ES2210228T3 - Proteinas de union a transferrina de neisseria gonorrhoeae y neisseria meningitidis. - Google Patents
Proteinas de union a transferrina de neisseria gonorrhoeae y neisseria meningitidis.Info
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Abstract
LAS PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERIOR REGULADAS POR EL HIERRO QUE SE HAN ENCONTRADO EN LA "NISSERIA GONORRHOEAE" Y "NEISSERIA MENINGITIDIS" SON IMPORTANTES EN LA FUNCION RECEPTORA DE LA TRANSFERRINA. LAS PROTEINAS, QUE SON AISLABLES POR MEDIO DE UNA COLUMNA DE AFINIDAD DE LA TRANSFERRINA, SE UNEN ESPECIFICAMENTE A UN ANTISERUM QUE SE OPONE A LA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERIOR REGULADA POR EL HIERRO QUE TIENE UN PESO MOLECULAR DE APROXIMADAMENTE 100 KD Y QUE SE HA ENCONTRADO EN LA "NEISSERIA GONORRHOEAE".
Description
Proteínas de unión a una transferrina de
Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meninigitidis.
Esta solicitud está dirigida a una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína regulada por hierro
encontrada en las membranas externas de Neisseria. La
especificación está dirigida además a vectores que contienen dichas
secuencias de ADN y a células huésped que codifican tales
vectores.
N. gonorrhoeae y N. meningitidis
son dos patógenos del género Neisseria que son genéticamente
similares, pero patógenamente diferentes. El hierro es un nutriente
esencial para el crecimiento de N. gonorrhoeae y N.
meningitidis, igual que lo es para muchas bacterias. A
diferencia de la mayoría de las demás bacterias gram negativas,
N. gonorrhoeae y N. meningitidis no producen ni
secretan pequeños compuestos solubles quelantes de hierro
denominados sideróforos. Estas otras bacterias gram negativas
tienen receptores capaces de captar el complejo
hierro-sideróforo.
En su lugar, se cree que N. gonorrhoeae y
N. meningitidis poseen proteínas de membrana que se unen a
las glicoproteínas de unión a hierro lactoferrina y transferrina,
las cuales están presentes en las secreciones exocrinas humanas y
en el suero humano, respectivamente. Se cree que N.
gonorrhoeae y N. meningitidis captan hierro en huéspedes
humanos a través de la unión de lactoferrina y transferrina a estas
proteínas de membrana que se unen a lactoferrina y transferrina,
esto es, a través de receptores.
Se cree que la proteína que se une a lactoferrina
de N. meningitidis es una proteína de la membrana externa de
105 kD, regulada por hierro; ver Schryvers y Morris, Infect.
Immun. 56, 1144-1149 (1988). Se ha descrito
que la proteína que se une a transferrina de una cepa de N.
meningitidis es una proteína de la membrana externa regulada por
hierro de 71 kD, aunque se ha descrito que otras cepas tienen
proteínas de unión a transferrina con pesos moleculares de 75
kD-88 kD, 85 kD y 95 kD; ver Schryvers y Morris,
Mol. Microbiol. 2, 281-288 (1988). Estos
autores reconocen que los resultados de los diferentes intentos
para identificar la proteína de unión a transferrina de N.
meningitidis no son consistentes unos con otros. De hecho, se
mostró que las proteínas de 85 kD y 95 kD no eran necesarias para la
función del receptor de transferrina en N. meningitidis; ver
Dyer y col., Microbial Pathogenesis 3,
351-363 (1987).
La capacidad de N. gonorrhoeae para
asimilar el hierro ha sido también de interés. En una
investigación, un ensayo de unión de manchas que implicaba la
utilización de membranas totales gonocócicas derivadas de células
cultivadas bajo condiciones deficientes en hierro, sugería la
presencia de receptores separados para lactoferrina y transferrina.
No se determinó el peso molecular ni otras propiedades de las
proteínas de unión. Ver Lee y Schryvers, Mol. Microbiol. 2,
827-829 (1988). Por tanto, no se ha establecido
previamente la identidad de las proteínas de unión en N.
gonorrhoeae.
Las enfermedades causadas por la infección
gonocócica y meningocócica son generalizadas y a menudo graves. Se
necesitan métodos mejorados para prevenir, detectar y tratar dichas
enfermedades, tales como gonorrea, meningitis y choque séptico.
El crecimiento de N. gonorrhoeae y N.
meningitidis en humanos puede ser inhibido reduciendo la
capacidad de estas células para captar hierro. Podría conseguirse
una reducción de la capacidad de las células gonocócicas y
meningocócicas para asimilar hierro de la corriente sanguínea
mediante el bloqueo de la función de los receptores de transferrina.
El receptor de transferrina, por ejemplo, podría ser bloqueado
mediante anticuerpos contra el receptor. Para producir anticuerpos
contra el receptor, sin embargo, el receptor debe ser identificado
de manera que pueda ser producido mediante técnicas de ADN
recombinante.
Existe, por tanto, la necesidad de identificar,
aislar y purificar las proteínas de unión a transferrina de
N. gonorrhoeae y N. meningitidis con el fin de
poder proporcionar moléculas de ADN que codifiquen tales proteínas.
Es el objeto de la presente invención proporcionar tales moléculas
de ADN y secuencias de nucleótidos que codifiquen tales proteínas de
unión a transferrina.
Estos y otros objetivos, como serán obvios para
aquellas personas con experiencia habitual en la técnica, han sido
conseguidos según sigue.
Una proteína regulada por hierro encontrada en
las membranas externas de Neisseria gonorrhoeae o
Neisseria meningitidis es obtenida en una forma en la que la
proteína está sustancialmente libre de:
(a) detergente;
(b) papel de nitrocelulosa/acetato de celulosa;
y
(c) otras proteínas reguladas por hierro de
Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.
La proteína es aislable por medio de una columna
de afinidad de transferrina.
La proteína se une específicamente a antisuero
producido contra una proteína de la membrana externa regulada por
hierro que tiene un peso molecular de 100 kD aproximadamente
encontrada en Neisseria gonorrhoeae; y la proteína es
importante en la función del receptor de transferrina en
Neisseria cionarrhoeae o Neisseria meningitidis.
La invención proporciona ahora moléculas de ADN
que expresan la proteína de unión a transferrina y variaciones de
la misma en una célula huésped. En particular, la invención
proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
regulada por hierro encontrada en las membranas externas de
Neisseria, donde la secuencia de nucleótidos es seleccionada
de un grupo que consta de:
(a) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia
(b) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia
(c) una variante de las secuencias de nucleótidos
de (a) o (b) que codifica variaciones en las secuencias de
aminoácidos de las proteínas codificadas por las secuencias de
nucleótidos de acuerdo con (a) o (b), donde dichas variaciones
ocurren naturalmente en cepas de N. gonorrhoeae y N.
meningitidis;
(d) un fragmento de las secuencias de nucleótidos
de (a) o (b) que codifica un fragmento antigénico y no tóxico de la
proteína regulada por hierro.
La Figura 1 muestra una secuencia de ADN parcial
del gen de la proteína de 100 kD de la cepa gonocócica FA19
obtenida de los insertos de pUNCH401 y pUNCH402; ver el Ejemplo 6a
y el Ejemplo 7.
La Figura 2A muestra la secuencia de un fragmento
del gen de la proteína de unión a transferrina de 100 kD en un
inserto de pUNCH403. Las letras mayúsculas indican la región de
solapamiento entre los clones pUNCH401 y pUNCH402 (Figura 1) y
pUNCH403. El codón de inicio propuesto para la proteína de unión a
transferrina gonocócica de 100 kD se encuentra en el nucleótido 659.
La dirección del marco de lectura abierto es opuesta a la mostrada
en la figura (esto es, desde el nucleótido 659 hasta el nucleótido
1). Ver el Ejemplo 8.
La Figura 3 muestra las posiciones de las
inserciones de transposones dentro del fragmento de la proteína de
unión a transferrina gonocócica de 100 kD en pUNCH403 y los
fenotipos correspondientes de los mutantes respectivos. Los
transposones (mTn3CAT) fueron insertados mediante mutagénesis con
vectores lanzadera en E. coli. Los transformantes
resistentes a cloranfenicol fueron seleccionados en FA19 para crear
mutantes. Debajo de cada inserción de transposón (indicada por un
triángulo invertido), el crecimiento en transferrina humana 2,5
\muM (saturada al 25% con Fe) y la expresión de proteína según se
analizó mediante transferencia Western, están indicados por + o -.
El marco de lectura abierto, indicado por una flecha ondulante, se
lee de derecha a izquierda (la misma orientación que en la Figura
2A) y comienza con metionina, denominada M. Se encontró una
secuencia -10 típica (-10) pero no pudo identificarse ninguna
secuencia -35 canónica. El crecimiento del tipo salvaje y la
expresión de proteínas están mostrados a la derecha bajo el
encabezamiento "No Tn".
La Figura 4 muestra la estrategia para el clonaje
del gen de la proteína de unión a transferrina de 95 kD
meningocócica. El fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb fue clonado a
partir de una biblioteca de lambda Zap II utilizando una sonda de
anticuerpo. Los fragmentos de 5,0 kb y 3,5 kb mostrados en la etapa
2 fueron clonados a partir de una biblioteca parcial de ClaI en
pHSS6-GCU utilizando el fragmento de 1,3 kb como
sonda. El fragmento de HincII de 3,5 kb de la etapa 3 fue clonado a
partir de una biblioteca de lambda Zap II utilizando como sonda el
fragmento EcoRI/ClaI de 3,5 kb de la etapa 2. Los fragmentos de las
etapas 1-3 encajan entre sí según se muestra en el
fragmento titulado "Cromosoma de FAM20".
La Figura 5 muestra la secuencia del fragmento
HincII/EcoRI de 1,3 kb de la etapa 1 de la Figura 4. El sitio de
unión de ribosomas está subrayado. El codón de inicio ATG y la
dirección de la transcripción están indicados por la flecha. Ver el
Ejemplo 10.
La Figura 6 muestra los resultados de
experimentos de mutagénesis por transposones que involucran al
fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb de la etapa 1 de la Figura 4. Ver
el Ejemplo 11.
Las proteínas de unión a transferrina son
preparadas a partir de las membranas de N. gonorrhoeae o
N. meningitidis. Las membranas pueden ser preparadas
mediante métodos conocidos en la técnica. El método descrito por
Schryvers y Morris en Infect. Immun. 56,
1144-1149 (1988) es adecuado. Este método se
incorpora a la presente por referencia.
Las membranas son obtenidas de células cultivadas
en un medio deficiente en hierro. El medio de crecimiento puede ser
un medio de crecimiento estándar tal como el medio base GC (medio
base gonocócico) suministrado por Difco. Este medio puede hacerse
deficiente en hierro mediante la adición de agentes quelantes tales
como ácido
etilén-diamino-tetraacético (EDTA),
ácido
etilén-diamino-di-orto-hidroxifenilacético
(EDDA) o desferal (Ciba Pharmaceuticals). Alternativamente, el
medio de crecimiento puede ser un medio definido químicamente
descrito por Mickelsen y Sparling (Inf. Immun. 33,
555-564 (1981)), que se hace deficiente en hierro
mediante tratamiento con el agente quelante
Chelex-100 (Bio-Rad).
Cualquier cepa gonocócica y meningocócica que
tenga una función normal del receptor de transferrina es útil en la
presente invención. Tales cepas están disponibles generalmente a
partir de fuentes clínicas y de otras fuentes, tales como la
American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland y el Neisseria
Repository, NAMRU, University of California, Berkley.
Por ejemplo, las cepas gonocócicas FA19, que está
descrita en McKenna y col., Infect. Immun. 56,
785-791 (1988); FA248, que está descrita en Biswas
y col., J. Bacteriol. 151, 77-82 (1979); y
F62, que está descrita en West y Sparling, Infect. and Immun.
47, 388-394 (1985), constituyen fuentes
adecuadas de la proteína de unión a transferrina gonocócica. Las
cepas meningocócicas FAM18 y FAM20 (Dyer y col., Microbial
Pathogenesis 3, 351-363 (1987)) y B16B6,
grupo X y grupo W135 (Schryvers y Morris 56,
1144-1149 (1988)) son representativas de fuentes
de la proteína de unión a transferrina meningocócica.
Las proteínas que se unen a transferrina pueden
ser aisladas de otras proteínas de la membrana de N.
gonorrhoeae y N. meningitidis privadas de hierro con
transferrina inmovilizada utilizando procedimientos de afinidad
conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, Schryvers y Morris,
Infect. Immun. 56, 1144-1149 (1988). El
método de Schryvers y Morris se incorpora a la presente por
referencia. Se utiliza preferiblemente una variación de este
procedimiento, que se describe en el Ejemplo 2a, para separar las
proteínas de unión a transferrina de las proteínas de membrana
gonocócicas y meningocócicas.
Brevemente, las membranas de células gonocócicas
y meningocócicas privadas de hierro son aisladas y tratadas con
transferrina biotinilada. El complejo resultante es inmovilizado
mediante, por ejemplo, tratamiento del complejo con
avidina-agarosa o
estreptavidina-agarosa. La pella de la resina de
afinidad es lavada completamente y suspendida en tampón. El receptor
de transferrina es separado de la transferrina inmovilizada
mediante, por ejemplo, calentamiento. Las proteínas son separadas
mediante, por ejemplo, SDS-PAGE de acuerdo con el
método de Laemmli, Nature 227, 680-685
(1970). Una proteína con un peso molecular de 100 kD
aproximadamente, de aquí en adelante la proteína de 100 kD, es
separada de gonococos. Una proteína con un peso molecular de
95-95 kD aproximadamente, de aquí en adelante
proteína de 95 kD, es separada de meningococos.
Los pesos moleculares fueron determinados
separando las bandas individuales en SDS-PAGE y
comparando sus posiciones con las de estándares conocidos. El
método es reconocido por los expertos en la técnica como preciso
dentro de un rango del 3-5%. Los pesos moleculares
variaban ligeramente entre determinaciones. El peso molecular de la
proteína de gonococos era consistentemente y repetidamente mayor
que el de la proteína de meningococos, y variaba entre
97-100 kD.
La confirmación de que la proteína de unión a
transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae es importante para
la función del receptor de transferrina fue obtenida mediante la
preparación de cinco mutantes gonocócicos diferentes deficientes en
actividad del receptor de transferrina. Cada mutante fue analizado
para determinar la presencia de la proteína de unión a transferrina
de 100 kD mediante transferencia Western utilizando antisuero
policlonal producido en conejos. En cada mutante, la cantidad de
proteína de la membrana externa de 100 kD era mucho menor que la
observada para las cepas gonocócicas de tipo salvaje. Otras cepas
gonocócicas mutantes que tenían actividad normal del receptor de
transferrina tenían niveles de tipo salvaje de la proteína de 100 kD
en sus membranas.
Un experimento similar estableció que la proteína
de meningococos de 95 kD es importante para la función del receptor
de transferrina. El análisis de transferencia Western fue realizado
con antisueros producidos contra la proteína de 100 kD de N.
gonorrhoeae, que se encontró que reaccionaba de manera cruzada
con la proteína de 95 kD de N. meningitidis. Por
tanto, en N. gonorrhoeae y N. meningitidis, la falta
de actividad del receptor de transferrina se correlaciona con la
ausencia de las proteínas de 100 kD y 95 kD, respectivamente.
Por tanto, contrariamente a lo esperado sobre la
base de la técnica anterior, la proteína de la membrana externa de
100 kD regulada por hierro encontrada en N. gonorrhoeae es
el receptor de transferrina. La proteína de la membrana externa de
95 kD regulada por hierro encontrada en N. meningitidis
reacciona sorprendentemente de manera cruzada con antisuero
producido contra la proteína de 100 kD encontrada en N.
gonorrhoeae, y es el receptor de transferrina de N.
meningitidis. Antisueros producidos en mamíferos, tales como
conejos, ratones, cabras, monos y humanos, contra el receptor de
transferrina de N. gonorrhoeae son generalmente reactivos de
manera cruzada con el receptor de transferrina de N.
meningitidis y viceversa. Los anticuerpos monoclonales son
también generalmente reactivos de manera cruzada con las proteínas
de 95 kD y 100 kD.
Según se utiliza en la presente, el receptor de
transferrina de N. gonorrhoeae y N. meningitidis
incluye la proteína de la membrana externa de 100 kD regulada por
hierro de N. gonorrhoeae y la proteína de la membrana
externa de 95 kD regulada por hierro de N. meningitidis. Debe
comprenderse que estos receptores de transferrina constituyen una
clase de proteínas. La clase incluye, por ejemplo, variaciones de
la secuencia de aminoácidos que ocurren de manera natural en las
diferentes cepas de N. gonorrhoeae y N.
meningitidis.
Las proteínas incluyen además análogos
funcionales de los receptores de transferrina de 100 kD o de 95 kD
de N. gonorrhoeae o N. meningitidis, respectivamente.
Una proteína es considerada un análogo funcional de otra proteína
para una función específica, según se describe más adelante, si el
análogo es reactivo inmunológicamente de manera cruzada con, y tiene
la misma función que, la otra proteína y es un fragmento de la
proteína.
Las proteínas y los análogos funcionales pueden
ser proporcionados en forma esencialmente pura. Para los fines de
esta especificación, esencialmente pura significa que las proteínas
y los análogos funcionales están libres de cantidades, excepto de
cantidades traza, de otras proteínas reguladas por hierro de N.
gonorrhoeae y N. meningitidis, así como de los
materiales utilizados durante el proceso de purificación. Las demás
proteínas reguladas por hierro de N. gonorrhoeae y N.
meningitidis incluyen otras proteínas que se unen a
transferrina. Los materiales utilizados en el proceso de
purificación incluyen detergentes, agentes de unión por afinidad y
películas de separación. Los detergentes incluyen dodecil sulfato
de sodio y sarcosina. Los agentes de unión por afinidad incluyen
agarosa, avidina-agarosa,
estreptavidina-agarosa, biotina y proteínas
biotiniladas tales como transferrina biotinilada. Las películas de
separación incluyen papel de nitrocelulosa y nitrocelulosa/acetato
de celulosa.
Se conocen métodos para aislar ADN una vez que la
proteína ha sido aislada y purificada. Muchos de estos métodos
están descritos en Maniatis y col., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992).
Se prefiere el método de selección inmunológica.
Por ejemplo, el ADN cromosómico de una cepa
gonocócica o meningocócica capaz de utilizar el hierro unido a
transferrina, tales como las descritas anteriormente, es aislado y
cortado en fragmentos del tamaño adecuado mediante métodos
estándar. Los métodos de corte de ADN adecuados incluyen, por
ejemplo, sonicación y la utilización de endonucleasas de
restricción. Un tamaño medio de fragmentos adecuado es de
0,5-10 kpb aproximadamente.
Se añaden adaptadores a los fragmentos y los
fragmentos resultantes son ligados en un vector adecuado. El
adaptador corresponde a un sitio de restricción en el vector.
Adaptadores adecuados incluyen, por ejemplo, EcoRI, PstI y BamHI.
Un vector adecuado es lambda-gt11. El ADN ligado
puede ser empaquetado en kits comerciales, tal como un kit
fabricado por Promega.
Las proteínas de la biblioteca resultante son
clonadas y expresadas en un huésped adecuado, típicamente E.
coli. El clonaje se realiza preferiblemente en un huésped E.
coli portador de las mutaciones siguientes: mcrA, mcrB, mcrC,
mrr, hsdS, hsdR y hsdM. Algunas cepas adecuadas de E. coli
incluyen DH5alphaMCR (BRL) y "SURE" (Stratagene).
Las placas obtenidas son sometidas a selección
inmunológicamente mediante métodos conocidos en la técnica.
Maniatis, Id. Un método adecuado está descrito en el Ejemplo 6 más
adelante. La selección puede ser facilitada por la utilización de un
kit comercial de selección, tal como el Picoblue Immunological
Screening Kit de Stratagene (La Jolla, CA) de acuerdo con el
protocolo de Stratagene acompañante, que está disponible en
Stratagene, o a partir de la historia de registros de esta
especificación.
Las placas que se unen al antisuero específico de
la proteína de unión a transferrina son seleccionadas de las placas
no reactivas y purificadas. Maniatis, Id. El ADN del fago
purificado es aislado por métodos conocidos en la técnica. Los
métodos adecuados incluyen, por ejemplo, precipitación con
polietilén glicol, lisis del fago y cromatografía de intercambio
aniónico, los cuales pueden ser facilitados por la utilización de
un kit fabricado por Qiagen (Studio
\hbox{City, CA).}
El ADN obtenido puede ser amplificado por métodos
conocidos en la técnica. Un método adecuado es el método de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Mullis y
col. en la Patente de EE.UU. 4.683.195 y por Sambrook, Fritch y
Maniatis (eds) en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda
Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Es conveniente
amplificar los clones de ADN en los vectores
lambda-gt11 utilizando oligómeros específicos para
lambda-gt11 disponibles en New England Biolabs.
Los clones amplificados son insertados en
vectores adecuados y secuenciados de acuerdo con métodos conocidos
en la técnica. Un método de secuenciación adecuado es el método de
terminación de la cadena en didesoxi descrito por Sanger y col. en
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467
(1977).
Se conocen vectores y polimerasas adecuados para
la secuenciación. Un vector adecuado es el vector Bluescript de
Stratagene. Una polimerasa adecuada es la Sequenasa (United States
Biochemical Corp., Cleveland, OH).
En el método de inmunoselección anteriormente
descrito, es normalmente necesario someter a selección un gran
número de placas con el fin de identificar fragmentos con el
antisuero específico hacia la proteína de unión a transferrina. Por
ejemplo, en un experimento, se obtuvieron 500.000 placas
aproximadamente de fragmentos de un cromosoma gonocócico (FA19). Se
identificaron dos placas utilizando el antisuero contra la proteína
de unión a transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae. Un clon
que tenía un tamaño de inserto de 323 pb (pUNCH401) fue aislado de
una placa, mientras que un clon con un tamaño de inserto de 483 pb
(pUNCH402) fue aislado de la otra placa. Estas secuencias de ADN
representan fragmentos solapantes del cromosoma de FA19. La
secuencia consenso de los dos fragmentos, incluyendo el
solapamiento, está mostrada como Figura 1. Los nucleótidos 75 a 323
representan las secuencias solapantes. Los nucleótidos 1 a 74
representan la secuencia no solapante del fragmento de 323 pb. Los
nucleótidos 324 a 558 representan la secuencia no solapante del
fragmento de 483 pb. El único marco de lectura abierto se extiende
en la dirección opuesta a la mostrada en la Figura 1 (esto es, desde
el nucleótido 558 hasta el nucleótido 1). Ver el
\hbox{Ejemplo
6a.}
Los fragmentos descritos anteriormente, o
subfragmentos de los mismos, pueden ser utilizados como sondas para
obtener fragmentos adicionales del gen de la proteína de unión a
transferrina. Utilizando esta técnica, un fragmento de ClaI de 8 kb
y un fragmento de HincII de 3,2 kb en el cromosoma de FA19 hibridan
con los fragmentos de 323 y 483 pb. En la Figura 2B se muestra un
mapa de restricción del fragmento de HincII de 3,2 kb. Los
fragmentos obtenidos pueden ser secuenciados. Ver los Ejemplos 7 y 8
y la Figura 2A.
Mediante extensiones adecuadas de los fragmentos,
se secuencia el gen completo. Los límites de la secuencia
codificadora son determinados por métodos conocidos en el oficio,
tal como mediante mutagénesis por inserción. Ver el Ejemplo 9. Se
utilizan métodos similares para determinar la secuencia de la
proteína de unión a transferrina meningocócica de 95 kD. Ver los
Ejemplos 10 y 11 y las Figuras 4-6.
Las proteínas descritas anteriormente pueden ser
producidas por medio de la tecnología de ADN recombinante. Métodos
adecuados para producir proteínas recombinantes a partir de ADN
aislado están descritos en Maniatis y
\hbox{col.,
Id.}
Brevemente, moléculas de ADN conteniendo la
secuencia de nucleótidos de la presente invención que codifica las
proteínas de unión a transferrina anteriormente descritas, así como
variantes y fragmentos obtenibles de acuerdo con la presente
invención, pueden ser expresadas utilizando una amplia variedad de
células huésped y una amplia variedad de vectores. El huésped puede
ser procariótico o eucariótico. El ADN puede ser obtenido de fuentes
naturales y, opcionalmente, modificado. El ADN puede ser también
sintetizado totalmente o en parte.
El vector puede contener segmentos de secuencias
de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Algunos vectores
procarióticos adecuados incluyen plásmidos de E. coli tales
como colE1, pCR1, pBR322, pMB9 y
RP4. Los vectores procarióticos incluyen también derivados de
ADN de fago tales como M13 y de otros fagos de ADN de hebra
sencilla filamentosos.
Están disponibles vectores útiles en levaduras.
Un ejemplo adecuado es el plásmido 2u.
Se conocen también vectores adecuados para
utilización en células de mamífero. Tales vectores incluyen
derivados bien conocidos del adenovirus SV40, secuencias de ADN
derivadas de retrovirus y vectores derivados de la combinación de
ADN plasmídico y de fago.
Se conocen en la técnica vectores de expresión
eucarióticos adicionales (por ejemplo, P.J. Southern y P. Berg, J.
Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); S.
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Of Sequences Cotransfected With A Modular Dihydrofolate Reductase
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601-621 (1982); R.J. Kaufmann y P.A. Sharp, Mol.
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4654-4659 (1983); G. Urlaub y L.A. Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220
(1980)).
Los huéspedes de expresión útiles incluyen
huéspedes procarióticos y eucarióticos bien conocidos. Algunos
huéspedes procarióticos adecuados incluyen, por ejemplo, E.
coli, tal como E. coli SG-936, E.
coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E.
coli X2282, E. coli DHI y E. coli MRC1,
Pseudomonas, Bacillus, tal como Bacillus
subtilis y Streptomyces. Las células eucarióticas
adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, células de insecto,
células animales, tales como células COS y células CHO, células
humanas y células vegetales en cultivo de tejidos.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención contienen al menos una secuencia para el control de la
expresión que está unida operativamente al gen de la proteína de
unión a transferrina o a un fragmento del mismo. La secuencia
control es insertada en el vector con el fin de controlar y regular
la expresión de la secuencia de ADN clonada. Ejemplos de secuencias
para el control de la expresión útiles son el sistema lac, el
sistema trp, el sistema tac, el sistema trc,
regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, la
región de control de la proteína de revestimiento fd, los
promotores glicolíticos de levaduras, por ejemplo el promotor para
la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la
fosfatasa ácida de levaduras, por ejemplo Pho5, los promotores de
los factores de acoplamiento alfa de levaduras y promotores
derivados de polioma, adenovirus, retrovirus y virus de simio, por
ejemplo los promotores temprano y tardío de SV40, y otras
secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de
células procarióticas o eucarióticas y sus virus o combinaciones
de las mismas.
Las proteínas de 100 kD o 95 kD pueden ser
purificadas por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las
proteínas de unión a transferrina completas o porciones de las
mismas pueden ser expresadas en forma de una proteína de fusión con
una pareja de fusión apropiada. La pareja de fusión facilita
preferiblemente la purificación y la identificación. Algunas parejas
de fusión útiles incluyen beta-galactosidasa (Gray
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6598 (1982)); trpE
(Itakura y col., Science 198, 1056 (1977)) y proteína A
(Uhlen y col., Gene 23, 369 (1983)). Por ejemplo, proteínas
de fusión conteniendo beta-galactosidasa pueden ser
purificadas mediante cromatografía de afinidad utilizando una
columna de anticuerpos anti-beta -galactosidasa
(Ullman, Gene 29, 27-31 (1984)).
Opcionalmente, el ADN que codifica la proteína de
fusión es manipulado a fin de que la proteína de fusión contenga un
sitio de corte entre la proteína de unión a transferrina y la
pareja de fusión. Se conocen en la técnica sitios de corte químico
y enzimático. Ejemplos adecuados de sitios que pueden ser cortados
enzimáticamente incluyen sitios que son reconocidos y cortados
específicamente por colagenasa (Keil y col, FEBS Letters 56,
292-296 (1975)); enteroquinasa (Hopp y col.,
Biotechnology 6, 1204-1210 (1988)); factor
Xa (Nagai y col., Methods Enzymol. 153,
461-481 (1987)); trombina (Eaton y col.,
Biochemistry 25, 505 (1986)); y glutation
S-transferasa (Johnson, Nature 338, 585
(1989); y Van Etten y col., Cell 58, 669 (1989)). La
colagenasa corta entre prolina y X en la secuencia
Pro-X-Gly-Pro, en la
que X es un aminoácido neutro. La enteroquinasa corta después de
lisina en la secuencia
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys.
El factor Xa corta después de arginina en la secuencia
Ile-Glu-Gly-Arg. La
trombina corta entre arginina y glicina en la secuencia
Arg-Gly-Ser-Pro.
Se conocen también agentes de corte químico
específicos. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno corta en los
residuos de metionina de las proteínas.
Alternativamente, las proteínas del receptor de
transferrina de 100 kD y 95 kD pueden ser sobreexpresadas detrás de
un promotor inducible y purificadas mediante cromatografía de
afinidad utilizando anticuerpos específicos hacia el receptor de
transferrina. Como otra alternativa, la proteína sobreexpresada
puede ser purificada utilizando una combinación de cromatografía de
intercambio iónico, de exclusión de tamaños y de interacción
hidrofóbica utilizando métodos conocidos en la técnica. Estos y
otros métodos adecuados están descritos por Marston, "The
Purification of Eukaryotic Polypeptides Expressed in E.
coli" en DNA Cloning, D.M. Glover, Ed., Volumen III,
IRL Press Ltd., Inglaterra, 1987.
La proteína de 100 kD de N. gonorrhoeae,
la proteína de 95 kD de N. meningitidis y sus análogos
funcionales son útiles para detectar y prevenir enfermedades
causadas por infección gonocócica y meningocócica.
Por ejemplo, las proteínas pueden ser marcadas y
utilizadas como sondas en inmunoensayos estándar para detectar
anticuerpos contra las proteínas en muestras, tales como en el
suero o en otros fluidos corporales de pacientes que estén siendo
analizados para determinar gonorrea, choque séptico o meningitis.
En general, una proteína de acuerdo con la reivindicación A, o un
derivado funcional de tal proteína, se incuba con la muestra
sospechosa de contener anticuerpos hacia la proteína. La proteína
es marcada antes, durante o después de la incubación. La detección
de la proteína marcada unida a un anticuerpo de la muestra indica
la presencia del anticuerpo. El anticuerpo está preferiblemente
inmovilizado.
Se conocen en la técnica ensayos adecuados para
detectar anticuerpos con proteínas, tales como el protocolo de
ELISA estándar descrito por R.H Kenneth,
"Enzyme-Linked Antibody Assay with Cells Attached
to Polivinyl Chloride Plates" en Kenneth y col., Monoclonal
Antibodies, Plenum Press, N.Y., página 376 (1981). Brevemente,
las placas son revestidas con una cantidad de proteína antigénica
suficiente para que se una a cantidades detectables del anticuerpo.
Después de incubar las placas con el polipéptido, las placas son
bloqueadas con un agente bloqueante adecuado, tal como, por
ejemplo, suero de cabra normal al 10%. La muestra, tal como suero
de un paciente, es añadida y valorada para determinar el punto
final. Se añaden simultáneamente controles positivos y negativos
para cuantificar la cantidad de anticuerpo relevante presente en las
muestras desconocidas. Después de la incubación, las muestras son
sondadas con anti-Ig humana de cabra conjugado a un
enzima adecuado. La presencia de anticuerpos
anti-proteína en la muestra está indicada por la
presencia del enzima.
Para utilización en inmunoensayos, la proteína
puede ser marcada con átomos y moléculas radiactivos o no
radiactivos. Tales marcas y métodos para conjugar las mismas a
proteínas son conocidos en la técnica.
Algunos ejemplos de marcas radiactivas útiles
incluyen ^{32}P, ^{125}I, ^{131}I y ^{3}H. La utilización
de marcas radiactivas ha sido descrita en U.K. 2.034.323, U.S.
4.358.535 y U.S. 4.302.204.
Algunos ejemplos de marcas no radiactivas
incluyen enzimas, cromóforos, átomos y moléculas detectables
mediante microscopía electrónica e iones metálicos detectables por
sus propiedades magnéticas.
Algunas marcas enzimáticas útiles incluyen
enzimas que producen un cambio detectable en un sustrato. Algunos
enzimas útiles y sus sustratos incluyen, por ejemplo, peroxidasa de
rábano picante (pirogallol y o-fenilén -diamina),
beta-galactosidasa (fluoresceín
beta-D-galactopiranósido) y
fosfatasa alcalina (5-
bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato/nitro azul tetrazolio). La utilización de marcas
enzimáticas ha sido descrita en U.K. 2.019.404, EP 63.879 y por
Rotman, Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 1981-1991
(1961).
Cromóforos útiles incluyen, por ejemplo,
moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes,
así como colorantes. Algunos cromóforos específicos útiles en la
presente invención incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina,
rojo Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol.
Las marcas pueden ser conjugadas a la sonda
mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Las marcas
pueden ser unidas directamente a través de un grupo funcional en la
sonda. La sonda contiene, o puede hacerse que contenga, tal grupo
funcional. Algunos ejemplos de grupos funcionales adecuados
incluyen, por ejemplo, amino, carboxilo, sulfhidrilo, maleimida,
isocianato, isotiocianato.
La marca puede ser también conjugada a la sonda
por medio de un ligando unido a la sonda mediante un método
descrito anteriormente y un receptor para ese ligando unido a la
marca. Cualquiera de las combinaciones
ligando-receptor conocidas es adecuada. Se prefiere
la combinación biotina-avidina.
Para utilización en inmunoensayos, las proteínas
pueden ser la proteína de 100 kD o de 95 kD completa o pueden ser
análogos funcionales de las mismas. Los análogos funcionales de
estas proteínas incluyen fragmentos y mutaciones por sustitución,
adición y deleción que no destruyan la capacidad de las proteínas
para unirse a sus anticuerpos. Siempre que las proteínas sean
capaces de detectar anticuerpos específicos para las proteínas de
unión a transferrina, son útiles en la presente invención.
Como las proteínas de unión a transferrina de la
presente invención son importantes para una función vital de N.
gonorrhoeae y N. meningitidis y se encuentran en las
membranas externas, las proteínas recombinantes obtenibles de
acuerdo con la presente invención son útiles en vacunas para la
prevención de enfermedades causadas por infecciones de
Neisseria, tales como gonorrea, choque séptico y meningitis.
Para este fin, es necesario que la proteína produzca anticuerpos
neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes son anticuerpos que
inhiben significativamente el crecimiento de, y/o destruyen, las
células bacterianas in vitro o in vivo. El
crecimiento de la bacteria es inhibido significativamente in
vivo si la inhibición es suficiente para prevenir o reducir los
síntomas de la enfermedad de un mamífero infectado con la
enfermedad.
Pueden utilizarse vacunas que contengan la
proteína de 100 kD o de 95 kD o fragmentos de las mismas como
antígeno para inhibir el crecimiento de, o destruir, los gonococos
o los meningococos de acuerdo con la invención. Los fragmentos de
las proteínas de 100 kD y 95 kD para este fin son fragmentos que
producen anticuerpos neutralizantes en un huésped mamífero tal como
en un huésped humano. Las vacunas pueden contener el receptor de
transferrina de 100 kD de N. gonorrhoeae y/o el receptor de
transferrina de 95 kD de N. meningitidis y adyuvantes
farmacéuticamente aceptables.
La vacuna puede contener además el antígeno en un
vehículo adecuado. La vacuna puede incluir adyuvantes, tales como
muramil péptidos y linfoquinas, tales como interferón,
interleuquina-1 e interleuquina-6.
El antígeno puede estar absorbido sobre partículas adecuadas, tales
como partículas de óxido de aluminio, o encapsulado en liposomas,
según se conoce en la técnica.
El antígeno puede ser también proporcionado en
una cepa avirulenta de Salmonella, tal como S.
typhimurium. Tales vacunas pueden ser preparadas mediante el
clonaje de ADN que contenga la porción activa de la proteína de
unión a transferrina en la cepa de Salmonella, como es
conocido en la técnica; ver, por ejemplo, Curtiss y col., Vaccine
6, 155-160 (1988) y Galan y col., Gene
94, 29-35 (1990).
La vacuna puede ser utilizada para inmunizar
mamíferos huésped, incluyendo humanos. La vacuna puede ser
administrada a un mamífero por métodos conocidos en la técnica.
Tales métodos incluyen, por ejemplo, la administración intravenosa,
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
La composición de la vacuna puede contener la
proteína de 100 kD o la proteína de 95 kD completas, pero
preferiblemente contiene un fragmento no tóxico de la proteína de
100 kD o de la proteína de 95 kD. Es bien conocida, por ejemplo, la
producción de fragmentos de proteínas antigénicas y la determinación
de aquellos fragmentos que contienen el sitio antigénico. La
longitud del fragmento no es crítica, siempre que el fragmento sea
antigénico y no tóxico. Por tanto, el fragmento debe contener
residuos de aminoácidos suficientes para definir el epítopo.
Métodos para aislar e identificar fragmentos antigénicos a partir de
polipéptidos antigénicos conocidos están descritos por Salfeld y
col. en J. Virol. 63, 798-808 (1989) y por
Isola y col. en J. Virol. 63, 2325-2334
(1989).
Si el fragmento define el epítopo, pero es
demasiado corto para ser antigénico, puede ser conjugado a una
molécula transportadora. Algunas moléculas transportadoras
adecuadas incluyen hemocianina de la lapa ojo de cerradura y
seroalbúmina bovina. La conjugación puede ser llevada a cabo
mediante métodos conocidos en la técnica. Uno de tales métodos es
la combinación de un residuo de cisteína del fragmento con un
residuo de cisteína de la molécula transportadora.
La proteína regulada por hierro recombinante
obtenible de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada
para aislar anticuerpos neutralizantes que reconozcan y se unan
específicamente a las proteínas codificadas por las secuencias de
nucleótidos de la invención. Los anticuerpos pueden ser
policlonales o monoclonales. Las definiciones de anticuerpos
neutralizantes y de análogos funcionales utilizadas junto con
vacunas (ver anteriormente) son aplicables también a la producción
de anticuerpos neutralizantes.
Pueden aislarse anticuerpos policlonales de
mamíferos que hayan sido inoculados con la proteína o con un
análogo funcional de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por métodos
conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el método
inmunológico de Kohler y Milstein, Nature 256,
495-497 (1975) y el método de ADN recombinante
descrito por Huse y col. en Science 246,
1275-1281 (1989).
Las proteínas recombinantes de unión a
transferrina y los análogos funcionales obtenibles de acuerdo con
la invención pueden utilizarse también con el fin de producir
anticuerpos para ser empleados como sondas para detectar la
presencia de Neisseria gonorrhoeae o Neisseria
meningitidis en una muestra. Los anticuerpos pueden ser
policlonales o monoclonales. Para este fin, los análogos
funcionales incluyen fragmentos de la proteína de 100 kD o de la
proteína de 95 kD, siempre que los análogos produzcan también
anticuerpos capaces de detectar la presencia de las proteínas de
100 kD o de 95 kD en una muestra. La muestra puede ser, por
ejemplo, un fluido corporal de un mamífero, incluyendo un humano,
sospechoso de estar infectado con N. gonorrhoeae o N.
meningitidis.
Se han descrito previamente ensayos para detectar
la presencia de proteínas con anticuerpos, y siguen formatos
conocidos tales como los formatos estándar de transferencia y
ELISA. Estos formatos se basan normalmente en la incubación de un
anticuerpo con una muestra sospechosa de contener la proteína de 95
kD o de 100 kD y la detección de la presencia de un complejo entre
el anticuerpo y la proteína. El anticuerpo es marcado antes,
durante o después de la etapa de incubación. La proteína es
preferiblemente inmovilizada antes de la detección. La
inmovilización puede ser realizada uniendo directamente la proteína
a una superficie sólida, tal como un pocillo de microvaloración, o
bien uniendo la proteína a anticuerpos inmovilizados.
Cuando se utilizan como sondas, los anticuerpos
pueden ser marcados mediante métodos conocidos en la técnica. Las
mismas marcas útiles para proteínas (ver anteriormente) son también
útiles para anticuerpos. Métodos para el marcaje de anticuerpos han
sido descritos, por ejemplo, por Hunter y Greenwood en Nature
144, 945 (1962) y por David y col. en Biochemistry
13, 1014-1021 (1974). Métodos adicionales
para el marcaje de anticuerpos han sido descritos en las Patentes
de EE.UU. 3.940.475 y 3.645.090.
Pueden utilizarse moléculas de ácido nucleico que
codifiquen la proteína de 100 kD, la proteína de 95 kD o fragmentos
de las proteínas de 100 kD o de 95 kD que tengan secuencias únicas
para detectar la presencia de N. gonorrhoeae o N.
meningitidis. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de ARN
o de ADN.
Se conocen en la técnica métodos para determinar
si una molécula de ácido nucleico sonda reconoce una molécula de
ácido nucleico específica en una muestra. Generalmente, se prepara
una sonda marcada que es complementaria a una secuencia de ácido
nucleico sospechosa de estar presente en una muestra.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico diana está
inmovilizada. La presencia de la sonda hibridada a la molécula de
ácido nucleico diana indica la presencia de la molécula de ácido
nucleico en la muestra. Ejemplos de métodos adecuados están
descritos por Dallas y col. en "The Characterization of an
Escherichia coli Plasmid Determinant that Encodes for the
Production of a Heat-labile Enterotoxin" en K.N.
Timmis y A. Puehler, eds, Plasmids of Medical, Environmental,
and Commercial Importance,
Elsevier/North-Holland Publishing Co., Amsterdam,
páginas 113-122 (1975); Grunstein y Hogness en Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975);
Palva y col. en la Patente de EE.UU. 4.731.325, que está asignada
a Orion-yhtyma, Espoo, Finlandia; Mullis y col. en
la Patente de EE.UU. 4.683.195, que está asignada a Cetus
Corporation, Emeryville, California; Schneider y col. en la Patente
de EE.UU. 4.882.269, que esta asignada a Princeton University, y
Segev en la Solicitud de PCT WO 90/01069. La patente de Schneider y
col. y la solicitud de Segev están ambas concedidas a ImClone
Systems Inc., New York City.
Las sondas anteriormente descritas son marcadas
de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Métodos para el
marcaje de sondas oligonucleotídicas han sido descritos, por
ejemplo, por Leary y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)
80:4045; Renz y Kurz, Nucl. Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson y
Gumport, Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167; Smith y col., Nucl. Acids
Res. (1985) 13:2399; y Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. (1984)
138:267.
La cepa gonocócica FA19 es pasada desde la
solución madre congelada una vez sobre agar GCB y utilizada
posteriormente para inocular matraces conteniendo 1 litro de caldo
GCB hasta una densidad de partida de 20 UK (unidades Klett). El
cultivo se hace crecer con un 5% de CO_{2} a 37ºC con agitación
vigorosa hasta que alcanza una densidad de 40 UK, momento en el cual
se añade el quelante, desferal, a una concentración final de 50
\muM. Las células son recogidas 4 horas después de la
adición.
La cepa meningocócica FAM20 es preparada de la
misma manera que la cepa gonocócica FA19, excepto por la
utilización de CDM tratado con Chelex en lugar de GCB y
desferal.
Los métodos utilizados para la preparación de
membranas y el aislamiento y purificación de la proteína de unión a
transferrina gonocócica es similar al de Schryvers y Morris,
Infect. and Immun. 56, 1144-1149 (1988) para
la preparación de la proteína de unión a lactoferrina meningocócica.
Este método del artículo de Schryvers y Morris se incorpora a la
presente por referencia. Se introducen las modificaciones
siguientes del método de Schryvers y Morris. Se mezclan 625 \mug
de transferrina biotinilada (preparada mediante el método de
Schryvers utilizando como reactivo de biotinilación
Biotina-S-S-NHS de
Pierce) con 25 mg de proteína de membrana total procedente de la
cepa gonocócica FA19 en 25 ml de NaCl 100 mM/Tris 50 mM, pH 8,0. La
mezcla es incubada a temperatura ambiente durante 1 hora con
agitación suave. Las membranas son aglutinadas a 17.000 x g durante
10 minutos. Las pellas son resuspendidas en 25 ml de NaCl 100
mM/Tris 50 mM, pH 8,0, seguido por la adición de Na_{2}EDTA a una
concentración final de 10 mM y de
N-lauroil-sarcosina a una
concentración final del 0,75%. Las membranas son solubilizadas
durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Se añaden
2,5 ml de estreptavidina-agarosa (Sigma) y se deja
que se unan durante 1 hora a temperatura ambiente. La resina es
centrifugada a 3000 x g durante 5 minutos, se retira el
sobrenadante y se lava la resina dos veces en NaCl 1 M/Tris 50 mM,
pH 8,0, con EDTA 5 mM y
N-lauroil-sarcosina al 0,5% y
posteriormente dos veces en NaCl 1 M/Tris 50 mM, pH 8,0, sin
adiciones. La proteína es eluida de la matriz con
N-lauroil-sarcosina al 0,45% y
beta-mercaptoetanol 125 mM en NaCl 1 M/Tris 50 mM,
pH 8,0.
Se repite el procedimiento del Ejemplo 2a,
excepto en que la cepa FA19 gonocócica es sustituida por la cepa
FAM20 meningocócica.
El eluato de la preparación de afinidad (Ejemplo
2a) es concentrado utilizando concentradores Amicon (peso molecular
de corte 30.000). La preparación de proteína concentrada resultante
es solubilizada en glicerol 20%, SDS 4%, Tris 130 mM, pH 8,0, 10
\mug/ml de azul bromofenol y separada en un gel de SDS 7,5%
poliacrilamida de acuerdo con el método de Laemmli, Nature
227, 680-685 (1970). El gel es teñido con
Azul Brillante de Coomassie para visualizar las proteínas. Se
separan dos especies de proteína como bandas individuales mediante
este método. La transferrina tiene un peso molecular de 80 kD
aproximadamente. La proteína de unión a transferrina tiene un peso
molecular de 100 kD. La banda de la proteína de 100 kD es cortada,
liofilizada y macerada.
Se repite el procedimiento del Ejemplo 3a,
excepto en que se sustituye el eluato del Ejemplo 2a por el eluato
del Ejemplo 2b.
Los polvos finos resultantes de los Ejemplos 3a y
3b son resuspendidos separadamente en solución salina, mezclados
con un volumen igual de adyuvante de Freund (completo para la
primera inyección, incompleto para las inyecciones posteriores) e
inyectados en conejos New England White, hembra. Las inyecciones
están separadas dos semanas. Puede detectarse anticuerpo
anti-proteína de 100 kD dos semanas después de la
tercera inyección mediante transferencia Western frente a la
proteína de unión a transferrina purificada.
Se aísla el ADN cromosómico de la cepa FA19
gonocócica de acuerdo con Seifert y col., J. Bacteriol. 172,
40-46 (1990) y se sonica mediante procedimientos
estándar (Maniatis y col., 1982) para producir un tamaño medio de
fragmentos de 500 pb. Se añaden adaptadores de EcoRI y los
fragmentos resultantes se ligan al ADN de
lambda-gt11 digerido con EcoRI (Maniatis y col.,
1982). El ADN ligado es empaquetado utilizando un kit fabricado por
Promega.
Se aísla el ADN cromosómico de la cepa FAM20
meningocócica de acuerdo con Seifert y col., J. Bacteriol.
172, 40-46 (1990) y se digiere con la
endonucleasa de restricción HincII. Se añaden adaptadores de EcoRI y
la molécula de ADN resultante es digerida con EcoRI y ligada a
lambda-Zap (Stratagene) digerido con EcoRI. El ADN
ligado es empaquetado utilizando un kit fabricado por Promega.
Aproximadamente 500.000 placas obtenidas de la
biblioteca de los Ejemplos 5a y 5b son sometidas a selección
mediante el método de selección inmunológica descrito en el
protocolo de Stratagene que acompaña al kit Picoblue Immunological
Screening Kit. Brevemente, el antisuero primario es absorbido con
un lisado de E. coli/fago disponible en Stratagene (La Jolla,
CA) de acuerdo con su protocolo. Se siembran 5 x 10^{4} ufp
(unidades formadoras de placas) aproximadamente en la cepa huésped
Y1090 de E. coli. Se colocan sobre las placas filtros de
nitrocelulosa empapados en isopropiltiogalactósido (IPTG) 10 mM
después de 3-4 horas de incubación a 42ºC. Las
placas son luego incubadas durante una noche, después de lo cual se
retiran los filtros, se lavan en solución salina tamponada con Tris
y Tween-20 al 0,05% (TBST) y se bloquean durante
una hora en solución salina tamponada con Tris y seroalbúmina bovina
al 5%. Los filtros son incubados posteriormente con una dilución
1:200 del anticuerpo primario absorbido durante una hora. Después
de la incubación con el anticuerpo primario, los filtros son
lavados extensamente con TBST e incubados posteriormente con el
anticuerpo secundario (dilución 1:3000 de
anti-anticuerpo de conejo producido en cabra
conjugado a fosfatasa alcalina, adquirido a
Bio-Rad) durante una hora. Los filtros son luego
lavados extensamente con TSBS e incubados finalmente en 0,3 mg/ml de
nitroazul tetrazolio (NBT), 0,15 mg/ml de
5-bromo-4-cloro-3-indoil
fosfato (BCIP), Tris 100 mM pH 9,8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM,
hasta que se desarrolla color suficiente.
Las placas que se unen al antisuero específico
para la proteína de unión a transferrina son recogidas y
purificadas separándolas de las otras placas no reactivas. El ADN
del fago purificado es aislado y purificado utilizando
cromatografía de intercambio aniónico (columna adquirida a Qiagen,
Studio City, CA).
Las placas obtenidas de la biblioteca de los
Ejemplos 5a y 5b son también sometidas a selección utilizando
sondas de ADN marcadas. El oligómero TfBP1, 2, 3 ó 5 es marcado no
radiactivamente utilizando
digoxigenina-11-dUTP y un kit para
la producción de colas en el ADN, ambos fabricados por Boehringer
Mannheim Biochemicals (BMB). Las secuencias de los oligómeros
son:
El protocolo para el marcaje y detección del ADN
está disponible en BMB con el kit de marcaje y detección de ADN no
radiactivo Genius. Alternativamente, los mismos oligómeros son
marcados radiactivamente con
alfa-^{32}P-dCTP y con el kit para
la producción de colas en el ADN de BMB, utilizando técnicas
estándar (Maniatis y col., 1982).
El ADN obtenido en el Ejemplo 5 ó 6 es
amplificado mediante la técnica de PCR (Sambrook y col. (eds),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold
Spring Harbor Press (1989)) utilizando como amplímeros oligómeros
específicos de lambda-gt11. Los insertos así
amplificados son clonados en vectores Bluescript (Stratagene)
utilizando técnicas estándar (Maniatis y col., 1982) y secuenciados
mediante el método de terminación de la cadena en didesoxi de
Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-5467 (1977) utilizando Sequenasa (United States
Biochemical Corp., Cleveland, OH).
Utilizando los métodos generales de los Ejemplos
6 y 7, se identifica un fragmento cromosómico de Sau3AI de 1,0 kpb
aproximadamente. Este fragmento es clonado en el sitio de BamHI del
vector pHSS6-GCU (Elkins y col., v. Bacteriol.
173, 3911-3913 (1991)). (La denominación GCU
indica que está incluida en el vector una secuencia de 10 pb
conocida como secuencia de captación gonocócica). Se sabe que esta
secuencia media la captación de ADN específica de una especie en el
gonococo (Elkins y col., Id.). La cepa huésped para este clonaje
fue HB101. El clon resultante es conocido como pUNCH403.
El inserto en pUNCH403 es secuenciado en su
totalidad utilizando moldes de doble hebra preparados de acuerdo
con el método descrito por Kraft y col. en Biotechniques 6,
554-556 (1988). La secuencia es determinada por
medio del método didesoxi de Sanger utilizando Sequenasa™ (United
States Biochemicals). La secuencia del fragmento de Sau3AI en
pUNCH403 está mostrada en la Figura 2A. La secuencia de la Figura
2A de nucleótidos 1-558 representa el solapamiento
entre pUNCH401 y pUNCH402 (Figura 1) y pUNCH403 (Figura 2A). Existe
un marco de lectura abierto desde el nucleótido 659 hasta el
nucleótido 1. Por tanto, el codón que comienza en el nucleótido 69
(en la hebra complementaria a la mostrada en la Figura 2A) que
codificaría un residuo de metionina, es el extremo 5' del gen.
Para determinar el efecto de la inactivación del
gen de la proteína de unión a transferrina de 100 kD, se aíslan
inserciones de transposones a lo largo de la longitud del inserto
en pUNCH403 de acuerdo con el protocolo descrito por Seifert y col.
en Genetic Engineering, Principals and Methods, Setlow, J.K. and
Holleander, A., eds., Plenum Press, N.Y., Vol. 8, páginas
123-134. Transposones mTn3CAT son insertados
mediante mutagénesis con vectores lanzadera en E. coli y los
transformantes resistentes a cloranfenicol son seleccionados
posteriormente en FA19 para crear mutantes. Los transposones
mTn3CAT son referidos por Seifert y col. como
m-Tn3(Cm). Los mutantes son luego valorados
por su capacidad para crecer en transferrina como única fuente de
hierro y por su capacidad para expresar la proteína de 100 kD
analizada mediante transferencia Western. Los resultados de ese
experimento están mostrados en la Figura 3. Los transposones en las
posiciones denominadas "I", 44, 37 y 24 suprimen la expresión
de la proteína de 100 kD y su capacidad para crecer en
transferrina. El transposón en la posición "A", sin embargo,
permitía cierto crecimiento en transferrina y la expresión de
cierta cantidad de proteína de unión a transferrina de longitud
nativa detectable. Estos resultados confirman la hipótesis de que
el gen estructural que codifica la proteína de 100 kD comienza en
la posición 659 (ver la Figura 2A), ya que una inserción corriente
arriba de este punto permite la expresión de la proteína de longitud
de tipo salvaje. El hecho de que la expresión no se detecte a los
niveles del tipo salvaje en el mutante "A", indica que la
región corriente arriba del supuesto codón de inicio es importante
para la regulación del gen que codifica la proteína de 100 kD.
El gen de la proteína de unión a transferrina
meningocócica de 95 kD fue clonado en tres etapas. En la primera
etapa, utilizando antisuero gonocócico, se identificó un fragmento
HincII/EcoRI de 1,3 kb de una biblioteca de lambda Zap II (ver la
Figura 4). La secuencia de este fragmento se presenta en la Figura
5. El supuesto codón de inicio está indicado por una flecha, que
muestra también la dirección de la transcripción. El sitio de unión
de ribosomas precedente está subrayado. El fragmento de 1,3 kb
contiene 500 pb aproximadamente del gen estructural de la proteína
de 95 kD. Este clon hibridaba con un único fragmento de ClaI de 5
kb en el cromosoma de la cepa meningocócica FAM20. Se construyó una
biblioteca de ClaI de 5 kb parcial en el vector
pHSS6-GCU (según se describió en el Ejemplo 8), y se
clonó un fragmento de ClaI de 5 kb utilizando como sonda el
fragmento de 1,3 kb. El mapeo de restricción parcial de este
fragmento de ClaI sugería que este fragmento no codifica el gen
estructural completo. Por tanto, en la etapa 3 se utilizó como sonda
un fragmento ClaI/EcoRI de 3,5 kb (generado a partir del fragmento
de ClaI de 5 kb obtenido en la etapa 2), teniendo como resultado el
clonaje del fragmento de HincII adyacente de una biblioteca de
lambda Zap II (Stratagene). Este fragmento de HincII tiene 3,5 kb
de tamaño aproximadamente y, probablemente, codifica el resto del
gen estructural de la proteína de 95 kD. Este fragmento de HincII de
3,5 kb es secuenciado mediante la producción de las deleciones
unidireccionales utilizando las Exonucleasas III y VII según está
descrito por E. Ozkaynak y S.D Putney en Biotechniques 5,
770 (1987).
El fragmento HincII/EcoRI de 1,3 kb fue utilizado
para mutagenizar el gen de la proteína de 95 kD meningocócica. Se
empleó el mismo procedimiento de mutagénesis con vectores lanzadera
descrito en el Ejemplo 9 excepto en que, en lugar de transposones
mTn3CAT, se introdujeron transposones mTn3erm en el clon de 1,3 kb.
Los transposones mTn3erm fueron producidos modificando los
transposones mTn3CAT descritos en el Ejemplo 9 con el fin de
conferir resistencia a eritromicina. Esta modificación permite
seleccionar los transformantes meningocócicos resistentes a
eritromicina. Estos transformantes fueron seleccionados por su
capacidad para crecer en placas de transferrina según se describió
en el Ejemplo 9. Los resultados de estos experimentos de
mutagénesis están detallados en la Figura 6. Aunque las inserciones
1 y 2 de mTn3erm suprimían completamente la expresión de la proteína
de 95 kD y la capacidad de los clones para crecer en placas de
transferrina, las inserciones 3 y 4 de mTn3erm presentaban cierto
crecimiento en transferrina y mostraban cierta cantidad de proteína
de 95 kD en transferencias Western. Sobre la base de los datos de
secuenciación y mutagénesis, parece que las inserciones 1 y 2 de
mTn3erm están en el gen estructural y en la región promotora,
respectivamente, mientras que las inserciones 3 y 4 parecen estar en
una región corriente arriba que podría estar implicada en la
regulación positiva de la expresión.
La invención según está reivindicada se hace
posible de acuerdo con la especificación y con las referencias y
materiales de partida fácilmente disponibles. No obstante, las
líneas celulares siguientes han sido depositadas en la American
Type Culture Collection, Bethesda, Maryland, el 16 de Julio de 1990
con el fin de facilitar la realización y la utilización de la
invención:
Línea celular meningocócica FAM18 (Número de
Acceso de la ATCC 55071)
Línea celular meningocócica FAM20 (Número de
Acceso de la ATCC 55072)
Línea celular gonocócica FA19 (Número de Acceso
de la ATCC 55073)
Además, los folletos siguientes que contienen
protocolos e información útiles están disponibles en la historia de
archivos de esta especificación.
- "Predigested Lambda Zap/EcoRI Cloning Kit Instruction Manual", Stratagene, La Jolla, California (20 de Noviembre de 1987);
- "Gigapack Plus" (para empaquetar fago lambda recombinante), Stratagene, la Jolla, California (25 de Abril de 1988);
- "picoBlue Immunoscreening Kit, Instruction Manual", Stratagene, La Jolla, California (19 de Mayo de 1989); y
- "Genius Nonradioactive DNA Labeling and Detection Kit", Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana (Enero de 1989).
Claims (5)
1. Un método para producir una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína regulada por hierro
encontrada en las membranas externas de Neisseria mediante
la amplificación y aislamiento de dicha secuencia de nucleótidos y
la recuperación de dicha secuencia de nucleótidos de una manera
conocida per se, en el que la secuencia de nucleótidos es
seleccionada de un grupo que consta de:
- (a)
- la secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
- (c)
- una variante de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) que codifica variaciones en las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (a) o (b), donde dichas variaciones ocurren de manera natural en cepas de N. gonorrhoeae y N. meningitidis;
- (d)
- un fragmento de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) que codifica un fragmento antigénico y no tóxico de la proteína regulada por hierro.
2. Un método para producir un vector mediante la
inserción en un vector de expresión de una secuencia de nucleótidos
obtenida por un método de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el vector contiene además al menos una secuencia control
que está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos
obtenida mediante un método de acuerdo con la reivindicación
1.
4. Un método para producir una célula huésped
mediante la inserción en una célula huésped de un vector obtenido
por un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.
5. Un método para producir una proteína regulada
por hierro encontrada en las membranas externas de
Neisseria, en el que una célula huésped obtenida por un
método de acuerdo con la reivindicación 4 que contiene un vector
obtenido mediante un método de acuerdo con la reivindicación 3, es
cultivaba bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína
codificada por dicha secuencia de nucleótidos, y la purificación de
la proteína.
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