ES2199938T3 - Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria. - Google Patents
Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria.Info
- Publication number
- ES2199938T3 ES2199938T3 ES93401531T ES93401531T ES2199938T3 ES 2199938 T3 ES2199938 T3 ES 2199938T3 ES 93401531 T ES93401531 T ES 93401531T ES 93401531 T ES93401531 T ES 93401531T ES 2199938 T3 ES2199938 T3 ES 2199938T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- sequence
- amino acid
- dna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 96
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 title description 7
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 53
- 101150101515 tbpl2 gene Proteins 0.000 claims description 52
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 34
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 claims description 21
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 18
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 14
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 14
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 84
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 abstract 1
- 101000653510 Homo sapiens TATA box-binding protein-like 2 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 abstract 1
- 102100030631 TATA box-binding protein-like 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 101150043772 psmC3 gene Proteins 0.000 description 25
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 101100098934 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) tbp2 gene Proteins 0.000 description 9
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 101150020633 tbp-1 gene Proteins 0.000 description 9
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- LYILPUNCKACNGF-NAKRPEOUSA-N Ala-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)N LYILPUNCKACNGF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 101150080060 TBP2 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 4
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 4
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- NLDNNZKUSLAYFW-NHCYSSNCSA-N Asn-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NLDNNZKUSLAYFW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N Ile-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 3
- YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N Ile-Thr-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)O)N YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 3
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N Leu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N 0.000 description 3
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N Leu-Met-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- IPSDPDAOSAEWCN-RHYQMDGZSA-N Lys-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IPSDPDAOSAEWCN-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N Met-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- UFOWQBYMUILSRK-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UFOWQBYMUILSRK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- HUURTRNKPBHHKZ-JYJNAYRXSA-N Met-Phe-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HUURTRNKPBHHKZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N Thr-Gly-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 3
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- VGNLMPBYWWNQFS-ZEILLAHLSA-N Thr-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O VGNLMPBYWWNQFS-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 3
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N Arg-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100245206 Dictyostelium discoideum psmC4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100259997 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) tbpA gene Proteins 0.000 description 2
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OLWAOWXIADGIJG-AVGNSLFASA-N Met-Arg-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O OLWAOWXIADGIJG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PJWDQHNOJIBMRY-JYJNAYRXSA-N Met-Arg-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PJWDQHNOJIBMRY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- GMMLGMFBYCFCCX-KZVJFYERSA-N Met-Thr-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMMLGMFBYCFCCX-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 101710172869 Peroxidase N Proteins 0.000 description 2
- DFEVBOYEUQJGER-JURCDPSOSA-N Phe-Ala-Ile Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O DFEVBOYEUQJGER-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- PMDOQZFYGWZSTK-LSJOCFKGSA-N Val-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C PMDOQZFYGWZSTK-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150095556 tbpB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GJMNLCSOIHOLQZ-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O GJMNLCSOIHOLQZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N Ala-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313141 Caenorhabditis elegans tbp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 101150097746 araB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFQUWYZCAGRUJN-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminediacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCNCC(O)=O IFQUWYZCAGRUJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70582—CD71
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION TIENE POR OBJETO UN FRAGMENTO DE CODIFICANTE ADN PARA UNA PROTEINA CAPAZ DE SER RECONOCIDA MEDIANTE UN ANTISUERO ANTIRRECEPTOR DE LA TRANSFERRINA DEL TRONCO DE N. MENINGITIDIS IM2394 O IM169, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE LA CITADA PROTEINA MEDIANTE UNA VIA RECOMBINANTE. A TITULO DE EJEMPLOS, UN TAL FRAGMENTO DE ADN CODIGO PARA LA SUBUNIDAD TBP1 DEL TRONCO IM2394 O IM2169 O PARA LA SUBUNIDAD TBP2 DEL TRONCO IM2394 O IM2169.
Description
Fragmentos de ADN codificante de las subunidades
del receptor de la meningitis neisseria.
La presente invención tiene por objetivo los
fragmentos de DNA de Neisseria meningitidis que codifican
para las subunidades del receptor de la transferrina, así como un
procedimiento de fabricación de cada una de las subunidades
mediante tecnología del DNA recombinante.
En general, las meningitis son de origen viral, o
de origen bacteriano. Las bacterias principalmente responsables
son: N. meningitidis y Haemophilus influenzae,
implicadas respectivamente en aproximadamente el 40 y 50% de los
casos de meningitis bacteriana.
En Francia, se estiman alrededor de 600 a 800
casos anuales de meningitis debida a N. meningitidis. En los
Estados Unidos, el número de casos se eleva a aproximadamente 2500
a 3000 por año.
La especie N. meningitidis está
subdividida en grupos séricos según la naturaleza de los
polisacáridos capsulares. A pesar de que existe una docena de
grupos séricos, el 90% de los casos son atribuibles a 3 grupos
séricos: A, B y C.
Existen vacunas eficaces a base de polisacáridos
capsulares para prevenir las meningitis de los grupos séricos de
N. meningitidis A y C. Estos polisacáridos, para prevenir
las meningitis de los grupos séricos A y C de N.
meningitidis. Estos polisacáridos, tal cual, son poco o nada
inmunogénicos en los niños de menos de 2 años y no inducen memoria
inmunológica. Sin embargo, estos inconvenientes se pueden
sobrellevar conjugando estos polisacáridos a una proteína
portadora.
En cambio, el polisacárido del grupo B de N.
meningitidis es poco o nada inmunogénico en el hombre, bien si
está en la forma conjugada o no. En consecuencia, es más
recomendable la búsqueda de una vacuna para las meningitis
inducidas principalmente por N. meningitidis del grupo sérico
B que una vacuna a base de polisacáridos.
Con dicho fin, se han propuesto diferentes
proteínas de la membrana externa de N. meningitidis. Más
precisamente, se trata del receptor de membrana de la transferrina
humana.
De forma general, la mayor parte de bacterias
necesitan hierro para su crecimiento y para ello han desarrollado
sistemas específicos de adquisición de hierro. En relación con
N. meningitidis que es un patógeno estricto del hombre, el
hierro sólo se puede conseguir a partir de las proteínas humanas de
transporte del hierro, como la transferrina y la lactoferrina, ya
que la cantidad de hierro en forma libre es despreciable en el
hombre (del orden de 10^{-18} M), en todo caso es insuficiente
para permitir el crecimiento bacteriano.
Así, N. meningitidis posee un receptor de
la transferrina humana y un receptor de la lactoferrina humana que
le permiten fijar estas proteínas quelantes del hierro y de captar
a continuación el hierro necesario para su crecimiento.
El receptor de la transferrina de la cepa de
N. meningitidis B16B6 ha sido purificado por Schyvers y col.
(patente internacional WO 90/12519) a partir de un extracto de
membranas. Esta proteína purificada está constituida esencialmente
por 2 tipos de polipéptidos: un polipéptido de un alto peso
molecular aparente de 100 KD y un polipéptido de un bajo peso
molecular aparente de unos 70 KD, según se observó tras
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.
Para las necesidades de la presente solicitud de
patente, se ha designado al producto de la purificación obtenido
por Schryvers de denominación provisional, receptor de la
transferrina y a sus polipéptidos constituyentes, subunidades. Por
ello, en el texto en curso las subunidades de alto peso molecular y
de bajo peso molecular se denominan respectivamente Tbp1 y Tbp2.
Sin embargo, el procedimiento de purificación descrito por
Schryvers y col., no puede utilizarse para la producción a gran
escala del receptor de la transferrina. La preparación industrial
de este receptor en la forma purificada pasa necesariamente por una
etapa de producción con ayuda de un sistema de expresión
heteróloga.
Por dicho motivo, la invención se propone
proporcionar los fragmentos del DNA codificante de las subunidades
del receptor de la transferrina de N. meningitidis.
Por otra parte, gracias a los trabajos pioneros
de Schryvers y col., se ha descubierto la existencia de por lo
menos 2 tipos de cepas que difieren en la constitución de sus
receptores de transferrina respectivos. Ello se puso en evidencia
gracias al estudio de los extractos de membrana de varias decenas de
cepas de N. meningitidis de orígenes diversos. En primer
lugar, se sometieron estos extractos de membranas a una
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y luego
a una electro-transferencia en filtros de
nitrocelulosa. Y a continuación estos filtros de nitrocelulosa se
incubaron en:
a) presencia de un antisuero de conejo dirigido
contra el receptor de la transferrina purificado a partir de la
cepa N. meningitidis B16B6, denominada también IM2394;
b) presencia de una antisuero de conejo dirigido
contra el receptor de la transferrina purificado a partir de la
cepa de N. meningitidis IM2169; o
c) en presencia de la transferrina humana
conjugada con la peroxidasa.
Respecto a a) y b), las subunidades del receptor
de la transferrina se pusieron de manifiesto gracias a la adición
de un anticuerpo anti-inmunoglobulinas de conejo
conjugado a la peroxidasa y la adición posterior del sustrato de
esta enzima.
Las tablas I y II siguientes indican el perfil de
algunas cepas representativas, tal como aparece en el gel de
poliacrilamida al 7,5% después de una electroforesis en presencia
de SDS; las bandas se caracterizan por sus pesos moleculares
aparentes expresados en kilodaltons (KD):
| Cepas | |||
| Tabla I | 2394 (B:2a:P1.2:L2,3) | 2234 (Y; nd) | |
| 2228 (B:nd) | 2154 (C, nd) | 550 (C: 2a:) | |
| 2170 (B:2a:P1.2:L3) | 2448 (B; nd) | 179 (C: 2a: P1.2) | |
| Detección con el | 93 | 93 | 99 |
| antisuero anti- | |||
| receptor 2394 | 68 | 69 | 69 |
| Detección con el | |||
| antisuero anti- | 93 | 93 | 99 |
| receptor 2169 | |||
| Detección con la | |||
| transferrina- | 68 | 69 | 69 |
| peroxidasa | |||
| N.B.: entre paréntesis, se indican por orden cronológico el grupo sérico, el serotipo, el subtipo y el inmunotipo. |
| Cepas | |||||||||
| Tabla II | 2169 | 1000 | 1604 | 132 | 1001 | 876 | 1951 | 2449 | 867 |
| (B:9:P | (B:nd) | (B:nd) | (C:15: | (A:4:P | (B:19: | (A:nd) | (B:nd) | (B:2b: | |
| 1.9 | P1.16) | 1.9) | P1.6) | P1.2) | |||||
| Detección con el | |||||||||
| antisuero anti- | 96 | 98 | 98 | 98 | 98 | 96 | 94 | 94 | 93 |
| receptor 2394 | |||||||||
| Detección con el | 96 | 98 | 98 | 98 | 98 | 96 | 94 | 94 | 93 |
| antisuero anti- | |||||||||
| receptor 2169 | 87 | 85 | 83 | 81 | 79 | 88 | 87 | 85 | 85 |
| Detección con la | |||||||||
| transferrina- | 87 | 85 | 83 | 81 | 79 | 88 | 87 | 85 | 85 |
| peroxidasa | |||||||||
| N.B.: Entre paréntesis, se indican por orden cronológico el grupo sérico, el serotipo, el subtipo y el inmunotipo. |
Los resultados representados en las dos primeras
líneas de las tablas muestran que existen 2 tipos de cepas:
El primer tipo (Tabla I) corresponde a las cepas
que poseen un receptor, cuyas dos subunidades en las condiciones
experimentales utilizadas son reconocidas por el antisuero
anti-receptor IM2394, mientras que únicamente se
reconoce por el antisuero anti-receptor IM2169 la
subunidad de alto peso molecular.
El segundo tipo (Tabla II) corresponde a las
cepas que poseen un receptor, cuyas 2 subunidades en las
condiciones experimentales utilizadas son reconocidas por el
antisuero anti-receptor IM2169, mientras que
únicamente se reconoce por el antisuero
anti-receptor IM2394 la subunidad de alto peso
molecular.
\newpage
En consecuencia, existe una diversidad antigénica
a nivel de la subunidad de menor peso molecular. De todas formas,
esta diversidad está restringida ya que se resuelve en dos grandes
tipos, contrariamente a lo sugerido por Griffiths y col., FEMS
Microbiol. Lett. (1990) 69:31.
Según estas observaciones, se podía suponer que
una vacuna eficaz contra todas las infecciones de N.
meningitidis podría estar constituida de forma adecuada por la
subunidad de alto peso molecular, independientemente de la cepa de
origen del receptor, ya que esta subunidad es reconocida por los dos
tipos de antisueros. De todas formas, no parece ser éste el caso ya
que la subunidad de alto peso molecular no sería capaz de inducir
la producción de anticuerpo de tipo neutralizante. Solamente la
menor de las 2 subunidades sería capaz de cumplir esta función. Ya
que esta subunidad de menor peso molecular se caracteriza por una
variación antigénica significativa del primero al segundo tipo de
cepa, un único tipo de receptor de la transferrina no debería ser
suficiente para vacunar contra todas las infecciones de N.
meningitidis. En consecuencia, una vacuna deberá contener por
lo menos una subunidad de menor peso molecular de cada una de las
cepas IM2394 e IM2169 o de sus equivalentes respectivos y,
opcionalmente, la subunidad de alto peso molecular de por lo menos
una cepa de N. meningitidis.
Es por ello que la invención proporciona un
fragmento del DNA aislado codificante para un péptido, un
polipéptido o una proteína capaz de ser reconocida por un antisuero
anti-receptor de la cepa de N. meningitidis
IM2394 o IM2169.
Un tal fragmento de DNA puede comprender en
particular una secuencia nucleotídica codificante para una
secuencia de aminoácidos homóloga a la que se muestra:
- en el identificador de secuencia (SEC ID N° 1)
n° 1, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba
con el residuo glutamina en posición 579;
- en la SEC ID N° 3, que comienza con el residuo
ácido glutámico en posición 1 y acaba con el residuo fenilalanina
en posición 884;
- en la SEC ID N° 5, que comienza con el residuo
ácido glutámico en posición 1 y se acaba en el residuo fenilalanina
en posición 887; o
- en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo
cisteína en posición 1 y se acaba con el residuo glutamina en
posición 691.
- A título indicativo, se precisa que un
fragmento de DNA de acuerdo con la presente invención puede
comprender además una secuencia nucleotídica adicional codificante
para cualquier otra secuencia de aminoácidos; en donde las dos
secuencias nucleotídicas consideradas forman un marco abierto de
lectura que codifica una proteína híbrida o un precursor.
De acuerdo con la presente invención, se puede
seleccionar de forma conveniente un fragmento de DNA a partir
de:
i) Un primer fragmento de DNA aislado, con una
secuencia nucleotídica codificante para una proteína con una
secuencia aminoacídica homóloga a la secuencia que se muestra en la
SEC ID N° 1, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y
se acaba con el residuo glutamina en posición 579.
ii) Un segundo fragmento de DNA aislado de una
secuencia nucleotídica codificante para una proteína con una
secuencia aminoacídica homóloga a la mostrada en la SEC ID N° 3,
que comienza con el residuo ácido glutámico en posición 1 y se
acaba con el residuo fenilalanina en posición 884.
iii) Un tercer fragmento de DNA aislado a partir
de una secuencia nucleotídica codificante para una proteína con una
secuencia aminoacídica homóloga a la mostrada en la SEC ID N° 5,
que comienza con el residuo ácido glutámico en posición 1 y se
acaba con el residuo fenilalanina en posición 887.
iv) Un cuarto fragmento de DNA aislado con una
secuencia nucleotídica codificante para una proteína con una
secuencia aminoacídica homóloga a la mostrada en la SEC ID N° 7,
que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y se acaba con
el residuo glutamina en posición 691.
Se entiende por "secuencia aminoacídica
homóloga" una secuencia que presenta un grado de homología de
por lo menos el 75%, preferentemente de por lo menos el 80%, más
preferentemente de por lo menos el 90%, todavía más preferentemente
de por lo menos el 100%, con la secuencia aminoacídica citada de
referencia. Se tendrá en cuenta que el término "homólogo", tal
como se define aquí, incluye el caso particular de identidad.
El grado de homología puede calcularse fácilmente
alineando las secuencias para obtener el máximo grado de homología;
para ello, puede ser necesario introducir artificialmente sitios
vacíos, como se muestra en la Figura 7. Una vez realizada la
alineación óptima, se establece el grado de homología contabilizando
todas las posiciones en las que los aminoácidos de dos secuencias
son idénticos, en relación con el número de posiciones totales.
\newpage
Sería engorroso describir las secuencias
homólogas de forma distinta a la genérica, debido al elevado número
de combinaciones posibles. El experto en la materia conoce de todas
formas las reglas generales que permiten reemplazar un aminoácido
por otro sin abolir la función biológica o inmunológica de la
proteína.
Es preferible un fragmento de DNA aislado que una
secuencia nucleotídica codificante para:
i) La subunidad Tbp1 de la cepa IM2394, cuya
secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 3, que comienza
con el residuo ácido glutámico en posición 1 y se acaba con el
residuo fenilalanina en posición 884;
ii) La subunidad Tbp2 de la cepa IM2394, cuya
secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 1, que comienza
con el residuo cisteína en posición 1 y se acaba con el residuo
glutamina en posición 579;
iii) La subunidad Tbp1 de la cepa IM2169, cuya
secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 5, que comienza
con el residuo ácido glutámico en posición 1 y se acaba con el
residuo fenilalanina en posición 887; o
iv) La subunidad Tbp2 de la cepa IM2169, cuya
secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 7, que comienza
con el residuo cisteína en posición 1 y se acaba con el residuo
glutamina en posición 691.
Cada una de las subunidades del receptor de la
transferrina, que es una proteína de membrana en la forma madura,
se produce inicialmente en forma de un precursor constituido por un
péptido señal asociado en posición N-terminal.
Por dicha razón, la presente invención tiene por
objetivo proporcionar un bloque de DNA aislado codificante para un
péptido señal, cuya secuencia aminoacícida presenta un grado de
homología de por lo menos el 80% y preferentemente del 100% con la
secuencia mostrada en:
i) la SEC ID N° 3, que comienza con el residuo
metionina en posición -24 y se acaba con el residuo alanina en
posición -1;
ii) la SEC ID N° 5, que comienza con el residuo
metionina en posición -24 y se acaba con el residuo alanina en
posición -1; o
iii) la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo
metionina en posición -20 y se acaba con el residuo alanina en
posición -1.
De acuerdo con la presente invención, también
puede seleccionarse un fragmento de DNA entre un quinto, sexto,
séptimo y octavo fragmentos de DNA que codifican respectivamente
para un precursor, cuya secuencia aminoacídica es homóloga a la
secuencia presentada en la SEC ID N° 1, 3, 5 ó 7.
El término "fragmento o bloque de DNA
aislado" hace referencia a un fragmento o bloque de DNA de
origen genómico que está i) insertado en un vector viral o
plasmídico o ii) situado bajo el control de un promotor
heterólogo.
Además, se considera que el bloque de DNA
codificante para el péptido señal, de acuerdo con la presente
invención, está aislado cuando está asociado a un fragmento de DNA
codificante para una proteína heteróloga al péptido señal; de modo
que se forma un marco de lectura abierto que codifica un precursor
híbrido.
La presente invención hace referencia a una caja
de expresión de un péptido, de un polipéptido o de una proteína
capaz de ser reconocida por un antisuero
anti-receptor de la cepa de N. meningitidis
IM2394 o IM2169, que comprende por lo menos un fragmento de DNA de
acuerdo con la invención, situado bajo el control de elementos
capaces de asegurar su expresión en una célula huésped
adecuada.
En la caja de expresión, el primero, segundo,
tercero o cuarto fragmento de DNA, de acuerdo con la invención,
codificante para una forma madura, puede estar o no asociado con un
bloque de DNA codificante para un péptido señal, dependiendo de si
interesa o no la secreción de la proteína. Preferentemente, se
buscará esta secreción. En este último caso, el bloque de DNA puede
codificar para un péptido señal homólogo o heterólogo de la forma
madura, obteniéndose como resultados respectivos, la síntesis de un
precursor natural o híbrido.
Los elementos indispensables de la expresión de
un fragmento de DNA de acuerdo con la invención son un promotor de
transcripción, los codones de inicio y de terminalización de la
traducción y, opcionalmente, un terminador de la transcripción. El
promotor puede ser constitutivo o inducible. Se ha descrito que el
fragmento de DNA codificante para la subunidad Tbp2 de la cepa
IM2394 parece ser tóxico para una célula heteróloga, en particular
para E. coli. En dicho caso, sería preferible utilizar un
promotor inducible; por ejemplo, el promotor del gen araB de
Salmonella thyphimurium.
Elementos como los del bloque de DNA codificante
para un péptido señal heterólogo (región señal) o un promotor ya
existen en número importante y son conocidos por los expertos en la
materia, cuyas competencias les permitirán elegir una región señal
o un promotor determinado que se adaptarán a la célula huésped
donde se pretende realizar la expresión.
En particular, se ha de resaltar que la subunidad
Tbp2 parece ser una lipoproteína, ya que su precursor comprende un
péptido señal característico de los precursores de lipoproteínas y
que posee una cisteína en posición N-terminal y
aminoácidos con una fuerte tendencia a adoptar una conformación de
tipo "giro" ligeramente corriente abajo de la cisteína
N-terminal (4 glicinas). Ver como referencias, Wu y
Tokunaga, Current Top. Microb. Immunol. (1986) 125:127. La
lipidación podría reforzar la inmunogenicidad de la subunidad
Tbp2.
Así, en un sistema procariota, sería deseable
obtener la subunidad Tbp2 a partir de su precursor natural, es
decir a partir de un precursor que comprende un péptido señal
heterólogo adaptado, que autorice la lipidación; es decir un
péptido señal de una lipoproteína distinta a la de Tbp2. Dicho
péptido señal presenta en particular la característica de ser
liberado mediante corte del precursor por una peptidasa señal de
tipo II. La secuencia en el sitio de corte del péptido señal
corresponde con la secuencia consensus (L, V, I)(A, S, T, G)(G, A)
C, siendo la cisteína (C) el primer aminoácido de la secuencia
madura. A título de ejemplo del péptido señal heterólogo, se
indican en particular las lipoproteínas ColE1, ColE3, Lpp, NIpA,
OsmB, Pal, RIpB y TraT, cuyas secuencias se representan
respectivamente en las SEC ID N° 9 a 24, así como las secuencias
nucleotídicas correspondientes.
En consecuencia, según un modelo de realización
determinado, una caja de expresión de acuerdo con la invención,
destinada a la producción de una proteína con una secuencia
aminoacídica homóloga a la mostrada en:
- la SEC ID N° 1, que empieza con el residuo
cisteína en posición 1 y que se acaba con el residuo glutamina en
posición 579 o
- la SEC ID N° 7, que empieza con el residuo
cisteína en posición 1 y se acaba con el residuo glutamina en
posición 691;
comprende:
i) un bloque de DNA codificante para un péptido
señal de una lipoproteína distinta a la subunidad Tbp2, como el
péptido señal RIpB y
ii) un fragmento de DNA codificante para la
mencionada proteína.
Por último, la presente invención proporciona (i)
un procedimiento de fabricación de un péptido, de un polipéptido o
de una proteína capaz de ser reconocida por un antisuero
anti-receptor de la cepa de N. meningitidis
IM2394 o IM2169, según el cual se cultiva una célula huésped que
contiene una caja de expresión de acuerdo con la presente invención
y se recoge el citado péptido, polipéptido o proteína a partir del
cultivo; así como (ii) el péptido, el polipéptido o la proteína
producida por este procedimiento y (iii) las composiciones
farmacéuticas, en particular las vacunas y los envases.
Con el fin de proceder de acuerdo con la
invención, la célula huésped puede ser una célula de mamífero, una
levadura o una bacteria. Aquí también, la elección de una línea
determinada está al alcance del experto en la materia.
De forma alternativa, una composición
farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener a título de
principio activo, un vector viral o bacteriano en cuyo genoma se ha
insertado un fragmento de DNA de acuerdo con la invención, situado
bajo el control de los elementos necesarios para su expresión. A
título de ejemplo de un vector adecuado, se incluyen en particular
los poxvirus, los adenovirus y las bacterias lácticas.
De acuerdo con la invención, una composición
farmacéutica es particularmente útil para tratar o prevenir una
infección de N. meningitidis, pudiéndose fabricar de forma
convencional. En particular, se asocia una cantidad eficaz desde un
punto de vista terapéutico a un soporte o a un diluyente. Dicha
composición se puede administrar mediante cualquier vía convencional
utilizada en el dominio de la materia; p. ej., en el dominio de las
vacunas, principalmente por vía entérica o parenteral. La
administración puede producirse en dosis únicas o repetidas después
de un cierto intervalo de tiempo. La vía de administración varía en
función de diversos parámetros, por ejemplo del individuo tratado
(condición, edad, etc.). Una composición puede además contener un
adyuvante aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
Con el fin de determinar el objetivo de la
presente invención, es necesario que las cepas de N.
meningitidis IM2394 (también denominadas B16B6) y IM2169
(también denominadas M982) estén disponibles públicamente por el
Institut Pasteur, 25 calle del Dr. Roux, 75015 Paris, con los
números de registro respectivos CIP7908 y CIP79017.
Un antisuero específico del receptor de la
transferrina de la cepa N. meningitidis IM2394 e IM2169
puede obtenerse tal como se especifica en el ejemplo descrito más
adelante.
La invención se describe con más detalle mediante
los ejemplos siguientes y las Figuras 1 a 8.
La Figura 1 representa la estructura del fago
lambda ZAP II y esquematiza la metodología de clonaje y expresión.
Lambda ZAP II es un vector de inserción equipado con dianas de
clonaje múltiples localizadas en la parte plasmídica (pBluescript
SK). Esta parte plasmídica puede escindirse in vivo mediante
co-infección con un fago auxiliar y convertirse en
un vector plasmídico. Si una secuencia codificante se fusiona en
fase con lac Z, o si un fragmento de DNA clonado comprende un
promotor funcional en E. coli, se posibilita la producción
de una proteína de interés que a su vez podrá detectarse con ayuda
de anticuerpos específicos.
La Figura 2 muestra la estructura del plásmido
pTG1265. Dicho plásmido se deriva del pGB2 (Churchward y col.,
Gene (1984) 31:165) de la manera siguiente: se digiere pGB2
con EcoRI y HindIII, se trata con la polimerasa de Klenow y
luego se liga al fragmento SspI-PvuII de 1 Kb aislado
de pT7T3 184 (Mead y col., Protein Engineering (1986) 1:
67; Pharmacia) que comprende el f1-ori, la
secuencia lac Z, los promotores T3 y T7, así como las dianas de
clonaje múltiple.
La Figura 3 muestra el mapa genómico de la región
de DNA de la cepa IM2394 que comprende las secuencias codificantes
para Tbp1 y Tbp2, así como los distintos fragmentos que han sido
clonados. B = BamHI; E = EcoRI;
H = HincII; R = EcoRV; X = XbaI; C = ClaI.
H = HincII; R = EcoRV; X = XbaI; C = ClaI.
La Figura 4 muestra el mapa genómico de la región
de DNA de la cepa IM2169 que comprende las secuencias codificantes
para Tbp1 y Tbp2, así como los diferentes fragmentos que se han
clonado. C = ClaI; H = HincII;
M = MluI; X = XbaI; ? = posición imprecisa.
M = MluI; X = XbaI; ? = posición imprecisa.
La Figura 5 muestra la estructura del plásmido
para13. Dicho plásmido es un plásmido capaz de replicarse en E.
coli y que comprende el promotor del operón arabinosa BAD
(ParaB) de Salmonella typhimurium (modificado a nivel de la
TATA box), así como el gen AraC. Corriente abajo del promotor ParaB
se halla la inserción de las dianas de clonaje múltiple. La serie
de plásmidos Para se describe en Cagnon y col., Prot. Eng.
(1991) 4: 843.
La Figura 6 muestra la metodología utilizada para
la construcción del vector de expresión pTG3786.
La Figura 7 compara las secuencias aminoacídicas
predecidas de las subunidades Tbp1 de las cepas IM2394 e IM2169. El
grado de homología puede estimarse a aproximadamente el 76%.
La Figura 8 compara las secuencias aminoacídicas
predecidas de las subunidades Tbp1 de las cepas IM2394 e IM2169. El
grado de homología puede estimarse a aproximadamente el 47%.
La Figura 9 muestra la metodología utilizada para
la construcción del vector de expresión pTG3779.
La Figura 10 muestra la metodología utilizada
para la construcción del vector de expresión pTG4710.
La Figura 11 muestra la metodología utilizada
para la construcción del vector de expresión pTG4764.
Se resuspende un liofilizado de la cepa N.
meningitidis IM2394 en aproximadamente 1 ml de caldo de cultivo
Muller-Hinton (BMH, Difco). La suspensión
bacteriana se extiende a continuación sobre el medio sólido de
Muller-Hinton que contiene sangre cocida (5%).
Al cabo de 24 h de incubación a 37°C en una
atmósfera que contiene el 10% de CO_{2}, se recoge la capa
bacteriana para sembrar 150 ml de BMH pH 7,2, repartidos en 3
erlenmeyers de 250 ml. La incubación se prosigue durante 3 h a 37°C
en agitación. Cada uno de los 3 cultivos así realizados permite
sembrar 400 ml de BMH pH 7,2 suplementado con
Etilendiamina-Di-O-Hidroxifenil-ácido
acético (EDDA, Sigma) 30 \muM, que es un agente quelante del
hierro en la forma libre.
Al cabo de 16 h de cultivo a 37°C en agitación,
se analiza la pureza de los cultivos mediante observación al
microscopio después de una tinción de Gram. La suspensión se
centrifuga, se pesa el sedimento que contiene los gérmenes y se
guarda a -20°C.
La purificación se realiza esencialmente mediante
el procedimiento descrito por Schryvers y col. (supra), de
la manera siguiente:
Se descongela el sedimento bacteriano y a
continuación se resuspende en 200 ml de tampón Tris HCl 50 mM, pH
8,0 (tampón A). La suspensión se centrifuga durante 20 min a 15.000
xg a 4°C (tampón A). Se recupera el sedimento y a continuación se
resuspende en tampón A a la concentración final de 150 g/l. Se
tratan fracciones de 150 ml durante 8 min a 800 bars en un lisador
de células a alta presión (Rannie, modelo 8.30H). El lisado celular
así obtenido se centrifuga durante 15 min a 4°C a 15.000 xg. Se
recupera el sobrenadante y luego se centrifuga durante 75 min a 4°C
a 200.000 xg. Después de la eliminación del sobrenadante; se
resuspende el sedimento en tampón A y se realiza la cuantificación
de proteínas según el método Lowry y se ajusta la concentración de
la suspensión a 5 mg/ml.
A 1,4 ml de la suspensión de membranas se añade
1,75 mg de transferrina humana biotinilada según el procedimiento
descrito por Schryvers. La concentración final de la fracción de
membranas es de 4 mg/ml. La mezcla se incuba 1 hora a 37°C y luego
se centrifuga a 100.000 xg durante 75 minutos a 4°C. El sedimento
de membranas se resuspende en el tampón A que contiene NaCl 0,1 M y
se incuba durante 60 min a temperatura ambiente.
Después de la solubilización, se añade a esta
suspensión un determinado volumen de N-Lauroil
Sarkosin al 30% (p/v) y de EDTA 500 mM de forma que las
concentraciones finales de Sarkosil y de EDTA son del 0,5% y de 5
mM, respectivamente. Después de una incubación de 15 minutos a 37°C
en agitación, se añade 1 ml de resina
estreptavidina-agarosa (Pierce) previamente lavada
con tampón A. La suspensión se incuba 15 min a temperatura ambiente
y luego se centrifuga a 1000 xg durante 10 min. La resina se
introduce a continuación en una columna y se elimina el eluido
directo.
La resina se lava con 3 volúmenes de columna con
tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0 con NaCl 1mM, EDTA 10
mM, Sarkosil al 0,5% (tampón B) y luego con un volumen de columna
con tampón B que contiene guanidina-HCl 750 mM. A
continuación se eluye el receptor de la transferrina con el tampón
B que contiene guanidina-HCl 2 M. El eluido se
recoge en fracciones, en tubos que contienen un volumen idéntico de
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M. Y se mide la
densidad óptica a 280 nm del eluido al salir de la columna con
ayuda de un detector UV.
Las fracciones correspondientes al pico de
elución se recogen, se dializan con tampón fosfato 10 mM, pH 8,0
que contiene Sarkosil al 0,05% y se liofilizan. El liofilizado se
resuspende en agua a una concentración 10 veces superior. La
solución se dializa una segunda. vez con tampón fosfato 50 mM, pH
8,0 que contiene Sarkosil al 0,05% (tampón C) y luego la solución
se filtra con una membrana de 0,22 \mum de porosidad.
Se determina el contenido proteico y se ajusta a
1 mg/ml mediante adición de tampón C en condiciones asépticas. Esta
preparación se guarda a -70°C.
Conejos neo-zelandeses albinos
reciben por vía subcutánea e intramuscular 100 \mug del receptor
IM2394 en presencia de adyuvante completo de Freund. Veintiún días
y 42 días después de la primera inyección, los conejos reciben de
nuevo 100 \mug del receptor purificado, pero esta vez en presencia
de adyuvante incompleto de Freund. Quince días después de la
primera inyección, se extrae el suero de los animales, se
descomplementa y se filtra en una membrana de 0,45 \mum de
porosidad. A continuación, el filtrado se agota en contacto con la
cepa IM2394, que ha sido cultivada previamente en presencia de
hierro en forma libre (en estas condiciones, se inhibe la síntesis
del receptor de la transferrina). Las modalidades de contacto son
las siguientes: 10 ml del filtrado se añaden a 10^{10} cfu
(unidades formadoras de colonias) de un cultivo de la cepa IM2394.
La adsorción se prosigue durante una noche a 4°C, en agitación. Las
bacterias se eliminan a continuación mediante centrifugación. El
sobrenadante se recupera y luego se somete de nuevo a 2 operaciones
de adsorción sucesivas como las descritas anteriormente.
Las fracciones alicuotadas del material obtenido
en 1A se secan y luego se resolubilizan en el tampón de Laemmli dos
veces concentrado (Tris 65 mM, SDS al 3%, glicerol al 10%,
2-mercaptoetanol al 5%). Y se añade un volumen de
agua equivalente.
Después de la sonificación, el material se
caliente a 90°C durante 2 minutos y luego se somete a una
electroforesis en gel de poliacrilamida. Las subunidades así
preparadas se transfieren a una membrana de PVDF (Immobilon,
Millipore) durante 16 horas a 400 mA en tampón Tris borato 50 mM,
pH 8,3. Las subunidades electrotransferidas se colorean con negro
de almidón, se recuperan las bandas correspondientes a Tbp1 y Tbp2
y a continuación se someten a microsecuenciación del extremo
N-terminal.
Esto se repite varias veces para establecer las
secuencias consensus N-terminales siguientes:
| Tbp1 IM2394: | EXVQAEQAEKQLDTIQV |
| Tbp2 IM2394: | XLXXXXSFDLDSVEXVQXMX |
(X= aminoácido no determinado)
Con el fin de secuenciar las regiones internas de
Tbp2, la proteína unida a la membrana PVDF se somete a la digestión
por tripsina en tampón Tris 0,1 M, pH 8,2. Al cabo de 4 h de
reacción a 37°C, se extraen los péptidos mediante ácido fórmico al
70%, luego mediante ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. A
continuación, estos péptidos se separan mediante HPLC.
\newpage
Para Tbp2 IM2394, las secuencias internas que se
han establecido son las siguientes:
| S1122: | NNIVLFGPDGYLYYK |
| S1125: | YTIQA |
| S''770: | DGNAAGPATEXVIDAYR |
| S''766: | XQIDSFGDVK |
| S1126: | AAFXXXI |
| S''769: | XNXXXMFLQGVR |
| S''771: | TPVSDVAAR |
| S''767: | XSPAFT |
| S''762: | NAIEMGGSFXFPGNAPEG(K) |
| S1128: | XQPESQQDVSENX |
El sedimento bacteriano obtenido en 1A se
resuspende en aproximadamente 25 ml de solución A (Tris 25 mM, pH
que contiene glucosa 50 mM y EDTA 10 mM) con 10 mg de proteinasa K.
La mezcla se deja 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se añaden 12,5 ml de solución A
que contiene 10 mg de lisozima. La mezcla se deja de nuevo durante
10 minutos a temperatura ambiente. Se completa el volumen con 0,5
ml de sarkosil al 10%. La mezcla se incuba 10 min a 4°C.
Se añaden 2 mg de RNAsa y se continua la
incubación 90 minutos a 37°C. El DNA se purifica mediante cuatro
extracciones fenólicas sucesivas. El DNA presente en la última fase
acuosa se precipita con etanol. Se obtiene DNA de alto peso
molecular mediante separación en gradiente de ClCs.
Se realizó una primera genoteca de DNA en el
vector lambda ZAP (Figura 1), de la manera siguiente:
Se fragmentó una preparación de DNA genómico
mediante ultrasonidos. Los extremos de los fragmentos así obtenidos
se convirtieron en extremos romos mediante tratamiento con la T4
polimerasa. Luego, se metilaron los fragmentos. Y a continuación,
los fragmentos se unen a adaptadores EcoRI, se tratan con la
enzima EcoRI y luego se inserta en la diana EcoRI del
fago lambda ZAP II (Stratagene).
La cepa de E. coli XL-Blue
(Stratagene) se infectó con la genoteca preparada de la forma
anterior. Se analizaron las calvas de lisis blancas (presencia de
fagos recombinantes) con ayuda de un antisuero específico del
receptor de la transferrina de la cepa IM2394, preparada tal como
se describió en 1B. Ello permitió identificar dos clones lambda ZAP
II. Los plásmidos pBluescript contenidos en estos clones se
excisaron mediante co-infección con el fago
"auxiliar" y se denominaron pBMT1 y pBMT2.
Los plásmidos pBMT1 y pBMT2 contienen cada uno un
fragmento EcoRI-EcoRI de 3,8 Kb y 1,3 Kb,
respectivamente. Dichos plásmidos se representan en la Figura
3.
La secuenciación del inserto
EcoRI-EcoRI de pBMT1 se realizó según el
procedimiento del "shotgun" (Bankier y Barrell,
Biochemistry (1983) B5:508), de la manera siguiente:
El inserto EcoRI-EcoRI de pBMT1 se
purificó y luego se fragmentó con ultrasonidos. Los extremos de los
fragmentos así obtenidos se convirtieron en romos mediante
tratamiento con la T4 polimerasa. Los fragmentos así tratados se
introdujeron en una diana del fago M13TG131 (descrito por Kieny y
col., Gene (1983) 26:91). Se secuenciaron unas 200 colonias
aisladas de esta preparación. El análisis de estas secuencias por
ordenador permitió reconstituir la secuencia completa del inserto
EcoRI-EcoRI de pBMT1.
Se localizó La secuencia codificante para la
extremidad N-terminal de Tbp1, tal como se muestra
en la Figura 3. Teniendo en cuenta la masa molecular de Tbp1, era
evidente que dicho inserto no comprendía el fragmento de DNA
completo codificante de la Tbp1. Cadena arriba del extremo 5' del
gen tbp1, se ha puesto en evidencia un marco de lectura abierto,
pero no ha sido posible identificar claramente una región
codificante del extremo N-terminal del gen tbp2.
La microsecuenciación de las regiones internas de
Tbp2 se llevó a cabo tal como se describió anteriormente en 1C. Las
secuencias internas localizadas hacia el extremo
C-terminal, correspondieron con la región 3' del
marco de lectura abierto cadena arriba de tbp1.
\newpage
Por otra parte, el DNA genómico de la cepa
IM2394, previamente digerido con HincII se analizó mediante
transferencia de Southern con ayuda de una sonda de DNA radioactiva
correspondiente a la zona HincII-HincII de 1,5 Kb del
inserto de 3,8 Kb de pBMT1; de este modo se pusieron de manifiesto
dos bandas. Esto ha permitido demostrar que el inserto de pBMT1
procedía de la unión artefactual de secuencias derivadas de dos
locus distintos. En consecuencia, la secuencia 5' de tbp2 estaba
ausente.
La genoteca de DNA genómico en lambda ZAP
anteriormente descrita se rastreó de nuevo; esta vez utilizando el
inserto EcoRI-EcoRI de pBMT2 como sonda. Se
seleccionaron 29 candidatos de entre las 200.000 calvas de fagos
analizadas. Solamente el plásmido derivado pTG2749 parecía poseer
un nuevo inserto en relación con pBMT1 y pBMT2. El inserto de
pTG2749 es el representado en la Figura 3. La región del inserto
cadena arriba de la diana EcoRV (región
EcoRV-EcoRI) se subclonó en M13TG131 y se secuenció
según el procedimiento de Sanger y col., PNAS (1977)
74:5463 con ayuda de cebadores sintéticos. De esta manera se
localizó la secuencia correspondiente al extremo
N-terminal de Tbp2.
La secuencia del fragmento de DNA codificante
para Tbp2 de la cepa IM2394 se representa en la SEC ID N° 1, así
como la secuencia aminoacídica correspondiente (SEC ID N° 2).
Justo cadena arriba de la secuencia codificante
de Tbp2 madura, el inserto de pTG2749 comprende una región genómica
distinta procedente de otro locus. Aquí también, se trata de un
artefacto de clonaje análogo al puesto en evidencia en el caso de
pBMT1.
Teniendo en cuenta las reordenaciones observadas
y la ausencia de secuencias 3' de tbp1 y 5' de tbp2,
la genoteca del DNA genómico construida en lambda ZAP se juzgó
inadecuada para la continuación del clonaje.
Se construyó entonces una segunda genoteca a
partir del DNA genómico en un plásmido de bajo número de copias, de
la manera siguiente: se digirió parcialmente una preparación de DNA
genómico con Sau3A. Los fragmentos de DNA de aproximadamente
de 4 a 6 Kb se purificaron después de su fraccionamiento en
gradiente de sacarosa y se insertaron en la diana BamHI del
plásmido pTG1265. Esta preparación plasmídica sirvió para
transformar la cepa de E. coli 5K. Se estimó que esta
biblioteca contenía aproximadamente 18.000 clones
independientes.
Se analizaron aproximadamente 50.000 clones de la
segunda genoteca con ayuda de una sonda radioactiva que
correspondía con un inserto EcoRI-EcoRI de pBMT2. Se
hibridó un solo clon; el plásmido pTG2759 que posee un inserto de
1,8 Kb. El tamaño de este inserto se juzgó insuficiente para
contener el gen completo codificante de Tbp1.
Se construyó una tercera genoteca según el
procedimiento descrito en el párrafo anterior, excepto que la cepa
de E. coli 5K se reemplazó por la cepa de E. coli
SURE (Stratagene). Se estimó que esta biblioteca contenía
aproximadamente 60.000 clones independientes.
Se analizaron aproximadamente 70.000 clones de la
tercera genoteca de DNA con ayuda de una sonda radioactiva
correspondiente al fragmento MluI-HincII de 2,4 Kb
aislado del inserto de pTG2754 descrito en el Ejemplo 2 de más
adelante y representado en la Figura 4. Se seleccionaron dos
clones, los plásmidos pTG2780 y pTG2781, representados en la Figura
3.
Se determinó la secuencia de los insertos de
pTG2780 y pTG2781 según el procedimiento de Sanger. Dicha secuencia
se representa en la SEC ID N° 3, así como la secuencia aminoacídica
correspondiente (SEC ID N° 4).
Se construyó una cuarta biblioteca de DNA. El DNA
genómico se digirió con Sau3A y una fracción que contenía
los fragmentos de aproximadamente 7 Kb se purificó en gradiente de
sacarosa. Esta fracción contenía un fragmento que correspondía con
el locus tbp1,2 ya que fue reconocido por una sonda de DNA
específica de tbp2. Después de la digestión con EcoRV
e XbaI y ligación con pTG1265 digerido con SmaI e
XbaI, se transformó en E. coli 5K. Se realizó un
rastreo de clones con ayuda de una sonda específica de tbp2.
Entre una serie de clones positivos, el plásmido pTG3791 se estudió
de forma particular y se demostró que contenía las secuencias 5' de
tbp2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal
putativo de Tbp2.
2A. El cultivo de la cepa IM2169 y la
purificación del receptor de la transferrina se efectuaron en
condiciones idénticas a las descritas en el Ejemplo 1A.
2B. La preparación de un antisuero
anti-receptor de la cepa IM2169 se realizó según el
protocolo descrito en el Ejemplo 1B.
2C. Las secuencias peptídicas que permiten la
identificación de los fragmentos de DNA se determinaron según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1C. Las microsecuencias que se
han establecido son las siguientes: Secuencia consensus del extremo
N-terminal de Tbp1: ENVQAGQAQEKQLXXIQVX
Secuencias de los péptidos internos de Tbp1:
| S1031: | XLS(E,W)NAGXVLXPADX |
| 51032: | QLDTIQVK |
| 51033: | TAGSSGAINEIEYENXX |
| 51034: | YVTWENVDXXXXXX |
Secuencia consensus del extremo
N-terminal de Tbp2:
| SLVXAXSFDLXSV |
Secuencias de los péptidos internos de Tbp2:
| S1037: | XXDNLSNAX |
| S1035: | XGDDYIFYXGEKPX |
| S1036: | XQGXYGFAMX |
| S1040: | XQATGHENFQYVYSGXFYK |
2D. La preparación del DNA genómico de la cepa
IM2169 se realizó según el protocolo descrito en el Ejemplo 1D.
2E. Clonaje
Una primera genoteca (fragmentos de DNA genómico
de la digestión parcial con Sau3A; pTG1265; E. coli 5K) se
construyó al igual que se describió anteriormente en el Ejemplo 1.
Se estimó que esta genoteca contenía aproximadamente 40.000 clones
independientes, de los cuales el 70% poseían un inserto de
4-6 Kb.
Se analizaron 130.000 clones de esta genoteca con
ayuda de una sonda radioactiva que correspondía con el inserto
EcoRI-EcoRI de pBMT2. De éstos se seleccionaron a
continuación 42 clones, de entre los cuales solamente se retuvieron
2 clones: los plásmidos pTG2753 y pTG2754, que se muestran en la
Figura 4. Los análisis de transferencia de Southern mostraron que
los mapas de restricción de los insertos de pTG2753 y pTG2754
correspondían con los mapas de restricción del DNA genómico.
La determinación de las secuencias nucleotídicas
y la búsqueda de las regiones codificantes de los extremos
N-terminales y las regiones internas demostraron que:
N-terminales y las regiones internas demostraron que:
- el inserto de 1,9 Kb de pTG2753 contiene la
región 3' del gen tbp2 y la región 5' del gen tbp1;
y
- el inserto de pTG2754 contiene la región 3' del
gen tbp2 y las regiones 5' y 3' del gen tbp1, en
rotura de fase. Este primera genoteca no permitió clonar los
fragmentos de DNA completos codificantes de Tbp1 o Tbp2.
Se construyó una segunda genoteca al igual que
antes, pero a partir de DNA genómico digerido con XbaI. Los
fragmentos de DNA se purificaron después del fraccionamiento en
gradiente de sacarosa. Cada fracción (aproximadamente 500 \mul)
se analizó mediante transferencia de Southern con una sonda
radioactiva correspondiente al extremo 3' de tbp1 (fragmento
del inserto de pTG2754). La fracción que hibridó y que contenía los
fragmentos de aproximadamente 6 Kb se clonó en pTG1265 y se
transformó en la cepa de E. coli K5.
Se analizaron aproximadamente 2400 clones de esta
genoteca con ayuda de una sonda radioactiva que correspondía al
fragmento HincII-MluI de 0,6 Kb aislado de pTG2754.
Se caracterizaron 5 clones, entre los que se retuvieron 2: pTG3720
y pTG3721, que se muestran en la Figura 4 y que contienen los dos
genes tbp1 y tbp2.
Para completar la secuencia nucleotídica
codificante de Tbp1, se secuenció el inserto de pTG3720 en la
región donde se situaba la rotura de fase descubierta en el inserto
de pTG2754. Esta secuenciación permitió poner en evidencia que la
ruptura de fase del inserto de pTG2754 era debida a una deleción de
22 pb. La secuencia completa del fragmento de DNA es la que se
muestra en la SEC ID N° 5.
Se continuó con la secuenciación del inserto de
pTG3720 para establecer la secuencia de tbp2. Una vez
identificada dicha secuencia, se observó también una ruptura de
fase.
Por último, la secuencia de tbp2 se
determinó a partir del plásmido pTG3721. Dicha secuencia es la que
se muestra en la SEC ID N° 7.
La diana SphI del plásmido para13 (Figura
5; Cagnon y col., Prot. Eng. (1991) 4:843) se destruyó
mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, para generar el
plásmido pTG3704. Dicho plásmido se linearizó mediante corte con
NcoI, se trató con la polimerasa Klenow para convertir los
extremos en romos y luego se digirió con HindIII.
Por otra parte, se sintetizaron los
oligonucleótidos OTG4015 y OTG4016 complementarios:
El fragmento de DNA de cadena doble
OTG4015/OTG4016 se insertó en el para13 tratado tal como se
describió anteriormente, para generar el plásmido pTG3717 en donde
se había reconstituido la secuencia codificante para el extremo
N-terminal del precursor de la proteína PelB de
Erwinia carotovora (Lei y col., J. Bact. (1987)
169:4379), tal como se aprecia a continuación:
(los extremos de pTG3704 aparecen
subrayados).
A partir del plásmido pTG2749, se generó por PCR
con ayuda de los cebadores OTG4011 y OTG4012, un fragmento que
incluye la región codificante para la región
N-terminal de Tbp2, hasta la diana interna MluI, tal
como se muestra en la Figura 6.
El fragmento generado por PCR se digirió con
BamHI, luego se insertó en la diana BamHI del fago
M13TG131, para generar M13TG3724. La secuencia de este fragmento se
verificó mediante secuenciación.
A partir de M13TG3724, se recuperó la región
codificante para la región N-terminal de Tbp2 en
forma de un fragmento SphI-MluI que a continuación se
insertó en pTG3717, previamente digerido con SphI y
MluI, para generar el plásmido pTG3743.
A partir del plásmido pBMT1, se recuperó la
región codificante para la región C-terminal de
Tbp2 en forma de un fragmento MluI-BanI, en donde el
extremo cohesivo BanI se convirtió en romo mediante el
tratamiento con la polimerasa Klenow. Se insertó este fragmento en
pTG3743, previamente digerido con HindIII, se trató con la
polimerasa Klenow y finalmente se digirió con MluI. De esta
forma se obtuvo el plásmido pTG3749.
La cepa de E. coli MC106 (Casadaban &
Cohen, J. Mol. Biol. (1980) 138:179) se transformó con
pTG3749 y luego se cultivó a 37°C, en medio LB suplementado con 2
g/l de glicerol y 100 \mug/ml de ampicilina. Al cultivo en fase
exponencial, se añadió 0,2 g/1 de arabinosa. La incubación se
prosiguió durante 6 h más. La expresión se observó al cabo de menos
de una hora después de la adición de arabinosa.
La electroforesis en gel de acrilamida de una
muestra del lisado celular puso en evidencia la presencia de una
proteína de aproximadamente 70KD, capaz de fijar la transferrina
humana marcada con la peroxidasa.
En el plásmido pTG3704 digerido con NcoI y
HindIII, se insertó un fragmento sintético constituido de
los cebadores OTG4038 y OTG4039, previamente apareados, generándose
de esta forma el plásmido pTG3756.
A partir del plásmido pTG2754, se generó mediante
PCR con ayuda de los cebadores OTG4037 y OTG4014 un fragmento que
incluía la región codificante del extremo
N-terminal del precursor de Tbp1 hasta la diana
MluI.
Este fragmento de PCR se digirió con BamHI
y se clonó en la diana BamHI de M13TG131 para generar
M13TG3738, cuya secuencia se verificó.
M13TG3738, cuya secuencia se verificó.
A continuación, se linearizó M13TG3738 con
SphI, se trató con la T4 DNA polimerasa para convertir los
extremos en romos, luego se digirió con MluI para aislar el
fragmento portador de la región codificante del extremo
N-terminal del precursor de Tbp1.
Este fragmento se insertó en pTG3756 digerido con
NcoI, se trató con la T4 DNA polimerasa y luego se digirió
con M1uI, para generar el plásmido pTG3778. Y se verificó la
secuencia de la unión NcoI°/SphI°.
El fragmento MluI-XbaI de pTG3720
codificante de la mayor parte de Tbp1 (3'tbp1) se insertó en el
plásmido pTG3778. El plásmido final así obtenido es el plásmido
pTG3779.
Se transformó E. coli MC1061 con pTG3779 y
luego se puso en cultivo a 37°C en medio LB. Al cultivo en fase
exponencial, se añadió 0,2 g/l de arabinosa y se prosiguió la
incubación durante 4 horas.
La electroforesis en gel de acrilamida de una
muestra del lisado celular total puso en evidencia la presencia de
una proteína de aproximadamente 100 KD, que es reconocida por los
anticuerpos anti-receptor.
A partir del plásmido pTG3749, se generó mediante
PCR con ayuda de los cebadores OTG4247 y OTG4248 un fragmento
codificante de la región C-terminal de Tbp2 (a
partir de la diana interna BamHI) y que contiene una diana de
restricción HindIII cadena abajo del codón de terminación de
la traducción de tbp2.
El fragmento generado por PCR se digirió con
HindIII y BamHI y se insertó simultáneamente con el
fragmento SphI-BamHI de pTG3749, codificante de la
región N-terminal de Tbp2 madura, en el vector
pTG3743 digerido con SphI y HindIII, para generar el
plásmido pTG3786. Y se verificó la secuencia de dicho fragmento
amplificado por PCR.
A partir del plásmido pTG3791, se generó por PCR
con ayuda de los cebadores OTG4491 y OTG4494 un fragmento
codificante para la región N-terminal del precursor
de Tbp2 hasta la diana interna EcoRV.
\newpage
A continuación, el fragmento generado por PCR se
digirió con BspHI y EcoRV y se ligó simultáneamente a
los fragmentos NcoI-SstI de pTG3704, que contienen
el gen araC y el promotor araB y
EcoRV-SstI de pTG3786, que contiene la región 3' del
gen tbp2 y el terminador araB. El plásmido resultante
pTG4710 se verificó mediante secuenciación (secuencia del fragmento
amplificado por PCR).
Se transformó E. coli
Xac-I (Normanly y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. (1986) 83:6548) con el plásmido pTG4710 y luego se cultivó
a 37°C en medio M9 + succinato al 0,5% + arginina 50 \mug/ml +
ampicilina 100 \mug/ml. En la fase exponencial, se añadió
arabinosa al 0,2%. Después de diferentes tiempos de inducción (1 h
a 3 h), se recogieron las células y se prepararon los extractos. El
análisis de transferencia de Western y del revelado de Tbp2 mediante
la transferrina-peroxidasa permitió demostrar que
la mayoría de Tbp2 se hallaba en forma de precursor. El análisis de
los extractos en SDS-PAGE seguido de una tinción de
proteínas con azul de Coomassie permitió demostrar una producción
importante de la proteína (que se evaluó en un 5-10%
de las proteínas totales). Las experiencias de marcaje in
vivo con Palmitato y con glicerol tritiados permitieron
demostrar que únicamente la forma madura está lipidada.
A partir de pTG3768 se generó por PCR con ayuda
de los cebadores OTG4494 y OTG4651 un fragmento codificante del
péptido señal RIpB (Takase y col., J. Bacteriol. (1987) 169:
5692) y el inicio de la secuencia codificante de Tbp2 madura hasta
la diana interna EcoRV.
A continuación, se digirió el fragmento de PCR
con BspHI y EcoRV y se insertó simultáneamente con el
fragmento EcoRV-HindIII de pTG3786 portador de la
región 3' del gen tbp2, en el vector pTG3704 digerido con
NcoI y
HindIII, para generar el plásmido pTG4764. La secuencia de este fragmento amplificado por PCR se verificó mediante secuenciación.
HindIII, para generar el plásmido pTG4764. La secuencia de este fragmento amplificado por PCR se verificó mediante secuenciación.
Se transformó E. coli
Xac-I con el plásmido pTG4764 y luego se cultivó a
37°C en medio M9 + succinato I al 0,5% + arginina 50 \mug/ml +
ampicilina 100 \mug/ml. En la fase exponencial, se añadió
arabinosa al 0,2%.
Al cabo de diferentes tiempos de inducción (1h a
3h), se recogieron las células y se prepararon los extractos. El
análisis de transferencia de Western seguido del revelado con
transferrina-peroxidasa puso en evidencia una banda
mayoritaria cuyo peso molecular correspondía con el de la Tbp2
madura y purificada. La proteína se detectó en los extractos
después de SDS-PAGE y tinción de proteínas con azul
de Coomassie (evaluándose el nivel de producción a aproximadamente
el 2-5% de las proteínas totales). Los experimentos
de marcaje in vivo con palmitato y glicerol tritiados
permitieron demostrar que la proteína así producida está lipidada.
La cantidad de la forma madura y lipidada de Tbp2 producida a
partir de la cepa Xac-I/pTG4764 es superior a la
producida por la cepa Xac-I/pTG4710.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pasteur Mérieux Sérums & Vaccins
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 58, Avenue Leclerc
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lyon
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Francia
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 69007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgén
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11, rue de Moisheim
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Francia
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 67000
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fragmentos de DNA codificantes de las subunidades del receptor de la transferrina de Neisseria meningitidis y procedimientos para su expresión.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 24
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: disco de 3^{1/4}
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: Patentin Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE DEPÓSITO: EP 93401531.4
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE DEPÓSITO: FR 92 07493
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 19 de junio de 1992
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1808 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DNA codificante de la subunidad Tbp2 del receptor de la transferrina
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Neisseria meningitidis IM2394
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....60
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido maduro
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 61....1797
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....1797
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID N° 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 599 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2800 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DNA codificante de la subunidad Tbp1 del receptor de la transferrina
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Neisseria meningitidis IM2394
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRA CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 40....111
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido maduro
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 112....2763
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 40....2763
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 908 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2809 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DNA codificante de la subunidad Tbp1 del receptor de la transferrina
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Neisseria meningitidis IM2169
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 71....142
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido maduro
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 143....2803
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 71....2803
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 911 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2230 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DNA codificante de la subunidad Tbp2 del receptor de la transferrina
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Neisseria meningitidis IM2169
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 60....119
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido maduro
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 120....2192
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 60....2192
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 711 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 8:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....51
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....51
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AGG AAA AGA TTT TTT GTG GGA ATA TTC GCG ATA
AAC CTC CTT GTT
\hfill48 \sa{Met Arg Lys Arg Phe Phe Val Gly Ile Phe Ala Ile Asn Leu Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
GGA 51
Gly
Gly
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Lys Arg Phe Phe Val Gly Ile Phe Ala
Ile Asn Leu Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
Gly
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....57
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....57
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AAA AAA ATA ACA GGG ATT ATT TTA TTG CTT CTT
GCA GTC ATT ATT
\hfill48 \sa{Met Lys Lys Ile Thr Gly Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Ile Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
CTG TCT GCA
\hfill57
Leu Ser Ala
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Lys Ile Thr Gly Ile Ile Leu Leu Leu
Leu Ala Val Ile Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
Leu Ser Ala
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....60
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....60
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AAA GCT ACT AAA CTG GTA CTG GGC GCG GTA ATC
CTG GGT TCT ACT
\hfill48 \sa{Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr Leu Leu Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
CTG CTG GCA GGT
\hfill60
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val
Ile Leu Gly Ser Thr Leu Leu Ala Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....69
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....69
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AAA CTG ACA ACA CAT CAT CTA CGG ACA GGG GCC
GCA TTA TTG GTG
\hfill48 \sa{Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly Ala Ala Leu Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
GCC GGA ATT CTG CTG GCA GGT
\hfill69
\sac{Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly
Ala Ala Leu Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....69
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....69
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG TTT GTA ACG AGC AAA AAA ATG ACC GCG GCT GTT
CTG GCA ATT ACT
\hfill48 \sa{Met Phe Val Thr Ser Lys Lys Met Thr Ala ala Val Leu Ala Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
TTG GCA ATG TCT CTG AGT GCA
\hfill69
\sac{Leu Ala Met Ser Leu Ser Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Phe Val Thr Ser Lys Lys Met Thr Ala Ala
Val Leu Ala Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Leu Ala Met Ser Leu Ser Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....63
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....63
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG CAA CTG AAC AAA GTG CTG AAA GGG CTG ATG ATT
GCT CTG CCT GTT
\hfill48 \sa{Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG GCA ATT GCG GCA
\hfill63
\sac{Met Ala Ile Ala Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met
Ile Ala Leu Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Met Ala Ile Ala Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....54
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....54
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AGA TAC CTG GCA ACA TTG TTG TTA TCT CTG GCG
GTG TTA ATC ACC
\hfill48 \sa{Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Leu Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
GCC GGG
\hfill54
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Leu
Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....66
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- PALABRE CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1....66
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
ATG AAA CAT AAC GTT AAG CTG ATG GCA ATG ACT GCC
GTT TTA TCC TCT
\hfill48 \sa{Met Lys His Asn Val Lys Leu Met Ala Met Thr Ala Val Leu Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
GTC CTC GTG CTC TCC GGG
\hfill66
\sac{Val Leu Val Leu Ser Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys His Asn Val Lys Leu Met Ala Met Thr
Ala Val Leu Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Val Leu Val Leu Ser Gly}
Claims (20)
1. Fragmento de DNA aislado que tiene una
secuencia nucleotídica codificante de una proteína que tiene una
secuencia aminoacídica que presenta un grado de identidad de por lo
menos el 75% con la secuencia que se muestra en:
- -
- la SEC ID N° 1, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba con el residuo glutamina en posición 579; o
- -
- la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba con el residuo glutamina en posición 691;
siendo reconocido el producto de expresión de
dicho fragmento por un antisuero anti-receptor de
la transferrina de la cepa N. meningitidis IM2394 o
IM2169.
2. Fragmento de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1, que contiene una secuencia nucleotídica
codificante de:
- i)
- la subunidad Tbp2 de la cepa IM2394 cuya secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 1, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba con el residuo glutamina en posición 579; o
- ii)
- la subunidad Tbp2 de la cepa IM2169 cuya secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba con el residuo glutamina en posición 691.
3. Fragmento de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1, que contiene una secuencia nucleotídica
codificante de un precursor que tiene una secuencia aminoacídica
con un grado de identidad de por lo menos el 75% con la secuencia
que se muestra:
- -
- en la SEC ID N° 1, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo glutamina en posición 579;
- -
- en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo glutamina en posición 691;
que puede ser reconocida por un antisuero
anti-receptor de la transferrina de la cepa N.
meningitidis IM 2394 o
IM 2169.
IM 2169.
4. Fragmento de DNA de acuerdo con la
reivindicación 3, que tiene una secuencia nucleotídica codificante
de:
- i)
- el precursor de la subunidad Tbp2 de la cepa IM2394, cuya secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 1, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo glutamina en posición 579; o
- ii)
- el precursor de la subunidad Tbp2 de la cepa IM2169, cuya secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo glutamina en posición 691.
5. Fragmento de DNA de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una secuencia aminoacídica
con un grado de identidad de por lo menos el 80% con la secuencia
de referencia.
6. Fragmento de DNA de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una secuencia aminoacídica
con un grado de identidad de por lo menos el 90% con la secuencia
de referencia.
7. Cassette de expresión destinada a la
producción de un péptido, polipéptido o proteína que se puede
reconocer por un antisuero anti-receptor de
transferrina de la cepa N. meningitidis IM2394 o IM2169, que
comprende un fragmento de DNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6 situado bajo el control de los elementos
necesarios para su expresión.
8. Cassette de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde dicho fragmento de DNA se halla situado
bajo control de los elementos que comprenden el promotor
araB de S. typhimurium.
9. Cassette de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, destinada a la producción de una proteína que
tiene una secuencia aminoacídica con un grado de identidad de por
lo menos el 75% con la secuencia mostrada:
- -
- en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo cisteína en posición 1 y acaba con el residuo glutamina en posición 691;
\newpage
que comprende:
- i)
- un bloque de DNA codificante del péptido señal RipB y
- ii)
- un fragmento de DNA codificante de dicha proteína.
10. Cassette de expresión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, destinada a la producción
de una proteína que tiene una secuencia aminoacídica con un grado
de identidad de por lo menos el 80% con la secuencia de
referencia.
11. Cassette de expresión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, destinada a la producción
de una proteína que tiene una secuencia aminoacídica con un grado
de identidad de por lo menos el 90% con la secuencia de
referencia.
12. Cassette de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9, destinada a la producción de la subunidad Tbp2 de
N. meningitidis IM2394 o IM2169, que comprende:
- i)
- un bloque de DNA codificante del péptido señal RipB y
- ii)
- un fragmento de DNA codificante de dicha subunidad.
13. Célula hospedadora transformada con un
cassette de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 7
a 12.
14. Procedimiento de producción de un péptido,
polipéptido o proteína que puede ser reconocido por un antisuero
anti-receptor de la transferrina de la cepa de
N. meningitidis IM2394 o IM2169, según el cual se cultiva una
célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13 y se recoge
dicho péptido, polipéptido o proteína a partir de dicho
cultivo.
15. Composición farmacéutica que comprende como
principio activo, un péptido, polipéptido o proteína que puede ser
reconocido por un antisuero anti-receptor de la
transferrina de la cepa de N. meningitidis IM2394 o IM2169,
obtenido mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación
14.
16. Composición farmacéutica que comprende como
principio activo, un vector viral o bacteriano en cuyo genoma se ha
insertado un fragmento de DNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho fragmento está colocado bajo
el control de los elementos necesarios para su expresión.
17. Bloque de DNA aislado codificante de un
péptido señal que tiene una secuencia aminoacídica con un grado de
identidad de por lo menos el 75% con la secuencia mostrada:
- -
- en la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo alanina en posición -1;
- -
- y que puede ser reconocida por un antisuero anti-receptor de la transferrina de la cepa de N. meningitidis IM2394 o IM2169.
18. Bloque de DNA aislado que codifica un péptido
señal que tiene una secuencia aminoacídica que se muestra en:
- -
- la SEC ID N° 7, que comienza con el residuo metionina en posición -20 y acaba con el residuo alanina en posición -1.
19. Bloque de DNA de acuerdo con la
reivindicación 17 que codifica un péptido señal que tiene una
secuencia aminoacídica con un grado de identidad de por lo menos el
80% con la secuencia de referencia.
20. Bloque de DNA de acuerdo con la
reivindicación 17 que codifica un péptido señal que tiene una
secuencia aminoacídica con un grado de identidad de por lo menos el
90% con la secuencia de referencia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9207493A FR2692592B1 (fr) | 1992-06-19 | 1992-06-19 | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
| FR9207493 | 1992-06-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2199938T3 true ES2199938T3 (es) | 2004-03-01 |
Family
ID=9430946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES93401531T Expired - Lifetime ES2199938T3 (es) | 1992-06-19 | 1993-06-15 | Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6028049A (es) |
| EP (1) | EP0586266B1 (es) |
| JP (1) | JPH06277066A (es) |
| AT (1) | ATE242810T1 (es) |
| AU (1) | AU679911B2 (es) |
| CA (1) | CA2098448A1 (es) |
| DE (1) | DE69333036T2 (es) |
| ES (1) | ES2199938T3 (es) |
| FI (1) | FI932826A (es) |
| FR (1) | FR2692592B1 (es) |
| HU (1) | HU219267B (es) |
| NO (1) | NO932222L (es) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992003467A1 (en) | 1990-08-23 | 1992-03-05 | The University Of North Carolina Of Chapel Hill | Transferrin binding proteins from neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis |
| US5912336A (en) * | 1990-08-23 | 1999-06-15 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis |
| FR2692592B1 (fr) * | 1992-06-19 | 1995-03-31 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
| CA2173142C (en) * | 1993-10-01 | 2000-11-14 | Thomas Bosselmann | Method and device for measuring an electrical alternating quantity with temperature compensation |
| FR2720408B1 (fr) * | 1994-05-31 | 1996-08-14 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments Tbp2 de Neisseria meningitidis. |
| FR2724936A1 (fr) * | 1994-09-22 | 1996-03-29 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Recepteur lactoferrine d'helicobacter |
| US6086893A (en) * | 1995-10-09 | 2000-07-11 | Pasteur Merieux Serums & Vaccins | Helicobacter lactoferrin receptor |
| FR2739624B1 (fr) * | 1995-10-10 | 1997-12-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Nouvelle sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis |
| US6290970B1 (en) * | 1995-10-11 | 2001-09-18 | Aventis Pasteur Limited | Transferrin receptor protein of Moraxella |
| US6610506B1 (en) | 1995-12-01 | 2003-08-26 | University Technologies International, Inc. | Transferrin binding proteins of Pasteurella haemolytica and vaccines containing same |
| FR2767060B1 (fr) * | 1997-08-07 | 2000-02-11 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Vaccin meningocoque comportant la valence de souche bz83 |
| BR9811907A (pt) * | 1997-08-15 | 2000-08-15 | Univ Utrecht | Proteìna de ligação de lactoferrina de neisseria |
| JP5102414B2 (ja) | 1998-05-01 | 2012-12-19 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 髄膜炎菌抗原および組成物 |
| US10967045B2 (en) | 1998-11-02 | 2021-04-06 | Secretary of State for Health and Social Care | Multicomponent meningococcal vaccine |
| US6391316B1 (en) | 1999-03-10 | 2002-05-21 | University Of Saskatchewan | Vaccine compositions comprising Haemophilus somnus transferrin-binding proteins and methods of use |
| CN100392082C (zh) * | 1999-04-30 | 2008-06-04 | 启龙股份公司 | 保守的奈瑟球菌抗原 |
| DK2270173T3 (en) * | 1999-05-19 | 2016-03-07 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Neisserial combination compositions |
| AU6490500A (en) * | 1999-07-16 | 2001-02-05 | Gerald R. Potts | Methods and systems for dynamic force measurement |
| GB9928196D0 (en) * | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
| US6388434B1 (en) | 2000-01-17 | 2002-05-14 | Bechtel Bwxt Idaho, Llc | Electro-optic high voltage sensor |
| MXPA02008314A (es) * | 2000-02-28 | 2002-12-09 | Chiron Spa | Expresion heterologa de proteinas de neisseria. |
| GB0007433D0 (en) * | 2000-03-27 | 2000-05-17 | Microbiological Res Authority | Recombinant transferrin binding proteins |
| US20030232055A1 (en) * | 2000-07-31 | 2003-12-18 | Ruslan Medzhitov | Innate immune system-directed vaccines |
| US20030175287A1 (en) * | 2001-01-03 | 2003-09-18 | Yale University | Innate immune system-directed vaccines |
| US7138267B1 (en) | 2001-04-04 | 2006-11-21 | Epicentre Technologies Corporation | Methods and compositions for amplifying DNA clone copy number |
| GB0121591D0 (en) | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
| EP2272946B9 (en) | 2002-02-25 | 2015-06-24 | Vaxiion Therapeutics, LLC | Minicell compositions and methods |
| WO2004015099A2 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine composition comprising lipooligosaccharide with reduced phase variability |
| GB0220194D0 (en) * | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Improved vesicles |
| CA2501812C (en) | 2002-10-11 | 2012-07-10 | Mariagrazia Pizza | Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages |
| DK2395073T3 (en) | 2002-11-01 | 2017-10-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Process for drying. |
| RU2378010C2 (ru) | 2003-10-02 | 2010-01-10 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс С.Р.Л. | Жидкие вакцины для множественных серогрупп менингококков |
| WO2005032584A2 (en) | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Pertussis antigens and use thereof in vaccination |
| JP5173194B2 (ja) | 2003-12-23 | 2013-03-27 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン |
| GB0408977D0 (en) | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins |
| GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| JP5275983B2 (ja) | 2006-06-12 | 2013-08-28 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン |
| GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
| AU2010247252A1 (en) * | 2009-05-14 | 2012-01-12 | Sanofi Pasteur | Method for admixing the lipopolysaccharide (LPS) of gram-negative bacteria |
| NZ597007A (en) | 2009-05-14 | 2013-09-27 | Sanofi Pasteur | Meningococcus vaccine containing lipooligosaccharide (los) from modified strains of l6 immunotype neisseria meningitidis |
| JP2013521770A (ja) | 2010-03-10 | 2013-06-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン組成物 |
| CA2810971C (en) | 2010-09-10 | 2020-11-03 | Novartis Ag | Developments in meningococcal outer membrane vesicles |
| PT2646470T (pt) | 2010-11-30 | 2017-05-03 | Hoffmann La Roche | Anticorpos anti-recetor da transferrina de baixa afinidade e a sua utilização na transferência de scfv terapêuticos através da barreira hematoencefálica |
| WO2013186753A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Novartis Ag | Vaccines for serogroup x meningococcus |
| JP2016539950A (ja) | 2013-12-02 | 2016-12-22 | ビー． シュライバーズ，アンソニー | 細菌表面受容体タンパク質由来の免疫原性組成物およびワクチン |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5141743A (en) * | 1989-04-27 | 1992-08-25 | University Technologies International, Inc. | Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins and vaccines containing the same |
| US5292869A (en) * | 1989-04-27 | 1994-03-08 | The Board Of Governors Of The University | Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins from bacteria and the preparation of vaccines containing the same |
| WO1992003467A1 (en) * | 1990-08-23 | 1992-03-05 | The University Of North Carolina Of Chapel Hill | Transferrin binding proteins from neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis |
| FR2682041B1 (fr) * | 1991-10-03 | 1994-01-14 | Pasteur Merieux Serums Vaccins | Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis. |
| FR2682114B1 (fr) * | 1991-10-03 | 1996-02-23 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Vaccin de sous-unite contre les infections a neisseria meningitidis et sous-unites correspondantes a l'etat purifie. |
| FR2692592B1 (fr) * | 1992-06-19 | 1995-03-31 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
-
1992
- 1992-06-19 FR FR9207493A patent/FR2692592B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-06-08 AU AU40098/93A patent/AU679911B2/en not_active Ceased
- 1993-06-15 EP EP93401531A patent/EP0586266B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-15 DE DE69333036T patent/DE69333036T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-15 CA CA002098448A patent/CA2098448A1/en not_active Abandoned
- 1993-06-15 ES ES93401531T patent/ES2199938T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-15 AT AT93401531T patent/ATE242810T1/de active
- 1993-06-16 NO NO932222A patent/NO932222L/no unknown
- 1993-06-18 HU HU9301791A patent/HU219267B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-06-18 FI FI932826A patent/FI932826A/fi unknown
- 1993-06-21 JP JP5173773A patent/JPH06277066A/ja active Pending
-
1995
- 1995-05-23 US US08/448,194 patent/US6028049A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-06-03 US US08/867,921 patent/US6326350B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6028049A (en) | 2000-02-22 |
| FI932826A (fi) | 1993-12-20 |
| FI932826A0 (fi) | 1993-06-18 |
| ATE242810T1 (de) | 2003-06-15 |
| HU219267B (en) | 2001-03-28 |
| FR2692592A1 (fr) | 1993-12-24 |
| JPH06277066A (ja) | 1994-10-04 |
| AU4009893A (en) | 1993-12-23 |
| NO932222L (no) | 1993-12-20 |
| NO932222D0 (no) | 1993-06-16 |
| US6326350B1 (en) | 2001-12-04 |
| DE69333036D1 (de) | 2003-07-17 |
| EP0586266A1 (fr) | 1994-03-09 |
| CA2098448A1 (en) | 1993-12-20 |
| AU679911B2 (en) | 1997-07-17 |
| DE69333036T2 (de) | 2004-05-13 |
| HU9301791D0 (en) | 1993-10-28 |
| FR2692592B1 (fr) | 1995-03-31 |
| HUT68443A (en) | 1995-06-28 |
| EP0586266B1 (fr) | 2003-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2199938T3 (es) | Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria. | |
| ES2217303T3 (es) | Proteinas de micobacterias, microorganismos que las producen y utilizaciones vacunales y para la deteccion de la tuberculosis. | |
| EP0449958A1 (en) | MENINGOCOCCALES CLASS I EXTERNAL MEMBRANE PROTEIN VACCINE. | |
| EA007409B1 (ru) | Антигенные полипептиды стрептококков, способы их получения и применения | |
| ES2270420T3 (es) | Genes receptores de la transferrina de haemophilus. | |
| US5571718A (en) | Cloning and expression of soluble truncated variants of Borrelia OspA, OspB and Vmp7 | |
| EP0469045B1 (en) | SYNTHETIC $i(PSEUDOMONAS) $i(AERUGINOSA) PILIN PEPTIDE AND RELATED VACCINES AND DIAGNOSTICS | |
| JPS6251994A (ja) | クロ−ン化抗原 | |
| AU615429B2 (en) | Vaccines and diagnostic assays for haemophilus influenzae | |
| JP3023997B2 (ja) | 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原 | |
| JP3450018B2 (ja) | コクシジウム症ワクチン | |
| KR0170752B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| JPS61111695A (ja) | Ｂ型肝炎ビールス又はｂ型肝炎ビールス成分からのｄｎａフラグメント、ポリペプチド及びオリゴペプチド、組み換えｄｎａ分子、ｄｎａベクター、エシエリヒア・コリｋ１２変異体、ポリペプチドの製法、ｂ型肝炎ビールス疾患に対する接種物質、モノクロナール抗体ｍａ１８／７、マウス雑種細胞ｇｏ１ａ１８／７‐１並びにモノクロナール抗体ｍａ１８／７の製法 | |
| PT96132A (pt) | Processo de preparacao de polipeptidos de vectores e de vacinas contra a malaria | |
| JP3135060B2 (ja) | ヘモフィルスインフルエンザｂ型菌の外皮膜タンパク質Ｐ２の部分断片を用いた接合体 | |
| US5273744A (en) | Vaccines for the protection of animals against theileria infection | |
| CA2253244A1 (en) | A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide | |
| US6096321A (en) | ClpG subunit of CS31A protein capsule containing heterologous peptides | |
| KR100394454B1 (ko) | 트랜스페린수용체유전자들 | |
| JPH09508276A (ja) | ワクチン |