JPS6251994A - クロ−ン化抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、破ＩＪＡｍｍ　（Ｃｌｏｓｆｒｉｄｉｕｌｌ
Ｉｉｅｔａｎｉ）の二Ｅ、　＝　Ｄ　ｌ−キシンをコー
ド邊る遺伝子のクローニング、その発現およびその発現
生成物のワクチン製造への利用に則する。

破傷風は、微生物、破傷風菌によつ−ｒひき起（二され
る、感染性の高い、世稈に広く分布する疾患である。そ
の胞子は、きわめて長ＩＮ間にわたり、ハウスダス１−
や土壌中で休眠し−Ｃいて、（二わ、が開放性の創１ｈ
に対す゛る主要り感染源になる１、汚染されＩキ二動物
の糞便もこの疾患の伝播（こ重要Ｋｆ役〃１を果たし、
同時１．’：　Ｊス前は非感染部分−ｃｄうつｒ二楊所
を汚染することになる。

破傷風への感染Ｇｉ創倶を・受けｌ、：患青が常（・二
部される危険であり、この感染ｆ！五通常されめ℃強烈
な疼痛を生じまた死を眉く可能性も少なく４にい、した
がって、１９世紀にその原因がバクテリアによることが
発見されて１ス来、０効なワクチンの開発に多くの努力
が払われてきた。ヒト・に、１３けるワクチン化に最初
に成功したのは１９６２年で＋Ｓつて、使用されたワク
チンは無毒化処１す！された粗テタヌスト４ニシンであ
つ１−、　、。

この疾患が宿主細胞にべ３染１ノたバクテリアによつＴ
：症１１Ｃを発症−４６ものではなく、バクテリア細胞
の分解に際しｌ放出される強力転ニコ−−Ｄ　Ｉ−＄シ
ン（Ｃよる（二とがづ゛で［、、ｌＩＱらかにされてい
たので、ａ初のワクチンの（票的はデタヌスｉ・キシン
１こ向１〕られｌ、′：。

１−介な１・４−シンを（；ｆるＥ　＆；１人最の絹胞
培酋を要４゛るが、ｉ二の場合１−キシンには細胞層が
爽Ｓ稼しやり゛い。生成したト・キシンは通常ホルムア
ルデ１′：：ドで処理し′Ｃ，無心化し、またゲルター
ルアルデヒドでもＳ毒化できる。ｌ）かしながら、Ｉ−
キシンの無害化中（二いずれの処理でもｔ”　４シンが
細胞爽雑物と抱合・物を生成し、これが有害な臨床反応
４・起イーすｊ＋Ｊ能性が出てくる。

ｉｎ　ｖｉｖｏでは、遺伝子鋳型によって、１−銅およ
び（−１笛の両名からなる単一（母体）ペプチドが合成
される。バクテリア細胞の分解峙に、内因性のブ［］テ
７−ゼがこのペプチドを前かＩう（を存する１個のジス
ルノイトテ楡の間で切断し、１個のジスルフィド槓で結
合した２個のペプチド鎖を！ｊえる。

パパインは１−１鎮を！；７Ｊ断しＬ１Ｌ鎮と■鎮の−
・部からなるＢフラグメント（約１００．０００ＨＩ４
）およびＨ鎖の残りからなるＣフラグメント−（約５０
．０ＯＯＨ１４）を与える。いずれのフラグメントも保
護効果を示すことができるが、未分解トキシンの夾雑に
よると考えられる毒性は残っていることが明らかにされ
ている［ｌ１ｅｌｔｉｎＯほか：Ｊ、１Ｓｉｏ１．Ｃｈ
ｅｎ＋、（１９７７）、２５２．１８７〜１９３］。

Ｈ旧よ、ドデシル硫酸ナトリウムと標準分子量マーカー
の存在下にポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した
見かけ上の相対分子量を意味する。

すなわち、分子量は、Ｌｌ、に、Ｌａｅ＋ｎｌｉ　［Ｎ
ａｔｕｒｅ　　（１９７７）、２７７．６８０〜６８５
］によって記載された方法で簡便に測定することができ
る。便利な標準分子量マーカーは、たとえば、ホスホリ
ラーゼＢ　（９，３Ｘ１０’　Ｈ杓、ウシｔｈ清アルブ
ミン（６，８Ｘ１０’ＨＷ）、アルドラーゼ（３，９Ｘ
１０’ＨＷ）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（
２，７ｘ　１０’　ＭＷ）　、オバルブミン（４，５ｘ
１０’ＨＷ）およびカルボニックアンヒドラーゼ（２，
９Ｘ１０’ＨＩ４）である。

本発明は、テタヌストキシンをコードするＤＮＡがクロ
ーン化され、テタヌス１〜キシンまたはその免疫原性フ
ラグメントの発現に使用できることを発見し完成された
ものである。すなわち、Ｂおよび、０両フラグメント、
ｉ］鎖およびＬ鎖、ならびに全トキシンが、より高い収
率で、また先行技術の欠点をもたずに得られる。

本発明は、テタヌストキシンまたはその少なくとも１個
のエピトープからなるペプチドをコードするクローン化
ＤＮＡ配列を提供する。

クローン化の語は、本川ｍａｙにおいては、その天然宿
主の外部において天然にまたは化学的に合成された任意
のＤＮＡ配列に対して用いられる。

本明細書において用いられるペプチドの語・は、主とし
てアミノ酸から構成され、２個以上のアミノ酸からなる
任意の分子構造を意味する。

本明細書において用いられるエピトープの語は、免疫原
性分子の免疫原決定基を意味し、免疫原決定基とは、適
当な形態で与えられた場合、罹病性動物に保護免疫応答
を誘導できる分子コンフィギユレーションをいう。

本発明のＤＮＡ配列は、テタヌストキシンをコードする
任意の天然の配列であっても、またこのような配列の突
然変異型であってもよい。考えられる突然変異には、１
個または複数個の塩培の買換、欠失、挿入および逆位が
包含される。いずれにしでも、この配列は、積極的な意
味または消極的な意味において、テタヌストキシンの少
なくと５１個のエピトープを常にコードするものである
。

好ましい態様におけるＤＮＡ配列は、第１図もしくは第
４図に示された配列の少なくとも一部に相当するか、ま
たはそれとホモロジーを有しく少なくとも５０％）その
負の鎖は第１図もしくは第４図に示された鎖と交差ハイ
ブリダイゼーションが可能な配列であるか、または上述
のいずれかの配列と遺伝子暗号の縮重の点でのみ相異Ｊ
る配列である。

また、所望のペプチドに相当するＤＮＡ配列を生じさせ
るのにＤＮＡ操作技術が必ずしも便利ではないような場
合には、本発明のＤＮＡ配列は所望のペプチドフラグメ
ントよりも鎖長の長いまたは短いペプチドをコードする
ものであってもよい。

たとえば、Ｃフラグメントを実質的にコードするＤＮＡ
配列がこのフラグメントの最初の３０個のアミノ酸をコ
ードしていなくてもよいし、またＢフラグメントの最後
の３０個のアミノ酸をコードしていてもよい。

本発明のＤＮＡ配列は以下の方法によって得ることがで
きる。破ａｍ菌の培養液を３日間生育させ、ついで濃厚
塩溶液中で溶菌し、溶菌液からテタヌストキシンのフラ
グメントＣを単離し、結品化する。次にフラグメントＣ
のオリゴペプチドＮ末端配列を自動アミノ酸配列分析装
置で決定し、そのオリゴペプチドの部分配列をコードす
ると考えられるＤＮＡに相当する３群の標識オリゴヌク
レオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、
全消化ゲノムＤＮＡのフラグメントをニトロセルロース
上で同定するためのプローブとして用いることができる
。プローブによって検出されたＨ−とほぼ等しいゲノム
ＤＮＡフラグメントを適当なプラスミド（たとえばｐＡ
Ｔ１５３）中にクローン化し、適当な宿主（たとえばＩ
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊｌｙｌｌｏｌ、）の形質転換に使用す
る。ついでコロニーを採取し、オリゴヌクレオチドプロ
ーブへのハイブリダイゼーションを調べる。このように
して選択された組換えり０−ンにプローブとして挿入Ｄ
ＮＡを用いてさらにクローンを発生させて、さらにゲノ
ムＤＮＡフラグメントを同定することができる。このよ
うにして、全テタヌストキシン配列をコードするクロー
ンの選択を行うことが可能である。この挿入体の切取り
、ヌクレアーゼ処理および発現プラスミドへの挿入によ
り、このフラグメントがペプチドとして発現される。

本発明の他の態様においては、テタヌストキシンの少な
くとも１個のエピトープからなる合成ペプチドが提供さ
れる。

さらに本発明の他の態様によれば、本発明のＤＮＡ配列
をもつ非病原性ウィルスが提供される。

これは、上記配列をｉｎ　ｖｉｖｏで発現することによ
り、感染の可能性があるを椎動物宿主に破傷風に対する
免疫を付与するのに使用することができる本発明はまた
、同様にして他の感染症に対する免疫を付与できる、上
述のような非病原性ウィルスをも提供する。これは他の
ワクチンと一緒にあるいは単独で投与することができる
。

本発明の他の態様においては、本発明のＤＮＡ配列を関
連宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミノ末端をコード
する部分に双頭結合して含有し、またさらに任意の関連
制御配列をもっていてもよい発現ベクターを提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、宿主ペプチドのアミ
ン末端部分とテタヌストキシンの少なくとも１個のエピ
トープを有するカルボキシ末端からなる融合蛋白質を提
供する。

本発明の別のＲ様では、適当な宿主内で翻訳可能遺伝子
と所望により関連制御配列からなり、それに本発明のＤ
ＮＡ配列が、上記遺伝子のカルボキシ末端部分から上記
ＤＮＡ配列まで適当な宿主内での発現に際して正しく翻
訳されてテタヌストキ゛シンの少なくとも部分またはそ
の少なくとも１個のエピトープからなるペプチドと上記
遺伝子をコードする蛋白質の部分から構成された融合蛋
白質を産生ずるように挿入された発現ベクターを提供す
る。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の
ＤＮＡ配列からなるクローニングベクターで宿主細胞を
形質転換し、その宿主１０胞を培養し、テタヌストキシ
ンまたはそのエピトープ少なくとも１個からなるペプチ
ドを発現させる方法を提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の
ＤＮＡ配列を含有するベクターを提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の
ＤＮＡ配列とさらにそのＤＮＡ配列の発現を調節する１
個または２個以上のｔ、１Ｊｔｌｌ配列を含有するベク
ターを提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、（２）破
傷風菌からＣＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーを
作成し、０　テタヌストキシンＤＮＡのプローブを選択
し、そのプローブに放射活性を付与し、（ｃ）　上記プ
ローブを用いて上記ライブラリーの１個または２個以上
のメンバーを選択し、■　このようにして上記ライブラ
リーから選択されたＤＮＡを用いて適当な宿主を形質転
換してテタヌストキシンまたはその少なくとも１個のエ
ピトープを含有するペプチドを発現させる各工程からな
る、テタヌストキシンの少なくとも一部分もしくはその
少なくとも１個のエピトープからなるペプチド、または
他のペプチド配列と共有結合していてもよい上記テタヌ
ストキシンもしくはペプチドの合成方法を提供する。

本発明は、さらに他の態様として、本明１１書に記載し
た任意の方法で得られるテタヌストキシンまたはその少
なくとも１個のエピトープからなるペプチドを医薬的に
許容される担体と配合した、破傷風に対する免疫を誘発
できるワクチンを提供する。

本発明の好ましい態様によれば、本発明は、木明細書に
記載した任意の方法で得られるＢフラグメント、Ｃフラ
グメント、Ｌ鎖、Ｈ鎖およびトキシン、またはそれらに
実質的に相当するペプチドを単独にまたは配合して含有
する上述のワクチンを提供する。

本発明は、さらに他の態様として、上述のワクチンの右
効吊を感染の可能性があるを椎動物宿主に投与すること
による宿主への破傷風に対する免疫を誘発する方法を提
供する。

本発明を、以下に図面を参照しながら、さらに詳細に説
明する。

第１図は、−続きの破Ｗ風菌ＤＮＡの塩基配列および相
当するアミノ酸配列を示す。

第２図はテタヌストキシン遺伝子の部分の制限エンドヌ
クレアーゼおよび一部のクローンの相対位置を示す。

第３図は全テタヌストキシン遺伝子のより簡単な制限酵
素地図である。

第４図は、テタヌストキシンのＬ鎖のＮ末端をコードす
るＤＮＡフラグメントの塩基配列を示す。

第１図は、テタヌストキシンの８フラグメントの部分お
よびＣフラグメントのすべてをコードする−続きの破ｆ
ｌｉｌｆｆｌ菌ＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列
を示す。３文字のアミノ酸記号および１文字のヌクレオ
チド記号は慣用法によっている。

配列は水用ｍ書に記載した方法によって決定した。

実Ｍ誤差が生じる余地の範囲内で可能な限り正確に決定
を行ったが、図に示した配列と実際のテタヌストキシン
遺伝子配列の間には、一部相違のある可能性は否定でき
ない。パパイン分解部位は３６６位に存在する。

第２図には、テタヌストキシンのＣフラグメントと８フ
ラグメントの部分の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す
。１文字の記号はそのように制限酵素を示す。Ｅ　（Ｅ
ｃｏＲＩ）：８　（ＢＱＪ！ＩＩ）：Ｓ　（ＳａｃＩ［
）：Ｋ　（ＫｐｎＩ）、他の酵素は略さずに表示した。

９は標識オリゴヌクレオチド結合の部位を示す。指示し
たプラスミド挿入体の相対的サイズおよび位置も表示し
た。工は−続きの破傷風菌ＤＮＡであり、「はトキシン
の部分の相対位置を示し、ＢおよびＣはトキシン中の８
およびＣフラグメントの位置を指示する。

第３図は第２図を全遺伝子に拡げた図である。

この図は一定の比例に従って作られていて、それに応じ
て第２図の縮尺を判断できる。文字記号は第２図の場合
と同様であるが、縮尺が犬ぎいため制限部位はわずかじ
か示していない 第４図はテタヌストキシン１鎖のＮ末端のＤＮＡおよび
相当するアミノ酸配列を示す。記号および配列決定法に
ついては、第１図に関しての一般的記述が第４図にもあ
てはまる。

本発明のＤＮＡ配列は、第２図に示すような、本明細書
に記載のようにして決定されたｆ１１１限酵素地図によ
って特徴づけることもできる。

遺伝子配列は、標的ＤＮＡの７ラグメントを、バクテリ
オファージクローニングベクターＭ１３ｍｐ３　［）１
ｅｓｓｉｎａ、Ｊ、＆　Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、：　（１９
８２）Ｇｅｎｅ、１９，２６９〜２７６］Ｍ１３ｍｐ１
８およびＭ　１３　ｍ　ｐ　１９　［Ｎｏｒｒａｎｄｅ
ｒ、Ｊ、ほか：　Ｇｅｎｅ。

２６．１０１〜１０６］にサブクローニングしたのち、
ジデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒほか：　（１９７７）Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　　７４　、５
４６３〜５４６７］によって決定した。

第１図に示した配列データを用いて、その配列の任意の
部分に相当するペプチドが、たとえばＨｅｒｒｉｒｉｅ
ｌｄ、Ｒ，Ｂ、＆　Ｈａｒｇｌｉｎ、Ａによって報告さ
れた方法［’Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、、　
３９　、８４１頁以下（１９７０）］により合成できる
。

合成の語は、たとえば上述のような化学的方法によって
製造されるペプチドに関して用いられる。

全テタヌストキシン遺伝子のクローニングは、容易に調
製できる全ゲノムＤＮＡ消化ライブラリーと、このよう
なライブラリー中に検出される関連配列またはそのフラ
グメントを用い、適当なプローブを利用して、たとえば
列２に記載したようにして実施できる。この方法によっ
て見出される配列の一部は所望の完全なりＮＡ配列と考
えられるが、大部分はこのような配列の７ラグメントで
ある。ライブラリー中のどのクローンが所望のＤＮＡ配
列の部分であるかを決定するためには、染色体歩行とし
て知られた方法［１１ａｄｆｉｃｌｄ、Ｃ，。

Ｆｏｃｕｓ　５．１〜５　（１９８３）　Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅｓ。

Ｌａｂｓ、　］を使用できる。この方法は、既知の７ラ
グメント（プローブ）を用い、クロスパイプリダイゼー
ションによって他の７ラグメントを検出するものである
。これらの新たに単離された配列自体をプローブとして
用い、これをくり返すことによってテタヌストキシンを
実質的にコードするＤＮＡの全配列が同定され、クロー
ン化できる。

このような操作を用い、このＤＮＡ配列の制限酵素地図
特性も得ることができる。

制限エンドヌクレアーゼ切断、ゲル電気泳動、ニトロセ
ルロースまたはポリアミド膜への遷移、およびクローン
化ＤＮＡから誘導される特異的プローブへのハイブリダ
イゼーションによる、ゲノムＤＮＡ中のテタヌストキシ
ンの遺伝子地図の構築は、ゲノムクローン中の方向およ
び位置ならびに新しいクローンの調製を確認するのにき
わめて有用である。

本発明のＤＮＡ配列の宿主としてはウィルスを使用でき
る。たとえば、感染細胞にヒボキサンチンを含まない培
地上での生育能を付与できないワタシニアウイルスの株
（Ｔｋ−）を用いて組織培養液を感染させる。この組織
培養液をついで、Ｔｋ＋遺伝子決定基に結合したテタヌ
ストキシン遺伝子またはそのフラグメントで形質転換し
てもよい。以後の増殖ウィルスの一部はゲノム中の挿入
体の形でこのような形質転換配列をもつことになる。つ
いで、これらは、ヒボキサンチン欠損培地上での生育能
を組織培養細胞に付与する能力によって選択できる。生
育能を付与するコロニーをついで、テタヌストキシンま
たはその少なくとも１個のエピトープからなるペプチド
の産生により、たとえばヒト免疫血清を用いて選択する
。このようなワクシニア株を用いて破傷」菌に感染する
可能性がある動物を感染させると、新しいワクシニア株
が保護免疫原テタヌスベブチドを産生ずる。

このようなワクチンには、他の感染症たとえば痘癒、ジ
フテリア、Ｂ型肝炎、狂犬病、単純ヘルペスウィルス、
百日咳等に対する免疫性を関連ＤＮＡの導入によって容
易に付与することもできる。

テタヌストキシンをコードするＤＮＡ配列の上述の特性
に基づき、得られたＤＮＡ配列または制限酵素地図を参
照して、この配列の任意所望のフラグメントのクローニ
ングが可能である。

外来性ＤＮＡの切片を正しい読み取り枠で大腸菌遺伝子
中に挿入すると、アミノ酸配列の一部は大腸菌遺伝子中 導される融合蛋白質を発現させることができる。

適当な制御配列と便利な制限部位をもつ適当な発現ベク
ターが構築され、融合蛋白質の高レベルでの発現が可能
になっている。

すなわち、選ばれた発現システムのυ１限地図および発
現させる配列を、翻訳フレームの知識とともに検討すれ
ば、発現ベクターに結合させた特異的ＤＮＡフラグメン
トを、さらに操作することなく発現させることができる
。たとえば、ＰＷＲＬ５０７は、ｔｒｐＥ遺伝子のヌク
レオチド１２２３におけるＢＱＪＩＩ部位に合成ＥＣ０
ＲＩ−Ｆ３ＱＩＴ１リンカ−を挿入したｍ遺伝子とｐＡ
Ｔ１５３から構築されたプラスミドである［Ｎ１ｃｈｏ
ｌｓ、Ｂ、Ｐ、ほか：　Ｊ、Ｈｏ１．８ｉｏ１．　１４
６　、４５〜５４　（１９８１）］。

適当なυ１限地図部位を用い、テタヌストキシン遺伝子
配列からのＤＮＡフラグメントをｔｒｐ［遺伝子内の部
位に正しい方向でクローン化することができるが、通常
、翻訳フレームが正しく配置されない。挿入配列を発現
させるためには、適当な長さの合成リンカ−を、ｔｒｐ
Ｅ遺伝子と挿入体の間の制限部位に挿入し、融合蛋白質
を正しいフレームで発現さぼることができる。別法とし
て、挿入ＤＮＡを含むプラスミドをバクテリアのＤＮＡ
と挿入ＤＮＡの間の唯一の制限部位で開裂し、このＤＮ
Ａを酵素Ｂａｊ３１で短時間処理して線状ＤＮＡの各末
端から数個の塩曇を除去する。

ＤＮＡポリメラーゼ■のに（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメン
トで修復したのち、プラスミドをＴ４リガーゼで再び環
化し、バクテリアの形質転換に使用する。形質転換体の
３個に１個は、テタヌストキシン配列をｔｒｌ）Ｅ遺伝
子生成物との融合蛋白質として発現させる正しい読み取
り枠で含有するはずである。

Ｂａ１３１による消化の程度が発現融合蛋白質の最終サ
イズ、ならびにそれに含まれるｔｒｐ［：およびデタヌ
ス］〜キシン配列の相対長を決定するものであることは
、本技術分野の熟練者には自明のとおりである。さらに
、３ａｊ！３１消化および修復後のリゲーション時に合
成リンカ−を挿入すると、形質転換後の特定の株の解析
が容易になる。

特定の制限酵素消化とＢａｊ３１Ｍ素処理の賢明な利用
により、テタヌストキシンの任意の特定領域を融合蛋白
質として発現させることができる。

別法として、一本鎖ＤＮＡを優先的に分解するヌクレア
ーピＳ１を用いてＢＧＪ！　ＩＩ制限部位の粘る末端を
消化し、プラント末端を残すこともできる。このプラス
ミドを再び環化すると、挿入ＤＮＡは、新しい、多分正
しい読み取り枠に置かれることになる。

ＤＮＡフラグメントを発現させる別法には、（通常）短
いＤＮＡ切片を、多くの場合大腸菌蛋白質のＮ末端アミ
ノ酸配列をコードする配列内で挿入できる読み取り枠（
ＯＲＦ）ベクターを用いる方法がある。挿入されるＤＮ
Ａは、正しい翻訳フレームで停止コドンを含んでいては
いけない。

また、転写の方向に対して正しい方向にあり、各末端で
正しい枠になければならない。無作為切断法によって生
じる蛋白質コード配列からのＤＮＡ切片では正しい枠で
読み通される確立は理論的に１７１８である。β−ガラ
クトシダーゼに基づくＯＲＦベクターが報告されている
（にｏｅｎｅｎほか：１９８２）。蛋白質のＮ末端にお
ける部位への正しい枠でのＤＮＡ切片の挿入により、β
−ガラクトシダーゼ蛋白質の通読発現が可能になり、こ
れは色素産生！Ｓ質５−ブロモー４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）の加水分解
によって検知できる。たとえば、コロニーを生育させる
アガール中にＸｇａ　Ｉが含まれていると、適当な宿主
株の官能性β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドによる
形質転換で青色の′コロニーを生じる。このようなベク
ターのひとつ、ｐＸＹ４６０は、ｔａｃブ０モーターの
制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。

ＥＣｏＲＩ部位に隣接するＳｍａＩ部位へのＤＮＡの挿
入は、遺伝子を正しい読み取り枠での発現に変換するこ
とかできる。大腸菌宿主たとえばＪＭ１０５の形質転換
はバクテリアをアンピシリン抵抗性に変換し、融合蛋白
質の発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（［ＰＴＧ）の添加により高レベルで誘導できる。

融合蛋白質中のテタヌストキシン遺伝子の部分によって
コードされるペプチドは、適当なペプチド結合の酵素的
または化学的切断によって融合蛋白質から分離できる。

発現されたアミノ酸配列の検討により、どのような酵素
的または化学的切断方法を用いるべきかは本技術分野の
熟練者には自明のとおりである。融合蛋白質発現システ
ム中のテタヌストキシンＤＮＡ配列とバクテリア遺伝子
配列の間に合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿入すれ
ば、発現融合蛋白質のテタヌストキシン配列と残余部分
の間に酵素的または化学的切断に適した部位を設けるこ
とができる。この方法でデタヌスｉ・キシン遺伝子がコ
ードするフラグメントを宿主ペプチドから精製すること
が可能である。

テタヌストキシン蛋白質またはその部分のコード配列の
直接発現は、挿入ＤＮＡ配列をＡ　ＬＪ　Ｇ開始コドン
のすぐ後に正しい取み取り枠で、このＤＮＡ挿入体が正
常時にバクテリアの制御領域によって転写、翻訳される
コード配列を置換するように位置させることにより達成
できる。このような制御領域には、開始コドンに対して
至適位置にあるプロモーターおよびリポソーム結合部位
が包含される。発現させるＤＮＡ配列は適当な制限部位
を用い、必要な場合には適当なオリゴヌクレオヂドリン
力−を用いることにより正しく配置させることができる
。挿入ＤＮＡ配列の末端には、翻訳を停止させるために
正しい読み取り枠で停止コドンを挿入することができる
し、また転写を停止させるためにターミネータ−配列を
添加することができる。発現させる挿入ＤＮＡはテタヌ
ストキシンの全コード配列でも、また全配列からアミノ
末端シグナル配列を除去した配列でもよいが、この蛋白
質の免疫原性フラグメントに相当するコード配列の部分
であることが好ましい。適当なフラグメントは、適当な
りＮＡクローン（ヌクレオチド配列の検討後）の制限酵
素消化により、また必要に応じて一方のまたは両方の末
端を制御された方法でさらに３ａｊ！３１処理して、Ｄ
ＮＡ配列の一部を除去することにより調製できる。制御
された消は、適当な緩衝液、温度、反応時間および酵素
ｍの選択により、たとえば例７に記載したように達成で
きる。この段階で、適当な合成リンカ−を挿入体に好ま
しくはプラント末端リゲーションにより添加し、ＡＵＧ
Ｉｍ始コドンの付与したりまた発現ベクターへのリゲー
ションを容易にすることができる。

クローン化されたフラグメントの制御された発現は、そ
の配列のいずれかの末端における配列を用いることによ
り、また既知の他の配列を用いることにより可能になる
。このような配列にはプロモーターおよびエンハンサ−
が包含される。このようなプロモーターには、Ｊｊａｃ
、ｊｒｐ、バクテリオファークλＤＬ及びハイブリドｔ
ｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）がある。適当なエンハンサーと
しては、ＳＶ４０エンハンサ−およびウシ乳頭腫ウィル
スからのエンハンサ−がある。

上述のベクターは、ＤＮＡのクローニングに適していて
、宿主ＩＩ胞の形質転換に使用して関連蛋白質を発現さ
せることができるものであれば任意の適当なベクターで
よい。このようなベクターには、プラスミド、バクテリ
オファージおよびコスミドが包含される。ＣＤＮＡのク
ローニングに使用できるベクターには、大！Ｉ！菌を用
いる場合ｐＵｃ８、ＤＵＣ９、ｐΔＴ１５３、ＤＢＲ３
２５およびｏＢＲ４３８が、枯草菌を用いる場合ρＢＤ
９およびｐＫＴ４３８が、酵母を用いる場合ｐＭＡ５６
が、哺乳類動物細胞を用いる場合ｐＡｄＤ２６ｓＶ　（
Ａ＞−３、ＤＳＶ２−ｄ　ｈ　ｆ　ｒ１ＳＶＥＨＡ３お
よび５ＶＬＨＡ８がある。

関連蛋白質の発現に使用いるベクターは上述したような
制御配列を包含することになる。このようなベクターに
は、大腸菌を用いる場合ｏＸＹ４６０Ｊ５よびｐＷＲＬ
５０７が、哺乳類動物細胞を用いる場合ｐｓｖ２−ｄｈ
ｆ’ｒがある。

上述の方法に使用するのに適当な宿主細胞の例には、原
核生物たとえばバクテリア（たとえば大腸菌ＨＢ　１０
１およびＤＨｌ、枯草菌５ｐ、ＢＤ１７０およびＩ　ト
１６１４０　）または真核生物たとえば酵母（たとえば
ＸＶ６１０−８ＣＩ母ＩＩ胞）もしくは哺乳類動物細胞
（たとえばシミアンＣジー１細胞）がある。

本発明はさらに、上述の本発明の方法で得られた上記テ
タヌストキシン蛋白質またはその少なくとも１個のエピ
トープからなるペプチドを包含する。これらの物質は、
破傷風に対する免疫を付与するためのワクチンに導入で
きる。この目的では、抗原蛋白質またはその少なくとも
１個のエピトープからなるペプチドを医薬的に許容され
る担体と配合することができる。抗原蛋白質またはペプ
チドは単独でまたは他のテタヌストキシンエビトープ含
有ペプチドと組合せて（たとえばＣおよびＢフラグメン
トを一緒に）もしくは破傷風に対する免疫を付与する弛
の抗原と組合せて使用することができる。

この場合の医薬的に許容される担体は、忠者に免疫ペプ
チドを導入するためのビークルとして用いるのに適当な
液体メジウムである。このような担体の例としては食塩
溶液を挙げることができる。

テタヌストキシンまたはペプチドは溶液としてまたは担
体中に固体で懸濁して、あるいは医薬的に許容される界
面活性剤で可溶化して使用できる。

ワクチンには、免疫応答を刺激し、ワクチンの効果を増
強するアジュバントを添加することもできる。本発明で
有利に使用できるアジュバントには水酸化アルミニウム
がある。

ワクチンは、テタヌストキシンまたはペプチドの汲終使
用濃度、０．２〜２００μｇ／ｄ、好ましくは５〜５０
μｇ／ｌｄ、とくに好ましくは１５μ’Ｊ／ｄを含有す
るように処方するのが便利である。処方後ワクチンを滅
菌容器に充填し、密封して、低温たとえば４℃に保存す
る。凍結乾燥してもよい。

を椎動物宿主に破傷風に対する免疫を誘導するためには
、適当に処方されたワクチンを１回または２回以上投与
する。ワクチンの１回用量は０．１〜２ｄ、好ましくは
０．２〜１！ｄ、とくに好ましくは０．５ｔｉ！が薦め
られる。

本発明のワクチンはワクチンの投与に慣用されている任
意の方法で、たとえば経口および非経口（たとえば皮下
もしくは筋向）注射により投与することができる。処置
はワクチンの１回投与または一定期間にわたり複数回の
投与とする。

次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する
が、これは本発明を単に例示するものであって、いかな
る意味においても本発明を限定するものではない。

例１：破傷風菌ＤＮＡ 破（！用菌株ＣＮ３９１１をミューラー（Ｈｕｅｌ　ｌ
ｅｒ　）培地６０ＯＩｄ中で３０時間生育させた［　Ｈ
ｕｅｌ　Ｉｅｒ、　Ｊ、１１．ほか：　Ｊ、Ｉｕ＋ｕｎ
ｏｌ　　（１９５４）且、３７７〜３８４］。細胞をツ
ルポール（５ｏｒｖａｌｌ）０５３０−ターを用い遠心
分離して（１０分、５．０００ｒｌ）Ｉｍ　）ペレット
化し、ライで５０ｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　ｐＨ８，
Ｏ１５ｍＨＥＤＴＡ１５０ｍＨＮａＣ！　（ＴＥＳ）２
０ｍ中に再懸濁した。ライソザイム２η／１７！を加え
、細胞を３７℃で２０分間インキュベートし、３．２−
の０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡを加え、さらにインキュベー
ションを３７℃で２５分間続けた。ＴＥＳ中２％ザルコ
シル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　７．２ｄを加えて細胞を溶
解させ、３７℃で１０分間、ついで４℃で１０分間イン
キュベートした。プロテアーゼに１０１１１／ｒｄを加
え、溶解液を一夜５０℃に放置した。溶解液８ｄを、Ｃ
５ＣＪ６９．６ｇと１ワｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣＪ！　
（ｐ］１８．Ｏ）　、１ｍＨＥＤＴＡ（ＴＥ）５５．２
ｄを含む溶液３５ＩｒＩｌに加えた。

ＰＭＳＦ　　５０Ｍｇ／Ｍ１を加え、この溶液をベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　７０．１　　Ｔｉローター
中、２０℃、３６．ＯＯＯｒｐｍで４８時間遠心分離゛
した。

澄明な溶液中に不透明な塊として認められる破傷風菌Ｄ
ＮＡを広径シリンジを用いて勾配から吸引し、ＴＥに対
して大規模に透析した。ＤＮＡをフェノールで１回、エ
ーテルで数回抽出したのち、−２０℃においてエタノー
ルで沈殿させた。

ＤＮＡを１１Ｒｇ／ＩＩ！！！になるように再懸濁して
一２０℃に保存した。

例２：結晶フラグメントＣ ミューラー培地中で生育させた破傷風菌バーバード（Ｈ
ａｒｖａｒｄ　）株の３日間培養で得られた微生物をＩ
Ｎ　　ＮＡＣ！で溶菌させてテタヌストキシンを生成さ
せた。これをリン酸カリウム（１，７５Ｍ、ｐＨ８，Ｏ
）による分別沈殿、ついでＯ，０１Ｍリン酸ナトリウム
ｐＨ７，２，０，２Ｍ　　ＥＤＴＡで平衡化したＤＥＡ
Ｅセルロース吸着によって精製した。精製した分画を０
．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６，５に対する透析により
平衡化した。この物質から、Ｋｉｍｍｃｌ　＆　Ｓｍ１
ｔｈ［Ｊ、８ｉｏ１゜Ｃｈｅｗ、（１９５４）２０７，
５１５〜５３１］の方法により粗酵素から誘導した結晶
パパインを用い、ｆｌａｔｔｉｎｇ　＆　Ｚｗｉｓｌｅ
ｒ　［ｔｌｅｌｔｉｎｇ、Ｔ、Ｂ、ほか：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ　　（１９７０）２５２．１８７〜
１９３］の方法に従ってフラグメントＣを製造した。

結晶フラグメントＣは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）　Ｇ　１００カラムから得られた適当な分画また
は消化混合物のいずれかを真空透析で濃縮し、ついで水
に対して透析することにより１ワられた。さらに透析す
ることにより、さらに何回かに分けて結晶が得られた。

再結晶は、フラグメントＣを０．５Ｍ塩化ナトリウムに
溶解し、ついで水に対して透析することにより実施した
。これらの条件下に、はぼ定量的な収率でフラグメント
Ｃが得られた。結晶化はフラグメントＣの残留毒性を低
下させるが、１２回再結晶をくり返した後でも完全には
消失しないことが明らかにされた。残留毒性を完全に除
くには、ｔｌｅｌｔｉｎｇ　＆　Ｚｗｉｓｌｅｒ（前出
）の記載に従ってセファロース４Ｂにカップリングさせ
た吸着テタヌス抗トキシンのカラムにフラグメントＣを
吸着させることが常に必要であった。精製されたフラグ
メントは最後に結晶懸濁液として透析し、凍結乾燥した
。

例３：テタヌストキシンＤＮＡの同定 精製フラグメントＣの最初の３０個のアミノ酸の配列は
、自動エドマン分解によって明らかにされた。配列はＬ
ＶＳ、ＡＳｎ、Ｌｅｕ、ＡＳｐ。

Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｓｎ。

Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、１１ｅ、Ａｓｐ。

Ｖａｌ、１１ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ。

Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、１１ｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ。

Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｓｎ。

ＡＳｐであった。これについて、最小の縮重のオリゴヌ
クレオチド混合物を与える最長の可能な−続きのアミノ
酸を解析した。残基６〜１１の配列および塩基長各１７
の３２種のオリゴヌクレオチドを第１表に示す（カッコ
内のヌクレオチドは可能な変化を示している）。これら
のオリゴヌクレオチドのひとつが７ラグメントＣをコー
ドするＤＮＡおよびｍＲＮＡと相補的であることが期待
される。この一群のオリゴヌクレオチドを、指示した場
所に含まれ３２Ｐ−ＡＴＰｒ標識された塩基の混合物と
ともに合成した。

（ｂ）　破傷風菌ＤＮＡフラグメントの同定Ｊ３よびク
ローニング 破＠風菌染色体ＤＮＡを数種の制限酵素で消化し、ニト
ロセルロースに移し、　Ｐ−標識オリゴヌクレオチド混
合物とハイブリダイズした。

ＥＣ０ＲＩ消化で顕著な２ｋｂのバンドが、またＰＳｔ
Ｉ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄｌｌ［で弱い高分子量の７
ラグメントが同定された。破傷風菌ＤＮＡ１００ｕ９を
ＥＣ０ＲＩで切断し、０．　７％アガロースゲル上で電
気泳動に付し、ＤＮＡを約２ｋｂのフラグメントを含む
領域からＭ製した。

２ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントのこのプールを、ＥＣ０
ＲＩで切断し、脱ホスホリル化したプラスミドρＡＴ１
５３中にクローニングした。

１００個の組換えクローンを採取し、コロニーを混合オ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。程度は異なるがプローブ
と反応性を示す数種のクローンが同定された。プラスミ
ドＤＮＡは７個のクローンから［４し、ＥＣ０ＲＩ消化
物をサザン法で検討した。４種のプラスミドがオリゴヌ
クレオチド混合物にハイブリダイズした２、０ｋｂＥＣ
ＯＲＩ挿入体を含有し、これらのプラスミドのひとつ゛
をｐＴｅ　ｔ　１と命名しさらに検討した。

ｐＴｅ　ｔ　Ｉ中の挿入体の制限酵素地図を第２図に示
す。さらにサゾン法を行ったところ、２ｋｂ挿人体の中
央の３００個の塩基対を含むフラグメントのみがプロー
ブとハイブリダイズした。すなわち、フラグメントＣの
アミノ末端をコードする配列は２ｋｂＥｃｏＲＩフラグ
メントの中央に存在した。

ＤＮＡ配列解析（例３参照）により、２ｋｂＥｃｏＲＩ
フラグメントはフラグメントＣの全コード領域を含むも
のではないことがわかった。したがって、隣接の制限酵
素生成フラグメントをｏＴｅ　ｔ　１をプローブとして
用いサザン法を行うことにより同定した。３．２ｋｂＢ
Ｑｊｌｌ破ｆセ風菌フラグメントがベクターｐＷＲＬ５
０７のＢｇＡ　Ｉ［部位にクローン化され、ｐＴｅｔ８
を生じた。このフラグメントはｐＴｅ　ｔ　ｌ中に存在
する１、４ｋｂ　　ＢｑｉＩ［−ＥｃｏＲＩフラグメン
トとそれに隣接する１、８ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ−ＢＧｊ
■フラグメントを含有した（第２図参照）。

テタヌストキシンの８フラグメントの残余部分（Ｌ鎖を
含む）をコードするクローンを得るために、ｏＴｅｔｌ
の破［菌挿入体をプローブとして使用し、破山菌ＤＮＡ
の約１ｋｂＢＱ１１１フラグメントを得た。これをｐＵ
ｃ８にクローン化しｐＴｅ　ｔ　１４を生成させた。つ
いでｐＴｅ　ｔ　１４からＥＣ０ＲＩフラグメントを欠
失させてｏＴｅｔｌ７を構築した。ｐＴｅ　ｔ　１７か
ら得られた４ｏｏｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｕ１７
ラグメン１へを用い、上に述べたと同様に操作して、１
．８ｋｂｐ破傷風菌ＤＮＡフラグメントをＩ）ＡＴ１５
３にクローニングしてｐＴｅｔ２０を作成した。

このフラグメントの配列決定により（例５、第４図）、
想定されるシャインーダルガルノ配列（四角で囲んだ）
に続いて塩基３５から読み取り枠が認められる。すなわ
ち、ＯＴｅ　ｔ　２０はテタヌストキシンのＮ末端をコ
ードし、ｐ　Ｔ　ｅ　ｔ　１　Ｊ３よびＤＴｅｔ８とと
もに全テタヌストキシン遺伝子をコードするものである
。

例４：全Ｃフラグメントをコードする発現プラスミド プラスミドｐＴｅｔ６およびｐ　１−　ｅ　ｔ　１０は
フラグメントＣの末端９１個のアミノ酸をコードしない
。この領域をコードするＤＮＡを含むこれらのプラスミ
ドの誘導体を次のようにしで構築した。

ＤＴｅｔ８を制限酵素ｐｓｔ■およびＳａＣ■で切断し
、５．３５ｋｂフラグメントを精製した。ｌｆｆ１＋様
にｐＴｅｔ６およびＤＴｅ　ｔ　１０をｐｓｔＪおよび
５ａｃＩＩで切断し、２．３ｋｂａよび２．７５ｋｂの
フラグメントを精製した。ｐＴｅｔ８とｐＴｅ　ｔ　６
のＰｓｔｒ−８ａｃ■フラグメントを結合させ、大腸菌
Ｄ１］１を形質転換し、組換えプラス−ニドｐＴｅｔ　
１１　（７，７ｋｂ）を生成させた。

同様にｐＴｅｔ８とｐ”ｒｅ　ｔ　１０のＰｓｔＩ−３
ａＣＩ［フラグメントを結合させてｏＴｅｔｌ２（８，
１ｋｂ）を生成させた。ｐＴｅｔｌｌｉ、ｔｔｒｐｌ：
遺伝子の部分とフラグメントＣの４５１のアミノ酸中４
４０個を含む融合蛋白質を発現することが期待される。

ｏＴｅｔｌ２はｔｒｐＥ遺伝子の部分、フラグメン１〜
Ｂの１２２個のアミノ酸および全フラグメントＣ（４５
１個のアミノ酸）を含有する融合蛋白質を発現すること
が期待される。ｐＴｅｔｌｌとｐＴｅ　ｔ　１２は８６
．０００Ｈ１４と１０１．ＱＯＯＨＨの交差反応蛋白質
を産生ずる。これらの値は、プラスミドの構造とヌクレ
オチド１７２０における終結コドンの利用に一致する（
第１図）。ｏＴｅｔｌ２を含む大腸菌株ＤＨ１は、１９
８５年６月２８日にＮａｔｉｏｎａ＋Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ　　ｏｆ　　１ｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　　
６１　　Ｃｏ１１ｎｄａｌｅＡＶｅ、、ＬＯｎｄＯｎ　
Ｎ１４９５ＨＴに寄託され、寄託番号はＮＣＴＣ１１９
１８である。

ＤＮＡの配列解析はＳａｎｇｅｒ　（前出）のジデオキ
シ法を用いて実施した。

ＤＮＡ！ｉｉ型は、線状ファージクローニング／配列決
定ベクターＭ　１３　ｍ　ｐ　８　ｒＨｅｓｓｉｎａ　
＆　ｖｉｅｉｒａ。

１９８２、前出）　、Ｍｌ　３ｍ１）１８またはＭ１３
ｍ　ｐ　１９　［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、Ｊ、ほか：　Ｇ
ｅｎｅ　（１９８３）、１１．１０１〜１０６］中に挿
入体の７ラグメントをサブクローニングすることにより
調製した。

配列決定はＳａｎｇｅｒはか（前出）の２戎に従い、合
成共通ブライ？　−（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）および［３５
ｓ］−ｄＡＴＰαＳ　（八ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて実施した。特定のフラグメ
ントリ配列を決定するのに用いた基本的な方法は、特定
の制限酵素フラグメント（ＲｓａＩ、Ｓａｕ［Ｉ［Ａ、
５ＳＤＩ。

ＥｃｏＲＩ、ＢｏＪＩＩ、５ａｃｌｒ、ＡｃｃＩ。

Ａｊ！ｕＩ、Ｋｐｎｌ、ＨｉｎｆＩ、Ａｈａｌ［［のい
ずれかまたはその組合せで消化して産生）を取り、電気
溶出で選択し、必要な場合にはＫｌｅｎＯＷＤＮＡポリ
メラーゼ■フラグメントを用いて付着末端をプラント末
端とするものである。ＤＮＡをホスファターゼ処理エン
ドヌクレアーゼ消化クロ−ニングファージとリゲートし
、大腸菌ＪＭ、１０１にトランスフェクトした［　Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、Ｊ、ほか：Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、
９．３０９　（１９８１）　］　、鋳型ＤＮＡは標準操
作によって調製した。可能な場合には常に、各クローン
の両鎖で配列を調べた。

第１図に示した配列は、全Ｃフラグメントと８フラグメ
ントのカルボキシ末端をコードする。両鏡の全配列の翻
訳により、唯一つの読み取り枠が６３　ｋＤの蛋白質を
コードすることが明らかにされた。ヌクレオチド３６７
〜４５７の翻訳により、フラグメントＣの最初の３０個
のアミノ酸と同一のアミノ酸を与えることから、このク
ローンがテタヌストキシンの一部を実際にコードするこ
とが確認された。フラグメントＣのアミノ末端残基はリ
ジンであり、これは１ＩＱｌｔｉｎｌＪの結果［Ｎｅｕ
ｂａｕｃｒ。

Ｖ、、Ｈｅｌｔｉｎｇ、Ｔ、Ｂ、；　ＢｉｏｃｈｅＩｌ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｃｓ、Ｃｏｍｇｉｕｎ。

（１９７７）旦−β、、６３５へ−６４２１と一致した
。

フラグメントＣの分子量の語算値は５１．５６２ダルト
ンであり、本発明者ら自身の測定結果（データは示して
いない）および１ｌｅｌｔｉｎｏ　（１９７７。

前出）の結果とよく一致した。

第４図のテタヌストキシンのＬｍのアミン末端部分をコ
ードするＤＮＡ配列である。四角で囲んだ塩基はリポソ
ーム結合に必要な配列（シャインーダルガルノ）に相当
し、Ｎ末端と考えられるアミノ酸（メチオニン）は塩基
３５によってコードされる。

例６：テタヌストキシン遺伝子の部分の制限酵素地図 プラスミドｐｒｅ　ｔ　１およびｐ’ｒｅｔＢからの破
Ｉｓ風菌ＤＮＡはＨａｎｉａｔｉｓほか［（１９８２）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　］の記載に従って調製し、
その一部を特異的なエンドヌクレアーゼ単独または場合
により二重消化すなわら２種の制限エンドヌクレアーゼ
を用いて処叩した。生成物を０．５μｇ／ＭＩｌのエチ
ジウムプロミドを含むＴｒｉｓ−３ｏｒａｔｅ−ＥＤＴ
Ａ　（ｐｌ＋８．２）中アガロースゲル（０，５％）上
で、長さの既知のＤＮＡフラグメントをサイズマーカー
として平行したトラックに並べて電気泳動を行つた。ク
ローン化ＤＮＡ内からの制限フラグメントのサイズの解
析により制限酵素部位の線状地図の作成が可能であった
。Ｃフラグメントに相当するテタヌス１〜キシン遺伝子
の詳細な地図を第２図に、全遺伝子の簡略な地図を第３
図に示す。

例７：ＴｒｏＥ−テタヌス融合蛋白質 大腸菌ＤＨ１の組換えプラスミド含有株を５０μｇ／Ｉ
ｌｄ！アンピシリン含有Ｍ９メジウム［Ｈａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｔ、ほか（１９８２）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　
］　１０ｄ中３７℃で一夜生育させた。培養液をインド
ールアクリル！ｉ！２（１０μｇ／ｄ）を含む新鮮な培
地で５ｆＦ５に希釈し、４時間＠通しながら生育させた
。細胞を遠心分離によって収穫し、Ｆａｉｒｗａａｔｈ
ｅｒ、Ｎ、　Ｆ、　ホｔｆｉ［１ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ
ｎ、　　（１９８２）　４１．１１１２〜１１１７］の
記載に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、ポリペプチドを可視化した。二ｌ−口セルロース
への非特異的結合を防止するために３％ヘモグロビンを
用い、ウェスタン法を実施した［Ｔｏｗｂ　ｉ　ｎ　、
　ＩＩ　、ほか：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（１９７９）７６；　　４３５０〜４３５４］
。

抗フラグメントＣ１２５抗体を　１１５０に希釈して用
い、蛋白質は　　ｆプロティンＡ　（５０，００Ｑ　ｃ
ｐｍ／ｄ　）を用いて可視化した。

発現した融合蛋白質はｔｒｏＥ生成物（アントラニレー
トシンテターゼ）のアミノ末端残基とテタヌストキシン
のカルボキシ末端残塁からなることが期待される。ｐＴ
ｅｔｌの１．４ｋｂＢｇＪＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン
トをｐＷＲＬ５０７のＢａＪＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にク
ローン化し、ｐＴｅ　ｔ　４を生成させた。テタヌスト
キシン配列を含む融合蛋白質は、ｐＴｅ　ｔ　１および
ｐｗＲｔ−５０７中のＢＱｊ！　ＩＩ部位の相が一致し
ていないので、得られなかった。

同じ読み取り枠で融合蛋白質を生成させるためには２つ
の方法を用いた。

ｆｉｌ　　ｐＴ　ｅ　ｔ　４を［３０ｊ！　［で切断し
、時間を変えてエキソヌクレアーゼＢａｊ！３１で消化
した。

リゲーション、大腸菌Ｄ　＋−１１への形質転換後、１
００個のコロニーを採取し、固相免疫スクリーンにより
、抗フラグメントＣ抗体と反応する誘導蛋白質の存在を
解析した。ｐＴｅｔ６と命名したプラスミドを含む１個
のクローンが、抗体と強く反応するものとして同定され
た（データは示していない）。融合蛋白質は、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、染色バンドとし
てまたウェスタン法により可視化された。融合蛋白質の
サイズ、７０ｋＤは、制限酵素地図の作成（データは示
していない）によって確認された約４００ｂｌ）の欠失
と一致している。ＤＮＡ配列解析により欠失の正確なサ
イズは４００ｂｐであること、融合蛋白質はｔｒｐＥの
ヌクレオチド１６３〜１１８２［Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　
Ｃ，Ｔ　　ほか：　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　（
１９８１〉兄、６６４７〜６６６６ＦおよびテタヌスＤ
ＮＡのヌクレオチド３９９〜１４４６を−１−ドするこ
とが明らかにされた。

［２）ｐＴｅｔ４のＢｇＪＩＩ部位の周囲の相はまたヌ
クレアーゼＳ１を用いて変化させた。Ｓｌは一本鎖ＤＮ
Ａを優先して分解するので、ＢＱｉ■フラグメントの付
着末端を消化してプラント末端を生成させる。ｐＴｅｔ
４のＥ３ａｌ　Ｉｆ部位の周囲の配列を検討したところ
、Ｓ１処理ついでリゲーションによりｔｒｐＥとテタヌ
スの配列は同じ読み取り枠で存在し、ｔｒｐＥ−テタヌ
ス融合蛋白質を生成できることが明らかにされた。ｐＴ
ｅ　ｔ４をＢＯＪＩ［，８１およびＴ４リガーゼで処理
し、これでＤ・Ｈｌを形質転換した。プラスミドｐＴｅ
　ｔ　１０を含みＢＱＩｎｔＡ位を欠く１個の形質転換
体について誘導によるハイブリッド蛋白質の産生を検討
した。９３ｋＤのバンドが生成し、これは族Ｃフラグメ
ント抗体と反応した。ｐＴｅ　ｔ４中のＤＮＡは全Ｃフ
ラグメントをコードせず、３′塩旦を欠いている。全Ｃ
フラグメントをコードするＤＮＡを含む１）Ｔｅ　ｔ　
６Ｊ５よびｐＴｅ　ｔ　ｉＯの誘導体を構築した。これ
らのプラスミド。

ｐＴｅｔｌｌおよびｐＴｅｔ１２もそれぞれ８６および
１０１　ｋＤの交差反応性融合蛋白質を産生じた。これ
らのプラスミドによって産生じた融合蛋白質のサイズは
ヌクレオチド１７２０における終結コドン（第１図参照
）の利用と一致している。

（３）ｐ丁ｅｔ１３は２個のプラスミドｐＸＹ４６０お
よびｐＴ８　ｔ　８から構築した。ＣフラグメントＤＮ
ＡのすべておよびＢフラグメントＤＮＡの切片を含む３
．２ｋｂ　　ＢｑｉＩ［フラグメントをｐＴｅｔ８から
調製し、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで切断したＤＸＹ４６０にリ
ゲートした。リゲーション混合物を大１ｔ！！ｒＡＴＧ
１に導入して形質転換し、組換えプラスミドを含む株に
ついてυ１限醇素消化で解析した。ｐＸＹ６４０中に正
しい方向で挿入された３、２ｋｂ　　Ｆ３ａｌ■フラグ
メン１−を含有し、予想されるサイズ（６３ｋＤ）の、
抗Ｃフラグメント血清と反応する蛋白質を発現する１個
のプラスミドを選択し、ｐＴｅ　ｔ　１３と命名した。

（４）　　ρ７ｅｔｉ６は次のようにして構築した。

ｐＴｅｔ８からの３．２ｋｂ　　Ｂｇｊ！ＩＩ’７ラグ
メン１へを精製し、ＳＳρ１およびＥｃｏＲＩで消化し
た。生成したフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したプ
ラスミドｐＵｃ９にリゲートした。リゲーション生成物
を大腸菌−ｒＧｌに導入して形質転換し、テタヌストキ
シン遺伝子の３′末端を含むＥｃｏＲＩ−８ｓρ■フラ
グメント含有ｐＵｃ９組換体を制限ＭｌｉｆＩ消化で同
定した。これらのひとつを選択し、ＤＴｅ　ｔ　１５と
命名した。

ｆ５）　　ｐＴ　ｅ　ｔ　１８は、ＤＴｅｔ１３をＫＤ
ｎＩおよびＳａｊ！Ｉで切断し、このフラグメント混合
物を、ｐ丁ｅｔ１６からの精製３２０ｂＤ　　ＫｐｎＩ
−３ａｊ！Ｉフラグメントにリゲートして構築した。リ
ゲーション生成物を大腸菌ＴＧＩに導入して形質転換し
、組換えプラスミドを１Ｉ１１限ｆ？ｆ素消化および発
現蛋白質と抗Ｃフラグメント血清との反応によって同定
した。テタヌストキシンＣフラグメントＤＮＡの大部分
を含むｐＴｅ　ｔ　１３のＫｐｎＩ−３ａｉＩ７ラグメ
ントとｐＴｅ　ｔ　１６からの３２００ｂｐ　　Ｋｐｎ
Ｉ−８ａｊ！Ｉフラグメントからなる組換えプラスミド
を選択し、ｐＴｅ　ｔ　１８と命名した。

例８：マウスの保護実験 大腸菌内で合成されたクローン化ＤＮＡ生成物が致死量
のテタヌストキシンからマウスを保護する能力を試験す
るために、２種の組換えプラスミドを用いた。

（１１ｏＴｅｔｌｌ（例７）は大腸菌ｔｒｌ）Ｅ残基と
テタヌストキシン残括かうなる融合蛋白質を産生ずる。

この蛋白質中には最初の１０個の残りを除く全フラグメ
ントＣが存在する。

（２１Ｄ　Ｔ　ｅ　ｔ　１８　（例７）はフラグメント
Ｂの部分と全７ラグメントＣを成熟蛋白質として発現す
る。これは長鎖の宿主蛋白質と融合してはいない。

（２）　蛋白質の精製 ｐＴｅｔｌｌおよびＤＴｅ　ｔ　ｉ　８によって産生す
る蛋白質の精製に際しては、これらが別のプロモーター
、すなわちそれぞれｔｒｐおよびｔａｃによって制御さ
れているの−で、異なる操作を使用する。

（１１ｐＴｅｔｌｌ　：ＤＴｅｔ１１含有大腸菌０）−
（１の一夜培養液をＭ９メジウム２００１＋１！中で生
育させた。−夜生育させたのち、さらに新鮮なメジウム
８００ｄを５ｊ２！ＪのＩＡＡ（インドリルアクリル酸
）とともに加えた。生育は４時１に続げた。

＋２１　　ｐＴ　ｅ　ｔ　１８　：大腸菌ＨＢ１０１の
一夜培養液をし培地１００ｄ中で生育させた。−夜生台
させたのち、培地９００ｄをさらに加え、５時間生育さ
せた。

両者の精製の以下の操作は次のとおりである。

ｗＩ朧を遠心分離しく６，０００ｒｐｍ　、１０分）、
ベレットを４℃で一夜保存した。

ベレットを室温で解凍し、ついで水上に置いた。

総容ｆｔ１１６ａｅの溶液Ｉ（２５＋ａＨＴｒｉｓ−）
−ＩＣＪ！　　ｐＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡ、０．２％
ＮＰ４０．１■ＨＰＭＳＦ）に再懸濁し、さらにライレ
ザイム２０醇を含有する溶液■４７！を加え、混合物を
氷上に２時間放置した。

１Ｍ硫酸マグネシウム２０μｌおよび１Ｒｇ／１ａｌｌ
ＤＮアーゼ４００μｌを加え、混合物をさらに２時間氷
上に放置した。ついで細砲を、４℃、１３゜０００　ｒ
ｐ−で１０分間遠心分離してペレット化し、上澄液（Ｓ
ｌ）を−２０℃で保存した。不溶性のベレットを５０ｍ
ＨＴｒ　ｉ　ｓ　　ｐＨ８，０，５ｍＨＥＤＴＡ、５ｍ
ＨＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０．ＨｇＨＰＭＳＦ　　２Ｏｄ
中に再懸濁し、上記と同様に遠心分離した。上澄液（Ｓ
２）を−２０℃で保存した。２回目の遠心後に（ｑられ
たベレット（ＦＰ２と呼ぶ）を０．８５％食塩水２０ｄ
に再懸濁し、４℃で一夜透析した。

透析物質（ＦＰ２）は−２０℃に凍結した。

ウェスタン法による解析で、この操作により破傷風菌に
特異的なバンドが増強されることが明らかになった。

０　マウスの保護 マウスを、次のように調製したＦＰ２１白質で免疫処置
した。

品用ｆｆｉ：ｔｒｐＥ、ＤＴｅｔｌｌおよびＤＴｅ　ｔ
　ｌ　ＢからのＦＰ２蛋白質１０ｄを遠心分離し、ベレ
ットを１．６ｄの食塩水に再懸濁した。

低用ｆｆｉ：２ｄのＦＰ２蛋白質を遠心分離し、１．６
ｄの食塩水に再懸濁した。

以下のようにＴｗｅｅｎ８０および７０インドの完全ア
ジュバントを加えた。

１．６ｄ　　ベレット ０．４ｄ１０％Ｔｗｅｅｎ　　　８０ ２．０ｄ　　フロイント完全アジュバント４．０Ｍ！ １群５匹の（Ｂ　ａ　１　ｂ／ｃ　）　ｖ’７スニ、上
述の蛋白質／アジュバント混合物０．２戒を皮下注射し
た。５週侵に第２回目の注射し、マウスに約１００ＬＤ
５．　　ｆｔ１Ｍテタヌスト主シンを与えた。

対照マウスには、ｔｒｐＥ蛋白質、デタヌス１ヘキシン
Ｃフラグメントを注射するか、または全く免疫処置を行
わなかった。結果を第２表に示ず。

ＤＴｅｔ　　１８　　　　　　　　　　高　　（１２５
）　　　　　　　５１５ｐＴｅｔ　　１８　　　　　　
　　　　低　　　（２５）　　　　　　　５１５ｐＴｅ
ｔ　　１１　　　　　　　　　　高　　（１２５）　　
　　　　　５１５ｐｒｅｔ　　１１　　　　　　　　　
　低　　　（２５）　　　　　　５１５Ｔｒｐ［高　（
１２５）　　　　０１５ＴｒｐＥ　　　　　　　　　　
　　低　　　（２５）　　　　　　　０１５Ｃフラグメ
ント　　？？？　　（５）　　　　５１５処置なし　　
　　　　　　　　　　　Ｏ１５例９：処方 （２）　破傷風／ジフテリア／百日咳配合膜腔内注射液 ０．５ｄ中 ２５　Ｌ　ｆ　　　　　　ジフテリア毒素３．５Ｌｆ　
　　　クローン化テタヌストキシン（蛋白質１０μｇ） ２　Ｘ　１０９Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　＠胞２０％　
　　　　　アルヒドロゲル ０．０５ｙ　　　　チメＯ号−ル 滅菌水　　　　　　適ｍ （ｃ）　ジフテリア／破Ｉｎ風腹腔内注射液上述の処方
からｐｅｒｔｕｓｓ＊ｓを除くほかは同様にして調製す
る。

（ｃ）　破傷風用注射液 ０、５ａｄ！中 ７Ｕｆ　　　　　　クローン化テタヌストキシン（蛋白
質２０１１ｇ＞ １５％　　　　　　アルヒドロゲル ０．０５１１１ｇ　　　　チメロサール滅菌水　　　　
　　適量 例１０：毒性データ ネ溶性融合蛋白質を遠心分離し、８Ｍ尿素０．４ｄに再
懸濁して、皮下２１射した。

２匹のマウスに各１ｄ投与（蛋白質２５０μｇ）２匹の
マウスに各５ｄ投与（蛋白質１２５０μｇ） ２匹のマウスに対照として８Ｍ尿素０．４ａｆ！を投与 死亡したマウスはなかった。

品用隋は、破傷風に対する有効な免疫を誘導するのに必
要な量の少なくとも５０倍以上である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、破Ｉ３風１１１ｉＤＮＡのＰＡ基配列および
相当するアミノ酸配列を示す。 第２図は、テタヌストキシン遺伝子の部分の制限エンド
ヌクレアービおよび一部のクローンの相対位置を示す図
である。 第３図は、全テタヌストキシン遺伝子の簡単な制限Ｍ素
地図である。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）テタヌストキシンまたはその少なくとも１個のエ
   ピトープからなるペプチドをコードするクローン化ＤＮ
   Ａ配列
2. （２）テタヌストキシンのＢもしくはＣフラグメントま
   たはその少なくとも１個のエピトープをコードする特許
   請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列
3. （３）テタヌストキシンのＨ鎖もしくはＬ鎖またはその
   少なくとも１個のエピトープをコードする特許請求の範
   囲第１項記載のＤＮＡ配列
4. （４）第１図と第４図のいずれかに記載の配列と少なく
   とも５０％のホモロジーを示す特許請求の範囲第１項記
   載のＤＮＡ配列
5. （５）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
   に記載のＤＮＡ配列を含有するベクター
6. （６）そのベクターの宿主細胞により翻訳可能な遺伝子
   のアミノ末端コード部分に双頭結合させた特許請求の範
   囲第５項記載の発現ベクター
7. （７）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
   に記載のＤＮＡ配列を含み、そのベクターの宿主細胞中
   で翻訳可能な遺伝子からなり、宿主中での発現に際し上
   記遺伝子のカルボキシ末端部分から上記ＤＮＡ配列まで
   を正しく翻訳して上記遺伝子がコードする蛋白質に融合
   したテタヌストキシンの少なくとも一部分からなる蛋白
   質またはその少なくとも１個のエピトープからなるペプ
   チドを産生するように配列された発現ベクター
8. （８）さらに１個または２個以上の制御配列を含有する
   特許請求の範囲第５項から第７項までのいずれかに記載
   のベクター
9. （９）（ａ）破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅ
   ｔａｎｉ）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ
   ーを作成し、 （ｂ）テタヌストキシンＤＮＡのプローブを選択し、そ
   のプローブに放射活性を付与し、（ｃ）上記プローブを
   用いて上記ライブラリーの１個または２個以上のメンバ
   ーを選択し、 （ｄ）このようにして上記ライブラリーから選択された
   ＤＮＡを用いて適当な宿主を形質転換してテタヌストキ
   シンまたはその少なくとも１個のエピトープを含有する
   ペプチドを発現させる各工程からなる、テタヌストキシ
   ンの少なくとも一部分もしくはその少なくとも１個のエ
   ピトープからなるペプチド、または他のペプチド配列と
   共有結合した上記テタヌストキシンもしくはペプチドの
   合成方法
10. （１０）宿主細胞を特許請求の範囲第５項から第８項ま
    でのいずれかに記載のクローニングベクターで形質転換
    し、この宿主細胞を培養してテタヌストキシンまたはそ
    の少なくとも１個のエピトープを含有するペプチドを発
    現させる、上記テタヌストキシンまたはペプチドの合成
    方法
11. （１１）テタヌストキシンの少なくとも１個のエピトー
    プからなる合成ペプチド
12. （１２）特許請求の範囲第９項および第１０項のいずれ
    かに記載の方法で得られたテタヌストキシン蛋白質また
    はその少なくとも１個のエピトープからなるペプチド
13. （１３）宿主ペプチドのアミノ末端部分と、テタヌスト
    キシンの少なくとも１個のエピトープを提供するカルボ
    キシ末端部分からなる融合ペプチド
14. （１４）特許請求の範囲第９項および第１０項のいずれ
    かに記載の方法で得られたテタヌストキシンまたはその
    少なくとも１個のエピトープからなるペプチドを医薬的
    に許容される担体と配合した、破傷風に対する免疫を誘
    発可能なワクチン
15. （１５）特許請求の範囲第９項および第１０項のいずれ
    かに記載の方法で得られたＢフラグメント、Ｃフラグメ
    ント、Ｌ鎖、Ｈ鎖もしくはそのトキシンまたはそれらに
    実質的に相当するペプチドの１種または２種以上からな
    る特許請求の範囲第１４項記載のワクチン
16. （１６）特許請求の範囲第１４項および第１５項のいず
    れかに記載のワクチンの有効量を破傷風菌への感染が疑
    われる脊椎動物宿主に投与する破傷風に対する免疫の誘
    発方法