JP5789203B2 - ワクチン組成物 - Google Patents
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Description
・少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
・少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
・少なくとも1つのナイセリア毒素、
・少なくとも1つのFe獲得タンパク質、
・少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質(好ましくは、外膜タンパク質、特に、内在性外膜タンパク質)、
から選ばれる少なくともまたは正確に2つ、3つ、4つまたは5つ全ての抗原カテゴリーから選ばれる少なくともまたは正確に2、3、4、5、6,7、8、9または10個の異なる抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供する。
・FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
・Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspAおよびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
・FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、ならびにLPS免疫型(immunotype)L2およびLPS免疫型L3の一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア毒素、
・TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28 (GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrBおよびP2086 (XthA)よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、ならびに
・PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA (GNA1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrAおよびPldA (Omp1A)よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質、好ましくは外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質、
から選ばれる少なくともまたは正確に2、3、4または5個のタンパク質群から選ばれる。
NMBに対する言及は、www.neisseria.orgからアクセス可能な配列の参照番号を示す。
アドヘジンとしては、例えばFhaB (WO98/02547)、NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445; NMB 1994)、NhhAとしても公知のHsf (NMB 0992) (WO99/31132)、Hap (NMB 1985)(WO99/55873)、NspA (WO96/29412)、MafA (NMB 0652)およびMafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20; 914-921 (2002))、Omp26 (NMB 0181)、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびPilC (Mol. Microbiol.1997, 23; 879-892)を包含する。これらは、宿主細胞の表面へのナイセリアの結合に関与するタンパク質である。Hsfはアドヘジンの一例であり、これは自己輸送体タンパク質でもある。したがって、本発明の免疫原性組成物はHsfと他の自己輸送体タンパク質との組合せを含むことが可能であり、この場合、Hsfがアドヘジンとしてその能力を発揮する。これらのアドヘジンはナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他のアドヘジンを包含する。
この抗原はWO98/02547の配列番号38(ヌクレオチド3083-9025)に記載されている。NMB0497も参照されたい。本発明者らは、FhaBが、単独でおよび特に本発明の他の抗原と共に、抗接着抗体を特に有効に誘導することを見出した。完全長FhaBを使用することは可能であるが、驚くべきことに、本発明者らは、特定のC末端トランケート化体(末端切断型)が、交差株作用(cross-strain effect)の点で、それと少なくとも同等に有効である、好ましくは、それより有効であることを見出した。また、好都合にも、そのようなトランケート化体は、クローニングが遥かに容易であることが示されている。本発明のFhaBトランケート化体は、典型的には、FhaB分子のN末端側の3分の2に相当し、好ましくは、新たなC末端は1200-1600位、より好ましくは1300-1500位、最も好ましくは1430-1440位に位置する。特定の実施形態は1433または1436位にC末端を有する。したがって、本発明のそのようなFhaBトランケート化体、およびそのようなトランケート化体を含むワクチンは、本発明の独立した態様であり、かつ、本発明の組合せ免疫原性組成物の1成分である。該N末端も、10、20、30、40または50個までのアミノ酸がトランケート(末端切断)されうる。
自己輸送体タンパク質には、典型的には、シグナル配列、パッセンジャードメイン、および外膜への結合のためのアンカードメインから構成される。自己輸送体タンパク質の具体例には、Hsf (WO99/31132) (NMB 0992)、HMW、Hia (van Ulsenら Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64)、Hap (NMB 1985) (WO99/55873; van Ulsenら Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64)、UspA、UspA2、NadA (NMB 1994) (Comanducciら J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454)、AspA (Infection and Immunity 2002, 70(8); 4447-4461; NMB 1029)、Aida-1様タンパク質、SSh-2およびTshが包含される。NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445)は、自己輸送体タンパク質のもう1つの例であり、かつ、アドヘジンでもある。本発明の免疫原性組成物は、NadAとアドヘジンとの組合せを含むことが可能であり、この場合、NadAが自己輸送体タンパク質としてその能力を発揮する。これらのタンパク質はナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の自己輸送体タンパク質を包含する。
Hsfは、自己輸送体タンパク質に共通の構造を有する。例えば、ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)株H44/76由来のHsfは、アミノ酸1-51から構成されるシグナル配列、表面に露出しており可変領域(アミノ酸52-106、121-124、191-210および230-234)を含有する成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域(アミノ酸52-479)、ネック部領域(アミノ酸480-509)、疎水性αへリックス領域(アミノ酸518-529)、および4個の膜貫通ストランドが外膜に伸長するアンカードメイン(アミノ酸539-591)からなる。
ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)由来のHap様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも3つの構造ドメインを示している。株H44/76由来のHap様配列を基準配列とすると、アミノ酸1-42を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43-950を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近しうると考えられるパッセンジャードメインをコードしており、残基951からC末端まで(1457)を含むドメイン3は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される。ドメイン2は表面に露出していると考えられ、よく保存されており(試験した全ての株において80%を上回る)、大腸菌(E. coli)内でサブユニット抗原として産生されうるため、それは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため(Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820)、それらは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2はパッセンジャードメインとして公知である。
鉄獲得タンパク質には、TbpA (NMB 0461) (WO92/03467, 米国特許第5912336号, WO93/06861およびEP586266)、TbpB (NMB 0460) (WO93/06861およびEP586266)、LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32:1117)、LbpB (NMB 1541)(WO/99/09176)、HpuA (U73112.2) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749)、HpuB (NC_003116.1) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749)、XthAとしても公知のP2086 (NMB 0399) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA (NMB 0634)、FbpB、BfrA (NMB 1207)、BfrB (NMB 1206)、GNA2132としても公知のLipo28 (NMB 2132)、Sibp (NMB 1882)、HmbR、HemH、Bcp (NMB 0750)、鉄(III) ABC輸送体パーミアーゼタンパク質 (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)、鉄(III) ABC輸送体-ペリプラズム (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)、TonB依存性受容体 (NMB 0964およびNMB 0293)(Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)およびトランスフェリン結合タンパク質関連タンパク質 (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000) が包含される。これらのタンパク質はナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の鉄獲得タンパク質を包含する。
TbpAはTbpBと相互作用してナイセリアの外膜上にタンパク質複合体を形成し、これはトランスフェリンに結合する。構造上は、TbpAは、短い細胞内ループおよびより長い細胞外ループにより連結された複数の膜貫通βストランド、TonBボックスおよびプラグ(plug)ドメインと共に、細胞内N末端ドメインを含有する。
毒素には、FrpA (NMB 0585; NMB 1405)、FrpA/C (定義については後記を参照されたい)、FrpC (NMB 1415; NMB 1405) (WO92/01460)、NM-ADPRT (NMB 1343) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al p135)、VapD (NMB 1753)、リポ多糖 (LPS; リポオリゴ糖またはLOSとも称される) 免疫型L2およびLPS免疫型L3が包含される。FrpAおよびFrpCは、これらの2つのタンパク質間で保存された領域を含有し、これらのタンパク質の好ましい断片は、この保存断片を含有するポリペプチド、好ましくは、FrpA/Cの配列のアミノ酸227-1004を含むポリペプチドであろう。これらの抗原はナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の毒素を包含する。
ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)は、鉄が制限された際に分泌される、FrpAおよびFrpCと称される2つのRTXタンパク質をコードしている(Thompsonら, (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら, (1993) Infect. Immun.. 61:2906-2911)。RTX(Repeat ToXin)タンパク質ファミリーは共通して、それらのC末端付近に、コンセンサス配列Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa (LXGGXGN/DDX)を有する一連の9アミノ酸の反復配列を有する。大腸菌(E. coli)HlyAにおける反復配列はCa2+の結合部位であると考えられる。図4に示すとおり、株FAM20において特徴づけられている髄膜炎菌FrpAおよびFrpCタンパク質は、それらの中央領域およびC末端領域においてはかなりのアミノ酸類似性を共有するが、N末端においては(有するとしても)非常に限られた類似性しか有さない。さらに、FrpAとFrpCとの間で保存された領域は、9アミノ酸モチーフの反復性(FrpAにおいては13回およびFrpCにおいては43回)により幾らかの多型を示す。
LPS(リポ多糖;LOS-リポオリゴ糖としても公知である)はナイセリアの外膜上の内毒素である。LPSの多糖部分は殺菌抗体を誘導することが公知である。
他のカテゴリーのナイセリアタンパク質も、本発明のナイセリアワクチン中に含有させる候補となる可能性があり、驚くべきほど有効に他の抗原と組み合わせることができる。膜結合タンパク質、特に内在性膜タンパク質、最も有利には外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質を、本発明の組成物中で使用することが可能である。そのようなタンパク質の一例は、ナイセリアホスホリパーゼ外膜タンパク質である、Omp1A (NMB 0464) (WO00/15801)としても公知のPldAである。更なる具体例としては、TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541) およびTspB (T細胞刺激性タンパク質) (WO 00/03003; NMB 1548, NMB 1628 またはNMB 1747)が挙げられる。更なる具体例には、PilQ (NMB 1812) (WO99/61620)、D15としても公知のOMP85 (NMB 0182) (WO00/23593)、NspA (U52066) (WO96/29412)、FhaC (NMB 0496またはNMB 1780)、PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995)、HpuB (NC_003116.1)、TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290)、OstA (NMB 0280)、GNA33およびLipo30としても公知のMltA (NMB0033)、HtrA (NMB 0532; WO 99/55872)、HimD (NMB 1302)、HisD (NMB 1581)、GNA 1870 (NMB 1870)、HlpA (NMB 1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、TbpA (NMB 0461) (WO92/03467) (前記の鉄獲得タンパク質の説明も参照されたい) ならびにLbpA (NMB 1541) が含まれる。
本発明の免疫原性組成物は完全長OMP85を、好ましくはOMV調製物の一部として含みうる。本発明の免疫原性組成物においては、OMP85の断片も使用することが可能であり、特に、アミノ酸残基1-475または50-475から構成されるOMP85の表面露出ドメインを、好ましくは、本発明の免疫原性組成物のサブユニット成分中に含有させる。OMP85の表面露出ドメインの前記配列は、N末端またはC末端の一方または両方において1、3、5、7、10、15、20、25または30個までのアミノ酸が伸長またはトランケートされうる。シグナル配列はOMP85断片から除去するのが好ましい。
OstAはリポ多糖の合成において機能し、毒性の調節因子であるとみなされうる。あるいは、毒素のカテゴリーを、毒素だけでなく毒性の調節因子をも含有するように拡張すると、OstAは毒素のカテゴリーに含まれうる。
免疫原性組成物は、宿主に投与されると免疫応答を生成しうる少なくとも1つの抗原を含む組成物である。好ましくは、そのような免疫原性調製物は、ナイセリア、好ましくはナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)およびナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)の感染に対する防御免疫応答を生成しうる。
そのような相乗的応答は、抗原の組合せにより惹起されるSBAが、各抗原により別々に惹起されるSBAより少なくとも50%、2倍、3倍、好ましくは4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、最も好ましくは10倍高いことにより特徴づけられうる。好ましくは、SBAは、該抗原が由来する同種株に対して、好ましくはまた、一群の異種株に対して測定される(代表的な群、例えば、A-4クラスターに属するBZ10 (B:2b:P1.2)、ET-37複合体に属するB16B6 (B:2a:P1.2)およびH44/76 (B:15:P1.7,16)については、後記を参照されたい)。SBAは、髄膜炎菌ワクチンの有効性を評価するための最も一般に認められている免疫学的指標である(Perkinsら J Infect Dis. 1998, 177:683-691)。任意の公知方法により、十分なSBAを確認することが可能である。SBAは、動物モデルから(実施例17〜20を参照されたい)またはヒト被験者から得た血清を使用して行うことができる。
あるいは、相乗的応答は、動物防御アッセイにおいて、抗原の組合せの有効性により特徴づけることが可能である。例えば、実施例12または13に記載のアッセイを用いることが可能である。好ましくは、抗原の組合せにより防御される動物の数は、抗原(特に、準最適量(suboptimal)の抗原)を単独で使用した場合と比較して有意に改善される。
あるいは、相乗的応答は、接着阻止アッセイにおいて、抗原の組合せの有効性により特徴づけることが可能である。例えば、実施例11に記載のアッセイを用いることが可能である。好ましくは、抗原の組合せに対して産生された抗血清により誘導される阻止の度合は、抗原の単体に対して産生された抗血清(特に、準最適量の抗体)を使用した場合と比較して有意に改善される。
本発明の免疫原性組成物はサブユニット組成物でありうる。サブユニット組成物は、抗原性組成物を生成するために成分を混合する前には、成分が単離され少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%の純度まで精製されている組成物である。
ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B(menB)は、外膜ブレブを、工業的規模でのその製造を可能にするのに十分な量で排出する。外膜小胞は、細菌細胞の界面活性剤抽出の方法により調製することが可能である(例えば、EP 11243を参照されたい)。
本発明の外膜小胞調製物中の幾つかの抗原のアップレギュレーションは、好ましくは、鉄制限条件下で増殖させたナイセリアの親株から外膜小胞を単離することにより達成される。培地内の低濃度の鉄は、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuBおよびP2086を含む、鉄獲得に関与するタンパク質の発現の増加をもたらす。それにより、関与遺伝子の組換え修飾(例えば、より強力なプロモーターの挿入または該遺伝子の追加的なコピーの挿入によるもの)を行わなくても、これらのタンパク質の発現がアップレギュレーションされる。本発明はまた、該遺伝子の組換え修飾をも用いる、鉄制限培地内での増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを含む。
多数の表面抗原は細菌株間で可変性であり、その結果、密接に関連した株の、限られた組に対してのみ、防御性であるに過ぎない。本発明の1つの態様は、他のタンパク質の発現が減少した、あるいは好ましくは、可変性表面タンパク質をコードする遺伝子が欠失した、本発明の外膜小胞を含む。そのような欠失により生じる細菌株が産生するブレブは、ワクチンとして投与されると、保存タンパク質(外膜上に保持されている)によってもたらされるワクチン被接種者の免疫系への影響がより大きいため、種々の株に対する交差反応性をより強く示す。本発明のブレブ免疫原性組成物においてダウンレギュレーションされうるナイセリアにおけるそのような可変性抗原の具体例には、PorA、PorB、Opaが包含される。
本発明の免疫原性組成物中のブレブは、WO01/09350に開示されているLPSの解毒方法により解毒されうる。特に、本発明のLPSの解毒方法は、WO01/09350に開示されているhtrBおよび/またはmsbB酵素のダウンレギュレーション/欠失を含む。ナイセリアのmsbBおよびhtrB遺伝子はそれぞれlpxL1およびlpxL2と称され(WO 00/26384)、これらの遺伝子の欠失突然変異は、一方の第2級アシル鎖を欠くmsbB-突然変異LOS、および両方の第2級アシル鎖を欠くhtrB-突然変異LOSにより、表現型により特徴づけられる。WO93/14155およびWO 95/03327は、本発明の組成物中で使用しうるポリミキシンBの無毒性ペプチド機能等価体を記載している。
被包性グラム陰性細菌からの細菌外膜ブレブの単離は、しばしば、莢膜多糖の同時精製をもたらす。場合によっては、この「混入」物質が有用となろう。なぜなら、多糖は、他のブレブ成分によりもたらされる免疫応答を増強しうるからである。しかし、場合によっては、細菌ブレブ調製物中の混入多糖物質の存在は、ワクチンにおけるブレブの使用に有害となろう。例えば、少なくともナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型Bの場合には、莢膜多糖は防御免疫を付与せず、ヒトにおいては有害な自己免疫応答を誘導しやすいことが示されている。したがって、ブレブの製造のために、莢膜多糖を含有しないように操作された細菌株から本発明の外膜小胞を単離することが可能である。したがって、該ブレブはヒトにおける使用に適しているであろう。そのようなブレブ調製物の特に好ましい一例は、莢膜多糖を欠くナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型Bからのものである。
本発明の免疫原性組成物はまた、サブユニット組成物および外膜小胞の両方を含みうる。可溶性の点でサブユニット組成物に加えるのに特に適した幾つかの抗原が存在する。そのようなタンパク質の具体例には、FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、AspAのパッセンジャードメイン、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQが含まれる。該外膜小胞調製物は、外膜小胞において組換えによりアップレギュレーションされている以下:NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA (高)、TbpA (低)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafBおよびPldAから選ばれる少なくとも1つの異なる抗原を有し、所望により、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を含みうる。
後述した特定の組合せにおいては、抗原の組合せがブレブ中に存在する場合には、抗原のそのような組合せを、前記のとおりにアップレギュレーションすべきである。
本発明の免疫原性組成物は更に、細菌莢膜多糖またはオリゴ糖を含みうる。該莢膜多糖またはオリゴ糖は、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型A、C、Yおよび/またはW-135、ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)b、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumoniae)、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)およびスタヒロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)のうち1以上に由来しうる。
本発明の免疫原性組成物は更に、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来のOMV調製物を含みうる。操作されたOMV調製物は、WO01/09350に記載のとおりにモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)から誘導されうる。アップレギュレーションには、以下の遺伝子(防御抗原をコードするもの)の1以上が好ましい:OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960)、HasR (PCT/EP99/03824)、PilQ (PCT/EP99/03823)、OMP85 (PCT/EP00/01468)、lipo06 (GB 9917977.2)、lipo10 (GB 9918208.1)、lipo11 (GB 9918302.2)、lipo18 (GB 9918038.2)、P6 (PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB (Helminen MEら, (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010)、D15 (PCT/EP99/03822)、OmplA1 (PCT/EP99/06781)、Hly3 (PCT/EP99/03257)、LbpAおよびLbpB (WO 98/55606)、TbpAおよびTbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980)、OmpE、UspA1およびUspA2 (WO 93/03761)、ならびにOmp21。それらはまた、他のグラム陰性菌内に異種的に導入されうる遺伝子としても好ましい。
本発明の免疫原性組成物は更に、ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)由来のOMV調製物を含みうる。操作されたOMV調製物は、WO01/09350に記載のとおりにヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)から誘導されうる。アップレギュレーションには、以下の遺伝子(防御抗原をコードするもの)のうち1以上が好ましい:D15 (WO 94/12641)、P6 (EP 281673)、TbpA (WO96/40929; WO95/13370)、TbpB (WO96/40929; WO95/13370)、P2、P5 (WO 94/26304)、OMP26 (WO 97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47およびHif (このオペロン内のすべての遺伝子は、ピリンをアップレギュレーションするためにアップレギュレーションされるべきである)。それらはまた、他のグラム陰性菌内に異種的に導入されうる遺伝子としても好ましい。
本発明の好ましい実施形態は、製薬上許容される賦形剤または担体をも含みうるワクチン中の本発明の免疫原性組成物の製剤である。
「ポリヌクレオチド」は、一般には、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAでありうる。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物でありうるDNAとRNAとを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAとの両方を含む三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドなる語には、1以上の修飾塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された主鎖を有するDNAまたはRNAも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような異常塩基が含まれる。DNAおよびRNAには種々の修飾が施されうるが、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の、典型的には天然で見出されるポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態が含まれる。「ポリヌクレオチド」にはまた、オリゴヌクレオチドとしばしば称される比較的短いポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のもう1つの態様は、ナイセリア疾患の治療または予防方法であって、それを要する宿主に本発明のワクチンの防御用量(または有効量)を投与することを含んでなる方法を含む。ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型A、B、C、YまたはW135および/またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)の感染が有利に予防または治療されうるであろう。
本発明者らは、ブレブ調製物およびワクチンに対する前記改良がゴーストまたは殺滅全細胞調製物およびワクチンに容易に拡張されうる(同じ利点を有する)と予想している。該ブレブ調製物の原料となる本発明の改変グラム陰性株は、ゴーストおよび殺滅全細胞調製物を製造するためにも使用することができる。グラム陰性株からのゴースト調製物(無傷エンベロープを有する空細胞)の製造方法は当技術分野においてよく知られている(例えば、WO 92/01791を参照されたい)。ワクチンに使用する不活化細胞調製物を製造するために全細胞を殺滅する方法もよく知られている。したがって、本発明の目的においては、「ブレブ[またはOMV]調製物」および「ブレブ[またはOMV]ワクチン」なる語ならびに本明細書の全体にわたって記載されている方法は、それぞれ「ゴースト調製物」および「ゴーストワクチン」ならびに「殺滅全細胞調製物」および「殺滅全細胞ワクチン」に適用可能である。
本発明のもう1つの態様は、本発明のワクチンでレシピエントを免疫し、該レシピエントから免疫グロブリンを単離する工程を含んでなる、ナイセリア感染の予防または治療に使用する免疫グロブリンの製造方法である。この方法により製造された免疫グロブリンは本発明のもう1つの態様である。本発明の免疫グロブリンと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物は、ナイセリア疾患の治療または予防用の医薬の製造において使用しうる本発明のもう1つの態様である。本発明の医薬製剤の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、ナイセリア感染の治療または予防方法は、本発明のもう1つの態様である。
以下の実施例は、特に断り書きが無い限り、当業者によく知られた通常の標準的な技術を用いて実施される。これらの実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
WO01/09350は、外膜小胞を製造するための、および外膜小胞が由来する該細菌株を操作するための詳細な方法を記載している。外膜小胞にリポタンパク質、例えばTbpB、および/またはリポ多糖を、保持させようとする場合には、デオキシコラートを低レベルで使用するかまたは使用しない単離方法が好ましい。
WO01/09350の実施例に記載のとおり、特定の地方においては、外膜小胞中のPorAの存在が有利となることがあり、改良された組換えブレブのワクチンの有効性を増強しうる。本実施例においては、本発明者らは、機能的cps遺伝子を欠くがPorAを発現する株におけるHsfタンパク質抗原の発現をアップレギュレーションするために修飾pCMK(+)ベクターを使用した。元々のpCMK(+)ベクターは、lacIqを発現する大腸菌(E. coli)宿主においては抑制されるがナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)においては転写活性があるキメラporA/lacOプロモーターを含有する。該修飾pCMK(+)においては、天然porAプロモーターを使用してhsf遺伝子の転写を駆動した。後記の表に記載のHSF 01-NdeIおよびHSF 02-NheIオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Hsfをコードする遺伝子をPCR増幅した。Hsf 01-NdeIプライマーの配列のため、発現されるHsfタンパク質は5'末端に2個のメチオニン残基を含有することになる。PCR増幅に用いる条件は、供給業者が記載している条件であった(HiFi DNAポリメラーゼ, Boehringer Mannheim, GmbH)。熱サイクルは以下のとおりであった:25回(94℃で1分、48℃で1分、72℃で3分)および1回(72℃で10分、4℃で回収まで)。ついで対応アンプリコンをpCMK(+)運搬ベクターの対応制限部位においてクローニングした。pCMK(+)-Hsfと称されるこの組換えプラスミドにおいては、組換えPCR法によりキメラporA/lacOプロモーター中に存在するlacOを欠失させた。pCMK(+)-Hsfプラスミドを鋳型として使用して次の2つの別々のDNA断片をPCR増幅した。
この実験の目的は、TbpA抗原の産生をアップレギュレーションするためにtbpA遺伝子の内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換することであった。その目的のために、大腸菌(E. coli)クローニング法を用いて、プロモーター置換プラスミドを構築した。tbpAコード配列の上流に位置するDNA領域(731bp)を、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)株ATCC 13090の民間Incyte PathoSeqデータベースにおいて見出した。このDNAは、TbpB抗原をコードする配列を含有する。該遺伝子はオペロンとして組織されている。tbpB遺伝子は欠失させられて、CmR/porAプロモーターカセットにより置換されるであろう。その目的のために、tbpB遺伝子の509bpの5'フランキング領域、2139bpのtbpBコード配列、87bpの遺伝子間配列およびtbpAコード配列の最初の483bpヌクレオチドに対応する3218bpのDNA断片を、取込み配列とNheIおよびHindIII制限部位(下線部)とを含有するオリゴヌクレオチドBAD16(5’- GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’)およびBAD17(5’-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3’)を使用して、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型BのゲノムDNAからPCR増幅した。このPCR断片をHigh Pure Kit(Boerhinger Mannheim, Germany)を用いて精製し、pGemTベクター(Promega, USA)内に直接クローニングした。(i)CmR/PorAプロモーターカセットのクローニングを可能にする適当な制限部位を挿入するために、および(ii)tbpBの209bpの5'フランキング配列およびtbpBコード配列を欠失させるために、このプラスミドをサークル(circle)PCR突然変異誘発(Jones & Winistofer (1992))に付した。該サークルPCRは、適当な制限部位XmaI、BglIIおよびXhoI(下線部)を含有するオリゴヌクレオチドBAD18(5’-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’)およびBAD19(5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G -3’)を使用して行った。適当な制限部位XmaI、SpeI、BglIIおよびXhoI(下線部)を含有するプライマーBAD21(5’- GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’)およびBAD20(5’- TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’)を使用して、既に記載されているpUC D15/Omp85プラスミドからCmR/PorAプロモーターカセットを増幅した。このPCR断片を該サークルPCRプラスミド中にクローニングした。このプラスミドは、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型B [cps-]および[cps- porA-]株を形質転換するために使用される。tbpAの上流領域における二重交差の組込みはtbpA ATGのすぐ上流へのporAプロモーターの挿入を導く。
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B株においてTbpAおよびHsfの発現を同時にアップレギュレーションすることであった。TbpAの産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること(プロモーター置換)によりアップレギュレーションした。この場合、tbpAの上流に位置するtbpB遺伝子は欠失しており、外膜内にTbpBタンパク質はもはや存在しない。Hsfの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入(相同組換え)によりアップレギュレーションした(遺伝子送達)。両方の株は、WO01/09350と称される別の特許に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー(CmRまたはKanR)は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。全ゲノムDNAをQiagen Genomicチップ500-Gプロトコールにより組換えNm.B(ナイセリア・メニンジティディス血清型B) cps-/TbpA+/PorA+株から抽出した。10μgのDNAをDraIII制限酵素で制限処理し、通常の形質転換プロトコールによりナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型Bを形質転換するために使用した。形質転換に使用した細胞は、組換えNmB(ナイセリア・メニンジティディス血清型B) cps-/Hsf+/PorA+(porA遺伝子座内への一重交差(1 crossing over)による相同組換え)または組換えNmB cps-/Hsf+/PorA-(porA遺伝子座内への2重交差(2 crossing over)による対立遺伝子交換/相同組換え)であった。それらを、200μg/ml カナマイシンを含有するGC寒天上で一晩プレーティングし、10mM MgCl2を含有するGC液体培地中にDO650= 0.1にまで希釈し、激しく攪拌しながら10μgのDraIII制限ゲノムDNAと共に37℃で6時間インキュベートした。二重交差事象(PCRスクリーニング)から生じた組換えナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)を、200μg/ml カナマイシンおよび5μg/ml クロラムフェニコールを含有するGC培地上で選択し、OMV調製物におけるTbpAおよびHsfの発現に関して分析した。図1に示すとおり、TbpAおよびHsfの産生は共に、TbpA/Hsf組換えNmB株から調製したOMVにおいては、対照NmB cps-株から調製したOMVの場合と比較して大幅に増加した。該二重組換え体における各タンパク質の過剰発現のレベルは、対応する一重組換え体において得られた発現のレベルに匹敵する。TbpAおよびHsfの過剰発現のレベルは、PorA+株およびPorA-株の場合と、匹敵するものであった(データは非表示)。総合すると、これらのデータは、(i)TbpAおよびHsfの発現が共におよび同時にナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)においてアップレギュレーションされうること、ならびに(ii)TbpAおよびHsfに関して富化された組換えブレブが入手可能であり免疫化に使用可能であることを示している。
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B株においてTbpAおよびNspAの発現を同時にアップレギュレーションすることであった。TbpAの産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること(プロモーター置換)によりアップレギュレーションした。NspAの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入(相同組換え)によりアップレギュレーションした(遺伝子送達)。両方の個々の株は別の特許WO01/09350に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー(CmRまたはKanR)は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。全ゲノムDNAをQiagen Genomicチップ500-Gプロトコールにより組換えNmB cps-/TbpA+/PorA+株から抽出した。10μgのDNAをAatII制限酵素で制限処理し、通常の形質転換プロトコールによりナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)血清型Bを形質転換するために使用した。形質転換に使用した細胞は組換えNmB cps-/NspA+/PorA-であった。それを、200μg/ml カナマイシンを含有するGC寒天上で一晩プレーティングし、10mM MgCl2を含有するGC液体培地中にDO650= 0.1にまで希釈し、激しく攪拌しながら10μgのAatII制限ゲノムDNAと共に37℃で6時間インキュベートした。二重交差事象(PCRスクリーニング)から生じた組換えナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)を、200μg/ml カナマイシンおよび5μg/ml クロラムフェニコールを含有するGC培地上で選択し、OMV調製物におけるTbpAおよびNspAの発現に関して分析した。TbpAおよびNspAの産生は共に、TbpA/NspA組換えNmB株から調製したOMVにおいては、対照NmB cps-株から調製したOMVの場合と比較して大幅に増加した。該二重組換え体における各タンパク質の過剰発現のレベルは、対応する一重組換え体において得られた発現のレベルに匹敵する。総合すると、これらのデータは、(i)TbpAおよびNspAの発現が共におよび同時にナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)においてアップレギュレーションされうること、ならびに(ii)TbpAおよびNspAに関して富化された組換えブレブが入手可能であり免疫化に使用可能であることを示している。
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B株においてNspAおよびD15/Omp85の発現を同時にアップレギュレーションすることであった。D15/Omp85の産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること(プロモーター置換)によりアップレギュレーションした。NspAの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入(相同組換え)によりアップレギュレーションした(遺伝子送達)。両方の株は別の特許WO01/09350に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー(CmRまたはKanR)は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。
ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)のHsf様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも4つの構造ドメインを示している。株H44/76のHsf配列を基準配列とすると、アミノ酸1-51を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸52-473を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近可能であるらしいパッセンジャードメインをコードしており、アミノ酸474-534を含むドメイン3は、タンパク質のオリゴマー化に必要な推定コイルドコイルドメインおよびヒンジ部(ネック部)をコードしており、残基535からC末端までを含むドメイン4は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される(Hendersonら (1998), Trends Microbiol. 6: 370-378; Hoiczykら (2000), EMBO 22: 5989-5999)。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため(試験した全ての株において80%を上回る;Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820に記載のとおり)、それらは興味深いワクチン候補の1つである。その目的のために、ドメイン2(Hsfパッセンジャードメインと称される)およびドメイン2 + 3(Hsfネック部+コイルドコイルドメインと称される)を大腸菌(E. coli)内で発現させ、大腸菌(E. coli)から精製した。末端RcaI(フォワードプライマー)およびXhoI(リバースプライマー)制限部位を付加するオリゴヌクレオチドを使用して、アミノ酸52-473(Hsfパッセンジャー)およびアミノ酸52-534(Hsf n + cc(ネック部+コイルドコイルドメイン))をコードするDNA断片をPCR増幅した。精製アンプリコンを、供給業者が推奨した条件中でRcaI/XhoIで消化し、ついでpET24d(Novagen Inc., Madison WI)大腸菌(E. coli)発現ベクターのNcoI(rcaIと互換性あり)/XhoI部位内にクローニングした。組換えプラスミドを選択し、それを使用して精製組換えプラスミドを調製した。発現を調べるために、これらのベクター(pET-Hsf pas & pET-Hsf ncc)を大腸菌(Escherichia coli)株Bl21DE3(Novagen)内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド(IPTG)調節性lacプロモーターの制御下に配置する。液体培養(700ml)のNovablue (DE3) [pET-24b/BASB029] 大腸菌(E. coli)組換え株を、600nmでの光学密度(OD600)が0.6に達するまで、攪拌下、37℃で増殖させた。その時点で、IPTGを1mMの最終濃度で加え、該培養物を更に4時間増殖させた。ついで該培養物を10,000rpmで遠心分離し、該ペレットを-20℃で少なくとも10時間凍結した。解凍後、該ペレット(680mlの培養物)を20mM リン酸バッファー(pH 7.0)に22℃で30分間再懸濁させ、ついでRannine破砕器への2回の通過による細胞溶解に付した。溶解した細胞を15,000rpm(Beckman J2-HS遠心機, JA-20ローター)、4℃で30分間かけてペレット化した。該上清を、20mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)で平衡化されたQセファロース・ファースト・フロー・カラム(Pharmacia)上にローディングした。貫流通過の後、カラムを5カラム容量の20mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)で洗浄した。該組換えタンパク質は250mM NaCl を含む20mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)により該カラムから溶出させた。抗原陽性画分をプールし、20mMリン酸バッファー(pH 7.0)に対して一晩透析した。0.5M NaClおよび20mMイミダゾールを該透析サンプルに加えた。ついでサンプルを、500mM NaClおよび20mMイミダゾールを含有する20mMリン酸バッファー(pH 7.0)中で平衡化されたNi-NTAアガロースカラム(Qiagen)上にアプライした。貫流通過の後、カラムを、500mM NaClおよび20mMイミダゾールを含有する5カラム容量の20mMリン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄した。混入物は20mMリン酸バッファー(pH 7.0)中の100mMイミダゾールにより溶出した。該組換えタンパク質は20mMリン酸バッファー(pH 7.0)中の250mMイミダゾールにより溶出した。抗原陽性画分をプールし、150mM NaClを含有する10mMリン酸バッファー(pH 6.8)に対して透析した。図2に示すとおり、約47kDa(推定相対分子量)に移動した富化された(純度はCBB染色SDS-PAGEにおいて90%を超えると推定される)Hsf様パッセンジャータンパク質が該カラムから溶出した。このポリペプチドは、5ヒスチジンモチーフに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に対して反応性であった。総合すると、これらのデータは、HsfパッセンジャーおよびHsf ncc遺伝子が共に、大腸菌(E. coli)内で組換え形態で発現可能であり精製可能であることを示している。
ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)のHap様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも3つの構造ドメインを示している。株H44/76のHap様配列を基準配列とすると、アミノ酸1-42を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43-950を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近可能であるらしいパッセンジャードメインをコードしており、残基951からC末端まで(1457)を含むドメイン3は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される。ドメイン2は表面に露出していると考えられ、よく保存されており(試験した全ての株において80%を超える)、大腸菌(E. coli)内でサブユニット抗原として産生されうるため、それは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため(試験した全ての株において80%を超える;Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820に記載のとおり)、それらは興味深いワクチン候補の1つである。その目的のために、ドメイン2(Hapパッセンジャードメインと称される)を大腸菌(E. coli)内で発現させ、大腸菌(E. coli)から精製した。末端NcoI(フォワードプライマー)およびXhoI(リバースプライマー)制限部位を付加するオリゴヌクレオチドを使用して、アミノ酸43-950(Hapパッセンジャー)をコードするDNA断片をPCR増幅した。精製アンプリコンを、供給業者が推奨した条件中でNcoI/XhoIで消化し、ついでpET24d(Novagen Inc., Madison WI)大腸菌(E. coli)発現ベクターのNcoI/XhoI部位内にクローニングした。組換えプラスミドを選択し、大規模精製した。発現を調べるために、これらのベクター(pET-Hap pass)を大腸菌(Escherichia coli)株Bl21DE3(Novagen)内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド(IPTG)調節性lacプロモーターの制御下に配置する。
マスター種からのアリコート画分(100μl)を、FEC013AAプレート(ダイズペプトンA3 20g/L, 酵母エキス 5g/L, NaCl 5g/L, 寒天 18g/L, 1Lまでの蒸留水)上に広げ、37℃で20時間培養した。該細菌叢を集め、NaCl 0.9%を含有する無菌水に再懸濁させた。この溶液を使用して、バッチ様式で使用する20L発酵槽内のFEC011AC培地(ダイズペプトン 24g/L, 酵母エキス 48g/L, MgSO4/7H2O 0.5 g/L, K2HPO4 2g/L, NaH2PO4/2H2O 0.45g/L, グリセロール (87%) 40g および1Lまでの蒸留水)に接種した。温度(30℃)、pH(6.8, NaOH 25% / H3PO4 25%)、圧力(500mbar)を一定に維持し、通気を20L/分に設定した。これらの条件において、攪拌を調整(100〜1000rpm)することにより、溶存酸素圧を20%に維持した。培養の8時間後(OD = 27.8)、誘導物質(IPTG, 1mM)を加えた。6時間後(OD = 49.2)および16H30(OD = 48.6)、サンプル(6L)を集めた。バイオマスを遠心分離により集め、対応ペレットを-20℃で保存した。
バッチ様式の発酵槽からHAPパッセンジャーを精製した。精製法を開発した(以下を参照されたい)。
ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)は、鉄が制限された際に分泌される、FrpAおよびFrpCと称される2つのRTXタンパク質をコードしている(Thompsonら, (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら, (1993) Infect. Immun.. 61:2906-2911)。RTX(Repeat ToXin;反復配列毒素)タンパク質ファミリーは共通して、それらのC末端付近に、コンセンサス配列Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa (LXGGXGN/DDX)を有する一連の9アミノ酸反復配列を有する。大腸菌(E. coli)HlyAにおける反復配列はCa2+の結合部位であると考えられる。図4に示すとおり、株FAM20において特徴づけられている髄膜炎菌FrpAおよびFrpCタンパク質は、それらの中央領域およびC末端領域においてはかなりのアミノ酸類似性を有するが、N末端においては(有するとしても)非常に限られた類似性しか有さない。さらに、FrpAとFrpCとの間で保存された領域は、9アミノ酸モチーフの反復性(FrpAにおいては13回およびFrpCにおいては43回)により幾らかの多型を示す。FrpAおよびFrpCのワクチンの能力を評価するために、本発明者らは、FrpAとFrpCとの間で保存されたタンパク質領域を大腸菌(E. coli)内で組換え法により製造した。その目的のために、フォワードプライマーFrpA-19(5’-CTCGAGACCATGGGCAAATATCATGTCTACGACCCCCTCGC-3’)およびリバースプライマーFrpA-18(3’-GTGCATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3’)を使用して、アミノ酸277-1007(ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)FAM20ペプチド配列の場合)を含むDNAセグメントをナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B H44/76ゲノムからPCR増幅した。それぞれ約1530bp(3反復)、約2130bp(13反復)および2732bp(23反復)の3つのアンプリコンを得、NcoIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼで消化した。ついでこれらの断片をpET24dのNcoI/XhoI(SalIと互換性あり)部位内に挿入し、組換えプラスミド(それぞれpET-Frp3、pET-Frp13およびpET-Frp23)を選択し、それらを使用して大腸菌(E. coli)BL21DE3細胞を形質転換した。図5に示すとおり、これらの構築物はすべて、誘導すると組換えFrpA/C保存ドメインを産生した。さらに、細胞分画分析による測定では、反復数が増加するにつれて、該組換えタンパク質の溶解度が増加した(データ非表示)。
3.5リットルの大腸菌(E. coli)Bl21DE3[pET-Frp23]を培養し、ODが0.6に達したら、2mM IPTGの添加により4時間誘導した。細胞を遠心分離により集め、対応ペレットを加圧破壊し、遠心分離により清澄化し、対応上清をNi2+イオン金属アフィニティーカラム(Ni-NTA-アガロース, Qiagen GmBh)上にローディングした。イミダゾールを溶出に使用し、最終的には、10mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、150mM NaClに対する十分な透析によりイミダゾール除去した。
ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)からのトランケート化FhaBのクローニング
QIAGENゲノムDNA抽出キット(Qiagen Gmbh)を使用して、ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型B株H44/76の1010個の細胞からゲノムDNAを抽出した。ついでこの物質(1μg)を、FhaB遺伝子に特異的なフォワードプライマー: JKP: 5'AAT GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3'および57JKP 5'CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3'を使用するポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に付した。該タンパク質のN末端の最初の1433個のアミノ酸をコードする約4200bpのDNA断片を得、NdeI/SpeI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pMG MCS(pMG誘導体, Proc Natl Acad Sci U S A 1985 Jan;82(1):88-92)の対応部位内に、標準的な分子生物学の技術(Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Fritsch & Maniatis編, Cold Spring Harbor press 1989)を用いて挿入した。Big Dye Cycle Sequencingキット(Perkin-Elmer)およびABI 373A/PRISM DNAシークエンサーを使用して、該クローン化FhaB断片のDNA配列を決定した(図1を参照されたい)。ついで組換えpMG-FhaBプラスミド(1μg)を、FhaBに特異的なプライマー:
および
を使用するポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に付した。4214bpのDNA断片を得、NdeI/XhoI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pET-24bクローニング/発現ベクター(Novagen)の対応部位内に、標準的な分子生物学の技術(Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Fritsch & Maniatis編, Cold Spring Harbor press 1989)を用いて挿入した。供給業者が記載している条件下でBig Dyesキット(Applied biosystems)を使用しABI 373/A DNAシークエンサー上で分析することにより、トランケート化FhaBを含有する組換えpET-24b(pET24b/FhaB2/3)の確認用配列決定を行った。得られたヌクレオチド配列を図6に示す。
pET24b/FhaB2/3クローニング/発現ベクターの構築は前記で説明した。このベクターは、(組換え産物のC末端において)6ヒスチジン残基ストレッチと融合させる状態で、株H44/76から単離されたトランケート化FhaB遺伝子を含有し、この遺伝子は、強力なバクテリオファージT7遺伝子10プロモーターの制御下に配置されている。発現を調べるために、このベクターを大腸菌(Escherichia coli)株Novablue(DE3)(Novagen)内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド(IPTG)調節性lacプロモーターの制御下に配置する。液体培養(100ml)のNovablue (DE3) [pET-24b/FhaB2/3] 大腸菌(E. coli)組換え株を、600nmでの光学密度(OD600)が0.6に達するまで、攪拌下、37℃で増殖させた。その時点で、IPTGを1mMの最終濃度で加え、該培養物を更に4時間増殖させた。ついで該培養物を10,000rpmで遠心分離し、該ペレットを-20℃で少なくとも10時間凍結した。解凍後、該ペレットをバッファーA(6M塩酸グアニジン, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0)に25℃で30分間再懸濁させ、針に3回通過させ、遠心分離(20000rpm, 15分間)により清澄化した。ついで該サンプルを1ml/分の流速でNi2+負荷Hitrapカラム(Pharmacia Biotech)上にローディングした。貫流通過後、カラムを40mlのバッファーB(8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0)、40mlのバッファーC(8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3)で順次洗浄した。ついで組換えタンパク質FhaB2/3/His6を、500mM イミダゾールを含有する30mlのバッファーD(8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3)カラムから溶出し、各3mlの画分を集めた。図7に示すとおり、約154kDa(推定相対分子量)に移動する、非常に富化されたFhaB2/3/His6が該カラムから溶出した。このポリペプチドは、5ヒスチジンモチーフに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に対して反応性であった。総合すると、これらのデータは、FhaB2/3が大腸菌(E. coli)内で組換え形態で発現可能であり精製可能であることを示している。
大腸菌(E. coli)内で発現させた部分精製組換えFhaB2/3/His6タンパク質をBalb/Cマウス(10匹/群)に3回、第0日、第14日および第29日に注射した。100μgのAlPO4上に吸着されたまたはSBAS2エマルション(1用量当たり5μgのMPLおよび5μgのQS21を含有するSB62エマルション)中に製剤化された2つの異なる製剤中の約5μgの抗原を動物に皮下注射した。SBAS2エマルションのみで免疫したマウスよりなる陰性対照群も該実験に加えた。特異的抗FhaB抗体を検出するために、第29日(2回目の注射の15日後)および第35日(3回目の注射の6日後)にマウスから採血した。プールした血清(マウス10匹/群からのもの)について、精製組換えFhaB2/3/Hisに対するELISAにより特異的抗FhaB抗体を測定した。
髄膜炎菌FHAB様、Hsf様およびHap様タンパク質に相同なタンパク質は重要なビルレンス決定因子であり、ボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)(FHA)およびヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)(HapおよびHsf)の細菌接着を媒介することが既に記載されている。上皮細胞および内皮細胞への接着は、髄膜炎菌の鼻咽頭でのコロニー形成および血液脳関門の通過のために決定的に重要であることが公知である。したがって、ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)の接着の阻害は、髄膜炎菌のコロニー形成および感染を抑制するための重要なアプローチの1つである。ここでは、本発明者らは、髄膜炎菌FHABの2/3、Hap様およびHsf様抗原に対して産生された抗血清が内皮細胞へのナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)の接着を妨げるかどうかを試験した。実験手順は以下を用いた。
こ試験で使用した髄膜炎菌試験株は無莢膜、無線毛、Opa-およびOpc-誘導体のNmA8013株であった。400μlのRPMI、50μlのウシ胎児血清、および接着阻止特性に関して試験すべき50μlの血清から構成される培地内で髄膜炎菌細胞(2.10E5コロニー形成単位(CFU)のNmA8013誘導体)を37℃で30分間インキュベートした。ついでこの混合物を、培地が既に除去されたヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のコンフルエント単層を含有するウェル内に入れる。細菌およびHUVEC細胞を37℃、5% CO2下で4時間インキュベートした。ついで細胞単層を新鮮なRPMI血清で3回洗浄し、ついで該プレートから剥がした。ついで、HUVEC細胞に伴うCFUを、連続希釈および該細胞ライセートのGCプレート上のプレーティングにより測定した。細胞結合髄膜炎菌の回収および増殖が可能となるよう、プレートを37℃で48時間インキュベートした。
抗FHA2/3、抗Hsf完全長(WO99/58683に記載されている)および抗Hap完全長(WO99/55873)抗体、ならびに対応HsfおよびHapパッセンジャードメインに対する抗血清は内皮HUVEC細胞への髄膜炎菌の接着を妨げる。図8は、AlPO4中に製剤化されたFHA 2/3により誘導された特異的抗体が、アジュバントのみの場合と比較してHUVEC細胞へのナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)Bの接着を抑制し得たことを示している。SBAS2アジュバントのみの場合(抗原無し、群4)と比較して、抗FHA 2/3抗体(SBAS2製剤)は尚も有効であるが、AlPO4ほどは強力ではない。SBAS2アジュバント(抗原無し)は単独では、接着を妨げうる抗体を誘導しない。群4と比較して、抗Hap抗体(群1)は若干の抑制効果を有しうる。群5においては、抗FHA 2/3抗体、抗Hsf抗体および抗Hap抗体の混合物を試験した場合には、該接着の抑制は抗FHA2/3のみの場合より強力であり、これは、抗Hap抗体および抗Hsf抗体によりもたらされる相乗効果を示唆している。第2の抑制実験(図2)においては、Hsf(候補タンパク質)を過剰発現する抗OMVに対する特異的ウサギ抗血清は、陰性対照(群3対4)と比較して内皮細胞へのナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)Bの固着を部分的に抑制することが可能であった。このウサギ抗血清は非常に高い特異的抗Hsf抗体力価を含有することを示している。rec Hsf(HsfパッセンジャーおよびHsf完全長)に対する抗体もHUVEC細胞上の細菌の接着を抑制しうる。これはマウス血清(群5〜6)およびウサギ血清(より低い程度である(laser extend))(群7〜8)の両方に当てはまる。この第2の実験においては、第1実験において既に試験した特異的抗rec FHA 2/3抗体(群1)の非常に高い抑制効果が証明されている。これらの結果は、これらの特異的抗原(Hap、FHA2/3およびHsf)が、単独でまたは組合せ物として、興味深いワクチン抗原であることを示している。
Balb/Cマウスにおいて、いつかの組換えOMVを、致死的チャレンジ後のそれらの防御効果に関して評価した。この能動免疫モデルは、皮下経路による一連の免疫化の後、いくつかの株の髄膜炎菌(鉄枯渇TSB培地に懸濁したもの)を成体Balb/CまたはOF1マウス(6〜8週齢)に腹腔内注射することを含むものであった。外的鉄源として使用した鉄デキストランは、感染動物において菌血症を維持し死を誘発するのに必要であるらしい。マウスにおけるこのIPモデルは、ビルレンス、免疫防御、および感染における鉄の役割を評価するのに有効であることが示されているが、それらは、ヒトにおいて菌血症および髄膜炎に先行する咽頭運搬段階を含んでいない。このモデルは、NspA、TbpAまたはHsfを過剰発現する本発明者らの幾つかのOMV候補をスクリーニングするために使用した。以下の実験においては、Al(OH)3(100μg Al(OH)3 /動物)(PV00N035およびPV00N043)またはAl PO4(100μg Al PO4/動物)に製剤化されたHsf、NspAまたはTbpAを過剰発現するrec.OMVの3(PV00N049)〜5μg(PV00N035およびPV00N043実験)でBalb/C(近交系)またはOF1(非近交系)マウスを皮下経路により3回、第0日、第14日および第28日に免疫した。ついで特異的Abの評価のために、第28日(2回目の免疫化の14日後)および第35日(3回目の免疫化の7日後)に動物から採血した。第35日に、チャレンジの1時間前に10mgの鉄デキストランを腹腔内注射する。該チャレンジはH44/76(B:15:P1.7,16)またはCU-385(B:4:P1.19,15)株で約1.10 e7 CFU/動物で行った(厳密なチャレンジ用量に関しては、結果の表を参照されたい)。CU-385株を用いて行った異種株は同種株を用いる場合より過酷(stringent)なものであった。第1日から第5日まで、死亡率を記録した。以下の表1に示すとおり、OMV TbpA (+)(porA(-)では1/10および3/5、ならびにporA (+)では9/10および3/5)、OMV NspA (+)(4/10および4/5)およびOMV Hsf (+)(3/10、2/10および3/5)を用いると、OMV por
A(-)と比較して、そしてそれより低い程度ではあるがOMV porA(+)と比較して、すでに良好な防御が認められる。これは、これらの3つの実験において本発明者らがなしうる全体的な観察である。これらのデータは、ブレブ表面で発現されるTbpA、HsfおよびNspA抗原が将来のmenBワクチンにとって重要であることを裏付けるものである。
Balb/Cマウスにおいて、いつかの組換え精製タンパク質を、致死的チャレンジ後のそれらの防御効果に関して評価した。この能動免疫モデルは、皮下経路による一連の免疫化の後、いくつかの株の髄膜炎菌(鉄枯渇TSB培地に懸濁したもの)を成体Balb/CまたはOF1マウス(6〜8週齢)に腹腔内注射することを含むものであった。
入手可能な種々の組換えOMV(OMV porA (+) rmp-LbpB, OMV porA (-) TbpA (+) Hsf (+), OMV porA (-) TbpA (+), OMV porA (-) NspA (+), OMV porA (-) Hsf (+), OMV porA (-) TbpA (+) NspA (+))を単独でまたは組合せ物として試験して、ワクチン候補のそのような組合せの相乗効果の検出において最良の組合せを統計的に決定することが可能である。また、この方法は、サブユニット抗原の組合せ、およびサブユニット抗原 + 組換えOMVの組合せを用いて行うことも可能である。32群の5匹/群のOF1マウスに注射し、該マウスモデルにおける血清殺菌・オプソニン活性、能動および受動防御に関して試験することが可能である(必要に応じて、準最適量の個々の抗原を使用する)。組合せ免疫化の後に付与される防御のレベルが個々の抗原の総和より高いかどうかが、相乗的な抗原組合せ物の指標となる。
HsfもしくはTbpAまたはHsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされた外膜小胞調製物中の15μgのタンパク質を、βメルカプトエタノールを含有するサンプルバッファーで希釈し、95℃で10分間加熱した。ついで該サンプルをSDS-PAGEポリアクリルアミドゲル(Novex 4-20% Tris-グリシン 1.5 m、二次元ウェル、SDS Page)上で泳動させ、クーマシーブルー中で1時間染色し、脱染剤での数回の洗浄により脱染した。結果を図9に示す。これは、HsfおよびTbpAのレベルが、それらの発現レベルが増強されたナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)外膜小胞調製物においては、かなり高いことを示している。
1群20匹のマウス群を筋肉内経路によりOMVで3回、第0日、第21日および第28日に免疫した。各接種物は、MPLと共にAlPO4で製剤化された5μg(タンパク質含量)のOMVを含むものであった。莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされるよう操作されたナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)株H44/76から、該OMVを得た。Hsf、TbpA、HsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされているOMV、またはそれらのいずれもがアップレギュレーションされていないOMVにおいて、比較を行った。第41日に、ELISAによる分析または血清殺菌アッセイのために、血液サンプルを採取した。
96ウェルマイクロプレート(Nunc, Maxisorb)を1μg/mlの特異的抗原含有PBS 100μlで4℃で一晩コートした。150mM NaCl、0.05% Tween 20で洗浄した後、プレートを、振とうしながら100μlの1% PBS-BSAで室温で30分間飽和させた。各工程(これは、0.2% PBS-BSAを希釈バッファーとして使用して、振とうしながら、室温で30分間行った)の間に、NaCl-Tween 20での洗浄により過剰な試薬を除去した。マイクロウェル当たり100μlの希釈血清サンプルを加えた。結合抗体をビオチン化抗マウスIg(Prosan)(1/2000)により認識させた。該抗原抗体複合体は、ストレプトアビジン-ビオチン化ペルオキシダーゼコンジュゲート(Amersham)(1/4000)と共にインキュベーションすることにより明らかにした。オルトフェニレンジアミン/H2O2(4mg/10mlのクエン酸バッファー 0.1M pH 4.5 + 5μl H2O2)を使用して該アッセイの結果を示す。プレートを暗所中、室温で15分間インキュベートした後、50μlの1N HClの添加により反応を停止させた。吸光度を490nmで測定した。
Hsf、TbpA、HsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされたOMV、または全くアップレギュレーションされていないOMVを接種したマウスからの抗血清の血清殺菌活性を、同種株H44/76または異種株Cu385を使用するアッセイにおいて比較した。血清殺菌アッセイは防御との良好な相関を示すことが示されており、したがって、防御免疫応答の惹起において候補組成物がどの程度有効であるかの良好な指標となる。
1群20匹のマウス群を筋肉内経路によりOMVで3回、第0日、第21日および第28日に免疫した。各接種物は、MPLと共にAlPO4で製剤化された5μg(タンパク質含量)のOMVを含むものであった。莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされるよう操作されたナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)株H44/76から、該OMVを得た。1つの群のマウスは、タンパク質のアップレギュレーションを伴わない対照OMVで免疫した。第2の群では、Hsf発現がアップレギュレーションされており、第3の群では、TbpA発現がアップレギュレーションされており、第4の群では、HsfとTbpAとの両方の発現がアップレギュレーションされていた。
標準的な分子生物学的方法を用いて、一連のトランケート化Hsf構築物を作製した。これらには、Hsfのシグナル配列を含有するアミノ酸1-54とHsfのアミノ酸134-592とをコードする構築物(Tr1Hsf)が含まれる。もう1つのトランケート化Hsfは、Hsfのシグナル配列のアミノ酸1-53およびそれに続くHsfのアミノ酸238-592を含有していた(Tr2Hsf)。前記の方法を用いて、これらの2つのトランケート化Hsf構築物および完全長Hsfをナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)B株MC58 siaD-, Opc-, PorA-内に導入して、それらの発現がアップレギュレーションされ外膜小胞が産生されるようにした。
PorAおよび莢膜多糖が前記のとおりにダウンレギュレーションされたナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)株H66/76を、前記の方法を用いてTbpAおよびHsf、LbpB、D15、PilQまたはNspAをアップレギュレーションするためのバックグラウンド株として使用した。前記のとおりに、外膜小胞を各株から調製した。前記の技術および当技術分野で公知の技術(PCT/EP99/02766、WO92/01460およびWO98/02547に記載のもの)を用いて、組換えFHAb、FrpC、FrpA/CおよびHapを作製した。
結果を以下の表に示す。同種H44/76株を使用するアッセイにおいては、第3の髄膜炎菌抗原に対する抗体の添加は、FrpCの場合を除き、TbpAおよびHsfのみに対する抗体を使用した場合に得られたものより高い血清殺菌力価をもたらさなかった。
LOS含量が約20%となるよう0.1% DOCでの抽出を用いて、WO01/09350に記載のとおりに、H44/76ナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)の2つの株を使用して外膜小胞調製物を調製した。株B1733はsiaD(-)、PorA(-)であり、これはTr1 Hsfがアップレギュレーションされており(実施例19)、lgtBはノックアウトされている。株B1820 B1733はsiaD(-)、PorA(-)であり、Tr1 Hsfはアップレギュレーションされており、lgtBはノックアウトされており、FrpBもノックアウトされている。LbpA/BおよびTbpA/Bのような鉄によって調節されるタンパク質がアップレギュレーションされるよう60μM デスフェラル(Desferal)で補足された培地内で両方の株を培養した。
Claims (14)
- ナイセリア膜結合タンパク質抗原GNA1870と、以下のカテゴリー:
a)少なくとも1つのナイセリア(Neisserial)アドヘジン、
b)少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
c)少なくとも1つのナイセリア毒素、
d)少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、
のうち少なくとも1つから選ばれる少なくとも1つの異なる抗原とを含んでなる免疫原性組成物であって、それらの抗原は、外膜小胞に存在する場合には、外膜小胞でアップレギュレーションされており、そのアップレギュレーションは未改変ブレブでの発現よりも少なくとも10%高い発現である、免疫原性組成物。 - GNA1870とLipo28、またはGNA1870とNMB0964が選択される、請求項1記載の免疫原性組成物。
- 請求項1または2記載の免疫原性組成物であって、該組成物が、
a)サブユニット組成物であるか、
b)外膜小胞において前記抗原がアップレギュレーションされている外膜小胞調製物を含むか、または
c)前記抗原の1以上を有するサブユニット組成物と、外膜小胞においてアップレギュレーションされている少なくとも1つの抗原を有する外膜小胞調製物とを含む、
免疫原性組成物。 - 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、
a)lgtBまたはlgtEのうち1以上からの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、
b)莢膜多糖を合成する能力を有さず、siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA、synBおよびsynCのうち1以上からの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、
c)OpC、OpAまたはPorAのうち1以上からの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、
d)FrpBの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、および/または
e)msbBおよび/またはhtrBからの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、
請求項3記載のb)またはc)の免疫原性組成物。 - 外膜小胞調製物が、外膜タンパク質に結合したLPSを含有する、請求項3のb)もしくはc)または請求項4記載の免疫原性組成物。
- ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)またはナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)に由来する抗原を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- すべてのナイセリア抗原がナイセリア・メニンジティディス(N. meningitidis)血清型Bに由来する、請求項6記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の免疫原性組成物と製薬上許容される担体とを含んでなるワクチン。
- 真核生物プロモーターにより発現が駆動される、GNA1870を含む少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質と少なくとも1つの異なるタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドを含んでなるワクチンであって、該タンパク質が、以下のカテゴリー:
a)Hsf、FhaB、NspA、PilC、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119およびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
b)Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspAおよびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
c)FrpA、FrpC、FrpA/C、VapDおよびNM-ADPRTよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア毒素、または
d)TbpA(高)、TbpA(低)、TbpB(高)、TbpB(低)、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964およびNMB0293よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質
のうち少なくとも1つから選ばれる、ワクチン。 - ナイセリア感染の治療または予防のための医薬の製造における、請求項8または請求項9記載のワクチンの使用。
- ナイセリア感染の治療または予防用の、請求項8または請求項9記載のワクチン。
- ナイセリア由来の少なくとも2つの抗原を1つに混合する工程を含んでなる、請求項1〜7のいずれか1項記載の免疫原性組成物の製造方法。
- ナイセリア培養物から外膜小胞を単離する工程を含んでなる、請求項3のb)もしくはc)または請求項4、5、6もしくは7記載の免疫原性組成物の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の免疫原性組成物と製薬上許容される担体とを一緒にする工程を含んでなる、請求項8記載のワクチンの製造方法。
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