ES2329979T3 - Proteinas de union de transferencia de neisseria gonorrhoeae y neisseria meningitis. su uso como vacuna. - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna frente a la infección causada por Neisseria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria gonorrhoeae purificado que comprende un polipéptido de 100 kD de la cepa de Neisseria gonorrhoeae FA19, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por un ácido nucleico complementario al polinucleótido mostrado en la Fig 2a.

Description

Proteínas de unión de transferrina de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis. Su uso como vacuna.

La presente solicitud se dirige a las proteínas de unión de transferrina de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis, y a los fragmentos y análogos de reacción inmunológica cruzada de las mismas. La memoria se dirige además a anticuerpos dirigidos frente a tales proteínas, así como al uso de tales proteínas y anticuerpos en la detección de N. gonorrhoeae y N. meningitidis, y en el tratamiento de las enfermedades provocadas por N. gonorrhoeae y N. meningitidis. El ADN que codifica las proteínas de unión de transferrina recombinantes y las células que expresan tal ADN también están englobados por la presente invención.

N. gonorrhoeae y N. meningitidis son dos patógenos del género Neisseria que son genéticamente similares, pero patogénicamente diferentes. El hierro es un nutriente esencial para el crecimiento de N. gonorrhoeae y N. meningitidis, como lo es para muchas bacterias. A diferencia de la mayoría de las bacterias gram-negativas, N. gonorrhoeae y N. meningitidis no producen ni secretan los compuestos quelantes del hierro solubles de poco tamaño denominados sideróforos. Estas otras bacterias gram-negativas tienen receptores que son capaces de absorber el complejo de hierro-sideróforo.

En cambio, se cree que N. gonorrhoeae y N. meningitidis poseen proteínas de membrana que se unen con las glicoproteínas de unión con el hierro lactoferrina y transferrina, que están presentes en las secreciones exocrinas humanas y en el suero, respectivamente. Se cree que N. gonorrhoeae y N. meningitidis absorben el hierro en huéspedes humanos mediante la unión de la lactoferrina y la transferrina con estas proteínas de membrana de unión con la lactoferrina y la transferrina, i.e., receptores.

Se cree que la proteína de unión de lactoferrina de N. meningitidis es una proteína de la membrana celular exterior regulada por el hierro de 105 kD; véase Schryvers y Morris, Infect. Immun. 56, 1144-1149 (1988). Se ha publicado que la proteína de unión de transferrina de una cepa de N. meningitidis es una proteína de la membrana celular exterior regulada por el hierro de 71 kD, aunque se ha publicado que hay otras cepas que tienen proteínas de unión de transferrina con pesos moleculares de 75 kD-88 kD, 85 kD y 95 kD; véase Schryvers y Morris, Mol. Microbiol. 2, 281-288 (1988). Estos autores reconocen que los resultados de los diversos intentos por identificar la proteína de unión de transferrina de N. meningitidis no concuerdan entre sí. De hecho, se observó que las proteínas de 85 kD y 95 kD no eran necesarias par la función receptora de la transferrina en N. meningitidis; véase Dyer et al., Microbial Pathogenesis 3, 351-363 (1987).

También ha sido de interés la capacidad de N. gonorrhoeae para asimilar el hierro. En una investigación, un ensayo de unión a puntos que implicaba el uso de membranas gonocócicas totales derivadas de células desarrolladas en condiciones deficientes en hierro sugirió la presencia de receptores separados para la lactoferrina y para la transferrina. No se determinaron el peso molecular ni otras propiedades de las proteínas de unión. Véase Lee y Schryvers, Mol. Microbiol. 2, 827-829 (1988). Por lo tanto, la identidad de las proteínas de unión en N. gonorrhoeae no ha sido establecida con anterioridad.

Las enfermedades provocadas por una infección gonocócica y meningocócica lo invaden todo y a menudo son graves. Se necesitan mejores procedimientos para prevenir, detectar y tratar enfermedades tales como la gonorrea, la meningitis y el choque séptico.

El crecimiento de N. gonorrhoeae y N. meningitidis en seres humanos se puede inhibir reduciendo la capacidad de estas células para absorber el hierro. Se podría realizar una reducción de la capacidad de las células gonocócicas y meningocócicas para asimilar el hierro en el torrente sanguíneo bloqueando la función receptora de la transferrina. Por ejemplo, podría bloquearse el receptor de la transferrina mediante anticuerpos frente al receptor. Para aumentar los anticuerpos frente al receptor, sin embargo, es necesario identificar al receptor para que pueda ser aislado.

Existe, por tanto, la necesidad de identificar, aislar y purificar las proteínas de unión de transferrina de N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Se necesitan moléculas de ADN que codifiquen tales proteínas para producir proteínas de unión de transferrina recombinantes. Se necesitan anticuerpos frente a las proteínas de unión de transferrina para inhibir la función receptora de la transferrina. Se necesitan vacunas para prevenir y tratar las infecciones gonocócicas y meningocócicas. Se necesitan sondas de anticuerpo y ácido nucleico para detectar N. gonorrhoeae y N. meningitidis. El objeto de la presente invención es proporcionar tales proteínas, anticuerpos, moléculas de ADN y vacunas para detectar, prevenir y tratar las infecciones gonocócicas y meningocócicas.

Schryvers et al., (1989) "Canadian Journal of Microbiology", vol. 35, n.º 5, 409-415 revelan un análisis comparativo de las proteínas de unión de transferrina y lactoferrina de la familia Neisseriaceae, incluyendo Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.

Griffiths et al., (1990) FEMS Microbiology Letters vol. 57, n.º 1-2, 31-36 informan sobre la heterogeneidad antigénica y molecular de la proteína de unión de transferrina de Neisseria meningitidis. Informan que las cepas de Neisseria meningitidis estudiadas tienen una proteína de unión con un M_{r} de entre 78 kDa y 83 kDa o de aproximadamente 68 kDa.

Resumen de la invención

Un aspecto de la invención proporciona una composición de vacuna frente a la infección causada por Neisseria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria gonorrhoeae purificado que comprende un polipéptido de 100 kD de la cepa de Neisseria gonorrhoeae FA19, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por un ácido nucleico complementario al polinucleótido mostrado en la Fig 2a.

Otro aspecto más de la invención proporciona una composición de vacuna frente a la infección causada por Neisseria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria meningitidis purificado que comprende un polipéptido de 95 kD de la cepa de Neisseria meningitidis FAM20, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por un ácido nucleico complementario al polinucleótido mostrado en la Fig 5.

Otro aspecto más de la invención proporciona el uso de las composiciones de vacuna de la invención para la fabricación de un medicamento para inmunizar un mamífero frente a la infección por Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis.

Otro aspecto más de la invención proporciona el uso de las composiciones de vacuna de la invención para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de y/o matar a Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis.

Éstos y otros objetivos, como será evidente para los expertos en la técnica, se han logrado proporcionando una proteína regulada por el hierro encontrada en las membranas exteriores de Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis, proteína que está sustancialmente libre de:

(a)

detergente;

(b)

papel de nitrocelulosa/acetato de celulosa; y

(c)

otras proteínas reguladas por el hierro de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis;

proteína que se puede aislar por medio de una columna de afinidad por la transferrina;

proteína que se une específicamente con los antisueros dirigidos frente a una proteína de la membrana celular exterior regulada por el hierro que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kD encontrada en Neisseria gonorrhoeae; y proteína que es importante en la función receptora de la transferrina de Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis; y análogos de tales proteínas.

Se proporcionan además moléculas de ADN que expresan la proteína de unión de transferrina y sus análogos en una célula huésped. La proteína recombinante resultante también forma parte de la revelación.

También se proporcionan anticuerpos frente a las proteínas de unión de transferrina de la invención. Los anticuerpos inhiben el crecimiento de N. gonorrhoeae y/o N. meningitidis, y son útiles para controlar las infecciones de estos patógenos.

La invención incluye composiciones de vacuna que comprenden las proteínas de unión de transferrina y los análogos de tales proteínas, así como los procedimientos para inmunizar a un huésped frente a enfermedades gonocócicas y meningocócicas, tales como la gonorrea, la meningitis y el choque séptico, mediante la administración de tales vacunas. Se pueden usar los anticuerpos proporcionados en la inmunización pasiva para tratar enfermedades gonocócicas y meningocócicas.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una secuencia de ADN parcial del gen de la proteína de 100 kD de la cepa gonocócica FA19 obtenida a partir de los insertos pUNCH401 y pUNCH402; véanse el ejemplo 6a y el ejemplo 7.

La figura 2A muestra la secuencia de un fragmento génico de la proteína de unión de transferrina de 100 kD en un inserto pUNCH403. Las letras mayúsculas indican la región de solapamiento entre los clones pUNCH401 y pUNCH402 (figura 1) y pUNCH403. El codón de inicio propuesto para la proteína de unión de transferrina gonocócica de 100 kD tiene lugar en el nucleótido 659. El sentido del marco de lectura abierto es opuesto al mostrado en la figura (i.e., del nucleótido 659 al nucleótido 1). Véase el ejemplo 8.

La figura 3 muestra las posiciones de las inserciones de transposones en el fragmento de la proteína de unión de transferrina gonocócica de 100 kD en pUNCH403 y los correspondientes fenotipos de sus respectivos mutantes. Los transposones (mTn3CAT) fueron insertados mediante mutagénesis lanzadera en E. coli. Se seleccionaron transformantes resistentes al cloranfenicol en FA19 para crear mutantes. Debajo de cada inserción de transposón (indicada mediante un triángulo invertido), el crecimiento sobre transferrina humana 2,5 uM (saturada al 25% con Fe) y la expresión de la proteína según lo analizado mediante transferencia Western se indican con + o -. El marco de lectura abierto, indicado con una flecha ondulada, se lee de derecha a izquierda (la misma orientación de la figura 2A) y comienza con metionina, indicada con una M. Se encontró una secuencia de -10 típica (-10), pero no se pudo identificar la secuencia de -35 canónica. El crecimiento de tipo natural y la expresión de la proteína se muestran a la derecha bajo el encabezamiento de "No Tn".

La figura 4 muestra la estrategia para la clonación del gen de la proteína de unión de transferrina de 95 kD meningocócica. Se clonó el fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb de un banco de Zap Lambda II usando una sonda de anticuerpo. Se clonaron los fragmentos de 5,0 kb y 3,5 kb mostrados en la etapa 2 de un banco de ClaI parcial en pHSS6-GCU usando el fragmento de 1,3 kb como sonda. Se clonó el fragmento Hinc II de 3,5 kb de la etapa 3 de un banco de Zap Lambda II usando el fragmento EcoRI/ClaI de 3,5 kb de la etapa 2 como sonda. Los fragmentos de las etapas 1-3 se encajan según lo mostrado en el fragmento titulado "Cromosoma FAM20".

La figura 5 muestra la secuencia del fragmento Hinc II/EcoRI de 1,3 kb de la etapa 1 de la figura 4. El sitio de unión al ribosoma está subrayado. El codón de inicio ATC y la dirección de la transcripción se indican con la flecha. Véase el ejemplo 10.

La figura 6 muestra los resultados de los experimentos de mutagénesis de los transposones que implican al fragmento Hinc II/EcoRI de 1,3 kb de la etapa 1 de la figura 4. Véase el ejemplo 11.

Descripción detallada de la invención Aislamiento de proteínas de bacterias

Se preparan proteínas de unión de transferrina a partir de las membranas de N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Las membranas se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. El procedimiento descrito por Schryvers y Morris en Infect. Immun. 56, 1144-1149 (1988) es adecuado.

Las membranas se obtienen de células desarrolladas en un medio deficiente en hierro. El medio de crecimiento puede ser un medio de crecimiento estándar, tal como una base de medio GC (base de medio gonocócico) suministrada por Difco. Es posible convertir este medio en deficiente en hierro mediante la adición de agentes quelantes, tales como el ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), ácido etilen-diamino-di-orto-hidroxifenil-acético (EDDA) o desferal (ciba Pharmaceuticals). Alternativamente, el medio de crecimiento puede ser un medio definido químicamente descrito por Mickelsen y Sparling (Inf. Immun. 33, 555-564 (1981)), que se haya vuelto deficiente en hierro mediante el tratamiento con el agente quelante Chelex-100 (Bio-Rad).

Cualquier cepa gonocócica y meningocócica que tenga una función receptora de la transferrina normal es útil en la presente invención. Tales cepas tienen generalmente un origen clínico o de otro tipo, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Bethesda, Maryland y el depósito de Neisseria, NAMRU, Universidad de California, Berkley.

Por ejemplo, la cepas gonocócica FA19, que se describe en McKenna et al, Infect. Immun. 56, 785-791 (1988); FA248, que se describe en Biswas et al., J. Bacteriol. 151, 77-82 (1979); y F62, que se describe en West y Sparling, Infect. and Immun. 47, 388-394 (1985) constituyen fuentes adecuadas de la proteína transferrina gonocócica. Las cepas meningocócicas FAM18 y FAM20 (Dyer et al., Microbial Pathogenesis 3, 351-363 (1987)) y B16B6, grupo X y grupo W135 (Schryvers y Morris 56, 1144-1149 (1988)) son representativas de fuentes de proteína de unión de transferrina meningocócica.

Las proteínas que se unen con la transferrina se pueden aislar de otras proteínas de membrana de N. gonorrhoeae y N. meningitidis privadas de hierro con transferrina inmovilizada usando procedimientos de afinidad conocidos en la técnica; véase, Por ejemplo, Schryvers y Morris, Infect. Immun. 56, 1144-1149 (1988). Es preferible usar una variación de este procedimiento, que se describe en el ejemplo 2a, para resolver las proteínas de unión de transferrina de las proteínas de membrana gonocócicas y meningocócicas.

En síntesis, se aíslan membranas de células gonocócicas y meningocócicas privadas de hierro y se tratan con transferrina biotinilada. El complejo resultante es inmovilizado mediante, por ejemplo, el tratamiento del complejo con avidina- o estreptavidina-agarosa. Se lavan exhaustivamente los sedimentos de la resina de afinidad y se suspenden en tampón. Se separa el receptor de transferrina de la transferrina inmovilizada mediante, por ejemplo, calentamiento. Las proteínas se separan mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS según el procedimiento de Laemmli, Mature 227, 680-685 (1970). Se resuelve una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kD, en lo sucesivo, proteína de 100 kD, de los gonococos. Se resuelve una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 95 kD de los meningococos.

Identificación de proteínas

Se determinaron los pesos moleculares resolviendo bandas simples sobre electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y comparando sus posiciones con las de los patrones conocidos. Los expertos en la técnica entienden que el procedimiento es exacto en un intervalo del 3-5%. Los pesos moleculares variaron ligeramente entre las determinaciones. El peso molecular de la proteína de los gonococos fue constante y repetidamente superior al de la de los meningococos, y varió de 97-100 kD.

La confirmación de que la proteína de unión de transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae es importante para la función receptora de la transferrina se obtuvo preparando cinco mutantes gonocócicos diferentes deficientes en actividad receptora de la transferrina. Se analizó cada mutante en cuanto a la presencia de la proteína de unión de transferrina de 100 kD mediante transferencia Western usando antisueros policlonales en conejos. En cada mutante, la cantidad de proteína de la membrana exterior de 100 kD fue mucho menor que la observada para las cepas gonocócicas de tipo natural. Otras cepas gonocócicas mutantes con una actividad receptora de la transferrina normal tenían niveles de tipo natural de la proteína de 100 kD en sus membranas.

Un experimento similar estableció que la proteína de 95 kD de los meningococos es importante para la función receptora de la transferrina. Se realizó un análisis de transferencia Western con antisueros dirigidos frente a la proteína de 100 kD de N. gonorrhoeae, que se descubrió que reaccionaba de forma cruzada con la proteína de 95 kD de N. meningitidis. De este modo, tanto en N. gonorrhoeae como en N. meningitidis, la falta de actividad receptora de la transferrina está correlacionada con la ausencia de las proteínas de 100 kD y de 95 kD, respectivamente.

Por lo tanto, en contra de las expectativas basadas en la técnica anterior, la proteína de la membrana exterior de 100 kD regulada por el hierro encontrada en N. gonorrhoeae es el receptor de la transferrina. La proteína de la membrana exterior de 95 kD regulada por el hierro encontrada en N. meningitidis, sorprendentemente, reacciona de forma cruzada con los antisueros dirigidos frente a la proteína de 100 kD encontrada en N. gonorrhoeae, y es el receptor de la transferrina de N. meningitidis. Los antisueros dirigidos en mamíferos, tales como conejos, ratones, cabras, monos y seres humanos, frente al receptor de la transferrina de N. gonorrhoeae, generalmente, reaccionan de forma cruzada con el receptor de la transferrina de N. meningitidis, y viceversa. Los anticuerpos monoclonales, generalmente, también reaccionan de forma cruzada con las proteínas de 95 kD y 100 kD.

Como se usa en la presente memoria, el receptor de la transferrina de N. gonorrhoeae y N. meningitidis incluye la proteína de la membrana exterior de 100 kD regulada por el hierro de N. gonorrhoeae y la proteína de la membrana exterior de 95 kD regulada por el hierro de N. meningitidis. Debería entenderse que estos receptores de la transferrina constituyen una clase de proteínas. La clase incluye, por ejemplo, las variaciones en la secuencia de aminoácidos que tienen lugar de manera natural en las diversas cepas de N. gonorrhoeae y N. meningitidis.

Las proteínas incluyen además análogos funcionales de los receptores de la transferrina de 100 kD o de 95 kD de N. gonorrhoeae o de N. meningitidis, respectivamente. Se considera que una proteína es un análogo funcional de otra proteína para una función específica, según lo descrito más adelante, cuando el análogo reacciona de forma inmunológicamente cruzada con y tiene la misma función que la otra proteína. El análogo puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína, o un mutante por sustitución, adición o eliminación de la proteína.

Las proteínas y los análogos funcionales son esencialmente puros. A efectos de esta memoria, esencialmente puros significa que las proteínas y los análogos funcionales están libres del resto, excepto cantidades traza, de las proteínas reguladas por el hierro de N. gonorrhoeae y N. meningitidis, así como de los materiales usados durante el procedimiento de purificación. Las otras proteínas reguladas por el hierro de N. gonorrhoeae y N. meningitidis incluyen otras proteínas de unión de transferrina. Los materiales usados en el procedimiento de purificación incluyen detergentes, agentes de unión por afinidad y películas de separación. Los detergentes incluyen dodecil-sulfato de sodio y sarcosina. Los agentes de unión por afinidad incluyen agarosa, avidina-agarosa, estreptavidina-agarosa, biotina y proteínas biotiniladas, tales como transferrina biotinilada. Las películas de separación incluyen papel de nitrocelulosa y papel de nitrocelulosa/acetato de celulosa.

ADN recombinante

Se conocen procedimientos para aislar ADN una vez que la proteína ha sido aislada y purificada. Muchos de estos procedimientos se describen en Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982). Se prefiere el procedimiento de inmuno-evaluación selectiva.

Por ejemplo, se aísla ADN cromosómico de una cepa gonocócica o meningocócica capaz de utilizar el hierro unido con la transferrina, tal como las descritas anteriormente, y se escinde en fragmentos de un tamaño adecuado mediante procedimientos estándar. Los procedimientos de escisión de ADN adecuados incluyen, por ejemplo, el tratamiento con ultrasonidos y el uso de endonucleasas de restricción. Un tamaño de fragmento medio adecuado es de aproximadamente 0,5-10 kpb.

Se añaden ligadores a los fragmentos y se unen los fragmentos resultantes en un vector adecuado. El ligador corresponde a un sitio de restricción dentro del vector. Los ligadores adecuados incluyen, por ejemplo, EcoRI, PstI y BamHI. Un vector adecuado es lambda-gtll. Se puede empaquetar el ADN unido con equipos comerciales, tales como un equipo fabricado por Promega.

Las proteínas del banco resultante se clonan y se expresan en un huésped adecuado, comúnmente, en E. coli. La clonación se realiza preferiblemente en un huésped de E. coli que porta las siguientes mutaciones: mcrA, mcrB, mcrC, mrr, hsdS, hsdR y hsdM. Algunas cepas de E. coli adecuadas incluyen DH5alphaMCR (BRL) y "SURE" (Stratagene).

Las placas que se obtienen son evaluadas selectivamente inmonológicamente mediante procedimientos conocidos en la técnica. Maniatis, Id. En el ejemplo 6 que se presenta más adelante, se describe un procedimiento adecuado. La evaluación selectiva puede ser facilitada por el uso de un equipo de evaluación selectiva comercial, tal como el equipo de inmuno-evaluación selectiva Picoblue de Stratagene (La Jolla, CA) según el protocolo de Stratagene adjunto, que está disponible en Stratagene o en el historial de archivo de esta memoria.

Las placas que unen los antisueros específicos de la proteína de unión de transferrina se seleccionan de placas no reactivas y purificadas. Maniatis, Id. El ADN del fago purificado se aísla mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen, por ejemplo, precipitación en polietilenglicol, lisis de fagos y cromatografía de intercambio iónico, que pueden ser facilitados por el uso de un equipo fabricado por Qiagen (Studio City, CA).

El ADN obtenido se puede amplificar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento adecuado es el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Mullis et al. en la patente estadounidense n.º 4.683.195 y por Sambrook, Fritch y Maniatis (eds) en "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Es conveniente amplificar los clones de ADN en vectores lambda-gtll usando oligómeros específicos de lambda-gt11 disponibles en New England Biolabs.

Los clones amplificados son insertados en vectores adecuados y secuenciados según los procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento de secuenciación adecuado es el procedimiento de la terminación de cadenas didesoxi descrito por Sanger et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74, 5463-5467 (1977).

Se conocen vectores y polimerasas adecuados para la secuenciación. Un vector adecuado es el vector Bluescript de Stratagene. Una polimerasa adecuada es la Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH).

En el procedimiento de inmuno-evaluación selectiva descrito anteriormente, habitualmente, es necesario evaluar selectivamente un gran número de placas para identificar los fragmentos con antisueros específicos de la proteína de unión de transferrina. Por ejemplo, en un experimento, se obtuvieron aproximadamente 500.000 placas de fragmentos de un cromosoma gonocócico (FA19). Se identificaron dos placas usando los antisueros frente a la proteína de unión de transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae. Se aisló un clon que tenía un tamaño de inserto de 323 pb (pUNCH401) de una placa, mientras que se aisló un clon con un tamaño de inserto de 483 pb (pUNCH402) de otra placa. Estas secuencias de ADN representan fragmentos de solapamiento del cromosoma FA19. La secuencia consenso de los dos fragmentos, incluyendo el solapamiento, se muestra como la figura 1. Los nucleótidos 75 a 323 representan las secuencias de solapamiento. Los nucleótidos 1 a 74 representan la secuencia de no solapamiento del fragmento de 323 pb. Los nucleótidos 324 a 558 representan la secuencia de no solapamiento del fragmento de 483 pb. El único marco de lectura abierto va en el sentido opuesto al mostrado en la figura 1 (i.e., del nucleótido 558 al nucleótido 1). Véase el ejemplo 6a.

Los fragmentos descritos anteriormente, o los sub-fragmentos de los mismos, se pueden usar como sondas para obtener más fragmentos del gen de la proteína de unión de transferrina. Mediante el uso de esta técnica, un fragmento ClaI de 8 kb y un fragmento HincII de 3,2 kb del cromosoma FA19 se hibrida con los fragmentos de 323 y 483 pb. La figura 2B, se muestra un mapa de restricción del fragmento HincII de 3,2 kb. Los fragmentos obtenidos se pueden secuenciar. Véanse los ejemplos 7 y 8, y la figura 2A.

Mediante las prolongaciones adecuadas de los fragmentos, se secuencia todo el gen. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mediante mutagénesis insercional. Véase el ejemplo 9. Se usan procedimientos similares para determinar la secuencia de la proteína de unión de transferrina meningocócica de 95 kD. Véanse los ejemplos 10 y 11, y las figuras 4-6.

Proteínas recombinantes

Las proteínas de la presente revelación se pueden producir por medio de tecnología de ADN recombinante. Los procedimientos adecuados para producir proteínas recombinantes a partir de ADN aislado se describen en Maniatis et al., Id.

En síntesis, se puede expresar ADN que codifica las proteínas de unión de transferrina de la presente revelación, así como ADN que codifica sus análogos funcionales, usando una amplia variedad de células huésped y una amplia variedad de vectores. El huésped puede ser procariota o eucariota. El ADN se puede obtener de fuentes naturales y, opcionalmente, puede estar modificado. El ADN también puede ser sintetizado por completo o en parte.

El vector puede comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Algunos vectores procariotas adecuados incluyen plásmidos de E. coli, tales como colE1, pCR1, pHR322, cMB9 y RP4. Los vectores procariotas también incluyen derivados de ADN de fago, tales como del fago M13 y de otros fagos de ADN monocatenarios filamentosos.

Hay disponibles vectores útiles en levadura. Un ejemplo adecuado es el plásmido 2u.

También se conocen vectores adecuados para su uso en células de mamífero. Tales vectores incluyen derivados conocidos del adenovirus SV-40, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores derivados de la combinación de plásmidos y ADN de fago.

Se conocen en la técnica otros vectores de expresión eucariotas (p. ej., P. J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981); R. J. Kaufmann y P. A. Sharp, "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); R. J. Kaufmann y P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); S. I. Scahill et al, "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80, 4654-4659 (1983); G. Urlaub y L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77, 4216-4220, (1980).

Los huéspedes de expresión útiles incluyen huéspedes procariotas y eucariotas conocidos. Algunos huéspedes procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como SG-936 de E. coli, HB 101 de E. coli, W3110 de E. coli, X1776 de E. coli, X2282 de E. coli, DHI de E. coli y MRCI de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis y Streptomyces. Las células eucariotas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, células de insecto y de animales, tales como las células COS y las células CHO, células humanas y células vegetales en cultivo tisular.

Los vectores de expresión útiles en la presente revelación contienen al menos una secuencia de control de la expresión que está unida operativamente con el gen de la proteína de unión de transferrina o un fragmento del mismo. Se inserta la secuencia control en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones promotoras y operadoras principales del fago Lambda, la región control de la cubierta proteínica fd, los promotores glicolíticos de levadura, p. ej., el promotor de la 3-fofoglicerato cinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levadura, p. ej., Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de la levadura y los promotores derivados de poliomas, adenovirus, retrovirus y virus de simio, p. ej., los promotores tempranos y tardíos de SV40 y otras secuencias conocidas por su control de la expresión de genes de células procariotas o eucariotas, y sus virus o combinaciones de los mismos.

Las proteínas de 100 kD o 95 kD se pueden purificar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas de unión de transferrina o partes de las mismas pueden ser expresadas en forma de una proteína de fusión con una pareja de fusión apropiada. La pareja de fusión preferiblemente facilita la purificación y la identificación. Algunas parejas de fusión útiles incluyen la beta-galactosidasa (Gray, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79, 6598 (1982)); trpE (Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)) y la proteína A (Uhlen et al., Gene 23 369 (1983)). Por ejemplo, las proteínas de fusión que contienen beta-galactosidasa se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad usando una columna de anticuerpos anti-beta-galactosidasa (Ullman, Gene. 29, 27-31 (1984)).

Opcionalmente, el ADN que codifica la proteína de fusión es diseñado genéticamente, tal que la proteína de fusión contiene un sitio escindible entre la proteína de unión de transferrina y la pareja de fusión. Ambos sitios escindibles química y enzimáticamente son conocidos en la técnica. Los ejemplos adecuados de sitios que son escindibles enzimáticamente incluyen sitios que son reconocidos específicamente y escindidos por la colagenasa (Keil et al., FEBS Letters 56, 292-296 (1975)); la enterocinasa (Hopp et al., Biotechnology 6, 1204-1210 (1988)); el factor Xa (Nagai et al., Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987)); la trombina (Eaton et al., Biochemistry 25, 505 (1986)); y la glutationa S-transferasa (Johnson, Nature 338, 585 (1989); y Van Etten et al., Cell 58, 669 (1989)). La colagenasa escinde entre la prolina y X en la secuencia Pro-X-Gly-Pro, en la que X es un aminoácido neutro. La enterocinasa escinde detrás de la lisina en la secuencia Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. El factor Xa escinde detrás de la arginina en la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg. La trombina escinde entre la arginina y la glicina en la secuencia Arg-Gly-Ser-Pro.

También se conocen agentes de escisión química específicos. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno escinde en los residuos de metionina de las proteínas.

Alternativamente, las proteínas receptoras de la transferrina de 100 kD y 95 kD pueden ser sobre-expresadas detrás de un promotor inducible y purificadas mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos específicos de los receptores de la transferrina. Como otra alternativa, la proteína sobre-expresada se puede purificar usando una combinación de cromatografía de intercambio iónico, de exclusión por tamaños y de interacción hidrófoba usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos y otros procedimientos adecuados están descritos por Marston, "The Purification of Eukaryotic Polypeptides Expressed in E. coli en DNA Cloning", D. M. Glover, Ed., Volumen III, IRL Press Ltd., Inglaterra, 1987.

Utilidad Proteínas como sondas

La proteína de 100 kD de N. gonorrhoeae, la proteína de 95 kD de N. meningitidis y sus análogos funcionales son útiles en la detección y la prevención de enfermedades provocadas por la infección gonocócica y meningocócica.

Por ejemplo, se pueden marcar las proteínas y usarlas como sondas en inmunoanálisis estándar para detectar anticuerpos frente a las proteínas en muestras, tales como en los sueros u otros fluidos corporales de pacientes que estén siendo tratados de gonorrea, choque séptico o meningitis. En general, se incuba una proteína según la reivindicación A, o un derivado funcional de tal proteína, con la muestra sospechosa de contener anticuerpos frente a la proteína. La proteína se marca bien antes, durante o después de la incubación. La detección de la proteína marcada unida con un anticuerpo en la muestra indica la presencia del anticuerpo. El anticuerpo está preferiblemente inmovilizado.

Los análisis adecuados para detectar anticuerpos con proteínas son conocidos en la técnica, tales como el protocolo de ELISA estándar descrito por R. H. Kenneth, "Enzyme-Linked Antibody Assay with Cells Attached to Polyvinyl Chloride Plates" en Kenneth et al., Monoclonal Antibodies, Plenum Press, N.Y., página 376 (1981). En síntesis, se revisten las placas con una cantidad suficiente de una proteína antigénica para unir cantidades detectables del anticuerpo. Tras incubar las placas con el polipéptido, éstas se bloquean con un agente bloqueador adecuado, tal como, por ejemplo, suero de cabra normal al 10%. Se añade la muestra, tal como sueros de pacientes, y se valora para determinar el punto final. Se añaden simultáneamente controles positivos y negativos para cuantificar la cantidad de anticuerpo relevante presente en las muestras desconocidas. Tras la incubación, se sondan las muestras con Ig anti-humana de cabra conjugada con una enzima adecuada. La presencia de anticuerpos anti-proteína en la muestra se indica mediante la presencia de la enzima.

Para su uso en inmunoanálisis, la proteína se puede marcar con átomos y moléculas radiactivas o no radiactivas. Tales marcadores y procedimientos para conjugarlos con proteínas son conocidos en la técnica.

Algunos ejemplos de marcadores radiactivos útiles incluyen ^{32}P, ^{125}I, ^{131}I y ^{3}H. El uso de marcadores radiactivos se ha descrito en los documentos U.K. 2.034.323; U.S.4.358.535 y U.S.4.302.204.

Algunos ejemplos de marcadores no radiactivos incluyen enzimas, cromóforos, átomos y moléculas detectables mediante microscopía electrónica e iones metálicos detectables mediante sus propiedades magnéticas.

Algunos marcadores enzimáticos útiles incluyen enzimas que provocan un cambio detectable en un sustrato. Algunas enzimas útiles y sus sustratos incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (pirogalol y o-fenilendiamina), beta-galactosidasa (beta-D-galactopiranósido de fluoresceína) y fosfatasa alcalina (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/azul de nitro-tetrazolio). El uso de marcadores enzimáticos ha sido descrito en los documentos U.K. 2.019.404; EP 63.879 y mediante Rotman, Proc. Natl. Acad Sci., 47, 1981-1991 (1961).

Los cromóforos útiles incluyen, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes, así como colorantes. Algunos cromóforos específicos útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, umbeliferona y luminol.

Tales marcadores pueden ser conjugados con la sonda mediante procedimientos que son conocidos en la técnica. Los marcadores pueden estar unidos directamente a través de un grupo funcional de la sonda. La sonda bien contiene o se puede hacer que contenga tal grupo funcional. Algunos ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, amino, carboxilo, sulfidrilo, maleimida, isocianato e isotiocianato.

También es posible conjugar el marcador con la sonda por medio de un ligando unido con la sonda mediante un procedimiento descrito anteriormente y un receptor para ese ligando unido con el marcador. Cualquiera de las combinaciones de ligando-receptor conocidas es adecuada. Se prefiere la combinación de biotina-avidina.

Para su uso en inmunoanálisis, las proteínas pueden ser la proteína de 100 kD entera o la de 95 kD entera, o pueden ser análogos funcionales de las mismas. Los análogos funcionales de estas proteínas incluyen fragmentos y mutaciones por sustitución, adición y eliminación que no destruyen la capacidad de las proteínas para unirse con sus anticuerpos. Siempre y cuando las proteínas sean capaces de detectar anticuerpos específicos de las proteínas de unión de transferrina, éstas son útiles en la presente invención.

Proteínas en vacunas

Como las proteínas de unión de transferrina de la presente revelación son importantes para una función vital de N. gonorrhoeae y N. meningitidis, y se encuentran en las membranas exteriores, estas proteínas son útiles en vacunas para la prevención de enfermedades provocadas por infecciones por Neisseria, tales como la gonorrea, el choque séptico y la meningitis. A tal efecto, es necesario que la proteína produzca anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes son anticuerpos que inhiben significativamente el crecimiento de y/o matan a las células bacterianas in vitro o in vivo. El crecimiento de las bacterias es inhibido significativamente in vivo si la inhibición es suficiente para prevenir o reducir los síntomas de la enfermedad de un mamífero infectado con la enfermedad.

Las vacunas que comprenden la proteína de 100 kD o la de 95 kD, o análogos funcionales, como antígeno se pueden usar para inhibir el crecimiento de, o matar a, los gonococos o los meningococos según la invención. Los análogos funcionales de las proteínas de 100 kD y de 95 kD a tal efecto incluyen fragmentos y mutaciones por sustitución, adición o eliminación que producen anticuerpos neutralizantes en un huésped mamífero, tal como un huésped humano.

La presente invención incluye además composiciones de vacuna para inmunizar a mamíferos, incluyendo seres humanos, contra la infección por N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Las vacunas comprenden el receptor de la transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae y/o el receptor de la transferrina de 95 kD de N. meningitidis, y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las proteínas de 100 kD y de 95 kD se pueden ser sustituidas por análogos funcionales según lo descrito anteriormente.

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La vacuna comprende el antígeno en un vehículo adecuado. La vacuna puede incluir adyuvantes, tales como péptidos de muramilo y linfocinas, tales como interferón, interleucina-1 e interleucina-6. El antígeno puede ser adsorbido sobre partículas adecuadas, tales como partículas de óxido de aluminio, o estar encapsulado en liposomas, según lo conocido en la técnica.

El antígeno también puede ser administrado en una cepa no virulenta de Samonella, tal como S. typhimurium. Tales vacunas se pueden preparar mediante la clonación de ADN que comprende la parte activa de la proteína de unión de transferrina en la cepa de Salmonella, según lo conocido en la técnica; véase, por ejemplo, Curtiss et al., Vaccine 6, 155-160 (1988) y Galan et al., Gene 94, 29-35 (1990).

La invención incluye además procedimientos de inmunización de huéspedes mamíferos, incluyendo seres humanos, con las composiciones de vacuna descritas anteriormente. La vacuna se puede administrar a un mamífero mediante procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.

La composición de vacuna puede contener la proteína de 100 kD entera o la proteína de 95 kD entera, pero contiene preferiblemente un fragmento no tóxico de la proteína de 100 kD o de la de 95 kD. Se sabe, por ejemplo, cómo producir fragmentos de proteínas antigénicas y cómo determinar aquellos fragmentos que contienen el sitio antigénico. La longitud del fragmento no es relevante, siempre y cuando el fragmento sea antigénico y no sea tóxico. Por lo tanto, el fragmento debería contener suficientes residuos de aminoácido como para definir el epítopo. Los procedimientos para aislar e identificar fragmentos antigénicos a partir de polipéptidos antigénicos conocidos están descritos por Salfeld et al. en J. Virol. 63, 798-808 (1989) y por Isola et al. en J. Virol. 63, 2325-2334 (1989).

Si el fragmento define el epítopo, pero es demasiado corto para ser antigénico, puede ser conjugado con una molécula transportadora. Algunas moléculas transportadoras adecuadas incluyen la hemocianina de lapa californiana y la albúmina de suero bovino. La conjugación se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica. Uno de tales procedimientos consiste en combinar un residuo de cisteína del fragmento con un residuo de cisteína de la molécula transportadora.

Anticuerpos para tratamiento

Además, la revelación incluye el aislamiento de anticuerpos neutralizantes que reconocen y se unen específicamente con las proteínas y los análogos funcionales de la invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Las definiciones de los anticuerpos neutralizantes y los análogos funcionales usados en combinación con las vacunas (véase la descripción anterior) se aplican también a la producción de anticuerpos neutralizantes.

Los anticuerpos policlonales son aislados de mamíferos a los que se ha inoculado la proteína o el análogo funcional según los procedimientos conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen el procedimiento inmunológico de Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497 (1975) y el procedimiento de ADN recombinante descrito por Huse et al. en Science 246, 1275-1281 (1989).

La revelación también incluye procedimientos para el tratamiento de mamíferos, incluyendo seres humanos, que padecen enfermedades provocadas por N. gonorrhoeae o N. meningitidis mediante la administración a tales mamíferos de una cantidad eficaz de los anticuerpos neutralizantes de la invención. La administración puede ser mediante los mismos procedimientos descritos anteriormente para la administración de vacunas.

Anticuerpos como sondas

Las proteínas de unión de transferrina y los análogos funcionales de la revelación también se pueden usar para producir anticuerpos para usarlos como sondas para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis en una muestra. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. A tal efecto, los análogos funcionales incluyen fragmentos y mutaciones por sustitución, adición y eliminación de la proteína de 100 kD o de la proteína de 95 kD, siempre y cuando los análogos también produzcan anticuerpos capaces de detectar la presencia de la proteína de 100 kD o de la de 95 kD. La muestra puede ser, por ejemplo, un fluido corporal de un mamífero, incluyendo un ser humano, sospechoso de estar infectado con N. gonorrhoeae o N. meningitidis.

Los análisis para detectar la presencia de proteínas con anticuerpos han sido descritos previamente, y siguen formatos conocidos, tales como los formatos de transferencia y de ELISA estándar. Estos formatos están basados normalmente en incubar un anticuerpo para una muestra sospechosa de contener la proteína de 100 kD o la de 95 kD, y detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo y la proteína. El anticuerpo se marca bien antes, durante o después de la etapa de incubación. La proteína se inmoviliza preferiblemente antes de la detección. La inmovilización se puede realizar uniendo directamente la proteína con una superficie sólida, tal como un pocillo de microvaloración, o uniendo la proteína con anticuerpos inmovilizados.

Cuando se usan como sondas, los anticuerpos son marcados normalmente mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los mismo marcadores útiles para las proteínas (véase descripción anterior) también son útiles para los anticuerpos. Han sido descritos procedimientos para marcar anticuerpos, por ejemplo, por Hunter y Greenwood en Nature 144, 945 (1962) y por David et al. en Biochemistry 13, 1014-1021 (1974). Se han descrito otros procedimientos para marcar anticuerpos en las patentes estadounidenses n.º 3.940.475 y 3.645.090.

Moléculas de ácido nucleico como sondas

Se pueden usar moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de 100 kD, la proteína de 95 kD o fragmentos de la proteína de 100 kD o de la de 95 kD que tengan secuencias únicas para detectar la presencia de N. gonorrhoeae o N. meningitidis. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser ARN o ADN.

Los procedimientos para determinar si una sonda de molécula de ácido nucleico reconoce una molécula de ácido nucleico específica en una muestra son conocidos en la técnica. Generalmente, se prepara una sonda marcada que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico sospechosa de estar en una muestra. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico diana es inmovilizada. La presencia de sonda hibridada con la molécula de ácido nucleico diana indica la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra. Hay ejemplos de procedimientos adecuados descritos pir Dallas et al. en "The Characterization of an Escherichia Coli Plasmid Determinant that Encodes for the Production of a Heat-labile Enterotoxin", en K. N. Timmis y A. Puehler, eds, Plasmids of Medical, Environmental, and Commercial Importance, Elsevier/North-Holland Publishing Co., Amsterdam, páginas 113-122 (1975); Grunstein y Hogness en Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 72, 3961-3965 (1975); Palva et al. en la patente estadounidense n.º 4.731.325, que está concedida a Orion-yhtyma, Espoo, Finlandia; Mullis et al. en la patente estadounidense n.º 4.683.195, que está concedida a Cetus Corporation, Emeryville, California; Schneider et al. en la patente estadounidense n.º 4.882.269, que está concedida a la Universidad de Princeton, y Segev en la solicitud vía PCT WO 90/01069. ImClone Systems Inc., New York City, tiene la licencia de tanto la patente de Schneider et al., como de la solicitud de Segev.

Las sondas descritas anteriormente están marcadas según los procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos para marcar sondas de oligonucleótido han sido descritos, por ejemplo, por Leary et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1983) 80:4045; Renz y Kurz, Nucl. Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson y Gumport, Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167; Smith et al, Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399; y Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267.

Ejemplos 1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Se pasa la cepa gonocócica FA19 de la solución madre una vez sobre base de agar de GC y luego se usa para inocular matraces que contienen 1 litro de caldo de GC hasta una densidad inicial de 20 UK (unidades de Klett). Se desarrolla el cultivo con CO_{2} al 5% a 37ºC, con una agitación vigorosa hasta alcanzar una densidad de 40 UK, momento en el que se añade el quelante desferal hasta una concentración final de 50 uM. Se recogen las células 4 horas después de la adición.

Se prepara la cepa meningocócica FAM20 del mismo modo que la cepa gonocócica FA19, a excepción del uso de CDM tratado con Chelex en lugar de la base de GC y desferal.

2a. Purificación por afinidad de la proteína de unión de transferrina gonocócica

Los procedimientos usados para la preparación de membranas, y el aislamiento y la purificación de la proteína de unión de transferrina gonocócica son similares al de Schryvers y Morris Infect. and Immun. 56, 1144-1149 (1988) para la preparación de la proteína de unión de lactoferrina meningocócica. Se introducen las siguientes modificaciones del procedimiento de Schryvers y Morris. Se mezclan 625 ug de la transferrina biotinilada (preparada mediante el procedimiento de Schryvers usando Biotina-S-S-NHS de Pierce como reactivo de biotinilación) con 25 mg de proteína de membrana total de la cepa gonocócica FA19 en 25 ml de NaCl 100 mM/Tris 50 mM, pH 8,0. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora con una agitación suave. Se nodulizan las membranas a 17.000 x g durante 10 minutos. Se vuelven a suspender los nódulos en 25 ml de NaCl 100 mM/Tris 50 mM, pH 8,0, siguiendo con la adición de NA_{2}EDTA hasta una concentración final de 10 mM y N-lauroil-sarcosina hasta una concentración final del 0,75%. Se disuelven las membranas durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Se añaden 2,5 ml de estreptavidina-agarosa (Sigma) y se permite la unión durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifuga la resina a 3.000 x g durante 5 minutos, se retira el sobrenadante y se lava la resina dos veces en NaCl 1M/Tris 50 mM, pH 8,0 con EDTA 5 mM y N-lauroil-sarcosina al 0,5%, y luego dos veces en NaCl 1M/Tris 50 mM, pH 8,0 sin adiciones. Se eluye la proteína de la matriz con N-lauroil-sarcosina al 0,45% y beta-mercaptoetanol 125 mM en NaCl 1M/Tris 50 mM, pH 8,0.

2b. Purificación por afinidad de la proteína de unión de transferrina meningocócica

Se repite el procedimiento del ejemplo 2a, a excepción de que la cepa meningocócica FAM20 sustituye a la cepa gonocócica FA19.

3a. Aislamiento de la proteína de unión de transferrina gonocócica

Se concentra el eluato de la preparación por afinidad (ejemplo 2a) usando concentradores Amicon (corte a 30.000 MW). Se disuelve la preparación de proteína concentrada resultante en glicerol al 20%; SDS al 4%; Tris 130 mM, pH 8,0; 10 ug/ml de azul de bromofenol, y se separa sobre un gel de poliacrilamida-SDS al 7,5% según el procedimiento de Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970). Se tiñe el gel con azul brillante de Coomassie para visualizar las proteínas. Se resuelven dos especies proteicas como bandas simples mediante este procedimiento. La transferrina tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kD. La proteína de unión de transferrina tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kD. Se separa, se liofiliza y se macera la banda de la proteína de 100 kD.

3b. Aislamiento de la proteína de unión de transferrina meningocócica

Se repite el procedimiento del ejemplo 3A, a excepción de que el eluato del ejemplo 2b sustituye al eluato del ejemplo 2a.

4. Antisueros frente a la proteína de unión de transferrina

Se vuelven a suspender por separado los polvos finos resultantes de los ejemplos 3a y 3b en solución salina, se mezclan con el mismo volumen de adyuvante de Freund (completo para la primera inyección; incompleto para las inyecciones posteriores) y se inyectan en conejos hembra blancos de Nueva Inglaterra. Las inyecciones se aplican cada dos semanas. Es posible detectar el anticuerpo frente a la proteína de 100 kD dos semanas después de la tercera inyección mediante transferencia Western frente a proteína de unión de transferrina purificada.

5a. Banco de expresión en Lambda-gt11 de ADN gonocócico

Se aísla ADN cromosómico de la cepa gonocócica FA19 según Seifert et al., J. Bacteriol. 172, 40-46 (1990) y se somete a un tratamiento de ultrasonidos mediante procedimientos estándar (Maniatis et al., 1982) para producir un fragmento con un tamaño medio de 500 pb. Se añaden ligadores EcoRI y se unen los fragmentos resultantes en ADN de Lambda-gt11 digerido por EcoRI. El ADN unido se empaqueta usando un equipo fabricado por Promega.

5b. Banco de expresión en Lambda-gt11 de ADN meningocócico

Se aísla ADN cromosómico de la cepa meningocócica FAM20 según Seifert et al., J. Bacteriol., 172, 40-46 (1990) y se digiere con la endonucleasa de restricción HincII. Se añaden ligadores EcoR1, y se digiere la molécula de ADN resultante con EcoR1 y se une en Lambda-Zap digerido por EcoR1 (Stratagene). El ADN unido se empaqueta usando un equipo fabricado por Promega.

6a. Inmuno-evaluación selectiva del banco de expresión

Se evalúan selectivamente aproximadamente 500.000 placas obtenidas del banco de los ejemplos 5a y 5b mediante el procedimiento de inmuno-evaluación selectiva descrito en el protocolo de Stratagene que acompaña al equipo de inmuno-evaluación selectiva Picoblue. En síntesis, se absorben los antisueros primarios con lisado de E. coli/fago disponible en Stratagene (La Jolla, CA) según su protocolo. Se emplacan aproximadamente 5 x 10^{4} u.f.p. (unidades formadoras de placa) en la cepa huésped de E. coli Y1090. Se colocan sobre las placas filtros de nitrocelulosa empapados en isopropil-tiogalactosidasa (IPTG) 10 mM tras 3-4 horas de incubación a 42ºC. Entonces se incuban las placas durante una noche tras lo que se retiran los filtros, se lavan en solución salina tamponada de Tris y Tween-20 al 0,05% (TBST) y se bloquean durante una hora en solución salina tamponada de Tris y albúmina de suero bovino al 5%. Entonces se incuban los filtros con una dilución 1:200 del anticuerpo primario absorbido durante una hora. Tras la incubación con el anticuerpo primario, se lavan los filtros exhaustivamente con TBST y luego se incuban con el anticuerpo secundario (dilución 1:3.000 de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina, adquirido en Bio-Rad) durante una hora. Entonces se lavan los filtros exhaustivamente con TBST y finalmente se incuban en 0,3 mg/ml de azul de nitro-tetrazolio (NBT); 0,15 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato (BCIP); Tris 100 mM, pH 9,8; NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM hasta que se desarrolla suficiente color.

Se recogen y se purifican del resto de placas no reactivas las placas que unen los antisueros específicos de la proteína de unión de transferrina. Se aísla el ADN de fago purificado y se purifica usando cromatografía de intercambio aniónico (columna adquirida en Qiagen, Studio City, CA).

6b. Evaluación selectiva del banco de expresión son sondas de ADN

Las placas obtenidas del banco de los ejemplos 5a y 5b también son evaluadas selectivamente usando sondas de ADN marcadas. Se marca no radiactivamente el oligómero TfBP1, 2, 3 ó 5 usando digoxigenin-11-dUTP y un equipo de terminación del ADN, ambos fabricados por Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB). Las secuencias de los oligómeros son:

TFBP1: GAG CCC GCC AAT GCG CCG CT

TFBP2: AGC GGC GCA TTG GCG GGC TC

TFBP3: GGG GCG CAT CGG CGG TGC GG

TFBP5: AAA ACA GTT GGA TAC CAT AC

Los protocolos para el marcaje y la detección del ADN están disponibles en BMB con el equipo de marcaje y detección de ADN no radiactivo Genius. Alternativamente, se marcan radiactivamente los mismos oligómeros con alfa-^{32}p-dCTP y el equipo de terminación del ADN de BMB usando técnicas estándar (Maniatis et al., 1982).

7. Amplificación y secuenciación de ADN

El ADN obtenido en el ejemplo 5 ó 6 es amplificado mediante la técnica de PCR (Sambrook et al., (eds), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición. Cold Spring Harbor Press (1989)) usando oligómeros específicos de Lambda-gt11. Se clonan los insertos así amplificados en vectores Bluescript (Stratagene) usando técnicas estándar (Maniatis et al., 1982) y se secuencian mediante el procedimiento de terminación de cadenas didesoxi de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 74, 5463-5467 (1977) usando Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH).

8. Otra secuencia del gen de la proteína de unión de transferrina de 100 kD de la cepa gonocócica FA19

Usando los procedimientos generales de los ejemplos 6 y 7, se identifica un fragmento Sau3AI cromosómico de aproximadamente 1,0 kpb. Este fragmento se clona en el sitio BamHI del vector pHSS6-GCU (Elkins et al., v. Bacteriol, 173, 3911-3913 (1991). (La designación GCU indica que una secuencia de 10 pb, conocida como la secuencia de absorción gonocócica, está incluida en el vector). Se sabe que esta secuencia media la absorción específica de una especie del ADN en el gonococo (Elkins et al., Id.). La cepa huésped para esta clonación fue HB101. El clon resultante se conoce como pUNCH 403.

Se secuencia el inserto de pUNCH 403 en su totalidad usando moldes bicatenarios preparados según el procedimiento descrito por Kraft et al. en Biotechniques 6, 554-556 (1988). La secuencia es determina por medio del procedimiento didesoxi de Sanger usando Sequenase^{TM} (United States Biochemicals). En la figura 2A, se muestra la secuencia del fragmento Sau3AI de pUNCH 403. La secuencia de la figura 2A de los nucleótidos 1-558 representa el solapamiento entre pUNCH 401 y pUNCH 402 (figura 1) y pUNCH 403 (figura 2A). El marco de lectura abierto está desde el nucleótido 659 al nucleótido 1. De este modo, el codón que comienza en el nucleótido 69 (de la cadena complementaria a la mostrada en la figura 2A), que codificaría un residuo de metionina, es el extremo 5' del gen.

9. Pruebas sobre la estructura y la función de la proteína de unión de transferrina de 100 kD

Para determinar el efecto de la desactivación del gen de la proteína de unión de transferrina de 100 kD, se aislaron inserciones de transposones a lo largo del inserto de pUNCH403 según el protocolo descrito en Seifert et al. en "Genetic Engineering, Principals and Methods", Setlow, J.K. y Holleander, A., eds., Plenum Press, N.Y., Vol. 8, páginas 123-134. Se insertan transposones mTn3CAT mediante mutagénesis lanzadera en E. coli y luego se seleccionan transformantes resistentes al cloranfenicol de FA19 para crear mutantes. Los transposones mTn3CAT son denominados por Seifert et al. como m-Tn3(Cm). Entonces se clasifican los mutantes en cuanto a su capacidad para crecer sobre transferrina como su única fuente de hierro y su capacidad para expresar la proteína de 100 kD según lo analizado mediante transferencia Western. Los resultados de ese experimento se muestran en la figura 3. Los transposones de las posiciones designadas con una "I", 44, 37 y 24 destruyen tanto la expresión de la proteína de 100 kD como su capacidad para crecer sobre transferrina. Sin embargo, el transposón de la posición "A" permitió algún crecimiento sobre transferrina y la expresión de alguna proteína de unión de transferrina de longitud nativa detectable. Estos resultados confirman la hipótesis de que el gen estructural que codifica la proteína de 100 kD comienza en la posición 659 (véase la figura 2A), pues la inserción secuencia arriba de este punto permite la expresión de la proteína de longitud de tipo natural. El hecho de que la expresión no se detecte a niveles de tipo natural en el mutante "A" indica que la región secuencia arriba del codón de inicio putativo es importante para la regulación del gen que codifica la proteína de 100 kD.

10. Construcción y evaluación selectiva del banco genómico meningocócico

Se clonó el gen de la proteína de unión de transferrina meningocócica de 95 kD en tres etapas. En la primera etapa, con el uso de antisuero gonocócico, se identificó un fragmento Hincii/EcoRI de 1,3 kb de un banco de Lambda Zap II (véase la figura 4). En la figura 5, se proporciona la secuencia de este fragmento. El codón de inicio putativo está indicado por una flecha que también muestra el sentido de la transcripción. El sitio de unión al ribosoma anterior está subrayado. El fragmento de 1,3 kb contiene aproximadamente 500 bp del gen estructural de la proteína de 95 kD. Este clon se hibridó con un solo fragmento ClaI de 5 kb en el cromosoma de la cepa meningocócica FAM20. Se construyó un banco de ClaI de 5 kb parciales en el vector pHSS6-GCU (según lo descrito en el ejemplo 8), y se clonó un fragmento ClaI de 5 kb usando el fragmento de 1,3 kb como sonda. El mapeado de la restricción parcial de este fragmento ClaI sugirió que este fragmento no codifica el gen estructural completo. Por lo tanto, en la etapa 3, se usó un fragmento cla1/EcoRI de 3,5 kb (generado a partir del fragmento ClaI de 5 kb obtenido en la etapa 2) como sonda, dando como resultado la clonación del fragmento HincII adyacente del banco de Lambda Zap II (Stratagene). Este fragmento HincII es de un tamaño de aproximadamente 3,5 kb y, probablemente, codifica el resto del gen estructural de la proteína de 95 kD. Este fragmento HincII de 3,5 kb es secuenciado mediante la generación de eliminaciones unidireccionales usando exonucleasas III y VII según lo descrito por E. Ozkaynak y S.D. Putney en Biotechniques 5, 770 (1987).

11. Pruebas sobre la estructura y la función de la proteína de unión de transferrina de 95 kD

Se usó el fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb para mutagenizar el gen de la proteína de 95 kD meningocócica. Se empleó el mismo procedimiento de mutagénesis lanzadera descrito en el ejemplo 9, a excepción de que en lugar de los transposones mTn3CAT, se introdujeron transposones mTn3erm en el clon de 1,3 kb. Los transposones mTn3erm se crearon mediante la modificación de los transposones mTn3CAT descritos en el ejemplo 9 para conferirles resistencia a la eritromicina. Esta modificación permite la selección de transformantes meningocócicos resistentes a la eritromicina. Estos transformantes fueron evaluados selectivamente en cuanto a su capacidad para crecer sobre placas de transferrina según lo descrito en el ejemplo 9. Los resultados de estos experimentos de mutagénesis se muestran detalladamente en la figura 6. Mientras que las inserciones 1 y 2 de mTn3erm inhibieron completamente la expresión de la proteína de 95 kD y la capacidad de los clones para crecer sobre placas de transferrina, las inserciones 3 y 4 de mTn3erm presentaron algún crecimiento sobre transferrina y mostraron alguna cantidad de proteína de 95 kD en transferencias Western. Basándose en los datos de secuenciación y de mutagénesis, parece que las inserciones 1 y 2 de mTn3erm están en el gen estructural y en la región promotora, respectivamente, mientras que las inserciones 3 y 4 parecen estar en una región secuencia arriba que podría estar implicada en la regulación positiva de la expresión.

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Referencias complementarias

La invención según lo reivindicado es posible según la memoria y las referencias y los materiales iniciales de fácil acceso. No obstante, las siguientes líneas celulares fueron depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo Bethesda, Maryland, el 16 de julio de 1990 para facilitar la elaboración y el uso de la invención:

Línea celular meningocócica FAM18 (número de acceso de la ATCC: 55071)

Línea celular meningocócica FAM20 (número de acceso de la ATCC: 55072)

Línea celular gonocócica FA19 (número de acceso de la ATCC: 55073)

Además, los siguientes folletos que contienen los protocolos y la información útiles están disponibles en el historial de archivo de esta memoria: "Predigested Lambda Zap/Eco RI Cloning Kit Instruction Manual", Stratagene, La Jolla, California (20 de noviembre de 1987);

"Gigapack Plus" (para el empaquetamiento de fagos Lambda recombinantes), Stratagene, La Jolla, California (25 de abril de 1988);

"picoBlue Immunoscreening Kit Instruction Manual," Stratagene, La Jolla, California (19 de mayo de 1989); y

"Genius Nonradioactive DNA Labeling and Detection Kit," Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana (enero, 1989).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de unión de transferrina de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: ImClone Systems Incorporated

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(B)

CALLE: 180 Varick Street

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(C)

CIUDAD: Nueva York

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(D)

ESTADO: Nueva York

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 10014

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(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 91918802.9

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de febrero de 1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Feit, Irving N.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.601

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: SPA-1-PT: EUROPE

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 212 -645 -1405

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(B)

TELEFAX: 212 -645 -2054

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 558 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENAMIENTO: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 1:

1

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 918 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENAMIENTO: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 2:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1192 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 3:

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3

4

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> ImClone Systems Incorporated

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Proteínas de unión de transferrina de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis

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<130> EP088991I - 01938/GRI

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 572.187

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 23-08-1991

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatenIN 3.0

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<210> 1

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<211> 558

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<212> ADN

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<213> Gonococo

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia:

\hskip1cm

Cepa parcial del gen de la proteína de 100 kD de la cepa gonocócica FA19 obtenida de los insertos pUNCH401 y pUNCH402

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<400> 1

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5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 918

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<212> ADN

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<213> Gonococo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia:

\hskip1cm

Secuencia del fragmento génico de la proteína de unión de transferrina de 100 kD de un inserto pUNCH403.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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6

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1192

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<212> ADN

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<213> Gonococo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia:

\hskip1cm

Secuencia del fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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7

Claims (6)

1. Una composición de vacuna frente a la infección causada por Neisseria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria gonorrhoeae purificado que comprende un polipéptido de 100 kD de la cepa de Neisseria gonorrhoeae FA19, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por un ácido nucleico complementario al polinucleótido mostrado en la Fig 2a.

2. Una composición de vacuna frente a la infección causada por Neisseria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria meningitidis purificado que comprende un polipéptido de 95 kD de la cepa de Neisseria meningitidis FAM20, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por el polinucleótido mostrado en la Fig 5.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 2, composición que comprende además una cantidad eficaz de un polipéptido regulado por el hierro de Neisseria gonorrhoeae purificado que comprende un polipéptido regulado por el hierro de 100 kD de la cepa de Neisseria gonorrhoeae FA19, o fragmentos que producen anticuerpos neutralizantes, codificado por un ácido nucleico complementario al polinucleótido mostrado en la fig. 2a.

4. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, composición que comprende además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

5. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el polipéptido purificado es un polipéptido recombinante purificado.

6. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el polipéptido purificado es capaz de producir anticuerpos neutralizantes en un huésped mamífero, anticuerpos que inhiben significativamente el crecimiento de y/o matan a Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis.