2 <151> 2002-08-02 <150> GB 0218035.4 <151> 2002-08-02 <150> GB 0218051.1 <151> 2002-08-02 <150> GB 0220197.8 <151> 2002-08-30 <150> GB 0220199.4 <151> 2002-08-30 <150> GB 0225524.8 <151> 2002-11-01 <15Ο> GB 0225531.3 <151> 2002-11-01 <150> GB 0230164.6 <151> 2002-12-24 <150> GB 0230168.7 <151> 2002-12-24 <150> GB 0230170.3 <151> 2002-12-24 <150> GB 0305028.3 <151> 2003-03-05 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <22 0> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <4 0 0> 1

Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly Asn Asp Xaa 1 5

<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <22 0> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 2

Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly Asp Asp Xaa 1 5

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3

Lys Thr Lys Cys Lys Phe Leu Lys Lys Cys 15 10

<210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4Ο0> 4 ggaattccat atgatgaaca aaatataccg c 31

<210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 5 gtagctagct agcttaccac tgataaccga c 31

<210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 6 aactgcagaa ttaatatgaa aggagaagaa cttttc 36

<210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 7 gacatactag tttatttgta gagctcatcc atg 33

<210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 8 tccccgcggg ccgtctgaat acatcccgtc 30

<210> 9 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 9 catatgggct tccttttgta aatttgaggg caaacacccg atacgtcttc a 51

<210 > 10 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 10 agacgtatcg ggtgtttgcc ctcaaattta caaaaggaag cccatatg 48

<210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 11 gggtattccg ggcccttcag acggcgcagc agg 33

<210> 12 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 Ο 0> 12 ggcctagcta gccgtctgaa gcgattagag tttcaaaatt tattc 45

<210> 13 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 13 ggccaagctt cagacggcgt tcgaccgagt ttgagccttt gc 42

<210> 14 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 14 tcccccggga agatctggac gaaaaatctc aagaaaccg 39

<210> 15 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 15 ggaagatctc cgctcgagca aatttacaaa aggaagccga tatgcaacag caacatttgt 60 tccg 64

<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 16 ggaagatctc cgctcgagac atcgggcaaa cacccg 36

<210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 17 tcccccggga gatctcacta gtattaccct gttatccc 38

<210 > 18 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 18 ctcgagacca tgggcaaata tcatgtctac gaccccctcg c 41

<210> 19 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 19 gtgcatagtg tcagagtttt tgtcgacgtc gtaattatag acc 43

<210> 20 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4Ο0> 20 aatggaatac atatgaataa aggtttacat cgcattatc 39

<210> 21 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 21 ccaactagtg tttttcgcta cttggagctg t 31

<210> 22 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 22 aatggaatac atatgaataa aggtttacat cgcattatct ttag 44

<210> 23 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 23 ggggccactc gaggtttttc gctacttgga gctgtttcag atagg 45

<210> 24 <211> 4217 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 24 atgaataaag gtttacatcg cattatcttt agtaaaaagc acagcaccat ggttgcagta 60 gccgaaactg ccaacagcca gggcaaaggt aaacaggcag gcagttcggt ttctgtttca 120 ctgaaaactt caggcgacct ttgcggcaaa ctcaaaacca cccttaaaac tttggtctgc 180 tctttggttt ccctgagtat ggtattgcct gcccatgccc aaattaccac cgacaaatca 240 gcacctaaaa accagcaggt cgttatcctt aaaaccaaca ctggtgcccc cttggtgaat 300 atccaaactc cgaatggacg cggattgagc cacaaccgct atacgcagtt tgatgttgac 360 aacaaagggg cagtgttaaa caacgaccgt aacaataatc cgtttgtggt caaaggcagt 420 gcgcaattga ttttgaacga ggtacgcggt acggctagca aactcaacgg catcgttacc 480 gtaggcggtc aaaaggccga cgtgattatt gccaacccca acggcattac cgttaatggc 540 ggcggcttta aaaatgtcgg tcggggcatc ttaactaccg gtgcgcccca aatcggcaaa 600 gacggtgcac tgacaggatt tgatgtgcgt caaggcacat tgaccgtagg agcagcaggt 660 tggaatgata aaggcggagc cgactacacc ggggtacttg ctcgtgcagt tgctttgcag 720 gggaaattac agggtaaaaa cctggcggtt tctaccggtc ctcagaaagt agattacgcc 780 agcggcgaaa tcagtgcagg tacggcagcg ggtacgaaac cgactattgc ccttgatact 840 gccgcactgg gcggtatgta cgccgacagc atcacactga ttgccaatga aaaaggcgta 900 ggcgtcaaaa atgccggcac actcgaagcg gccaagcaat tgattgtgac ttcgtcaggc 960 cgcattgaaa acagcggccg catcgccacc actgccgacg gcaccgaagc ttcaccgact 1020 tatctctcca tcgaaaccac cgaaaaagga gcggcaggca catttatctc caatggtggt 1080 cggatcgaga gcaaaggctt attggttatt gagacgggag aagatatcag cttgcgtaac 1140 ggagccgtgg tgcagaataa cggcagtcgc ccagctacca cggtattaaa tgctggtcat 1200 aatttggtga ttgagagcaa aactaatgtg aacaatgcca aaggcccggc tactctgtcg 1260 gccgacggcc gtaccgtcat caaggaggcc agtattcaga ctggcactac cgtatacagt 1320 tccagcaaag gcaacgccga attaggcaat aacacacgca ttaccggggc agatgttacc 1380 gtattatcca acggcaccat cagcagttcc gccgtaatag atgccaaaga caccgcacac 1440 atcgaagcag gcaaaccgct ttctttggaa gcttcaacag ttacctccga tatccgctta 1500 aacggaggca gtatcaaggg cggcaagcag cttgctttac tggcagacga taacattact 1560 gccaaaacta ccaatctgaa tactcccggc aatctgtatg ttcatacagg taaagatctg 1620 aatttgaatg ttgataaaga tttgtctgcc gccagcatcc atttgaaatc ggataacgct 1680 gcccatatta ccggcaccag taaaaccctc actgcctcaa aagacatggg tgtggaggca 1740 ggctcgctga atgttaccaa taccaatctg cgtaccaact cgggtaatct gcacattcag 1800 gcagccaaag gcaatattca gcttcgcaat accaagctga acgcagccaa ggctctcgaa 1860 accaccgcat tgcagggcaa tatcgtttca gacggccttc atgctgtttc tgcagacggt 1920 catgtatcct tattggccaa cggtaatgcc gactttaccg gtcacaatac cctgacagcc 1980 aaggccgatg tcaatgcagg atcggttggt aaaggccgtc tgaaagcaga caataccaat 2040 atcacttcat cttcaggaga tattacgttg gttgccggca acggtattca gcttggtgac 2100 ggaaaacaac gcaattcaat caacggaaaa cacatcagca tcaaaaacaa cggtggtaat 2160 gccgacttaa aaaaccttaa cgtccatgcc aaaagcgggg cattgaacat tcattccgac 2220 cgggcattga gcatagaaaa taccaagctg gagtctaccc ataatacgca tcttaatgca 2280 caacacgagc gggtaacgct caaccaagta gatgcctacg cacaccgtca tctaagcatt 2340 accggcagcc agatttggca aaacgacaaa ctgccttctg ccaacaagct ggtggctaac 2400 ggtgtattgg cactcaatgc gcgctattcc caaattgccg acaacaccac gctgagagcg 2460 ggtgcaatca accttactgc cggtaccgcc ctagtcaagc gcggcaacat caattggagt 2520 accgtttcga ccaaaacttt ggaagataat gccgaattaa aaccattggc cggacggctg 2580 aatattgaag caggtagcgg cacattaacc atcgaacctg ccaaccgcat cagtgcgcat 2640 accgacctga gcatcaaaac aggcggaaaa ttgctgttgt ctgcaaaagg aggaaatgca 2700 ggtgcgccta gtgctcaagt ttcctcattg gaagcaaaag gcaatatccg tctggttaca 2760 ggagaaacag atttaagagg ttctaaaatt acagccggta aaaacttggt tgtcgccacc 2820 accaaaggca agttgaatat cgaagccgta aacaactcat tcagcaatta ttttcctaca 2880 caaaaagcgg ctgaactcaa ccaaaaatcc aaagaattgg aacagcagat tgcgcagttg 2940 aaaaaaagct cgcctaaaag caagctgatt ccaaccctgc aagaagaacg cgaccgtctc 3000 gctttctata ttcaagccat caacaaggaa gttaaaggta aaaaacccaa aggcaaagaa 3060 tacctgcaag ccaagctttc tgcacaaaat attgacttga tttccgcaca aggcatcgaa 3120 atcagcggtt ccgatattac cgcttccaaa aaactgaacc ttcacgccgc aggcgtattg 3180 ccaaaggcag cagattcaga ggcggctgct attctgattg acggcataac cgaccaatat 3240 gaaattggca agcccaccta caagagtcac tacgacaaag ctgctctgaa caagccttca 3300 cgtttgaccg gacgtacagg ggtaagtatt catgcagctg cggcactcga tgatgcacgt 3360 attattatcg gtgcatccga aatcaaagct ccctcaggca gcatagacat caaagcccat 3420 agtgatattg tactggaggc tggacaaaac gatgcctata ccttcttaaa aaccaaaggt 3480 aaaagcggca aaatcatcag aaaaaccaag tttaccagca cccgcgacca cctgattatg 3540 ccagcccccg tcgagctgac cgccaacggc ataacgcttc aggcaggcgg caacatcgaa 3600 gctaatacca cccgcttcaa tgcccctgca ggtaaagtta ccctggttgc gggtgaagag 3660 ctgcaactgc tggcagaaga aggcatccac aagcacgagt tggatgtcca aaaaagccgc 3720 cgctttatcg gcatcaaggt aggcaagagc aattacagta aaaacgaact gaacgaaacc 3780 aaattgcctg tccgcgtcgt cgcccaaact gcagccaccc gttcaggctg ggataccgtg 3840 ctcgaaggta ccgaattcaa aaccacgctg gccggtgcgg acattcaggc aggtgtaggc 3900 gaaaaagccc gtgccgatgc gaaaattatc ctcaaaggca ttgtgaaccg tatccagtcg 3960 gaagaaaaat tagaaaccaa ctcaaccgta tggcagaaac aggccggacg cggcagcact 4020 atcgaaacgc tgaaactgcc cagcttcgaa agccctactc cgcccaaact gaccgccccc 4080 ggtggctata tcgtcgacat tccgaaaggc aatttgaaaa ccgaaatcga aaagctggcc 4140 aaacagcccg agtatgccta tctgaaacag ctccaagtag cgaaaaacac tagtggccac 4200 catcaccatc accatta 4217

Lisboa, 2 de junho de 2016

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogénica compreendendo GNA1870, NadA e Lipo28, em que os referidos antigénios, quando presentes numa vesícula de membrana externa, foram regulados positivamente na vesícula de membrana externa, com a condição de que a composição imunogénica não seja uma das seguintes composições divulgadas no documento WO 2004/032958: uma mistura de (1) uma proteína "NadA"; (2) uma proteína "741"; (3) uma proteína "936"; (4) uma proteína "953"; e (5) uma proteína "287"; uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio; uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio, em combinação com OMV preparadas a partir da estirpe H44/76; ou uma mistura de proteína híbrida AG287-953, proteína híbrida 936-AG741, proteína NadA(NL) (c) e um adjuvante de hidróxido de alumínio, em combinação com OMV preparadas a partir da estirpe 394/98.
2. Composição imunogénica da reivindicação 1, em que a referida composição: a) é uma composição de subunidade; b) compreende uma preparação de vesícula de membrana externa, em que os antigénios foram regulados positivamente na vesícula de membrana externa; ou c) compreende uma composição de subunidade possuindo um ou mais dos antigénios, e uma preparação de vesícula de membrana externa possuindo, pelo menos, um antigénio, o qual foi regulado positivamente na vesícula de membrana externa.
3. Composição imunogénica da reivindicação 2 (b) ou (c), em que uma célula hospedeira a partir da qual a preparação de vesícula de membrana externa é derivada: a) foi manipulada de modo a regular negativamente a expressão de um ou mais de lgtB ou lgtE; b) é incapaz de sintetizar polissacárido capsular e foi manipulada de modo a regular negativamente a expressão de um ou mais de siaD, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (equivalente a synX e siaA) ou synB (equivalente a siaB) e synC (equivalente a siaC); c) foi manipulada de modo a regular negativamente a expressão de um ou mais de OpC, OpA ou PorA; d) foi manipulada de modo a regular negativamente a expressão de FrpB; e/ou e) foi manipulada de modo a regular negativamente a expressão de msbB e/ou htrB.
4. Composição imunogénica das reivindicações 2 (b) ou (c) ou 3, em que a preparação de vesícula de membrana externa contém LPS, o qual é conjugado a uma proteína da membrana externa.
5. Composição imunogénica das reivindicações 1-4 compreendendo um antigénio derivado de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae.
6. Composição imunogénica da reivindicação 5, em que todos os antigénios de Neisseria são derivados de N. meningitidis serogrupo B.
7. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, compreendendo ainda um ou mais polissacáridos ou oligossacáridos capsulares bacterianos.
8. Composição imunogénica da reivindicação 7, em que os polissacáridos ou oligossacáridos capsulares são derivados de bactérias selecionadas do grupo consistindo de: Neisseria meningitidis serogrupo A, C, Y e W-135.
9. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, compreendendo ainda um adjuvante.
10. Composição imunogénica da reivindicação 9, em que o adjuvante compreende gel de hidróxido de alumínio.
11. Vacina compreendendo a composição imunogénica das reivindicações 1-10 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Vacina compreendendo um ou mais polinucleótidos cuja expressão é conduzida por um promotor eucariótico, codificando GNA1870, NadA e Lipo28.
13. Utilização da vacina da reivindicação 11 ou reivindicação 12 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infeção por Neisseria.
14. Vacina da reivindicação 11 ou reivindicação 12 para utilização no tratamento ou prevenção de infeção por Neisseria.
15. Método de preparação da composição imunogénica das reivindicações 1-10, compreendendo um passo de misturar em conjunto, pelo menos, os antigénios GNA1870, NadA e Lipo28 de Neisseria.
16. Método de preparação da composição imunogénica das reivindicações 2(b) ou (c) ou 3-9, compreendendo um passo de isolar as vesículas de membrana externa de uma cultura de Neisseria.
17. Método de preparação da vacina da reivindicação 11 compreendendo um passo de combinar a composição imunogénica das reivindicações 1-10 com um veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa,2 de junho de 2016