CN1671413A - 包含革兰氏阴性菌来源的运铁蛋白结合蛋白和hsf疫苗组合物 - Google Patents

包含革兰氏阴性菌来源的运铁蛋白结合蛋白和hsf疫苗组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗革兰氏阴性菌感染的免疫原性组合物和疫苗。本发明免疫原性组合物包含运铁蛋白结合蛋白和Hsf，这两种抗原的组合显示为协同性作用，产生高血清杀菌测定活性的抗体。这种抗原组合可用于抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neissaria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)和流感嗜血菌(Haemophilus infulenzae)的疫苗。

Description

包含革兰氏阴性菌来源的运铁蛋白结合蛋白和HSF的疫苗组合物
                      技术领域
本发明涉及革兰氏阴性菌的免疫原性组合物和疫苗、它们的生产和这些组合物的药用用途。更具体的说，本发明涉及包含运铁蛋白结合蛋白和Hsf的疫苗组合物。这两种抗原的存在导致更高水平杀菌抗体的产生。
                      背景
革兰氏阴性菌是许多人类疾病的病原体，需要发展有效的疫苗对抗这些细菌。具体的说，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、马耳他布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、埃希氏大肠杆菌(Esherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)均为可通过免疫接种治疗的致病革兰氏阴性菌。
淋病奈瑟氏球菌为淋病的病原体，淋病是世界上最常报道的一种性传播疾病，估计其年发病率为6200万例(Gerbase et al 1998 Lancet351；(Suppl 3)2-4)。淋病的临床症状包括泌尿生殖道、咽喉或直肠的粘膜炎症和新生儿眼部感染。女性上行性淋球菌感染可导致不孕、宫外孕、慢性盆腔炎病以及形成输卵管脓肿。复杂型淋病伴有败血症、关节炎、心内膜炎和脑膜炎。
耐抗生素淋球菌的巨大数目导致淋病发病率及其并发症的增加。对淋病的抗生素疗法，一种有吸引力的替代方法是免疫接种预防。现在还没有针对淋病奈瑟氏球菌的疫苗。
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种重要病原体，特别是在儿童和青年成人中。败血症和脑膜炎是侵袭性脑膜炎球菌疾病(IMD)最危及生命的形式。由于其高发病率和高致死率，这种疾病已成为世界性健康问题。
基于其荚膜多糖抗原性差异，现已鉴定了十三种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群，最常见的是血清群A、B和C，它们引起了世界上90％的这类疾病。血清群B是欧洲、美国和一些拉丁美洲国家脑膜炎球菌疾病最常见的病因。
现已发展出基于血清群A、C、W和Y荚膜多糖的疫苗，这些疫苗控制了脑膜炎球菌疾病的爆发(Peltola et al 1985 Pediatrics 76；91-96)。但是血清群B的免疫原性很弱，只能引起主要为同型IgM的短暂抗体应答(Ala′Aldeen D and Cartwright K 1996，J.Infect.33；153-157)。现在还没有广泛有效抗血清群B脑膜炎球菌的疫苗，而此血清群正是在大多数温带国家中引起这类疾病的主要原因。这是一个特别棘手的问题，因为血清型B引起的疾病在欧洲、澳大利亚和美国的发生率正在上升，大多数是在5岁以下的儿童中。发展抗血清群B脑膜炎球菌的疫苗特别困难，因为其多糖荚膜免疫原性很弱，这是由于其荚膜与人神经细胞黏附分子的免疫性相似。因此生产疫苗的策略集中在脑膜炎球菌外膜的表面暴露结构上，但由于这些抗原在各菌株之间显著变化而受到阻碍。
进一步研究导致由外膜囊泡构成的疫苗的产生，外膜囊泡含有一些组成正常细菌膜成分的蛋白质。其中一个疫苗是VA-MENGOC-BC抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B和C的Cuban疫苗(Rodriguez et al1999 Mem Inst.Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro 94；433-440)。此疫苗被设计用于对抗古巴爆发的侵袭性脑膜炎球菌疾病，该疾病不能被使用荚膜多糖AC疫苗的接种计划清除。该疾病的主导血清群为B和C，VA-MENGOC-BC疫苗成功控制了疾病爆发，估计其抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B株的疫苗有效率为83％(Sierra et al 1990 In Neisseria，Walter Gruyter，Berlin，m.Atchman et al(eds)p 129-134，Sierra et al 1991，NIPH Ann 14；195-210)。此疫苗对特定的爆发有效，但引起的免疫应答不能防范脑膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
随后在拉丁美洲相同和不同脑膜炎球菌血清群B菌株引起的流行病流行期间进行的效力研究表明，此疫苗在较大儿童和成人中有一定效力，但在最具感染危险的较小儿童中其效力明显较低(Milagreset al 1994，Infect.Immun.62；4419-4424)。问题是这类疫苗在有多菌株地方性流行病的国家如联合王国有多大的效果。抗异株免疫原性的研究只表现出有限的交叉反应性血清杀菌活性，特别是在婴儿中(Tappero et al 1999，JAMA 281；1520-1527)。
挪威发展出第二个外膜囊泡疫苗，它使用的是斯堪的纳维亚普遍流行的血清型B中分离的菌株(Fredriksen et al 1991，NIPH Ann，14；67-80)。临床试验此疫苗，发现其29个月后保护率为57％(Bjune et al1991，Lancet，338；1093-1096)。
但是，在疫苗的使用中外膜囊泡涉及一些问题。例如，OMV含有有毒的脂多糖，而且它们含有的免疫显性抗原可为菌株特异性或其表达常常变异。已有一些方法可用来克服一些外膜囊泡制剂疫苗的问题。WO01/09350描述了解决某些这种问题的方法，例如降低毒性和修饰外膜囊泡上存在的抗原。
现有的抗脑膜炎球菌疫苗具有不同的问题。基于蛋白的外膜疫苗为特异性的，并只对少数菌株有效。多糖疫苗是次优的，因为它们引起较弱的短时免疫反应，特别是对于血清群B(Lepow et al 1986；Peltola 1998，Pediatrics 76；91-96)。
奈瑟氏球菌感染表明了一个重要的健康问题，对于这个问题，淋病奈瑟氏球菌没有疫苗可用，脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗的效力和防范异株的能力有限。显然现在需要发展更好的抗奈瑟氏球菌感染疫苗，它们能提高现有疫苗的效力，并防范更广范围的菌株。
                      附图简述
图1.考马斯染色的凝胶显示来源于不同脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜囊泡制剂中Hsf、TbpA和NspA的表达水平。1道-分子量标记；2道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖被下调；3道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调；4道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调，NspA被上调；5道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调，Hsf被上调；6道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调，TbpA被上调；7道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调，TbpA和Hsf被上调；8道-从H44/76菌株制备的外膜囊泡，其中荚膜多糖和PorA被下调，TbpA和NspA被上调。
                      发明详述
本发明公开了一种抗原的组合物，当抗原结合于免疫原性组合物或疫苗中时，可比单独给予抗原时诱导更高的杀菌抗体滴度。优选抗原组合物导致杀菌抗体的滴度协同效应性升高。由于杀菌抗体近似反映了候选疫苗的效力，疫苗中Tbp和Hsf的结合产生非常高效的疫苗。本发明另一个优点是Tbp和Hsf两个抗原的结合将能防范更广范围的菌株。
本发明涉及包含运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白或其抗原片段的免疫原性组合物。在与其它抗原形成的混合物中，这些蛋白质被分离或优选纯化到纯度或富集度至少为30％、40％，更优选为50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白可分离自或来源于相同或不同的革兰氏阴性菌株。
分离是指蛋白质被人工从其自然环境中分离出来。纯化是指在抗原与本发明免疫原性组合物的其它成分结合之前，被纯化到纯度至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
来源于是指编码蛋白质的基因来源自某个菌株或蛋白质纯化自某个菌株。因此，来源于包括独立表达系统中产生的重组蛋白，如果编码此蛋白的基因来源于所述细菌。
相互结合时，Tbp和Hsf表现出有利的相互作用，优选协同性引起杀菌活力(例如用血清杀菌检测法或SBA测量)更高的免疫应答，优选超过各抗原分别引起应答的累积，更优选其协同因子至少为1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9，最优选其协同因子至少为10。疫苗中加入Tbp和Hsf引起强烈的杀菌免疫应答，并防范多个菌株，较现有疫苗有显著的优势。
本发明的一个实施方案是包含运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白的免疫原性组合物。免疫原性组合物是包含至少一种给予宿主时可产生免疫应答的抗原的组合物。Tbp和Hsf样蛋白可来源于任何革兰氏阴性菌，包括粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血杆菌、博德特氏菌、奈瑟氏球菌(包括脑膜炎奈瑟氏球菌，它可以是血清群A、B、C、W135或Y，以及淋病奈瑟氏球菌)或上述革兰氏阴性菌菌株。本发明包括免疫原性组合物，其中Tbp和Hsf样蛋白来源于相同或不同的革兰氏阴性菌菌株。
运铁蛋白结合蛋白
运铁蛋白结合蛋白(Tbp)为革兰氏阴性菌外膜上的蛋白或蛋白复合物，它结合运铁蛋白。该家族中的某些蛋白可形成锚定于外膜的β桶。结构上，运铁蛋白结合蛋白可包含带TonB盒和活塞结构域的胞内N端结构域，以及与短胞内环和较长胞外环相连的多次穿膜β链。其它实例包括与整合膜蛋白相互作用形成复合物的脂蛋白。该家族蛋白的实例为TbpA和TbpB。术语Tbp包括单独存在或处于结合状态的这些蛋白，以及TbpA和TbpB形成的复合物。优选本发明免疫原性组合物中至少存在TbpA。
现已区分了TbpB的两个家族，它们分别具有高分子量和低分子量。TbpB的高分子量和低分子量形式(WO93/06861；EP586266)与不同家族TbpA相连(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)，这些TbpA根据其同源性区分。虽然具有相同分子量，TbpA因其与高分子量形式或低分子量形式TbpB相连而被分为高分子量家族和低分子量家族(Rokbi et al FEMS Microbiol.Lett.100；51，1993)。已知TbpA和TbpB在各种细菌中表达，包括脑膜炎奈瑟氏球菌(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)、淋病奈瑟氏球菌(WO92/03467；US5912336)、流感嗜血杆菌(Gray-Owen et alInfect.Immun.1995；63：1201-1210，Schryvers J.Med.Microbiol.1989；29：121-130；WO95/13370；WO96/40929)、大叶性肺炎放线杆菌、粘膜炎莫拉氏菌(Mathers et al FEMS Immunol.Med.Microbiol.1997；19：231；Chen et al Vaccine 1999；18：109；WO97/13785；WO99/52947)和溶血巴斯德氏菌(Cornelissen et al Infection andImmunity  68；4725，2000)。TbpA和TbpB也被分别称为Tbp1(NMB 0461)和Tbp2(NMB 0460)(Cornelissen et al Infection and Immunity  65；822，1997)。
本文使用的Tbp表示来源于革兰氏阴性菌的运铁蛋白结合蛋白，其来源包括粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血杆菌，优选奈瑟氏球菌，更优选脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌，最优选脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B。Tbp包含TbpA和TbpB以及高分子量和低分子量形式的TbpA及TbpB。Tbp包含上述单独存在的蛋白、该蛋白与其它任何蛋白的复合物及其可与运铁蛋白结合的复合物。
虽然Tbp可指任何高或低分子量形式的TbpA或TbpB，优选高分子量和低分子量形式的TbpA和/或TbpB存在于本发明的免疫原性组合物中。最优选存在高分子量和低分子量TbpA。
本发明的免疫原性组合物中还可考虑包含其它摄铁蛋白替代或补充Tbp。粘膜炎莫拉氏菌的摄铁蛋白包括TbpA、TbpB、Ton-B依赖受体、CopB(Sethi et al Infect.Immun.1997；65：3666-3671)、HasR、OmpB1和LbpB(Du et al Infect.Immun.1998；66：3656-3665；Mathers etal FEMS Immunol.Med.Microbiol.1997；19：231-236；Chen et alVaccine 1999；18：109-118)。流感嗜血杆菌的摄铁蛋白包括TbpB、HasR、TonB依赖受体、血红蛋白结合蛋白、HhuA、HgpA、HgbA、HgbB和HgbC(Cope et al Infect.Immun.2000；68：4092-4101；Maciveret al Infect.Immun.1996；64：3703-3712；Jin et al Infect.Immun.1996；64：3134-3141；Morton et al J.Gen.Microbiol.1990；136：927-933；Schryvers J.Med.Microbiol.1989；29：121-130)。脑膜炎奈瑟氏球菌来源的摄铁蛋白包括Tbp1(NMB 0461)、Tbp2(NMB 0460)、FbpA(NMB0634)、FbpB、BfrA(NMB 1207)、BfrB(NMB 1206)、LbpA(NMB 1540)、LbpB(NMB 1541)、也称为GNA2132的Lipo28(NMB 2132)、Sibp(NMB1882)、Ton B依赖受体(NMB 0964和NMB 0293)和HmbR(Tettelin et alScience 287；1809-1815 2000)。
本发明免疫原性组合物中包含的Tbp蛋白与WO93/06861和EP586266中所述来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpA和TbpB具有同源性；优选与WO93/06861和EP586266中所述TbpA和TbpB氨基酸序列的一致性超过40％、45％、50％、60％、70％，更优选超过80％或90％，最优选超过95％、96％、97％、98％、99％。
Tbp包含一些特殊区域。例如，在来源于脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76的TbpA中，氨基端186个氨基酸形成内部球形区域，22个跨膜β链，形成β桶结构。这些区域由短的胞内环和较大的胞外环连接。胞外环2、3和5具有最高程度的序列多样性，环5暴露于表面。环5和4涉及配体结合，优选本发明免疫原性组合物中包含TbpA片段。
除了本文所述的基因上调技术外，革兰氏阴性菌中的运铁蛋白结合蛋白还可通过在下述限铁条件下生长而被上调。在本发明免疫原性组合物中，外膜囊泡中的运铁蛋白结合蛋白被上调，上调优选通过使宿主菌株在限铁条件下生长达到。该方法还会导致各种铁调控蛋白的上调，特别是奈瑟氏球菌菌株中的FrpB和血红素/血红素结合蛋白利用蛋白C、流感嗜血杆菌中的HgpA和HgpB，它们可成为免疫显性的。因此用下述方法下调这些蛋白的表达(优选缺失编码它们的基因)是有利的，以确保本发明免疫原性组合物引起的免疫应答可抵抗多种菌株中存在的抗原。
Hsf样蛋白
Hsf样蛋白是自体转运(autotransporter)蛋白，与WO99/31132中发现的脑膜炎奈瑟氏球菌Hsf序列具有同源性；优选与WO99/31132中发现的Hsf氨基酸序列(优选SEQ ID NO 2、4、6或8)的同源性超过40％、50％、60％、70％，更优选超过80％，最优选超过90％，最优选超过95％、96％、97％、98％、99％。Hsf样蛋白为表面暴露蛋白，被认为有粘附素功能。这些蛋白形成多聚复合体，在感染和建群时表达。
许多革兰氏阴性菌中发现有Hsf样蛋白，包括脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、粘膜炎莫拉氏菌和埃希氏大肠杆菌。脑膜炎奈瑟氏球菌中发现的Hsf样蛋白的实例包括Hsf(也称为NhhA-NMB 0992)(WO99/31132)、Aida-1样蛋白(Peak et al 2000，FEMS Imm.Med.Microbiol.28；329)、IgA蛋白酶、Ssh-2、Hap(WO99/55873)、NadA(J.Exp Med.2002 195；1445)、UspA2和Tsh。粘膜炎莫拉氏菌中Hsf样蛋白的实例包括Hsf、UspA1(WO93/03761)、UspA2(WO93/03761)、外膜酯酶和YtfN。流感嗜血杆菌中Hsf样蛋白的实例包括Hia/Hsf(St Geme et al J.Bacteriol.2000 182：6005-6013)、Hap、IgA1蛋白酶、HMW1、HMW2(Barenkamp et al Infect.Immun.1992 60；1302-1313)、YadA、YadAc和YtfN(Hendrixson et alMol Cell 1998；2：941-850；St Geme et al Mol Microbiol.1994；14：217-233；Grass and St Geme Infect.Immunol.2001；69；307-314；St Gemeand Cutter J.Bacteriology 2000；182；6005-6013)。埃希氏大肠杆菌中Hsf样蛋白的实例包括Hsf、Hia和Hap。
Hsf具有自体转运蛋白常见的结构。例如，脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株的Hsf由以下部分组成：暴露于表面包含可变区(52-106，121-124，191-210和230-234位氨基酸)的蛋白氨基端的头区(52-479位氨基酸)、颈区(480-509位氨基酸)、疏水α螺旋区(518-529位氨基酸)和跨外膜的四个穿膜链所在的锚定区(539-591位氨基酸)。
Hsf可指包含1-51位氨基酸组成的信号序列的全长多肽。本发明也包含除去信号序列的Hsf，这样该多肽组成Hsf的成熟形式。其它Hsf优选形式可被截短以缺失WO01/55182中公开蛋白的可变区。优选变体包括缺失了1、2、3、4或5个WO01/55182中定义的可变区。优选变体缺失了52-237位间氨基酸残基或缺失了54-237位间氨基酸残基，更优选缺失了52-133位间氨基酸残基或55-133位间氨基酸残基。需要理解的是截短的变体可包含或不包含Hsf的1-51位氨基酸信号序列。上述序列和下述序列可在N端和C端的任一端或两端被截短或延长1、2、3、4、5、7、10或15个氨基酸。
当Hsf用于亚单位疫苗时，优选使用可溶性乘客域(passengerdomain)部分；例如52-479位氨基酸的完整结构域，最优选其保守部分例如134-479位氨基酸。
虽然优选使用全长Tbp和/或Hsf样蛋白(特别是TbpA和Hsf)、或其天然变体、或N端和/或C端缺少不超过60个氨基酸的全序列，Tbp和/或Hsf样蛋白的抗原片段也包含在本发明免疫原性组合物中。这些片段是从Tbp和Hsf样蛋白，优选TbpA和Hsf的氨基酸序列中取出的连续片段，包含至少10个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选30个氨基酸，更优选40个氨基酸，或最优选50个氨基酸。此外，抗原片段表示与抗体产生免疫学反应的片段，该抗体为抗脑膜炎奈瑟氏球菌Tbp或Hsf样蛋白抗体，优选抗TbpA或Hsf抗体，或为哺乳动物宿主被脑膜炎奈瑟氏球菌感染时产生的抗体。抗原片段还包括产生免疫应答的片段，该免疫应答特异性拮抗来源于革兰氏阴性菌的Tbp或Hsf样蛋白，优选TbpA或Hsf。这些片段优选防范其来源细菌的感染，优选防范奈瑟氏球菌感染，更优选防范脑膜炎奈瑟氏球菌感染，最优选防范脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B感染。
优选TbpA片段包含TbpA胞外环。使用脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株的TbpA序列时，这些环对应于环1的200-202位氨基酸、环2的226-303位氨基酸、环3的348-395位氨基酸、环4的438-471位氨基酸、环5的512-576位氨基酸、环6的609-625位氨基酸、环7的661-671位氨基酸、环8的707-723位氨基酸、环9的769-790位氨基酸、环10的814-844位氨基酸和环11的872-903位氨基酸。在序列对比后，对应的序列在其它Tbp蛋白中也组成优选片段。最优选片段包含组成Tbp环2、环3、环4或环5的氨基酸序列。
虽然上述Tbp或TbpA蛋白的优选片段涉及脑膜炎奈瑟氏球菌，本领域的技术人员能基于序列同源性，从所有上述革兰氏阴性菌株的Tbp或TbpA蛋白中轻易找出同等多肽，这些多肽也是本发明的片段。
优选Hsf片段包含Hsf整个头区，优选包含Hsf 52-473位氨基酸。其它Hsf优选片段包含头区的表面暴露区，包含52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479位氨基酸。最优选片段为用在本发明OMV制剂中的134-591和用在本发明亚单位组合物中的134-479。
虽然上述Hsf样蛋白或Hsf蛋白优选片段涉及脑膜炎奈瑟氏球菌，本领域的技术人员能基于序列同源性，从所有上述革兰氏阴性菌株的Hsf样蛋白或Hsf蛋白中轻易找出同等多肽，这些多肽也是本发明的片段。
本发明还包含Tbp和Hsf样蛋白，优选TbpA和Hsf的融合蛋白。这些融合蛋白可为Tbp和Hsf样蛋白的结合物，优选TbpA和Hsf，或其片段结合到同一多肽中。或者，本发明还包含Tbp和Hsf样蛋白各自的融合蛋白，优选TbpA和/或Hsf，或其片段的融合蛋白，使Tbp和Hsf样蛋白两者，优选TbpA和Hsf，或其片段均存在于本发明组合物中。例如TbpA或Hsf可与下述蛋白形成融合蛋白：β半乳糖苷酶、谷胱甘肽S转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc标记、聚组氨酸、或病毒/细菌表面蛋白如流感病毒血细胞粘附素、破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
可引入免疫原性组合物的分离运铁蛋白结合蛋白是本领域熟知的(WO0025811)。它们可由细菌宿主表达，用去污剂提取(例如2％Elugent)，用亲和层析或本领域熟知的标准柱层析技术(Oakhill et alBiochem J.2002 364；613-6)纯化。类似的，Hsf的分离可使用本领域熟知的技术完成。重组Hsf可在E.Coli或其它细菌菌株中表达。该蛋白可使用亲和层析纯化。如果在Hsf序列中引入了标记，这可成为常规程序。
发明人指出本文使用的术语“包含”、“包括”在所有场合可任选替换为术语“由……组成”、“组成为”。
疫苗组合
本发明涉及包括Tbp和Hsf样蛋白的抗原组合，所述组合有效引起高效抗革兰氏阴性菌的杀菌活性。本发明抗原性组合物可包含Tbp和Hsf外的抗原。它们可包含其它来源于革兰氏阴性菌蛋白抗原，优选来源于奈瑟氏球菌，更优选来源于脑膜炎奈瑟氏球菌。
脑膜炎奈瑟氏球菌
对于脑膜炎奈瑟氏球菌，本发明免疫原性组合物优选包含Hsf和TbpA。在OMV制剂中，优选Hsf和TbpA在OMV来源的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中上调。TbpA可以高或低分子量形式存在，优选高和低分子量形式都存在。Hsf优选作为膜整合蛋白截短物存在于OMV中，优选134-591位氨基酸。Hsf还可作为亚单位疫苗存在，优选为乘客域(氨基酸52-479)，最优选为乘客域134-479氨基酸位截短物。
可进一步向上述组合物中加入抗原(若存在于OMV中则上调)，例如，NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也称为D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO96/31618见SEQ ID NO：38)、FrpA(NMB 0585)或FrpC或至少30、50、100、500、750个氨基酸的两者相同保守部分(WO92/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117；Schryvers et al Med.Microbiol.1999 32：1117)、FhaB(WO98/02547 SEQ ID NO：38[3083-9025位核苷酸])、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(WO99/57280)(NMB0033)和ctrA(PCT/EP00/00135)。
优选本发明免疫原性组合物中抗原组合包含Tbp和Hsf样蛋白和FhaB的组合；Tbp和Hsf样蛋白和PilQ的组合；Tbp和Hsf样蛋白和NspA的组合；Tbp和Hsf样蛋白和FrpC的组合；更优选包含Tbp和Hsf样蛋白和Hap的组合；Tbp和Hsf样蛋白和FrpA/C的组合；Tbp和Hsf样蛋白和LbpB的组合；Tbp和Hsf样蛋白和D15的组合。最优选包含D15为外膜囊泡制剂的部分。
粘膜炎莫拉氏菌抗原
本发明免疫原性组合物中优选包含一个或多个下述粘膜炎莫拉氏菌来源的蛋白(优选TbpA和Hsf样蛋白来源于粘膜炎莫拉氏菌)：OMP106(WO97/41731 & WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、Lipo10(GB 9918208.1)、Lipo11(GB 9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME，etal(1993)Infect.Immun.61：2003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、OmplA1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785 & WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)，以及Omp21。
流感嗜血杆菌抗原
本发明免疫原性组合物中优选包含一个或多个下述流感嗜血杆菌来源的蛋白(优选TbpA和Hsf样蛋白来源于流感嗜血杆菌)：D15(WO 94/12641)、P6(EP 281673)、TbpA、TbpB、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO 97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47和Hif。
本发明另一个方面为包含本发明抗原性组合物和其它抗原的疫苗组合，该组合用于某些疾病状况时有优势，包括与病毒和革兰氏阳性菌有关的疾病。
在一个优选组合中，包含本发明Tbp和Hsf样蛋白的抗原性组合物用1、2、3或优选所有4个下述脑膜炎球菌荚膜多糖或寡糖配制：A、C、Y或W-135，它们可为单纯型或与蛋白载体结合的结合型。这种包含脑膜炎奈瑟氏球菌来源TbpA和Hsf的疫苗在用作全球脑膜炎球菌疫苗时有优势。优选包含结合型脑膜炎球菌荚膜多糖C、C和Y或A和C。
在一个更优选实施方案中，如上述优选用1、2、3或所有4个单纯型或结合型脑膜炎球菌荚膜多糖(或寡糖)A、C、Y或W-135配制的包含本发明TbpA和Hsf的抗原性组合物用结合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖或寡糖配制，和/或一个或多个单纯型或结合型肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖或寡糖。该疫苗还可任选包含一个或多个保护宿主抵抗肺炎链球菌感染的蛋白抗原。这种疫苗用作脑膜炎/链球菌肺炎疫苗时有优势。
在一个更优选的实施方案中，包含本发明Tbp和Hsf样蛋白的免疫原性组合物用荚膜多糖配制，该荚膜多糖来源于一个或多个下述细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A群链球菌、B群链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。在一个优选实施方案中，免疫原性组合物包含来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y其中一个或多个的荚膜多糖。一个更优选的实施方案包含来源于肺炎链球菌的荚膜多糖。肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选为选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。一个更优选的实施方案包含流感嗜血杆菌PRP荚膜多糖。一个更优选的实施方案包含5型、8型或336金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。一个更优选的实施方案包含I型、II型或III型表皮葡萄球菌的荚膜多糖。一个更优选的实施方案包含Ia型、Ic型、II型或III型B群链球菌荚膜多糖。一个更优选的实施方案包含A群链球菌荚膜多糖，更优选包含至少一种M蛋白，更优选包含多种M。
优选肺炎球菌蛋白抗原为暴露于肺炎球菌外表面的肺炎球菌蛋白(至少在肺炎球菌部分生命周期中可被宿主免疫系统识别)，或肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选该蛋白为肺炎链球菌毒素、粘附素、2-成分信号转导蛋白(2-component signal tranducr)或脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白包含但不限于：肺炎球菌溶血素(优选经化学处理或突变解毒)[Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)：4010″Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcuspneumoniae types 1 and 2.″，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989Jan 23；1007(1)：67-72″Expression of the pneumolysin gene inEscherichia coli：rapid purification and biological properties.″，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton et al)，WO99/03884(NAVA)]；PspA及其穿膜缺失突变体(US 5804193-Briles etAL.)；PspC及其穿膜缺失突变体(WO 97/09994-Briles et al)；PsaA及其穿膜缺失突变体(Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62″Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putativeadhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae″)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其穿膜缺失突变体；CbpA及其穿膜缺失突变体(WO97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect.Immun.199664：3544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMSMICROBIOL LETT 1998，164：207-14)；M样蛋白(EP 0837130)和粘附素18627(EP 0834568)。更优选的肺炎球菌蛋白抗原为WO 98/18931中公开的抗原，特别是选自WO 98/18930和PCT/US99/30390中的抗原。
本发明疫苗还可任选包含防范白喉(Diphtheria)、破伤风(tetanuss)和百日咳博德特氏菌中的一种或多种感染的抗原。百日咳成分可为灭活的完整百日咳博德特氏菌(Pw)或包含至少一个(优选所有3个)来源于PT、FHA和69kDa pertactin抗原的无细胞百日咳(Pa)。提供对白喉和破伤风防范的典型抗原为白喉类毒素和破伤风类毒素。所述类毒素可为化学失活的毒素或引入点突变的无活性毒素。
本发明疫苗还可任选包含一种或多种使宿主防范无定型(non-typeable)流感嗜血杆菌、RSV的抗原和/或一种或多种保护宿主防范流感病毒的抗原。这种疫苗用作全球中耳炎疫苗是有优势的。
优选无定型流感嗜血杆菌蛋白抗原包括丝束蛋白(US 5766608)和包含其多肽的融合蛋白(如LB1融合蛋白)(US 5843464-Ohio StateResearch Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap和D15。
优选流感病毒抗原包括生长于鸡蛋、MDCK细胞或Vero细胞中的完整存活或失活病毒、分裂流感病毒(split influenza virus)或完整流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)，或其纯化蛋白或重组蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白，或其组合。
优选RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
应领会的是本发明抗原性组合物可包含一种或多种来源于单一种类细菌的荚膜多糖。抗原性组合物还可包含来源于一种或多种细菌的荚膜多糖。
该荚膜多糖可为非结合形式或与载体蛋白结合，如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)、TbpA或Hsf。本发明一个实施方案包含与TbpA和Hsf结合的非结合荚膜多糖。
多糖结合物可通过任何已知结合技术制备。例如多糖可通过硫醚键结合。该结合方法用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖，形成氰酸酯。活化的多糖可直接结合或通过间隔基团连接到载体蛋白的氨基上。优选氰酸酯与己二胺偶合，氨基衍化多糖用涉及硫醚键形成的异种连接化学(heteroligation chemistry)方法结合到载体蛋白上。该结合物在Uniformed Services University的PCT公开申请WO93/15760中有所介绍。
结合物还可通过直接还原氨基化方法制备，如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中所述。其它方法如EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中所述。
另一个方法涉及通过碳二亚胺缩合，用己二酸酰肼(ADH)衍化的溴化氰活化多糖偶合到载体蛋白上(Chu C.et al Infect.Immunity，1983 245 256)。
包含外膜囊泡的抗原性组合物
本发明一个优选方面是在OMV中上调或过度表达Tbp和Hsf。革兰氏阴性菌通过连续两层膜结构即质膜和外膜与外界基质隔离。革兰氏阴性菌的外膜是动态的，根据环境条件可产生剧烈的形态变化。在这些表现中，对许多革兰氏阴性菌中的外膜囊泡的形成进行了记载和研究(Zhou et al 1998)。其中，一份不完全的产囊泡细菌病原体名单包括：百日咳博德特氏菌、布氏疏螺旋体、马耳他布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、鹦鹉热衣原体、砂眼衣原体、埃希氏大肠杆菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。虽然对其产生OMV/囊泡的生化机制还未完全了解，对这些外膜囊泡进行了详细的研究，因为它们代表分离天然构型外膜蛋白制剂的一种有力的方法学。在这种情况下，外膜制剂的使用对发展抗奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和衣原体的疫苗具有特别吸引力。而且，外膜囊泡联合多个合适蛋白或非蛋白抗原可带来扩展防范种内变体的效果。
本发明外膜囊泡具有上调的Tbp和Hsf样蛋白(优选TbpA和Hsf)。这可任选通过使Hsf样蛋白和Tbp在来源于一种革兰氏阴性菌的外膜囊泡中上调达到，优选奈瑟氏球菌菌株。Hsf样蛋白和Tbp还可各自在来源于不同革兰氏阴性菌菌株的外膜囊泡中上调，优选奈瑟氏球菌菌株。在一个优选实施方案中，Tbp和Hsf样蛋白，更优选TbpA和Hsf上调的不同奈瑟氏球菌菌株分别为L2和L3免疫型脑膜炎奈瑟氏球菌或L3和L2免疫型脑膜炎奈瑟氏球菌。
奈瑟氏球菌菌株来源囊泡制剂的制备可通过任何技术人员已知的方法进行。优选使用EP 301992、US 5,597,572、EP 11243或US 4,271,147、Frederikson et al.(NIPH Annals[1991]，14：67-80)、Zollinger et al.(J.Clin.Invest.[1979]，63：836-848)、Saunders et al.(Infect.Immun.[1999]，67：113-119)、Drabick et al.(疫苗[2000]，18：160-172)或WO 01/09350(实施例8)中公开的方法。一般OMV用去污剂提取，优选脱氧胆酸，核酸任选用酶法清除。任选用超速离心后排阻层析的方法纯化。若包含2个或更多不同本发明的囊泡，它们可混和装在一个容器中形成本发明的多价制剂(如果本发明的不同囊泡为在单独容器中的独立成分，将其同时给予[就医一次]宿主也认为是多价制剂)。OMV制剂通常经0.2μm滤器过滤除菌，优选储存在已知可稳定囊泡制剂的蔗糖溶液(如3％)中。
外膜囊泡制剂中Tbp和Hsf样蛋白的上调可通过在OMV制剂来源的革兰氏阴性菌中插入额外的基因拷贝实现。若非如此，OMV制剂来源的细菌菌株中基因启动子可被换为更强的启动子。这些技术在WO01/09350中有论述。与来源于未改造脑膜炎奈瑟氏球菌(如H44/76菌株)的OMV相比，蛋白的上调会导致OMV中存在更高水平的蛋白。优选水平高出至少1.2、1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。
当LPS为OMV中额外抗原时，可优选在OMV制备方法中使用低浓度去污剂(如脱氧胆酸或DOC)提取的方案，以保留高水平的结合LPS而除去特别有毒的弱结合LPS。所用DOC浓度优选为0-0.5％DOC，更优选0.02％-0.4％，0.03％-0.3％，0.04％-0.2％，0.05％-0.15％，0.05％-0.2％DOC，最优选接近或恰好0.1％DOC。
“强启动序列”指增加编码所需抗原的基因转录的调控元件。
“上调表达”指相对于未改造(即天然产生)囊泡，任何增强所需抗原表达的方法。应该理解的是“上调”的量因所需特定抗原不同而变化，但是不超过破坏囊泡膜完整性的量。抗原的上调指表达比未改造囊泡中高至少10％。优选高至少50％。更优选高至少100％(2倍)。最优选高至少3、4、5、7、10、20倍。优选在囊泡来源于限铁条件下生长的细菌时评估表达水平(例如在铁螯合剂存在下)。
或者，上调表达可指在代谢或营养改变时使表达不受条件限制的进行，特别对于TbpA、TbpB、LbpA和LbpB。
再次说明，术语“工程改造细菌菌株以产生更少所述抗原”或下调是指相对于未改造囊泡(即天然囊泡)，任何降低所需抗原表达(或功能基因产物的表达)的方法，优选为缺失，从而使表达比未改造囊泡至少低10％。优选低至少50％，最优选完全消除。如果下调蛋白为酶或功能蛋白，下调可通过引入一个或多个突变完成，该突变导致酶活力或功能活性下降10％、20％、50％、80％或优选下降100％。
改变奈瑟氏球菌蛋白表达要求的工程步骤可通过技术人员已知的多种方法进行。例如，可插入序列(如启动子或可读框)、通过转座子插入技术打断启动子/基因。例如，为了上调基因表达，可通过转座子在基因起始密码子上游最多2kb(更优选上游200-600bp，最优选上游约400bp)处插入强启动子。可使用点突变或缺失(特别对于下调基因的表达)。
但是这些方法可能极不稳定或不确定，因此优选工程步骤通过同源重组进行。优选此方法发生在两个序列之间：一个为细菌染色体至少30个核苷酸的序列(重组区)，另一个为转入此株细菌的载体至少30个核苷酸的序列(第二个重组区)。优选这些区域为40-1000个核苷酸，更优选为100-800个核苷酸，最优选为500个核苷酸)。这些重组区应有足够的相似性，这样它们可在严格条件下相互杂交。
本文中所述进行遗传改造的方法(如通过重组和引入其它基因序列到奈瑟氏球菌基因组中上调或下调基因表达)见WO01/09350中所述。典型可整合入奈瑟氏球菌的强启动子为porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst和hpuAB。优选组成性强启动子PorA和PorB。已被确定的是PorB启动子活性包含在对应于porB起始密码子上游-1到-250核苷酸的片段中。
通过在限铁条件下生长上调摄铁蛋白的表达
本发明外膜囊泡制剂中运铁蛋白结合蛋白的上调优选通过从限铁条件下生长的革兰氏阴性菌亲株中分离外膜囊泡实现。培养基中低浓度的铁导致涉及摄铁蛋白表达增加，包括TbpA和TbpB。这些蛋白的表达因此被上调而无需重组改造有关基因，如通过插入强启动子或插入额外的基因拷贝。本发明还包括通过使基因已被重组改造的菌株在限铁培养基中生长而上调运铁蛋白结合蛋白的方法。
限铁可通过向培养基中加入铁螯合剂实现。合适的铁螯合剂包括2，2-二吡啶、EDDHA(乙二胺-二(邻羟基苯乙酸))和Desferal(甲磺酸去铁胺，Sigma)。优选Desferal螯合剂，以10-100μM的浓度加入培养基中，优选25-75μM，更优选50-70μM，最优选60μM。培养基中铁主要来自酵母浸出物和大豆蛋白胨，各批中含量可有差异。因此对于不同批次培养基，不同浓度的Desferal可实现上调摄铁蛋白的最佳效果。熟练技术人员可轻易确定最佳浓度。一般来说，应向培养基中加入足够的铁螯合剂以上调所需铁调控蛋白的表达，但不应多至对细菌生长产生有害的效果。
优选将通过在限铁条件下生长使运铁蛋白结合蛋白上调的方法与重组上调Hsf样蛋白相结合，以获得本发明的外膜囊泡。
下调/除去可变的非保护性免疫显性抗原
许多表面抗原在细菌菌株间是可变的，其结果是保护只针对有限密切相关的菌株。本发明的一个方面包括含有Tbp和Hsf样蛋白的外膜囊泡，优选TbpA和Hsf，该外膜囊泡中其它蛋白的表达降低，或优选编码可变表面蛋白的基因被缺失。当在疫苗中给予缺失获得的产囊泡细菌菌株时，有更大潜力产生抗各种菌株的交叉反应，这是因为保守蛋白(保留在外膜上)对免疫者的免疫系统产生了较大影响。可变抗原的实例包括：对于奈瑟氏球菌：经历了抗原性变异的pili(PilC)、PorA、Opa、OpC、PilC、PorB、TbpB、FrpB；对于流感嗜血杆菌：P2、P5、pilin、IgA1蛋白酶；对于莫拉氏菌属：OMP106。
其它可被下调或关闭的基因是细菌体内容易打开(表达)或关闭的基因。这样基因编码的外膜蛋白不经常存在于细菌表面，襄泡制剂中这些蛋白的存在由于上述原因对疫苗的有效性也是有害的。一个下调或缺失的优选实例是奈瑟氏球菌Opc蛋白。含Opc囊泡疫苗引起的抗Opc免疫只有有限的保护作用，因为感染生物容易变为Opc-。这类蛋白另外的实例是流感嗜血杆菌HgpA和HgpB。
例如，这些可变或非保护性基因表达可被下调，甚至关闭。其优势是免疫系统集中作用在少量存在于囊泡外膜表面上的更好抗原上。
下调表达的方法在WO01/09350中公开。
下调免疫显性的外膜蛋白是指蛋白表达水平降低，优选关闭，或者突变和/或缺失暴露于表面的免疫显性环，使外膜蛋白免疫显性更低。下调蛋白酶功能是指蛋白表达水平降低或优选关闭，或者指酶功能的表现降低或优选消失。
优选用于制作本发明免疫原性组合物的脑膜炎球菌菌株具有下调、优选缺失PorA、OpA和Opc中的1、2或3个。优选PorA和Opa；PorA和OpC；OpA和OpC；PorA和Opa以及OpC被下调。
已知四个不同Opa基因存在于脑膜炎球菌的基因组中(Aho et al.1991 Mol.Microbiol.5：1429-37)，因此所述的Opa表达被下调是指优选1、2、3或(优选)所有4个存在于脑膜炎球菌中的基因被下调。下调可通过WO01/09350中所述遗传性实现，或通过从脑膜炎球菌Opa系中寻找容易找到的自然稳定不表达或低表达的菌株来实现。这些菌株可使用Poolman et al(1985 J.Med.Micro.19：203-209)中所述技术找到，其中Opa-细胞和表达Opa的细胞具有不同表型，该区别可通过在平板上或显微镜下观察细胞形态看到。一旦发现。稳定表现出Opa-的菌株可通过发酵后对细胞内容物进行Western blot确认其Opa的缺失。
当本发明外膜囊泡中运铁蛋白结合蛋白的上调是通过在限铁条件下生长实现时，可变铁调控蛋白也可上调。这些蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌中的FrpB(Microbiology 142；3269-3274，(1996)；J.Bacteriol.181；2895-2901(1999))，以及流感嗜血杆菌中的血红素/血红素结合蛋白利用蛋白C(J.Bacteriol.177；2644-2653(1995))和HgpA、HgpB和HgpC(Infect.Immun.66；4733-4741(1998)，Infect.Immun.67；2729-2739(1999)，Microbiology 145；905-914(1999))。本发明人已发现，当使用限铁条件上调运铁蛋白结合蛋白的表达时，至少下调这些蛋白中的可变蛋白是有利的。这可通过使用WO01/09350中所述方法实现，或通过缺失蛋白中可变部分实现。这会保证免疫原性组合物引起的免疫应答被引向较大范围的菌株中存在的抗原。FrpB的下调优选与本发明囊泡性免疫原性组合物中下述抗原下调结合：PorA和OpA；PorA和OpC；OpA和OpC；PorA和OpA和OpC，所述抗原来源于革兰氏阴性菌，优选粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血杆菌或奈瑟氏球菌(更优选脑膜炎奈瑟氏球菌)。在一个本发明的替代实施方案中，外膜囊泡中的FrpB被下调，该外膜囊泡来源于革兰氏阴性菌，优选粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血杆菌或奈瑟氏球菌(更优选脑膜炎奈瑟氏球菌)，任选在限铁条件下生长。
LPS的解毒
本发明免疫原性组合物中的OMV可通过WO01/09350中公开的LPS解毒方法解毒。具体的说，LPS的解毒方法涉及下调，优选缺失WO01/09350中所述的酶htrB和/或msbB。这些基因缺失突变株的表型特征为msbB-突变株的LPS与野生型相比失去了一条仲酰基链，htrB-突变株LPS失去了2(两者)仲酰基链。这些方法优选与涉及低浓度DOC提取OMV的方法结合，优选0-0.3％DOC，更优选0.05-0.2％DOC，最优选约0.1％DOC。
其它LPS解毒方法包括向囊泡制剂中加入功能等同于多粘菌素B[与脂质A高度亲和的分子]的无毒多肽(优选SAEP2)(功能等同于多粘菌素B的无毒多肽——特别是多肽SAEP2(序列KTKCKFLKKC中2个半胱氨酸形成二硫键)用途详见WO93/14115、WO95/03327、Velucchi et al(1997)J Endotoxin Res 4：1-12，和EP976402)。
多糖交叉反应
从荚膜革兰氏阴性菌中分离细菌外膜囊泡常导致荚膜多糖也被纯化。在某些情况下，此“污染物”是有用的，因为它可增强其它囊泡成分引起的免疫应答。但在其它情况下，细菌囊泡制剂中污染多糖物质的存在对疫苗中囊泡的使用是有害的。例如，已显示至少对于脑膜炎奈瑟氏球菌其血清群B荚膜多糖不引起保护性免疫，而且它容易引起有害的人体自身免疫应答。所以，本发明外膜囊泡可从产囊泡细菌菌株中分离，该菌株经工程改造没有荚膜多糖。此囊泡因而适合用于人体。一个特别优选的囊泡制剂实例是来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的缺乏荚膜多糖的菌株。一般外膜囊泡应从不能合成荚膜多糖的革兰氏阴性菌中分离，特别是上述msbB-的突变株。
这可通过使用改造的产囊泡菌株实现，该菌株中荚膜生物合成和/或输出所必需的基因受损。编码荚膜多糖生物合成或输出基因的失活可通过突变(点突变、缺失或插入)调控区、编码区或两者(优选使用上述同源重组技术)实现，或通过任何其它降低这些基因酶功能的方法。此外，荚膜生物合成基因的失活可通过反义过度表达或转座子诱变实现。优选方法为缺失某些或全部多糖生物合成和输出必需的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖(cps)基因。为达此目的，可使用置换质粒pMF121(Frosh et AL.1990，Mol.Microbiol.4：1215-1218中所述)以运载缺失突变cpsCAD(+galE)基因簇。
当上述本发明免疫原性组合物来源于脑膜炎球菌B菌株时，更优选也除去荚膜多糖(其包含人类相似多糖结构)。虽然许多基因可通过关闭实现此效果，本发明人已表明，优选产囊泡菌株通过遗传工程改造永久性下调siaD基因功能基因产物的表达(即下调α-2-8聚唾液酸转移酶活力)，优选通过关闭基因，最优选通过缺失全部或部分基因启动子和/或可读框。该失活作用如WO01/09350中所述。siaD(也称为synD)突变是许多可导致荚膜多糖中人类相似表位缺失的突变中最有优势的突变，因为它是仅有的对LOS保护性表位没有影响的突变中的一个，因此它在将LOS作为最终保护性抗原目标的方法中具有优势，而且它对细菌的生长影响最小。因此本发明一个优选方面是上述的免疫原性囊泡制剂，该制剂来源于lgtE-siaD-、lgtA-siaD-或优选lgtB-siaD-脑膜炎球菌B突变株。该菌株本身为本发明的另一个方面。
虽然由于上述原因优选siaD-突变株，可使用其它关闭奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌B)荚膜多糖合成的突变株。因此产囊泡菌株可被遗传改造永久性下调下列一个或多个功能基因产物的表达：ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(同synX和siaA)、synB(同siaB)或synC(同siaC)基因，优选通过关闭基因，最优选通过缺失所有或部分基因启动子和/或可读框。lgtE-突变可与一个或多个这些突变结合。优选lgtB-突变与一个或多个这些突变结合。因此本发明的另一个方面是上述免疫原性囊泡制剂，该制剂来源于有上述结合突变的脑膜炎球菌B菌株。该菌株本身是本发明的另一个方面。
LPS寡糖部分中的不均一性在不同奈瑟氏球菌中产生了结构多样性和抗原多样性(Griffiss et al.Inf.Immun.1987；55：1792-1800)。这被用于将脑膜炎球菌细分为12个免疫型(Scholtan et al.J MedMicrobiol 1994，41：236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫学上相同，其结构相似(甚至相同)，因此被称为L3，7，9(通称为“L3”)。脑膜炎球菌LPS L3，7，9(L3)、L2和L5可通过唾液酸化或加入胞嘧啶5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸修饰。虽然L2、L4和L6型LPS有免疫学差异，但是它们结构相似，并且本文中提及L2之处，在本发明范围内可任选用L4或L6取代。LPS结构和不均一性的说明详见M.P.Jennings etAL，Microbiology 1999，145，3013-3021和Mol Microbiol 2002，43：931-43。
由于L3或L2型LPS与人鞘糖脂中的乳-N-新四糖寡糖基团(lacto-N-neotetraose oligosaccharide group)(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-)存在结构相似性，L3或L2型LPS抗体的安全性已受到质疑。即使大量人群已用脱氧胆酸提取的含残量L3型LPS的囊疫苗安全免疫(G.Bjune et AL，Lancet(1991)，338，1093-1096；GVG.Sierra et AL，NIPH ann(1991)，14，195-210)，缺失LOS糖的末端部分对于防止任何与人组织表面结构发生的交叉反应是有利的。在一个优选实施方案中，lgtB基因的失活导致形成末端半乳糖残基和唾液酸缺失的LPS结构中间体(突变保留L2和L3型LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-结构)。该中间体可在L3和L2型LPS菌株中获得。一个替代性次优选(短)的LPS可通过关闭lgtE基因获得。一个更加替代性次优选的LPS可通过关闭lgtA基因获得。如果选择该lgtA-突变株，优选还关闭lgtC的表达以防止形成非免疫原性的L1免疫型。
最优选LgtB-突变，因为本发明人已发现这是最佳截短方式，可解决安全性问题而仍保留可引起杀菌抗体应答的LPS保护性寡糖表位。
因此，还包含L2或L3制剂(无论纯化型或分离型囊泡)或脑膜炎球菌囊泡制剂的本发明免疫原性组合物一般最好来源于遗传工程改造以永久性下调lgtB、lgtA或lgtE功能基因产物表达的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌)，优选通过关闭基因，最优选通过缺失全部或部分基因启动子和/或可读框。
包含各种lgt基因(包括lgtB和lgtE)的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本领域已知的(见M.P.Jennings et AL，Microbiology 1999，145，3013-3021和本文列举的参考文献，以及J.Exp.Med.180：2181-2190[1994])。
在囊泡制剂中，特别在用低浓度DOC提取的制剂中，LPS可用作本发明免疫原性组合物中的抗原。下调/缺失/失活lgtE、lgtA(特别是与lgtC结合)或者优选lgtB基因/基因产物的酶功能是有利的，以除去人类相似的乳-N-新四糖结构。包含用于生物合成LPS寡糖结构的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本领域已知的(Jennings etal Microbiology 1999 145；3013-3021和本文列举的参考文献，以及J.Exp.Med.180：2181-2190[1994])。优选下调/缺失lgtB(或功能基因产物)，因为它保留了完整的LPS保护性表位。
在本发明脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B囊泡制剂中，优选下调/缺失siaD和lgtB(虽然在脑膜炎球菌B产囊泡菌株中也可使用lgtB-与下述任何ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-(同synX-和siaA-)、synB-(同siaB-)或synC-(同siaC-)结合)，获得具有最佳安全性和保留LPS保护性表位的囊泡制剂。
本发明免疫原性组合物可包含至少1、2、3、4或5种不同外膜囊泡制剂。其中包含2种或更多OMV制剂时，每种OMV中至少一种本发明抗原被上调。这些OMV制剂可来源于相同种和血清群的奈瑟氏球菌，或优选来源于不同类、血清群、血清型、亚血清型或免疫型的奈瑟氏球菌。例如，免疫原性组合物可包含一种或多种包含L2免疫型LPS的外膜囊泡制剂，以及一种或多种包含L3免疫型LPS的外膜囊泡制剂。优选L2或L3型OMV制剂来源于LPS寡糖合成基因座相转变最小的稳定菌株。
优选的奈瑟氏球菌囊泡制剂
除了Hsf和Tbp外，在奈瑟氏球菌包括淋病球菌和脑膜炎球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌B)中进行上调时，优选一个或多个下述基因(编码保护性抗原)：NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB(NMB2039)、OMP85(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PIdA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO96/31618)、FrpA/FrpC(WO92/01460)、LbpA/LbpB(PCT/EP98/05117)、FhaB(WO98/02547)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(WO99/57280)、MafA(NMB0652)、MafB(NMB0643)、Omp26(NMB0181)、粘附素NMB0315、粘附素NMB0995、粘附素NMB1119、P2086(NMB0399)、Lip028(NMB2132)、NM-ADPRT(NMB1343)、VapD(NMB1753)和CtrA(PCT/EP00/00135)。它们也优选作为异源基因导入其它革兰氏阴性菌中。
优选下调一个或多个下述基因：PorA、PorB、PilC、LbpA、LbpB、Opa、Opc、HtrB、msbB和lpxK。
优选上调一个或多个下述基因：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
优选改造以下抑制调控序列：fur操纵基因区(特别对于TbpB基因或LbpB基因或两者)；DtxR操纵基因区。
优选下调一个或多个下述基因：galE、siaA、siaB、siaC、siaD、ctrA、ctrB、ctrC和ctrD。
本发明免疫原性组合物还可包含来源于革兰氏阴性菌的OMV/囊泡制剂，此革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血菌b。
优选的铜绿假单胞菌囊泡制剂
除了Hsf和Tbp，优选上调一个或多个下述基因(编码保护性抗原)：PcrV、OprF、OprI。它们也优选作为异源基因导入其它革兰氏阴性菌株中。
优选的粘膜炎莫拉氏菌囊泡制剂
除了Hsf和Tbp，优选上调一个或多个下述基因(编码保护性抗原)：OMP106(WO97/41731和WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB9918208.1)、lipo11(GB9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(HelminenME，et al(1993) Infect.Immun.61：2003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、Omp1A1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785，WO95/13370和WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)，以及Omp21。它们也优选作为异源基因导入其它革兰氏阴性菌株中。
优选下调一个或多个下述基因：CopB、OMP106、OmpB1、LbpA、和LbpB。
优选下调一个或多个下述基因：htrB、msbB和lpxK。
优选上调一个或多个下述基因：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
优选的流感嗜血杆菌囊泡制剂
除了Hsf和Tbp，优选上调一个或多个下述基因(编码保护性抗原)：D15(WO94/12641、WO95/12641)、P6(EP281673)、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hap、Hin47和Hif(应上调所有此操纵子中的基因以上调菌毛蛋白)。它们也优选作为异源基因导入其它革兰氏阴性菌株中。
优选下调一个或多个下述基因：P2、P5、Hif、IgA1蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和lpxK。
优选上调一个或多个下述基因：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
优选本发明的免疫原性组合物或疫苗不包含和/或由其组成：WO00/71725第3页18行到第52页2行的表中列出的SEQ ID具体组合和/或WO00/71725中实施例1-11所述任何个别组合。
优选额外的或替代的WO01/52885中公开的任何个体化组合在本发明中未要求保护。
疫苗制剂
一个本发明优选实施方案是疫苗中本发明的免疫原性组合物制剂，该制剂还可包含药学可接受的赋形剂或载体。
用任何前述改造过的菌株生产外膜囊泡制剂可通过任何本领域技术人员熟知的方法实现。优选使用EP301992、US5,597,572、EP11243或US4,271,147中公开的方法。最优选使用WO01/09350中公开的方法。
Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)中描述了疫苗制备的一般方法。
本发明的抗原性组合物在本发明疫苗制剂中可佐剂化。合适的佐剂包含铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但还可为钙盐(特别是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或者可为任何酰化酪氨酸、酰化糖、阳离子或阴离子衍生多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。
可使用的合适Th1佐剂系统包括，单磷酰脂质A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A，和单磷酰脂质A、优选3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。一个增强系统涉及WO94/00153中所述单磷酰脂质A与皂苷衍生物组合，特别是QS21和3D-MPL的组合，或者WO96/33739中所述反应原性更弱的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。一个特别有潜力的涉及水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂配方见WO95/17210中所述，并且这是优选配方。
本发明疫苗可包含皂苷，更优选QS21。它还可包含水包油乳液和生育酚。包含寡核苷酸的未甲基化CpG(WO 96/02555)也是优选的TH1应答诱导物，并适合用于本发明中。
本发明的疫苗制剂可用于保护或治疗易感染的哺乳动物，通过全身途径或粘膜途径给予所述疫苗。这些给药途径可包括肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下注射途径；或口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道粘膜给药的途径。因此本发明的一个方面为免疫人类宿主，使其抵抗革兰氏阴性菌感染导致的疾病，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的本发明囊泡制剂。
选择每剂疫苗中抗原剂量，此剂量在典型的免疫者中引起免疫保护应答而无显著的有害副反应。该剂量根据使用的特异性免疫原及其使用方式不同而变化。一般每剂包含1-100μg蛋白抗原，优选5-50μg，最典型在5-25μg范围内。
具体疫苗的最佳剂量可通过涉及观察受免疫者中适当免疫应答的标准研究确定。在首次接种后，受免疫者可以恰当的间隔接受一次或多次加强免疫。
本发明的多核苷酸
“多核苷酸”一般指任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸，它可为未修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、单链和双链区混和的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混和的RNA、包含单链或更典型双链或单链和双链区混和的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，为了稳定或其它原因具有修饰骨架的DNA或RNA。“修饰”碱基包括如三苯甲基化碱基和稀有碱基如次黄嘌呤核苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包含自然界一般存在的多核苷酸的化学、酶或代谢性修饰形式，以及病毒和细胞中特征性的DNA和RNA化学形式。“多核苷酸”还包含相对短的多核苷酸，常被称为寡核苷酸。
本发明的另一个方面涉及免疫学的/疫苗制剂，此制剂包含一种或多种编码Tbp和Hsf样蛋白的多核苷酸，特别是对应于本发明蛋白组合的多核苷酸。这些技术是本领域已知的，例如见Wolff et al.，Science，(1990)247：1465-8。
这些多核苷酸中Tbp和Hsf样蛋白，优选TbpA和Hsf，其表达受真核启动子调控，可在哺乳动物细胞中表达。多核苷酸还可包含编码其它抗原的序列。这些真核启动子的实例包含使用哺乳动物细胞作为宿主的病毒来源的启动子，包括腺病毒启动子、逆转录病毒启动子。此外，哺乳动物启动子也可用于驱动TbpA和Hsf样蛋白的表达。
抗体和被动免疫
本发明的另一个方面是使用包含TbpA和Hsf样蛋白的免疫原性组合物产生免疫球蛋白，该免疫球蛋白可用于治疗或预防革兰氏阴性菌感染，优选奈瑟氏球菌，更优选脑膜炎奈瑟氏球菌，最优选脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
用于产生多克隆抗体的接种物通过将抗原性组合物分散在生理学可接受的稀释剂中制备，该稀释剂如为生理盐水或其它适合用于人体的辅料，以形成水性组合物。给予哺乳动物免疫刺激量的接种物，保持接种哺乳动物一段足以使抗原性组合物诱导产生保护性抗体的时间。
抗体可通过熟知的技术如亲和层析分离到所需的纯度。
抗体可包括来源于各种常用动物的抗血清制剂，这些动物如山羊、灵长动物、驴、猪、马、豚鼠、小鼠或人。从这些动物取血并回收血清。
依照本发明生产的免疫球蛋白可包含完整抗体，抗体片段或亚片段。抗体可为任何种类的完整免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、对Tbp和Hsf有双重特异性的嵌合抗体或杂合抗体。它们也可为片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和包括杂合片段在内的类似物。免疫球蛋白还包含天然的、合成的或遗传工程改造的蛋白，该蛋白如抗体般作用，与特异性抗原结合形成复合物。
本方面的疫苗可给予作为在特异性攻击下产生免疫球蛋白来源的接受者。接受者捐献血浆，用传统血浆分离方法从中获得超免疫球蛋白。给予其它接受者以超免疫球蛋白，以传递抗奈瑟氏球菌感染抗性或治疗奈瑟氏球菌感染。本发明超免疫球蛋白对于治疗或预防奈瑟氏球菌疾病特别有用，在婴儿、免疫低下个体或治疗需要但没有时间使个体应答疫苗产生抗体时。
本发明另一个方面是包含单克隆抗体的药用组合物，该抗体与TbpA和Hsf反应的，可用于治疗或预防革兰氏阴性菌感染，优选奈瑟氏球菌，更优选脑膜炎奈瑟氏球菌，最优选脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
这类药用组合物包含的单克隆抗体可为任何种类的完整免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、对Tbp和Hsf样蛋白有双重特异性的嵌合抗体或杂合抗体。它们也可为片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和包括杂合片段在内的类似物。
制造单克隆抗体的方法是本领域熟知的，可包括将脾细胞与骨髓瘤细胞融合(Kohler and Milstein 1975 Nature 256；495；Antibodies-alaboratory manual Harlow and Lane 1988)。另外，单克隆Fv片段可通过筛选合适噬菌体展示文库(Vaughan TJ et al 1998 NatureBiotechnology 16；535)获得。单克隆抗体还可用本领域熟知的技术人源化或部分人源化。
血清杀菌测定
血清杀菌测定是检测免疫原性组合物中组合的抗原间协同关系的优选方法。这种协同应答的特征可为抗原组合引起的SBA相对于每个抗原单独引起的SBA，高出至少50％、2倍、3倍，优选4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，最优选10倍。优选测量对抗原来源的同源菌株的SBA，优选还测量对一组异源菌株的SBA。(代表性的抗原组见下，如属于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合物的B16B6(B:2a:P1.2)；以及H44/76(B:15:P1.7，16))。SBA是获得最广泛承认的评估脑膜炎球菌疫苗效力的免疫标记(Perkins et al.J InfectDis.1998，177：683-691)。令人满意的SBA可通过任何已知的方法确认。SBA可用从动物模型(见实施例6-9)或从人类受试者获得的血清进行。
用人血清进行SBA的更优选方法如下述。在第一次接种前、第二次接种后2月和第三次接种后1月取血样，(1年内接种三次为典型的人初种计划，给予时间例如为0、2和4月，或0、1和6月)。该人初种计划可在1岁以下婴儿中(例如在进行Hib免疫的同时)进行或在2-4岁儿童中进行，青少年也可按该初种计划进行接种以进行SBA测定。如果可行，初种后6-12个月和增强剂量后1月再取血样。
对于有同源杀菌活力的抗原或囊泡制剂，如果(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在1岁以下婴儿中)(初种计划)第三次疫苗剂量后1月，抗本发明抗原来源的脑膜炎球菌的活力在SBA(抗体稀释)滴度(与接种前滴度相比)方面上升了四倍的受试者，其占全部受试者的百分比大于30％，优选大于40％，更优选大于50％，最优选大于60％，则SBA是令人满意的。
当然，有异源杀活力的抗原或囊泡制剂也可为有同源杀菌活力的囊泡制剂，如果它可也可引起令人满意的抗其来源脑膜炎球菌的SBA。
对于有异源杀菌活力的抗原或囊泡制剂，如果(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在1岁以下婴儿中)(初种计划)第三次疫苗剂量后1月，抗三种异源脑膜炎球菌的活力在SBA(抗体稀释)滴度(与接种前滴度相比)方面上升了四倍的受试者，其占全部受试者的百分比大于20％，优选大于30％，更优选大于35％，最优选大于40％，则SBA是令人满意的。该试验是对具有异源杀菌活力的抗原或囊泡制剂能否诱导产生抗各种脑膜炎球菌菌株的交叉杀菌抗体的良好指示。三种异源菌株之间优选具有不同电泳型(ET)复合物或多座序列型(multilocus sequence typing)(MLST)图谱(见Maiden et al.PNAS USA1998，95：3140-5)，而且优选与有异源杀菌的抗原或囊泡制剂的来源菌株也不同。技术人员可轻易决定三种具有不同电泳型复合物的菌株，这些菌株反映了脑膜炎球菌中，特别脑膜炎球菌B型中的遗传多样性，它们被认作重大疾病的起因和/或代表公认的MenB高毒力系(见Maiden et al.同上)。例如可使用以下三种菌株：属于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合物的B16B6(B:2a:P1.2)；属于ET-5复合物的H44/76(B:15:P1.7，16)，或任何其它属于相同ET/簇的菌株。这些菌株可用于测试有异源杀菌活力的抗原或囊泡制剂，该制剂来源于或制自例如属于ET-5复合物的脑膜炎球菌CU385株(B:4:P1.15)。另一个可使用的实例菌株来源于3系流行病克隆(如NZ124[B:4:P1.7，4])。另一个ET-37株为NGP165(B:2a:P1.2)。
测定SBA活力的方法是本领域已知的。例如可使用的方法在WO99/09176的实施例10C中有介绍。一般来说，培养受试菌株培养物(优选在铁耗竭的情况下-通过向培养基中加入铁螯合剂如EDDA)于对数期。细胞可以悬浮于含BSA的培养基(如含0.3％BSA的Hanks培养基)中，调整到约20000CFU/ml，获得工作细胞悬液。混和2倍稀释受试血清(优选在56℃下加热30min失活)[例如50μl/孔的体积]和20000CFU/ml的受试脑膜炎球菌悬液[例如25μl/孔的体积]，制成系列反应混合物。振摇(如在210rpm下)并温育(如在37℃下15分钟)反应小瓶。最终反应混合物[如体积为100μl]还包含补体来源[如25％最终体积的预先测定的幼兔血清]，温育如上述[如37℃下60分钟]。无菌聚苯乙烯U形底96孔微量滴定板可用于此测定。可用多管移液器从每孔取出一等份[如10μl]，滴于Mueller-Hinton琼脂平板上(优选包含1％的Isovitalex和1％热失活马血清)上，温育(例如5％CO2中37℃下18小时)。优选每个平板上最多可数出80CFU的单个菌落。下述三个试样可用作对照：缓冲液+细菌+补体；缓冲液+细菌+失活补体；血清+细菌+失活补体。SBA滴度可使用程序直接计算，该程序用回归算法处理数据，给出对应于杀死50％细胞的稀释度。
本专利说明书引用的所有文献或专利申请通过整体引用结合到本文中。
                   本发明的工业应用方法
除非详细另有说明，下面的实施例使用本领域技术人员熟知和常规的标准技术进行。实施例用于说明而不是限制本发明。
实施例1：构建外膜囊泡制剂中使用的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌 株的方法。
WO01/09350提供了制备外膜囊泡和处理外膜囊泡来源细菌菌株的详细方法。当外膜囊泡需保留脂蛋白如TbpB和/或脂多糖时，优选用低浓度脱氧胆酸或不用脱氧胆酸的分离方法。
实施例2：缺少cps功能基因但表达PorA的重组脑膜炎奈瑟氏球菌 血清群B菌株中Hsf蛋白抗原的上调。
如WO01/09350实施例中所述，在某些国家，外膜囊泡中PorA的存在是有利的，可增强重组改良囊泡的疫苗效力。在下面实例中，我们采用改造的pCMK(+)载体在缺少cps功能基因但表达PorA的菌株中上调Hsf蛋白抗原的表达。原始pCMK(+)载体包含嵌合porA/lacO启动子，它在表达laclq的大肠杆菌宿主中被抑制，但在脑膜炎奈瑟氏球菌中有转录活性。改造的pCMK(+)中原porA启动子用于推动hsf基因转录。编码Hsf的基因用下表中的HSF01-NdeI和HSF02-NheI寡核苷酸引物进行PCR扩增。由于HSF01-NdeI引物序列，表达的Hsf蛋白在5′末端含有2个甲硫氨酸。采用供应商所述的PCR扩增条件(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。热循环如下：25次(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃3分钟)和1次(72℃10分钟，4℃直到回收)。对应的扩增子随后克隆到pCMK(+)传递载体相应的限制酶切位点中。在该称为pCMK(+)-Hsf的重组质粒中，我们通过重组扩增方法PCR缺失了嵌合porA/lacO启动子中的lacO。pCMK(+)-Hsf质粒用作PCR扩增2个单独DNA片段的模板：
-片段1包含porA 5′重组区、卡那霉素抗性基因和porA启动子。使用的寡核苷酸引物RP1(sacII)和RP2见下表。RP1引物与lac操纵子上游序列同源。
-片段2包含来源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA 3′重组区。使用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)见下表。RP3引物与lac操纵子下游序列同源。片段1的3′末端和片段2的5′末端有48个碱基重叠。500ng的各PCR(1和2)用于最终使用RP1和RP4的PCR反应。最终获得的扩增子亚克隆至SacII和ApaI内切的pSL1180载体中。用QIAGEN maxiprep试剂盒大规模纯化改造的质粒pCMK(+)-Hsf，用2μg该材料转化缺少cps功能基因的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株。为了保持porA的表达，通过PCR和蛋白质印迹筛选方法结合选择一次交换导致的整合。porA特异性PCR和蛋白质印迹确定的卡那霉素抗性试验阳性克隆储存于-70℃甘油保藏，用于进一步研究。细菌(对应于约5.108个菌体)重悬于50μlPAGE-SDS缓冲液，冷冻(-20℃)/煮沸(100℃)三次，用12.5％凝胶的PAGE-SDS电泳分离。检测来源于NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的完整细胞细菌裂解产物(WCBL)中Hsf的表达。考马斯染色检测到Hsf的表达显著增加(相对于内源Hsf水平)。此结果证实改造的pCMK(+)-Hsf载体是有功能的，可成功用于上调外膜蛋白的表达，而不消除主要PorA外膜蛋白抗原的产生。
本方面工作中使用的寡核苷酸
   寡核苷酸               序列       说明
Hsf01-Nde 5’-GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAAAAT ATA CCG C-3’ NdeI克隆位点
Hsf02-Nhe 5’-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACTGAT AAC CGA C-3’ NheI克隆位点
GFP-mut-Asn 5’-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAAGGA GAA GAA CTT TTC-3’ AsnI克隆位点与NdeI兼容
GFP-Spe 5’-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAGAGC TCA TCC ATG-3’ SpeI克隆位点与NheI兼容
RP1(SacII) 5’-TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATACAT CCC GTC-3’ SacII克隆位点
RP2 5’-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAAATT TGA GGG CAA ACA CCC GAT ACGTCT TCA-3’
RP3 5’-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCCTCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CATATG-3’
RP4(ApaI) 5’-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGACGG CGC AGC AGG-3’ ApaI克隆位点
实施例3：通过启动子置换上调脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的tbpA 基因。
本实验的目的是用强porA启动子置换tbpA基因的内源启动子区，以上调TbpA抗原的产生。为了该目的，用大肠杆菌克隆方法学构建启动子置换质粒。在脑膜炎奈瑟氏球菌ATCC 13090的私有IncytePathoSeq数据库中发现了tbpA编码序列上游DNA区(731bp)。此DNA包含编码TbpB抗原的序列。此基因位于一操作子中。缺失tbpB基因并用CmR/porA启动子盒取代。为了该目的，从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的基因组DNA中，PCR扩增对应于tbpB基因5′端509bp侧翼区、2139bp的tbpB编码序列、87bp的基因间序列和tbpA编码序列前483个核苷酸的3218bp的DNA片段，使用的寡核苷酸为包含摄取序列以及NheI和HindIII限制酶切位点(下划线)的BAD16(5′-GGC CTA  GCT  AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AATTTA TTC-3′)和BAD17(5′-GGC C AA GCT  TCA GAC GGC GTT CGACCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′)。用High Pure试剂盒(BoerhingerMannheim，Germany)纯化该PCR片段，直接克隆于pGemT载体(Promega，USA)中。该质粒经循环PCR诱变(Jones &Winistofer(1992))，其作用是(i)插入合适的限制酶切位点以克隆CmR/PorA启动子盒，以及(ii)缺失tbpB基因5′端209bp的侧翼序列和tbpB编码序列。循环PCR使用的寡核苷酸为包含合适限制酶切位点XmaI、BglII和XhoI(下划线)的BAD18(5′-TCC  CCC  GGG A AG  ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3′)和BAD19(5′-GGAAGA  TCT CCG  CTC  GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATATGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3′)。从前述pUC D15/Omp85质粒扩增CmR/porA启动子盒，使用包含合适限制酶切位点XmaI、SpeI、BglII和XhoI(下划线)的引物BAD21(5′-GGA  AGA  TCT CCGCTC  GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3′)和BAD20(5′-TCC  CCC GGG  AGA  TCT C AC  TAG  TAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)。该PCR片段克隆至循环PCR质粒中。该质粒用于转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B(cps-)和(cps-porA-)菌株。TbpA上游区中两次交换导致的整合引导porA启动子直接插入tbpA ATG的上游。
实施例4：构建TbpA和Hsf两种抗原表达上调的脑膜炎奈瑟氏球菌 血清群B菌株。
本实验的目的是在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株中同时上调TbpA和Hsf的表达。TbpA产生是通过将其内源性启动子区置换为强porA启动子(启动子置换)上调的。在这种情况下，位于tbpA上游的tbpB基因缺失，TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf的表达通过在porA基因座插入(同源重组)相应基因第二份拷贝(基因送递)上调。两个菌株已描述于另一专利WO01/09350中。两个方法中使用的选择标记(CMr或Kanr)允许二者整合组合到同一染色体中。
用Qiagen Genomic tip 500-G方案从重组脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B cps-/TbpA+/PorA+菌株中提取完整基因组DNA。10μg的DNA用DraIII限制性内切酶内切，用经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。用于转化的细胞为重组NmB cps-/Hsf+/PorA+(通过1次交换同源重组到porA基因座中)或重组NmB cps-/Hsf+/PorA-(通过2次交换等位交换/同源重组到porA基因座中)。在含有200μg/ml卡那霉素的GC琼脂平板培养过夜，在含10mM MgCl2的GC液体培养基中稀释到DO650＝0.1，与10μg经DraIII内切的基因组DNA在37℃下激烈搅拌下共同温育6小时。在含200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培养基上筛选两次交换得到的重组脑膜炎奈瑟氏球菌(PCR筛选)，分析其OMV制剂中TbpA和Hsf的表达。如图1所示，与制备自对照cps-菌株的OMV相比，制备自TbpA/Hsf重组NmB菌株的OMV中TbpA和Hsf两者产量显著增加。在双重重组株中每种蛋白的过度表达水平可与相应一次重组株中获得的表达水平相近。TbpA和Hsf的过度表达水平可与PorA+和PorA-菌株中相近(数据未显示)。综上所述，这些数据表明：(i)脑膜炎奈瑟氏球菌中TbpA和Hsf的表达可一起同时上调；以及(ii)可获得重组富含TbpA和Hsf的囊泡并用于免疫。
外膜囊泡Hsf和TbpA的含量分析
考马斯兰染色SDS-PAGE
15μg具有Hsf或TbpA或Hsf和TbpA两者均上调外膜囊泡制剂中的蛋白在含有β巯基乙醇的样品缓冲液稀释，95℃加热10分钟。样品在聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE(Novex 4-20％ Tris-甘氨酸1.5mm 2Dwell SDS Page)，在考马斯兰中染色1小时，脱色洗涤数次。结果如图1所示，它表明来源于Hsf和TbpA蛋白表达水平已增强的外膜囊泡制剂中Hsf和TbpA水平明显较高。
实施例5：Hsf和/或TbpA上调的OMV的免疫原性。
每组20只小鼠用OMV经肌肉内途径免疫三次，分别在0、21和28天。每次接种5μg(蛋白含量)用AlPO4和MPL配制的OMV。OMV来源于脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株，其经工程改造后荚膜多糖和PorA下调。比较Hsf、TbpA、Hsf和TbpA两者上调都或两者都不上调时的OMV。在第41天，取血样用ELISA或血清杀菌测定分析。
ELISA测定抗Hsf抗体
96孔微量滴定板(Nunc，Maxisorb)4℃下用100μl 1μl/mg特异性抗原PBS溶液包被。用150mM NaCl的0.05％Tween 20冲洗后，滴定板用100μl 1％PBS-BSA在室温下振摇饱和30分钟。在每个步骤之间(0.2％PBS-BSA作稀释缓冲液，在室温下振摇30分钟)，用NaCl-Tween20冲洗除去过量试剂。每孔中加入100ml血清稀释样品。结合抗体被生物素化抗小鼠Ig(Prosan)(1/2000)识别。抗原-抗体复合物用链霉抗生物素蛋白-生物素化过氧化物酶结合物(Amersham)(1/4000)显示。邻苯二胺/过氧化氢(4mg/10ml 0.1M柠檬酸缓冲液+5μl过氧化氢，pH4.5)用于显色检测。滴定板在黑暗中室温下温育15分钟，加入50μl 1N盐酸停止反应。读出490nm的吸光度。
    滴度中点(混和血清)
g1，囊泡TbpA-HSF，IM     15471
g2，囊泡TbpA，IM     15.41
g3，囊泡HSF，IM     14508
g4，囊泡CPS(-)PorA(-)，IM     -
g5，MPL/AlPO4，IM     -
上表所示结果表明，用有HSF或Hsf和TbpA两者均上调的OMV免疫，抗Hsf抗体滴度升高或相等。事实上用佐剂或Hsf和TbpA均未上调的OMV或只有TbpA上调的OMV接种，血清中不能检测到抗Hsf抗体。
实施例6：Hsf和/或TbpA上调OMV的抗血清的血清杀菌活力
用Hsf上调、TbpA上调、Hsf和TbpA均上调或均未上调的OMV接种小鼠，用同源H44/76菌株或异源Cu385菌株测定比较小鼠抗血清的血清杀菌活力。血清杀菌测定显示与保护作用良好的相关性，因此是候选组合物引起的保护性免疫应答效力的良好指示。
脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B野生型(H44/76株＝B:15 P1.7，16L3，7，9，CU385株＝B:4 P1.19，15 L3，7，9)在MR+1％Polyvitex+1％马血清Petri培养皿上37℃+5％CO2下培养过夜。它们在加入了50μMDesferal(铁螯合剂)的TSB液体培养基中37℃下振摇传代培养3小时，470nm下光密度达到约0.5。
56℃加热40分钟失活混和血清或单独的血清。血清样品在0.3％HBSS-BSA中1/100稀释，然后在圆底微量滴度板中连续稀释两倍(8个稀释度)(体积50μl)。
合适OD的细菌用0.3％HBSS-BSA稀释至每毫升1.3 10e4 CFU。37.5μl的此稀释物加入至血清稀释物中，微量滴定板37℃下振摇温育15分钟。然后每孔中加入12.5μl兔补体。37℃下振摇温育1小时后，微量滴定板置于冰上以停止杀菌。
采用倾斜法(tilt method)，每孔取20μl置于MH+1％Polyvitex+1％马血清Petri培养皿上，37℃+CO2下温育过夜。计数CFU，计算杀菌百分比。血清杀菌滴度为产生≥50％杀菌的最终稀释度。
                                                            H44/76                                  CU385
OMV                                          GMT            ％效应者数                GMT           ％效应者数
CPS(-)PorA(-)   93     30％   58     5％
CPS(-)PorA(-)Hsf   158     40％   108     20％
CPS(-)PorA(-)TbpA   327     60％   147     30％
CPS(-)PorA(-)Hsf-TbpA   3355     100％   1174     80％
在另两个类似实验中获得了与上表所示相似的结果。
用Hsf和TbpA两者均上调的OMV接种后，可发现抗同源和异源菌株杀菌滴度(GMT)显著增加。通过比较，用Hsf或TbpA上调OMV接种的小鼠其杀菌GMT与用对照OMV接种的小鼠其杀菌GMT相似。
双重上调的益处也在产生显著水平杀菌抗体(滴度大于1/100)小鼠的百分比中清楚的观察到，特别在使用异源菌株的实验中。
实施例7：混和抗HSf和抗TbpA血清对杀菌活力的效果
每组20只小鼠用OMV经肌肉内途径免疫三次，分别在0、21和28天。每次接种5μg(蛋白含量)用AlPO4和MPL配制的OMV。OMV来源于脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株，其工程改造后荚膜多糖和PorA下调。一组小鼠用没有蛋白上调的对照OMV免疫。第二组中Hsf表达上调，第三组中TbpA表达上调，第四组中Hsf和TbpA的表达均上调。
混和同组小鼠的血清或混和来自只有Hsf或TbpA上调组的血清。测定每个混和血清的血清杀菌活力，结果如下表所示。
用下述制剂免疫小鼠混和血清进行的SBA   SBA滴度
    TbpA-Hsf囊泡     774
    TbpA囊泡     200
    Hsf囊泡     50
    CPS(-)PorA(-)囊泡     50
    抗TbpA+抗Hsf混和血清     1162
上表所示的结果表明，混和抗Hsf和抗TbpA抗血清得到的血清杀菌活力比单独用任何一个抗血清得到的活力高得多。抗Hsf抗体和抗TbpA抗体两者共同存在可产生协同效应。
实施例8：截短的Hsf蛋白可与TbpA协同结合
采用标准分子生物学方法得到一系列截短的Hsf构成物。它们包括编码含有Hsf信号序列的1-54位氨基酸的构成物和Hsf(Tr1Hsf)的134-592位氨基酸构成物。第二个截短的Hsf包含Hsf信号序列1-53位氨基酸，其后是Hsf 238-592位氨基酸(Tr2Hsf)。这两个截短的Hsf构成物和全长Hsf引入脑膜炎奈瑟氏球菌B株MC58 siaD-、Opc-、PorA-中，上调它们的表达并采用上述方法生产外膜囊泡。
外膜囊泡制剂吸附于Al(OH)3上，在0、21和28天注射到小鼠体内。在第42天从小鼠取血并制备血清。将此血清与接种TbpA上调OMV的小鼠的血清混和，按上述方法进行血清杀菌测定。
结果
                                                                        血清杀菌滴度
组别                                                           H44/76                     CU385
 MC58 PorA+siaD+MC58 PorA-siaD-HsfMC58 PorA-siaD-Tr1HsfMC58 PorA-siaD-Tr2Hsf阴性对照  25600153010155050  2560080013605050
 TbpA+MC58 PorA+siaD+TbpA+MC58 PorA-siaD-HsfTbpA+MC58 PorA-siaD-Tr1HsfTbpA+MC58 PorA-siaD-Tr2HsfTbpA+阴性对照  25600259543831568778  2418214382891742532
上表结果表明，第一个截短物(Tr1Hsf)引起免疫应答，此应答可与抗TbpA的抗血清结合产生比使用全长Hsf与抗TbpA的抗血清结合更大的血清杀菌活力。但是，截短的程度非常重要，与全长Hsf相比Tr2中的截短作用有不利的影响。Tr1Hsf增强的杀菌活力可抵抗使用的两种菌株。
实施例9：抗TbpA、Hsf和第三种脑膜炎球菌蛋白抗体的血清杀菌 活力。
如上述脑膜炎奈瑟氏球菌H66/76株中PorA和荚膜多糖下调，该菌株作为背景菌株，用上述方法上调TbpA和Hsf、LbpB、D15、PilQ或NspA。如上述从每株菌中制备外膜囊泡。用本领域熟知的方法制备重组FhaB、FrpC、FrpA/C和Hap，如PCT/EP99/02766、WO92/01460和WO98/02547中所述。
外膜囊泡制剂和重组蛋白吸附于Al(OH)3上，在0、21和28天注射到小鼠体内。在第42天从小鼠取血并制备血清。抗TbpA和Hsf上调OMV的血清与接种LbpB、D15、PilQ或NspA上调OMV或接种重组FhaB、FrpC、FrpA/C或Hap的小鼠的血清混和，血清杀菌测定按上述方法进行。
结果
结果如下表所示。在使用同源H44/76菌株的测定中，加入抗第三种脑膜炎球菌抗原的抗体，除FrpC外，不能产生比单独使用抗TbpA和Hsf抗体更高的血清杀菌滴度。
但是，在使用异源菌株的血清杀菌测定中，加入抗第三种抗原的抗体是有利的。抗D15(OMP85)、Hap、FrpA/C和LbpB的抗体对增加抗CU385菌株的血清杀菌滴度特别有效。
                                                                                        血清杀菌滴度
抗血清混合物                                                       H44/76                         CU385
抗TbpA-Hsf和非免疫血清抗TbpA-Hsf和抗FhaB抗TbpA-Hsf和抗Hap抗TbpA-Hsf和抗FrpA/C抗TbpA-Hsf和抗LbpB抗TbpA-Hsf和抗D15抗TbpA-Hsf和抗PilQ抗TbpA-Hsf和抗NspA抗TbpA-Hsf和抗FrpC  537852604577503454004823470847386082  214125635150435848344657224225182300
实施例10：外膜囊泡中的FrpB敲除对它们在同源和异源菌株引起 杀菌免疫应答能力的影响。
两株H44/76脑膜炎奈瑟氏球菌按WO01/09350中所述用于制备外膜囊泡制剂，用0.1％DOC提取，使LOS含量为约20％。B1733菌株为siaD(-)、PorA(-)，具有上调的Tr1Hsf(实施例8)，lgtB被敲除。B1820 B1733菌株为siaD(-)、PopA(-)，具有上调的Tr1Hsf，lgtB被敲除，FrpB也被敲除。两株菌在加入了60μM Desferal的培养基中培养，这样铁调控蛋白如LbpA/B和TbpA/B被上调。
囊泡制剂吸附于Al(OH)3上，在0和21天肌内注射5μg到每组30只小鼠体内。在第28天取血样。
对三种L3菌株(同源野生型H44/76株和两株异源L3；NZ124和M97250687)进行血清杀菌测定，如实施例6中所述。
结果
用于接种的囊泡     H44/76GMT    SC     M97250687GMT    SC       NZ124GMT    SC
 B1733   1518   30/30    151    11/30      70    4/29
 B1820   781    19/30    1316   24/30      276   19/30
GMT表示SBA中血清滴度的几何平均数。
SC表示血清转变小鼠(SBA滴度＞1/100)的数目。
结果清楚的显示，FrpB敲除(B1820)囊泡比FrpB(+)囊泡(B1733)引起更好的异源交叉杀菌应答。在M97250687和NZ124菌株中，SBA滴度更高，血清转变小鼠的比例也更高。同源菌株中缺失FrpB的结果不佳。
这些数据表明FrpB促进免疫应答，但由于此外膜蛋白高度易变，抗此蛋白的抗体只能杀死同源菌株。

Claims (71)

1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含来源于相同或不同革兰氏阴性菌的分离的运铁蛋白结合蛋白(Tbp)或其抗原片段和分离的Hsf样蛋白或其抗原片段。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其片段和Hsf样蛋白或其片段来源于奈瑟氏球菌(Neisseria)。
3.权利要求1-2任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其片段来源于脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)。
4.权利要求1-3任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白或其片段来源于脑膜炎奈瑟氏球菌。
5.权利要求1-4任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其片段来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
6.权利要求1-5任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白或其片段来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
7.权利要求1-6任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其片段来源于淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)。
8.权利要求1-7任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白或其抗原片段来源于淋病奈瑟氏球菌。
9.权利要求1-8任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其抗原片段来源于粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)。
10.权利要求1-9任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白或其抗原片段来源于粘膜炎莫拉氏菌。
11.权利要求1-10任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白或其抗原片段来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。
12.权利要求1-11任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白或其抗原片段来源于流感嗜血杆菌。
13.权利要求1-12任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白为TbpA或其抗原片段。
14.权利要求13的免疫原性组合物，所述组合物含有高分子量型TbpA或低分子量型TbpA、或者高分子量型TbpA和低分子量型TbpA两者都含有。
15.权利要求1-14任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白为Hsf或其抗原片段。
16.权利要求1-15任一项的免疫原性组合物，所述组合物含有Tbp和/或Hsf样蛋白的抗原片段，所述抗原片段能产生抗奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌或流感嗜血杆菌感染的保护性反应。
17.权利要求16的免疫原性组合物，所述组合物含有TbpA和/或Hsf的抗原片段。
18.权利要求1-17任一项的免疫原性组合物，所述组合物含有Tbp与Hsf样蛋白或它们的抗原片段的融合蛋白。
19.权利要求18的免疫原性组合物，所述组合物含有TbpA与Hsf样蛋白或它们的抗原片段的融合蛋白，所述抗原片段能产生抗奈瑟氏球菌属感染的保护性反应。
20.一种分离的免疫原性组合物，所述组合物包含来源于革兰氏阴性菌的外膜囊泡制剂，其中运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白两者的表达至少比未改造革兰氏阴性菌天然表达高1.5倍。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白的表达由于在限铁条件下生长而上调。
22.权利要求20-21任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于奈瑟氏球菌。
23.权利要求20-22任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于脑膜炎奈瑟氏球菌。
24.权利要求20-23任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
25.权利要求20-22任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于淋病奈瑟氏球菌。
26.权利要求20-25任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂来源的宿主细胞被工程改造，从而下调LgtB和LgtE中一个或多个基因的表达，优选为前者。
27.权利要求20-26任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂来源的宿主细胞不能合成荚膜多糖，并且优选被工程改造，从而下调表达而且优选缺失一个或多个以下基因：siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(同synX和siaA)，synB(同siaB)和synC(同siaC)，最优选为siaD。
28.权利要求20-27任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂来源的宿主细胞已经被工程改造，从而下调表达而且优选缺失OpC、OpA和PorA中一个或多个基因，优选为PorA。
29.权利要求20-28任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂来源的宿主细胞已经被工程改造，从而下调FrpB的表达，优选缺失此基因。
30.权利要求20-29任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂来源的宿主细胞已经被工程改造，从而下调表达并且优选缺失msbB和/或HtrB，优选为msbB。
31.权利要求20-30任一项的免疫原性组合物，其中外膜囊泡制剂含有与外膜蛋白(OMP)结合的LPS。
32.权利要求31的免疫原性组合物，其中LPS在外膜囊泡制剂中与OMP原位结合(优选囊泡内)。
33.权利要求20-32任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于粘膜炎莫拉氏菌。
34.权利要求20-33任一项的免疫原性组合物，其中至少一部分外膜囊泡制剂来源于流感嗜血杆菌。
35.权利要求20-34任一项的免疫原性组合物，所述组合物包含从两株或更多株革兰氏阴性菌分离出的外膜囊泡制剂。
36.权利要求35的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白在来源于不同菌株的不同囊泡或来源于同一菌株的相同囊泡中被上调。
37.权利要求20-36任一项的免疫原性制剂，所述制剂包含的外膜囊泡制剂中增强的运铁蛋白结合蛋白表达来源于引入革兰氏阴性菌的多核苷酸。
38.权利要求20-37任一项的免疫原性组合物，所述制剂包含的外膜囊泡制剂中增强的Hsf样蛋白表达来源于引入革兰氏阴性菌的多核苷酸。
39.权利要求20-38任一项的免疫原性组合物，所述制剂包含的外膜囊泡制剂中增强的运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白表达来源于引入革兰氏阴性菌的编码两种蛋白的多核苷酸。
40.权利要求20-39任一项的免疫原性组合物，其中菌株已经遗传工程改造，在编码运铁蛋白结合蛋白的基因上游导入了更强的启动子序列。
41.权利要求20-40任一项的免疫原性组合物，其中菌株已经遗传工程改造，在编码Hsf样蛋白的基因上游导入了更强的启动子序列。
42.权利要求20-41任一项的免疫原性组合物，其中菌株已经遗传工程改造，在编码运铁蛋白结合蛋白和Hsf样蛋白的基因上游导入了更强的启动子序列。
43.权利要求20-42任一项的免疫原性组合物，其中运铁蛋白结合蛋白为TbpA，优选为高分子量TbpA、低分子量TbpA或高分子量TbpA和低分子量TbpA两者，而且最优选来自脑膜炎奈瑟氏球菌。
44.权利要求20-43任一项的免疫原性组合物，其中Hsf样蛋白为来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Hsf。
45.权利要求1-44任一项的免疫原性组合物，所述组合物还含有单纯型或结合型细菌荚膜多糖或寡糖。
46.权利要求1-45任一项的免疫原性组合物，所述组合物含有两种或更多种细菌荚膜多糖或寡糖，所述多糖或寡糖与运铁蛋白结合蛋白或Hsf样蛋白结合或与两者同时结合。
47.权利要求45-46任一项的免疫原性组合物，其中荚膜多糖或寡糖来源于以下一种或多种细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W-135、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、A群链球菌、B群链球菌、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
48.一种免疫原性组合物，所述组合物包含一种或多种编码运铁蛋白结合蛋白或其抗原片段和Hsf样蛋白或其抗原片段的多核苷酸，所述蛋白或其片段的表达由真核启动子推动。
49.权利要求48的免疫原性组合物，其中编码了奈瑟氏球菌的TbpA和Hsf。
50.权利要求48-49任一项的免疫原性组合物，其中编码了脑膜炎奈瑟氏球菌的TbpA和Hsf。
51.权利要求1-50任一项的免疫原性组合物，所述组合物含有佐剂。
52.权利要求51的免疫原性组合物，所述组合物含有铝盐。
53.权利要求51-52任一项的免疫原性组合物，所述组合物含有3D-MPL。
54.权利要求51的免疫原性组合物，所述组合物包含含CpG的佐剂。
55.一种包含权利要求1-54任一项的免疫原性组合物和药学可接受的赋形剂的疫苗。
56.一种用于治疗或预防革兰氏阴性菌疾病的方法，所述方法包括给予保护剂量或有效剂量的权利要求55的疫苗。
57.权利要求56的方法，其中预防或治疗奈瑟氏球菌感染。
58.权利要求55的疫苗在制备治疗或预防革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。
59.权利要求58的用途，其为在制备治疗或预防奈瑟氏球菌感染的药物中的用途。
60.一种经遗传工程改造的革兰氏阴性菌株，所述菌株是权利要求20-44任一项的免疫原性组合物中外膜囊泡的来源。
61.一种制备权利要求1-17任一项的免疫原性组合物的方法，所述方法包括将分离的运铁蛋白结合蛋白与分离的Hsf样蛋白或它们的抗原片段混合的步骤。
62.一种制备权利要求20-44任一项的免疫原性组合物的方法，所述方法包括从革兰氏阴性菌培养物中分离外膜囊泡的步骤。
63.权利要求62的方法，其中分离外膜囊泡的步骤包括用0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％、0.08-0.15％或优选0.1％浓度的去污剂提取，去污剂优选为DOC。
64.一种制备权利要求47免疫原性组合物的方法，所述方法包括将细菌荚膜多糖或寡糖与运铁蛋白结合蛋白和/或Hsf样蛋白结合的步骤。
65.一种制备权利要求55疫苗的方法，所述方法包括将权利要求1-54的免疫原性组合物与药学可接受的赋形剂结合的步骤。
66.一种制备用于预防或治疗奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，所述方法包括用权利要求55的疫苗免疫接受者，并从接受者分离免疫球蛋白的步骤。
67.一种用权利要求66的方法获得的免疫球蛋白制剂。
68.一种药用制剂，其包含权利要求67的免疫球蛋白制剂和药学可接受的赋形剂。
69.一种药用制剂，其包含抗脑膜炎奈瑟氏球菌TbpA和Hsf的单克隆抗体以及药学可接受的赋形剂。
70.一种治疗或预防革兰氏阴性菌感染的方法，所述方法包括给予患者有效剂量的权利要求68-69任一项的药用制剂的步骤。
71.权利要求68-69任一项的药用制剂在制造治疗或预防革兰氏阴性菌疾病的药物中的用途。
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