CN1688333A - 疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及奈瑟氏球菌疫苗组合物，它们的制备，和这种组合物在医学中的用途。更具体地，本发明涉及产生更适于产生奈瑟氏球菌，尤其是脑膜炎球菌的外膜泡囊(或疱)疫苗的新的工程化脑膜炎球菌菌株的方法。还基于新的LOS亚单位或脑膜炎球菌外膜泡囊(或疱)疫苗的用途描述了有利的方法和疫苗产物，该LOS亚单位或脑膜炎球菌外膜泡囊(或疱)疫苗可更安全和更有效地用于人受试者中。具体地，描述了基因下调的组合，如：PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC。备选地或额外地，表明lgtB^－是为了有效和安全地在奈瑟氏球菌疫苗组合物中使用L3和/或L2 LOS的最佳突变。还描述了来自lgtB^－和荚膜多糖缺陷的脑膜炎球菌突变株的疱疫苗；还描述了制备疱制剂的有利方法，其中LOS将作为重要抗原保留。

Description

疫苗

发明领域

本发明涉及奈瑟氏球菌疫苗组合物、它们的生产和这些组合物在医学中的用途。更具体地，本发明涉及产生更适于产生奈瑟氏球菌，尤其是脑膜炎球菌的外膜泡囊(或疱)疫苗的新的工程化脑膜炎球菌菌株的方法。还基于新的LOS亚单位或脑膜炎球菌外膜泡囊(或疱)疫苗的用途描述了有利的方法和疫苗产物，该LOS亚单位或脑膜炎球菌外膜泡囊(或疱)疫苗可更安全和更有效地用于人受试者中。

发明背景

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎球菌)是经常从人上呼吸道分离的革兰氏阴性细菌。其可导致严重的侵入性细菌疾病如菌血症和脑膜炎。脑膜炎球菌疾病的发病率显示出地区的、季节的和年度的差异(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989)。该细菌通常根据其荚膜多糖的血清群分类。

气候温和的国家中的多数疾病是由于血清群B菌株并且这些疾病的发病率为1-10/100,000/年总人口——有时达到更高值(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7：R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.等Clin.Infect.Dis.16：237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，等Epidemiol.Infect.105：119-126，1990)。

血清群A脑膜炎球菌占优势的流行病(主要在中非)有时达到高达1000/100,000/年的发病率水平(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989)。总体上脑膜炎球菌疾病的几乎所有病例都由血清群A、B、C、W-135和Y脑膜炎球菌导致，且四价A、C、W-135和Y荚膜多糖疫苗是可得到的(Armand，J.，Arminjon，F.，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10：335-339，1982)。

在过去几十年中许多欧洲国家内脑膜炎奈瑟氏球菌感染的频率已经上升。这归因于由于社会活动(例如，游泳池、戏院，等)增加导致的传播的增加。分离出对一些标准抗生素较不敏感或具有抗性的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株已不罕见。该现象已经产生了对该生物的新的抗菌剂、疫苗、药物筛选方法和诊断试验的未满足的医学需求和需要。

现今通过将现有的多糖疫苗化学缀合到载体蛋白改良这些疫苗(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等JAMA 275：1499-1503，1996)。

然后，没有得到血清群B疫苗。已经发现该血清群B荚膜多糖是非免疫原性的——最可能是因为其与宿主组分有结构类似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等J.Infect.Dis.126：514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Mkel，P.M.Lancet ii.：355-357，1983)。因此努力集中在试图开发从外膜泡囊(或疱)或从它们纯化的蛋白组分得到的血清群B疫苗。

备选地，用于疫苗开发的脑膜炎球菌抗原是脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)。这些是结合外膜的糖脂，它们缺少O侧链而与肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的脂多糖类(LPS)不同，并从而像LPS的粗糙形式(Griffiss等，Rev Infect Dis 1988；10：S287-295)。LOS的寡糖部分内的异质性导致不同脑膜炎球菌菌株之间的结构和抗原多样性(Griffiss等，Inf.Immun.1987；55：1792-1800)。这已被用于将菌株细分成12种免疫型(immunotype)(Scholtan等，J Med Microbiol 1994，41：236-243)。免疫性L3、L7和L9在免疫学上相同并且结构类似(或甚至相同)并因此被指定为L3、7、9(或者，为了本说明书的目的，通称为“L3”)。脑膜炎球菌LOS L3、7、9(L3)、L2和L5可以通过唾液酸化，或者通过加入胞嘧啶核苷-5’-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸而被修饰。尽管L2、L4和L6 LOS在免疫学上可区分，它们在结构上类似并且对于此处提到的L2，在本发明范围内可以任选被L4或L6代替。已经表明LOS的抗体在实验大鼠中保护大鼠抵抗感染并且有助于感染脑膜炎奈瑟氏球菌的儿童中的杀细菌活性(Griffiss等，J Infect Dis 1984；150：71-79)。

然而，与LOS用于脑膜炎球菌疫苗相关的一个问题是其毒性(由于其脂质A部分)。

LOS还存在于脑膜炎球菌疱的表面上。许多年来的努力主要集中于开发基于脑膜炎球菌外膜泡囊(疱)的疫苗(de Moraes，J.C.，Perkins，B.，Camargo，M.C.等，Lancet 340：1074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.等，338：1093-1096，1991)。这些疫苗的优点是包括处于正确折叠构象的几种整合外膜蛋白，当施用于宿主时它们可引起保护性免疫应答。此外，奈瑟氏球菌菌株(包括脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B-menB)分泌足够量的外膜疱而可以进行它们的工业规模上的生产。然而，更通常通过包含以0.5％去污剂(例如，脱氧胆酸盐)提取细菌细胞的方法制备疱(例如EP 11243)。尽管由于上述LOS毒性(也称为内毒素)而希望使用该提取方法，但是该方法也具有从疫苗除去大多数LOS抗原的作用。

使用LOS作为疫苗抗原的另一个问题是12种LPS免疫型以各种糖类结构存在(M.P.Jennings等l，Microbiology 1999，145，3013-3021；Mol Microbiol 2002，43：931-43)。针对一种免疫型产生的抗体不能识别不同的免疫型。尽管努力集中于产生LOS免疫型的寡糖部分的一般的“核心”区(例如，WO 94/08021)，但是抗修饰的LOS产生的抗体的杀细菌活性丧失了。从而，疫苗可能需要具有不同免疫型的许多LOS组分以达到有效。

使用LOS(也称作LPS或脂多糖)作为人疫苗的抗原的另一个问题是它们携带与人的糖类结构(例如，人红细胞上)相似的糖类结构，从而对它们的使用造成安全问题。然后由于LOS抗原的杀细菌效力的结构敏感性，改变LOS结构是有问题的。

本发明给出了改善一个或多个上面的问题的方法，并给出了基于脑膜炎球菌LOS，尤其存在于外膜泡囊上时的LOS作为保护性抗原制备新疫苗的方法。

发明描述

本说明书中提到的出版物和专利或专利申请中公开的主题和信息在此处被并入作为参考。

“脂寡糖”(或“LOS”)也可指“脂多糖”或“LPS”。

发明人意欲让这里的术语“包含”在每种情况下可以任选被术语“由…组成”代替。

本发明人已经发现缩短LOS寡糖结构导致丧失可以引起杀细菌免疫应答的表位。替代地，本发明人已经发现为了在疫苗制剂中最有效使用LOS，LOS寡糖结构必须尽可能多的保留，但是仅仅2种LOS抗原的组合可以产生普遍有效的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌)疫苗。本发明的第一方面是用于防止或治疗奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌或脑膜炎球菌B)疾病，包含免疫型L2的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌)LOS或免疫型L3的LOS的免疫原性组合物。LOS可通过公知的纯化步骤分离，或者可存在于来自L2和L3奈瑟氏球菌菌株的至少两种外膜泡囊(或疱)制剂中。为了从疱制剂除去有毒的结合不紧的LOS，但是保留疱中整合的LOS抗原的高水平，疱优选用低浓度去污剂-0-0.3％，优选0.05-0.2％，最优选约0.1％，优选脱氧胆酸盐(或DOC)提取。LOS抗原(尤其是疱疫苗中的)的这种组合令人惊奇地优点是有效抗90％以上的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。

本发明人也发现本发明的上面的疱免疫原性组合物，且实际上任何来自奈瑟氏球菌(优选淋球菌或脑膜炎球菌)的疱免疫原性组合物，可以增强它们的表面上保护性抗原(包括LOS)的效果，如果免疫优势的外膜蛋白的某些组合在表达中被下调(优选被缺失)的话。因此本发明的另一方面是来自一种奈瑟氏球菌菌株的奈瑟氏球菌疱制剂，与天然的、未修饰的菌株相比，该菌株的下面的外膜蛋白的两种或更多种在表达中被下调(且优选缺失)：PorA、PorB、OpA、OpC或PilC。优选PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC，或者PorA和OpA和OpC被下调或缺失。FrpB表达的下调(优选缺失)在交叉保护性抗原——尤其是从铁限制条件下生长的奈瑟氏球菌菌株制备的疱制剂中的交叉保护性抗原——效果的增强中也显示出益处。与FrpB下调与上面提到的一种或多种下调的组合得到的疱是本发明的一个实施方案一样，从具有该突变的菌株得到的奈瑟氏球菌疱是本发明的另一个实施方案。优选如果PorA被下调，那么BorB不被下调，反之亦然。

在产生疱免疫原性组合物的任何奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，尤其此处描述的菌株中，上面的突变是有益的，然而，优选使用L2或L3免疫型奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，它们一般用此处描述的低DOC％提取方法提取。优选地，本发明的疱免疫原性组合物含有L2和L3疱，其中至少一种(优选2种)在免疫优势的外膜蛋白(或OMPs)的上面的组合中缺乏。下调这些基因的技术在WO 01/09350中讨论(此处被并入作为参考)。已知在脑膜炎球菌基因组中存在四种不同的Opa基因(Aho等，1991 Mol.Microbiol.5：1429-37)，因此当说Opa在表达中被下调时表示优选地，脑膜炎球菌中存在的1、2、3或(优选)所有4种基因被这样下调。这些下调可以通过如WO 01/09350中描述的通过遗传方法或者通过寻找容易发现的、天然的、稳定的并且在Opa基因座没有表达或者有低表达的脑膜炎球菌菌株来实现。使用Poolman等(1985 J.Med.Micro.19：203-209)中描述的技术可以发现这种菌株，其中Opa^-细胞具有与表达Opa的细胞不同的表型，这可通过观察平板上或者显微镜下细胞的外观而发现。一旦发现，通过发酵建立Opa的缺乏后对细胞内含物进行蛋白印迹(Western blot)，该菌株可以显示出稳定的Opa^-。

上面的LOS免疫原性组合物的安全性

由于存在与人鞘糖脂中存在的乳-N-neotetraose寡糖基团(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-；图1)类似的结构，已经对针对L3或L2LOS产生的抗体的安全性提出了疑问。尽管许多人已经安全地接种含有残留量的L3 LOS的用脱氧胆酸盐提取的泡囊疫苗(G.Bjune等，Lancet(1991)，338，1093-1096；GVG.Sierra等，NIPH ann(1991)，14，195-210)，但是如果LOS将保留为此处讨论的抗原，本发明人已经发现缺失LOS糖结构的末端部分有利于抗LOS免疫应答与存在于人组织表面的结构的交叉反应。在优选的实施方案中，lgtB基因的失活导致中间的LOS结构，其中缺少末端半乳糖残基和唾液酸(见图1和2，突变留下了L2和L3 LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-结构)。这些中间产物可以在L3和/或L2 LOS菌株中得到。LOS的备选地和较不优选的(短的)版本可以通过关闭lgtE基因得到。LOS的另一备选的和较不优选的版本可通过关闭lgtA基因得到。如果选择了这种lgtA突变，优选还关闭lgtC表达以防止形成非免疫原性L1免疫型。

LgtB^-突变体是最优选的，因为本发明人已经发现这是解决安全问题而仍然保持LOS保护性寡糖表位的最佳截断，该表位仍然可诱导杀细菌(甚至交叉-杀细菌的)抗体应答。

因此，本发明的上面的L2和/或L3制剂(纯化的或者在分离的疱中)或脑膜炎球菌疱制剂一般(尤其L2和/或L3)有利地来自奈瑟氏球菌菌株(优选脑膜炎球菌菌株)，该菌株被基因工程化而永久下调来自lgtB、lgtA或lgE基因的功能基因产物的表达，该下调优选通过关闭该基因，最优选通过缺失该基因的启动子和/或可读框的全部或部分来实现。

优选地，本发明的奈瑟氏球菌菌株合成荚膜多糖有缺陷。

当本发明的上面的疱制剂来自脑膜炎球菌B菌株时，尤其优选荚膜多糖(其也含有人-类似的糖结构)也被除去。尽管可以关闭许多基因以实现该目的，但是本发明人已经有利地表明优选疱生产菌株已经被基因工程化而永久下调来自siaD基因的功能基因产物的表达(即，下调α-2-8多唾液酸转移酶活性)，该下调优选通过关闭该基因，最优选缺失该基因的启动子和/或可读框的全部或部分而实现。这种失活在WO01/09350中描述。siaD(也称为synD)突变是可导致人类似的表位从荚膜多糖除去的许多突变中最有利的，因为其是对LOS的保护性表位的生物合成没有影响，从而在针对最后使用LOS作为保护性抗原的方法中有利，并且对细菌的生长影响最小的仅有的突变之一。本发明的一个优选的方面因此是如上描述的疱免疫原性制剂，其来自lgtE^-siaD^-、lgtA^-siaD^-或，优选地lgtB^-siaD^-脑膜炎球菌B突变菌株。该菌株本身是本发明的另一方面。

尽管因为上面的原因优选siaD^-突变，但是可以使用关闭脑膜炎球菌B(或通常脑膜炎球菌)荚膜多糖合成的其他突变。从而疱生产菌株可以被基因工程化而永久下调来自下面基因的一种或多种的功能基因产物的表达：ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(等价于synX和siaA)、synB(等价于siaB)或synC(等价于siaC)基因，该下调优选通过关闭该基因，最优选通过缺失该基因的启动子和/或可读框的全部或部分来实现。LgtE^-突变可以与这些突变的一种或多种组合。优选地，lgtB^-突变与这些突变的一种或多种组合。本发明的另一方面因此为如上描述的疱免疫原性制剂，其来自脑膜炎球菌B(或一般地脑膜炎球菌)的组合突变菌株。该菌株自身是本发明的一个方面。

含有各种lgt基因，包括lgtB和lgtE的奈瑟氏球菌基因座和其序列是本领域中公知的(见M.P.Jennings等，Microbiology 1999，145，3013-3021和其中引用的参考文献；J.Exp.Med.180：2181-2190[1994]；WO 96/10086)。

当终产物中将使用全长(未截断的)LOS时，希望LOS不被唾液酸化(由于这种LOS产生针对最具危险性、侵入性并且也未被唾液酸化的脑膜炎球菌B菌株的免疫应答)。在这种情况中，使用具有缺失的synA(等价于synX和siaA)、synB(等价于siaB)或synC(等价于siaC)基因的荚膜阴性菌株是有利的，因为这种突变也使得menB LOS不能被唾液酸化。

上面的突变在产生疱免疫原性组合物的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，尤其是此处描述的那些菌株中是有益的，然而，优选使用L2或L3免疫型奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，它们一般用此处描述的低DOC％提取方法提取。优选本发明的疱免疫原性组合物含有L2和L3疱，其中至少一种(优选两种)来自上面基因的表达中缺陷的菌株。

LOS的毒性

通过下调某些基因所来自的细菌生产菌株中这些基因的表达也可以使本发明上面的纯化的LOS或疱免疫原性组合物毒性更小。虽然这些解毒作用对于使用天然OMV的鼻内免疫接种是不必要的(J.J.Drabick等，Vaccine(2000)，18，160-172)，但是对于肠胃外接种，解毒作用将具有益处。优选地，本发明的LOS纯化的LOS或疱免疫原性组合物通过奈瑟氏球菌生产菌株的基因工程化进行解毒，该基因工程化为通过突变/修饰/失活参与脂质A生物合成的基因，尤其是参与将仲酰基链加到脂质A的那些基因，具体地通过下调来自msbB和/或htrB基因的功能基因产物的表达，优选通过关闭该基因，最优选通过缺失该基因的启动子和/或可读框的全部或部分。备选地(或额外地)纯化的LOS或疱免疫原性组合物可来自奈瑟氏球菌菌株，其已经被遗传修饰从而下面基因的一种或多种被上调(通过导入更强的启动子或整合该基因的额外拷贝)：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。备选地(或额外地)纯化的LOS或疱免疫原性组合物可通过向该组合物加入与多粘菌素B(一种对脂质A具有高亲和性的分子)功能相当的无毒肽而解毒。

关于上面的解毒方法，以及相关启动子/基因序列和上调和下调方法的更多细节见WO 01/09350。奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因也分别称为lpxL1和lpxL2，(见WO 00/26384)，这些基因的缺失突变在表型上的特征是与野生型相比丧失一条仲酰基链(并保持4条伯酰基链和1条仲酰基链)的msbB^-突变的LOS，和丧失两条仲酰基链的htrB^-突变的LOS。这些突变优选与确保奈瑟氏球菌生产菌株是荚膜多糖缺陷的(见上面)的突变组合以确保疱上解毒的LOS的最佳呈递，或者有助于解毒的亚单位LOS的纯化。对于可用于本发明组合物中、功能相当于多粘菌素B的无毒肽——尤其肽SAEP2(序列KTKCKFLKKC，其中两个半胱氨酸形成二硫键)的用途的细节，见WO 93/14115、WO95/03327、Velucchi等(1997)J Endotoxin Res 4：1-12，和EP 976402。

“下调功能基因产物的表达”在这里指对所述基因的启动子或可读框的进行添加、缺失或替代，从而总基因产物的生物合成活性降低(降低60、70、80、90、95或最优选100％)。显然可导入移码突变，或者较弱的启动子被替代，然而，最优选可读框和/或启动子的大部分或全部被缺失以确保该(活性)基因产物的永久下调(如在WO 01/09350中描述的)。

上面的突变在产生疱免疫原性组合物的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，尤其是此处描述的那些菌株中是有益的，然而，优选使用L2或L3免疫型奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌，最优选menB)菌株，这些菌株一般用此处描述的低DOC％提取方法提取。优选地，本发明的疱免疫原性组合物含有L2和L3疱，其中至少一种(优选两种)来自上面的基因表达缺陷的菌株。

本发明的其他方面包括上面描述的遗传修饰的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌或淋球菌或脑膜炎球菌B)菌株，本发明的LOS或疱免疫原性制剂可从这些菌株得到。

本发明的LOS或含LOS的疱制剂

本发明的另一方面是从本发明的奈瑟氏球菌菌株分离的LOS制剂(尤其上面描述的制剂的任一种)。优选地，分离的LOS(或含LOS疱)为L2或L3免疫型，且本发明的免疫原性组合物优选包含本发明的L2和L3 LOS(或疱)制剂。

通过将上面LOS(纯化的或存在于疱制剂中)的寡糖部分缀合到包含T-细胞表位来源的载体(从而使得LOS成为甚至更好的[依赖T]的免疫原)也可以改良这些制剂。通过将本发明的纯化的LOS制剂呈递到本领域中公知的脂质体制剂中(见例如WO 96/40063和其中引用的参考文献)可以备选地(或额外地)使其成为更好的抗原。

从细菌分离LOS的方法是本领域熟知的(见例如Wesphal & Jann[Meth.Carbo.Chem.1965，5：83-91]的热水-苯酚方法)。还见Galanos等，1969，Eur J Biochem 9：245-249，和Wu等，1987，Anal Bio Chem160：281-289。缀合分离的LOS的技术也是公知的(见例如EP 941738，其在此处被引入作为参考)。

为了本发明的目的，“包含T-细胞表位来源的载体”通常为肽或，优选地，多肽或蛋白。缀合技术是本领域中熟知的。一般的载体包括来自未分类的流感嗜血菌(H.influenzae)的蛋白D、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、或疱(尤其奈瑟氏球菌或脑膜炎球菌)制剂中的外膜蛋白。

本发明的优选的分离的LOS组合物为：包含L2和L3分离的LOS的组合物，其中每种LOS的寡糖部分被任选缀合到包含T细胞表位来源的载体；包含L2或L3 LOS的组合物，该LOS具有与来自lgtB^-脑膜炎球菌菌株的LOS一致的结构，其中每种LOS的寡糖部分被任选缀合到包含T细胞表位来源的载体；最优选地，包含L2和L3分离的LOS的组合物，这些LOS具有与来自lgtB^-脑膜炎球菌菌株的LOS一致的结构，其中每种LOS的寡糖部分被任选缀合到包含T细胞表位来源的载体。

优选地，本发明的LOS组合物已经被解毒。这可以通过肼或碱性水解化学处理的公知技术进行，这些化学处理从该分子除去酰基链(但是可以降低该分子的保护功效)，但是解毒优选通过从htrB^-或msbB^-脑膜炎球菌突变株(如上述；尤其在荚膜多糖负菌株中)分离LOS进行，或者通过向该组合物中加入与多粘菌素B(对脂质A具有高亲和性的一种分子)功能等价的无毒肽，尤其是SAEP 2(如上述)来进行。

本发明的LOS可以以分离状态(如果脂质A部分仍然完整则通常为微团的形式)施用，或者可以以脂质体施用。在该情况下，可将外膜蛋白加入脂质体，并且LOS可以在脂质体内被缀合到这些外膜蛋白而使得寡糖成为依赖T的抗原。这可以用如下述的关于疱内LOS交联所描述的类似化学方法进行。

LOS的寡糖部分疱内交联(缀合)到疱表面上存在的外膜蛋白

当LOS(尤其是本发明的LOS)存在于疱制剂中时，LOS优选被原位缀合，这可通过允许LOS缀合到也存在于疱制剂上的一种或多种外膜蛋白(例如脑膜炎球菌的PorA或PorB)的方法实现。从而本发明的另一方面是来自革兰氏阴性细菌菌株的疱制剂，在该菌株的外膜中整合一种缀合到LOS的外膜蛋白。尽管LOS可以被加到疱制剂中用于缀合，但是优选LOS天然存在于疱制剂的表面上。

该方法可有利地增强疱制剂中LOS抗原的稳定性和/或免疫原性(提供T-细胞帮助)和/或抗原性-从而为最具保护性构象中的不依赖T的寡糖免疫原提供T-细胞帮助-如同LOS处于外膜表面上的天然环境一样。此外，在疱内缀合LOS可导致LOS的解毒(不希望被理论束缚，脂质A部分如果被缀合可以更稳定地埋在外膜中从而不容易被利用而导致毒性)。这样，可以不需要上面提到的从htrB^-或msbB^-突变株分离疱，或者通过向组合物中加入与多粘菌素B功能等价的无毒肽(但是可以组合加入以更加安全)的解毒方法。

本发明的缀合的疱制剂一般为与完全未缀合的LOS的相同量的相同疱相比，本发明疱中LOS的毒性降低了。通过技术人员，例如使用欧洲药典中的LOS兔致热性测定法(见实施例7)，可以容易地确定LOS毒性。

本发明的缀合疱制剂是有利地从而缀合的LOS具有适于在宿主中引起免疫应答的构象，来自宿主的血清与未缀合的LOS有反应性(可以结合)——该未缀合的LOS优选存在于用于制备疱制剂的细菌上，最优选在SBA测定法中为杀细菌方式。

当奈瑟氏球菌疱被缀合到LOS，并且这些疱来自如此处描述的一种或多种免疫优势的外膜蛋白中被下调的菌株时，优选如果PorA被下调，那么PorB不被下调，反之亦然。这允许LOS的大部分与主要外膜蛋白交联，从而使缀合对疱中存在的交叉保护性的少数外膜抗原的影响最小。

具体地，本发明人发现包含疱的组合物，其中疱中的LOS已经以疱内方式被缀合到也存在于疱中的外膜蛋白，能够形成治疗或预防该疱所来自的生物导致的疾病的疫苗的基础，其中这种疫苗具有减弱的毒性(优选基本上无毒)并且/或者能够诱导针对天然环境中LOS的依赖T的杀细菌应答。

因此本发明还提供了这种疱内LOS缀合的疱制剂。“疱内”指天然存在于疱中的LOS被缀合到存在于相同疱上的外膜蛋白。优选地，疱来自可以产生疱的任何革兰氏阴性生物(见WO 01/09350)，优选粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、未分类的流感嗜血菌或奈瑟氏球菌(最优选脑膜炎球菌)。

这些疱制剂可分离自所讨论的细菌(见WO 01/09350)，然后用公知的缀合化学方法以将LOS寡糖部分上的基团(例如，NH₂或COOH)连接到疱外膜蛋白上的基团(例如，NH₂或COOH)。也可以使用利用戊二醛、甲醛，或戊二醛/甲醛混合物的交联技术，但是优选使用更有选择性的化学方法如EDAC或EDAC/NHS(J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement By N-hydroxysuccinimide of water-solublecarbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry156：220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)173-176页)。可用于本发明的能够产生LOS和蛋白分子之间的共价交联的其他缀合化学或处理在EP 941738中描述。

优选地，疱制剂在不存在荚膜多糖时被缀合。疱可以从不产生荚膜多糖的菌株(天然地或通过突变)分离，或者可以被纯化以除去大多数(除去60、70、80、90或99％以上)和优选所有污染的荚膜多糖。这样，疱内LOS缀合反应更有效。

优选地，疱内存在的LOS的5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95％以上被交联/缀合。

优选已经制备了本发明的疱使得疱的LOS含量为3-30、5-25、10-25、15-22，最优选约或精确地20％，LOS含量可通过使用纯化的LOS作为标准在SDS-PAGE电泳后银染测量(见Tsai，J.Biol.Standardization(1986)14：25-33的方法)。脑膜炎球菌疱中20％LOS可以用0.1％的低DOC，提取实现，该提取可以除去结合不紧的LOS分子，但是保留大部分抗原。

当疱内缀合的疱来自脑膜炎球菌时，优选疱所来自的菌株是不能产生荚膜多糖的突变菌株(例如，上述突变菌株的一种，尤其是siaD^-)。还优选有效抗脑膜炎球菌疾病的免疫原性组合物包含L2和L3疱，其中L2和L3 LOS都缀合到疱外膜蛋白。此外，优选疱内缀合的疱内的LOS结构与来自lgtB^-脑膜炎球菌菌株的LOS的结构一致。最优选地免疫原性组合物包含疱内缀合的疱：来自L2或L3突变的脑膜炎球菌菌株，其不能产生荚膜多糖并且是lgtB^-的；包含来自不能产生荚膜多糖的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3疱；包含来自为lgtB^-的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3疱；或者最优选地包含来自不能产生荚膜多糖并且为lgtB^-的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3疱。

可用于本发明的一般的L3脑膜炎球菌菌株是H44/76 menB菌株。一般的L2菌株是B16B6 menB菌株或者39E脑膜炎球菌C型菌株或菌株760676。

如上面陈述的，本发明的疱已经通过缀合作用而被一定程度地解毒，并且不需要进一步解毒，然而为了额外的安全性可以使用进一步的解毒方法，例如，通过使用来自htrB^-或msbB^-脑膜炎球菌菌株的疱或者通过向疱组合物中加入与多粘菌素B(一种对脂质A具有高亲和性的分子)功能等价的无毒肽(优选SEAP 2)(如上述)。从而LOS的缀合(尤其以疱内方式)与包含相同量的未缀合的LOS的制剂相比令人惊奇地显示出LOS的更低毒性。这样，通过LOS疱内缀合到疱外膜蛋白进一步提供了疱(尤其脑膜炎球菌的)解毒的一般方法，且通过将LOS缀合到疱外膜蛋白还提供了LOS解毒的方法。

以上面的方法提供了脑膜炎球菌疱和包含疱的免疫原性组合物，它们有作为重要抗原的LOS，其毒性减弱(优选基本无毒)、没有自身免疫性问题，具有依赖T的特征，存在于其天然环境中，并且能够诱导针对潜在的90％以上脑膜炎球菌菌株的杀细菌抗体应答(对于L2+L3组合物而言)。

Men A、C、Y或W荚膜多糖或寡糖的一种或多种(优选至少MenC，或MenA和MenC，或者MenC和MenY)也可以缀合到本发明的疱的外膜蛋白上。尽管这可以在和LOS交联相同的反应中进行，但是优选在单独的(优选后面的)反应中进行。

最佳疱内LOS缀合的方法是本发明的另一方面。所述方法应该包括如下步骤：从革兰氏阴性细菌分离疱(优选使用此处描述的低％DOC)，实施适于将存在于疱中的LOS缀合(优选通过其寡糖部分)到相同疱上存在的外膜蛋白的化学反应，分离疱内缀合的疱制剂，和任选将疱内缀合的疱制剂与通过相同方法制备的但是具有不同LOS免疫型(优选混合L2和L3奈瑟氏球菌/脑膜炎球菌疱)的另一疱内缀合的疱制剂配制和/或将该疱制剂与药学上可接受的赋形剂配制以形成疫苗组合物。

疱内制剂应该优选包括下面的方法步骤的1、2或所有的3步：缀合pH应该大于pH7.0，优选大于或等于pH7.5(最优选pH9以下)；在反应过程中应该保持1-5％，优选2-4％，最优选约3％蔗糖的条件；NaCl应该在缀合反应中最小化，优选低于0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M，最优选根本不存在。所有这些方法特征在于确保在整个缀合过程中疱保持稳定并处于溶液中。

EDAC/NHS缀合方法是疱内缀合的优选方法。EDAC/NHS比甲醛优选，因为甲醛可导致太高程度的交联从而负面地影响滤过率。EDAC与羧酸(如LOS中的KDO)反应产生活性酯中间产物。存在胺亲核物质(如外膜蛋白如PorB中的赖氨酸)时，形成酰胺键，释放异脲副产物。然而，通过形成硫代-NHS酯中间产物可以增加EDAC-介导的反应的效率。硫代-NHS酯比从EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯在水溶液中能存在更长时间。这样，使用两步方法可以实现酰胺键形成的更高得率。EDAC/NHS缀合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement By N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156：220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)173-176页中讨论。反应中优选使用0.01-5mg EDAC/mg疱，更优选0.05-1mgEDAC/mg疱。使用的EDAC的量依赖于样品中存在的LOS的量，而LOS的量又依赖于用于提取疱的脱氧胆酸盐(DOC)％。在低％DOC(例如，0.1％)，使用高量的EDAC(1mg/mg和更高)，然而在更高％DOC(例如，0.5％)时，使用较低量的EDAC(0.025-0.1mg/mg)以避免太多的疱间交联。

本发明的优选方法因此是产生疱内缀合的LOS(优选脑膜炎球菌的)的方法，该方法包含步骤：存在EDAC/NHS，pH为pH7.0到pH9.0(优选约pH7.5)，在1-5％(优选约3％)蔗糖中，并且任选在基本无NaCl(如上述)的条件中缀合疱，并从反应混合物分离缀合的疱。

该反应后可跟随着反应混合物的Western分离凝胶，该方法使用抗-LOS(例如抗L2或抗L3)mAbs以显示随着反应时间的过去，疱中更大比例的LOS的LOS分子量的增加。

使用这种技术可以回收疱，得率为99％。

发现EDAC是优秀的疱内交联剂，因为其将LOS交联到OMP，足够提高LOS依赖T的免疫原性，但是不将其交联到如此高的程度以致发生像差滤过率、聚集和疱间交联的问题。产生的疱的形态类似于未缀合的疱的形态(通过电子显微镜)。此外，上面的方案避免了发生过高交联(其可降低疱表面上天然存在的保护性OMP，例如TbpA或Hsf的免疫原性)。

分离疱的技术

通过许多公知的技术可以分离本发明的外膜泡囊(OMV或疱)(Fredriksen等，NIPH Annals(1991)，14，67-79；Zollinger等，J.ClinInvest(1979)，63，836-848；Saunders等，Infect Immun(1999)，67，113-119；J.J.Drabick等，Vaccine(1999)，18，160-172)。这些技术分为两大类——使用脱氧胆酸盐(约0.5％)从脑膜炎球菌提取疱的技术，和使用低水平脱氧胆酸盐(DOC)或根本无脱氧胆酸盐的技术。无DOC方法的疱具有在OMV中保持高水平LOS的有趣特征——这在疫苗(其中LOS是保护性抗原)中是有利的。与DOC提取的疱相比，通过无DOC方法得到的OMV中L3 Ags的浓度约高10倍。因为该原因，对于本发明方法优选制备疱的无去污剂(优选无DOC)方法，尽管用含有低水平去污剂(优选DOC)的缓冲液提取也可以是有利的，因为该步骤将把大多数紧密相互作用的LOS留在疱中而除去更具毒性的松散保持的LOS。一般0-0.5％，优选0.02-0.4％、0.04-3％或0.06-2％的去污剂(优选DOC)被用于疱提取，更优选0.08％-0.15％，最优选约或者精确地0.1％被用于获得稳定存在于疱中的LOS的最佳量。尤其优选无DOC(或者低DOC-0.3％DOC或以下)的提取方法，其中LOS已经被上面详述的方法的一种或多种解毒。

优选本发明所有实施方案中疱的LOS含量为3-30、5-25、10-25、15-22、最优选大约或精确地为20％，LOS含量可通过使用纯化的LOS作为标准在SDS-PAGE电泳后银染测量(见Tsai，J.Biol.Standardization(1986)14：25-33的方法)。使用Nmen L3 LOS作为该方法中的标准，通常用0.1％DOC提取的Nmen L3免疫型疱中LOS含量为约20％LOS，用0.2％DOC提取的为约15％LOS，用0.3％DOC提取的为约10％LOS，用0.5％DOC提取的为约5％LOS。

疫苗组合物

本发明的免疫原性组合物通过加入药学上可接受的赋形剂可容易地制备成疫苗组合物。

进一步提供了制备本发明的奈瑟氏球菌(优选脑膜炎球菌的)免疫原性组合物或疫苗的方法，该方法包含步骤：分离如上描述的本发明的纯化的LOS(优选L2或L3)或者产生如上描述的本发明的分离的疱(优选L2或L3免疫型)，并与药学上可接受的赋形剂配制LOS或疱。优选在混合步骤中组合本发明的免疫型L2和L3两者的纯化的LOS，或者本发明的免疫型L2和L2两者的疱，或者L2的纯化的LOS或L3的疱(或反之亦然)。本发明的纯化的LOS或疱优选在分离后已经如上描述的被缀合。也可以为纯化的LOS加入额外的脂质体配制步骤(使用本领域中公知的技术-见例如WO 96/40063和其中引用的参考文献)。疱制剂优选通过用低浓度的(或无)DOC提取进行分离(如上述)。

这些L2和L3组合方法可产生有效针对几乎所有脑膜炎球菌B菌株的疫苗。

上面的免疫原性组合物(或方法)可以已经将来自血清群A、C、Y或W的一种或多种(2、3或4种)脑膜炎球菌多糖或寡糖(简单的或缀合到包含T细胞表位的载体，如上述)加入到组合物中。优选至少加入C(最优选缀合的)，更优选A和C或Y和C(优选所有都缀合)，最优选A、C、Y和W(优选所有都缀合)。有利地是，缀合的流感嗜血菌B荚膜多糖或寡糖也被包括在上面的组合物中以产生通用的脑膜炎疫苗。

优选由WO 94/08021中逐一列举的组合物组成或包含这些组合物的组合物不被本发明中请求保护。

本发明的疫苗制剂

本发明的免疫原性组合物可以与适宜的佐剂配制以产生本发明的疫苗组合物。

适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝(优选氢氧化铝)，但是也可以是钙盐(尤其是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸，或者酰化糖、阳离子或阴离子衍生化的多糖，或者聚磷腈的不溶性悬浮液。

可以加入的适宜的Th1佐剂系统包括，单磷酰基脂质A，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(或LPS的其他无毒衍生物)，和单磷酰基脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)[或者无毒LPS衍生物]与铝盐(优选磷酸铝)的组合。增强系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO 94/00153中公开的QS21[或其他皂苷]和3D-MPL[或无毒LPS衍生物]的组合，或者如WO96/33739中公开的反应原性较弱的组合物，其中QS21[或皂苷]被胆固醇抑制。包含水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的尤其强的佐剂制剂在WO95/17210中描述并且是可以加入的优选制剂。可以加入的其他佐剂包含皂苷，优选QS21和/或水包油乳剂和生育酚。也可以加入含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO 96/02555)。

疫苗制剂通常在Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(编者Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press NewYork)中描述。

免疫保护剂量的疫苗可以通过全身性或粘膜途径施用。这些施用可包括通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或者通过粘膜施用于口/消化道(优选鼻内施用)、呼吸道、泌尿生殖道。一般选择每剂疫苗的疱量作为在一般的受接种者中诱导免疫保护性应答而无明显的不利副作用的量。这种量将依赖于使用哪种特定免疫原和其是怎样呈递的而变。通常，预期每剂包含1-100μg每种疱，优选5-50μg，最一般地为5-25μg。

对本发明的疱免疫原性组合物的进一步改进

本发明上面的疱组合物可以在本发明疫苗的功效方面进一步改进，如果产生该组合物的奈瑟氏球菌菌株(包括淋球菌，优选脑膜炎球菌，最优选脑膜炎奈瑟氏球菌B)的下面的基因(编码保护性抗原)的一种或多种被上调，该上调通过插入该基因的其他拷贝到基因组中，或者在现有基因的上游导入更强启动子，或者WO 01/09350中讨论的其他方法之一，这些方法能够诱导被修饰的菌株产生与未修饰菌株相比超过1.2、1.5、2、3、5或10倍抗原水平而实现：NspA(WO 96/29412)、Hsf或其截断物(WO 99/31132 & WO 01/551 82；也称为NhhA)、Hap(PCT/EP99/02766)、OMP85(WO 00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO 96/31618)、TbpA(WO92/03467、US5912336、WO93/06861和EP586266)、TbpB(WO93/06861和EP586266)、NadA(Comanducci等，J.Exp.Med.2002195；1445-1454；NMB 1994)、FrpA/FrpC或者包括5个或更多重复序列的这些抗原间的共有部分(WO 92/01460；Thompson等，(1993)J.Bacteriol.175：811-818；Thompson等，(1993)Infect.Immun..61：2906-2911)、LbpA、LbpB(PCT/EP98/05117)、FhaB(WO98/02547 SEQ ID NO38[核苷酸3083-9025])、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、Tbp2(WO 99/57280；NMB 0460)、MltA(WO99/57280；NMB 0033)、TspA(WO 00/03003)、TspB(WO 00/03003)、ctrA(PCT/EP00/00135)、MafA(NMB 0652)、MafB(NMB0643)、Omp26(NMB 0181)、粘附素X(NMB 0315)、粘附素Y(NMB 0995)、粘附素Z(NMB 1119)、和OstA(NMB 0280)。NMB序列的实例可以在www.neisseria.org的数据库中发现。对于此处提到的Hsf，该术语可以在各种情况下代替Hsf截断物-尤其WO01/55182中公开的那些。

尤其优选Hsf和TbpA(低或高分子量形式，或者均为低和高分子量形式[EP 586266])，或者Hsf和OMP85，或者OMP85和TbpA(低或高分子量形式，或者均为低和高分子量形式)，或者NspA和Hsf，或者NspA和OMP85，或者NspA和TbpA(低或高分子量形式，或者均为低和高分子量形式)都被上调。当组合物包含2种疱时，优选每种疱具有不同的上调。如果TbpA高和低将都被上调，优选它们在来自天然包含2种形式的TbpA的2种菌株的组合物中存在的2中单独的疱中上调。最优选地，2种菌株具有L2和L3 LOS免疫型。通过遗传方法或者通过将奈瑟氏球菌/脑膜炎球菌生产菌株生长于铁限制条件，例如存在50-70μM Desferal(去铁胺甲磺酸盐，从Sigma得到)可以上调TbpA。如果采取后一方法，优选FrpB基因表达被下调(优选缺失)，因为该可变抗原可能在从分离自铁限制条件的脑膜炎球菌菌株分离的疱中成为免疫优势的。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包含来自lgtB^-荚膜多糖^-msbB^-菌株的L3疱，该菌株优选在TbpA高和Hsf中被上调，和来自lgtB^-荚膜多糖^-msbB^-菌株的L2疱，该菌株优选在TbpA低和Omp85中被上调。更优选地，两种疱在PorA和/或FrpB表达，和任选地OpC和/或OpA表达中被额外地下调。疱最优选通过如上述的低DOC方法分离，并且两种疱中LOS被疱内交联到外膜蛋白。

血影或被杀死的完整细胞疫苗

本发明人设想上面关于疱的组合物和疫苗可以容易地扩充为关于血影或被杀死的完整细胞制剂和疫苗的方法(具有相同的优点)。从革兰氏阴性菌株制备血影制剂(具有完整外膜的空细胞)的方法是本领域熟知的(见例如WO 92/01791)。杀死完整细胞以制备用于疫苗的失活的细胞制剂的方法也是熟知的。因此，预见含有该文献的全文描述的疱的组合物和疫苗可应用于包含相等的本发明血影和被杀死的完整细胞制剂的相同组合物或疫苗。

本发明组合物的血清杀细菌测定法

血清杀细菌测定法是当抗原被组合在本发明的免疫原性组合物中时评定抗原间协同关系的优选方法。

这种协同应答的特征可以是抗原组合引起的SBA比每种抗原单独引起的SBA高至少50％、2倍、3倍、优选4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、最优选10倍。优选针对产生抗原的同源菌株，优选还针对一组异源菌株，测量SBA。(对于代表性组见例如下面的属于A-4簇的BZ10(B：2b：P1.2)、属于ET-37复合物的B16B6(B：2a：P1.2)，和H44/76(B：15：P1.7，16))。SBA是估计脑膜炎球菌疫苗的功效的最常见的被承认的免疫学标记(Perkins等，J Infect Dis.1998，177：683-691)。令人满意的SBA可以通过任何公知方法确定。使用从动物模型，或者从人类受试者得到的血清可以实施SBA。

用人血清进行SBA的优选方法如下。在第一次接种前、第二次接种后两个月和第三次接种后一个月(一年内的三次接种是一般的人初次接种方案，该方案在例如，第0、2和4个月，或者第0、1和6个月执行)采集血样。可以对1岁以下的婴儿(例如，在Hib接种的同时进行)实施这种人初次接种方案，或者2-4岁的幼儿或青少年也可以用这种初次接种方案接种以检验SBA。如果适用，在初次接种后6到12个月和激发剂量后1个月采集另一血样。

如果第三次疫苗剂量(初次接种方案的)(在2-4岁幼儿或青少年中，但是优选在1岁内的婴儿中)1个月后，针对产生本发明的抗原的脑膜炎球菌菌株的SBA(抗体稀释液)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者的百分比为所有受试者的30％以上，优选40％以上，更优选50％以上，最优选60％以上，那么SBA将可以令人满意地用于具有同源杀细菌活性的抗原或疱制剂。

当然，如果具有同源杀细菌活性的抗原或疱制剂也可以引起针对其所来自的脑膜炎球菌菌株的令人满意的SBA，那么该抗原或疱制剂也可以组成具有同源杀细菌活性的疱制剂。

如果第三次疫苗剂量(初次接种方案的)(在2-4岁幼儿或青少年中，但是优选在1岁内的婴儿中)1个月后，针对3种异源脑膜炎球菌菌株的SBA(抗体稀释液)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者的百分比为所有受试者的20％以上，优选30％以上，更优选35％以上，最优选40％以上，那么SBA将可以令人满意地用于具有异源杀细菌活性的抗原或疱制剂。这种试验可有效指示具有异源杀细菌活性的抗原或疱制剂是否能够诱导针对各种脑膜炎球菌菌株的交叉杀细菌抗体。三种异源菌株应该优选具有相互间和优选与具有异源杀细菌活性的抗原或疱制剂所从中制备和得到的菌株不同的电泳型(ET)-复合物或多基因座序列定型(MLST)模式(见Maiden等，PNAS USA 1998，95：3140-5)。技术人员将能够容易地确定具有不同ET-复合物的三种菌株，该ET-复合物反映了脑膜炎球菌，尤其是脑膜炎球菌B型菌株之间所观察到的遗传多样性，这些菌株被认为是严重的疾病负担的原因并且/或者代表被识别的MenB剧毒谱系(见Maiden等，如前)。例如，可以使用的三种菌株是下面的：属于A-4簇的BZ10(B：2b：P1.2)；属于ET-37复合物的B16B6(B：2a：P1.2)；和属于ET-5复合物的H44/76(B：15：P1.7，16)，或者属于相同ET/簇的其他谱系。这些谱系可用于试验具有异源杀细菌活性的抗原或疱制剂，该制剂从例如属于ET-5复合物的脑膜炎球菌菌株CU385(B：4：P1.15)制备或得到。可以使用的另一示例菌株来自谱系3流行病克隆(例如，NZ124[B：4：P1.7，4])。另一种ET-37菌株是NGP165(B：2a：P1.2)。

测量SBA活性的方法是本领域公知的。例如，可以使用的方法在WO 99/09176中实施例10C中描述。概括地，所要试验的菌株培养物生长于(优选在铁耗尽条件中-通过向生长培养基中加入铁螯合剂如EDDA)生长的对数期。这可被悬浮在含有BSA的培养基(如含有0.3％BSA的Hanks培养基)中以得到调节到约20000CFU/ml的工作细胞悬浮液。将所要试验的血清的一系列两倍稀释液(优选在56℃热失活30分钟)[例如在50μl/孔体积]和将要试验的20000CFU/ml脑膜炎球菌菌株悬浮液[例如25μl/孔体积中]混合可以得到一些列反应混合物。应该温育(例如，37℃15分钟)并摇动(例如，在210rpm)反应小瓶。最终反应混合物[例如在100μl体积中]额外地含有补充来源[如25％终体积的预试验的幼兔血清，或者用于人血清学的人血清]，并如上温育[例如，37℃60分钟]。无菌聚苯乙烯U形底96孔微量滴定板可用于该测定法。可以使用多道移液器从每孔吸取等分试样[例如10μl]，然后将其滴到Mueller-Hinton琼脂板上(优选含有1％Isovitalex和1％热失活的马血清)并温育(例如在5％CO₂中37℃18小时)。优选地，单个菌落可以计数高达80CFU/等分试样。下面的三种试样可用作对照：缓冲液+细菌+补充物；缓冲液+细菌+失活的补充物；血清+细菌+失活的补充物。使用程序可以直接计算SBA效价，该程序通过回归计算处理数据得到相应于细胞杀死50％的稀释液的量度。

该专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请在这里并并入作为参考。

实施例

除了另有详细描述的之外，下面的实施例使用标准技术实施，这些技术是本领域技术人员熟知并且常规的。这些实施例是阐明性的，但是不限制本发明。

实施例1

在WO 01/09350中描述了描述缺失编码参与脑膜炎球菌B的B荚膜多糖产生的蛋白的基因、缺失PorA基因、脑膜炎球菌疱的表面上各种保护性外膜蛋白的上调、免疫优势蛋白或生物合成酶的下调，和分离疱的方法的实例。

实施例2：LOS：关键的交叉保护性抗原

为了为了评价LOS作为潜在的交叉保护性抗原的角色，根据两种不同方法使用H44/76野生型(WT)脑膜炎球菌B菌株(表达L3 LOS)和表达“类galE^-样LOS”(关于lgtE^-LOS的短结构)的修饰的H44/76菌株产生疱。第一种方法使用0.1％DOC以产生疱中高水平的LOS，第二种方法使用0.5％DOC以在所得疱中具有低水平的LOS。

小鼠接受每剂通过IM途径三次注射的(在第0、21和28天)吸附在Al³⁺盐(磷酸铝)和3D-MPL上的5μg疱。在第三次注射后14天采集血样。

抗L3 LOS ELISA在合并的血清中使用纯化的L3 LOS进行。图3A中的结果清楚地表明0.1％DOC方法产生了能够引起小鼠中抗LOS应答的疱。这表明galE^-LOS和L3 LOS能够诱导抗体的产生。另一方面0.5％DOC提取了太多的LOS以使其作为疱疫苗中的关键抗原。

血清杀细菌测定法

使用不同的NmenB菌株：同源WT H44/76菌株、PorA(-)H44/76菌株、和两种异源菌株(基于血清亚型)Cu385和NZ124对各自血清进行SBA。这四种菌株表达一种L3 LOA。加入第五种菌株。与H44/76相比，该菌株(B16B6)不仅对于PorA，而且对于LOS都是异源的(它是一种免疫型L2菌株)。

图3B中的结果指出仅针对L3菌株但是仅仅对于DOC 0.1％WT疱的交叉杀细菌应答。对于DOC 0.1％galE^-疱和DOC 0.5％WT疱没有观察到交叉杀细菌应答。此外，熟知PorA抗体诱导的杀细菌应答是依赖血清型的。在该实验中对于DOC 0.5％WT疱或galE^-疱和用PorA(-)H44/76菌株得到的SBA数据也观察到该情况。

所有这些结果表明含有高百分比L3 LOS的疱诱导的交叉杀细菌应答是由于针对LOS抗原的Abs的产生。

仅仅L3 LOS(不是galE^-LOS)能够引起杀细菌抗体的产生。尽管，在ELISA中对于DOC 0.1％galE^-疱中观察到良好的抗-LOS应答，但是该应答不是生物学相关的(无SBA)。

此外，由于抗L3 LOS Abs仅仅杀死L3菌株而不杀死L2菌株，似乎该应答是LOS免疫型特异的，显示最佳的疫苗应该理想地含有L3和L2 LOS以实现最佳覆盖。

耗尽实验

为了阐明WT DOC 0.1％疱诱导的应答主要是由于抗-LOS抗体，用不同浓度的纯化的L3 LOS耗尽血清库。耗尽后，血清用于针对同源WT H44/76菌株的杀细菌测定法中。

用针对DOC 0.1％WT疱产生的血清得到的结果(见图3C)显示出明显的剂量-范围抑制，表明该制剂诱导的大多数抗体针对LOS(证实用PorA(-)H44/76菌株产生的SBA结果)。相反，WT DOC 0.5％诱导的应答不像用PorA(-)H44/76菌株进行的SBA所阐明的针对LOS并且也通过LOS耗尽指示。

对于L2 LOS可能得到该结果。

实施例3：用L3和中间产物(lgtB^-)DOC自由疱(未解毒的LOS)诱导的交叉杀细菌抗体进行的实验

所用的MC58脑膜炎球菌衍生菌株为B：P1.7.16，opc-，siaD-。该菌株被遗传修饰以表达L3(菌株2G2)或中间表位(菌株2G EcoNlb-1，像2G2但是额外地lgtB^-)或者短版本的LPS(菌株C6，其为lgtE^-)。根据正常的高(0.5％)DOC方法或者无DOC方法产生OMV。

通过肌内途径在第0、20和28天免疫接种小鼠(每组10只)3次。它们接受1或者10μg(蛋白含量)在Al(OH)₃上配制的疱。在第28天(postII)和第42天(post III)采集血样。

在合并的血清上并使用以幼兔血清作为外源补充物来源的同源菌株(MC58和H44/76)和两种异源菌株(M97250687和M9725078)进行杀细菌分析。

下表概述了结果(50％杀灭的杀细菌效价)：

抗原	血样	菌株和血清型
						MC58P1.7.16	H44/76TTP1.7.16	M97250687P1.19.15	M97252078P1.4
		c6 no doc 10ug IMc6 no doc 10ug IMc6 no doc 1ug IMc6 no doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII	＞25601353247411	＞2560＞2560620878					＞2560＞2560247748	9890＜20＜20
2g2 no doc 10ug IM2g2 no doc 10ug IM2g2 no doc 1ug IM2g2 no doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII					＞320＞2560＞2560＞2560	＞2560＞2560＞2560＞2560	＞2560＞2560＞2560＞2560	＞25601407119348
		2gecoN1b-1 no doc 10ug IM2gecoN1b-1 no doc 10ug IM2gecoN1b-1 no doc 1ug IM2gecoN1b-1 no doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII	＞2560＞256011512220	＞2560＞2560＞2560＞2560					＞2560＞256016961947	1162121322135
c6 doc 10ug IMc6 doc 10ug IMc6 doc 1ug IMc6 doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII					30618933NC(＞20)	2481044324	34140063156	＜20＜20＜20＜20
		2g2 doc 10ug IM2g2 doc 10ug IM2g2 doc 1ug IM2g2 doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII	NC(＞20)201275237	25＜20＜20＜20					360647299/644728	＜20＜20＜20＜20
2gecoN1b-1 doc 10ug IM2gecoN1b-1 doc 10ug IM2gecoN1b-1 doc 1ug IM2gecoN1b-1 doc 1ug IM	PostIIPostIIIPostIIPostIII					573NC(＞40)261348	3121NCNC	6851140118692	＜20＜20＜20＜20

显然，L3(2g2)或中间(2gecon1b-1)表位的存在诱导了交叉杀细菌抗体，而来自截断的LPS菌株(C6)的疱诱导较低水平的交叉反应抗体。当注射1μg OMV时尤其证明了这一点。

此外，如用以DOC纯化的OMV所表明的，减少疱的LPS含量降低了交叉杀细菌抗体的诱导。除了LPS增加，可能无DOC的疱也可以有利地保留与OMV如脂蛋白松散地相互作用的一些蛋白。

实施例4：L3 LOS和外膜蛋白的疱内交联

所用的MenB疱来自H44/76菌株(LOS免疫型L3)，该菌株为SiaD^-(从而不表达荚膜多糖)和PorA^-。使用两种不同的菌株：完整的L3(菌株B1717，siad(-)PorA(-)Full L3)和截断的L3(菌株B 1727，siad(-)PorA(-)lgtB(-)TrL3)。

根据公知方法使用EDAC/NHS缀合方法交联疱内的LOS和OMP使得LOS的寡糖组分为依赖T的抗原(EDAC/NHS比甲醛优选，发现甲醛交联程度太高从而不利地影响滤过率)。EDAC与羧酸反应产生活化酯中间产物。存在胺亲核物质时，形成酰胺键并释放异脲副产物。然而，通过形成硫代-NHS酯中间产物可以增加EDAC-介导的反应的效率。硫代-NHS酯比仅EDAC与羧酸盐反应形成的活性酯在水溶液中存在更长时间。这样，使用两步方法可以实现酰胺键形成的更高得率。EDAC/NHS缀合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement By N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156：220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)173-176页中讨论

反应混合物含有体积为1mL的3％蔗糖(用于疱稳定)中的1.5mg硫代-NHS和5mg EDAC。疱以0.025mg EDAC/mg疱的比率存在。疱以2mg/ml的浓度存在并用0.1N HCl或0.1N NaOH调节pH到7.5。

反应物在室温放置4小时，并将混合物对含有3％蔗糖，pH7.5的2mM磷酸缓冲液透析。混合物然后经Sterivex G10 0.22μm过滤。回收疱的得率为99％。

反应后可以紧接着使用抗L3-mAb的蛋白印迹。通过该反应，低MW LOS变得更暗淡而新的更高MW带出现在带上。该更高的MW带似乎占优势并可以代表共价连接到PorB的被缀合的LOS的大多数。

发现EDAC是优秀的疱内交联剂，因为其将LOS不可逆地交联到OMP，并足够提高LOS依赖T的免疫原性，但是不交联到如此高的程度使得产生如差的滤过率、聚集和疱间交联的问题。产生的疱的形态类似于未交联的疱产生的形态(通过电子显微照片观察)。此外，上面的方案避免了发生过高交联(其可降低疱表面上天然存在的保护性OMP，例如TbpA的免疫原性)。

实施例5：L3和截断的(中间的，lgtB-)L3可诱导产生识别截断的(中间的lgtB-；TrL3)L3 LOS的杀细菌Abs

OMV(疱)从MenB菌株H44/76 siaD-PorA-L3或H44/76siad-porA-TrL3产生。进行两种不同的提取；所用的DOC百分比为0.1或0.5％。还评价了两种不同的佐剂制剂：Al(OH)₃或磷酸铝+3D-MPL。小鼠(OF1雌性小鼠，6-8周龄，每组30只)通过IM途径(5μg疱/注射)注射3次(第0、21和28天)。从II后(第28天)和III后(第42天)的血清(合并的血清或各自的血清)收集SBA。

用0.1％DOC提取的疱诱导的血清的50％细胞杀死的几何平均效价和合并的血清效价比用0.5％DOC提取的要大。这可能通过如下事实解释：0.1％DOC提取的疱诱导的血清中LOS是用0.5％DOC提取的疱诱导的血清中LOS的2.5倍。用含有完整L3 LOS或截断的L3 LOS的疱诱导的血清的SBA之间没有显著差异。如果疱用磷酸铝+3D-MPL作为佐剂，与用氢氧化铝作为佐剂相比，SBA增加。

还进行了血清耗尽实验。血清用1mg/mL纯化的L3或trL3 LOS耗尽然后对这些耗尽的血清实施SBA。结果表明杀细菌的Abs(含有抗-L3抗体)可以几乎完全被血清的trL3 LOS预处理耗尽，且杀细菌Abs(含有抗-trL3抗体)可以几乎完全被血清的L3 LOS预处理耗尽。从而抗-L3杀细菌Abs能够与trL3 LOS反应，并且抗-trL3杀细菌Abs能够与L3 LOS反应。此外，从而已经阐明了杀细菌Abs对存在于L3和trL3 LOS中的LOS结构的专一性。

总之，我们已经阐明trL3结构(OMVs中)能够诱导产生针对L3菌株的杀细菌Abs。结合耗尽实验，我们已经证明TrL3和L3 LOS是免疫学基础上非常接近的结构，并且trL3可用于产生能够杀死L3菌株的Ab。

实施例6：TrL3解决了使用完整L3结构的自身免疫的潜在问题

如果L3和trL3结构关于保护性抗体在免疫学上是如此密切相关，那么这两种结构关于与L3(和L2)LOS相关的可能的自身免疫问题是否存在不同[通过乳-N-neotetraose部分]？我们通过是否冷凝集素能够识别trL3 LOS已经着手解决该问题。

已知MAb1 B2-1B7(J Bio Chem 256(1981)10967-10972；和ATCC保藏号TIB-189)在低温凝集人成年红细胞(RBC)并与LNnT(乳-N-neotetraose)反应。其是一般的凝集素。

该单克隆抗体与MabL3.7.9单克隆抗体联合用于下面的实验中，MabL3.7.9单克隆抗体能够杀死L3脑膜炎球菌菌株。

这两种Abs用于ELISA，微量滴定板用聚-L-赖氨酸(1μg/ml，37℃2小时)预涂，然后用纯化的L3或纯化的TrL3 LOS(5μg，4℃过夜)涂布。然后将板用BSA(1％，室温30分钟)饱和。之后用2种抗体的每一种实施标准ELISA。

结果(图4)清楚地表明Mab L379与L3和TrL3反应(图4B)但是1B2-1B7仅仅与L3 LOS反应(图4A)。从而，我们可以说TrL3不被冷凝集素识别，该冷凝集素与含有LNnT四糖的结构(如L3 LOS和人红细胞)反应。

从而，TrL3 LOS具有足够长而保留保护性表位，但是足够短而丧失可能具有人自身免疫问题的表位的最佳特征。

没有理由认为对于本专利申请中提出的截断的L2(lgtB^-)LOS结构也是这样的。

实施例7：交联对B 1820 DOC 0.1％疱的致热性/抗原性的影响

使用不同浓度的EDAC(存在的EDAC越多，越多的疱被交联)交联疱(来自菌株B1820；其来自siaD(-)PorA(-)FrpB(-)截断的Hsf被上调的H44/76，通过lgtB(-)突变截断的L3菌株，存在desferral的条件下培养，疱用DOC 0.1％提取)。交联为疱内的，这通过疱的无菌过滤证明。

使用纯化的Mmen L3 LOS作为标准，SDS-PAGE电泳后通过银染测量得到疱中LOS含量为18％(Tsai，J.Biol.Standardization(1986)14：25-33)。通常用0.1％DOC提取的疱中LOS含量为约20％，使用0.2％DOC的为约15％LOS，使用0.3％DOC的为约10％LOS，使用0.5％DOC的为约5％LOS。通常，包含10％未缀合的LOS或更多的疱是不可接受的致热的。

兔中的致热性

试验了两种制剂(吸附在Al(OH)₃或AlPO₄上的疱)并且如欧洲药典中描述的，致热性试验中兔通过IV途径接受500ng/kg。

结果清楚地表明(下表中)疱内交联对疱的致热性的正影响。相同批的疱用作对照或与不同浓度的EDAC交联。疱被交联地越多(更多EDAC)，它们的致热性越小。对两种不同制剂都观察到该结果。

处理	Al(OH)3	制剂AlPO4	两种制剂s
				未交联EDAC 0.05fEDAC0.2EDAC1	3.1*2.71.71.5	2.82.21.71.4	5.94.93.42.9

^τEDAC浓度：mg EDAC/mg疱

^*各自温度(℃)增加的和(每组3只兔)

^ζ6只兔的和(3只来自Al(OH)₃组，3只来自AlPO₄组)

交联疱的抗原性

评定上面的疱(未吸附的)的抗原性以确定交联是否对疱的抗原性有影响。疱的不同制剂(交联的或未交联的)涂布在微量滴定板上(10μg/ml，4℃过夜)。洗涤和饱和后，将来自用B1820 DOC 0.1或0.5％免疫接种的小鼠的MAb L379或血清的连续稀释液加到板中(室温摇动30分钟)。使用偶联到生物素的抗小鼠Ig然后使用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，之后通过OPD和H₂O₂显示来揭示被涂布的疱上抗体的固定。使用微量滴定板读出器测量每个微孔的密度。

结果表明MAb L379(针对L3 LOS但是还能够与TrL3 LOS(lgtB^-突变体)反应和针对L3菌株的杀细菌活性)同等地识别未处理的(未缀合的)B1820疱和不同的交联疱(无论所用EDAC的浓度怎样)。见图5A。用EDAC 0.2和1得到的更高应答可以反应疱中LOS的更好的锚定或者至少这些EDAC浓度下交联疱中LOS的更高的稳定性。

还使用小鼠血清评定这些疱的抗原性。使用两种不同血清；第一种来自用B1820 DOC 0.5％疱(低LOS含量≤8％的疱，主要诱导抗蛋白抗体)免疫接种的小鼠。第二种血清来自用B1820 DOC 0.1％疱(LOS含量≥15％的疱，主要诱导针对LOS的交叉杀细菌Abs)免疫接种的小鼠。如用L379 MAb所观察到的，用这两种血清得到的结果(分别为图5B和5C)不显示出未处理的(未缀合的)疱和交联的疱(无论所用的EDAC浓度如何)之间的任何差异。

总之，似乎LOS的抗原性不受交联影响并且疱的“总”抗原性不被EDAC处理所改变。正在进行小鼠中免疫原性实验以证明交联(与高浓度EDAC)不破坏关键保护性抗原的免疫原性。然而，初步结果(实施例8)表明当用EDAC 0.025对DOC 0.5％提取的疱进行交联时，表现出EDAC处理后这些疱的免疫原性增强。

实施例8：交联的疱(EDAC 0.025mg化学)的免疫原性

在该实验中疱从B1727菌株产生。该菌株是遗传修饰的H44/76菌株，其是siaD(-)PorA(-)trL3(lgtB^-)Hsf+TbpA上调的。这些疱使用0.5％DOC提取。小鼠通过IM途径免疫接种3次(在第0、21和28天)。每次注射，它们接受吸附在Al(OH)₃上的5μg疱。

对第三次注射后14天采集的单独血清进行针对H44/76菌株的血清杀细菌分析。结果显示出EDAC处理对反应者数目(SBA效价＞100的小鼠数目)的正影响：对于EDAC处理的疱的反应者为37％，而未修饰疱的反应者仅为17％。

制剂中不存在3D-MPL，以及0.5％DOC提取后疱制剂中LOS的相对低的百分比(约5％)解释了该低应答。

小鼠	B1727SiaD(-)PorA(-)TrL3 TbpA-Hsf交联“EDAC”	疱B1727 SiaD(-)PorA(-)TrL3 TbpA-Hsf无处理
			GMT库的SBA	52249	2760
反应者	11/30	5/30

还进行了抗Hsf-ELISA以确定是否交联对该蛋白的免疫原性有影响。结果(用合并的血清得到的)表明交联对IgG抗-Hsf应答没有影响。没有检测到IgM。

	抗Hsf ELISA
			IgM	IgG
	B1727Siaα(-)PorA(-)TbpA-Hsf TrL3交联EDAC	50			18140
B1727Siaα(-)PorA(-)TbpA-Hsf TrL3			50	15627
	负对照	50			50

实施例9：TrL3 LOS数据

评价了下面的实验：

-TrL3(lgtB(-)L3 LOS)对诱导能够与LNnT(乳-N-neotetraose)反应的Abs的影响；

-上面构建体的杀细菌抗体的诱导。

从两种遗传修饰的H44/76菌株产生疱。两种都是siaD()PorA(-)但是一种产生WT L3 LOS而另一种产生TrL3 LOS(lgtB(-))。这些疱根据不同方法产生以具有高LOS含量(约18％，使用DOC 0.1％提取)或低LOS含量(接近5％，使用DOC 0.5％提取)。

通过IM途径用吸附在有或没有3D-MPL的Al(OH)₃上的5μg疱(每次注射)免疫接种三次(在第0、21和28天)。

抗LNnT ELISA

方法：微量滴定板用通过间隔区(ADH)缀合到人血清清蛋白的LNnT涂布(PBS中5μg缀合物/ml，100μl/微孔)。4℃过夜温育后，将板用PBS-BSA 1％洗涤并饱和(室温下40分钟)。洗涤后，在PBS-0.2％BSA-0.05％Tween20中连续稀释(室温下30分钟)。通过偶联到过氧化物酶(Jackson)的抗小鼠-IgG然后与OPDA和H₂O₂温育显示IgG在LNnT上的固定。

结果：正对照是1B2-1B7 Mab。该MAb与LNnT并且与L3LOS(但是不与TrL3 LOS)反应(见前面的实施例)并且其凝集人红细胞。负对照(-)是来自只用佐剂免疫接种的小鼠的血清。

结果(图6)清楚地表明仅仅具有高LOS含量(DOC 0.1％)的L3疱诱导产生能够与LNnT反应的IgG。具有类似LOS含量的Tr L3疱不诱导针对LNnT的IgG的产生，就像含有低含量LOS(DOC 0.5％)的两种疱制剂也不诱导针对LNnT的IgG的产生一样。

H44/76菌株的SBA

对第三次注射后14天采集的单独的血清进行针对H44/76菌株的SBA分析。下面的结果清楚地表明trL3(lgtB(-))LOS疱诱导和L3 LOS类似的杀细菌抗体水平(见GMT和SBA效价＞1/100的小鼠的数目(＝SC))。

制剂		L3疱		TrL3疱
						DOC0.5％	DOC0.1％	DOC0.5％	DOC0.1％
		Al(OH)3+MPL	GMTSC	33119/30	412529/30					102927/30	320430/30
Al(OH)3	GMTSC					16914/30	202929/30	13813/30	82830/30

实施例10：FrpB敲除

下面的数据是两个临床前实验的概述。

在这些实验中，两种遗传修饰的H44/76菌株用于使用0.1％DOC产生疱。通过该方法得到的疱的LOS含量接近20％。

这两种H44/76菌株如下：

-B1733：siaD(-)PorA(-)Tr(截断的)Hsf上调的lgtB(-)

-B1820：siaD(-)PorA(-)TrHsf上调的lgtB(-)FrpB(-)

菌株在存在desferral时生长后产生疱，该desferral用于上调依赖铁的蛋白如LbpA/B、TbpA/B、FrpB(B 1733中)等的产生。

这些不同的疱制剂吸附在Al(OH)₃上并每隔三周通过IM途径两次注射到小鼠中。在第二次施用后7天采集血样。小鼠每次注射接受5μg疱。

SBA结果

对三种L3菌株(同源野生型菌株H44/76和两种异源L3菌株：NZ124和M97250687)实施杀细菌测定法。结果清楚地表明FrpB(-)(敲除)(B1820)疱比FrpB(+)疱(B1733)诱导更好的异源交叉杀细菌应答(高效价和更好的血清转变SC)。异源应答，尽管通过FrpB耗尽被降低，但是仍然令人满意。

这些数据表明FrpB是疱引起的免疫应答中的主要驱动者，但是，由于该外膜蛋白高度可变，针对该蛋白的抗体仅能够诱导同源菌株的杀灭。疱生产菌株中FrpB的缺失因此是提高疱疫苗产生的覆盖的有利方法。

疱	H44/76		M97250687		NZ124
							GMT	SC	GMT	SC	GMT	SC
	B1733B1820	1518781	30/3019/30	1511316	11/3024/30	70276							4/2919/30

实施例11：msbB(lpxL 1)突变对疱的致热性的影响

两种NmenB菌株用于该评价：

-对照菌株，其是galE(-)[从而不能产生荚膜多糖]

-msbB突变菌株：其是galE(-)和msbB(-)

使用0.1％DOC从这两种菌株产生疱以便在OMVs(疱)中具有15％以上的LOS含量。如在前面实施例中陈述的，具有高于10％LOS含量的疱制剂从致热性观点看是不令人满意的并且在欧洲药典的兔致热性测定法中失败。

上面的疱在Al(OH)₃(50μg OMVs/500μg Al³⁺盐)上配制以用于的兔的致热性测定法中(通过IV途径注射500ng疱/kg)。

结果清楚地表明msbB的缺失(尤其在不能产生荚膜多糖的菌株中)使得能够产生即使在LOS含量大于15％时也在兔中为非致热性的疱。

疱	稀释	单独的t°增加(℃)	t°的和	结论
					对照DOC 0.1％	0.5μg/kg	0.7-1.4-1.2	3.3	失败
MsbB(-)DOC 0.1％	0.5μg/kg	0.1-0.2-0.2	0.5	通过

欧洲药典标准：

-如果单独的t°的和＜1.15℃，则“通过”

-如果单独的t°的和在1.15℃和2.65℃之间，则“如果不重复，则失败”

-如果单独的t°的和＞2.65℃，则“失败”

结论：

包含来自具有lgtB(-)和msbB(-)突变并且用较低(例如0.1％)脱氧胆酸盐浓度提取的脑膜炎球菌菌株的L3和L3疱的组合物提供了针对脑膜炎球菌B的有效、安全的疫苗的坚实基础。该疱生产菌株是理想的荚膜多糖合成缺陷的，并且疱具有疱内交联到外膜蛋白的LOS。和Hsf和/或TbpA抗原上调一样，PorA(-)和FrpB(-)的之一或两者在提高交叉杀细菌有效性方面也是有用的。

Claims (52)

1.奈瑟氏球菌疱制剂，其来自具有L2 LOS免疫型的奈瑟氏球菌菌株或者具有L3 LOS免疫型的奈瑟氏球菌菌株并且其中菌株为lgtB^-；或者奈瑟氏球菌疱制剂，其包含来自具有L2 LOS免疫型的奈瑟氏球菌菌株和具有L3 LOS免疫型的奈瑟氏球菌菌株的疱的组合，任选其中每种菌株为lgtB^-。

2.权利要求1的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株为脑膜炎球菌的，优选血清群B。

3.权利要求1或2的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株不能合成荚膜多糖。

4.权利要求3的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株与它们所来自的天然菌株相比，如下荚膜多糖基因之一的表达被下调，优选被缺失：ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA、synB、synC，或优选siaD；并且其中当L2和L3疱都存在时，它们所来自的菌株优选具有相同的荚膜多糖基因在每种菌株中的表达被下调。

5.权利要求1-4的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株与它们所来自的天然菌株相比，下面的脂质A基因之一或两者表达被下调，优选被缺失：msbB或htrB，优选前者；并且其中当L2和L3疱都存在时，它们所来自的菌株优选具有相同的脂质A基因在每种菌株中的表达被下调。

6.权利要求1-5的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株与它们所来自的天然菌株相比，一或多种下述外膜蛋白基因的表达被下调，优选被缺失：porA、porB、opA、opC、pilC或frpB；并且其中当L2和L3疱都存在时，它们所来自的菌株优选具有相同的外膜蛋白基因在每种菌株中的表达被下调。

7.权利要求6的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株与它们所来自的天然菌株相比，下面的外膜蛋白基因的任一种组合的表达被下调，优选被缺失：PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC、PorA和FrpB、OpC和FrpB、OpA和FrpB、PorA和OpA和OpC和FrpB。

8.权利要求1-7的奈瑟氏球菌疱制剂，其中奈瑟氏球菌菌株具有一或多种下述外膜蛋白抗原的表达被上调：NspA、TbpA低、TbpA高、Hsf、Hap、OMP85、PilQ、NadA、LbpA、MltA；其中当L2和L3疱都存在时，它们所来自的菌株优选具有一种或多种不同的外膜蛋白抗原在每种菌株中的表达被上调。

9.来自一种奈瑟氏球菌菌株的奈瑟氏球菌疱制剂，该菌株与它们所来自的天然菌株相比，下面的外膜蛋白的两种或多种表达被下调，优选被缺失：PorA、PorB、OpA、OpC、PilC、或FrpB。

10.权利要求9的奈瑟氏球菌疱制剂，其中该奈瑟氏球菌菌株与它们所来自的天然菌株相比，下面的外膜蛋白组合的任一种的表达被下调，优选被缺失：PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC、PorA和FrpB、OpC和FrpB、OpA和FrpB、PorA和OpA和OpC和FrpB。

11.权利要求1-10的奈瑟氏球菌疱制剂所来源的奈瑟氏球菌菌株。

12.从权利要求11的奈瑟氏球菌菌株分离的LOS制剂，其包含免疫型L2和/或L3 LOS。

13.在脂质体制剂中的权利要求12的LOS制剂。

14.权利要求1-10任一项的奈瑟氏球菌疱制剂或权利要求12或13的LOS制剂，其中所含LOS缀合到T-辅助表位的来源，优选蛋白或外膜蛋白。

15.权利要求14的奈瑟氏球菌疱制剂，其可以通过疱内交联方法得到。

16.免疫原性组合物或疫苗，其包含权利要求1-10或12-15任一项的奈瑟氏球菌疱制剂或LOS制剂，以及药学上可接受的赋形剂。

17.权利要求16的疫苗，进一步包含佐剂，优选氢氧化铝，或者3D-MPL和磷酸铝。

18.权利要求16或17的疫苗，其另外地包含来自下面的菌株的一种或多种缀合的荚膜多糖或寡糖：脑膜炎球菌血清群A、脑膜炎球菌血清群C、脑膜炎球菌血清群W-135、脑膜炎球菌血清群Y、和B型流感嗜血菌。

19.制备权利要求16的奈瑟氏球菌疱制剂疫苗的方法，该方法包含步骤：培养权利要求11的奈瑟氏球菌菌株，从中分离疱，任选如果合适组合L2和L3疱，和将疱与药学上可接受的赋形剂配制。

20.权利要求19的方法，其中通过用0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、0.06-0.2、或0.08-0.15％的脱氧胆酸盐，优选用大约或精确地0.1％脱氧胆酸盐提取来实施分离步骤。

21.革兰氏阴性细菌菌株的疱制剂，在该菌株的外膜中整合缀合到LOS的外膜蛋白。

22.权利要求21的疱制剂，其中10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99％以上的缀合的LOS的脂质A部分整合到疱的外膜和/或环境中，从而其毒性被减弱或者与其已经施用的宿主屏蔽。

23.权利要求21或22的疱制剂，其中疱中LOS与具有相同量的未缀合的LOS的疱相比毒性减弱。

24.权利要求21-23的疱制剂，其中10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99％以上的缀合的LOS处于当施用于宿主的免疫系统时适于诱导针对该LOS的杀细菌抗体应答的天然构象。

25.权利要求21-24的疱制剂，其中缀合的LOS具有适于在宿主中引起针对未缀合的LOS反应性的免疫应答的构象。

26.权利要求21-25的疱制剂，其中外膜蛋白缀合到LOS分子的寡糖或多糖部分。

27.权利要求21-26的疱制剂，其中外膜蛋白和LOS分子对产生疱的革兰氏阴性细菌菌株而言是天然的。

28.权利要求21-27的疱制剂，其可通过疱内交联方法得到。

29.权利要求21-28的疱制剂，其中疱中存在的10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95％以上的LOS交联或缀合到外膜蛋白。

30.权利要求21-29的疱制剂，其来自不产生荚膜多糖的革兰氏阴性菌株，或来自不包含荚膜多糖的疱制剂。

31.权利要求21-30的疱制剂，其中荚膜多糖不缀合到整合在疱制剂中的外膜蛋白。

32.权利要求21-31的疱制剂，其从粘膜炎莫拉氏菌或未定型流感嗜血菌菌株得到。

33.权利要求21-31的疱制剂，其从奈瑟氏球菌菌株，优选脑膜炎奈瑟氏球菌得到。

34.权利要求33的疱制剂，其中疱制剂包含缀合的L2 LOS、缀合的L3 LOS、或者缀合的L2和L3 LOS的混合物，优选分别缀合到至少两种不同疱。

35.权利要求33或34的疱制剂，其来自lgtB^-菌株，或者其中LOS具有截断结构，与来自lgtB^-菌株的相一致。

36.权利要求32-35的疱制剂，其来自htrB^-和/或msbB^-菌株，或者其中LOS脂质A部分缺少仲酰基链，与从htrB^-和/或msbB^-脑膜炎菌株分离的相一致。

37.免疫原性组合物或疫苗，其包含权利要求21-36的疱制剂和药学上可接受的赋形剂。

38.权利要求37的免疫原性组合物或疫苗，其另外包含一种佐剂，优选氢氧化铝，或3D-MPL和磷酸铝。

39.权利要求37或38的免疫原性组合物或疫苗，其还包含一种或多种来自下面的菌株的缀合的荚膜多糖或寡糖：脑膜炎球菌血清群A、脑膜炎球菌血清群C、脑膜炎球菌血清群W-135、脑膜炎球菌血清群Y、和B型流感嗜血菌。

40.从革兰氏阴性细菌菌株制备疱内缀合的疱制剂的方法，其中该菌株的外膜中整合了缀合到LOS的外膜蛋白，该方法包含步骤：

a)从革兰氏阴性菌株分离疱，

b)实施适于将存在于疱中的LOS的寡糖部分缀合到存在于相同疱上的外膜蛋白的化学方法，

c)分离疱内缀合的疱制剂，和

d)任选将疱内缀合的疱制剂与通过相同方法制备但是具有不同LOS免疫型的另一疱内缀合的疱制剂配制和/或将疱制剂与药学上可接受的赋形剂配制以产生疫苗组合物。

41.权利要求40的方法，其中在步骤a)中疱用低浓度如0-0.3％，优选大约或精确地0.1％的脱氧胆酸盐提取。

42.权利要求40或41的方法，其中步骤b)中pH保持在7到9之间，优选约pH7.5。

43.权利要求40-42的方法，其中步骤b)在1-5％，优选约3％的蔗糖中实施。

44.权利要求40-43的方法，其中步骤b)在低NaCl浓度条件中实施。

45.权利要求40-44的方法，其中步骤b)用EDAC/NHS化学方法实施。

46.权利要求40-45的方法，其中步骤a)中疱分离自奈瑟氏球菌菌株，优选脑膜炎球菌菌株，最优选脑膜炎球菌B菌株。

47.权利要求46的方法，其中菌株不能产生荚膜多糖，并且优选为siaD^-突变体。

48.权利要求46或47的方法，其中菌株是lgtB^-突变体。

49.权利要求46-48的方法，其中菌株是msbB^-和/或htrB^-。

50.权利要求46-49的方法，其中菌株具有L2 LOS免疫型。

51.权利要求46-50的方法，其中菌株具有L3 LOS免疫型。

52.权利要求46-51的方法，其中在步骤d)中通过权利要求50的方法产生的具有L2免疫型的脑膜炎球菌疱内缀合的疱制剂与另一通过权利要求51的方法产生的具有L3免疫型的脑膜炎球菌疱内缀合的疱制剂组合。

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