JPS6119490A - 原虫類抗原用ｄｎａのクロ−ニング - Google Patents
原虫類抗原用ｄｎａのクロ−ニングInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、マラリヤワクチン用抗原ペプチドの提供に使
用できるプラスモジウム（ＰＩａＳＩＯｄ＋ｔｌｌｌｌ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｎ＋）のクローンＤＮＡ配列および
その断片に関する。
用できるプラスモジウム（ＰＩａＳＩＯｄ＋ｔｌｌｌｌ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｎ＋）のクローンＤＮＡ配列および
その断片に関する。
全第三世界における保健問題として、マラリヤの重要性
はますます増大しつつある。数億の人々がこの病気に罹
っていて、原虫類プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｉ ）の寄生によって起こる最
も急性の病型ではアフリカだけで百方Å以上の小児が死
亡している。この寄生虫の血流中における無性増殖に対
する効采的な免疫によればこの疾患を予防できる。侵入
型の分裂小体に対する有効な免疫応答によって赤血球の
再侵入を防止すればこのサイクルが遮断される。
はますます増大しつつある。数億の人々がこの病気に罹
っていて、原虫類プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｉ ）の寄生によって起こる最
も急性の病型ではアフリカだけで百方Å以上の小児が死
亡している。この寄生虫の血流中における無性増殖に対
する効采的な免疫によればこの疾患を予防できる。侵入
型の分裂小体に対する有効な免疫応答によって赤血球の
再侵入を防止すればこのサイクルが遮断される。
けつ歯類のマラリヤモデルにおいて、成熟赤血球内型分
裂前体中で合成され、分裂小体の表面上に表現された蛋
白抗原が精製でき、この抗原によるワクチン化でプラス
モジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ匹１ｕ）に対する保護
免疫を生じることが明らかにされている〔ホルダーはか
（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、 ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ
，Ｒ，） ：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９４ニー
３６１〜３６４（１９８１））。この抗原は、見かけの
分子量（ＭＷ）２３０．０００で、ｉｎ ｖｉｖｏで蛋
白分解プロセッシングを受けて、この抗原の分離断片が
分裂小体表面に存在する（ホルタ−はか（Ｈｏｌｄｅｒ
＆ Ｆｒｅｅｍａｎ） 、１９８１ 、前出：ホルダ
ーほか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、 ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ。
裂前体中で合成され、分裂小体の表面上に表現された蛋
白抗原が精製でき、この抗原によるワクチン化でプラス
モジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ匹１ｕ）に対する保護
免疫を生じることが明らかにされている〔ホルダーはか
（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、 ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ
，Ｒ，） ：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９４ニー
３６１〜３６４（１９８１））。この抗原は、見かけの
分子量（ＭＷ）２３０．０００で、ｉｎ ｖｉｖｏで蛋
白分解プロセッシングを受けて、この抗原の分離断片が
分裂小体表面に存在する（ホルタ−はか（Ｈｏｌｄｅｒ
＆ Ｆｒｅｅｍａｎ） 、１９８１ 、前出：ホルダ
ーほか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、 ＆ Ｆｒｅｅｍａ
ｎ。
Ｒ，Ｒ，） ：パラシトロジー（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ
ｇｙ） 、隻８ ：２１１〜２１９ （１９８４ａ））
。
ｇｙ） 、隻８ ：２１１〜２１９ （１９８４ａ））
。
「分子量」の語は、ドデシル硫酸ナトリウムと標準分子
量マーカーの存在下にポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって測定された見かけの相対的分子量を意味する。
量マーカーの存在下にポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって測定された見かけの相対的分子量を意味する。
本発明の抗原蛋白質の分子量は、したがッテ、レムリ（
Ｉｌ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ ） （ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ） 、２２７ ： ６８０〜６８５（１９７０
））によって報告された方法によって測定するのが好都
合である。便利な標準分子量マーカーとしては、たとえ
ば、スペクトリンヘテロダイマー（２，２Ｘ １０５Ｍ
Ｗ） 、β−ガラクトシ’ｊ−セ（１，６Ｘ １０５Ｍ
Ｗ） 、ホス＊’Ｊラーセｂ（９，３Ｘ １０４８１４
） 、ウシ血清アルブミン（６，８Ｘ １０４８１４）
、アルドラーゼ（３，９Ｘ１０４ＨＷ）、ｔ−リオー
スホスフエートイソメラーゼ＜２．７Ｘ１０４Ｈ旧およ
びリゾチーム（１，５Ｘ１０’ＨＷ）がある。
Ｉｌ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ ） （ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ） 、２２７ ： ６８０〜６８５（１９７０
））によって報告された方法によって測定するのが好都
合である。便利な標準分子量マーカーとしては、たとえ
ば、スペクトリンヘテロダイマー（２，２Ｘ １０５Ｍ
Ｗ） 、β−ガラクトシ’ｊ−セ（１，６Ｘ １０５Ｍ
Ｗ） 、ホス＊’Ｊラーセｂ（９，３Ｘ １０４８１４
） 、ウシ血清アルブミン（６，８Ｘ １０４８１４）
、アルドラーゼ（３，９Ｘ１０４ＨＷ）、ｔ−リオー
スホスフエートイソメラーゼ＜２．７Ｘ１０４Ｈ旧およ
びリゾチーム（１，５Ｘ１０’ＨＷ）がある。
マウスのワクチン化に、この蛋白質を用いた場合、保護
効果はアジュバント依存性で、細胞仲介エフェクター経
路によって与えられるものと思われる（フリーマンほか
（Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ，’Ｒ，＆ Ｈｏ１ｄｅｒ。
効果はアジュバント依存性で、細胞仲介エフェクター経
路によって与えられるものと思われる（フリーマンほか
（Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ，’Ｒ，＆ Ｈｏ１ｄｅｒ。
Ａ、Ａ、） ：クリニカル・エクスペリメンタル・イミ
′ユノロジー（ＣＩｉｎ、 Ｅｘｐ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、 ） 、５４ ：６０９〜６１６ （１９８３ａ）
）、しかし、この蛋白質に対するモノクロナール抗体は
マウスに受動免疫を付与することが示されている〔ンジ
ャリアムはか（Ｈａｊａｒｉａｍ、 Ｗ、Ｒ，ｅｔ ａ
ｔ） ：ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、［ｍ
ｍｕｎＯｌ、） 、１３２ ：３１３１〜３１３７ （
１９８４））。
′ユノロジー（ＣＩｉｎ、 Ｅｘｐ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、 ） 、５４ ：６０９〜６１６ （１９８３ａ）
）、しかし、この蛋白質に対するモノクロナール抗体は
マウスに受動免疫を付与することが示されている〔ンジ
ャリアムはか（Ｈａｊａｒｉａｍ、 Ｗ、Ｒ，ｅｔ ａ
ｔ） ：ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、［ｍ
ｍｕｎＯｌ、） 、１３２ ：３１３１〜３１３７ （
１９８４））。
類似の蛋白質抗原が、他のプラス王ジウム属についても
報告されている。プラスモジウム（Ｐ、ｙｏｅｌｉｉ）
の２３０，０ＯＯＨＷ精製抗原に対して産生じた多価抗
血清は、試験した他のすべてのプラスモジウム属の血液
段階型と免疫蛍光により交差反応を示した〔ホルダーは
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｍａｎ ） ＋ １９８
４８、前出〕。プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｃｈａｂａｕｄｉ ）においては、抗原はウェスター
ン法によって２５０．０００８−の共通抗原として同定
され、これも同様にプロセッシングを受ける（ホルダー
ほか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、ｅｔ ａｔ） ：モル
キュジー・アンド・バイオケミカル、・パラシトロジー
（Ｈｏｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）
、９ ：１９１〜１９６ （１９８３））。２５０．
０００ＨＩＩ４のプラスモジウム（ＰＩａｓａ＋ｏｄｉ
ｕｇｉ ｃｈａｂａｕｄｉ ）蛋白質に特異的なモノク
ロナール抗体は、マウスにおいてプラスモジウム（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ ）のチャレンジ
に受動免疫を付与することが明らかにされた〔ボイルほ
か（Ｂｏｙｌｅ、 Ｄ、Ｂ、 ｅｔ ａｔ ） ：イン
フエクション・アンド・イミユニティ−（Ｉｎｆｅｃｔ
、 Ｉｍｍｕｎ、） 、３８ ： ９４〜１０２（１９
８２））、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎ
ｏｗｌｅｓｉ＞の２３０．０ＯＯＮ！ｌｌ蛋白質に対す
るモノクロプール抗体は分裂小体を凝集させ、したがっ
てｉｎ ＶｉｔｒＯにおいて赤血球の寄生虫侵入を阻止
し〔ニブシュタインほか（Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ｎ、ｅｔ
ａｌ） ：ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、
Ｉｇ＋ｍｕｎｏ１． ）、１２７：２１２〜２１７ （
１９８１））、このプラスモジウム（Ｐｌａｓｉｏｄｉ
ｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ ）の蛋白質はｉｎ ｖｉｖｏ
においてプロセッシングを受け、分裂小体の表面上に表
現される一連の断片を生成する（デビットはか（Ｄａｖ
ｉｄ ｅｔ ａｌ ） ：モルキュジー・アンド・バイ
オケミカル・パラシトロジー（Ｍｏ１． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、） 、エユ：２６７〜２８
２ （１９８４））。
報告されている。プラスモジウム（Ｐ、ｙｏｅｌｉｉ）
の２３０，０ＯＯＨＷ精製抗原に対して産生じた多価抗
血清は、試験した他のすべてのプラスモジウム属の血液
段階型と免疫蛍光により交差反応を示した〔ホルダーは
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｍａｎ ） ＋ １９８
４８、前出〕。プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｃｈａｂａｕｄｉ ）においては、抗原はウェスター
ン法によって２５０．０００８−の共通抗原として同定
され、これも同様にプロセッシングを受ける（ホルダー
ほか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ、Ａ、ｅｔ ａｔ） ：モル
キュジー・アンド・バイオケミカル、・パラシトロジー
（Ｈｏｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）
、９ ：１９１〜１９６ （１９８３））。２５０．
０００ＨＩＩ４のプラスモジウム（ＰＩａｓａ＋ｏｄｉ
ｕｇｉ ｃｈａｂａｕｄｉ ）蛋白質に特異的なモノク
ロナール抗体は、マウスにおいてプラスモジウム（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ ）のチャレンジ
に受動免疫を付与することが明らかにされた〔ボイルほ
か（Ｂｏｙｌｅ、 Ｄ、Ｂ、 ｅｔ ａｔ ） ：イン
フエクション・アンド・イミユニティ−（Ｉｎｆｅｃｔ
、 Ｉｍｍｕｎ、） 、３８ ： ９４〜１０２（１９
８２））、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎ
ｏｗｌｅｓｉ＞の２３０．０ＯＯＮ！ｌｌ蛋白質に対す
るモノクロプール抗体は分裂小体を凝集させ、したがっ
てｉｎ ＶｉｔｒＯにおいて赤血球の寄生虫侵入を阻止
し〔ニブシュタインほか（Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ｎ、ｅｔ
ａｌ） ：ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、
Ｉｇ＋ｍｕｎｏ１． ）、１２７：２１２〜２１７ （
１９８１））、このプラスモジウム（Ｐｌａｓｉｏｄｉ
ｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ ）の蛋白質はｉｎ ｖｉｖｏ
においてプロセッシングを受け、分裂小体の表面上に表
現される一連の断片を生成する（デビットはか（Ｄａｖ
ｉｄ ｅｔ ａｌ ） ：モルキュジー・アンド・バイ
オケミカル・パラシトロジー（Ｍｏ１． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、） 、エユ：２６７〜２８
２ （１９８４））。
プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ａｒｕｍ ）において、プラスモジウム（Ｐ、ｙｏｅｌ
ｉｉ）の２３０．０００８Ｗ蛋白質に対する多価抗血清
は１９５．０００１慴抗原（以下Ｐ、１９５蛋白質と呼
ぶ）と交差反応した〔ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ｅ
ｔａｌ）：前出（１９８３ａ））。糖蛋白質と考えられ
るこの抗原〔ハワードほか（Ｈｏｗａｒｄ、 Ｒ，Ｊ、
ｅｔａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル
・パラシトロジー（Ｍｏ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐａ
ｒａｓｉｔｏｌ、）、１１：３°４９〜３６２ （１９
８４））の生合成は、寄生虫の分裂前体内で起こり、赤
面球内段階の末期に抗原は蛋白分解プロセッシングを受
けて分離した断片を生じる〔ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅ
ｒ、 Ａ、Ａ。
ａｒｕｍ ）において、プラスモジウム（Ｐ、ｙｏｅｌ
ｉｉ）の２３０．０００８Ｗ蛋白質に対する多価抗血清
は１９５．０００１慴抗原（以下Ｐ、１９５蛋白質と呼
ぶ）と交差反応した〔ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ｅ
ｔａｌ）：前出（１９８３ａ））。糖蛋白質と考えられ
るこの抗原〔ハワードほか（Ｈｏｗａｒｄ、 Ｒ，Ｊ、
ｅｔａｌ）：モルキュラー・アンド・バイオケミカル
・パラシトロジー（Ｍｏ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐａ
ｒａｓｉｔｏｌ、）、１１：３°４９〜３６２ （１９
８４））の生合成は、寄生虫の分裂前体内で起こり、赤
面球内段階の末期に抗原は蛋白分解プロセッシングを受
けて分離した断片を生じる〔ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅ
ｒ、 Ａ、Ａ。
＆ Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ，Ｒ，） ：ジャーナル・オ
フ・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ、
Ｈｅｄ、 ）、１５６：１５２８〜１５３８ （１９８
２）；ホールほか（Ｈａｌｌ、 Ｒ，ｅｔ ａｌ） ：
モルキュジー・アンド・バイオケミカル・パラシトロ
ジー（Ｈｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
、 ）エユ：６１〜８０（１９８４ａ））。分裂小体の
表面に（鼻血球内段階の末期に血清中に放出され）、蛋
白質は完全なプロセッシングを受け、分子量約８３，０
００、’４２．０００および１９，０００の３種の分離
したＰ、１９５断片が存在する。これらの３種の断片が
分裂小体の主要な表面抗原で、ヒト免疫血清によって強
力に認識される［ツリーマンはか（Ｆｒｅｅｍａｎ、
Ｒ，Ｒ，＆ Ｈｏ１ｄｅｒ、 Ａ、Ａ、） ：ジャーナ
ル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｈｅｄ、） 、１５８ ： １６４７〜１６５
３（１９８３ｂ）；ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ
、Ａ、 ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ，Ｒ，） ：ジャーナ
ル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｈｅｄ、）、１６０ ： ６２４〜６２９ （
１９８４ｂ））。
フ・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ、
Ｈｅｄ、 ）、１５６：１５２８〜１５３８ （１９８
２）；ホールほか（Ｈａｌｌ、 Ｒ，ｅｔ ａｌ） ：
モルキュジー・アンド・バイオケミカル・パラシトロ
ジー（Ｈｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
、 ）エユ：６１〜８０（１９８４ａ））。分裂小体の
表面に（鼻血球内段階の末期に血清中に放出され）、蛋
白質は完全なプロセッシングを受け、分子量約８３，０
００、’４２．０００および１９，０００の３種の分離
したＰ、１９５断片が存在する。これらの３種の断片が
分裂小体の主要な表面抗原で、ヒト免疫血清によって強
力に認識される［ツリーマンはか（Ｆｒｅｅｍａｎ、
Ｒ，Ｒ，＆ Ｈｏ１ｄｅｒ、 Ａ、Ａ、） ：ジャーナ
ル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｈｅｄ、） 、１５８ ： １６４７〜１６５
３（１９８３ｂ）；ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ、 Ａ
、Ａ、 ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、 Ｒ，Ｒ，） ：ジャーナ
ル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｈｅｄ、）、１６０ ： ６２４〜６２９ （
１９８４ｂ））。
７ 本明細書において使用されるｒＰ、１９５Ｊの詔は
、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕ、ａ＋ ）の赤血球分裂前体中に存在する分子
量１．８〜２．３Ｘ１０５の蛋白質であって、ｉｎ ｖ
ｉｖｏにおいてプロセッシングを受けて分子量約８．３
×１０ ．４．２Ｘ１０’および１．９Ｘ１０’の分離
断片を生じ、寄生虫の分裂小体の表面膜と会合している
。
、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕ、ａ＋ ）の赤血球分裂前体中に存在する分子
量１．８〜２．３Ｘ１０５の蛋白質であって、ｉｎ ｖ
ｉｖｏにおいてプロセッシングを受けて分子量約８．３
×１０ ．４．２Ｘ１０’および１．９Ｘ１０’の分離
断片を生じ、寄生虫の分裂小体の表面膜と会合している
。
プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａＬｃｉ
ａｒｕｍ ）Ｐ、１９５内には、特異的モノクロナール
抗体の結合度または見かけの分゛子量のわずかな差によ
って検知される構造上のある種の多形現象が存在すると
も思われる〔マツクブライドほか（ＨｃＢｒｉｄｅ。
ａｒｕｍ ）Ｐ、１９５内には、特異的モノクロナール
抗体の結合度または見かけの分゛子量のわずかな差によ
って検知される構造上のある種の多形現象が存在すると
も思われる〔マツクブライドほか（ＨｃＢｒｉｄｅ。
Ｊ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ） ：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ） 、２１７ ：２５４〜２５７ （１９８２）；
マツクプライドはか（ＨｃＢｒｉｄｅ、 Ｊ、Ｓ、 ｅ
ｔ ａｌ ） ： ｔ−ソングアクション・オフ・ザ・
ロイアル・ソサイアテイー・オフ・トロピカル・メデイ
シン・アンド・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ、 Ｒｏｙ、
Ｓｏｃ、 Ｔｒｏｐ、 Ｈｅｄ、 １ｌｙｏ
、） 、７旦＝３２〜３４ （１９８４）；ホールほか
（）ｔａｌｌ、Ｒｌｅｔ ａｌ ） ：前出（１９８４
ａ））。しかしながら、これらの抗原が対応抗原であっ
て、特定の抗原決定基に認められる差は動物における広
い意味での免疫応答には重要でないことは、本技術分野
における熟練者には自明のとおりである。Ｐ、１９５で
免疫処置されたセイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ ）サルはチ
ャレンジ感染に対して保護されることが示されている（
ベリンほか（Ｐｅｒｒｉｎ、 Ｌ、Ｈ，ｅｔ ａｔ）
：ジャーナル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン
（Ｊ、 ｔＸｐ、 Ｒｅｄ、） 、 １６０ ： ４４
１〜４５１（１９８４）：ホー／Ｌ、 ホか（Ｈａｌｌ
、 Ｒ，ｅｔ ａｌ） ：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、３１１．３７９〜３８２（１９８４ｂ））。
ｅ ） 、２１７ ：２５４〜２５７ （１９８２）；
マツクプライドはか（ＨｃＢｒｉｄｅ、 Ｊ、Ｓ、 ｅ
ｔ ａｌ ） ： ｔ−ソングアクション・オフ・ザ・
ロイアル・ソサイアテイー・オフ・トロピカル・メデイ
シン・アンド・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ、 Ｒｏｙ、
Ｓｏｃ、 Ｔｒｏｐ、 Ｈｅｄ、 １ｌｙｏ
、） 、７旦＝３２〜３４ （１９８４）；ホールほか
（）ｔａｌｌ、Ｒｌｅｔ ａｌ ） ：前出（１９８４
ａ））。しかしながら、これらの抗原が対応抗原であっ
て、特定の抗原決定基に認められる差は動物における広
い意味での免疫応答には重要でないことは、本技術分野
における熟練者には自明のとおりである。Ｐ、１９５で
免疫処置されたセイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ ）サルはチ
ャレンジ感染に対して保護されることが示されている（
ベリンほか（Ｐｅｒｒｉｎ、 Ｌ、Ｈ，ｅｔ ａｔ）
：ジャーナル・オフ・エクスベリメンタル・メデイシン
（Ｊ、 ｔＸｐ、 Ｒｅｄ、） 、 １６０ ： ４４
１〜４５１（１９８４）：ホー／Ｌ、 ホか（Ｈａｌｌ
、 Ｒ，ｅｔ ａｌ） ：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、３１１．３７９〜３８２（１９８４ｂ））。
本明細書に用いる「エピトープ」の語は、免疫原性分子
の抗原性決定基を意味し、抗原性決定基は適当な形で存
在する場合、感受性動物に保護的免疫応答を引き出すこ
とができる分子立体配置からなる。
の抗原性決定基を意味し、抗原性決定基は適当な形で存
在する場合、感受性動物に保護的免疫応答を引き出すこ
とができる分子立体配置からなる。
Ｐ、１９５は対立遺伝子変異を受けやすく、プラスモジ
ウム（ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＋＋ ）の異なる株
では異なる形の蛋白質を表現する場合もあるが、どの株
から得られたＰ、１９５も実質的に類似のものであるこ
とも明らかである。
ウム（ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＋＋ ）の異なる株
では異なる形の蛋白質を表現する場合もあるが、どの株
から得られたＰ、１９５も実質的に類似のものであるこ
とも明らかである。
本明細書に記載のプラスモジウム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋ ）株からのＰ、１９
５遺伝子をサイソング（Ｔｈａｉｔｈｏｎｏ、 Ｓ、
）らによッテ単離された株からの相当する遺伝子〔サイ
ソングはか（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ
） ： トランズアクション・オフ・ザ・ロイアル・
ソサイアテイ・オフ・トロピカル・メデイシン・アンド
・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ、 Ｒｏｙ、 Ｓｏｃ、 Ｔ
ｒｏｐ、 ＨＣｄ、 ｆｌｙ（１，） 、７８ ：２４
２〜２４５ （１９８４））とサザン法で比較したとこ
ろ、核酸ハイブリダイゼーション〔シュバルツ（Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚ、 Ｒ，Ｔ、） ）によって検出できる構造
多形現象を示した。
５遺伝子をサイソング（Ｔｈａｉｔｈｏｎｏ、 Ｓ、
）らによッテ単離された株からの相当する遺伝子〔サイ
ソングはか（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ
） ： トランズアクション・オフ・ザ・ロイアル・
ソサイアテイ・オフ・トロピカル・メデイシン・アンド
・ハイジーン（Ｔｒａｎｓ、 Ｒｏｙ、 Ｓｏｃ、 Ｔ
ｒｏｐ、 ＨＣｄ、 ｆｌｙ（１，） 、７８ ：２４
２〜２４５ （１９８４））とサザン法で比較したとこ
ろ、核酸ハイブリダイゼーション〔シュバルツ（Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚ、 Ｒ，Ｔ、） ）によって検出できる構造
多形現象を示した。
以上略述した理由により、プラスモジウム（Ｐ、 ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ ） Ｐ、 １９５またはその抗原性
断片は血液段階マラリヤのワクチンとして利用価値があ
るものと考えられる。
ｌｃｉｐａｒｕｍ ） Ｐ、 １９５またはその抗原性
断片は血液段階マラリヤのワクチンとして利用価値があ
るものと考えられる。
ｉｎ ｖｉｖｏで産生され、分裂小体表面上に存在する
この蛋白質またはその抗原性断片を大量かつ比較的純粋
に得るためには、プラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕａ ）におけるこの蛋白質の表現をコードする遺
伝子のＤＮＡ配列を同定することが望まれる。この配列
を同定したのち、この配列を適当なベクターにクローニ
ングし適当な宿主中に表現させるか、あるいは同定した
配列に相当するアミノ酸配列を化学的に合成することに
より、蛋白質分子の免疫的に有効な部分を再生すること
が望ましい。
この蛋白質またはその抗原性断片を大量かつ比較的純粋
に得るためには、プラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕａ ）におけるこの蛋白質の表現をコードする遺
伝子のＤＮＡ配列を同定することが望まれる。この配列
を同定したのち、この配列を適当なベクターにクローニ
ングし適当な宿主中に表現させるか、あるいは同定した
配列に相当するアミノ酸配列を化学的に合成することに
より、蛋白質分子の免疫的に有効な部分を再生すること
が望ましい。
本発明は、上述のプラスモジウム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）からの抗原（Ｐ、１
９５）をコードするＤＮＡをクローニングすることが可
能で、このクローンＤＮＡを、その抗原またはその少な
くとも１個のエピトープを含むペプチドを適当な宿主中
で表現可能な適当なベクター中に導入することによって
、機能抗原またはその断片が得られることを発見し、完
成されたものである。
９５）をコードするＤＮＡをクローニングすることが可
能で、このクローンＤＮＡを、その抗原またはその少な
くとも１個のエピトープを含むペプチドを適当な宿主中
で表現可能な適当なベクター中に導入することによって
、機能抗原またはその断片が得られることを発見し、完
成されたものである。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明はプラスモ
ジウム（ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）のＰ、１９５
蛋白質、またはその少なくとも１個のエピトープを含む
ペプチドをコードするクローンＤＮＡ配列を提供するも
のである。
ジウム（ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）のＰ、１９５
蛋白質、またはその少なくとも１個のエピトープを含む
ペプチドをコードするクローンＤＮＡ配列を提供するも
のである。
本明細書において用いられる「クローンＤＮＡ配列」と
は、天然宿主の外部で合成されたＤＮＡ配列を意味する
。
は、天然宿主の外部で合成されたＤＮＡ配列を意味する
。
本明細囚において用いられる「ペプチド」の語は、２個
以上のアミノ酸からなる主としてアミノ酸によって構成
される分子構造を意味づる。この定義によれば、Ｐ、１
９５も一種のペプチドである。
以上のアミノ酸からなる主としてアミノ酸によって構成
される分子構造を意味づる。この定義によれば、Ｐ、１
９５も一種のペプチドである。
本発明のＤＮＡ配列は天然に生じる配列と同一・でも、
またそれが単一もしくは多塩基置換、欠失、挿入および
逆位を含む変異を受けた配列でもよい。
またそれが単一もしくは多塩基置換、欠失、挿入および
逆位を含む変異を受けた配列でもよい。
ただし、このような配列からなるＤＮＡ分子は、常に、
プラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）のＰ
、１９５蛋白質の少なくとも１個のエピトープを有する
べ、プチドとして表現されるものでなければならない。
プラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）のＰ
、１９５蛋白質の少なくとも１個のエピトープを有する
べ、プチドとして表現されるものでなければならない。
次に、本発明を、図面を参照しながらさらに詳細に説明
する。
する。
第１図はＰ、１９５をコードする遺伝子を含むプラスモ
ジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） ＤＮＡのス
トレッチ塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列
を示す。
ジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） ＤＮＡのス
トレッチ塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列
を示す。
第２図はＰ、１９５ＩＩ伝子のＣＤＮＡ制限地図を示す
。
。
第３図はＰ、１９５ゲノム配列の制限地図を示す。
第４図は本発明を例示する過程で用いられるプラスミド
の構築を例示するものである。
の構築を例示するものである。
第１Ａ図から１１図まで（つづく）は、Ｐ、１９５遺伝
子のヌクレオチド配列、それがコードするアミノ酸配列
およびその暗号配列の両端におけるストレッチ配列を示
す。２段に並んだ文字の下段はヌクレオチドを慣用の略
号によって示したもので、上段は読み取り枠がコードす
るアミノ酸配列をアミノ酸の慣用略号で示したものであ
る。
子のヌクレオチド配列、それがコードするアミノ酸配列
およびその暗号配列の両端におけるストレッチ配列を示
す。２段に並んだ文字の下段はヌクレオチドを慣用の略
号によって示したもので、上段は読み取り枠がコードす
るアミノ酸配列をアミノ酸の慣用略号で示したものであ
る。
この配列は本明細書に述べる方法で決定されたものであ
り、実験誤差の範囲内で可能な限り正確に決定されたが
、このｐ、１９５３１ｉ伝子配列には変動がある可能性
もある。
り、実験誤差の範囲内で可能な限り正確に決定されたが
、このｐ、１９５３１ｉ伝子配列には変動がある可能性
もある。
第２図は遺伝子ならびに暗号配列の両端に伸びたＣＤＮ
Ａクローン中の配列を、図の最上段に太線として示し、
ｉｌ要な制限酵素部位を記入しである。この図中の制限
酵素記号はすべて慣用法によつた。他の制限酵素部位は
、図を複雑にしないように下部の平行線上に示す。図の
最下部の囲まれた線は、各種プラスミド挿入部が由来す
るＰ、１９５遺伝子関連位置を示す。ゲノム挿入部であ
るＧ１を除いてすべてｃＤＮＡ挿入部である。
Ａクローン中の配列を、図の最上段に太線として示し、
ｉｌ要な制限酵素部位を記入しである。この図中の制限
酵素記号はすべて慣用法によつた。他の制限酵素部位は
、図を複雑にしないように下部の平行線上に示す。図の
最下部の囲まれた線は、各種プラスミド挿入部が由来す
るＰ、１９５遺伝子関連位置を示す。ゲノム挿入部であ
るＧ１を除いてすべてｃＤＮＡ挿入部である。
ＸおよびＹはＰ、１９５コ一ド配列のそれぞれ５′およ
び３′推定末端を示す。
び３′推定末端を示す。
第３図はＰ、１９５遺伝子を含むゲノムＤＮＡのストレ
ッチの制限地図を例示したものである。スケールはｋｂ
ｐで、図中にボールド書体の大文字で示したＰ、１９５
遺伝子のＨｉｎｄＩ［Ｉ制限部位を基。
ッチの制限地図を例示したものである。スケールはｋｂ
ｐで、図中にボールド書体の大文字で示したＰ、１９５
遺伝子のＨｉｎｄＩ［Ｉ制限部位を基。
単点として選んだ。他の制限酵素部位は次の記号で表示
した。Ｅ （ＥｃｏＲＩ） 、Ｒ（Ｒｓａｊり、Ａ（Ａ
ｊ！ＵＩ）、Ｍ（ＭｂＯＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｎ
（ＮｄｅＩ）、Ｔ （ＴａｑＩ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）
およびＰ（ＰＳｔＩ）である。
した。Ｅ （ＥｃｏＲＩ） 、Ｒ（Ｒｓａｊり、Ａ（Ａ
ｊ！ＵＩ）、Ｍ（ＭｂＯＩ）、Ｐｖ（ＰｖｕＩＩ）、Ｎ
（ＮｄｅＩ）、Ｔ （ＴａｑＩ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）
およびＰ（ＰＳｔＩ）である。
制限地図の下に示した配列のストレッチは指示した特異
的クローンにハイブリダイズすることが明らかにされた
ストレッチである。カッコ内の数字はそのセグメントが
ハイブリダイズするＣＤＮＡクローンで、数字は常に関
連ｐＰＦＣクローンに相当する。カッコ外にさらに数字
とそれに続いて上述の２個の文字がある場合、これは用
いられたブＯ−ブが全クローンより小さく、数字は断片
の長さくＫｂｐ）、文字はその断片の生成に用いた制限
酵素を示している。
的クローンにハイブリダイズすることが明らかにされた
ストレッチである。カッコ内の数字はそのセグメントが
ハイブリダイズするＣＤＮＡクローンで、数字は常に関
連ｐＰＦＣクローンに相当する。カッコ外にさらに数字
とそれに続いて上述の２個の文字がある場合、これは用
いられたブＯ−ブが全クローンより小さく、数字は断片
の長さくＫｂｐ）、文字はその断片の生成に用いた制限
酵素を示している。
第４図はＰ、１９５ＤＮＡの断片の表現に用いられる２
種のプラスミドの構築を例示している。
種のプラスミドの構築を例示している。
ｐＷＲＬ ５０７は図に示すように多数の特徴的な制限
部位と、特徴的な遺伝子機能を有する。
部位と、特徴的な遺伝子機能を有する。
アンピシリン抵抗性をＴｅ ｔ’はテトラサイクリン抵
抗性を付与する。ρＸＹ４６０も図に示すように特徴的
な制限部位を有し、プロモーター（Ｐｔａｃ） 、β−
ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｊ！ａＣ１）お
よびアンピシリン抵抗性を付与する遺伝子（ＡｍｐＲ”
）を含む。
抗性を付与する。ρＸＹ４６０も図に示すように特徴的
な制限部位を有し、プロモーター（Ｐｔａｃ） 、β−
ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｊ！ａＣ１）お
よびアンピシリン抵抗性を付与する遺伝子（ＡｍｐＲ”
）を含む。
上述のＤＮＡ配列は、前述した条件を仮定すれば、また
この配列の決定に際しての実験誤差を考鑵する限り、第
１図に示した配列のすべてまたは一部を有することをコ
ードするものである。
この配列の決定に際しての実験誤差を考鑵する限り、第
１図に示した配列のすべてまたは一部を有することをコ
ードするものである。
また、上述のＤＮＡ配列は、本明細書に述べる方法で決
定できる第２図および第３図のような制限地図を有する
ことをコードするものである。
定できる第２図および第３図のような制限地図を有する
ことをコードするものである。
遺伝子配列は、化学切断法〔マキサムはが（）ｌａｘａ
ｍ、 Ａ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｗ、） ：メソッズ
・イン・エンザイモロシー（Ｈｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、） 、６５ ：４９９ （１９８０））または目的
のＤＮＡ断片をバクテリオファージクローニングベクタ
ーにサブクローニングしたのち〔メッシングはか（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ＆ Ｖｉｅｉｒａ、 Ｊ、） ：
ジーン（Ｇｅｎｅ ）、−り旦：２６９〜２７６ （１
９８２）） 、ジデオキシ法〔サンガーはが（Ｓａｎｇ
ｅｒ、 ｅｔ ａｔ ） ：プロシーデイングズ・オフ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、 Ｈａ目、 Ａｃａｄ。
ｍ、 Ａ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｗ、） ：メソッズ
・イン・エンザイモロシー（Ｈｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、） 、６５ ：４９９ （１９８０））または目的
のＤＮＡ断片をバクテリオファージクローニングベクタ
ーにサブクローニングしたのち〔メッシングはか（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ＆ Ｖｉｅｉｒａ、 Ｊ、） ：
ジーン（Ｇｅｎｅ ）、−り旦：２６９〜２７６ （１
９８２）） 、ジデオキシ法〔サンガーはが（Ｓａｎｇ
ｅｒ、 ｅｔ ａｔ ） ：プロシーデイングズ・オフ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、 Ｈａ目、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）、工４ ： ５４６３〜５４６７）によって
決定された。
決定された。
第１図に示した配列の分析により２１６位に開始コドン
と思われるもの（ＡＩＪＧ）があり、さらに１６５４個
のコドンの読み取り枠が続いている。
と思われるもの（ＡＩＪＧ）があり、さらに１６５４個
のコドンの読み取り枠が続いている。
ペプチド遺伝子生成物の分子量の計算値は１８９．９５
３になる。開始コドンに続いてシグナル配列と推定され
る１８個のコドンが存在し、これは蛋白質が成熟する前
に蛋白質から切り離されるアミノ酸配列をコードするも
のと思われる。
３になる。開始コドンに続いてシグナル配列と推定され
る１８個のコドンが存在し、これは蛋白質が成熟する前
に蛋白質から切り離されるアミノ酸配列をコードするも
のと思われる。
ヌクレオチド４４７〜５２７は７、Ｐ、１９５の８３．
０００ＨＩＪ断片内に生じるトリペプチド配列Ｓｅ ｒ
−０１’ｙ−ＧＪ ｙおよび５ｅｒ−Ｖａｊ！−Ａｌａ
の交互のくり返しをコードしている（例６）。
０００ＨＩＪ断片内に生じるトリペプチド配列Ｓｅ ｒ
−０１’ｙ−ＧＪ ｙおよび５ｅｒ−Ｖａｊ！−Ａｌａ
の交互のくり返しをコードしている（例６）。
翻訳された配列内のアミノ酸の一部の分布は不斉である
。たとえば１９個のシスティン残基のうち、２個はシグ
ナルペプチドと思われる配列中に、１１個はＣ末端の９
７個のアミノ酸 （４２，０００８−断片）中に存在する。Ａｓｎ−Ｘ−
３ｅｒまたはＴｈｒ （Ｘはプロリン以外の通常のアミ
ノ酸である）で示される構造の１１個のトリペプチド配
列が確認されているが、これらはＮ−グリコシレージョ
ン部位と考えられる。第１図に示した配列データを用い
、この配列のいかなる部分に相当するペプチドもたとえ
ばメリフィールド他（Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、 Ｒ，Ｂ
、およびＭａｒ（ｌｌｉｎ、＾。
。たとえば１９個のシスティン残基のうち、２個はシグ
ナルペプチドと思われる配列中に、１１個はＣ末端の９
７個のアミノ酸 （４２，０００８−断片）中に存在する。Ａｓｎ−Ｘ−
３ｅｒまたはＴｈｒ （Ｘはプロリン以外の通常のアミ
ノ酸である）で示される構造の１１個のトリペプチド配
列が確認されているが、これらはＮ−グリコシレージョ
ン部位と考えられる。第１図に示した配列データを用い
、この配列のいかなる部分に相当するペプチドもたとえ
ばメリフィールド他（Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、 Ｒ，Ｂ
、およびＭａｒ（ｌｌｉｎ、＾。
（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｃｍ、 （１９７０
） ３９．８４１頁以下参照）の方法を用いて合成する
ことができるということが認識されよう。而して、本発
明のもう一つの具体例としてＰ、１９５の少なくとも１
種のエピトープを含む合成ペプチドが提供される。
） ３９．８４１頁以下参照）の方法を用いて合成する
ことができるということが認識されよう。而して、本発
明のもう一つの具体例としてＰ、１９５の少なくとも１
種のエピトープを含む合成ペプチドが提供される。
水明１ｍ占で用いる「合成」なる用語はたとえば上記の
ごとぎ化学的方法により製造されるペプチドをさす。
ごとぎ化学的方法により製造されるペプチドをさす。
Ｐ、１９５をコードするＤＮＡ配列の断片の同定および
クローニングは、たとえば次のようにして実施すること
ができる。同調培養したプラス干ジウム（Ｐ、 ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）の細胞を界面活性剤で処理し、エタ
ノール処理および遠心分離でメツセンジャーＲＮＡ （
ｍＲＮＡ＞を沈殿させ、オリゴ−ｄＴセルロース上゛ク
ロマトグラフィーに付して精製することにより、まずｍ
ＲＮＡを抽出した。はぼ純粋な生成物を次に、逆転多酵
素とＤＮＡポリメラーゼを用いるコピーＤＮＡ （ｃＤ
ＮＡ）の合成に使用した。生成後、ｃＤＮＡをプラスミ
ドに挿入し、ついでこれを形質転換により宿主に導入し
た。生成したライブラリー中のどのクローンが関連ＤＮ
Ａ挿入部を含有するかを確認するため、プラスモジウム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍ ） ｍＲＮＡを蔗糖勾
配法により遠心分離してプローブを単利し、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの翻訳により分画の性質を調べた。
クローニングは、たとえば次のようにして実施すること
ができる。同調培養したプラス干ジウム（Ｐ、 ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）の細胞を界面活性剤で処理し、エタ
ノール処理および遠心分離でメツセンジャーＲＮＡ （
ｍＲＮＡ＞を沈殿させ、オリゴ−ｄＴセルロース上゛ク
ロマトグラフィーに付して精製することにより、まずｍ
ＲＮＡを抽出した。はぼ純粋な生成物を次に、逆転多酵
素とＤＮＡポリメラーゼを用いるコピーＤＮＡ （ｃＤ
ＮＡ）の合成に使用した。生成後、ｃＤＮＡをプラスミ
ドに挿入し、ついでこれを形質転換により宿主に導入し
た。生成したライブラリー中のどのクローンが関連ＤＮ
Ａ挿入部を含有するかを確認するため、プラスモジウム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍ ） ｍＲＮＡを蔗糖勾
配法により遠心分離してプローブを単利し、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの翻訳により分画の性質を調べた。
Ｐ、１９５をコードすることが明らかにされた分画を、
部分アルカリ加水分解したのち、ポリヌクレオチドキナ
ーゼとγ３２Ｐ−ＡＴＰによって放射標識した。このプ
ローブをコロニーハイブリダイゼーション実験に用いた
ところ、数個のクローンがそれとハイブリダイズし、そ
の一部は強力にハイブリダイズすることが明らかになっ
た。これらをクロスハイブリダイゼーションによってフ
ァミリーに分類し、各ファミリーから１個ずつをニック
トランスレーションにより、ＤＮＡポリメラーゼとα−
”’Ｐ−ｄＡＴＰで放射標識した。これらのプローブが
Ｐ、１９５のＤＮＡ配列の一部であるとすれば、プラス
モジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍ ） ｊｍＲ
ＮＡの全抽出物中、１９５．０ＯＯＩＩＷ（７）蛋白質
をコードするのに必要なｍＲＮＡの最低の長さである５
、３００塩基以上のｍＲＮＡとハイブリダイズするはず
である。
部分アルカリ加水分解したのち、ポリヌクレオチドキナ
ーゼとγ３２Ｐ−ＡＴＰによって放射標識した。このプ
ローブをコロニーハイブリダイゼーション実験に用いた
ところ、数個のクローンがそれとハイブリダイズし、そ
の一部は強力にハイブリダイズすることが明らかになっ
た。これらをクロスハイブリダイゼーションによってフ
ァミリーに分類し、各ファミリーから１個ずつをニック
トランスレーションにより、ＤＮＡポリメラーゼとα−
”’Ｐ−ｄＡＴＰで放射標識した。これらのプローブが
Ｐ、１９５のＤＮＡ配列の一部であるとすれば、プラス
モジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍ ） ｊｍＲ
ＮＡの全抽出物中、１９５．０ＯＯＩＩＷ（７）蛋白質
をコードするのに必要なｍＲＮＡの最低の長さである５
、３００塩基以上のｍＲＮＡとハイブリダイズするはず
である。
このようなｍＲＮＡを認識するプローブ（ノーサン法）
を、さらに、適当な宿主中でそのＣＤＮＡ配列を融合ペ
プチドとして表現できるベクター中に導入して、その性
質を調べた。このｃＤＮＡの表現を確認するため、その
断片をベクター中に導入する前にエキソヌクレアーゼで
処理して、読み取り枠をランダム化した。表現ペプチド
をＰ、１９５に対して誘発された多価ウサギ面清で検査
した。上述のＤＮＡ断片はこのような操作で検出された
。
を、さらに、適当な宿主中でそのＣＤＮＡ配列を融合ペ
プチドとして表現できるベクター中に導入して、その性
質を調べた。このｃＤＮＡの表現を確認するため、その
断片をベクター中に導入する前にエキソヌクレアーゼで
処理して、読み取り枠をランダム化した。表現ペプチド
をＰ、１９５に対して誘発された多価ウサギ面清で検査
した。上述のＤＮＡ断片はこのような操作で検出された
。
Ｐ、１９５に対する完全なＣＤＮＡのクローニングにつ
いては、全ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの合成法が数種
知られている〔たとえばハイデツカ−ほか（Ｈｅｉｄｅ
ｃｋｅｒ、Ｇ、 ＆ Ｈｅ５ｓｉａ、Ｊ、） ： ヌク
レイ ０ツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ’Ｒｅｓ、）、１ユニ４８９１〜４
９０６ （１９８３））。またクローニングは、容易に
調整できる全ゲノムＤＮＡ消化ライブラリー、およびこ
のライブラリー中に上述の断片をプローブとして用いる
ことにより検出される関連配列またはその断片を使用し
ても実施できる〔たとえばオデインクはか（Ｏｄｉｎｋ
、に、Ｇ、ｅｔ ａｔ ） ニーＥルキュラー−７ンド
・バイオケミカル・パラシトロジー（Ｈｏ１．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。
いては、全ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの合成法が数種
知られている〔たとえばハイデツカ−ほか（Ｈｅｉｄｅ
ｃｋｅｒ、Ｇ、 ＆ Ｈｅ５ｓｉａ、Ｊ、） ： ヌク
レイ ０ツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ’Ｒｅｓ、）、１ユニ４８９１〜４
９０６ （１９８３））。またクローニングは、容易に
調整できる全ゲノムＤＮＡ消化ライブラリー、およびこ
のライブラリー中に上述の断片をプローブとして用いる
ことにより検出される関連配列またはその断片を使用し
ても実施できる〔たとえばオデインクはか（Ｏｄｉｎｋ
、に、Ｇ、ｅｔ ａｔ ） ニーＥルキュラー−７ンド
・バイオケミカル・パラシトロジー（Ｈｏ１．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、） 、上０：５５〜５６ （１９
８４））。
８４））。
この方法で見出される配列の一部は要求されるｃＤＮＡ
配列の全長であるが、多くはこの配列の断片である。ラ
イブラリー中のどのクローンが所望のＤＮＡの一部に相
当するかを決定するためには、染色体歩行としそ知られ
ている方法（ハツトフィールド（Ｉａｄｆｉｅ！ｄ、Ｃ
，） ：フォーカス（Ｆｏｃｕｓ ）、５：１〜５ （
１９８３））を使用する。この方法は既知の断片（プロ
ーブ）を用いて、クロスハイブリダイゼーションにより
他の断片を検出するものである。これらの新たに突き止
められた配列はそれ自体プローブとして使用してもよく
、この方法で、Ｐ、１９５をコードするＤＮＡの全配列
が同定され、クローン化できる。この操作によればＤＮ
Ａ配列の制限地図特性も明らかにできる。
配列の全長であるが、多くはこの配列の断片である。ラ
イブラリー中のどのクローンが所望のＤＮＡの一部に相
当するかを決定するためには、染色体歩行としそ知られ
ている方法（ハツトフィールド（Ｉａｄｆｉｅ！ｄ、Ｃ
，） ：フォーカス（Ｆｏｃｕｓ ）、５：１〜５ （
１９８３））を使用する。この方法は既知の断片（プロ
ーブ）を用いて、クロスハイブリダイゼーションにより
他の断片を検出するものである。これらの新たに突き止
められた配列はそれ自体プローブとして使用してもよく
、この方法で、Ｐ、１９５をコードするＤＮＡの全配列
が同定され、クローン化できる。この操作によればＤＮ
Ａ配列の制限地図特性も明らかにできる。
ゲノムＤＮＡ中のＰ、 １９５の遺伝、子の物理的地図
の、制限エンドヌクレアーゼ切断、ゲル電気泳動、ニト
ロセルロースまたはポリアミド膜へのトランスファーお
よびクローンＤＮＡ由来の特異的プローブへのハイブリ
ダイゼーションによる構築はｃＤＮＡの方向性および位
置ならびにゲノムクローンの確認にきわめて有用でそれ
を容易にする。
の、制限エンドヌクレアーゼ切断、ゲル電気泳動、ニト
ロセルロースまたはポリアミド膜へのトランスファーお
よびクローンＤＮＡ由来の特異的プローブへのハイブリ
ダイゼーションによる構築はｃＤＮＡの方向性および位
置ならびにゲノムクローンの確認にきわめて有用でそれ
を容易にする。
さらに、ＣＤＮＡクローン内の制限部位とゲノム中の制
限部位の比較は、ｃＤＮＡが合成されるｍＲＮＡ中には
存在しない遺伝子の特徴を検出するのに使用できる。た
とえば、暗号配列内の分断、イントロンの存在を検出で
き、これは転写ＲＮＡから特異的スプライシングによっ
て切り取られる。
限部位の比較は、ｃＤＮＡが合成されるｍＲＮＡ中には
存在しない遺伝子の特徴を検出するのに使用できる。た
とえば、暗号配列内の分断、イントロンの存在を検出で
き、これは転写ＲＮＡから特異的スプライシングによっ
て切り取られる。
このような約７００ｂ、ｌ）、のイントロンと思われる
例が、上述の方法によりヌクレオチド暗号配列２２１と
３１３の間（第１図）、すなわちこれらの位置でＭｂｏ
Ｉ （Ｍ）と）ｉｉｎｄｌ１部位の問（第３図）に認め
られている。
例が、上述の方法によりヌクレオチド暗号配列２２１と
３１３の間（第１図）、すなわちこれらの位置でＭｂｏ
Ｉ （Ｍ）と）ｉｉｎｄｌ１部位の問（第３図）に認め
られている。
上述のように、Ｐ、 １９５はｉｎ ｖｉｖｏでプロセ
ッシングを受け、上に述べたような断片を含む分離断片
となる。これらの断片がマラリヤに対する免疫を付与す
るのに有益であることは容易に証明でき、このような断
片のＤＮＡ配列は本発明の重要な一態様である。とくに
、このような配列は一般に、全蛋白質のＤＮＡ配列より
も適当なベクター中で良好に表現されるからである。
ッシングを受け、上に述べたような断片を含む分離断片
となる。これらの断片がマラリヤに対する免疫を付与す
るのに有益であることは容易に証明でき、このような断
片のＤＮＡ配列は本発明の重要な一態様である。とくに
、このような配列は一般に、全蛋白質のＤＮＡ配列より
も適当なベクター中で良好に表現されるからである。
したがって、さらに本発明の一態様として、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで生じるＰ、１９５断片をコードするクローンＤＮ
Ａ配列を挙げることができる。
ｖｏで生じるＰ、１９５断片をコードするクローンＤＮ
Ａ配列を挙げることができる。
感受性宿主に免疫応答をとくに引き出しやすい天然に生
じるＰ、１９５断片は、分裂小体表面に存在する断片で
ある。
じるＰ、１９５断片は、分裂小体表面に存在する断片で
ある。
さらに本発明はその一態様として、プラスモジウム（Ｐ
、ｒａｌｃｉｐａｒｕ＋） ＋７）分裂小体ａｉｓ上に
ｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ、１９５断片をコードするク
ローンＤＮＡ配列を提供する。
、ｒａｌｃｉｐａｒｕ＋） ＋７）分裂小体ａｉｓ上に
ｉｎ ｖｉｖｏで生じるＰ、１９５断片をコードするク
ローンＤＮＡ配列を提供する。
線状遺伝子配列中のプロセッシング断片の位置決定のた
めには（ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｌｌ
ｌａｎ ） ：前出（１９８４ｂ））、ひとつの直接的
アプローチとして、断片を精製して部分アミノ酸配列を
決定し、ついでこれを翻訳された遺伝子配列と比較する
方法がある。これは分裂小体から多分、赤血球侵入過程
で特異的に離脱すると思われ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ＠養液
の上清に蓄積する８３．０００ＨＷｌｉｇについて実行
可能なことが明らかにされている。Ｐ、１９５の８３．
０Ｏ０１４Ｗ断片の２０個のアミノ末端残基の配列決定
により、相当する暗号配列が第１図のヌクレオチド２７
３〜３３２に存在すること、すなわちこの断ハが遺伝子
内にあることが示され・でいる。
めには（ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｌｌ
ｌａｎ ） ：前出（１９８４ｂ））、ひとつの直接的
アプローチとして、断片を精製して部分アミノ酸配列を
決定し、ついでこれを翻訳された遺伝子配列と比較する
方法がある。これは分裂小体から多分、赤血球侵入過程
で特異的に離脱すると思われ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ＠養液
の上清に蓄積する８３．０００ＨＷｌｉｇについて実行
可能なことが明らかにされている。Ｐ、１９５の８３．
０Ｏ０１４Ｗ断片の２０個のアミノ末端残基の配列決定
により、相当する暗号配列が第１図のヌクレオチド２７
３〜３３２に存在すること、すなわちこの断ハが遺伝子
内にあることが示され・でいる。
モノクロプール抗体を用い常法によって、４２．０００
８％４１ｉ片の位置が決定され、これは例７に記載され
ている。４２．０００ＨＷおよび８３．０００１４％４
両断片の暗号配列は、遺伝子の逆の末端にあることが確
認されている。
８％４１ｉ片の位置が決定され、これは例７に記載され
ている。４２．０００ＨＷおよび８３．０００１４％４
両断片の暗号配列は、遺伝子の逆の末端にあることが確
認されている。
Ｐ、１９５遺伝子内の対立変異を明らかにする実験から
、最大の保存は領域５′のＨｉｎｄｌ［［部位（８３，
０ＯＯＨ１４断片中）および３′非暗号領域（第２図）
に起こることが示されている。もつとも保存性の高い配
列は４２．０ＯＯＨＮ断Ｈのカルボキシ末端における約
１３０個のアミノ酸残基に相当する遺伝子の３′末端に
あって、この断片が少なくとも１個の有用なエピトープ
を含むことを示唆している。
、最大の保存は領域５′のＨｉｎｄｌ［［部位（８３，
０ＯＯＨ１４断片中）および３′非暗号領域（第２図）
に起こることが示されている。もつとも保存性の高い配
列は４２．０ＯＯＨＮ断Ｈのカルボキシ末端における約
１３０個のアミノ酸残基に相当する遺伝子の３′末端に
あって、この断片が少なくとも１個の有用なエピトープ
を含むことを示唆している。
したがって、本発明はその−・態様として、ざらにＰ、
１９５の４２．０００ＨＷ断片に相当するＤＮＡ配列を
提供するものである。 ′本発明のＤＮＡ配列は、こ
のＤＮＡ配列を含有するウィルスの産生にも使用できる
。たとえば、感染ｍ胞にヒボキサンチンを含有しない培
地上での生育能を付与できないワクシニアウィルスの株
（Ｔｋ−’）を用いて組織培養を感染させる。この組織
培養をＴｋ＋遺伝決定基に結合したＰ、１９５遺伝子ま
たはその断片で形質転換する。以後の子孫ウィルスの一
部はこの形質転換配列をゲノム中への挿入体の形でもつ
ことになる。これらは、組織培養細胞にヒボキサンチン
欠乏培地上での生育能を付与する能力により選択できる
。生育するコ 。
１９５の４２．０００ＨＷ断片に相当するＤＮＡ配列を
提供するものである。 ′本発明のＤＮＡ配列は、こ
のＤＮＡ配列を含有するウィルスの産生にも使用できる
。たとえば、感染ｍ胞にヒボキサンチンを含有しない培
地上での生育能を付与できないワクシニアウィルスの株
（Ｔｋ−’）を用いて組織培養を感染させる。この組織
培養をＴｋ＋遺伝決定基に結合したＰ、１９５遺伝子ま
たはその断片で形質転換する。以後の子孫ウィルスの一
部はこの形質転換配列をゲノム中への挿入体の形でもつ
ことになる。これらは、組織培養細胞にヒボキサンチン
欠乏培地上での生育能を付与する能力により選択できる
。生育するコ 。
ロニーをさらに、たとえばＦｌｌｌ、２のような関連モ
ノクロプール抗体を用い、Ｐ、１９５またはその少なく
とも１個のエピトープを含むペプチドの産生について選
択する。このようなワクシニア株は免疫原性マラリヤベ
プチドを産生ずるので、マラリヤに罹患しやすい動物の
感染に使用できる。
ノクロプール抗体を用い、Ｐ、１９５またはその少なく
とも１個のエピトープを含むペプチドの産生について選
択する。このようなワクシニア株は免疫原性マラリヤベ
プチドを産生ずるので、マラリヤに罹患しやすい動物の
感染に使用できる。
すなわち、本発明は、さらにその−態様として、感受性
を雌動物にマラリヤの免疫を付与するのに使用できる、
本発明のＤＮＡ配列をもった非病原性ウィルスを提供す
るものである。
を雌動物にマラリヤの免疫を付与するのに使用できる、
本発明のＤＮＡ配列をもった非病原性ウィルスを提供す
るものである。
このようなワクチンはまた、他の感染、たとえば天然痘
、ジフテリア、Ｂ型肝炎、狂犬病、単純庖疹、百日咳等
に対する免疫も容易に付与できることは明白である。し
たがって、本発明はまた、さらに他の感染に対する゛免
疫も付与できる上述のような非病原性ウィルスをも提供
するものである。
、ジフテリア、Ｂ型肝炎、狂犬病、単純庖疹、百日咳等
に対する免疫も容易に付与できることは明白である。し
たがって、本発明はまた、さらに他の感染に対する゛免
疫も付与できる上述のような非病原性ウィルスをも提供
するものである。
これは他のワクチンと合して、または個々に、同時投与
することができる。
することができる。
Ｐ、１２５のＤＮＡ配列の上述の特性に基づき、得られ
た制限地図を参照して、この配列の任意の所望の断片の
クローニングが可能である。
た制限地図を参照して、この配列の任意の所望の断片の
クローニングが可能である。
外来性ＤＮＡ小片を正しい読み取り枠で大腸菌遺伝子に
挿入すると、一部のアミノ酸配列は大腸菌遺伝ｆから、
一部は挿入ＤＮＡに由来する融合蛋白質が表現される。
挿入すると、一部のアミノ酸配列は大腸菌遺伝ｆから、
一部は挿入ＤＮＡに由来する融合蛋白質が表現される。
適当な制御配列と右利な制限部位をもつ適当なベクター
が構築されていて、融合蛋白質の高レベルの表現が可能
になっている。
が構築されていて、融合蛋白質の高レベルの表現が可能
になっている。
選ばれた表現システムの制限地図と表現させる配列を調
査し、これに翻訳枠の知識があれば、特異的ＤＮＡ断片
を表現ベクター中にリゲートするだけの操作で、その表
現が可能である。たとえば、ｐＷＲＬ５０７’はｐＡＴ
１５３とｔｒｐＥ３１！伝子から（二」）Ｌｔスほか（
Ｎｉｃｈｏｌｓ、Ｂ、Ｐ、ｅｔ ａｌ ） ：ジャーナ
ル・オフ・モルキュラー・バイオ［１ジー（Ｊ、Ｈｏ１
．Ｂｉｏｌ、 ） 、１４６ ： ４５〜５４（１９８
１））、ｔｒｐＥ遺伝子のヌクレオチド１２２３のＢＱ
ＩＩ部位に合成ＥＣ０ＲＩ−ＢＱＩＩ［リンカ−を挿入
して構築されたプラスミドである（第４図）。このベク
ターはＮｄｅＩとＥＣ０ＲＩ、ＥＣ０ＲＩとＢａｍＨＩ
またはＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌで切断し、このＤＮＡ小
断片をＤＰＦＧ Ｉの２．７Ｋｂｐ ＮｄｅＩ−Ｅｃｏ
ＲＩＩｒ片、ｐＰＦｃｌ ０２８の４００ｂｐＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片または ｐＰＦｃ１０２８の２．４Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−）１
ｉ ｎｄｎｌ （Ｈｉ ｎｄｌ［［部位はこのプラスミ
ドのポリリンカー中にある）断片でそれぞれ置換できる
。さらに、ｐＰＦｃ１０２８の１．２ＫｂｐＥｃｏＲＩ
−ＮｄｅＩのような特異的面ハをＤＬＪＣ９のポリリン
カー領域（この場合、ＥｃｏＲＩ／プラント末端断片と
して）にサブクローンし、ついでＥＣ０ＲＩと）ｌ ｉ
ｎｄｌ［ｌで切り出し、ｐＷＲ１５０７のＥＣ０ＲＩ
とＨｉ ｎｄｌ［［カットにクローン化することができ
る。
査し、これに翻訳枠の知識があれば、特異的ＤＮＡ断片
を表現ベクター中にリゲートするだけの操作で、その表
現が可能である。たとえば、ｐＷＲＬ５０７’はｐＡＴ
１５３とｔｒｐＥ３１！伝子から（二」）Ｌｔスほか（
Ｎｉｃｈｏｌｓ、Ｂ、Ｐ、ｅｔ ａｌ ） ：ジャーナ
ル・オフ・モルキュラー・バイオ［１ジー（Ｊ、Ｈｏ１
．Ｂｉｏｌ、 ） 、１４６ ： ４５〜５４（１９８
１））、ｔｒｐＥ遺伝子のヌクレオチド１２２３のＢＱ
ＩＩ部位に合成ＥＣ０ＲＩ−ＢＱＩＩ［リンカ−を挿入
して構築されたプラスミドである（第４図）。このベク
ターはＮｄｅＩとＥＣ０ＲＩ、ＥＣ０ＲＩとＢａｍＨＩ
またはＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌで切断し、このＤＮＡ小
断片をＤＰＦＧ Ｉの２．７Ｋｂｐ ＮｄｅＩ−Ｅｃｏ
ＲＩＩｒ片、ｐＰＦｃｌ ０２８の４００ｂｐＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片または ｐＰＦｃ１０２８の２．４Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−）１
ｉ ｎｄｎｌ （Ｈｉ ｎｄｌ［［部位はこのプラスミ
ドのポリリンカー中にある）断片でそれぞれ置換できる
。さらに、ｐＰＦｃ１０２８の１．２ＫｂｐＥｃｏＲＩ
−ＮｄｅＩのような特異的面ハをＤＬＪＣ９のポリリン
カー領域（この場合、ＥｃｏＲＩ／プラント末端断片と
して）にサブクローンし、ついでＥＣ０ＲＩと）ｌ ｉ
ｎｄｌ［ｌで切り出し、ｐＷＲ１５０７のＥＣ０ＲＩ
とＨｉ ｎｄｌ［［カットにクローン化することができ
る。
適当な制限酵素部位を用０、Ｐ、１９５遺伝子配列から
のＤＮＡ断片をｔｒｐＥ遺伝子内に正しい方向でクロー
ニングすることは可能であるが、通 □１常、
翻訳枠がずれてしまう。挿入配列を発現させるには、適
当な長さの合成リンカ−をｔｒｐＥ道伝子と公子体の間
の制限部位に挿入して、融合蛋白質を読み取り枠どおり
に発現させる。また、挿入ＤＮＡを含むプラスミドをバ
クテリアＤＮＡと挿入ＤＮＡの間の特徴的制限部位で開
裂し、そのＤＮＡを酵素Ｂａ１３１で短時間処理して直
線化ＤＮＡの各末端から数個の塩基を除去する。
のＤＮＡ断片をｔｒｐＥ遺伝子内に正しい方向でクロー
ニングすることは可能であるが、通 □１常、
翻訳枠がずれてしまう。挿入配列を発現させるには、適
当な長さの合成リンカ−をｔｒｐＥ道伝子と公子体の間
の制限部位に挿入して、融合蛋白質を読み取り枠どおり
に発現させる。また、挿入ＤＮＡを含むプラスミドをバ
クテリアＤＮＡと挿入ＤＮＡの間の特徴的制限部位で開
裂し、そのＤＮＡを酵素Ｂａ１３１で短時間処理して直
線化ＤＮＡの各末端から数個の塩基を除去する。
ＤＮＡポリメラーゼ１の大（にＩｅｎＯＷ）断片で修復
したのち、プラスミドをＴ４リガーゼで再び環化し、バ
クテリアの形質転換に使用する。形質転換体の３個中１
個はＰ、１９５配列を正しい読み取り枠で含有し、１立
且上遺伝子生成物との融合蛋白質として表現される。Ｂ
ａ１３１による消化の程度が表現される融合蛋白質の最
終サイズおよび１Ｌ且王とそれに含まれるＰ、１９５配
列との長さの割合によって決まることは本技術分野にお
ける熟練者には自明のどおりである。さらに、Ｂａ１３
１消化および修復後のリゲーションの間に合成リンカ−
を挿入すれば、形質転換後の特定株の分析が容易になる
。特異的制限酵素による消化とＢａ１３１酵素処理を上
手に使用すればＰ、１９５の任意の特定領域を融合蛋白
質として表現することができる。
したのち、プラスミドをＴ４リガーゼで再び環化し、バ
クテリアの形質転換に使用する。形質転換体の３個中１
個はＰ、１９５配列を正しい読み取り枠で含有し、１立
且上遺伝子生成物との融合蛋白質として表現される。Ｂ
ａ１３１による消化の程度が表現される融合蛋白質の最
終サイズおよび１Ｌ且王とそれに含まれるＰ、１９５配
列との長さの割合によって決まることは本技術分野にお
ける熟練者には自明のどおりである。さらに、Ｂａ１３
１消化および修復後のリゲーションの間に合成リンカ−
を挿入すれば、形質転換後の特定株の分析が容易になる
。特異的制限酵素による消化とＢａ１３１酵素処理を上
手に使用すればＰ、１９５の任意の特定領域を融合蛋白
質として表現することができる。
したがって、本発明は、さらに他の態様として、適当な
宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミン末端コード部分
に縦列に結合した本発明のＤＮＡ配列を含むベクターを
提供するものである。このベクターは任意の制御配列を
伴っていてもよく、適当な宿主の形質転換を用いると、
Ｐ、１９５の少なくとも一部分またはその少なくとも１
個のエピトープからなる融合蛋白質を産生ずる。
宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミン末端コード部分
に縦列に結合した本発明のＤＮＡ配列を含むベクターを
提供するものである。このベクターは任意の制御配列を
伴っていてもよく、適当な宿主の形質転換を用いると、
Ｐ、１９５の少なくとも一部分またはその少なくとも１
個のエピトープからなる融合蛋白質を産生ずる。
ＤＮＡ断片を発現させる別法としては読み取り枠（ＯＲ
Ｆ）ベクターを用いる方法がある。これにＤＮＡの通常
は短い断片を多くの場合、大腸菌蛋白質のＮ末端アミノ
酸配列をコードする配列内に挿入できる。この挿入ＤＮ
Ａは停止コドンを正しい翻訳枠で含有してはならず、転
写方向に関し正しい方向性をもたねばならず、また各末
端が正しい枠内になければならない。ランダム切断法で
生じた蛋白質コード配列からのＤＮＡ切片が正しい枠で
読み取られる確率は１／１８である。β−ガラクトシダ
ーゼに基づ＜ＯＲＦベクターが報告されテイル〔ケネン
ほか（にｏｅｎｃｎ ａｔ ａｔ）、１９８２）。この
蛋白質のＮ末端における部位にＤＮＡ切片を正しい枠で
挿入すると、β−ガラクトシダーゼ蛋白質を読み通して
表現され、これは発色性気質５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を
加水分解するので検知できる。たとえば、Ｘｇａ Ｉが
含まれているアガール上でコロニーを生育さゼると、機
能性β−ガラクトシダーゼを表現するプラスミドをもつ
適当な宿主株の形質転換体は青色のコロニーを産生ずる
。このようなベクターのひとつ、ｐＸＹ４６０はｔａｃ
プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
含有する。
Ｆ）ベクターを用いる方法がある。これにＤＮＡの通常
は短い断片を多くの場合、大腸菌蛋白質のＮ末端アミノ
酸配列をコードする配列内に挿入できる。この挿入ＤＮ
Ａは停止コドンを正しい翻訳枠で含有してはならず、転
写方向に関し正しい方向性をもたねばならず、また各末
端が正しい枠内になければならない。ランダム切断法で
生じた蛋白質コード配列からのＤＮＡ切片が正しい枠で
読み取られる確率は１／１８である。β−ガラクトシダ
ーゼに基づ＜ＯＲＦベクターが報告されテイル〔ケネン
ほか（にｏｅｎｃｎ ａｔ ａｔ）、１９８２）。この
蛋白質のＮ末端における部位にＤＮＡ切片を正しい枠で
挿入すると、β−ガラクトシダーゼ蛋白質を読み通して
表現され、これは発色性気質５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を
加水分解するので検知できる。たとえば、Ｘｇａ Ｉが
含まれているアガール上でコロニーを生育さゼると、機
能性β−ガラクトシダーゼを表現するプラスミドをもつ
適当な宿主株の形質転換体は青色のコロニーを産生ずる
。このようなベクターのひとつ、ｐＸＹ４６０はｔａｃ
プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
含有する。
ＥＣｏＲＩ部位のとなりのＳｍａＩ部位にＤＮＡを挿入
すると遺伝子が正しい読み取り枠で発現するように変換
できる。ＪＭ１０５のような大腸菌宿主の形質転換はバ
クテリアをアンピシリン抵抗性に変換し、融合蛋白質の
表現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）の添加により高レベルに誘導される。
すると遺伝子が正しい読み取り枠で発現するように変換
できる。ＪＭ１０５のような大腸菌宿主の形質転換はバ
クテリアをアンピシリン抵抗性に変換し、融合蛋白質の
表現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）の添加により高レベルに誘導される。
したがって、本発明は別の一態様として、適当な宿主中
で翻訳可能な遺伝子からなり、関連制御配列をもってい
てもよいベクターであって、本発明のＤＮＡ配列が上記
遺伝子カルボ４シ末端部分から上記ＤＮＡ配列まで正し
く翻訳されて適当な宿主中で表現するように改変して挿
入されているベクターを提供するものである。これによ
り、Ｐ、１９５の少なくとも一部分またはその少なくと
も１個の１ビトープを含むペプチドと上記遺伝子がコー
ドする蛋白質の部分とからなる融合蛋白質が産生される
。
で翻訳可能な遺伝子からなり、関連制御配列をもってい
てもよいベクターであって、本発明のＤＮＡ配列が上記
遺伝子カルボ４シ末端部分から上記ＤＮＡ配列まで正し
く翻訳されて適当な宿主中で表現するように改変して挿
入されているベクターを提供するものである。これによ
り、Ｐ、１９５の少なくとも一部分またはその少なくと
も１個の１ビトープを含むペプチドと上記遺伝子がコー
ドする蛋白質の部分とからなる融合蛋白質が産生される
。
Ｐ、１９５遺伝子の部分によってコードされた、融合蛋
白質中のペプチドは適当なペプチド結合の酵素的または
化学的切断によって融合蛋白質から切り取ることができ
る。表現されたアミノ酸配列の検査により、酵素的また
は化学的切断法のとれを採用するかは本技術分野の熟練
者であれば容易 １に決定できる。融合蛋白質表
現システムのＰ、１９５ＤＮＡ配列とバクテリア遺伝ｆ
配列の間に合成オリゴヌクレオ、チドリンカーを挿入す
れば、Ｐ、１９５配列と表現された融合蛋白質の残部の
間に酵素的または化学的切断に適した部位が付与される
。この方法でＰ、１９５遺伝子コ一ド断片を宿主ペプチ
ドから分離、精製することがで′きる。
白質中のペプチドは適当なペプチド結合の酵素的または
化学的切断によって融合蛋白質から切り取ることができ
る。表現されたアミノ酸配列の検査により、酵素的また
は化学的切断法のとれを採用するかは本技術分野の熟練
者であれば容易 １に決定できる。融合蛋白質表
現システムのＰ、１９５ＤＮＡ配列とバクテリア遺伝ｆ
配列の間に合成オリゴヌクレオ、チドリンカーを挿入す
れば、Ｐ、１９５配列と表現された融合蛋白質の残部の
間に酵素的または化学的切断に適した部位が付与される
。この方法でＰ、１９５遺伝子コ一ド断片を宿主ペプチ
ドから分離、精製することがで′きる。
Ｐ、１９５蛋白質またはその部分をコードする配列を直
接表現させるには、ＡＬＪＧ開始コドンの後に挿入ＤＮ
Ａ配列を直接、ＤＮＡ挿入体がバクテリア制御領域によ
って通常は転写、翻訳されるコード配列を置換するよう
に正しい読み取り枠で位置させればよい。このような制
御領域には、開始フドンに対して至適位置にプロモータ
ーとリポソーム結合部位を含有する。表現すべきＤＮＡ
配列は適当な制限部位の使用により正しく位置され、必
要ならば適当なオリゴヌグレオチドリンカーを使用する
こともできる。挿入ＤＮＡ配列の末端には、翻訳を停止
させるために停止コドンを正しい読み取り枠で挿入させ
、また転写を停止させるためにターミ・ネーター配列を
添加することもできる。
接表現させるには、ＡＬＪＧ開始コドンの後に挿入ＤＮ
Ａ配列を直接、ＤＮＡ挿入体がバクテリア制御領域によ
って通常は転写、翻訳されるコード配列を置換するよう
に正しい読み取り枠で位置させればよい。このような制
御領域には、開始フドンに対して至適位置にプロモータ
ーとリポソーム結合部位を含有する。表現すべきＤＮＡ
配列は適当な制限部位の使用により正しく位置され、必
要ならば適当なオリゴヌグレオチドリンカーを使用する
こともできる。挿入ＤＮＡ配列の末端には、翻訳を停止
させるために停止コドンを正しい読み取り枠で挿入させ
、また転写を停止させるためにターミ・ネーター配列を
添加することもできる。
表現すべき挿入ＤＮＡはＰ、１９５の全コード配列もし
くはアミノ末端ジグプル配列を除去した全配列、また好
ましくはその蛋白質の免疫原性断片に相当する一部のコ
ード配列である。適当なＩｌｉハは適当なｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡクローン（ヌクレオチド配列の検査後に
）の制限酵素消化により調製でき、必、要に応じて一端
または両端をさらにＢａ１３１で処理し、ＤＮＡ配列の
一部を制御された方法で消化、除去する。制御された消
化は、適当な緩Ｉ！液、温度、反応時間、酵素色をたと
えば例８に述べるように選択することにより達成される
。この段階で、適当な合成リンカ−を、好ましくはプラ
ント末端リゲーシ］ンにより挿入体に添加すると、ＡＵ
Ｇ開始コドンの付与また表現ベクターへのリグ−シコン
の容易化が可能になる。
くはアミノ末端ジグプル配列を除去した全配列、また好
ましくはその蛋白質の免疫原性断片に相当する一部のコ
ード配列である。適当なＩｌｉハは適当なｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡクローン（ヌクレオチド配列の検査後に
）の制限酵素消化により調製でき、必、要に応じて一端
または両端をさらにＢａ１３１で処理し、ＤＮＡ配列の
一部を制御された方法で消化、除去する。制御された消
化は、適当な緩Ｉ！液、温度、反応時間、酵素色をたと
えば例８に述べるように選択することにより達成される
。この段階で、適当な合成リンカ−を、好ましくはプラ
ント末端リゲーシ］ンにより挿入体に添加すると、ＡＵ
Ｇ開始コドンの付与また表現ベクターへのリグ−シコン
の容易化が可能になる。
本発明は、さらにその態様として、宿主細胞を上に定義
したクローニングベクターで形質転換し、この宿主細胞
を培養して上記Ｐ、１９５またはその少な（とも１個の
エビ、トープからなるペプチドを表現させることをコー
ドする方法を提供する。
したクローニングベクターで形質転換し、この宿主細胞
を培養して上記Ｐ、１９５またはその少な（とも１個の
エビ、トープからなるペプチドを表現させることをコー
ドする方法を提供する。
クローン断片の制御された表現は、その配列の一方の末
端の配列の使用によりまたは既知の他の配列の使用によ
って可能である。このような配列にはプロモーターおよ
びエンハンサ−がある。このようなプロモーターの例と
しては、ｌ ａｃ。
端の配列の使用によりまたは既知の他の配列の使用によ
って可能である。このような配列にはプロモーターおよ
びエンハンサ−がある。このようなプロモーターの例と
しては、ｌ ａｃ。
ｔｒｐ、バクテリオファージλｐＬおよびハイブリッド
ｔｒｐ−１ａｃ （ｔａｃ）を挙げることができる。適
当なエンハンサ−の例としてはＳＶ４０エンハンサ−お
よびウシ乳頭腫ウィルスからのエンハンサ−がある。
ｔｒｐ−１ａｃ （ｔａｃ）を挙げることができる。適
当なエンハンサ−の例としてはＳＶ４０エンハンサ−お
よびウシ乳頭腫ウィルスからのエンハンサ−がある。
本発明はさらにその一態様して、本発明の上述のＤ Ｎ
Ａ、配列を含有するベクターを提供する。
Ａ、配列を含有するベクターを提供する。
上述のベクターはＤＮＡのクローニングに適し、宿主細
胞の形質転換に使用でき、関連蛋白質を表現させること
ができる適当な任意のベクターである。このようなベク
ターとしては、プラスミド、バクテリオファージおよび
コスミドを挙げることかできる。ＤＮＡのクローニング
に使用できるベクターとしては、大腸菌に用いる場合ｐ
Ｕｃ８、ｐｕｃ９、Ｉ）ＡＴ１５３、ｐＢＲ３２５およ
びｐＢＲ３２８が、枯草菌に用いる場合ＤＢＤ９および
ｐＫＴ４３８が、酵母に用いる場合ｐＭＡ５６が、哺乳
類細胞に用い場合 ・ｐＡｄＤ２６ＳＶ （Ａ）−３、 ｐｓＶ２−ｄｈ ｆ ｒＳＳＶＥＨＡ３および５ＶＬＨ
Ａ８がある。
胞の形質転換に使用でき、関連蛋白質を表現させること
ができる適当な任意のベクターである。このようなベク
ターとしては、プラスミド、バクテリオファージおよび
コスミドを挙げることかできる。ＤＮＡのクローニング
に使用できるベクターとしては、大腸菌に用いる場合ｐ
Ｕｃ８、ｐｕｃ９、Ｉ）ＡＴ１５３、ｐＢＲ３２５およ
びｐＢＲ３２８が、枯草菌に用いる場合ＤＢＤ９および
ｐＫＴ４３８が、酵母に用いる場合ｐＭＡ５６が、哺乳
類細胞に用い場合 ・ｐＡｄＤ２６ＳＶ （Ａ）−３、 ｐｓＶ２−ｄｈ ｆ ｒＳＳＶＥＨＡ３および５ＶＬＨ
Ａ８がある。
関連蛋白質の表現に使用されるベクターは上述したよう
な制御配列を包含するものである。このようなベクター
としては、大腸菌に用いる場合ｐＸＹ４６０およびｐＷ
ＲＬ ５０７、Ｉｌｉ 乳類ＭＡ Ｉ！に用いる場合ｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒがある。
な制御配列を包含するものである。このようなベクター
としては、大腸菌に用いる場合ｐＸＹ４６０およびｐＷ
ＲＬ ５０７、Ｉｌｉ 乳類ＭＡ Ｉ！に用いる場合ｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒがある。
本発明はさらにその一態様として、本発明のＤＮＡ配列
と、さらにそのＤＮＡ配列の表現を調節するた′めの１
個または２個以上の制御配列を含有するベクターを提供
するものである。
と、さらにそのＤＮＡ配列の表現を調節するた′めの１
個または２個以上の制御配列を含有するベクターを提供
するものである。
上述の方法に使用するのに適当な宿主細胞の例としては
、原核生物たとえばバクテリア（たとえば大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）トｌ８１０１およびＤＩ−（１、枯□。、５
ｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐ、 ） Ｂ Ｄ １７０およ、
。
、原核生物たとえばバクテリア（たとえば大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）トｌ８１０１およびＤＩ−（１、枯□。、５
ｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐ、 ） Ｂ Ｄ １７０およ、
。
ｌＨ６１４０）の細胞、真核生物たとえば酵母細胞（た
とえばＸＶ６１０−８Ｇ酵母細胞）または哺乳類細胞（
たとえばシミアンｃｖ−ｉ細胞）がある。
とえばＸＶ６１０−８Ｇ酵母細胞）または哺乳類細胞（
たとえばシミアンｃｖ−ｉ細胞）がある。
本発明はまたその一態様として、Ｐ、１９５の少なくと
も一部分またはそのエピトープ少なくとも１個を含むペ
プチド、あるいはさらに他のペプチド配列と共有結合し
ていてもよいＦ記Ｐ、１９５の少なくとも一部分または
ペプチドを合成するにあたり、 ａ） プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーを作り、 ｂ） Ｐ、 １９５のプローブを選択して、そのプロ
ーブを放射標識し、 Ｃ） そのプローブを用いてライブラリーの少なくとも
１個のメンバーを選択し、 ｄ）ライブラリーから選択されたＤＮＡを用いて、Ｐ、
１９５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少なく
とも１個を含むペプチドの表現に使用できる適当な宿主
を形質転換する各工程からなる方法を提供するものであ
る。
も一部分またはそのエピトープ少なくとも１個を含むペ
プチド、あるいはさらに他のペプチド配列と共有結合し
ていてもよいＦ記Ｐ、１９５の少なくとも一部分または
ペプチドを合成するにあたり、 ａ） プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーを作り、 ｂ） Ｐ、 １９５のプローブを選択して、そのプロ
ーブを放射標識し、 Ｃ） そのプローブを用いてライブラリーの少なくとも
１個のメンバーを選択し、 ｄ）ライブラリーから選択されたＤＮＡを用いて、Ｐ、
１９５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少なく
とも１個を含むペプチドの表現に使用できる適当な宿主
を形質転換する各工程からなる方法を提供するものであ
る。
本発明はまた、上述の本発明の方法のいずれかによって
得られたＰ、１９５蛋白質またはそのエピトープ少なく
とも１個からなるペプチドを包含する。これらの物質は
、マラリヤに対する免疫を付与するためのワクチンに導
入することができる。
得られたＰ、１９５蛋白質またはそのエピトープ少なく
とも１個からなるペプチドを包含する。これらの物質は
、マラリヤに対する免疫を付与するためのワクチンに導
入することができる。
この目的には、抗原性蛋白質またはそのエピトープ少な
くとも１個からなるペプチドを医薬的に許容される担体
と配合して提供する。この抗原性蛋白質またはペプチド
は単独で、または側のＰ、１９５エピトープ含有ペプチ
ドもしくはマラリヤに対する免疫を付与する他の蛋白質
と組合せて使用できる。
くとも１個からなるペプチドを医薬的に許容される担体
と配合して提供する。この抗原性蛋白質またはペプチド
は単独で、または側のＰ、１９５エピトープ含有ペプチ
ドもしくはマラリヤに対する免疫を付与する他の蛋白質
と組合せて使用できる。
本発明はさらにその一態様として、Ｐ、１９５またはそ
の少なくとも１個のエピトープを含有するペプチドを医
薬的に許容される担体と配合してなる、マラリヤに対す
る免疫を誘発するワクチンを提供するものである。
の少なくとも１個のエピトープを含有するペプチドを医
薬的に許容される担体と配合してなる、マラリヤに対す
る免疫を誘発するワクチンを提供するものである。
この場合の医薬的に許容される担体とは、患者に抗原を
導入するためのビークルとして使用するのに適当な液体
メジウムである。このような担体の例としては食塩水が
ある。Ｐ、１９５またはペプチドは担体中に溶液として
も、また固体として懸濁してもよく、また医薬的に許容
される界面活性剤の添加により可溶化してもよい。
導入するためのビークルとして使用するのに適当な液体
メジウムである。このような担体の例としては食塩水が
ある。Ｐ、１９５またはペプチドは担体中に溶液として
も、また固体として懸濁してもよく、また医薬的に許容
される界面活性剤の添加により可溶化してもよい。
このワクチンは免疫応答を刺激するためのアジュバント
加え、ワクチンの効果を増強させることもできる。本発
明に使用するのに便利なアジュバントには水酸化アルミ
ニウムがある。
加え、ワクチンの効果を増強させることもできる。本発
明に使用するのに便利なアジュバントには水酸化アルミ
ニウムがある。
このワクチンはＰ、１９５またはペプチドを最終濃度が
０．２＞５ＩＩｔｇ／ｍｌ！の範囲、好ましくは０．５
〜２ｒＲｇ／ｒｄ１と（に好ましくはＩ Ｒｇ／ｄにな
るように処方するのが便利である。処方後、ワクチ゛ン
は滅菌容器に充填し、密封し、低温たとえば４℃に保存
してもよい。また凍結乾燥することもできる。
０．２＞５ＩＩｔｇ／ｍｌ！の範囲、好ましくは０．５
〜２ｒＲｇ／ｒｄ１と（に好ましくはＩ Ｒｇ／ｄにな
るように処方するのが便利である。処方後、ワクチ゛ン
は滅菌容器に充填し、密封し、低温たとえば４℃に保存
してもよい。また凍結乾燥することもできる。
を椎動物宿主にマラリヤに対する免疫を誘発するために
は、適当に処方されたワクチンを１回または２回以上投
与する。１回投与量は０．１〜２ｄ１好ましくは０．２
〜１ｄ１とくに好ましくは０．５ｍである。
は、適当に処方されたワクチンを１回または２回以上投
与する。１回投与量は０．１〜２ｄ１好ましくは０．２
〜１ｄ１とくに好ましくは０．５ｍである。
本発明はさらにその一態様として、感受性のを椎動物宿
主に、上述のワクチンの有効量を投与することによる、
宿主へのマラリヤに対する免疫の誘発方法を提供するも
のである。
主に、上述のワクチンの有効量を投与することによる、
宿主へのマラリヤに対する免疫の誘発方法を提供するも
のである。
このワクチンはワクチンの投与に際して慣用されている
任意の方法、軽口的にまたは非軽口的に（たとえば皮下
もしくは筋肉内注射）投与される。
任意の方法、軽口的にまたは非軽口的に（たとえば皮下
もしくは筋肉内注射）投与される。
処置はワクチンの１回投与または一定期間における複数
の投与によって行われる。
の投与によって行われる。
次に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、
これは単に本発明を例示するものであって、本発明をい
かなる意味でも限定するものではない。
これは単に本発明を例示するものであって、本発明をい
かなる意味でも限定するものではない。
匠ユ
Ｐ、１９５遺伝子からのｃＤＮＡクローンのｉプラスモ
ジウム（Ｌ堕江江肛聾）培養を維持し、ホルダーはか（
Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８２）
の記載に従って同調させ、再侵入の最終サイクル後３０
〜４０ｈに遠心分離して細胞を集めた。ＰＢＳ （１５
０＋ＨＮａＣＪｌ、５ｍＨＫＣ１および１０１ＩＩＨリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７，２）中で洗浄したのち、５０
ｇ１Ｈｉ￥酸ナトリウムｐＨ５，５，１００ｍＭ Ｎ
ａＣ１、Ｉ ＩＮ Ｅ Ｄ Ｔ Ａおよび３％Ｗ／Ｖ
になるように添加したＳＤＳの４倍容に細胞を再懸濁し
た。同じ緩衝液で平衡化したフェノール：クロロホルム
（１：１）で激しく５分間抽出したのち、１６．０００
９で３分間遠心分離した。水相に２回目の抽出を行った
のち、エタノールで核酸を沈殿させ、遠心分離し、ペレ
ットを０．１８ ＥＤＴＡ （ｐＨ７，５）にＣ５ＣＪ
！４ｇを加えた液４ｄ中に溶解した。ＲＮＡを０．１８
ＥＤＴＡ中９５％（ｗ／ｖ ） Ｃ５ＣＪ！をクッシ
ョンとして、２５℃、１５０．０００ｇで１６時間遠心
分離してベレット化し、蒸留水に再溶解し、エタノール
で２回沈殿させた。
ジウム（Ｌ堕江江肛聾）培養を維持し、ホルダーはか（
Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８２）
の記載に従って同調させ、再侵入の最終サイクル後３０
〜４０ｈに遠心分離して細胞を集めた。ＰＢＳ （１５
０＋ＨＮａＣＪｌ、５ｍＨＫＣ１および１０１ＩＩＨリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７，２）中で洗浄したのち、５０
ｇ１Ｈｉ￥酸ナトリウムｐＨ５，５，１００ｍＭ Ｎ
ａＣ１、Ｉ ＩＮ Ｅ Ｄ Ｔ Ａおよび３％Ｗ／Ｖ
になるように添加したＳＤＳの４倍容に細胞を再懸濁し
た。同じ緩衝液で平衡化したフェノール：クロロホルム
（１：１）で激しく５分間抽出したのち、１６．０００
９で３分間遠心分離した。水相に２回目の抽出を行った
のち、エタノールで核酸を沈殿させ、遠心分離し、ペレ
ットを０．１８ ＥＤＴＡ （ｐＨ７，５）にＣ５ＣＪ
！４ｇを加えた液４ｄ中に溶解した。ＲＮＡを０．１８
ＥＤＴＡ中９５％（ｗ／ｖ ） Ｃ５ＣＪ！をクッシ
ョンとして、２５℃、１５０．０００ｇで１６時間遠心
分離してベレット化し、蒸留水に再溶解し、エタノール
で２回沈殿させた。
ｍＲＮＡを精製するため、オリゴ−ｄＴセルロースクロ
マトグラフィーを標準法によって実施した［マニアナイ
スほか（Ｈａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ．Ｆｒ１ｔｓｃｈ。
マトグラフィーを標準法によって実施した［マニアナイ
スほか（Ｈａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ．Ｆｒ１ｔｓｃｈ。
Ｅ、Ｆ、 ＆ ５ａｎｌｂｒｏｏｋ、 Ｊ、） ：分
子クローニング−実験便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ
） 、コールド争スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ ５ｐｒｉｎｌＪ ｔｌａｒｂｏｒ ｃａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）
、１９８２］、蔗糖勾配によるＲＮＡのサイズ分画は
以前に報告されているように行った［オデインクほか（
Ｏｄ ｉｎｋ、 Ｋ、 Ｇ。
子クローニング−実験便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ
） 、コールド争スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ ５ｐｒｉｎｌＪ ｔｌａｒｂｏｒ ｃａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）
、１９８２］、蔗糖勾配によるＲＮＡのサイズ分画は
以前に報告されているように行った［オデインクほか（
Ｏｄ ｉｎｋ、 Ｋ、 Ｇ。
ｅｔ ａｌ ） ：ジャーナル・オフ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉｎ、） 、２
５６ ： ＋１４５３〜１４５８ （１９８１）］、
ｃＤＮＡライブラリーは標準操作を用いて構築した［マ
ニアナイスばか（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ） ：
前出（１９８２）］。ｃＤＮＡは６μびのポリへ十ＲＡ
Ｎ、５μ９のオリゴ−ｄＴ（１２〜１８）、１ｍＭの各
ヌクレオシドトリホスフェート、０．１ＨトリスＨＣｊ
！ （ｐＨ８，３） 、１０ｍＭＭｏＣｊ！２．１４０
ｍＭ ＫＣＪ！、１０ｉＨＤＴＴおよび３０ＵのＡＭ
Ｖ逆転写酵素を含む反応液５０μｍ中、４２℃で９０分
間反応させて合成した。 ・ 第２鎖の合成は０．１ＨＨＥＰＥＳ （ｐＨ６，９）、１０ｍＭ Ｍａｘｉ 、２．．５
ｍＭＤＴＴ、７０ａ＋ＨＫＣＩ、０．５ＩＩＨの各ヌク
レオシドトリホスフェートおよび５０Ｕの大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ大断片を含む液０．ｌｄ中、１５℃で１６
時間反応させて行った。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、ＤＮ
Ａ５μ９を回収し、０．５μグをｐＬＩｃ８のｐｓｔ■
部位に単独重合Ｇ−Ｃティリングによって挿入した′［
ヴイアイラはか（Ｖｉｅｉｒａ Ｊ、 ＆ Ｈｅ５ｓｉ
ｎｏ、Ｊ、） ：ジーン（Ｇｅｎｅ ）、１９：２５９
〜２６８ （１９８２）］。形質転換には大腸菌ＨＢ１
０１を用いた。３，０００の形質転換体をもつレプリカ
フィルターを、ｉｎ ＶｉｔｒＯの翻訳で以前にＰ、１
９５をコードするｍＲＮＡに富むことが示されているγ
−３２Ｐ−ＡＴＰポリヌクレオチドキナーゼ標識３３ｓ
ｍＲＮＡ［オデインクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａ
ｌ）、１９８４］で検査した。この検査で、６０個の組
換体プラスミドが検出され、そのうち１２個は強力なシ
グナルを与えた。ニックトランスレーションを行った挿
入体のクロスハイブリダイゼーションに基づき、１２個
の組換体から６個のサブグループが形成された。
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉｎ、） 、２
５６ ： ＋１４５３〜１４５８ （１９８１）］、
ｃＤＮＡライブラリーは標準操作を用いて構築した［マ
ニアナイスばか（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ） ：
前出（１９８２）］。ｃＤＮＡは６μびのポリへ十ＲＡ
Ｎ、５μ９のオリゴ−ｄＴ（１２〜１８）、１ｍＭの各
ヌクレオシドトリホスフェート、０．１ＨトリスＨＣｊ
！ （ｐＨ８，３） 、１０ｍＭＭｏＣｊ！２．１４０
ｍＭ ＫＣＪ！、１０ｉＨＤＴＴおよび３０ＵのＡＭ
Ｖ逆転写酵素を含む反応液５０μｍ中、４２℃で９０分
間反応させて合成した。 ・ 第２鎖の合成は０．１ＨＨＥＰＥＳ （ｐＨ６，９）、１０ｍＭ Ｍａｘｉ 、２．．５
ｍＭＤＴＴ、７０ａ＋ＨＫＣＩ、０．５ＩＩＨの各ヌク
レオシドトリホスフェートおよび５０Ｕの大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ大断片を含む液０．ｌｄ中、１５℃で１６
時間反応させて行った。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、ＤＮ
Ａ５μ９を回収し、０．５μグをｐＬＩｃ８のｐｓｔ■
部位に単独重合Ｇ−Ｃティリングによって挿入した′［
ヴイアイラはか（Ｖｉｅｉｒａ Ｊ、 ＆ Ｈｅ５ｓｉ
ｎｏ、Ｊ、） ：ジーン（Ｇｅｎｅ ）、１９：２５９
〜２６８ （１９８２）］。形質転換には大腸菌ＨＢ１
０１を用いた。３，０００の形質転換体をもつレプリカ
フィルターを、ｉｎ ＶｉｔｒＯの翻訳で以前にＰ、１
９５をコードするｍＲＮＡに富むことが示されているγ
−３２Ｐ−ＡＴＰポリヌクレオチドキナーゼ標識３３ｓ
ｍＲＮＡ［オデインクほか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａ
ｌ）、１９８４］で検査した。この検査で、６０個の組
換体プラスミドが検出され、そのうち１２個は強力なシ
グナルを与えた。ニックトランスレーションを行った挿
入体のクロスハイブリダイゼーションに基づき、１２個
の組換体から６個のサブグループが形成された。
これらの組換えプローブはＰ、１９５のＤＮＡ配列の一
部を表わすという前提から、プラスモジウム（Ｐ、 ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）の全抽出物からの５．３００塩基
以上の長さのｍＲＮＡに上記プローブはハイブリダイズ
するはずである。これが 約１９５，０００８Ｈの蛋白質をコードするのに必要な
最低な長さと評価されるからである。各グループからの
メンバーをニックトランスレーションで標識し、プラス
モジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＲＮＡをプロ
ーブとしてノザン法で検出した［トーマス（Ｔｈｏｍａ
ｓ、Ｐ、Ｓ、 ） ：ブロシーデイングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・・オフ
・ザ・ユナイテッド・スティソ・オフ・アメリカ（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｌｌ５Ａ
）、７７：５２０１〜５２０５ （１９８０）］。それ
ぞれ１．６ｋｂ、２，３ｋｂおよび１．ｌｋｂのｃＤＮ
ＡＤＮＡ５μ９３個の組換体、１）ＦＣｌ２、ＤＦＣｌ
６およびｐＦＣｌ ７が、それぞれサイズ９ｋｂ、７．
５ｋｂおよび５．５ｋｂのｍＲＮＡにハイブリダイズし
た。ＤＦＣｌ ７から単離された挿入ＤＮＡをエキソヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理して、読み取り枠のランダ
ム化と、トリプトファンオペロンの部分をもつ表現プラ
スミドへの押入を行った。ＤＮＡはＢｓ５ｈＩＩ部位に
挿入された。
部を表わすという前提から、プラスモジウム（Ｐ、 ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）の全抽出物からの５．３００塩基
以上の長さのｍＲＮＡに上記プローブはハイブリダイズ
するはずである。これが 約１９５，０００８Ｈの蛋白質をコードするのに必要な
最低な長さと評価されるからである。各グループからの
メンバーをニックトランスレーションで標識し、プラス
モジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＲＮＡをプロ
ーブとしてノザン法で検出した［トーマス（Ｔｈｏｍａ
ｓ、Ｐ、Ｓ、 ） ：ブロシーデイングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・・オフ
・ザ・ユナイテッド・スティソ・オフ・アメリカ（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｌｌ５Ａ
）、７７：５２０１〜５２０５ （１９８０）］。それ
ぞれ１．６ｋｂ、２，３ｋｂおよび１．ｌｋｂのｃＤＮ
ＡＤＮＡ５μ９３個の組換体、１）ＦＣｌ２、ＤＦＣｌ
６およびｐＦＣｌ ７が、それぞれサイズ９ｋｂ、７．
５ｋｂおよび５．５ｋｂのｍＲＮＡにハイブリダイズし
た。ＤＦＣｌ ７から単離された挿入ＤＮＡをエキソヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理して、読み取り枠のランダ
ム化と、トリプトファンオペロンの部分をもつ表現プラ
スミドへの押入を行った。ＤＮＡはＢｓ５ｈＩＩ部位に
挿入された。
成熟ｔｒｐＥ遺伝子生成物、アントラニル酸シンテター
ゼ■のカルボキシ末端から１３個のアミノ酸である。こ
の部位にＣＤＮＡをシフト変異を生己ないように挿入す
ると５６．０ＯＯＨＩｆのアントラニル酸シンテアーゼ
Ｉをもつ融合蛋白質が産生ずる。β−インドールアクリ
ル酸の存在下トリプトファン飢餓により、遺伝子を誘導
すると、生成した組換体のひとつ、ｐＦＴｌ ７３３は
７２．０００８賀（ＳＤＳ −ＰＡＧＥで測定）の融合
蛋白質を与え、これはｃＤＮＡ挿入体によってコードさ
れる１６．０ＯＯＨＩｌが付加したことを意味する。
ゼ■のカルボキシ末端から１３個のアミノ酸である。こ
の部位にＣＤＮＡをシフト変異を生己ないように挿入す
ると５６．０ＯＯＨＩｆのアントラニル酸シンテアーゼ
Ｉをもつ融合蛋白質が産生ずる。β−インドールアクリ
ル酸の存在下トリプトファン飢餓により、遺伝子を誘導
すると、生成した組換体のひとつ、ｐＦＴｌ ７３３は
７２．０００８賀（ＳＤＳ −ＰＡＧＥで測定）の融合
蛋白質を与え、これはｃＤＮＡ挿入体によってコードさ
れる１６．０ＯＯＨＩｌが付加したことを意味する。
バクテリア抽出物とプラスモジウム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）分裂前体抽出物をＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセル
ロースに移し、ついでＰ、１９５に特異的な多価ウサギ
血清で調べた。ｐＦＴｌ ７３３の融合蛋白質は抗血清
によって明らかに検知された。この抗血清はプラスモジ
ウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ＋）分裂前体の全抽
出物からＰ、１９ｇのみを検知し、著しくＰ、１９５に
特異的であった。Ｌ立且王遺伝子生成物およびロ蹄疫つ
ィルスＶＰ１蛋白質からなる８０．０ＯＯＨＷ融合蛋白
質を含むバクテリア抽出物とは反応しなかった。さらに
、正常ウサギ血清を用いた対照では結合は認められなか
った。すなわち、ｐＦＣｌ ７はプラスモジウム （Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） Ｐ、 １９５の抗原決
定基の一部をコードする。ｐＦＣｌ ７についてはその
別名ｐＰＦＣ１０１７によって以下に引用される。
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセル
ロースに移し、ついでＰ、１９５に特異的な多価ウサギ
血清で調べた。ｐＦＴｌ ７３３の融合蛋白質は抗血清
によって明らかに検知された。この抗血清はプラスモジ
ウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ＋）分裂前体の全抽
出物からＰ、１９ｇのみを検知し、著しくＰ、１９５に
特異的であった。Ｌ立且王遺伝子生成物およびロ蹄疫つ
ィルスＶＰ１蛋白質からなる８０．０ＯＯＨＷ融合蛋白
質を含むバクテリア抽出物とは反応しなかった。さらに
、正常ウサギ血清を用いた対照では結合は認められなか
った。すなわち、ｐＦＣｌ ７はプラスモジウム （Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） Ｐ、 １９５の抗原決
定基の一部をコードする。ｐＦＣｌ ７についてはその
別名ｐＰＦＣ１０１７によって以下に引用される。
例 ２
組換ＣＤＮＡライブラリーをサイズ分画したＣＤＮＡか
ら構築した。例１と同様にして調製し、ティリングした
ＣＤＮＡを２５１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４＞、１
００ｉＨＮａＣ１，２，５１ＨＥＤＴ人中５％〜２０％
（ｖ／ｖ ）蔗糖勾配５Ｊ１１！に、５Ｗ５０．１０−
ター（ベックマン）を用い４５、ＯＯＯｒｐｍで３時間
遠心分離した。２ ｋｂｐ〜８ｋｂｐ領域（７）ＣＤＮ
Ａ （約１００ｎｏ）を収穫し、３００ ｎｏのｄＧ−
ティリングＰｓｔｌ消化ｐｌＪｃ９でアニーリングし、
ＤＨ１細胞のアンピシリン抵抗性形質転換に使用した。
ら構築した。例１と同様にして調製し、ティリングした
ＣＤＮＡを２５１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４＞、１
００ｉＨＮａＣ１，２，５１ＨＥＤＴ人中５％〜２０％
（ｖ／ｖ ）蔗糖勾配５Ｊ１１！に、５Ｗ５０．１０−
ター（ベックマン）を用い４５、ＯＯＯｒｐｍで３時間
遠心分離した。２ ｋｂｐ〜８ｋｂｐ領域（７）ＣＤＮ
Ａ （約１００ｎｏ）を収穫し、３００ ｎｏのｄＧ−
ティリングＰｓｔｌ消化ｐｌＪｃ９でアニーリングし、
ＤＨ１細胞のアンピシリン抵抗性形質転換に使用した。
６個のアガール板上に１，２００個の組換体が得られた
。レプリカフィルターを、ニックトランスレーションで
標識した。ｐＰＦｃｌｏｌ７からの挿入ＤＮＡで検査し
た。１１個のクローンがこのプローブにハイブリダイズ
したＤＮＡを含むものとして同定された。
。レプリカフィルターを、ニックトランスレーションで
標識した。ｐＰＦｃｌｏｌ７からの挿入ＤＮＡで検査し
た。１１個のクローンがこのプローブにハイブリダイズ
したＤＮＡを含むものとして同定された。
これらのクローンにＩｌｌ＞ＰＦＣｌｏｏｌから１０１
１までの番号を付した。これらのクローンを、ｐＰＦｃ
ｌｏｌ７とりＯスハイプリダイゼーションしないｐＰＦ
Ｃ１００７中の挿入体の一部分・を用いて再スクリーニ
ングした。このプローブにハイブリダイズするさらに８
個のクローン、ｐＰＦＣ１０２８〜１０３５が単離され
た。
１までの番号を付した。これらのクローンを、ｐＰＦｃ
ｌｏｌ７とりＯスハイプリダイゼーションしないｐＰＦ
Ｃ１００７中の挿入体の一部分・を用いて再スクリーニ
ングした。このプローブにハイブリダイズするさらに８
個のクローン、ｐＰＦＣ１０２８〜１０３５が単離され
た。
１００ｎａのｄＱ−ティリングＣＤＮＡを用いてざらに
ＣＤＮＡライブラリーを構築し、１ｏｏｎａのＧ−ティ
リングｐＵｃ９でアニーリングし、ＤＨＩ細胞に形質転
換した。約６０００個の組換体が得られ、これらをレプ
１）カフイルター上、ｐＰ’Ｆｃ１０１７からの３４０
ｂｐＨｉ ｎ ｄ−Ｉｌｌ −Ｐｓｔ１断片でスクリー
ニングした。このプローブにハイブリダイズしたクロー
ンｐＰＦＣ１０１３〜１０１６および１０１８〜１０２
７を取り、精製した。このライブラリーもｐＰｌ−ｃ１
００７由来のプローブでスクリーニングし、さらに１１
個のコロニー、ｐＰＦｃ１０３６〜１０４６を得た。
ＣＤＮＡライブラリーを構築し、１ｏｏｎａのＧ−ティ
リングｐＵｃ９でアニーリングし、ＤＨＩ細胞に形質転
換した。約６０００個の組換体が得られ、これらをレプ
１）カフイルター上、ｐＰ’Ｆｃ１０１７からの３４０
ｂｐＨｉ ｎ ｄ−Ｉｌｌ −Ｐｓｔ１断片でスクリー
ニングした。このプローブにハイブリダイズしたクロー
ンｐＰＦＣ１０１３〜１０１６および１０１８〜１０２
７を取り、精製した。このライブラリーもｐＰｌ−ｃ１
００７由来のプローブでスクリーニングし、さらに１１
個のコロニー、ｐＰＦｃ１０３６〜１０４６を得た。
これらのｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡを塩
化セシウム勾配上で遠心分離して精製し、制限酵素地図
の作成およびクロスハイブリダイゼーションによって性
質を調べた。ＣＤＮＡクローン“を重複線状配列に調製
した。配列分析に用いた６個のＣＤＮＡクローンの位置
を第２図に示 コす。
化セシウム勾配上で遠心分離して精製し、制限酵素地図
の作成およびクロスハイブリダイゼーションによって性
質を調べた。ＣＤＮＡクローン“を重複線状配列に調製
した。配列分析に用いた６個のＣＤＮＡクローンの位置
を第２図に示 コす。
毀−１
Ｐ、１９５ 公子からのゲノムクローンプラスモジウ
ム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＋＋） Ｄ Ｎ Ａ ［
オデインクはか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ ） ：前出
（１９８４）の方法で調製］をＨｉ ｎｄｌｌ［で完全
に消化し、サンプルを１０〜ｂ ２０１Ｍトリス−ＨＣｊ！ （ｐｔ１８．０） 、 ５
ｍＨ−を用いて２０℃、２６．ＯＯＯｒｐｍで２４時間
遠心分離した。管の底の細孔部から０．５ｍの分画を集
め各分画の一部を１％アガロースゲル上に走らせた。ニ
ックトランスレーションを行ったｐＰＦｃｌｏｌ７との
ハイブリダイゼーションで陽性シグナル示した勾配領域
の分画をＥＣ０ＲＩで消化し、ゲル精製ト１ｉ ｎｄｌ
［ｌ＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＬＩＣ８ＤＮＡでリゲートした
。各分画からのＤＨＩ形質転換体約４００個をニトロセ
ルロースフィルター上、ｐＰＦｃｌｏｌ ７挿入体との
コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニング
を行った［グルンシュタインはか（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
。
ム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＋＋） Ｄ Ｎ Ａ ［
オデインクはか（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ ） ：前出
（１９８４）の方法で調製］をＨｉ ｎｄｌｌ［で完全
に消化し、サンプルを１０〜ｂ ２０１Ｍトリス−ＨＣｊ！ （ｐｔ１８．０） 、 ５
ｍＨ−を用いて２０℃、２６．ＯＯＯｒｐｍで２４時間
遠心分離した。管の底の細孔部から０．５ｍの分画を集
め各分画の一部を１％アガロースゲル上に走らせた。ニ
ックトランスレーションを行ったｐＰＦｃｌｏｌ７との
ハイブリダイゼーションで陽性シグナル示した勾配領域
の分画をＥＣ０ＲＩで消化し、ゲル精製ト１ｉ ｎｄｌ
［ｌ＋ＥｃｏＲＩ切断ｐＬＩＣ８ＤＮＡでリゲートした
。各分画からのＤＨＩ形質転換体約４００個をニトロセ
ルロースフィルター上、ｐＰＦｃｌｏｌ ７挿入体との
コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニング
を行った［グルンシュタインはか（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
。
Ｈ，＆ Ｈｏｏｎｅｓｓ、 Ｄ、 ） ニブＯシーデ
イングズ・オフ・ザ・ナシヨナル・アカデミ−・オフ・
ザイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、） 、７２ ：３９６１ （１９７５）］。分
画３９からの１個のコロニーが陽性シグナルを与えた。
イングズ・オフ・ザ・ナシヨナル・アカデミ−・オフ・
ザイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、） 、７２ ：３９６１ （１９７５）］。分
画３９からの１個のコロニーが陽性シグナルを与えた。
この組換体、ｐＰＦｇｌは相当するゲノムＤＮＡ断片と
共移動する３、１ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
を含み、両者は同じ制限酵素地図を有する。ｐＰＦｑ１
挿人体の部分末端標識マツピングによりｐＰＦａｌの制
限地図が得られた［スミスほか（Ｓａ＋ｉｔｈ。
共移動する３、１ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
を含み、両者は同じ制限酵素地図を有する。ｐＰＦｑ１
挿人体の部分末端標識マツピングによりｐＰＦａｌの制
限地図が得られた［スミスほか（Ｓａ＋ｉｔｈ。
Ｈ，０，８ＢｉｒｎＳｔｉｅｌ、 Ｈ，Ｌ、 ）ヌーク
レイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 ） 、３ ：２３８７ （’１９６７）］
。配列決定は例５に記載のサンガー・ジブオキシン法で
実施した。
レイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 ） 、３ ：２３８７ （’１９６７）］
。配列決定は例５に記載のサンガー・ジブオキシン法で
実施した。
プラスモジウム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） Ｄ Ｎ
Ａはオディンクほか［０ｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ ：
前出（１９８４）’ ］の記載したようにして調製し、
そｐ一部を、特異的エンドヌクレアーゼを個々にまた場
合により二重消化すなわち２個の１ｉＩＪ限エンドヌク
レアーゼを用いて制限した。生成物を０．５μｇ／＃ｌ
ｉ！のエチジウムプロミドを含有するトリス−ホウ酸−
ＥＤＴＡ （ｐ）１８．２）中アガロースゲル（０，７
％〜１．５％）上、平行トラックに既知の長さのＤＮＡ
断片をサイズマーカーとして置いて、電気泳動に付した
。ＤＮＡを毛管プロット操作によってジーン・スクリー
ン・プラス（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎＰｌｕｓ ； Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ／ Ｄｕｐｏ
ｎｔ）に移し、業者の示したプロトコールに従って５０
％ホルムアミドの存在下４２℃で３２ｐｓｔ識プローブ
ＤＮＡにハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプロ
ーブＤＮＡはクロネツクス・ライトニング−プラス（Ｃ
ｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ ）スクリ
ーン間のＸ−ＱｍａｔＳフィルムを用い、７０℃でオー
トラジオグラフィーにより検出した。
Ａはオディンクほか［０ｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ ：
前出（１９８４）’ ］の記載したようにして調製し、
そｐ一部を、特異的エンドヌクレアーゼを個々にまた場
合により二重消化すなわち２個の１ｉＩＪ限エンドヌク
レアーゼを用いて制限した。生成物を０．５μｇ／＃ｌ
ｉ！のエチジウムプロミドを含有するトリス−ホウ酸−
ＥＤＴＡ （ｐ）１８．２）中アガロースゲル（０，７
％〜１．５％）上、平行トラックに既知の長さのＤＮＡ
断片をサイズマーカーとして置いて、電気泳動に付した
。ＤＮＡを毛管プロット操作によってジーン・スクリー
ン・プラス（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎＰｌｕｓ ； Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ／ Ｄｕｐｏ
ｎｔ）に移し、業者の示したプロトコールに従って５０
％ホルムアミドの存在下４２℃で３２ｐｓｔ識プローブ
ＤＮＡにハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプロ
ーブＤＮＡはクロネツクス・ライトニング−プラス（Ｃ
ｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ ）スクリ
ーン間のＸ−ＱｍａｔＳフィルムを用い、７０℃でオー
トラジオグラフィーにより検出した。
プローブＤＮＡはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡプラスミ
ドクローンから切り出した特異的プラスミドＤＮＡまた
は特、異的配列であり、アガロースゲル電気泳動および
溶出により精製された。
ドクローンから切り出した特異的プラスミドＤＮＡまた
は特、異的配列であり、アガロースゲル電気泳動および
溶出により精製された。
ＤＮＡは３２［Ｐ］α−ＡＴＰの存在下、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼとのニックトランスレーションにより標識
した。特異的プローブにハイブリダイズしたゲノムＤＮ
Ａ内からの制限断片のサイズの分析により、構築すべき
制限酵素部位の線状地図ができた。このようなＰ、１９
５遺伝子地図を、特異的断片がハイブリダイズする典型
的な部位およびプローブとともに第３図に示す。ゲノム
ＤＮＡの他の特異的消化も数種実施し、クローンＤＮＡ
からの他の特異的断片で検査したことはいうまでもない
。結果は第３図に示した地図と一致した。地区を繁雑に
しないように、ＤＮＡ配列に存在する制限部位のすべて
は示していない。
ポリメラーゼとのニックトランスレーションにより標識
した。特異的プローブにハイブリダイズしたゲノムＤＮ
Ａ内からの制限断片のサイズの分析により、構築すべき
制限酵素部位の線状地図ができた。このようなＰ、１９
５遺伝子地図を、特異的断片がハイブリダイズする典型
的な部位およびプローブとともに第３図に示す。ゲノム
ＤＮＡの他の特異的消化も数種実施し、クローンＤＮＡ
からの他の特異的断片で検査したことはいうまでもない
。結果は第３図に示した地図と一致した。地区を繁雑に
しないように、ＤＮＡ配列に存在する制限部位のすべて
は示していない。
ＤＮＡ配列からのゲノム地図および制限酵素地図の調査
により、これらの２つは蛋白質コード配列に相当する領
域で、ヌクレオシド３１３におけるＨｉｎｄｌｌ［部位
の右側に、共直線性であることが示された。しかしなが
ら、ゲノムＤＮＡには、ＣＤＮＡクローンに存在しない
付加的な７００ ｐｂの配列が、ＣＤＮＡ配列中のヌク
レオシド２２１と３１３のＭｂｏ１部位およびＨｉ ｎ
ｄｎ１部位のの間に存在した。これはコード配列の開始
直後のイントロンと考えられる。
により、これらの２つは蛋白質コード配列に相当する領
域で、ヌクレオシド３１３におけるＨｉｎｄｌｌ［部位
の右側に、共直線性であることが示された。しかしなが
ら、ゲノムＤＮＡには、ＣＤＮＡクローンに存在しない
付加的な７００ ｐｂの配列が、ＣＤＮＡ配列中のヌク
レオシド２２１と３１３のＭｂｏ１部位およびＨｉ ｎ
ｄｎ１部位のの間に存在した。これはコード配列の開始
直後のイントロンと考えられる。
地−上に示した部位は、酵素Ａ（Ａｊ！ｕＩ）、Ｂ （
ＢａｍＨＩ）、Ｅ （ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（Ｈｉｎｄｌ）
、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｎ（ＮｄｅＩ）Ｐ （ＰｓｔＩ）．
Ｐｖ （ＰｖｕＩ［）、Ｒ（ＲｓａＩ）およびＴ（Ｔａ
ｑＩ）部位の一部である。プローブは全プラスミドかま
たは挿入体もしくはプラスミドポリリンカー領域内での
部位で特異的酵素により消化して誘導した特異的断片で
ある。
ＢａｍＨＩ）、Ｅ （ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（Ｈｉｎｄｌ）
、Ｍ（ＭｂｏＩ）、Ｎ（ＮｄｅＩ）Ｐ （ＰｓｔＩ）．
Ｐｖ （ＰｖｕＩ［）、Ｒ（ＲｓａＩ）およびＴ（Ｔａ
ｑＩ）部位の一部である。プローブは全プラスミドかま
たは挿入体もしくはプラスミドポリリンカー領域内での
部位で特異的酵素により消化して誘導した特異的断片で
ある。
烈
ＤＮＡの配列分析はマサキムはか（Ｈａｘａｍ ＆Ｇ１
１ｂｅｒｔ 、前出、１９８０）の化学的切断法および
サンガーの（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、前出、１９７
７）ジデオキシ法で実施した。
１ｂｅｒｔ 、前出、１９８０）の化学的切断法および
サンガーの（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、前出、１９７
７）ジデオキシ法で実施した。
１、化学的切断
配列分析に適当なりＮＡ断片は次のようにして調製した
。
。
ａ）ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（業者指定の条件
による）で消化し、ついで混合物にウシ腸アルカリホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え、反応を
３７℃で３０分間続けた。
による）で消化し、ついで混合物にウシ腸アルカリホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え、反応を
３７℃で３０分間続けた。
ＤＮＡをクロロパンで抽出し、エタノールで沈殿させた
。ＤＮＡの５′末端をマニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ、前出、１９８２）の記載に従い、ポリヌ
クレチオドキナーゼを用いて［３２Ｐ］で標識した。標
識ＤＮＡを第２の適当な制限エンドヌクレア、−ゼで切
断し、混合物を１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルに負荷し
、問題のＤＮＡバンドをこのアガロースゲルから電気溶
出し、その配列を決定した。
。ＤＮＡの５′末端をマニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ、前出、１９８２）の記載に従い、ポリヌ
クレチオドキナーゼを用いて［３２Ｐ］で標識した。標
識ＤＮＡを第２の適当な制限エンドヌクレア、−ゼで切
断し、混合物を１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルに負荷し
、問題のＤＮＡバンドをこのアガロースゲルから電気溶
出し、その配列を決定した。
ｂ）ＤＮＡ断片は上記ａ）項に記載の操作を改良法によ
っても調製した。ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消
化し、ホスファターゼ処理し、゛５′末端を上に略述し
たよ、うにして［３２Ｐ］で標識した。次にＤＮＡ断片
を脱イオンホルムアミド添加［最終濃度７０％（Ｖ／Ｖ
’） ］により変性させ、１００℃に５分間加熱した
。サンプルを氷水で急冷し、直ちに非変性１５％ポリア
クリルアミドゲル［アクリルアミド：ビスアクリルアミ
ド比、６０：１（Ｗ／Ｗ）］上に負荷した。分離された
ＤＮＡ鎖をゲルから電気法用し、配列決定した。
っても調製した。ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消
化し、ホスファターゼ処理し、゛５′末端を上に略述し
たよ、うにして［３２Ｐ］で標識した。次にＤＮＡ断片
を脱イオンホルムアミド添加［最終濃度７０％（Ｖ／Ｖ
’） ］により変性させ、１００℃に５分間加熱した
。サンプルを氷水で急冷し、直ちに非変性１５％ポリア
クリルアミドゲル［アクリルアミド：ビスアクリルアミ
ド比、６０：１（Ｗ／Ｗ）］上に負荷した。分離された
ＤＮＡ鎖をゲルから電気法用し、配列決定した。
２、ジデオキシ配列決定
挿入体断片を線状ファージクローニング／シクエンシン
グベクターＭ１３１１１１）８中にサプク０−二ングし
てＤＮＡ鋳型を調製した［メシングはか（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ ＆ Ｖｉｅｉｒａ） ：前出、１９８２］．配列決
定はサンガー（Ｓａｎｏｅｒ ｅｔ ａｌ ：前出、１
９７７）の記載に従い、合成共通プライマー（Ｃｅｌｌ
ｔｅｃｈ）および［３”Ｓ ］ −ｄ Ａ Ｔ Ｐ ａ
Ｓ （ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉＯｌｎａ
ｌ ）を用いて実施した。特異的断片の配列決定には二
塩基法を用いた。まず、特異的制限断片（ＲｓａＩ、Ｈ
ｉｎｆＩ、ＲｓａＩ−Ａｈａｌｌｌ、ＴａｑＩ消化によ
り製造）を電気溶出によって精製し、必要な場合には、
付着端をクレノーＤＮＡポリメラーゼ■断片を用いてプ
ラント端にした。上記プロトコールによるクローニング
または配列決定が困難な断片はＢａ１−３１ ［マニア
テイスホか（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、１９８２
）で処理した。条件（ＤＮＡおよび酵素濃度）は、断片
の各末端から１００〜１５０ｂｐＤＮＡｈ＜３０℃で１
分間に除去されるように選択した。消化の過程で一連の
重複断片が得られた。Ｂａｄ−３１処理ＤＮＡをＤＮＡ
ポリメラーゼエクレノー断片で修復した。ＤＮＡをホス
ファターゼ処理３ｍａＩ−消化Ｍ １３ ｍｐ８（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）でリゲートし、ＪＭ１０３またはＪＭｌ
ｏｌにトランスフェクションした［メシングｔよか（Ｈ
ｅｓｓｉ’ｎｇ、Ｊ、ｅｔ ａｌ ） ：メクレイツク
・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
）、９：３０９（１９８１）］、標準操作に従って、鋳
型ＤＮＡを調製した。可能な場合には、各クローンの両
鏡から配列が得られた。
グベクターＭ１３１１１１）８中にサプク０−二ングし
てＤＮＡ鋳型を調製した［メシングはか（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ ＆ Ｖｉｅｉｒａ） ：前出、１９８２］．配列決
定はサンガー（Ｓａｎｏｅｒ ｅｔ ａｌ ：前出、１
９７７）の記載に従い、合成共通プライマー（Ｃｅｌｌ
ｔｅｃｈ）および［３”Ｓ ］ −ｄ Ａ Ｔ Ｐ ａ
Ｓ （ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉＯｌｎａ
ｌ ）を用いて実施した。特異的断片の配列決定には二
塩基法を用いた。まず、特異的制限断片（ＲｓａＩ、Ｈ
ｉｎｆＩ、ＲｓａＩ−Ａｈａｌｌｌ、ＴａｑＩ消化によ
り製造）を電気溶出によって精製し、必要な場合には、
付着端をクレノーＤＮＡポリメラーゼ■断片を用いてプ
ラント端にした。上記プロトコールによるクローニング
または配列決定が困難な断片はＢａ１−３１ ［マニア
テイスホか（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、１９８２
）で処理した。条件（ＤＮＡおよび酵素濃度）は、断片
の各末端から１００〜１５０ｂｐＤＮＡｈ＜３０℃で１
分間に除去されるように選択した。消化の過程で一連の
重複断片が得られた。Ｂａｄ−３１処理ＤＮＡをＤＮＡ
ポリメラーゼエクレノー断片で修復した。ＤＮＡをホス
ファターゼ処理３ｍａＩ−消化Ｍ １３ ｍｐ８（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）でリゲートし、ＪＭ１０３またはＪＭｌ
ｏｌにトランスフェクションした［メシングｔよか（Ｈ
ｅｓｓｉ’ｎｇ、Ｊ、ｅｔ ａｌ ） ：メクレイツク
・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
）、９：３０９（１９８１）］、標準操作に従って、鋳
型ＤＮＡを調製した。可能な場合には、各クローンの両
鏡から配列が得られた。
各クローンの配列を重複させることにより得られた全配
列を第１図に示す。配列の決定に用いたクローンはＤＮ
Ａ配列から得られた第２図の制限地図の下に示す。
列を第１図に示す。配列の決定に用いたクローンはＤＮ
Ａ配列から得られた第２図の制限地図の下に示す。
例 ６
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養プラスモジウム（Ｐ、 ｆａｆｃ
ｉｐａｒｕｍ）からの上清（例１参照）を収穫し、１０
．０００９で５分間遠心分離して細胞層を除去した。培
養上清各１００ｎｅに１１ｄの１Ｍトリス、１００ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍＨＥＧＴＡ、ｌＩｄの１００ｍＨＰ
ＭＳＦ、 １ｍの０．５Ｍヨードアセｉ−アミド、１ｄ
の１０ｍＨＴＬＣＫおよび０４５ｇのデオキシコール酸
ナトリウムを加えた。ｐＨをＨＣｌで８．２に調整し、
ついでサンプルを １００．０００ｇで４５分間遠心分離した。遠心分離後
の上清を、あらかじめ１ｍＨＥＤＴＡ、１ｍＨＥＧＴＡ
および０．５％（、ｗ／ｖ ） −Ｆオキシコール酸ナ
トリウム含有１０ＩＩｌ旧−リス−ＨＣ１（ｐＨ８，２
） （平衡緩衝液）で平衡化した抗体８９．１−セフ
ァロースカラム［ホルダーはか（Ｍｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ’ ） 、前出（１９８４ｂ）に記載の
方法により調製）１０ｄに適用した。カラムを平衡緩衝
液で十分洗浄したのち、カラムに残った物質を０．５％
（Ｗ／Ｖ ）デオキシコール酸ナトリウム含有５ＱｍＨ
ジエチルアミン塩酸塩（ＤＨｌｌ、５）で溶出した。溶
出液をへｍ１ｃｏｎχＨ５０フィルターを用いて限外濾
過し、ｐＨを８．２に調製した。溶出液中の主ポリペプ
チドは８３、ＯＯ’ＯＨ一種であり、これがウェスタン
法でモノクロナール抗体８９．１．ウサギ多価抗Ｐ、１
９５血清またはヒトプラスモジウム（Ｐ、ｆａｌｃｔｐ
ａｒｕｍ）免疫血清のいずれかと反応する唯一の成分で
あった。生成物中の主夾雑物は１ｏＧで１、溶出液を濃
縮したのち、上述のようにして平衡化したプロティンＡ
−セファロースカラム（０，９Ｘ １０ｃｍ） （Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ）を通
して除去できた。Ｉｃ＋Ｇが除去された、遅れない物質
を集めた。固体の塩酸グアニジンを澄明な溶液が得られ
るまで加え、ついで蛋白質を還元し、Ｓ−カルボキシメ
チル化した［ワックスダールほか（１４ａｘｄａ１．
Ｈ，Ｊ、ｅｔ ａｌ ） ：バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、７ ：１９５９〜１９６６
（１９６８）］。還元され、Ｓ−カルボキシメチル化
された８３，０００１４Ｗポリペプチドを最後に、１
ｒａＨＥ Ｄ Ｔ Ａ 、 １ ｍＷＥＧＴＡおよび６
ＭｆＪ！酸グアニジン含有の１０ｍ）ｌトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８，２）で平衡化したセファクリルＳ ３００
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｔｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ、スウェーデン）のカラムを通して精製した。各分画
を２８０ ｎｍでの°比色定量および５ＤＳ−ＰＡＧＥ
分析によって調べ、８３．０００Ｈ１１種含有分画をプ
ールした。水および５％（Ｖ／Ｖ ）ギ酸に対して十分
に透析したのち、サンプルを凍結乾燥し、５％ギ鍍の小
容量にとり自動シクエンサーに適用した。この蛋白質を
、バカナリーら［Ｂａｃｃａｎａｒｉ。
ｉｐａｒｕｍ）からの上清（例１参照）を収穫し、１０
．０００９で５分間遠心分離して細胞層を除去した。培
養上清各１００ｎｅに１１ｄの１Ｍトリス、１００ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍＨＥＧＴＡ、ｌＩｄの１００ｍＨＰ
ＭＳＦ、 １ｍの０．５Ｍヨードアセｉ−アミド、１ｄ
の１０ｍＨＴＬＣＫおよび０４５ｇのデオキシコール酸
ナトリウムを加えた。ｐＨをＨＣｌで８．２に調整し、
ついでサンプルを １００．０００ｇで４５分間遠心分離した。遠心分離後
の上清を、あらかじめ１ｍＨＥＤＴＡ、１ｍＨＥＧＴＡ
および０．５％（、ｗ／ｖ ） −Ｆオキシコール酸ナ
トリウム含有１０ＩＩｌ旧−リス−ＨＣ１（ｐＨ８，２
） （平衡緩衝液）で平衡化した抗体８９．１−セフ
ァロースカラム［ホルダーはか（Ｍｏｌｄｅｒ ＆
Ｆｒｅｅｍａｎ’ ） 、前出（１９８４ｂ）に記載の
方法により調製）１０ｄに適用した。カラムを平衡緩衝
液で十分洗浄したのち、カラムに残った物質を０．５％
（Ｗ／Ｖ ）デオキシコール酸ナトリウム含有５ＱｍＨ
ジエチルアミン塩酸塩（ＤＨｌｌ、５）で溶出した。溶
出液をへｍ１ｃｏｎχＨ５０フィルターを用いて限外濾
過し、ｐＨを８．２に調製した。溶出液中の主ポリペプ
チドは８３、ＯＯ’ＯＨ一種であり、これがウェスタン
法でモノクロナール抗体８９．１．ウサギ多価抗Ｐ、１
９５血清またはヒトプラスモジウム（Ｐ、ｆａｌｃｔｐ
ａｒｕｍ）免疫血清のいずれかと反応する唯一の成分で
あった。生成物中の主夾雑物は１ｏＧで１、溶出液を濃
縮したのち、上述のようにして平衡化したプロティンＡ
−セファロースカラム（０，９Ｘ １０ｃｍ） （Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ）を通
して除去できた。Ｉｃ＋Ｇが除去された、遅れない物質
を集めた。固体の塩酸グアニジンを澄明な溶液が得られ
るまで加え、ついで蛋白質を還元し、Ｓ−カルボキシメ
チル化した［ワックスダールほか（１４ａｘｄａ１．
Ｈ，Ｊ、ｅｔ ａｌ ） ：バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、７ ：１９５９〜１９６６
（１９６８）］。還元され、Ｓ−カルボキシメチル化
された８３，０００１４Ｗポリペプチドを最後に、１
ｒａＨＥ Ｄ Ｔ Ａ 、 １ ｍＷＥＧＴＡおよび６
ＭｆＪ！酸グアニジン含有の１０ｍ）ｌトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８，２）で平衡化したセファクリルＳ ３００
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｔｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ、スウェーデン）のカラムを通して精製した。各分画
を２８０ ｎｍでの°比色定量および５ＤＳ−ＰＡＧＥ
分析によって調べ、８３．０００Ｈ１１種含有分画をプ
ールした。水および５％（Ｖ／Ｖ ）ギ酸に対して十分
に透析したのち、サンプルを凍結乾燥し、５％ギ鍍の小
容量にとり自動シクエンサーに適用した。この蛋白質を
、バカナリーら［Ｂａｃｃａｎａｒｉ。
Ｄ、Ｐ、ｅｔ ａｌ ：ジャーナル・オフ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、８ｉｏ１．ＣｈｅＩＩｌ、）
、２５９ ：１２２９１〜１２２９Ｂ（１９８４）］
の記載のように０．３３Ｍ Ｑｕａｄｒｏｌプログラ
ムヲ用イ、Ｓｅｑｕａｍａｔ ｐ６オートコンバーター
およびｓｅｑｕａｍａｔＳＣ〜５１０ブＯグラムコント
ローラーを装置したベックマン８９０Ｇシクエンサーに
より、２０サイクルの自動化エドマン分解に付した。放
出されたアミノ酸のフェニルチオヒダントイン１１３体
を逆相１−ＩＰＬｃで同定し、逆加水分解で確認した［
バカナリーほか（８ａｃｃａｎａｒｉ、 ｅｔ ａｔ）
：前出、１９８４］。培養上滑９１０ｄに出発し、親
和性カラムからの溶出液に蛋白質５．９ηが存在した。
カル・ケミストリー（Ｊ、８ｉｏ１．ＣｈｅＩＩｌ、）
、２５９ ：１２２９１〜１２２９Ｂ（１９８４）］
の記載のように０．３３Ｍ Ｑｕａｄｒｏｌプログラ
ムヲ用イ、Ｓｅｑｕａｍａｔ ｐ６オートコンバーター
およびｓｅｑｕａｍａｔＳＣ〜５１０ブＯグラムコント
ローラーを装置したベックマン８９０Ｇシクエンサーに
より、２０サイクルの自動化エドマン分解に付した。放
出されたアミノ酸のフェニルチオヒダントイン１１３体
を逆相１−ＩＰＬｃで同定し、逆加水分解で確認した［
バカナリーほか（８ａｃｃａｎａｒｉ、 ｅｔ ａｔ）
：前出、１９８４］。培養上滑９１０ｄに出発し、親
和性カラムからの溶出液に蛋白質５．９ηが存在した。
蛋白質２．６ｍｙをプロティンＡ−セファロースカラム
に通じ、精製蛋白質４００μ９をエドマン分解に付した
。
に通じ、精製蛋白質４００μ９をエドマン分解に付した
。
ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に出発し、分解サイクル
を（り返すと、以下の部分アミノ酸配列が得られた。
を（り返すと、以下の部分アミノ酸配列が得られた。
１、 ２． ３． ４． ５． ６． ７． ８． ９
．１０、Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ
、Ｉ、Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌｌｌ、 １２． １３． １４． １５． １６．
１７． １８． １９． ２０゜Ｌｙｓ／ＰｈｅＬｙ
ｓ／ＰｈｅＬｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｔ位置１〜５の残
基は明瞭に同定できなかった 登（Ｎ、１．）
。用いたＨＰＬＣシステムではリジンとフェニルアラニ
ン誘導体をたがいに分離できなかった。
．１０、Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ、１． Ｎ
、Ｉ、Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌｌｌ、 １２． １３． １４． １５． １６．
１７． １８． １９． ２０゜Ｌｙｓ／ＰｈｅＬｙ
ｓ／ＰｈｅＬｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｔ位置１〜５の残
基は明瞭に同定できなかった 登（Ｎ、１．）
。用いたＨＰＬＣシステムではリジンとフェニルアラニ
ン誘導体をたがいに分離できなかった。
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンから誘導されたヌ
クレオチド配列の検査によって、この残基の配列（６〜
２０）はヌクレオチド２８８〜３２２の翻訳配列に相当
することがわかった。
クレオチド配列の検査によって、この残基の配列（６〜
２０）はヌクレオチド２８８〜３２２の翻訳配列に相当
することがわかった。
この分析では、８３，０００ＨＩ４断片はＰ、１９５プ
レカーサーのアミノ末端配列から誘導される。
レカーサーのアミノ末端配列から誘導される。
完全配列では、ヌクレオチド２１６のＡＵＧ （メチオ
ニン）開始コドンが１８個のアミノ酸のヌクレオチド配
列が続き、これは多くの膜または分泌蛋白質の一次翻訳
生成物上に存在するシグナル配列に相当し、通常これは
蛋白質が小胞体の管腔中に通過するとき切断される［ク
ライル（Ｋｒｅｉ Ｉ、 Ｇ、 ） ：アニュアル・レ
ビュー・オプ・バイオケミストリー （八ｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 、 ５０ ： ３ ’
１ ７〜３ ４ ８（１９８１）］。
ニン）開始コドンが１８個のアミノ酸のヌクレオチド配
列が続き、これは多くの膜または分泌蛋白質の一次翻訳
生成物上に存在するシグナル配列に相当し、通常これは
蛋白質が小胞体の管腔中に通過するとき切断される［ク
ライル（Ｋｒｅｉ Ｉ、 Ｇ、 ） ：アニュアル・レ
ビュー・オプ・バイオケミストリー （八ｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 、 ５０ ： ３ ’
１ ７〜３ ４ ８（１９８１）］。
よび コーーイン ｊ のこれらの の習
直接アミノ酸配列決定により、８３，０ＯＯＨＷ断片の
アミノ末端はＰ、１９５アミノ末端に近接して存在する
ことが明らかにされた（例６）。
アミノ末端はＰ、１９５アミノ末端に近接して存在する
ことが明らかにされた（例６）。
ｉｎ ｖｉｖｏでの蛋白分解によるプロセッシングで産
生された他の断片は、Ｐ、１９５に対して誘発された特
異的抗体（好ましくはモノクロナール抗体）によって認
識されるポリペプチドのサイズの分析により線状遺伝子
配列中に見出すことができた。
生された他の断片は、Ｐ、１９５に対して誘発された特
異的抗体（好ましくはモノクロナール抗体）によって認
識されるポリペプチドのサイズの分析により線状遺伝子
配列中に見出すことができた。
この分析には２種のモノクロナール抗体を使用した。抗
体８９．１ ［ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ） ：前出（１９８２）］は分裂前体中の細
胞内Ｐ、１９５および分裂小体表面上の８３．０ＯＯＨ
Ｗ断片と反応する。それは、この寄生虫の次の環ステー
ジとは反応せず（免疫蛍光による）、赤血球の分裂小体
侵入時のこの断片の喪失と一致した。抗体１１１．２は
分裂前体中の細胞内Ｐ、１９５、分裂小体表面および環
ステージ寄生虫と反応する（免疫蛍光による）。この特
異性は最近ホールほか（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｔ ：前出
、１９８４ａ）によって報告されたモノクロナール抗体
の場合に類似している。
体８９．１ ［ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ） ：前出（１９８２）］は分裂前体中の細
胞内Ｐ、１９５および分裂小体表面上の８３．０ＯＯＨ
Ｗ断片と反応する。それは、この寄生虫の次の環ステー
ジとは反応せず（免疫蛍光による）、赤血球の分裂小体
侵入時のこの断片の喪失と一致した。抗体１１１．２は
分裂前体中の細胞内Ｐ、１９５、分裂小体表面および環
ステージ寄生虫と反応する（免疫蛍光による）。この特
異性は最近ホールほか（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｔ ：前出
、１９８４ａ）によって報告されたモノクロナール抗体
の場合に類似している。
Ｐ、１９５およびそのプロセッシング断片は、メチオニ
ンを含まないメジウム中での寄生虫培養液に［３５Ｓ］
メチオニンを添加することによりｉｎ ＶｉｔｒＯテ標
識できる［ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ） ：前出（１９８２）、フリーマンはか（Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ＆ ｔｌｏｌｄｅｒ） ：前出（１９８３
）］、天然に放出された分裂小体の表面上のプロセッシ
ング断片はすでに報告されているように（フリーマンは
か（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏ１ｄｅｒ） ：前出（１
９８３ｂ）：ホルダーはか（Ｈｑｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅ
ｅｍａｎ） ：前出（１９８４ｂ）］ラクトパーオキシ
ダーゼを用い［１］ヨウ素での放射ヨード化により標識
できる。
ンを含まないメジウム中での寄生虫培養液に［３５Ｓ］
メチオニンを添加することによりｉｎ ＶｉｔｒＯテ標
識できる［ホルダーはか（Ｈｏｌｄｅｒ ＆Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ） ：前出（１９８２）、フリーマンはか（Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ＆ ｔｌｏｌｄｅｒ） ：前出（１９８３
）］、天然に放出された分裂小体の表面上のプロセッシ
ング断片はすでに報告されているように（フリーマンは
か（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｈｏ１ｄｅｒ） ：前出（１
９８３ｂ）：ホルダーはか（Ｈｑｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅ
ｅｍａｎ） ：前出（１９８４ｂ）］ラクトパーオキシ
ダーゼを用い［１］ヨウ素での放射ヨード化により標識
できる。
［３５Ｓ］メヂオニン標識分裂前体の界面活性剤抽出物
から、Ｐ、１９５に対するウサギ多価抗血清は、Ｐ、１
９５ならびに５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定された分子量
１５３．０００；１１０．０００：８３．０００：４５
．０００：４２．０００および２９．０００の断片を免
疫沈殿された。非還元ゲル上（ジチオスレイトールの非
存在下）、４５．０００および４２．０００Ｍ誓種はそ
れぞれ見かけの分子量３８．０００および３６，０００
のように移動した。抗体８９．１はＰ、１９５ならびに
１５３，０００、ｉｉｏ、ｏｏｏおよび８３．０００８
一種を免疫沈殿させた。抗体１１１．２はＰ、１９５な
らびに４５．０・００および４２，０ＯＯＨＷ種を免疫
沈殿させた。
から、Ｐ、１９５に対するウサギ多価抗血清は、Ｐ、１
９５ならびに５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定された分子量
１５３．０００；１１０．０００：８３．０００：４５
．０００：４２．０００および２９．０００の断片を免
疫沈殿された。非還元ゲル上（ジチオスレイトールの非
存在下）、４５．０００および４２．０００Ｍ誓種はそ
れぞれ見かけの分子量３８．０００および３６，０００
のように移動した。抗体８９．１はＰ、１９５ならびに
１５３，０００、ｉｉｏ、ｏｏｏおよび８３．０００８
一種を免疫沈殿させた。抗体１１１．２はＰ、１９５な
らびに４５．０・００および４２，０ＯＯＨＷ種を免疫
沈殿させた。
表面標識分裂小体の界面活性剤抽出物、から、多価抗Ｐ
、１９５血清は、見か【プの分子量８３．０００：４２
．０００および１９．０００の３種の断片を免疫沈殿さ
せた。８３．０００８Ｈ断片は抗体８９．１によって免
疫沈殿された。
、１９５血清は、見か【プの分子量８３．０００：４２
．０００および１９．０００の３種の断片を免疫沈殿さ
せた。８３．０００８Ｈ断片は抗体８９．１によって免
疫沈殿された。
抗体１１１．２は４２．０００および
１９．０ＯＯＨ１４種を免疫沈殿させた。これらの断片
のペプチドマツピングによる分析では、これらは多分、
Ｐ、１９５の非重複片と考えられた［ホルダーはか（Ｈ
ｏｔｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ） ；前出（１９８４
ｂ）］。
のペプチドマツピングによる分析では、これらは多分、
Ｐ、１９５の非重複片と考えられた［ホルダーはか（Ｈ
ｏｔｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ） ；前出（１９８４
ｂ）］。
これらのデータおよび例６と１０の記載に基づき、Ｐ、
１９５コ一ド配列内の断片の線状順序が決定できる。８
３．０００Ｍ−断片の７ミノ末端について決定したアミ
ノ酸配列は、遺伝子のコード領域の５′末端、推定シグ
ナル配列の直後の配列に相当する。したがって、８３，
０ＯＯＨＷ断片はＰ、１９５のアミノ末端４２％に由来
する。抗体８９．１で認識され、抗体１１１．２によっ
て認識されない１５３．０００８Ｈの主たる中間プロセ
ッシング断片はコード配列のアミノ末端７８．５％に由
来し、したがって全８３．０００ＨＩｌ断片を包含する
。抗体１１１．２は１５３．０００１４Ｗ断片と反応し
ないので、コード配列のカルボキシ末端２１．５％に由
来する。１９，０ＯＯＨＮ断片は、１５３．０００８一
種の配列内に存在し、８３．０００Ｈ１４種内には存在
しないものと推定される。
１９５コ一ド配列内の断片の線状順序が決定できる。８
３．０００Ｍ−断片の７ミノ末端について決定したアミ
ノ酸配列は、遺伝子のコード領域の５′末端、推定シグ
ナル配列の直後の配列に相当する。したがって、８３，
０ＯＯＨＷ断片はＰ、１９５のアミノ末端４２％に由来
する。抗体８９．１で認識され、抗体１１１．２によっ
て認識されない１５３．０００８Ｈの主たる中間プロセ
ッシング断片はコード配列のアミノ末端７８．５％に由
来し、したがって全８３．０００ＨＩｌ断片を包含する
。抗体１１１．２は１５３．０００１４Ｗ断片と反応し
ないので、コード配列のカルボキシ末端２１．５％に由
来する。１９，０ＯＯＨＮ断片は、１５３．０００８一
種の配列内に存在し、８３．０００Ｈ１４種内には存在
しないものと推定される。
例 ８
別の実験で、ｐＷＲＬ５０７（第４図）をＮｄｅＩとＥ
ｃ ｏ ＲＩ 、・Ｅ ｃ ｏ ＲＩと３ ａｍＨＩ
またはＥｃｏＲｆと）ｌｉｎｄｌ［［Ｔ”消化°し、関
連断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。このＤＮ
Ａ （０，１ｐｎ＋ｏｌ）をＰ、１９５組換体から誘導
されたＤＮＡ断片０．５μｍｏｌと、関連対の制限酵素
でリゲートし、ついでＤＨＩ細胞をアンピシリン抵抗性
に形質転換するのに使用した。コロニーを小プラスミド
ブレバレージョンの制限酵素消化によるスクリーニング
に付した。その挿入体を含むプラスミドをもつ株をさら
に、１００μｇ／ｍｌ！アンピシリンおよび１０μｇ／
Ｉｄインドールアクリル酸（誘発表現）または１００μ
ｇ／Ｉｄアンピシリンおよび１０μｇ／ｄトリプトファ
ン（非誘発表現）含有Ｍ９最小培地中で生育させた。バ
クテリアをｉｏ、ｏｏｏｇで１分間遠心分離して収穫し
、ＰＡＧＥに対するＳＤＳザンブル負荷緩衝液［２％（
Ｗ／Ｖ ）ドデシル硫酸ブトリウム、 ・１０％（Ｖ
／Ｖ ’）グリセロール、０．１Ｍジチオスレイトール
および０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー
含有６２．５ｍＨトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ６，，８）
］の添加により分解した。その一部をｓｏｓ −ＰＡＧ
Ｅによる分析に付し、ついでゲルをクーマシーブルーで
染色して全蛋白質を検出するか、または分解蛋白質をニ
トロセルロースに移し、精製Ｐ、１９５に対して誘発さ
れた多価抗血清によるウェスタン法に使用した。
ｃ ｏ ＲＩ 、・Ｅ ｃ ｏ ＲＩと３ ａｍＨＩ
またはＥｃｏＲｆと）ｌｉｎｄｌ［［Ｔ”消化°し、関
連断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。このＤＮ
Ａ （０，１ｐｎ＋ｏｌ）をＰ、１９５組換体から誘導
されたＤＮＡ断片０．５μｍｏｌと、関連対の制限酵素
でリゲートし、ついでＤＨＩ細胞をアンピシリン抵抗性
に形質転換するのに使用した。コロニーを小プラスミド
ブレバレージョンの制限酵素消化によるスクリーニング
に付した。その挿入体を含むプラスミドをもつ株をさら
に、１００μｇ／ｍｌ！アンピシリンおよび１０μｇ／
Ｉｄインドールアクリル酸（誘発表現）または１００μ
ｇ／Ｉｄアンピシリンおよび１０μｇ／ｄトリプトファ
ン（非誘発表現）含有Ｍ９最小培地中で生育させた。バ
クテリアをｉｏ、ｏｏｏｇで１分間遠心分離して収穫し
、ＰＡＧＥに対するＳＤＳザンブル負荷緩衝液［２％（
Ｗ／Ｖ ）ドデシル硫酸ブトリウム、 ・１０％（Ｖ
／Ｖ ’）グリセロール、０．１Ｍジチオスレイトール
および０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー
含有６２．５ｍＨトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ６，，８）
］の添加により分解した。その一部をｓｏｓ −ＰＡＧ
Ｅによる分析に付し、ついでゲルをクーマシーブルーで
染色して全蛋白質を検出するか、または分解蛋白質をニ
トロセルロースに移し、精製Ｐ、１９５に対して誘発さ
れた多価抗血清によるウェスタン法に使用した。
１）ＰＦＱＩのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含む株は、
クーマシーブルー染色または多価抗血清との反応で分解
物中に検出できる１３５．ＯＯＯＷＭの誘発融合蛋白質
を産生じた。これはｔｒｐＥ遺伝子生成物のＮ末端から
の２３３個のアミノ酸およびＰ、１９５からの９０７個
のアミノ酸を含有する融合蛋白質に相当する。１）ＰＦ
Ｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む株は、
ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸とリンカ−とＰ、１
９５からの１５６個のアミノ酸を含有する分子量５３．
０“００の融合蛋白質を産生じた。
クーマシーブルー染色または多価抗血清との反応で分解
物中に検出できる１３５．ＯＯＯＷＭの誘発融合蛋白質
を産生じた。これはｔｒｐＥ遺伝子生成物のＮ末端から
の２３３個のアミノ酸およびＰ、１９５からの９０７個
のアミノ酸を含有する融合蛋白質に相当する。１）ＰＦ
Ｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む株は、
ｔｒｐＥからの３２６個のアミノ酸とリンカ−とＰ、１
９５からの１５６個のアミノ酸を含有する分子量５３．
０“００の融合蛋白質を産生じた。
ｐＰＦｃ１０２８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄｌ［断片を
含む株は、ｔｒｉ）Ｅからの３２６個のアミノ酸とリン
カ−とＰ、１９５からの５９４個のアミノ酸を含有する
１０５．０００８−融合蛋白質を産生じた。ｐＰＦｃ１
０２８からのＥＣ０ＲＩ−ＮｄｅＩ断片を含む株はｔｒ
ｐＥからの３２６個のアミノ酸とＰ、１９５からの４０
１個のアミノ酸からなる８５，０００Ｈ１４の融合蛋白
質を産生した。
含む株は、ｔｒｉ）Ｅからの３２６個のアミノ酸とリン
カ−とＰ、１９５からの５９４個のアミノ酸を含有する
１０５．０００８−融合蛋白質を産生じた。ｐＰＦｃ１
０２８からのＥＣ０ＲＩ−ＮｄｅＩ断片を含む株はｔｒ
ｐＥからの３２６個のアミノ酸とＰ、１９５からの４０
１個のアミノ酸からなる８５，０００Ｈ１４の融合蛋白
質を産生した。
いずれの場合も、融合蛋白質はクーマシーブルー染色で
検出され、多価抗Ｐ、１９５血清とウェスタン法で反応
した。
検出され、多価抗Ｐ、１９５血清とウェスタン法で反応
した。
ヌクレオチド８６３＝１６１３とそのＧ−Ｃ末端および
ｐｓｔ’Ｉ部位から）ｌ ｉ ｎｄｌ［［部位までのｐ
ＬＩｃ９ポリリンカー領域からなる、ｃＤＮΔクローン
ｐＰＦｃ１０１３由来の７５０ｂｐＲｓａＩ−Ｈｉｎｄ
ｌ［［断片をあらかじめＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、ウシ
腸ホスファターゼで処理し、さらに＠ ｉ ｎｄｌ［ｒ
で消化したプラスミドｐｔＪｃ９にクローニングした。
ｐｓｔ’Ｉ部位から）ｌ ｉ ｎｄｌ［［部位までのｐ
ＬＩｃ９ポリリンカー領域からなる、ｃＤＮΔクローン
ｐＰＦｃ１０１３由来の７５０ｂｐＲｓａＩ−Ｈｉｎｄ
ｌ［［断片をあらかじめＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、ウシ
腸ホスファターゼで処理し、さらに＠ ｉ ｎｄｌ［ｒ
で消化したプラスミドｐｔＪｃ９にクローニングした。
この挿入体を次にＥＣ０ＲＩとＨｉ ｎｄｌｌ［を用い
てｐＬＪＣ９から切り取り、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［
によるｐＷＲＬ５０７カツトに正しい方向で挿入した。
てｐＬＪＣ９から切り取り、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［
によるｐＷＲＬ５０７カツトに正しい方向で挿入した。
読み取り枠の合った表現を得るために、このプラスミド
５μ９をＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、構築体を線状化
した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５００μり／ｄ
のＢＳＡを含む水５０μｌに溶かし、ついで等容量のＢ
ａｊ！３１緩衝液と混合したｆマニアテイスほか（Ｈａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ） ：前出（１９８２）］。
５μ９をＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、構築体を線状化
した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５００μり／ｄ
のＢＳＡを含む水５０μｌに溶かし、ついで等容量のＢ
ａｊ！３１緩衝液と混合したｆマニアテイスほか（Ｈａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ） ：前出（１９８２）］。
ＤＮＡを０．０２単位の酵素Ｂａｊ！３１ （Ｂｉｏｌ
ａｂｓ ）により３０℃で１分間消化し、ついで２０μ
ｍの１Ｍトリス、１００ＩＩＩＨＥＤＴＡ、１００＋ｅ
ＨＥＧＴＡを加えて反応を停止させた。ＤＮＡをアガロ
ースゲル電気泳動で精製し、ついでヌクレオチドトリホ
スフェートの存在下、最終容量５０μｍのニックトラン
スレーション緩衝液［マニアテイスほか（Ｈａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａり：前出（１９８２）］中、酵素（ベー
リンガー／マンハイム）２．５単位を用いてＤＮＡポリ
メラーゼ１大断片（クレノー）で、室温において９０分
間処理した。ＤＮＡ （０，１ｐＩＩｌｏｌ）を２００
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｆｏｌａｂｓ ）と７℃
で一夜インキユベーションして再び環化し、ついでＤＨ
１細胞をアンピシリン抵抗性に形質転換するのに用いた
。１０個の形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によりスクリーニングした。
ａｂｓ ）により３０℃で１分間消化し、ついで２０μ
ｍの１Ｍトリス、１００ＩＩＩＨＥＤＴＡ、１００＋ｅ
ＨＥＧＴＡを加えて反応を停止させた。ＤＮＡをアガロ
ースゲル電気泳動で精製し、ついでヌクレオチドトリホ
スフェートの存在下、最終容量５０μｍのニックトラン
スレーション緩衝液［マニアテイスほか（Ｈａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａり：前出（１９８２）］中、酵素（ベー
リンガー／マンハイム）２．５単位を用いてＤＮＡポリ
メラーゼ１大断片（クレノー）で、室温において９０分
間処理した。ＤＮＡ （０，１ｐＩＩｌｏｌ）を２００
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｆｏｌａｂｓ ）と７℃
で一夜インキユベーションして再び環化し、ついでＤＨ
１細胞をアンピシリン抵抗性に形質転換するのに用いた
。１０個の形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によりスクリーニングした。
８個の形質転換体の１グループがＥＣｏＲＩ部位を失っ
たプラスミドを含有した。このグループについて、イン
ドールアクリル酸ま、たはトリフ１−ファンの存在下に
おけるＭ９メジウム中での生育によりさらに分−析した
。１個の株が、インドールアクリル酸の存在下に生育し
たとき約６５，０００Ｈの融合蛋白質を産生じ、この融
合蛋白質はウェスタン法で多価抗Ｐ、１９５血清と反応
した。
たプラスミドを含有した。このグループについて、イン
ドールアクリル酸ま、たはトリフ１−ファンの存在下に
おけるＭ９メジウム中での生育によりさらに分−析した
。１個の株が、インドールアクリル酸の存在下に生育し
たとき約６５，０００Ｈの融合蛋白質を産生じ、この融
合蛋白質はウェスタン法で多価抗Ｐ、１９５血清と反応
した。
同様にして、ｐＰＦＣ１０２８からのＮｄｅＩ−Ｈｉｎ
ｄｌ［［断片（この場合Ｈｉｎｄｉ［［部位はプラスミ
ドポリリンカーである）をプラント末端−Ｈｌｎｄｌ［
［断片として、あらかじめ１」ｉ ｎ ｄ ＩＩおよび
Ｈｉｎｄｎｌで切断したｐＵＣＱ中にザブクローニング
した。この断片をＥＣ０ＲＩとｌ−１ｉｎｄ■によるｐ
ＷＲＬ５０７カツトに挿入したのち、この新しい構築体
をＥＣ０ＲＩで再び開裂し、Ｂａｊ！３１で処理し、つ
いで上述のように再び環化した。１個の株が約５６．０
００８Ｈの融合蛋白質を産生じ、これは抗Ｐ、１９５血
清とのウェスタン法で検出され、Ｐ、１９５遺伝子のコ
ード領域のＣ末端１９０個のアミノ酸配列を含有した。
ｄｌ［［断片（この場合Ｈｉｎｄｉ［［部位はプラスミ
ドポリリンカーである）をプラント末端−Ｈｌｎｄｌ［
［断片として、あらかじめ１」ｉ ｎ ｄ ＩＩおよび
Ｈｉｎｄｎｌで切断したｐＵＣＱ中にザブクローニング
した。この断片をＥＣ０ＲＩとｌ−１ｉｎｄ■によるｐ
ＷＲＬ５０７カツトに挿入したのち、この新しい構築体
をＥＣ０ＲＩで再び開裂し、Ｂａｊ！３１で処理し、つ
いで上述のように再び環化した。１個の株が約５６．０
００８Ｈの融合蛋白質を産生じ、これは抗Ｐ、１９５血
清とのウェスタン法で検出され、Ｐ、１９５遺伝子のコ
ード領域のＣ末端１９０個のアミノ酸配列を含有した。
各融合蛋白質の比較的純粋なプレバレージョンを細胞分
解物から製造した。、１個の株からの単一コロニーを５
０μＳＪ／ａｔ！のアンピシリンを含有するＭ９メジウ
ム１００ａｌｌ中、３７℃で一夜生育させた。、翌日、
−夜培養した液を５０μｇ／Ｉ１１アンピシリンおよび
１０μｆｉ／ｌｄインド一ルアクリル酸含有Ｍ９培養メ
ジウム４００ｄで希釈し、３７℃で５時間インキュベー
トした。バクテリアを１０分門６．０００ｇで遠心分離
して収穫した。
解物から製造した。、１個の株からの単一コロニーを５
０μＳＪ／ａｔ！のアンピシリンを含有するＭ９メジウ
ム１００ａｌｌ中、３７℃で一夜生育させた。、翌日、
−夜培養した液を５０μｇ／Ｉ１１アンピシリンおよび
１０μｆｉ／ｌｄインド一ルアクリル酸含有Ｍ９培養メ
ジウム４００ｄで希釈し、３７℃で５時間インキュベー
トした。バクテリアを１０分門６．０００ｇで遠心分離
して収穫した。
バクテリアのベレットを１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｉｌｌ＋
ＨＰＭＳＦ、０．２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０および１■／
Ｉｄリゾチームを含有する２５１１Ｈトリス（Ｄ）１８
．０Σ１０ｄ中に懸濁し、氷上に２時間放置した。この
時点でＩＭＭＣＩＳＯ４２０、μｌおよび１Ｑ／１ｔｄ
ＤＮＡｓｅ２．００１１１を添加し、このサンプルを氷
上でさらに２時間放置してインキュベートした。不溶物
質を２０．ｏｏｏｇで１０分間遠心分離して収穫し、上
清（Ｓｌ）は保存した。
ＨＰＭＳＦ、０．２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０および１■／
Ｉｄリゾチームを含有する２５１１Ｈトリス（Ｄ）１８
．０Σ１０ｄ中に懸濁し、氷上に２時間放置した。この
時点でＩＭＭＣＩＳＯ４２０、μｌおよび１Ｑ／１ｔｄ
ＤＮＡｓｅ２．００１１１を添加し、このサンプルを氷
上でさらに２時間放置してインキュベートした。不溶物
質を２０．ｏｏｏｇで１０分間遠心分離して収穫し、上
清（Ｓｌ）は保存した。
ベレット化した物質を、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＨＥ
ＤＴＡ、１ｍＭ、ＰＭＳＦおよび１％ＮＰ４０を含む５
０ＩｌｌＮトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）’１０ｔｔ
ｄｌに懸濁して洗浄した。これを２０ 、’ＯＯＯ９で
１０分間遠心分離して、上清（Ｓ２）を保存した。ペレ
ットを５０ｍＨｔ−リス−ＨＣｊ！ （ｐＨ８，１）
、５Ｉｌｌ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
８ＫＳＣＮの１０ａｉ！に再懸濁し、ついで２０．００
０ｇで１０分間遠心分離して、第三の上清（Ｓ３）とベ
レット分画（Ｐ）を得た。ベレット分画は０．１％（Ｗ
／Ｖ ）ドデシル硫酸ナトリウムを加・えたまたは加え
ない水１０ｍに再懸濁して物質を可溶化し、ついで０．
８９％ＮａＣｊ！に対して十分透析した。各上清および
ベレット分画の一部をとり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマ
シーブルー染色およびウェスタン法で分析した。融合蛋
白質の高レベルでの表現がある場合には、この操作で最
終ペレット分画に融合蛋白質が多く、したがって融合蛋
白質の精製が有効に行われた。表現レベルが低い場合に
は、融合蛋白質はＳｌおよびＰ両分向に存在した。
ＤＴＡ、１ｍＭ、ＰＭＳＦおよび１％ＮＰ４０を含む５
０ＩｌｌＮトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）’１０ｔｔ
ｄｌに懸濁して洗浄した。これを２０ 、’ＯＯＯ９で
１０分間遠心分離して、上清（Ｓ２）を保存した。ペレ
ットを５０ｍＨｔ−リス−ＨＣｊ！ （ｐＨ８，１）
、５Ｉｌｌ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
８ＫＳＣＮの１０ａｉ！に再懸濁し、ついで２０．００
０ｇで１０分間遠心分離して、第三の上清（Ｓ３）とベ
レット分画（Ｐ）を得た。ベレット分画は０．１％（Ｗ
／Ｖ ）ドデシル硫酸ナトリウムを加・えたまたは加え
ない水１０ｍに再懸濁して物質を可溶化し、ついで０．
８９％ＮａＣｊ！に対して十分透析した。各上清および
ベレット分画の一部をとり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマ
シーブルー染色およびウェスタン法で分析した。融合蛋
白質の高レベルでの表現がある場合には、この操作で最
終ペレット分画に融合蛋白質が多く、したがって融合蛋
白質の精製が有効に行われた。表現レベルが低い場合に
は、融合蛋白質はＳｌおよびＰ両分向に存在した。
ヌクレオチド２９６１〜４７５４ （１７９３個のヌク
レオチド）およびヌクレオチド４７５３〜５１２８（３
７５個のヌクレオチド）に相当するｐＰＦｃ１０２８か
ら−の２個のＤｄｅＩ断片を７ガロースゲル電気泳動で
精製し、Ｂａｊ！３１ヌクレアーゼ０．０４単位により
３０℃で２．５分間処理し、ついで上述のようにしてＤ
ＮＡポリメラーゼエのクレノー断片で修復した。このＤ
ＮＡを、あらかじめＳｍａｌで切断し、ウシアルカリホ
スファターゼで処理したＤＸＹ４６０にリゲートし、こ
れをＪＭ１０５細胞のアンピシリン抵抗性への形質転換
に用いた。形質転換体をｘｑａｌを含むアガール板上に
置き、得られた青色のコロニーを取った。この方法で得
られた株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析、クーマシ
ーブルー染色、およびＩＰＴＧの存在下に生育させた細
胞からの分解物のウェスタン・プロッティングによりス
クリーニングした。１）ｄｅｉ大断大金片む株はすべて
、ウサギ多価抗Ｐ、１９５面滴と反応する大きい融合蛋
白質を産生じた。Ｄｄｅ１小断片小金片１０個の株につ
いても同様に検討したが、わずかに１個が野生型β〜ガ
ラクトシダーゼより有意に大きい融合蛋白質を産生じ、
この融合蛋白質はウサギ抗Ｐ、１９５血清と反応した。
レオチド）およびヌクレオチド４７５３〜５１２８（３
７５個のヌクレオチド）に相当するｐＰＦｃ１０２８か
ら−の２個のＤｄｅＩ断片を７ガロースゲル電気泳動で
精製し、Ｂａｊ！３１ヌクレアーゼ０．０４単位により
３０℃で２．５分間処理し、ついで上述のようにしてＤ
ＮＡポリメラーゼエのクレノー断片で修復した。このＤ
ＮＡを、あらかじめＳｍａｌで切断し、ウシアルカリホ
スファターゼで処理したＤＸＹ４６０にリゲートし、こ
れをＪＭ１０５細胞のアンピシリン抵抗性への形質転換
に用いた。形質転換体をｘｑａｌを含むアガール板上に
置き、得られた青色のコロニーを取った。この方法で得
られた株をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析、クーマシ
ーブルー染色、およびＩＰＴＧの存在下に生育させた細
胞からの分解物のウェスタン・プロッティングによりス
クリーニングした。１）ｄｅｉ大断大金片む株はすべて
、ウサギ多価抗Ｐ、１９５面滴と反応する大きい融合蛋
白質を産生じた。Ｄｄｅ１小断片小金片１０個の株につ
いても同様に検討したが、わずかに１個が野生型β〜ガ
ラクトシダーゼより有意に大きい融合蛋白質を産生じ、
この融合蛋白質はウサギ抗Ｐ、１９５血清と反応した。
他の株は挿入体を含有していたが、遺伝子生成物は正常
β−ガラクトシダーゼと同じ大きさで、ウサギ抗Ｐ、１
９５血清と反応しなかった。融合蛋白質を産生じた１個
の株は、その蛋白質のＣ末端領域をカバーする３１０ｂ
ｐの挿入体を含んでいた。
β−ガラクトシダーゼと同じ大きさで、ウサギ抗Ｐ、１
９５血清と反応しなかった。融合蛋白質を産生じた１個
の株は、その蛋白質のＣ末端領域をカバーする３１０ｂ
ｐの挿入体を含んでいた。
ｐＰＦｃ１０２８由来のＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅ■とＥｃｏ
ＲＩ−）１ｉｎｄｌｌｌ断片を例８に記載したようにし
てｐＷＲＬ５０７に挿入し、にｍ発現プラスミド中のＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＹ４６０ （第４図）か
らのＰｓｔＩ−ＥＣＯＲＩ断片で置換することにより直
接発現させた。この構築において、ｔｒｐ制御領域とコ
−ド配列はｔａｃ制御領域［デ・ボアはか（ｄｅ Ｂｏ
ｅｒ、 Ｈ，Ａ、 ｅｔ ａｌ ） ：ブロシーデイン
グズ・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
） 、 ８０ ：２１〜２５ （１９８３）］およびＡ
ｔＪＧｆ４始コドンで置換される。直接発現生成物は細
胞分解物中に、精製Ｐ、１９５に対して誘発された抗血
清とのウェスタン法で検出された。これらの２つの構築
からの直接発現生成物の見かけの分子量はそれぞれ４７
．０００および７０．０００であった。
ＲＩ−）１ｉｎｄｌｌｌ断片を例８に記載したようにし
てｐＷＲＬ５０７に挿入し、にｍ発現プラスミド中のＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＹ４６０ （第４図）か
らのＰｓｔＩ−ＥＣＯＲＩ断片で置換することにより直
接発現させた。この構築において、ｔｒｐ制御領域とコ
−ド配列はｔａｃ制御領域［デ・ボアはか（ｄｅ Ｂｏ
ｅｒ、 Ｈ，Ａ、 ｅｔ ａｌ ） ：ブロシーデイン
グズ・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
） 、 ８０ ：２１〜２５ （１９８３）］およびＡ
ｔＪＧｆ４始コドンで置換される。直接発現生成物は細
胞分解物中に、精製Ｐ、１９５に対して誘発された抗血
清とのウェスタン法で検出された。これらの２つの構築
からの直接発現生成物の見かけの分子量はそれぞれ４７
．０００および７０．０００であった。
例１０
プラスモジウム（Ｐ、 ｆａ Ｉｃ ｉｐａｒｕｍ ）
由来Ｐ、１９５に特異的なウサギ多価抗血清は、フロイ
ント完全アジュバント（Ｆ ＣＡ 、 Ｄｉｆｃｏ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ。
由来Ｐ、１９５に特異的なウサギ多価抗血清は、フロイ
ント完全アジュバント（Ｆ ＣＡ 、 Ｄｉｆｃｏ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ。
ｏｅｔｒｏ＋ｔ ）中張白質１００μ９でつ、サギを免
疫処置し、ついで２２．４３および２１１日に７０イン
ド不完全アジユバント（ＦＩＡ）中張白質１００μ９を
ブースター投与することによって得られた。
疫処置し、ついで２２．４３および２１１日に７０イン
ド不完全アジユバント（ＦＩＡ）中張白質１００μ９を
ブースター投与することによって得られた。
多価抗血清は精製融合蛋白質（例８）による免疫処置に
より産生じた。ウサギにＦＣＡ中蛋中質白質２５０μ皮
下投与して免疫処置し、ついで２１日目にＦＩＡ中蛋中
質白質２５０μ９−スター投与した。３５日目に一次免
疫処置後、血清サンプルを採取した。マウスにＦＣＡ中
蛋中質白質１２５μグ腔内投与して免疫処置し、２３日
目に同容量をブースター投与した。３０日目に一次免疫
処置後、血清サンプルを採取した。
より産生じた。ウサギにＦＣＡ中蛋中質白質２５０μ皮
下投与して免疫処置し、ついで２１日目にＦＩＡ中蛋中
質白質２５０μ９−スター投与した。３５日目に一次免
疫処置後、血清サンプルを採取した。マウスにＦＣＡ中
蛋中質白質１２５μグ腔内投与して免疫処置し、２３日
目に同容量をブースター投与した。３０日目に一次免疫
処置後、血清サンプルを採取した。
抗血清の蛋白質に対する抗体への結合力価は、固相放射
免疫定社法（Ｒ４Ａ）で定量化できた。
免疫定社法（Ｒ４Ａ）で定量化できた。
マイクロ゛タイタープレートのウェルを蛋白質でコーテ
ィングし、ついで抗体溶液の一連の希釈液を一連のウェ
ルを加える。非結合抗体を洗い去ったのち、結合抗体を
高度標識特異的試薬、たとえば第一の抗体に特異的なス
タヒロコツカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ ）からのプロティンＡ ＋または
親和性精製１ａＧを用いて検出する！マイクロタイター
プレートのコーティングに用いた蛋白質は例８に記載大
腸菌分解物から精製した融合蛋白質、またはホルダーは
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８
４ｂ）によって記載されたようにプラスモジウム（Ｐ、
ｆａｌｃｉｐａｒｕｓｎ）感染赤血球からモノクロナ
ール抗体親和性クロマトグラフィ＝で精製したＰ、１９
５のいずれかであった。
ィングし、ついで抗体溶液の一連の希釈液を一連のウェ
ルを加える。非結合抗体を洗い去ったのち、結合抗体を
高度標識特異的試薬、たとえば第一の抗体に特異的なス
タヒロコツカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ ）からのプロティンＡ ＋または
親和性精製１ａＧを用いて検出する！マイクロタイター
プレートのコーティングに用いた蛋白質は例８に記載大
腸菌分解物から精製した融合蛋白質、またはホルダーは
か（Ｈｏｌｄｅｒ ＆ Ｆｒｅｅｍａｎ：前出、１９８
４ｂ）によって記載されたようにプラスモジウム（Ｐ、
ｆａｌｃｉｐａｒｕｓｎ）感染赤血球からモノクロナ
ール抗体親和性クロマトグラフィ＝で精製したＰ、１９
５のいずれかであった。
抗原を０．０５８ ＮａＨＣＯ３（＋）８９．６）２０
μｇ／ｍｌｊ中２０μｇ／Ｉｎ１に希釈し、この溶液５
０μｍを、ウェル９６！ｍつきＰＶＣマイクロタイター
プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ ＞の各ウェルに添加した。９０分後に、プレートを
０．５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン４０および０．２％（Ｗ／
Ｖ ）ウシ血清アルブミン補給リン酸緩衝食塩水（洗浄
緩衝液）で完全に洗浄した。各血清希釈液５０μｌをウ
ェルに二重に加え、３０分後にプレートを１０分間、洗
浄緩衝液で洗浄した。
μｇ／ｍｌｊ中２０μｇ／Ｉｎ１に希釈し、この溶液５
０μｍを、ウェル９６！ｍつきＰＶＣマイクロタイター
プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ ＞の各ウェルに添加した。９０分後に、プレートを
０．５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン４０および０．２％（Ｗ／
Ｖ ）ウシ血清アルブミン補給リン酸緩衝食塩水（洗浄
緩衝液）で完全に洗浄した。各血清希釈液５０μｌをウ
ェルに二重に加え、３０分後にプレートを１０分間、洗
浄緩衝液で洗浄した。
５０μｌの Ｉ標識プロティンＡ（１，５ｘ１０５Ｃ
ｐＩｌｌ）を３０分間加え、十分洗浄し、バッカードＰ
ＥＤガンマーカウンターを用いて特異的抗体を検出した
。
ｐＩｌｌ）を３０分間加え、十分洗浄し、バッカードＰ
ＥＤガンマーカウンターを用いて特異的抗体を検出した
。
第１表から明らかなように、Ｐ、１９５配列を含む融合
蛋白質で免疫処置したウサギは、ＲＩＡで精製したＰ、
１９５と反応する抗体、および融合蛋白質と反応するＰ
、１９５含有抗体に対する多価抗血清を産生じた。この
場合、融合蛋白質１はｔｒｐｌ：に挿入されたｐＰＦｃ
１０２８ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ断片の生成物であり、融
合蛋白質２はｔｒｐＥに挿入されたｐＰＦｃ１０２８Ｅ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［断片の生成物である。
蛋白質で免疫処置したウサギは、ＲＩＡで精製したＰ、
１９５と反応する抗体、および融合蛋白質と反応するＰ
、１９５含有抗体に対する多価抗血清を産生じた。この
場合、融合蛋白質１はｔｒｐｌ：に挿入されたｐＰＦｃ
１０２８ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ断片の生成物であり、融
合蛋白質２はｔｒｐＥに挿入されたｐＰＦｃ１０２８Ｅ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［断片の生成物である。
例８に、融合蛋白質が多価抗Ｐ、１９５抗血清中の抗体
とウェスタン法で反応することを示した。
とウェスタン法で反応することを示した。
融合蛋白質に対して誘発された抗血清は、融合蛋白質お
よび精製Ｐ、１９５蛋白質とウェスタン法で反応した。
よび精製Ｐ、１９５蛋白質とウェスタン法で反応した。
線状コード配列中のプロセッシング断片の位置は、一部
、３５Ｓ−メチオニン標識プラスモジウム（Ｐ、 ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）の界面活性剤抽出物（例７）からの
免疫沈殿で決定された。融合蛋白質に対する抗血清をこ
の抽出物から蛋白質を免疫沈殿させるだめに用いたとき
はいずれの場合もＰ、１９５が認識された。さらに、ｐ
ＰＦｃｌ ０２８Ｅｃ’ｏＲＩ−ＮｄｅＩ挿入体によっ
てコードされる蛋白質に対して誘発されたウサギ抗血清
は１５３，０００および２９，００ＯＮＷｉ片と優先的
に反応した。
、３５Ｓ−メチオニン標識プラスモジウム（Ｐ、 ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）の界面活性剤抽出物（例７）からの
免疫沈殿で決定された。融合蛋白質に対する抗血清をこ
の抽出物から蛋白質を免疫沈殿させるだめに用いたとき
はいずれの場合もＰ、１９５が認識された。さらに、ｐ
ＰＦｃｌ ０２８Ｅｃ’ｏＲＩ−ＮｄｅＩ挿入体によっ
てコードされる蛋白質に対して誘発されたウサギ抗血清
は１５３，０００および２９，００ＯＮＷｉ片と優先的
に反応した。
ｐＰＦｃ１０２８ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［［挿入体に
対して誘発されたウサギ抗血清は、 ４２．０００８Ｗ断片と優先的に反応した。
対して誘発されたウサギ抗血清は、 ４２．０００８Ｗ断片と優先的に反応した。
第 １ 表
固相ＲＩＡによる各種抗原への抗体結合１／１０希釈抗
血清中抗体によって結合された１２５１、−７０テイン
Ａ （ＣｐＩＩＩ ）抗 原 正常 抗Ｐ、１９
５ 抗融合蛋白質１ 抗融合蛋白質２ウザギ ウサギ
ウサギ ウサギＰ、１９５ １
６１ ６５８１ １９５９ １４３２融合
蛋白質１ ２３４ ２００７ １０９５２ １
３２９１融合蛋白質２ ５２ １０９３ ３６
００ ３４１６
血清中抗体によって結合された１２５１、−７０テイン
Ａ （ＣｐＩＩＩ ）抗 原 正常 抗Ｐ、１９
５ 抗融合蛋白質１ 抗融合蛋白質２ウザギ ウサギ
ウサギ ウサギＰ、１９５ １
６１ ６５８１ １９５９ １４３２融合
蛋白質１ ２３４ ２００７ １０９５２ １
３２９１融合蛋白質２ ５２ １０９３ ３６
００ ３４１６
第１Ａ図〜第１■図はＰ、１９５をコードする遺伝子を
含むプラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｄ
ＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードするアミ
ノ酸配列である。 第２図はＰ、１９５遺伝子のｃＤＮＡ制限地図である。 第３図はＰ、１９５ゲノム配列の制限地図である。 第４図は、本発明、の実旅態様において使用できるプラ
スミドの構築例を示す図である。 トーー→ 嘴１１− Ｃフ 手続補正書（方式） 昭和６０年７月７７日
含むプラスモジウム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｄ
ＮＡのストレッチ塩基配列およびそれがコードするアミ
ノ酸配列である。 第２図はＰ、１９５遺伝子のｃＤＮＡ制限地図である。 第３図はＰ、１９５ゲノム配列の制限地図である。 第４図は、本発明、の実旅態様において使用できるプラ
スミドの構築例を示す図である。 トーー→ 嘴１１− Ｃフ 手続補正書（方式） 昭和６０年７月７７日
Claims (19)
- （１）プラスモジウム（￥Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ￥
）のＰ．１９５蛋白質またはその少なくとも１個のエピ
トープからなるペプチドをコードするクローンＤＮＡ配
列。 - （２）第１図に示されるＤＮＡ配列の少なくとも一部分
からなる特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （３）第２図および第３図に示される制限部位を有する
特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （４）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じるＰ．１９５断片の
任意の１個をコードする特許請求の範囲第１項記載のＤ
ＮＡ配列。 - （５）天然に生じる分子量４２，０００の Ｐ．１９５断片またはその少なくとも１個のエピトープ
からなるペプチドをコードするクローンＤＮＡ配列。 - （６）第１図に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部
分からなる特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
れか一つに記載のＤＮＡ配列に由来するＰ．１９５蛋白
質またはペプチド。 - （７）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
一つに記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。 - （８）適当な宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミノ末
端コード部分に縦列に結合した、特許請求の範囲第１項
から第５項までのいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含
むベクターであって、適当な宿主の形質転換に用いると
Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはその少なくとも１
個のエピトープからなるペプチドを含む融合蛋白質を産
生するベクター。 - （９）さらに少なくとも１個の制御配列を含む特許請求
の範囲第８項記載のベクター。 - （１０）適当な宿主内におけるＤＮＡ配列の表現を調節
する少なくとも１個の制御配列をさらに含有する特許請
求の範囲第７項および第８項のいずれか一つに記載のベ
クター。 - （１１）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か一つに記載のＤＮＡ配列が挿入された、適当な宿主中
で翻訳可能な遺伝子からなるベクターであって、その遺
伝子のカルボキシ末端部分からそのＤＮＡ配列へ適当な
宿主中で正しく翻訳されて表現され、Ｐ．１９５の少な
くとも一部分またはその少なくとも１個のエピトープを
含むペプチドおよびその遺伝子がコードする蛋白質の少
なくとも一部分からなる融合蛋白質を形成するように適
当に改変されたベクター。 - （１２）さらに少なくとも１個の制御配列を含む特許請
求の範囲第１１項記載のベクター。 - （１３）特許請求の範囲第７項から第１２項までのいず
れか一つに記載のベクターで宿主細胞を形質転換し、そ
の宿主細胞を培養し、Ｐ．１９５またはそのエピトープ
少なくとも１個を含むペプチドを表現させる方法。 - （１４）特許請求の範囲第７項から第１２項までのいず
れか一つに記載のベクターを含有する細胞。 - （１５）Ｐ．１９５の少なくとも１種のエピトープから
なる合成ペプチド。 - （１６）Ｐ．１９５の少なくとも一部分またはそのエピ
トープ少なくとも１個を含むペプチド、あるいはさらに
他のペプチド配列と共有結合していてもよいＰ．１９５
の少なくとも一部分またはペプチドを合成するにあたり
、 ａ）プラスモジウム（￥Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ￥）からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーを作り、 ｂ）Ｐ．１９５のプローブを選択して、そのプローブを
放射標識し、 ｃ）そのプローブを用いてライブラリーの少なくとも１
個のメンバーを選択し、 ｄ）ライブラリーから選択されたＤＮＡを用いて、Ｐ．
１９５の少なくとも一部分またはそのエピトープ少なく
とも１個を含むペプチドの表現に使用できる適当な宿主
を形質転換する各工程からなる方法。 - （１７）特許請求の範囲第１５項のペプチドまたは特許
請求の範囲１項から第５項までのいずれか一つに記載の
ＤＮＡ配列に由来するＰ．１９５またはそのエピトープ
少なくとも１個を含むペプチドを医薬的に許容される担
体と配合してなるマラリヤに対する免疫誘発用ワクチン
。 - （１８）さらにアジュバントを加えた特許請求の範囲第
１７項記載のワクチン。 - （１９）さらに少なくとも１種の他の抗マラリヤワクチ
ンを加えた特許請求の範囲第１７項および第１８項のい
ずれか一つに記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848404692A GB8404692D0 (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | Cloning of dna for protozoal antigens |
| GB848424340A GB8424340D0 (en) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | Cloning of dna |
| GB8404692 | 1984-09-26 | ||
| GB8424340 | 1984-09-26 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5230426A Division JP2893626B2 (ja) | 1984-02-22 | 1993-09-16 | 原虫類ワクチン用抗原ペプチドおよびこのペプチドを含有するワクチン |
Publications (2)
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