JPS63503197A

JPS63503197A - マラリアに対する保護免疫を与えるポリペプチド類

Info

Publication number: JPS63503197A
Application number: JP62502018A
Authority: JP
Inventors: アンダース，ロビン・フレドリック; ケンプ，デビッド・ジェイムス; ブラウン，グラハム・バレンシイ; コッペル，ロス・レオン; ミッチェル，グラハム・フランク; ウッドロー，グレム・チャールズ; テタツ，チモシー・ジョン; ゴス，ニール・ハワード
Original assignee: サラマン・プロプライエタリー・リミテッド
Priority date: 1986-03-14
Filing date: 1987-03-13
Publication date: 1988-11-24
Also published as: IL81890A0; KR880701243A; EP0297110A1; EP0297110A4; WO1987005607A1; ZW5087A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マラリアに対する保護免疫を与えるポリペプチド類技術分野本発明は、マラリア、特にプラスモジウム・ファルシパルム（町ｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染に対する保護免疫を付与するのに適した抗原性を有するポリペプチド類、その製造方法、該ポリペプチド類を含有するワクチン、およびこれらを用いる免疫学的な方法に関する。

従来技術ヒト・マラリア寄生虫プラスモジウム・ファルシパルムは、ヒトにおいて免疫応答を誘導する多数のポリペプチド類をコードしている。最近になって、分子クローニング法は、この複合混合物中に存在する個々のポリペプチド抗原を分析することを容易なものにした［ケンプ等（Ｋｅｍｐ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）］。

クローンされた配列を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）コロニーをヒト抗体でスクリーニングすることによって、これらの抗原類を発現する多くのｃＤＮＡクローンが単離された。これらクローンのスクリーニングおよび製造は、国際特許出願明細書Ｔｏ　８４１０２９１？（参考のために記載した）に詳細に記載されている。ＲＥＳＡと命名された、リング−感染した赤血球表面抗原に対するある特定のクローンされた抗原が、国際特許出願Ｔｏ　８６１０１８０２（参考のために記載した）に完全に記載されている。本発明は、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としてのＲＥＳＡフラグメントが、サルをプラスモジウム・ファルシパルムの有毒株によるチャレンジから保護することができるという発見に基づいている。この実験に用いたサルの血清を分析すると、２種類のペプチド（その配列は、ＲＥＳＡの特徴的な反復配列に由来する）のどちらかに対する抗体と保護の間に強い関係が示された。第１のペプチドは長さが２２アミノ酸であり、１１アミノ酸配列ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡの直列反復からなり、一方、第２のペプチドは配列旦旦Σゆる５°反復領域の一部であり、一方、８アミノ酸配列は３°反復領域に見い出される。

すなわち、本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原の５°あるいは３°反復領域、それらの誘導体類、それら領域の一部、それら領域の一部の誘導体類、１１アミノ酸および８アミノ酸反復単位、それらの一部あるいは誘導体類、あるいは上記ペプチド類の組合わせ物あるいはマルチマーを含むペプチド類あるいはポリペプチド類を含有するワクチンで免疫化することによって、哺乳動物マラリア、特にファルシパルムマラリアに対する保護免疫を誘導することができるというアプローチに基づいている。

一般的に、抗原が大きいほど免疫原性が高くなるようである。逆に、３０アミノ酸あるいはそれ以下のアミノ酸からなる小さいペプチド類は免疫原性がないようである。通常の操作では、小さいペプチド類は比較的大きい担体分子［たとえば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホール・リムビット・ヘマシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｉｔ　ｈａｅｍａｃｙａｎｉｎ）］と化学的に結合させて免疫原性を向上させる。従って、化学的に合成した１１アミノ酸あるいは８アミノ酸ペプチド（あるいはそれらの複合体）を適当な担体分子と結合させることによってワクチンを創製するのは可能性のあるアプローチである。

最も免疫原性の高いワクチンは、免疫システムにＲＥＳＡ反復エピトープ類を多数与えるものであろうと予想することもできる。化学的に合成されるペプチド類については、達成可能な長さに実際上の限界が存在する。市販ワクチン用の、コスト−効果の高いペプチドは比較的短いものであり、２０〜３０アミノ酸であるにすぎないであろう。従って、本発明は、マラリアワクチンへの合成的なアプローチだけでなく、組換え分子（そのマラリア配列はＲＥＳＡ分子から誘導されている）の発現に基づくアプローチをも含むものである。

発明の説明第１の態様において、本発明はポリヌクレオチド配列を提供するものであり、これには、その配列がプラスモジウム・ファルシパルムの完全長さのＲＥＳＡ分子に由来している第１のポリヌクレオチド配列、該第１のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、１つあるいは多数の塩基の置換、欠失、挿入および変位を含む突然変異により該第１の配列あるいはハイブリダイズする配列と関連しているポリヌクレオチド配列、あるいは発現の際に天然゛のプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原由来のポリペプチドあるいは該ポリペプチドと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列が含まれる。

本発明のこの態様には、実施例に記載したポリヌクレオチド配列を含む、上記配列の一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物、あるいは上記配列の一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーであるポリヌクレオチド配列が含まれる。

また、本発明のこの態様には、本発明に係るポリヌクレオチド配列を選択するための方法であって、１またはそれ以上のヌクレオチド配列を提供し、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原領域の全部、一部、類似体、同族体、誘導体、それらのマルチマーあるいは組合わせ物をコードしていることがわかっているヌクレオチド配列と該配列のどれがハイブリダイズするかを調べることからなる方法も含まれる。

この態様」こよれば、本発明により、本発明に係るヌクレオチド配列の同定に有用なプローブであって、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原領域由来のヌクレオチド配列、あるいはプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原領域と類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、あるいは該配列とハイブリダイズする配列、およびラベルからなるプローブが提供される。

第２の態様において、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチド配列の製造方法を提供するものであり、その方法は以下のようであってよい：１、本発明に係るポリヌクレオチドのマルチマーの反復単位を含むヌクレオチド配列を合成し、次いで酵素により該ヌクレオチド配列を「頭部−尾部」結合させて反復単位のマルチマーを作成する。

２、（ａ）本発明に係るペプチドあるいはポリペプチド単位を構成しているアミノ酸配列を１またはそれ以上のＲＮＡ配列がコードしている、多数のＲＮＡ配列を提供し、（ｂ）該ＲＮＡ配列に相補的な第１の鎖のＤＮＡ配列を合成し、（ｃ）該第１の鎖のＤＮＡ配列に相補的な第２の鎖のＤＮＡを合成して２重鎖ｃＤＮＡを作成し、（ｄ）該ｃＤＮＡ配列を自律的に複製するクローニングベクターに挿入して組換えクローニングベクターを作成し、（ｅ）工程（ｄ）の組換えクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｆ）挿入されたＤＮＡ配列が本発明に係るペプチドあるいはポリペプチド単位をコードしている形質転換宿主細胞を選択し、（ｇ）工程ＣＦ＞の形質転換宿主のクローニングベクター内に含まれている挿入ＤＮＡ配列を同定し、（ｈ）該挿入ｃＤＮＡ配列を単離し、（ｉ）酵素による制限、超音波による剪断、または酵素ＤＮａｓｅ■あるいはＢａ１３１による消化のいずれかによって、またはこれら方法の組合わせによって、ＲＥＳＡ　ＤＮＡの適当なフラグメントを調製し、そして（Ｄ本発明に従う適切な条件下で、酵素により該フラグメントを「頭部−尾部」結合させて反復単位のマルチマーを作成する。

３　、ＲＥ　Ｓ　Ａ抗原の遺伝子を含有するゲノムＤＮＡ（プラスモジウム・ファルシパルムの）を単離し、そして（ａ）酵素による制限、超音波による剪断、または酵素ＤＮａｓｅＩあるいはＢａ１３１による消化のいずれかによって、またはこれら方法を種々組合わせることによって、ＲＥＳＡ　ＤＮＡの種々フラグメントを作成し、（ｂ）酵素により、ＲＥＳＡ　ＤＮＡの単離したフラグメントを「頭部−尾部」結合させてこれらフラグメントのフレーム内マルチマーを作成する。

８アミノ酸の反復領域をコードしているポリヌクレオチドを合成によって調製するのが好ましい（この領域を区切っている適当な制限酵素部位が、１１アミノ酸の反復をコードしている領域とは異なり、天然の配列中に存在しないので）。しかし、このアプローチは、クローンされたｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡからの８アミノ酸反復領域の単離、それに続く、８アミノ酸反復を含む制限フラグメント（実質的に８アミノ酸反復領域だけを含むＤＮＡフラグメントが得られるようエキソヌクレアーゼで切り取ったフラグメント）の単離を妨げるものではない。

また、本発明は、ベクターＤＮＡおよび本発明の第１の態様に従うポリヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ挿入体であることを特徴とする、組換えＤＮＡ分子を提供するものである。

この組換えＤＮＡ分子のベクターＤＮＡは、プラスミド、ウィルスまたはバクテリオファージＤＮＡからなる。

適当なプラスミドニハ、ｐＵＣ１３、ｐｓＫｓ１０６、ｐＬＫ５７、ｐＬＶ８５、ｐＰＬｃ２４５、ｐｔａｃｌ　２Ｈ，ｐＢＴＡ３９５、ｐ〜ＶＴ５７１およびｐＢＴＡ２６０が含まれる。適当なウィルスには、ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルス類、ワクシニアレトロウィルス類、バキュロウィルス類、エプスタイン −バーウィルスおよび５Ｖ−４０ベースのウィルス類が含まれる。適当なバクテリオファージには、Ｍ１３およびλが含まれる。本発明に係る組換えＤＮＡ分子の範囲内に含まれるのは、発現コントロール配列がＤＮＡに機能的に結合している組換えＤＮＡ分子である。これにより、ヘテロローガスな系での分子の発現が得られる。好ましいものとして、本発明は、実施例に記載の、発現コントロール系に機能的に結合したＤＮＡ分子を提供するものである。

また、本発明は、本発明に係る組換え分子で形質転換された形質転換宿主を提供するものである。この宿主細胞は、細菌細胞、酵母、菌類、および植物およびヒト細胞を含む高等真核細胞から選ぶことができる。本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５゛あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５゛あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドを発現しうる形質転換宿主を含むものである。

本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５゛あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるポリペプチド、または該ポリペプチドと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドをコードしているＤＮＡを有するように宿主を形質転換するための方法であって、適当な宿主を用い、該宿主に本発明に係る組換えＤＮＡ分子を導入することからなる方法を提供するものである。

また、本発明は、本発明に係る形質転換宿主の発現産物であって、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５゛あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５′あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドからなる産物をも提供するものである。

また、本発明は、実質的に純粋な形のこのような発現産物をも包含するものである。

さらに、この発現産物は、形質転換宿主の、またはその他の、発現レベルの増加を宿主に引き出すことができるか、あるいはさらに免疫原性の高い分子の産生を導く第１のペプチド配列、およびプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるか、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドである第２のペプチド配列からなる融合産物であることもできる。

また、本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原の種々の部分、ならびに特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーを含有するポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原の種々の部分、ならびに特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドを生合成するための方法であって：プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマー、またはプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５′あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドに対応しているか、または発現の際にコードしている第１のＤＮＡ配列を含むＤ　Ｎ　Ａ挿入体であることを特徴とする組換えＤＮＡ分子を得：該組換えＤＮＡ分子で宿主を形質転換して、該宿主が、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーからなるポリペプチド、またはプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５′あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドを含有するタンパク質産物を発現することができるようにし；そして該宿主を培養して該発現物を得、タンパク質産物を集めることからなる方法を提供するものである。

第３の態様において、本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原に対する哺乳動物の免疫応答を刺激するための組成物であって、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーからなるポリペプチド、またはプラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５°あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドの少なくとも１種を、薬学的に許容しうる担体および／またはアジュバントとともに含有するか、またはそのようなポリペプチド単独からなる組成物を提供するものである。

適当なアジュバントには、ムラミルジペプチドなどの種々マイコバクテリウムの抽出物およびアルヒドロゲルが含まれる。

また、この態様は、該組成物を製造するための方法であって、本発明に係るポリペプチドの少なくとも１種の有効量を調製するための工程群および所望により該有効量を薬学的に許容しうる担体および／またはアジュバントと混合することからなる方法をも提供するものである。

適当な投与量範囲はｌ投与あたり０．１μ９〜３ｍｇである。

第４の態様において、本発明は、マラリア、特にファルシパルムマラリアに対して免疫を付与する方法であって、本発明に係る組成物あるいはポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与することからなる方法を提供するものである。

さらに別の態様は、抗マラリア抗体の検出に有用な、本発明に係るポリペプチド含有の試薬を提供するものである。

また、本発明は、抗マラリア抗体を検出するための方法であって、プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のＲＥＳ／ｌ子の領域、ならびに特に５°あるいは３°反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原の５°あるいは３°反復単位を含むＲＥＳＡ分子の領域の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドを調製し、そして該ポリペプチドを検定に用いて抗マラリア抗体を検出することからなる方法を提供するものである。

さらに別の本発明に係る試薬には、本発明に係るポリペプチドに対して生成させた抗体であって、マラリア抗原の検出に有用な抗体が含まれる。

また、本発明は、マラリア抗原を検出するための方法であって：プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、ならびに特に５゛あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーであるポリペプチド、または該プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメント、特に５°あるいは３゛反復単位の、全部、一部、類似体、同族体、誘導体あるいはそれらの組合わせ物のマルチマーあるいはモノマーと類似の生物学的あるいは免疫学的活性を示すポリペプチドを調製し；該ポリペプチドに対する抗体が生成するように、動物を該ポリペプチドで免疫学的にチャレンジし；そして該抗体を検定に用いてマラリア抗原を検出することからなる方法を提供するものである。

本発明の別の態様によれば、哺乳動物の血液段階のプラスモジウム・ファルシパルム抗原に対する免疫化のためのワクチン組成物であって、配列：（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）ｎ。

（ＥＥＮＶＥＨＤＡ）ｎ、および（Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｖ　）ｎ［配列中、ｎは正の整数である］からなる群から選ばれる配列、または削除および／または保存的置換によってこれらから導かれる関連配列の少なくとも１つを有するか、または含有している合成ペプチド（この合成ペプチドは、所望により担体分子に結合される）を、それらの薬学的に許容しうる担体とともに含有する組成物が提供される。

この合成ペプチドは、（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）ｎおよび（ＥＥＮＶＥＨＤＡ）ｎ　［ここで、ｎは正の整数であるコから選ばれる配列の少なくとも１つを有するか、または含有しているのが好ましい。上記のように、本発明は、担体分子と結合していることもある反復オリゴマーとして、メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）固相合成あるいはその他の適当な方法で合成したある種のペプチド類を、薬学的に許容しうる担体とともに用いて、プラスモジウム・ファルシパルムによる感染の結果から保護する免疫応答を刺激することに関する。

また、合成ペプチドに対する免疫応答を刺激し、それによって組成物の保護効果を高めるために、本発明のワクチン組成物は、たとえばリン酸アルミニウムなどのアジュバントを含有していてもよい。

発現コントロール配列と機能的に結合した適当なヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子、またはそのような組換えＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡクローニング媒体あるいはベクターを含んでいる宿主細胞中での発現によって、本発明のワクチン組成物に用いるペプチドを調製することができる。このようにして発現される合成ペプチドは、所望の配列を有するか、あるいは含んでいる部分、およびそれに融合した組換えＤＮＡ分子のＤＮＡがコードしている付加的なポリペプチドからなる融合ポリペプチドであってもよい。

別法では、この合成ペプチドを、化学的手段、たとえばよく知られた上記のメリーフィールド固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　１９６３）によって調製してもよい。

図面の簡単な説明以下の詳細な説明および添付の図面により、本発明の細部がさらに明らかなものとなるであろう。

第１図：酵母株ＡＨ２２中に産生じたＲＥＳＡ−特異的なタンパク質の検出。発現ベクターｐＢＴＡ２６０だけ（レーンＡ）を含有するか、またはＲＥＳＡの２．８ｋｂＸ＋ｕｌフラグメント（レーンＢ）あるいはＲＥＳＡの３　、２　ｋｂフラグメント（レーンＣ）のどちらかをｐＢＴＡ２６０に挿入した組換えベクターを含有する株ＡＨ２２゜レーンＤおよびＥは、酵母株ＭＴ３０２−１ｃ中での、ＲＥＳＡの２．８ｋｂＸｍｎｌおよび３　、２　ｋｂフラグメントの発現をそれぞれ示す。ＲＥＳＡ−特異的なタンパク質は、Ａｇ６３２−ベータガラクトシダーゼ融合タンパク質に対するアフィニティー精製抗体を用い、ウェスタンプロット分析で検出した。

第２図：ベクターｐＳＫＳ　ｌ　０６（レーンＡ）、ｐＢＴＡ３５４（レーンＢ）、ｐｔｙ　Ｃ９（レーンＣ）またはｐＢＴＡ３５６（レーンＤ）を含ＲＥＳＡ −特異的なタンパク質の検出。ＲＥＳＡ−特異的なタンパク質は、第１図について記載したようにして検出した。

第３図二大腸菌中で発現されるＲＥＳＡ−特異的なタンパク質の検出。１．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントの発現の検出（第３Ｂ図）に用いた抗体がＲＥＳＡの３′反復領域に対するモノクローナルであること以外は、第１図について記載したようにしてＲＥＳＡ−特異的なタンパク質を検出した。

第３Ａ図：ベクターｐＢＴＡ３６８を含有する３Ｍ１０７の１　ｏｎ−突然変異体中でのＲＥＳＡ−特異的なタンパク質の検出を示しているが（レーンｌ）、親ベクターｐＵＣ１３を含有している同一の宿主株は検出しうるＲＥＳＡ−特異的なタンパク質を全く産生じない（レーン２）。

第３Ｂ図：ベクターｐＢＴＡ３６７を含有するＪＭ１０９株中でのＲＥＳＡ−特異的なタンパク質の検出を示しているが（レーンｌ）、ベクターｐＢＴＡ３９５（ｐＵＣｌ　３と密接に関連しているベクターであり、その多重クローニング部位だけが異なっている）を含有する同一の宿主株は検出しうるＲＥＳＡ−特異的なタンパク質を全く産生じない（レーン２）。

第４図：大腸菌株ＪＭ１０９中でのβ−ガラクトシダーゼ−Ａ８６３２融合タンパク質の検出。レーンＡおよびＣは、それぞれ発現ベクターｐｓＫｓ１０６およびｐＢＴＡ２８６のコントロール下で産生される、β−ガラクトシダーゼの完全な長さのおよび短くなった誘導体（矢印）の発現を示している。レーンＢおよびＤは、それぞれ発現ベクターｐＢＴＡ２２４、およびｐＢＴＡ２８６に密接に関連したベクターのコントロール下で産生される、対応するβ−ガラクトシダーゼ −Ａｇ６３２融合タンパク質の発現を示している：この後者ベクターはｐＢＴＡ２８６とは異なるフレームに多重クローニング部位を有しているが、それ以外はｐＢＴＡ２８６と同じである。電気泳動によって分離した全細胞タンパク質を含有している５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ）染色によって融合タンパク質を見えるようにした。５°反復領域に対するモノクローナル抗体を用い、ウェスタンプロット分析によって、融合タンパク質（レーンＢおよびＤの矢印）がＲＥＳＡ−特異的であることを確認した（データは示していない）。

第５図：大腸菌株ＪＭ１０９でのβ−ガラクトシダーゼ−Ａｇ２８融合タンパク質の検出。レーンＡは、発現ベクターｐｓＫｓ１０６のコントロール下で産生される、ＪＭ１０９での完全な長さのβ−ガラクトシダーゼ（矢印）の発現を示し、一方、レーンＢは、発現ベクターｐＢＴＡ２２４のコントロール下のβ−ガラクトシダーゼ−Ａｇ２８融合タンパク質（矢印）の発現を示している。３°反復領域に対するモノクローナル抗体を用い、ウェスタンプロット分析によって、矢印のバンド（レーンＢ中の）がＲＥＳＡ−特異的であることを確認した（データは示していない）。

第６図：酵母株Ａｇ２２中での、天然に近いタンパク質として、およびＰＧＫ− 融合タンパク質としてのＡｇ６３２　Ｂの検出。レーンＢおよびＤは、ベクターｐＢＴＡ３８０を含有する細胞中でのＰＧＫ−融合タンパク質（レーンＢ）としての、およびベクターｐＢＴＡ５３５を含有する細胞中での天然に近いタンパク質（レーンＤ）としての、Ａｇ６３２　Ｂの発現を示している。レーンＡおよびＣは、親ベクターｐＭＡ２７およびｐＢＴＡ２６１　（ｐＢＴＡ２６０に密接に関連したベクターであり、部分的ＥｃｏＲＩ２μｍＤＮＡ由来のＤＮＡセグメントの配向だけが異なっている）をそれぞれ含有する細胞中で産生されるＲＥＳＡ −特異的なタンパク質が存在しないことを示してい°る。５°反復領域に対するモノクローナル抗体を用いること以外は、第１図で記載したようにしてＲＥＳＡ −特異的なタンパク質を検出した。

第７図：それぞれ、ＩＰＴＧの存在下および非存在下で増殖させた、大腸菌株ＪＭＩＯＩ（レーンＣ，Ｄ）、ＪＭ１０９（レーンＥ１Ｆ）、３Ｍ１０７　頃〔（レーンＧ、Ｈ）、ＮＢ４２Ｆ’（レーン１１Ｊ）、ＮＢ４２（レーンに、Ｌ）、ＴＧ８９４（レーンＭ、Ｎ）、およびＡＫＢＣ２Ｂ（レーン０、Ｐ）での、発現ベクターｐＢＴＡ３９５のコントロール下の、Ａｇ６３２Ｂのウェスタンプロット分析。レーンＡおよびＢは、挿入体を欠くプラスミドを有する大腸菌株ＮＢ４２を示している。このウェスタンをＡｇ６３２のβ−ガラクトシダーゼ融合体に対するアフィニティー精製抗体でプローブし、結合した抗体をヒツジ抗−ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲートで検出した。

第８図：大腸菌株ＪＭＩ　０９ｃｌ　８５７（Ａ）およびＰＬ４５９（Ｂ）において、発現ベクターｐＬＶ８５のコントロール下で産生されるＡｇ６３２Ｂのウェスタンプロット分析。この細胞を本明細書中に記載したようにして熱−誘導した。レーン１．３は２８℃で増殖させた細胞を、レーン２．４は４２℃で増殖させた細胞を含んでいる。

（Ａ）および（Ｂ）のレーンｌおよび２は、挿入体を欠くプラスミドを有する対照株を示している。このウェスタンを第７図について記載したようにしてプローブした。

第９図：大腸菌株ＪＭＩＯＩ（Ａ）、ＮＢ４２Ｆ”（Ｂ）、ＪＭＩ　０７亘（Ｃ）およびＪＭ１０９（Ｄ）での、発現ベクターｐＢＴＡ３９５のコントロール下の、天然の５゛反復のウェスタンプロット分析。（Ａ）および（Ｄ）；レーンｌおよび２は挿入体を欠くプラスミドを有する対照株を示し、レーン３および４はモノマー、レーン５および６はダイマー、レーン７および８はトリマーおよびレーン９および１０はヘキサマー。（Ｂ）および（Ｃ）：レーン１および２は、モノマー、レーン３および４はダイマー、レーン５および６はトリマーおよびレーン７および８はヘキサマー。細胞をそれぞれＩ　ＰＴＧの存在下および非存在下で増殖させた。このウェスタンを第７図について記載したようにしてプローブした。

第１０図二大腸菌株ＰＬ４５９において、発現ベクターｐＩ、Ｖ８５のコントロール下で産生させた天然の５°反復モノマーのウェスタンプロット分析。レーンＡおよびＢは挿入体を欠くプラスミドを有するＰＬ４５９株を、レーンＣおよびＤはモノマー含有株を示す（それぞれ、２８℃および４２℃で増殖させた）。この細胞を本明細書中に記載したようにして熱−誘導した。このウェスタンを第７図について記載したようにしてプローブした。

第１１図：大腸菌株ＪＭ１０１（Ａ）、Ｃ６００λ（Ｂ）、ＴＧ８９４（Ｃ）およびＮ８４２Ｆ’（Ｄ）での、発現ベクターｐＢＴＡ３９５のコントロール下の、合成の５゛反復のウェスタンプロット分析。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）レーンｌおよび２はトリマー、レーン３および４はペンタマー、およびレーン５および６はヘプタマーを示す。５°反復挿入体を欠くプラスミドを有する対照株を（Ｃ）レーン７および８に示す。（Ｄ）；レーンｌおよび２はトリマーを示し、レーン３および４はヘプタマーを示す。細胞をそれぞれＩ　ＰＴＧの存在下および非存在下で増殖させた。このウェスタンを第７図に記載したようにしてプローブした。

β−ｇａｌ　−Ａｇｆ３３２融合産物を臭化シアン消化することによって得たペプチドを、本明細書中に記載のようにしてＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）で分画した。ピーク（Ｃ）は、５°反復領域を含有するペプチドに対応している。

第１２図からの、ピークＣを含有している分画の一部を２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動にかけ、次いで明細書中に記載のようにしてニトロセルロースに移した。アルカリホスファターゼと結合した抗−マウスＩｇＧ抗体およびクローンＡｇ６３２（ＦＰ　Ａｇ６３２）が産生ずる融合タンパク質に対して生成したモノクローナル抗体（Ｍａｂ３０６．１４）を用いてバンドを検出した。

第１４図：大腸菌中で発現したＲＥＳＡ遺伝子およびセグメントに予想される構造。示した構造は、クローンされたＦＣ２７ｃＤＮＡの配列（Ａｇ４６ヌクレオチド３，２７０−４．５８６）に結合させた（内部ＥｃｏＲＩ部位で）、プラスモジウム・ファルシパルム単離体ＦＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）からのクローンされた染色体性Ｂｃ。

ＲＩフラグメントの配列（ヌクレオチド１−３，２６９）からなる。

大腸菌中で発現させ、Ａｏｔｕｓサルのワクチン接種に用いたフラグメントの相対位置および終点が示されている。

第１５図：構築物Δ１１に含まれているＲＥＳＡの３．５９ｋｂフラグメントの模式図。

第１６図：酵母発現ベクターｐＢＴＡ２６０およびｐＢＴＡ２６１の構築工程の概略図。

第１７図：制限酵素Ｈ４ｎｆｌおよびＡｌｕＩを用いて、完全長さのＲＥＳＡ　ＤＮＡから切断したＲＥＳＡの５°反復領域の配列。適当なｄＮＴＰの存在下、フレノウ酵素を用いて、切断した分子の５°末端を２本鎖形に変換した。

第１８図ニブラスミドｐＢＴＡ５５９を得るためにＩ）ＢＴＡ３９５の多重クローニング部位領域に挿入したＲ’ＥＳＡの天然５°反復領域の配列。翻訳された配列は、予想したアミノ酸配列の発現産物を与える。

第１９図二頭部−尾部ライゲートして（３３−ｍｅｒ）ａＤ　Ｎ　Ａ分子を得、これにアダプターを付加してベクターｐＢＴＡ３９５へのライゲートを可能にするための、合成１１アミノ酸反復単位の配列。これによってベクターｐＢＴＡ５４０が得られ、その配列の一部をここに示した。モノマーと呼ばれるこの挿入体は、ＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩで消化した後に単離すると、さらに別の頭部− 尾部自己ライゲートのベースとなる。

第２０図：クローンＡｇ２Ｂから単離した融合ポリペプチドで免疫化したＡ　ｏｔｕｓサルでの抗体応答を示している（グループｌ）。

Ａ、ＢＳＡにコンジュゲートしたＥＥＮＶＥＨＤＡと反応する抗体Ｂ、ＢＳＡにコンジュゲートした（Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｖ　）４と反応する抗体実線は、治療することなく回復したサルを示している。破線は、１０％寄生虫血症に達し、治療されたサル、または１０％寄生虫血症に達する前にマラリアで死んだサルを示している。

第２１図：クローンＡｇ６３２から単離した融合ポリペプチドで免疫化したＡｏｔｕｓサルでの抗体応答を示している（グループ２）。

Ａ、Ｂ５Ａ１．：：）ンジュゲートした（　Ｄ　Ｄ　Ｅ　ＨＶ　Ｅ　Ｅ　Ｐ　Ｔ　Ｖ　Ａ　）　ｔと反応する抗体Ｂ、ＢＳＡにコンジュゲートした（ＥＥＮＶ）、と反応する抗体すべてのサルが治療することなく回復した。

第２２図：クローンＡｇ６３１およびＡｇ６３３から単離した融合ループ３）。

Ａ、Ｂ５Ａｌ：コンジュゲートした（　Ｄ　Ｄ　Ｅ　ＨＶ　Ｅ　Ｅ　Ｐ　Ｔ　Ｖ　Ａ　）　ｘと反応する抗体Ｂ、ＢＳＡにコンジュゲートした（ＥＥＮＶ）、と反応する抗体実線は、治療することなく回復したサルを示している。破線は、ｌＯ％寄生虫血症に達し、治療されたサル、またはｌＯ％寄生虫血症に達する前にマラリアで死んだサルを示している。

第２３図二マイクローＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定した、ＲＥＳＡ合成ペプチドで免疫化したマウスの抗体応答。ＫＬＨと結合さ仕たペプチドは次のもノテあった：ＥＥＮＶＥＨＤＡ（ＲＥＳＡ　３°−１）、黒枠；（ＥＥＮＶ）、（ＲＥＳＡ　３ °−２）、斜線を引イタ棒、ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡＹ（ＲＥＳＡ　５°−ＩＹ）、陰影を付ケタ棒；および対照として、ＮＰ７Ｓ−１，すなわちプラスモジウム・ファルシパルム単離体ＮＦ７Ｓ抗原の２つの反復に対応している１６−アミノ酸ペプチド、白樺。完全フロインドアジュバントとＫＬＨコンジュゲートＩ００μ９でマウスを免疫化し、４週間後に不完全アジュバント中の同一量のコンジュゲートでブースター処理した。ブースター処理の２週間後に抗体測定用の血液を採取した。ＲＥＳＡの５°反復（ＦＰＡｇ６３２）および３°反復（１；’ｌ）Ａｇ２Ｂ）に対応している融合ポリペプチド（下の枠）、およびＢＳＡとコンジュゲートした合成ペプチド（上の枠）のそれぞれに対し、１種類の希釈（１：２５０）で、血清を複数回検定した。３匹のマウスだけが生き残ったＲＥＳＡ　５°−ＩＹで免疫化した群を除き、結果は５回の平均である。

第２４図：マイクロ−ＥＬＩ　ＳＡで測定した、マウス抗−ＲＥＳＡペプチド抗血清とプラスモジウム・ファルシパルムに感染した赤血球の超音波処理物（単離物ＦＣ２７）との反応性。それぞれの棒は、個々のマウスで得られた値である。

本明細書中、ＰＢＴＡ３８２、ｐＢＴＡ５３５、ｐＢＴＡ３７９、ｐＢＴＡ５３７およびｐＢＴＡ３５６と命名した株の寄託は、それぞれ取得番号ＡＴＣＣ６７３５０、ＡＴＣＣ６７３４９、ＡＴＣＣ６７３４８、ＡＴＣＣ６７３５１およびＡＴＣＣ６７３４７の−〇コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）に行った。

（ａ）大腸菌：細菌細胞を初期対数期まで増殖させ、使用する発現システムに応じて誘導した。ｌａｃプロモーターを含有しているものを、富培地（トリプトン大豆ブロス）または最小培地（Ｍｑ塩＋グリセリン）中、３７℃で増殖させ、１ｍＭイソプロピル−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに２〜４時間収穫前に増殖させた。

始めに、λＰＬプロモーターを含有する細胞（感温性リプレッサーＣｌ８５７とともに）を富培地中、３０℃で増殖させ、次いで、４時間、４２℃にして誘導した。次いで、細胞を遠心し、ベレットを電気泳動試料緩衝液に懸濁し、５〜１５分間煮沸してタンパク質を変性した。

（ｂ）酵母：２％グルコース含有の最小培地中、対数期まで増殖させることによって酵母細胞を誘導した。細胞ペレットを集め、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフＣリド（ＰＭＳＦ）含有の蒸留水中、ガラスピーズとのポルテックス撹拌によって細胞を破壊した。次いで、全細胞破片を試料緩衝液中で２〜５分間煮沸してタンパク質を変性した。

酵母または大腸菌からの全細胞タンパク質試料を上記のようにして調製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる１次元電気泳動で分離した。次いで、タンパク質のバンドを、クーマツシーブルーでゲルを染色することによって見えるようにするが、または免疫プロット用にニトロセルロースシートに移した。

免疫プロットによるタンパク質の分析電気泳動によってタンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートに移した。次に、このシートをブロッ）　（Ｂ　１ｏｔｔｏＸ　５％脱脂粉乳のリン酸緩衝食塩水）中でインキュベートし、次いで以下に挙げる抗 −ＲＥＳＡ抗体の１つとともにインキュベートした：（ｉ）β−ガラクトシダーゼ−Ａｇ６３２融合タンパク質に対するウサギ抗血清（大腸菌および酵母抽出物に対して予め吸着した）、（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ−Ａｇ６３２融合タンパク質に対するアフィニティー−精製した抗体、または（ｉｉｉ）５°または３°反復領域のどちらかに対するモノクローナル抗体。

このシートを洗浄し、次いで　１ｔＪ−タンパク質Ａとともにインキュベートし、洗浄し、オートラジオグラフィーにかけるか；または、アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗−ウサギＩｇＧとともにインキュベートし、洗浄し、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）で現像した。

５°反復領域に対するモノクローナル抗体はタンパク質Ａと結合することができないので、アフィニティー−単離したヒツジ抗−マウスＩｇＧ［シレヌス（Ｓｉ　Ｉｅｎｕｓ）］との中間インキュベートは、このモノクローナルによる免疫検定においてＩｔＪ−タンパク質Ａを使用することを可能にした。このような場合、タンパク質Ａとのインキュベートは、ｐＨ８，８に緩衝化したプロット中で行なった。

ＤＮＡ法ＤＮＡの単離および操作に用いた方法のすべては、マニアナイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９ｇ２．”）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ” 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　！Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の記載のものと実質的に同じである。

課」」ｄ」町１床以下に挙げる大腸菌株を用いた：鏡　参照文献　遺伝子型ＪＭＩＯＩ　１　Δ（ｌａｃ、ｐｒｏ）、５ｕｐＥ（ＧｌｎＶ）、ｔｈｉ／Ｆ’ 　ｓ　ｐｒｏｋ＝Ｂ：。

ＮＢ４２Ｆ’　１，３　１１Ｂ４２／Ｆ’　ｐｒｏＡ”Ｂ”、　Ｉａｃｌｑ、Δ （ｌａｃＺ）Ｍ２Ｓ、ＴＧ８９４　呵、臘、１ｅｕＢ６．　ｐｒｏＡム岨、ｈｉｓ−４゜ＡＫＥＣ２８４ｔｈｒＣ，１ｅｕＢ６、ｔｈｙＡ、　ｔｒｐｃ１１１７、ｈｓｄＲｋ、　ｈｓｄＭｋ。

Ｃ６００（λ）　５　ｔｈｉＡｌ、　ｔｈｒ−Ｌ　１ｅｕＢ６．５ｕｐＥ　（ｇｌｎＶ）４４、側、ＦｈｕＡ２１（λ戸参照文献：１、グロネンボーンおよびメリック［Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、、Ｎａｔｊｒｅ　２７２：３７５−３７７（１９７ｇ）コ２、ヤニッシューペロン、ビエラ、メリック［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｒａ、Ｊ、、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１１９（１９８５）：］９８２）］融合ポリペプチドの単離適当な細菌細胞を、通気した８００１！の培養器中、中間対数期になるまで増殖させ、４５℃で１５分間熱−誘導し、さらに３７℃で９０分間インキュベートした。この細菌細胞を遠心して集め、０゜２５１１９／ｗＱリソチーム、１０ｍＭトリス、ｐＨ８，２＋ｎＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭ　ＮａＣｌ２で処理して溶解した。最終濃度０．２％となるようにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を加え、この溶液を１０ｍＭ　ＭｇＣ（ｈおよび１μ９７ＭＱＤＮａｓｅにした。室温で３０分間インキュベートした後、８５０ｇで遠心して細胞破片を除去した。

４０．０００ｇで遠心して不溶性の細菌タンパク質を集め、次いで２％ＳＤＳおよび１０＋ｎＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有の０　、１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解した。次に、この溶解したタンパク質を、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ　４　Ｑ　Ｑカラム（２５ｕ＋ｘ　９０ｉｌ）と直結したセファクリル８３００カラム（２５ｍｉｘ　９０　ｘｘ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで分画した。このカラムを平衡化し、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭＤＴＴ含有の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、８）を用い、４０ｙｒＱ／時間の流速で溶離した。各分画の少量を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、融合ポリペプチドの溶出部分を同定した。他のポリペプチドのかなりの部分を含んでいない融合ポリペプチドを含有している分画をプールした。この溶液から融合ポリペプチドを濃縮し、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）への吸着によって不純なＳＤＳの約９０％を除いた。このため、プールした分画を、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭＤＴＴ含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４）中で洗浄しておいたＨＡと、室温で２０分間混合した。次いで、ＨＡを沈澱させ、上清をデカンテーションして捨て、１＋ｎＭＤＴＴを含むがＳＤＳを含まない０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４）にＨＡを再懸濁した。このＨＡを２００ｘｘｘ　１５＋ｖａ＋カラムに入れた後、１ｍＭＤＴＴ含有の０，５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、８）で融合ポリペプチドを溶離した。使用時までこの融合ポリペプチドを、この溶液中、−７０℃で保存した。

ペプチドの合成およびフンジュゲートキーゼルグール（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）Ｋ　Ａ樹脂支持体による、アセ−トン等（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、　１９８３）のＦＭｏｃ固相合成法によって、ペプチドＲＥＳＡ　５°−１およびＲＥＳＡ　５°−ＩＹを合成した。その他のペプチドのすべては、メリーフィールドの固相ＴＢｏｃ法（１９６３）を用い、手作業で、またはアプライド・バイオシステムズ社（ＡＰｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）のモデル４３０Ａ自動ペプチド合成機で合成した。

グルタルアルデヒドを用いてこのペプチドを、担体タンパク質、キーホールド・リムベット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｄ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ、　ＫＬＭ）およびウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）とコンジュゲートした。このため、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１ｙ１２中のタンパク質４ス９およびペプチド２所に２５ｍＭグルタルアルデヒド０　、５　＊Ｑを滴下し、この溶液を室温で６時間放置した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸 −緩衝食塩水（ＰＢＳ、数回交換）に対し、４℃で２４時間透析した。

マウスの免疫化フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）とＫＬＭ／ペプチドコンジュゲート１００μ９（担体タンパク質）でマウスを免疫化し、４週聞役に、不完全アジュバント中の同一量のフンシュゲートでブースター処理した。ブースター処理の２週間後にマウスから血液を採取した。

ウサギの免疫化ＦＣＡ、ツルームラミルジペプチド／スクアレン−アラセル（Ｓｑｕａｌｅｎｅ −Ａｒａｃｅｌ、　Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）またはアルミニウムと、ジフテリアトキソイド／ペプチドコンジュゲート２５０μｇ（担体タンパク質）で免疫化した。各実験群に３匹のウサギを用い、この動物を筋肉内により免疫化し、３週間後に２回目の同一の免疫化を行なった。

酵素結合した免疫吸収検定（ＥＬＩＳＡ）を用いる抗体測定４℃で一晩、ＰＢＳ中のＢＳＡ／ペプチドコンジュゲート（５μ９／酎ＢＳＡ）５０μＱで被覆した、可撓性のポリ塩化ビニル微量滴定プレートを用いて、通常のマイクロ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡを行なった。１種類の希釈（マウスについては１：２５０、ウサギについてはｌ：１０００）で血清を２回検定し、結合した抗体を、アフィニティー精製した（マウスあるいはウサギ免疫グロブリンで）西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヒツジＦ（ａｂ）ｔで検出した。１種類の希釈（１：２０００）でサルの血清を３回検定し、結合した抗体を、アフィニティー精製した（Ａｏｔｕｓ免疫グロブリンで）西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギＦ（ａｂ）ｔで検出した。

結合した西洋ワサビペルオキシダーゼを検出するための基質として２．２°−アジノビス（３−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸）を試験に用いる動物は、動物施設［疾病コントロールセンター、マラリア部門、アトランタ、米国（Ｍａｌａｒｉａ　Ｂｒａｎｃｈ、　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ａｔ１ａｎｔａ、　ＵＳＡ）］において、同同一量で行なう試験開始前の最低１ケ月間、前もって調整した。この期間に、ベースラインの血清学的、血液学的、血液化学的、および臨床的パラメーターを確立した。ワクチンまたは対照処理群への動物（抜型■、ＸあるいはＸＩのＡｏｔｕｓサル）の割り当ては、乱数表を用いてランダムな。

配分とした。６週間離して、各動物に試験あるいは対照抗原を２回接種した。最初の免疫化には、抗原２５０μ９を完全フロインドアジュバントで乳化し、これを筋肉内注射した。２回目の免疫化には、同一量の抗原を、完全フロインドアジュバントを追加した不完全フロインドアジュバント（１０部中に１部）で乳化し、これも筋肉内注射した。

２回目の免疫化の２週間後に、プラスモジウム・ファルシパルムのインドシナ　Ｉ／ＣＤＣ株に感染したＡｏｔｕｓサルから得た５００゜０００の無性寄生虫を静脈内接種することによって、この動物をチャレンジした。チャレンジした日から、毎日の血液標本について寄生虫血症の測定を行なった。抗体レベルを調べるための血清試料は、試験中、１週間毎に採取した。１０％またはそれ以上の寄生虫血症を示した動物をこの研究から除き、メフロキーネで治療した。

結　果酵母および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に於いて完全な長さのＲＥＳＡが発現するＩ；めの組換えベクターの組み立て。

（ａ）醪旦完全な長さのＲＥＳＡフラグメントを酵母および大腸菌の発現ベクターの両方にサブクローンすることを容易にするために、Δ１１と命名した第一の構築物を作成した。

ＲＥＳＡ染色体ＥｃｏＲＩラグメント由来の５″−遺伝子爵配列の様々な量（ａｎ＋ｏｕｎｔ）　（第１４図）を、エキソヌクレアーゼＢａ１３１を用いて取り除きｓ　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩリンカ−をこの新しい５′末端に付与した。１０個のＢａ１３１欠損クローンを得、配列分析によってこれらの欠損終末端を決定しｔ；。１０個のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを各々ｐＧＳ６２に入し、得られＩ；プラスミドをワクシニアのクローニングに使用した。ワタシニア感染細胞へのトランスフェクションのために２つのプールを調製した二プールｌは５個の最長のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント・サブクローンを含有しており、プール２は５個の最短のサブクローンを含有していた。トランスフェクションの後、ワクシニアウィルス・プデークを得、ＲＥＳＡポリペプチドの「５′反復部」に特異的な家兎抗血清を使用してＲＥＳＡの５″末端の発現に関してスクリーニングした。

ポジティブ・クローン（Δ１１と命名）の配列を決定し、ＡＵＧ開始コドンの直後に開始していることが分かった。

組換えベクターΔ１１の精製ＤＮＡ　（第１５図）をＢａｍＨＩで消化した後、ｄＮＴＰｓの存在下クレノー酵素で処理することにょっンド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、５’　ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ３’　］を、元のＢａｍＨ１部位をＢｇｌＩ［部位に効果的に変換する切断ベクターにライゲートした。別々に、Δ１１をＸ　ｍ　ｎＩで部分消化し、ＲＥＳＡコード領域の下流に位置するＸｍｎ１部位が合成リンカ−を使用することによってＢａｍＨＩ部位に変換されている組換えプラスミドを分離した。次いで、Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｉｆ　Ｐ　ｓ　ｔ■フラグメン１−（第１５図、ａ）およびＰｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ７ラグメント（第１５図、ｂ）を、低融点（ＬＭＰ）アガロースゲルから精製して分離し、これら２つの７ラグメントを一緒に酵母発現ベクターｐＢＴＡ２６０のＢｇｌｌＩ部位にライゲートし、組換えベクターｐＢＴＡ３６９を調製した。

ベクターｐＢＴＡ２６０およびｐＢＴＡ２６１の組み立てについて以下説明する（第１６図も参照）。ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の全体と共に、ＰＧＫ転写および終止コントロール領域を含有する３ｋｂＨｉｎｄｎ［フラグメントを９ＭＡ２７から切除し［メロ−（Ｍｅｌｌｏｒ、Ｊ、）ら、１９８３、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２４：１（４］、ＨｉｎｄＩ［［消化ｐＢＲ３２２にライゲートして［ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ。

Ｆ、）ら１９７７、ジーン２：９５−１１３］　、組換えベクターｐＢＴＡ２１２を調製した。次いで、ＰＧＫ翻訳開始コドンの直ぐ上流の５ａｕ３Ａ部位からＰＧＫ遺伝子内でただ一つのＢｇｌＩ［部位までの７ラグメント（サイズ約１．２　ｋ　ｂ）をこのベクターから欠損させ、ベクターｐＢＴＡ２２９を調製した。ｐＢＴＡ２２９のＥｃｏＲＩ部位にｐＭＡ３ａ由米のＥｃｏＲＩ部分７ラグメント（２μプラスミド複製起源およびＩｅｕ−２遺伝子を含有）をライゲートすることによって、ベクターｐＢＴＡ２３０およびｐＢＴＡ２３４を組み立てた［キングマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ、Ｓ、Ｍ、）らの酵母に於ける遺伝子発現（Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ）、１９８３　；コーラ（Ｍ、Ｋｏｒｈｏｌａ）およびベイサネン（Ｅ、Ｖａｉｓａｎｅｎ）版、アルコ・シンポジウム・ヘルシンキの議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ）、１９８３　、生物工学研究および工業発酵研究の基礎（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＢｉｏＬｅｃｈｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ５６ｂｐをｐＢＴＡ２３０およびｐＢＴＡ２３４の唯一のＢｇｌＩ［部位にライゲートし、ＰＧＫプロモーターに基づく発現ベクターｐＢＴＡ２６０およびｐＢＴＡ２６１を調製しｔ；。ｐＢＴＡ２６０およびｐＢＴＡ２６１に於けるＰＧＫ翻訳開始領域の回りのヌクレオチド配列を以下に示す：翻訳方向 −１０ｍｅｔ　ｓｅｒ　ｇｌｕ　ｉｌｅ　５ｅｒ５’　ＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＣＣ３’ＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴ　ＴＡＣＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＧ　ＡＧＧＢｇｌＩ［一１０位の上流のＤＮＡ配列は、天然の配列と同一である。

完全な長さのＲＥＳＡフラグメント３．２ｋｂを含有する組換えベクターｐＢＴＡ３６９を、ＬｉＣ１法［イト−（Ｉｔｏ、Ｈ，）ｒ　ａ％１９８３、ジャーナル−オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔ、）１５３：１６３−１６８］によって酵母菌株ＡＨ２２［ボーウェン（Ｂｏｗｅｎ、Ｂ、Ａ、）らの１９８４、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１２．１６２７− １６４０１　、およびＭＴ３０２−ＩＣ［メロ−（Ｍａｌｌｏｒ、Ｊ、）らの１９８３、ジーン２４：ｌ−１４１に形質転換した。マテリアルズ・アンド・メソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｓｈｏｄｓ）に記載されているように、酵母培養液からタンパク質を分離し、得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法によって分析しノこ。完全な長さのＲＥＳＡの酵母に於ける発現は、ウェスターン分析によって検出できた（第１図、レーンＣおよびＥであるが、５ＤＳ−ＰＡゲルのコマッシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色では検出できなかった）。

（ｂ）大腸菌大腸菌に於いて完全な長さのＲＥＳＡを発現する組換えベクターを、酵母ベクターの構築物りＢＴＡ３６９に対応させて組み立てた（上記の実施例１（ａ））、ｐＢＴＡ３６９の精製ＤＮＡをＢｇｌＩ［およびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｂｇ　Ｉ　Ｉ［−ＢａｍＨＩフラグメント３．９ｋｂをＬＭＰアガロースゲルから精製した。このフラグメント、即ち（完全な長さのＲＥＳＡ遺伝子に加えて）：（ｉ）ＰＧＫ遺伝子由来の酵母転写終止領域、および（ｉｉ）ｐＢＲ３２２の小さいＨｉｎｄｎ［−ＢａｍＨＩ７ラグメントを含有したこの７ラグメントを、ＢａｍＨＩ−消化した大腸菌発現ベクターｐＵｃ９　［ヴイーラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）およびメッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８２、ジー７１９：２５９−２６８１にライゲートし、形質転換された大腸菌宿主ＪＭ１０７１ｏｎ−［ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，）らの１９８５、ジーン３３：１０３−１１９］に於いて組換えベクターを（ブルー／ホワイトＸｇａ　ｌ法によって）検出した。この組換えベクターはｐＢＴＡ３５６として知られている。

マテリアルズ・アンド・メソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されているように、大腸菌培養液からタンパク質を分離し、得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法によって分析した。完全な長さのＲＥ、Ｓ　Ａの大腸菌に於ける発現は、ウェスターンプロット分析によって検出できた（第２図）が、５ＤＳ−ＦＡ’７’ルのコマッシー染色では検出できなかった。

実施例２　酵母および大腸菌に於けるＲＥＳＡのｘｍｎＩ７ラグメント（２，８ｋｂ）の発現のための組換えベクターの組み立て。

Δ１１の精製ＤＮＡをＸｍｎＩで消化し、ＲＥＳＡの５″および３′反復領域を共に含有する２、８ｋｂ７ラグメントを、ＬＭＰアガロースゲルから精製した。

次いで、合成リンカ−［ニュー・イングランド・バイオラプス、ＢｇｌｌＩ、５ ’　ＣＡＧＡＴＣＴＧ　３’］を用いてこのフラグメントを、酵母発現ベクターｐＢＴＡ２６０のＢｇｌＩ［部位または大腸菌１ａｃ発現ベクターｐｓＫｓ１０６　［シャビラ（Ｓｈａｐｉｒａ、Ｓ、に、）らの１９８３、ジーン２５７１− ８２］のＢａｍＨＩ部位のいずれかにクローンした。このようにして作成したこれら２つの組換えベクターは、それぞれｐＢＴＡ３５７およびｐＢＴＡ３５４として知られている。大腸菌菌株ＪＭ１０７１ｏｎ−を、別々に２つのベクターを使用して形質転換し、無作為プライミング法（ｒａｎｄａｍｐｒｉｍｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）によって３！Ｐ標識したＲＥＳＡの１．３ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして用いたグランスティン・ハイブリダイゼーション（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）により、所望のクローンを検出した［ファインベルクおよびヴオーゲルスタイン（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）のアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）＋１３２：６］　。

次いで、プラスミドｐＢＴＡ３５７を有した細胞由来のミニＤＮＡ試料を調製し、これを使用して酵母菌株ＡＨ２２およびＭＴ３０２−１ｃを形質転換した。マテリアルズ・アンド・メソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されているように、酵母むよび大腸菌培養液からタンパク質を分離し、得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法によって分析した。ＲＥＳＡ特異的物質の、酵母および大腸菌両方に於ける発現は、ウェスターンプロット分析によって検出できた（第１図レーンＢおよびＤ１第２図レーｏＲＩフラグメントの大腸菌に於ける発現のだめの組換えベクターの組み立て。

ベクターΔ１１の精製ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、得られた７ラグメントをＬＭＰアガロースゲルの電気泳動にかけて分離した。２．２ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン）　（ＲＥＳＡの５′反復領域を含有しているが、３′反復領域は含有してしない）を精製し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲに重油化されたｐＵｃ１３［ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）およびメッシングＱ、ｌＪｅｓｓｉｎｇ）、１９８２、ジーン坦：２５９−２６８］にライゲートし、組換えベクターｐＢ’ｒＡ３６８を調製した。１．３ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、ＥｃｏＲＩ−消化ｐＵｃ１３にライゲートして組換えベクター、ＢＴＡ３６７を調製した。この組換え分子を用い、大腸菌菌株ＪＭＩＱ７＋ｏｎ−およびＪＭ１０９をそれぞれ形質転換した。

無作為法により３２Ｐ−標識した２、２ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩまたは１．３ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントのいずれかをプローブとして用いたグランスタイン・ハイブリダイゼーション法によって、得られた組換えクローンを検出した。

マテリアルズ・アンド・メソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されているように、大腸菌培養液からタンパク質を分離し、得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法によって分析した。ＲＥＳＡ特異的物質の、大腸菌に於ける発現を、ウェスターンプロット分析によって検出した（第３Ａ図レーン１１第３Ｂ図レーンｌ）。

実施例４　β−ガラクトシダーゼＡｇ６３２融合タンパク質の大腸−に於ける発現のための組換えベクターの組み立て。

Ａｇ６３２由米の５ａｃＩ／ＥｃｏＲＩ７ラグメントを、ｐＢ”ｒＡ２２４のＳａｃ　ＩおよびＥｃｏＲＩの間に再度クローンし、ｐ１３ＴＡ３７９を得た。

Ａｇ６３２への比較的短いβ−ガラクトシダーゼ融合体を、以下に記載のように組み立てた。ｐＢＴＡ３７９の精製ＤＮＡをＨｐａＩおよびＡｖａＩを用いて消化し、サイズ４０００ｂｐ、１４４３ｂｐｖ　６２４ｂｐおよび２９０ｂｐのフラグメントを作成した。次いで、ｄＮＴＰｓの存在下、クレノー酵素と共にこれらの制＠７ラグメントをインキュゲートすることによってこれらのＡｖａＩ末端を平滑末端にした。次いで、得られたフラグメントをＬＭＰアガロースゲルの電気泳動法により分離し、得られた４ｋｂフラグメントを精製した後、自己ライゲートさせて組換えベクターｐＢＴＡ５１１を調製した。このベクターは、β−ガラクトシダーゼの大きなセグメントが欠損していることを除いてはｐＢＴＡ３７９と同一であった。このライゲーション混合体をＤＮＡの供給源として使用し、大腸菌菌株ＪＭ１０９を形質転換した。マテリアルズ・アンド・メソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されているように、大腸菌培養液からタンパク質を分離し、得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法によって分析した。ＲＥＳＡ特異的な抗原物質の発現を、第４図に示しているように検出した。ネガティブコントロールとして使用したベクターｐＢＴＡ２８６は、ｐＢＴＡ５１１をｐＢＴＡ３７９から得た同様の方法によって、ベクターｐＢＴＡ２２４から得Ｉ；。

実施例５　ＲＥＳＡフラグメントＡｇ６３１％Ａｇ６３２およびＡｇ６３３の大腸菌に於ける発現のための組換えベクターの組み立て。

ＮＡクローンＮＦ７　Ａｇ１３　（内部ＥｃｏＲＩ部位を重複（オーバーラツプ）している（コーマンらを参照））由来のＮＦ７　Ａｇ１３Ｌを用いて検出した。全てのクローンの配列を鎖終末法（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により完全に決定した。ＮＦ７　Ａｇ１３　（分離体ＮＦ＆由来）は、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）　１．６５４−３．７２７から分かる配列を有する共直線（ｃｏｌ　１ｎｅａｒ）であり、大腸菌では、３゛側からこれまでの配列はおそらく欠損を受けている（コーマンら）。大腸菌に於いて発現するこれらの７ラグメント（Ａｇ６３１．Ａｇ６３２およびＡｇ６３３）を、クローンＮＦ７　Ａｇ１３の５’ＥｃｏＲＩフラグメント（ヌクレオチド、１．６５４−３．２６９、これらはコーマンらのヌクレオチドｌ−１，６１６に対応）を音波処理して生成させた。得られた７ラグメントにリンカ−（ＧＣＡＡＴＴＣＣ）を付加した後、λｇｔｌｌ−ａｍｐ３にライゲートし、ＮＦ７　Ａｇ１３の７ラグメントを用いたハイプリダイ−ジョンによってスクリーニングして配列のどの部分が存在しているかを検定した。使用したプローブは、ＰｓｔＩ部位までのＥｃｏＲＩリンカ−（ヌクレオチド１゜６５４−１，９６９）　；　３５２塩基対（ｂｐ）のＡｌｕ　１フラグメント（２，１６２−２゜５１３）および４８５ｂｐＨｉｎｃｌＩ−ＥＣＯＲＩ７ラグメント（２，７８５−３，２６９）由来であった。ＲＥＳＡ遺伝子の異なる部分を有するクローンを、安定な融合ポリペプチドの産生に関し、誘導されたクローンの溶解物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた後、コマッシー・ブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で染色することによって試験した。クローンＡｇ６３］、Ａｇ６３２およびＡｇ６３３は、重複したフラグメントの組を有し、実質的な量の安定な融合ポリペプチドを産生するので、これらを選別した。これら３つのフラグメントの正確な終点を配列決定を行い検定した。Ａｇ６３１は９８９ｂｐ挿入体（ヌクレオチド１．６５４−２．６４２）を含有しているので、５′反復部までの２１８アミノ酸、並びに５′反復部をコードしている。Ａｇ６３２は９９７ｂｐ挿入体（２，２０８−３，２０４）を含有しているので、５′反復部をコードしている。このクローンの５’ＥｃｏＲＩ部位をクローニング人工産物によって破壊した；ベクターＥｃｏＲＩ部位の５″張り出し部を外見上取り除き、平滑末端フラグメントのヌクレオチド２．２０８を得られた平滑末端に直接ライゲートした。これにより得られた配列を、融合点間にわたる５ａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに関し、β−ガラクトシダーゼ配列に対応した合成オリゴヌクレオチドを用いて決定した。Ａｇ６３３は７３０ｂｐ挿入体（ヌクレオチド２，５３５−３．２６４）を含有しているので、５′反復部より下流に位置している。

実施例６　ＲＥＳＡ３’７ラグメントＡｇ２８の大腸菌に於ける発現のｊ；めの組換えベクターの組み立て。

Ａｇ２８はＡｇ１３と同一の配列を有しており、国際特許明細書画ｗｏ８４１０２９１７に開示されている。Ａｇ２８に対応したＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ７ラグメントとして分離し、ＥｃｏＲＩによって開裂されたベクターｐＢＴＡ２２４にライゲートした。［ｐＢＴＡ２２４は、ｐＵＲ２９２［ルーサーおよびミューラーーヒル（Ｒｕｔｈｅｒ、Ｖ、　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈ４１１，Ｂ、）、１９８７、ＥＭＢＯジャーナル２：１７９１−１７９４）］の］β−ガラクトシダーゼ遺伝の外側に位置するＥｃｏＲＩ部位を除去することによってｐＵＲ２９２から得た。このことは、ｐＢＴＡ２２４をＥｃｏＲＩで部分消化しｌ；後、４個のｄＮＴＰ’ｓの存在下クレノー酵素を用いて粘着末端を充填し、再ライゲートし、１ａｃ２遺伝子の外側に見いだされるＥｃｏＲＩ部位が消失したプラスミドを分離することにより実施した。］このライゲーション混合物を大腸菌菌株ＪＭ１０９を形質転換するためのＤＮＡの供給源として使用した。適当なりローンを、＄３ｐ−標識化ＲＥＳＡ　ＤＮＡを使用したグランスティン・ハイブリダイゼーション実験によって検出した。

次いで、マテリアルズ・アンド・メソッズに記載された方法により、β−ガラクトシダーゼへの融合物としてのＡｇ２８の発現を検定した。第５図レーンＢには、コマッシー染色性タンパク質寒天上のこのＲＥＳＡ７ラグメントの検出を示している。これらの分子の同定は、免疫プロッティング法により行った（資料示さず）。

実施例７　近似天然分子（Ｎｅａｒ　Ｎａｔｉｖｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ）としてのＡｇ６３２Ｂの、大腸菌および酵母に於ける発現。

完全に近い長さのβ−ガラクトシダーゼに融合されていないＲＥＳＡフラグメントの発現に関する実験を行った。このような分子の始原型は、配列がＡｇ６３２に類似したフラグメントである。この分子（Ａｇ６３２Ｂと命名）を、以下のようにＲＥＳＡから得た。

クローンされたＲＥＳＡゲノムＤＮＡを、ＡｃｃＩおよびＥｃｏＲＩを用い、即ちこれら２つの部位地図はＡｇ６３２の終末端に近いので、これらを用いて開裂させた。次いで、分離したＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、この分子の末端を無作為化するためにＢａ１３１で手短に消化した。ＢｇｌＩ［リンカ−を加えた後、得られた分子（Ａｇ６３２Ｂ）をベクターｐＢＴＡ２６０　（既述）ノＢｇＩｆｆ部位にライゲートし、大腸菌にクローンした。分離した全てのクローンは、センス鎖（有意なりＮＡ−末鎖）がＰＧＫ翻訳開始領域の方向と反対の方向である挿入体を有していた。ＢｇｌｌＩで消化し、ｐＢＴＡ３９５のＢｇ１１部位に挿入した後、得られた一つのクローン由来のＡｇ６３２Ｂ挿入体を分離した。［ベクターｐＢＴＡ３９５を、オリゴヌクレオチドをｐＵｃ１３の複数クローニング部位の５ａｌＩおよびＢａｍＨ１部位間に部位−ニングすることによって特別に組み立て、以下に示す部位群を得た：５ａｌＩ　Ｂｇｌｌｌ　ＸｈｏＩ　ＢａｍＨＩＡＧＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣにの領域の外側のＤＮＡ配列は、ｐＵｃ１３の配列と同一である。Ｊ得られた組換えプラスミドをｐＢＴＡ５５７と命名した。次いで、５ａｌＩおよびＢａｍＨＩを使用してＡｇ６３２Ｂ挿入体をｐＢＴＡ３５７から切除し、ベクターｐＬＶ８５の５ａｌＩおよびＢａｍＨＩの部位間に挿入してプラスミドｐＢＴＡ５３７を得た。ベクターｐＬＶ８５は、下記の複数のクローニング部位を有していることを除いてはベクターｐＰＬｃ２４５　［レマウト（Ｒｅｍａｕｔ、Ｅ、）らの１９８３年の核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅａｅａｒｃｈ）１４：４６７７−４６８８］　と同一である：いて切除し、ｐＢＴＡ２６０のＢｇｌＩ［部位にライゲートしてｐＢＴＡ５３５を得た。

次いで、第６．７および８図に於ける説明のように、組換えプラスミドＩ）ＢＴＡ５５７、ｐＢＴＡ５３７およびｐＢＴＡ５３５を、適当な大腸菌および酵母菌株に形質転換し、Ａｇ６３２Ｂの発現の程度をマテリアルズ・アンド・メソッズに記載のように検定した。

これらの図に示しているように、ＲＥＳＡ−特異的物質は、各々検出することができた（第６図レーンＤ１第７図レーンＣ，Ｅ、Ｇ。

■、ＫＳＭおよび０、第８Ａ図レーン４、第８Ｂ図レーン４）。

実施例８　酵母ホスホグリセレートキナーゼへの融合体としてのＡｇ６３２Ｂの発現。

酵母のＰＧＫ遺伝子へのＡｇ６３２Ｂの融合体を以下のように組み立てた。

Ａｇ６３２Ｂを、Ｂｇｌｎを用いてｐＢＴＡ５５７がら切除し、ベクターｐＭＡ２７に含有されたＰＧＫ構造遺伝子の３′末端の近くに見いだされるＢｇ１１１部位にライゲニトすることによりプラスミドｐＢＴＡ３８０を得た。大腸菌に於ける構築物の特性を調べた後、菌株ＡＨ２２の酵母細胞をこのプラスミドで形質転換し、ＲＥＳＡ特異的物質の発現の程度を検定した。第６図レーン８に示しているように、ＲＥＳＡ物質の発現は検出される。

実施例９　近似天然型であり、頭部から尾部までのマルチマー（重合体）系列としての天然５′反復領域の発現。

ＲＥＳＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｆＩおよびＡｌｕＩで消化した後、ＲＥＳＡの５゛反復領域をＤＮＡフラグメントとして分離した。Ｈ４ｎｆｌ酵素により生成した、５′末端に於ける張り出している３つの塩基を、クレノー酵素を用いたｄＡおよびｄＴによる「充填」によって二重鎖に変換した（第１７図参照）。

この分子（ＸｈｏＩリンカ−の添加後）を、プラスミドｐＵｃ１３のポリリンカー内に下記の制限酵素部位を含有させて特別に組み立てた大腸菌プラスミド（ｐＢＴＡ３９５）のＸｈｏＩ部位にクロＲＥＳＡのＨｉｎｆＩ−Ａｌｕ１７ラグメントのＸｈｏＩ部位への挿入時に、ＢｇｌｌＩおよびＢａｍＨＩ部位に於けるＡＴＣのフレームが同一になるように、上記の複数クローニング部位も組み立てた（ｐＢＴＡ３９５のこの領域の配列に関しては実施例７を参照）。

次いで、得られた組換えプラスミドｐＢＴＡ５５９を酵素Ｂｇｌ■およびＢａｍＨＩを用いて消化し、挿入体を分離した。次いで、ウィルソン（Ｗｉｌｌｓｏｎ）らに開示された方法（，１９８５）にしたがって、この分子を、ＢｇｌｎおよびＢａｍＨＩの存在下に自己ライゲートさせ、全てが実質的に頭部から尾部の直列反復部のように配列したオリゴマー系列を得た。これらの分子を大きさくサイズ）に基づいて分別し、ベクターｐＢＴＡ３９５のＢｇｌｌ［部位にライゲートした。次いで、組換え分子を大腸菌に形質転換し、オリゴヌクレオチド・プローブを用いてスクリーニングした。マルチマーのフレーム内系列を含有したクローンを同定した。これらの配列の中から以下の分子を選別し、更に調査を行った：モノマー（単量体）（即ちｐＢＴＡ５５９、第１８図）、ダイマー（二量体）、トリマー（二量体）およびヘキサマー（六量体）。

次いで、これらのマルチマー挿入体の幾つかを、以下のようにベクターｐＬＶ８５にクローンした。プラスミドを含有するマルチマーのｐＢＴＡ３９５系列を５ａｉ１およびＢａｍＨＩを用いて消化し、得られた挿入体を、５ａｌＩおよびＢａｍＨＩであらかじめ切断しておいたｐＬＶ８５にライゲートした。このことは、ＰＬプロモーターの制御下にあるＲＥＳＡ反復領域を有するプラスミド系列を生じさせるばかりでなく、挿入体のすぐ下流に位置するＴＡＡ終止コドンを提供するものである。

適当な大腸菌菌株を形質転換し、各々のマルチマ一種の発現性を、マテリアルズ・アンド・メソッズに記載のように免疫プロット法によって検定した。第１０図に示した上記のモノマーに関する成績により、ＲＥＳＡ特異的物質の検出結果が示されている。

実施例１０　単位配列がＲＥＳＡの１１アミノ酸反復配列に対応している合成りＮＡ分子のマルチマー系列の発現。

配列がＲＥＳＡの５′領域の１１アミノ酸反復部に対応している合成りＮＡ分子を合成した。幾つかの場合には、コドンに於ける第３塩基を変更して、酵母および大腸菌で高度に発現されるタンパク質をコードする最も頻繁に使用されているコドンの配列と同じにした。この分子を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）Ｄ　Ｎ　Ａ合成機の固相系上の２つの相補的な３３塩基オリゴヌクレオチドとして合成した。このオリゴヌクレオチドの配列は以下である：Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ａｌａ５’　−ＣＡＴ　ＧＡＣＧＡＡ　ＣＡＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ−３’３’　−ＣＴＴ　ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＴＧＡ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ−５’アニーリングを行い二重鎖分子を得た後、ＤＮＡ試料をリガーゼと共に混合し、長いマルチマー分子の集まりとした。次いで、下記のアダプター分子を加え、これらが、ＢｇｌＩ［およびＢａｍＨＩで消化しｔ：、ｐＢＴＡ３９５にクローンできるようにした：ａ）５′末端のアダプター５’−ＧＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＣＴ−３’３’−ＡＴＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧ−５’５’−ＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧ−３’３’−ＣＴＡＴＡＧＡＣＣＴＡＧ−５’ＤＮＡ配列決定を行い、塩基３３ｍｅｒ配列の頭部から尾部単位６個を含有していることを確認した一つの組換え分子を分離し、これをｐＢＴＡ　と命名した。次いで、このプラスミドをＢｇｌＮおよびＢａｍＨＩで消化し、挿入体を分離した。次いで、この分子を、ＢｇｌｎおよびＢａｍＨＩの存在下、ウィルソンらの方法によって自己ライゲートさせ、全てが実質的に頭部から尾部の直列反復部として配列したオリゴマー系列を得た。実施例９に記載の方法により、フレーム内頭部−尾部マルチマーの系列を同定した。これらの配列の中から以下の分子を選別し、更に調査を行ったニトリマー、ペンタマー（五量体）、およびヘプタマー（七量体）。

次いで、実施例９に記載の方法と同じ方法によって、これらのマルチマー挿入体の幾つかをベクターｐＬＶ８５にクローンした。

適当な大腸菌菌株を形質転換し、各々のマルチマ一種の発現性を、マテリアルズ・アンド・メソッズに記載のように免疫プロット法によって検定しｔ；。第１１図に示したように、殆どの菌株に於いて、ＲＥＳＡ特異的物質が検出された。

実施例１１　単位配列がＲＥＳＡの８アミノ酸反復配列に対応している合成りＮＡ分子のマルチマー系列の発現。

配列がＲＥＳＡの３′領域由来の反復単位の一つの配列に対応している合成りＮＡ分子を合成した。幾つかの場合には、コドンに於ける第３塩基を変更して、酵母および大腸菌で高度に発現されるタンパク質をコードする最も頻繁に使用されているコドンの配列と同じにした。この分子を、８個のアミノ酸反復部をコードしている２つの直列反復部からなる２つの相補的な４８塩基のオリゴヌクレオチドとして合成した。このオリゴヌクレオチドの配列、並びにこれらによってコードされているアミノ酸は以下である：Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ５’　−ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＣＧＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＣ３’　−ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＧＧＡＣＧＣＴ−３’ ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　−５’アプライド・バイオシステムダＤＮＡ合成機によって合成した。

アニーリングを行い二重鎖単位を得た後、ＤＮＡ試料をリガーゼと共に混合し、長いマルチマー分子の集まりとした。

次いで、下記のアダプター分子を加え、これらが、ＢｇｌｎおよびＢａｍＨＩで消化したｐＢＴＡ３９５にクローンできるようにした：ａ）５′末端のアダプター５’−ＧＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＣＴ−３’３’−ＡＴＧＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴ−５’ｂ）３′末端のアダプター５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧ−３’３’−ＣＴＡＴＡＧＡＣＣＴＡＧ− ５’ＤＮＡ配列決定を行い、塩基４８ｍａｒ配列の頭部から尾部単位３個を含有していることを確認した一つの組換え分子を分離し、これをｐＢＴＡ５５１と命名した。実施例１Ｏに記載のように、まず始めに、この分子の挿入を行い、出発分子の頭部から尾部の直列反復部として全て配列したオリゴマー系列を組み立て、特徴付けを行った。

これらの配列の中から以下の分子を選別し、更に調査を行った：ペンタマーおよびデカマー（士量体）。

適当な大腸菌菌株を形質転換した。発現は、通常の方法によって測定することができる。

実施例１２　あるメチオニン残基がインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）突然変異誘発法によって他のアミノ酸に突然変異されたＡｇ６３２の変異体の組み立ておよび発現。

比較的安定なＡｇ６３２　（５’反復部および両側の配列を有するβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質）の臭化シアン開裂によってＲＥＳＡのタンパク質フラグメントを産生するための戦略を以下に概略説明する。天然Ａｇ６３２を開裂することにより、５′反復部を有する〜１ｌＯａａフラグメント、Ａｇ６３２に存在する〜３３０ａａよりも実質的に小さいタンパク質が得られるので、本発明者らは、部位を目的にしたインビトロ突然変異誘発法によって、選別したＭｅｔ残基を除去することに決めた。これは、本質的に、クローンＡｇ６３２由米の５ａｃ−ＥｃｏＲＩ７ラグメントを含有する一重鎖Ｍ１３鋳型（ｍｐ１９）に基づくシラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）の方法によって行った。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、以下である：５’−ＣＡＧ　ＴＡＡ　ＴＴＴ　ＣＧＴ　ＴＧＡ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＣＡ−３′ 最初の標的は、５′反復部の下流に位置するＭｅｔコドン（第１４図に於いて塩基２６０９−２６１１）である。このコドンをＡＴＣ（Ｉｌｅをコードしている）に変換し、ＥｃｏＲｖ部位を作成した。得られた突然変異体は、Ａｇ６３２とサイズまたは免疫反応性の点で区別できない量的に豊富で安定な融合タンパク質を産生ずる。同様の戦略が、Ａｇ６３２の他のＭｅｔ残基を除去する上で適用することができる。

実施例１３　β−ガラクトシダーゼに融合され、ＣＮＢｒで開裂された比較的大きな分子部分として発現されるＲＥＳＡのフラグメントの分離。

この研究は、β−ガラクトシダーゼ−Ａｇ６３２融合ポリペプチドを分離し、ＣＮＢｒで開裂させた後、５′反復領域を含有するＲＥＳＡの７ラグメントを分離することによると説明される。

１、細胞の増殖プラスミドｐＢＴＡ３７９を有する大腸菌菌株ＪＭ１０９（実施例４参照）を、アンピシリン０．２５ｍｇ７ｍＱ含有するＴＢＳ培地４Ｑにて、６時間（Ａｓｓｓが１．６になる時間である）増殖させる。次いで、この培養液に１００＋ｎＭ　Ｉ　ＰＴＧ　Ｉ　０ｒａＱを加え、β−ガラクトシダーゼ−Ａｇ６３２（β− ｇａｌ−Ａｇ）融合生産物の合成を誘発させる。この培養液を振盪器にて３７° Ｃで一晩インキユベートした後、４°Ｃに於ける１７．７００ｇの遠心分離３０分によって細胞を回収した。得られた細胞ペレットを０．９５％生理食塩水に再懸濁し、上記と同様な遠心分離によって細胞を回収した。

２．細胞溶解およびβ−ｇａｌ　Ａｇ６３２融合生産物の回収洗浄した細胞ベレットを０．９５％生理食塩水に再懸濁し、１９゜０００ｐｓｉでマーチン−ガラリン・プレス（Ｍａｒｔｉｎ−Ｇａｕｌｉｎ　Ｐｒｅｓｓ）に３回通し、細胞の溶解を行った。溶解された細胞の懸濁液を１７゜７００９の遠心分離（４°Ｃ）に３０分かけ、上清を捨て、得られたペレットを、１＋＋ＭＥＤＴＡ、１＋ＭＰＭＳＦおよび５％トリトンＸ１００を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）２００ｍＱに再懸濁した。この溶液を更に１７．７００ｇ３０分の遠心分離（４０Ｃ）にかけた。この遠心分離液のベレットにのみ含有されているβ− ｇａ　１−Ａｇ６３２融合生産物を、８Ｍ尿素および０．１ＭＤＴＴを含有する０、１Ｍ）リス−〇〇　（ｐ　Ｈ８，０）　５０ｒａａを加えて３７℃で２時間インキュベートした後に溶解した。得られた溶液を２５．７００９の３０分間遠心分離（４°Ｃ）にかけて清浄化し、上溝を回収した。

３、セフ７クリル（Ｓｅｐｈｃｒｙｌ）Ｓ　−３００クロマトグラフイー上記の清浄化上溝４０ＩＩＩＱに、氷酢酸２．ＯｍＱを加え、ｐＨを約４以下にした。

次いで、この溶液を、ｌａＭＤＴＴおよび８Ｍ尿素を含有するＯ、１Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（３，４ｃｒＡｘ　８０ｃｒｎ；　Ｖ　ｔ　−７２６ｍｆｆ）にかけ、これと同じ緩衝液で溶出した。流速？　、　Ｏｒｎ（１部分で分画５．０ＩＩ１１２ずつを採集した。５ＤＳ−ＰＡＧＥで検定し、カラムのボイドボリューム（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）で溶出されたβ−ｇａｌＡｇ６３２融合生産物を、水で透析し、凍結乾燥にかけた。

４、β−ｇａｌＡｇ６３２融合生産物の臭化シアン消化上記の凍結乾燥した物質を７０％蟻酸８ｍＱに溶解し、これに臭化シアン６６０ｍｇを加えた。この反応を、環境温度の暗所にて２４時間行った後、得られた溶液を水１０容量で希釈して凍結乾燥した。

５、ＤＥＡＥ−セファクリル・クロマトグラフィー上記の凍結乾燥した開裂生産物（４１，４ｍｇ）を、８Ｍ尿素、ｌａＭＤＴＴおよび１ｍＭＥＤＴＡを含有する５０１＋１Ｍトリス−ＣＩ２（ｐＨ７，５）２領ｉに溶解し、これと同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セフ７クリルカラム（４，４ｃｍｘ　１２　、ＯｃｍＨＶ　ｔ　−１８２ｍＱ）にかけた。次いで、ペプチドを、出発緩衝液中、塩化ナトリウム０から４００ｍＭの直線傾斜溶離溶媒で溶出した。傾斜溶離を完全に行うために、カラムを１Ｍ塩化ナトリウムを含有する出発緩衝液で溶出させた（第１２図）。流速３　ｍＱ１分で分画５ｍＱずつを採集した。

得られた分画を、ウェスターン・プロット分析によって分析し、主要な免疫的交叉反応帯が１Ｍ塩化ナトリウム洗液で溶出されていることが判明した（第１３図）。このことは、５部反復領域を含有する臭化シアンペプチドの既知のアミノ酸組成と一致するものである。

実施例１４　あらかじめ本ＲＥＳＡ物質でワクチン接種したサルを、毒性を有するプラスモジウム・ファルシパルム単離体で抗原投与した時に於ける、ＲＥＳＡの各種の・フラグメントの保護能力の試験。

ＲＥＳＡ分子の各種の領域を試験するためのワクチン試行（トライアル）を、米国、アトランタ州疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）のマラリア部署の役員と協力して実施した。２゜匹のサルを全てこのトライアルに使用した：３つの試験群（５匹すル／群）には、第１４図に示した４つのｃＤＮＡにより生産した融合ポリペプチドを投与し、対照群は、無関係の融合ポリペプチドで免疫した（第１表参照）。

動物を０回目に、フロイントの完全アジュバントと共に各種の抗原２５０μｇを用いて免疫した。６週間後に、この動物に、７０インドの完全アジュバント１０部に１部のフロイントの不完全アジュバントを含有した上記と同量の抗原を用いて２回目の免疫を行った。この増強免疫を行って２週間後に、動物に、Ｐ、ファルシパルム単離体インドシナ１で感染されたオータス（Ａｏｔｕｓ）赤血球０．５ｘｌＯ’の抗原投与を行った。感染の進行具合を、ギムザ染色した血液の塗抹標本を顕微鏡で観察することにより毎日モニターした。１０％若しくはそれ以上の赤血球細胞が感染された動物は素早くこのトライアルから除外し、メフロキン（ｍｅｆ　１ｏｑｕｉｎｅ）で処置した。免疫によって得られる有効性の第一の基準は、対照群での結果と比較した実験群の最大平均寄生虫血症とした。残念ながら、対照群（第４群）のサル２匹および第２、群のサル１匹は、免疫の有意な有効性を示したにもかかわらず、Ｐ。

ファルシパルムの抗原投与を行う前に死亡してしまった（第２表）。

第２表本　化学療法を要した動物群。

＃　寄生虫血症ｌＯ％に達する前にマラリアにより死亡した動物。

免疫に対する血清学的応答および抗原投与感染。

ＲＥＳＡポリペプチドの異なる部分に対する抗体応答に関してサルを調査したところ、上記の勇気づけられる結果の有意性が顕著に強調された。血清抗体を、ＲＥＳＡの３つの異なるエピトープに対応している合成ペプチドを使用するＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定し、固相ＥＬＩＳＡｓの標的抗原として牛血清アルブミンにコンジュゲートした。２つのペプチドＥＥＮＶＥＨＤＡおよび（ＥＥＮＶ）４が、ＲＥＳＡの３′反復構造内に見いだされる２つの主要な反復配列に対応していＩ；。他のペプチド、ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡは、ＲＥＳＡ（７）５’反復構造に見いだされる反復配列に対応している。この配列は１回反復しているが、他の反復部は欠失および／または保存的置換によってこの配列から得これらの抗体判定の成績を第２０−２２図に示す。ＦＰ　Ａｇ２８で免疫した５匹のサルは、抵抗性を形成したか否か（１０％寄生虫血症に達しないで回復）、あるいは依然として感受性である（マラリアにより死亡若しくはｌＯ％寄生虫血症に達してメフロキンを投与）にかかわらず全て、（ＥＥＮＶ）、ペプチドに対する抗体を高濃度に有していた。（ＥＥＮＶ）４に対する抗体は、最初の免疫の後には急速に濃度が上昇し、このトライアルの間中、高濃度を維持していた。これらのサルから採取した°血液を他の３′反復ペプチド（ＥＥＮｖビＨＤＡ）に関して検定を行うと、ＦＰ　Ａｇ２８による免疫により抵抗性を付与した２匹の動物では高濃度の抗体を有していたが、感受性を有する３匹の動物では、抗体は検出されないか、または非常に低濃度であった。抗原投与の結果として明らかな感染症が発病した前または後のいずれであっても、５′反復ペプチドに対する抗体はこれらのサルの血清中には検出されなかった。

第２群の、ＦＰ　Ａｇ６３２による免疫によって抵抗性を付与した４匹のサルに関しては、最初の免疫によって誘起された５′反復ペプチド（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）２に対する抗体の急速な上昇が認められた。第２群のサルには、Ａｇ６３２による免疫によって３′反復ペプチドのいずれに対する抗体も検出可能な濃度で出現しなかったが、その寄生虫血症の兆候は、（ＥＥＮＶ）、に対する抗体の産生に関連するものであった。第２群の動物に於ける（Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｖ）、に対する抗体濃度は対照群（第４群）動物の抗体濃度よりも高かったので、５′反復融合ポリペプチド（ＦＰ　Ａｇ６３２）による免疫により、増強されｆニーＣＥ　Ｅ　Ｎ　Ｖ）、に対する抗体の応答性に対して、動物は明らかに感作されていた。

第」群のように第３群には、合成ペプチドに対する抗体応答性に係る相違によって区別され得る感受性および抵抗性動物が存在した。３匹の抵抗性サルは、ＦＰ　Ａｇ６３１およびＦＰ　Ａｇ６３３の混合体による免疫によって誘起された５ ′反復ペプチドに対して高度な応答性を示し、一方２匹の感受性サル（１匹は１０％寄生虫血症の治療レベルに達する前に死亡）は、このペプチドに対して非常に低い抗体レベルであった。５匹の動物はいずれも、ＦＰ　Ａｇ６３１およびＦＰＡｇ６３３による免疫によって誘導される３′反復ペプチドのどちらに対しても抗体を有していなかったが、第２群に於ける成績に対応するように、これらの動物に抗原投与を行い、感染症を発病させた場合には動物は（Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｖ）、に対する増強された応答性に対して感作されていた。

抗原投与されて生き残った３匹の対照群動物では、抗厚投与前は３つのペプチドのいずれに対しても抗体は検出されなかったが、３つの動物のうち２匹には、２匹の動物に１０％寄生虫血症を急速に引き起し、治療を必要とさせ、他の動物は死に至らしめた約６％寄生虫血症を引き起こした感染によって誘導された（Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｖ）、に対する抗体が低濃度で認められた。

上述の血清学的検定により、ＲＥＳＡの短い反復配列は宿主保護抗体の標的物であるエピトープをコードしていることが分かった。従って、Ｐ、ファルシパルムの血液段階に対して免疫するには、これらの配列（またはこれらのマルチマー）に対応した合成ペプチドを適当な担体と共に投与すれば十分であろう。

実施例１５　合成ペプチドの免疫原性。

（ａ）マウスに於ける免疫原性ＲＥＳＡ反復配列に対応した合成ペプチドの免疫原性を、マウスをキーホー゛ルリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）　（ＫＬＨ）とコンジュゲートしたペプチドで免疫することによって説明する。これらの実験では、オータス・ワクチントライアルの血清学的検定に使用したものと同じ２つのＲＥＳＡ３’反復ペプチド、即ち（ＥＥＮＶ）４およびＥＥＮＶＥＨＤＡを使用した。これらの免疫原性試験復１１アミノ酸配列のＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡＹ？’あり、そのｃ−末端にはチロシンが付加されている（オータス血清学に使用した合成ペプチドは、この１１アミノ酸配列の２つの複写物（ｅｄｉｔｉｏｎｓ）に対応している２２−ｍａｒ）。

これらのペプチドにより免疫したマウスから得た血清を、ＢｓＡとコンジュゲートした各ペプチド、ＲＥＳＡの３′および５′反復部に対応した融合ポリペプチド、更に感染性赤血球の音波処理物に対してのマイクロＥＬ　Ｉ　ＳＡによって検定した。これらのペプチドにより免疫されたマウスは全て、ホモローガスなペプチドと反応する抗体、並びにその配列を含有する融合ポリペプチドを産生じた（第２３図）。更に、ペプチド（ＥＥＮＶ）４は、それと共存して５−アミノ酸配列を有している他の３′反復ペプチドＥＥＮＶＥＨＤＡとも反応する抗体を誘導した。しかし、この逆は成り立たず、ＥＥＮＶＥＨＤＡで誘起された抗体は（Ｅ　Ｅ　Ｎ　ｖ）ｉと反応しなかった。

これらの抗ペプチド抗血清をペプチド−ＢＳＡコンジュゲート体に関して検定すると、ＲＥＳＡの５′および３′反復部間に明らかな交叉反応性は認められなかった。しかし、同じ抗血清を融合ポリペプチドに関して検定すると、ヘテロローガスな反復部との反応性はホモローガスな反復部との反応性に比べ非常に弱いが、このペプチドはその両方の反復構造部と反応する抗体を誘導することが判明した。

これらの抗ペプチド抗血清をＰ、７アルシパルムに感染された赤血球の音波処理物に関して検定すると（第２４図）　、（ＥｅＮｖ）４により免疫されたマウスから最も強力なシグナルが認められ、希釈度１；よりも突出したシグナルを良好に与えた。ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡＹで免疫した３匹のマウスのうちの２匹とは封蝋的に、ＥＥＮＶＥＨＤＡで免疫した４匹のマウスのうちで１匹がバックグラウンドよりも突出しｊ；シグナルを与えた。これらは比較的低いシグナルであるが、これら合成ペプチドが各々、免疫性ペプチドのみならずこれらの配列を含有する寄生虫抗原とも反応する抗体応答性を誘導できることは明らかである。

この実験に使用したペプチドは以下のものである：　（ＥＥＮＶ）、、ＲＥＳＡ３’−反復４−ｍａｒの８個の反復部に対応した３２−ｍｅｒ；（ＥＥＮＶＥＨＤＡ）４．ＲＥＳＡ３’−反復ｇ−ｍａｒの４個の反復部に対応した３２−ｍｅｒ；および（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）、、ＲＥＳＡ５″−反復１　ｌ　−ｍｅｒの３個の反復部に対応した３　３−＋ｎｅｒ。

グルタルアルデヒドを用いてジフテリア毒素にコンジュゲートしたペプチドを使用し、３つの異なるアジュバント：７０インドの完全アジュバント（ＦＣＡ）、ノルＭＤＰ／スクアレンーアルラセル（Ｓｑｕａｌｅｎｅ−Ａｒｌａｃｅｌ）（ＭＤＰ）　［チパ・ガイギー（Ｃｉｂａ（；ｅｉｇｙ）から入手］およびミョウバン（Ａｌｎｍ）を用いて家兎を免疫した。各実験群に３匹の家兎を供し、各々を免疫するために投与したコンジュゲート体は、担体タンパク質２５０μｇと同量であった。動物を筋肉注射により免疫し、最初の免疫から３週間経て、同量のアジュバントおよび同じ投与経路によって２回目の増強免疫を行った。

免疫に対する抗体応答性を、標的抗原として牛血清アルブミンにコンジュゲートした同じＲＥＳＡペプチドを使用して固相ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって検定した。第３表の成績は、家兎血清のｉ　：　１ｏｏｏ希釈度を使用して得られた光学濃度を示したものであり、これにより、アジュバントとしてＦＣＡおよびＭＤＰを使用すれば高度な抗体応答性が得られ、アジュバントとしてミョウバンを使用してもこれが得られないことが分かる。

第３表　家兎に於ける、ジフテリア毒とコンジュゲートしたＲＥＳＡ合成ペプチドに対する抗体応答性これらの値は、マイクロＥＬ　Ｉ　ＳＡによって家兎血清の希釈度ｌ：１０００で分析した４１４ｎｍに於ける光学濃度の値である。各個は３匹の家兎に於ける平均値である。

産業的出願本発明に従えば、マラリアに対する保護免疫性を提供することによって、哺乳動物のマラリア、特にフフルシパルム・マラリア寄生虫する上で有効なワクチンを得ることができる。

本発明は、マラリア抗原、マラリア寄生虫または抗マラリア抗体を検出するために有用な試薬を調製するために利用することができる。

参考文献１、アサ−トン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　Ｅ−、）ら、（１９８３）、ジャーナル・オブ、ケミカル・ソサイアティー（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、パーキン（Ｐｅｒｋｉｎ）訳、１．１　：　６５−７３゜２、コーマン（Ｃｏｗｍａｎ、Ａ、Ｆ、）ら、（１９８４）、モレキュラー・バイオ口３、ケムプ（Ｋｅｍｐ、Ｄ、Ｊ、）ら、（１９８３）、プロシーディング・オブ・ナチョナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　Ａ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

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ｌｎ＋＋内む６＋１１　ａ口９堕６・６・　ＰＣＴ／Ａυ８７１０００７１ＡＮＮＥＸ　ＴＯＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．プラスモジウム・フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原をコードしている領域から得られたポリヌクレオチド配列、このポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、第１に挙げた配列若しくはハイブリダイズ配列と関連しているポリヌクレオチド配列、またはプラスモジウム・アァルシバルムのＲＥＳＡ抗原由来のポリペプチド着しくはこのポリペプチドと同様の生物学的若しくは免疫学的活性を示すポリペプチドを発現時にコードしているポリヌクレオチド配列。２．プラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原の５′および／または３′ 反復領域から得られたポリヌクレオチド配列、このポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、第１に挙げた配列若しくはハイプリダイズ配列と関連しているポリヌクレオチド配列、またはプラスモジウム・フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原の５′および／または３′反復領域から得られるポリペプチド若しくはこのポリペプチドと同様の生物学的若しくは免疫学的活性を示すポリペプチドを発現時にコードしているポリヌクレオチド配列。３．第１項または第２項に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチド配列の一部、類似体、同族体、誘導体若しくは組み合わせ物、またはその全て若しくは一部、類似体、相同体、誘導体若しくは組み合わせ物のマルチマーであるポリヌクレオチド配列。４．プラスモジウム・フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原をコードしている領域から得られるヌクレオチド配列、またはプラスモジウム・フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原の領域と同様の生物学的若しくは免疫学的活性を示すポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列とハイプリダイズする配列、およびラベルからなる第１項から第３項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を同定するために有用なプローブ。５．第１項から第３項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ挿入体およびベクターＤＮＡで特徴づけられる組換えＤＮＡ分子。６．ベクターＤＮＡがプラスミド、ウイルスまたはバクテリォフアージＤＮＡからなる第５項に記載の組換えＤＮＡ分子。７．発現コントロール配列が機能的に連結している第５項または第６項に記載の組換えＤＮＡ分子。８．第５項から第７項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換された形質転換宿主。９．宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌および高等真核細胞の中から選ばれる第８項に記載の形質転換宿主。１０．第８項または第９項に記載の形質転換宿主の発現生産物。１１．実質的に純粋な第１０項に記載の発現生産物。１２．ブラスモジウム・ファルシパルムのＲＥＳＡ抗原のフラグメントのモノマー若しくはマルチマー、またはそのフラグメントの一部、類似体、同族体、誘導体若しくは組み合わせ物を含有しているポリペプチド、またはこのポリペプチドと同様の生物学的若しくは免疫学的性質を有するポリペプチド。１３．該フラグメントがプラスモジウム・フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原の５′ および／または３′反復単位（群）を含有している第１２項に記載のポリペプチド。１４．第１２項または第１３項に記載のポリペプチドを少なくともひとつ含有しており、薬学的に許容できる担体および／若しくはアジュバントをも含有していることもある、哺乳動物に於ける免疫応答を刺激する組成物。１５．哺乳動物に第１４項に記載の組成物の有効量を投与することからなる哺乳動物に免疫を与える方法。１６．第１２項または第１３項に記載のポリペプチドを少なくともひとつ含有する試薬を調製し、この試薬を、抗マラリア抗体を検出するために使用することからなる抗マラリア抗体の検出方法。１７．第１２項または第１３項に記載のポリペプチドに対して誘起された抗体。１８．第１７項に記載の抗体を含有する試薬を調製し、この試薬を、マラリア抗原を検出するために使用することからなるマラリア抗原の検出方法。１９．（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）ｎ（ＥＥＮＶＥＨＤＡ）ｎおよび（ＥＥＮＶ）ｎ（ここに、ｎは正の整数である）からなる群から選ばれる少なくともひとつの配列またはこの配列から欠損および／若しくは保存的置換によって得られる関連配列で示されるか若しくはこの配列を含有する担体分子と結合していることもある合成ペプチドを、薬学的に許容できる希釈剤および／またはアジュバントと共に含有している、血液段階のプラスモジウム・ファルシパルム抗原に対する免疫を哺乳動物に付与するための組成物。２．該合成ペプチドが、（ＤＤＥＨＶＥＥＰＴＶＡ）ｎおよび（ＥＥＮＶＥＨＤＡ）ｎ［ここに、ｎは正の整数である］から選ばれる少なくともひとつの配列で示されるペプチドであるか若しくはその配列を含有する合成ペプチドである第１９項に記載の組成物。