JP5566684B2 - Clostridiumdifficileに対する、組換え毒素A/毒素Bワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、医学免疫学の分野に関し、そしてさらに薬学的組成物、ワクチンの作製方法およびワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、Clostridium difficileの毒素Aおよび毒素Bをコードする遺伝子由来の組換えタンパク質、ならびにC.difficileに対する活性なワクチンにおけるそれらの使用に関する。
Clostridium difficileは、グラム陽性の嫌気性芽胞形成桿菌であり、抗生物質関連下痢(AAD)および大腸炎(AAC)の病因因子である。この疾患の症状は、軽度の下痢から、劇症でかつ生命を脅かす偽膜性腸炎(PMC)までの範囲である。抗生物質治療は、正常な腸の微生物叢を破壊し得る。正常な微生物叢の破壊は、C.difficileの芽胞が発芽し得、そしてこの生物が増殖して疾患の原因毒素を産生するのを可能にする状態を生じる。C.difficileは抗生物質関連下痢のうちの約25%を引き起こすが、しかし、C.difficileはほぼ常に、PMCの原因因子である(Lyerly,D.M.およびT.D.Wilkins,Infections of the Gastrointestinal Tract,第58章,867−891頁(Raven Press,Ltd,New York 1995))。さらに、C.difficileは頻繁に、院内感染下痢、特に高齢の患者または免疫無防備状態の患者の院内感染下痢の原因因子として同定される(米国特許第4,863,852号(Wilkinsら)(1989))。
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。このタンパク質をコードする遺伝子は、C.difficileの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。さらに好ましい実施形態は、この毒素がC.difficileの毒素Aまたは毒素Bであることを提供する。本発明のより好ましい実施形態は、組換えタンパク質成分が、非中毒性であり、そしてC.difficileの毒素Aもしくは毒素Bの反復単位(rARUもしくはrBRU)またはそれらのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含む、両方の毒素の一部を含むことを提供する。免疫原性組成物は、炭水化物部分ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは哺乳動物における注射に適切な処方における他の組成物をさらに含み得る。
・本発明は、さらに以下を提供し得る:
・(項目1) 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、C.difficile毒素Aの少なくとも1回の繰り返し単位(rARU)、またはC.difficile毒素Bの少なくとも1回の繰り返し単位(rBRU)、または各毒素Aおよび毒素Bの少なくとも1回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物。
・(項目2) 上記組換えタンパク質成分が、一般的に互いに融合される、少なくとも2回の上記繰り返し単位を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目3) 上記組換えタンパク質成分が、化学的に互いに結合される、少なくとも2回の上記繰り返し単位を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目4) 上記組成物が、毒素Aまたは毒素Bあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目5) 哺乳動物の宿主において、C.difficile株に対する防御応答を誘発する、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目6) 毒素Aまたは毒素Bあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目2に記載の免疫原性組成物。
・(項目7) 哺乳動物の宿主において、C.difficile株に対する防御応答を誘発する、項目2に記載の免疫原性組成物。
・(項目8) 毒素Aまたは毒素Bあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目3に記載の免疫原性組成物。
・(項目9) 哺乳動物の宿主において、C.difficile株に対する防御応答を誘発する、項目3に記載の免疫原性組成物。
・(項目10) 薬学的に受容可能なキャリア中に、項目1〜9のいずれか1項に記載される免疫原性組成物を含む、薬学的組成物。
・(項目11) 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目1〜9のいずれか1項に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・(項目12) 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目10に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・(項目13) 上記タンパク質成分が、毒素Aまたはそのフラグメントである、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目14) 上記タンパク質成分が、上記毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目13に記載の免疫原性組成物。
・(項目15) 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目14に記載の免疫原性組成物。
・(項目16) 上記タンパク質成分が、毒素Bまたはそのフラグメントである、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目17) 上記タンパク質成分が、上記毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目16に記載の免疫原性組成物。
・(項目18) 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目17に記載の免疫原性組成物。
・(項目19) 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、T細胞依存性である免疫応答を誘発する、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目20) 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、T細胞非依存性である免疫応答を誘発する、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目21) 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、T細胞依存性およびT細胞非依存性の両方である免疫応答を誘発する、項目1に記載の免疫原性組成物。
・(項目22) 上記免疫応答が、細胞依存性免疫応答である、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目23) 上記免疫応答が、上記哺乳動物の宿主において、追加免疫効果を生じる、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目24) 上記免疫応答が、C.difficile株に対する防御応答を誘発する、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目25) 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答を誘発する、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目26) 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答または細胞依存性免疫応答の両方を誘発する、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目27) 上記免疫応答が、C.difficile株に対する防御応答を誘発する、項目19または20または21に記載の免疫原性組成物。
・(項目28) 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Clostridium difficile毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・(項目29) 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Clostridium difficile毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・(項目30) 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Clostridium difficile毒素A繰り返し単位(rARU)またはClostridium difficile毒素B繰り返し単位(rBRU)あるいはそれらのいずれかのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・(項目31) 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Clostridium difficile毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメント、およびClostridium difficile毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・(項目32) 項目28、29、30または31のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
・(項目33) 上記ワクチンが、ヒトでの使用のために処方される、項目32に記載のワクチン。
・(項目34) 上記ワクチンが、動物での使用のために処方される、項目32に記載のワクチン。
・(項目35) 免疫原性組成物を産生するための方法であって、当該方法は、
組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、当該遺伝子配列がClostridium difficile株から単離される、工程;
微生物宿主で、当該組換えタンパク質を発現する工程;
当該宿主の培養物から当該組換えタンパク質を回収する工程;および
当該組換えタンパク質成分を回収する工程であって、当該タンパク質成分は、Clostridium difficile毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメントであるか、またはClostridium difficile毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントである、工程、
を包含する、方法。
・(項目36) 上記遺伝子配列の発現が、当該配列の上流に作動可能に配置される誘導性プロモータおよび上記宿主の機能によって調節される、項目35に記載の方法。
・(項目37) 上記微生物宿主が、Escherichia coliである、項目36に記載の方法。
・(項目38) 上記組換えタンパク質が、約10mg/mlよりも高いレベルで発現される、項目37に記載の方法。
・(項目39) 上記組換えタンパク質が、上記培養の約50mg/lよりも高いレベルで発現される、項目37に記載の方法。
・(項目40) 上記組換えタンパク質が、上記培養の約100mg/lよりも高いレベルで発現される、項目37に記載の方法。
・(項目41) 上記タンパク質が、約50kDaよりも大きい、項目37に記載の方法。
・(項目42) 上記タンパク質が、約90kDaよりも大きい、項目37に記載の方法。
・(項目43) 上記タンパク質が、硫酸アンモニウム沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィーによって回収される、項目37に記載の方法。
・(項目44) 上記タンパク質が、スクシニル化される、項目37に記載の方法。
・(項目45) Clostridium difficile株由来のタンパク質成分をコードする少なくとも1つの遺伝子を含む、組換え遺伝子配列。
・(項目46) 上記遺伝子が、毒素Aまたはそのフラグメントをコードする、項目45に記載の組換え配列。
・(項目47) 上記遺伝子が、上記毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメントをコードする、項目46に記載の組換え配列。
・(項目48) 上記遺伝子が、上記毒素Bまたはそのフラグメントをコードする、項目45に記載の組換え配列。
・(項目49) 上記遺伝子が、上記毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントをコードする、項目48に記載の組換え配列。
・(項目50) 毒素Aまたはそのフラグメントをコードする第1遺伝子、および毒素Bまたはそのフラグメントをコードする第2遺伝子を含む、項目45に記載の組換え配列。
・(項目51) 上記毒素A繰り返し単位(rARU)またはそのフラグメントをコードする上記第1遺伝子、および上記毒素B繰り返し単位(rBRU)またはそのフラグメントをコードする上記第2遺伝子を含む、項目50に記載の組換え配列。
・(項目52) 項目45または項目50の遺伝子配列、および微生物宿主に選択的な表現型を与える遺伝子を含む、発現ベクター。
・(項目53) 上記選択的な表現型が、カナマイシンに対して耐性である、項目52に記載の発現ベクター。
・(項目54) 項目52または項目53の発現ベクターで形質転換された、微生物宿主。
・(項目55) 受動免疫治療のための、病原性微生物株に対する抗体の産生のための項目1〜9および13〜31のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の使用。
本発明は、免疫原性組成物に関する。この組成物は、少なくとも1つの組み換えタンパク質成分を含む。ここで、このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Clostridium difficileの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、そのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。なおさらなる好ましい実施形態は、その毒素が毒素Aであることを提供する。ここで、なおさらに好ましい実施形態は、毒素A反復単位(rARU)またはそのフラグメントのアミノ酸配列のすべてを含む毒素の一部分である。別の好ましい実施形態は、その毒素が毒素Bであることである。ここで、さらに別の好ましい実施形態は、反復単位(rBRU)またはそのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含むその毒素の一部分である。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物における注射のために適切な処方物において、薬学的に受容可能なキャリアまたは他の組成物を含み得る。
本発明のこれらの免疫原性組成物は、哺乳動物宿主において免疫応答を惹起する。この動物にはヒトおよび他の動物が含まれる。免疫応答は、細胞依存性応答または抗体依存性の応答のいずれかあるいはその両方であり得、そしてさらにその応答は、免疫記憶または追加免疫効果あるいはその両方を、その哺乳動物宿主において提供し得る。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、そしてClosteridium difficile株による感染からの哺乳動物被検体または宿主による保護的応答を提供し得る。
(実施例1:rARU発現ベクターの構築)
発現および精製のために使用したベクターをクローニングのための標準的な技術を用いて構築した(Sambrookら、Molecular Cloning:ALaboratorv Manual (1989))。rARUをコードする毒素A遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列は、クローニングされた毒素A遺伝子から得(Doveら、Infect.Immun.58.480−488 (1990);Phelpsら、Infect Immun.59:150−153 (1991))、そして図2に示す。この遺伝子フラグメントは、タンパク質867アミノ酸長をコードする(図3)。ここで、算出される分子量は98kDaである。この遺伝子フラグメントを発現ベクターpRSETBへとサブクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子を、次にこのベクターへとサブクローニングした。得られたベクターpRSETB−ARU−Kmrは、rARUを発現する。この組み換えタンパク質のN末端にはさらに31アミノ酸が発現ベクターpRSETBによって与えられる。その組み換えタンパク質の最後の算出分子量は102kDaである。
Escherichia coli T7 発現宿主株BL21(DE3)を、記載されるように、pRSETB−ARU−Kmrで形質転換した(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory
Manual (1989))。1Lの培養物を、pRSETB−ARU−Kmrを含む10mlのEscherichia coli BL21 (DE3)の一晩培養物に接種し、、そして25 μg/mlのカナマイシンを含むTerrificブロス (Sigma, St.Louis.,MO)中で1.8−2.0にまでO.D.600増殖させ、そしてイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度40μMにまで添加した。細胞を、誘導の22時間後採集し、0.2%のカザミノ酸を含む0.1Lの標準的なリン酸緩衝化生理食塩水pH7に懸濁化し、そして超音波処理により破壊した。細胞砕片を遠心分離により溶解物から除去した。溶解物は、代表的に、TOX−A試験EIAにおいて106の力価(0.2を超えるA450を有する最高希釈物の逆数)を含んだ(TechLab.Inc..Blacksburg, VA)。溶解物を、40%硫酸アンモニウムで飽和させ、4℃で一晩攪拌し、そして沈澱したタンパク質を遠心分離により採取した。この硫酸アンモニウム画分を0.1Lの5mM K2PO4、0−1M NaC12, pH 8.0中に懸濁し、そして4℃で同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。可溶性材料を遠心分離により除去した。透析した溶液をSepharose CL−6Bクロマトグラフィー媒体(50ml媒体/100ml溶液)を含むカラムに通した。画分を収集し、そしてrARUの存在について、TOX−A試験を用いてEIAによりモニターした。EIA活性を含む画分を、およそ102KDaの分子量でのrARUの存在についてSDS−PAGEにより、分析した。単一バンドのrARUを含む画分をプールした。純度をさらに確実とするために、プールされた溶液をSepharose CL−6B カラム (25 ml媒体/100 mlタンパク質溶液)に対して通過させた。精製されたrARUを含む溶液を22μフィルターを通過させることによりフィルター濾過し、そして4℃で保存した。精製されたrARUを、精製(溶解物および透析された硫酸アンモニウム画分)の工程からのサンプルとともに、図5に示す。その手順は、代表的に、1リットルのE.coli/pRSETB−ARU−Kmr培養物あたりおよそ100mg rARUを得る。併せて6リットルのバッチにより、合計で748mgのrARUについて0.88mg/mlでまたは125mg/リットルの培養物0.850リットルのrARUが得られた。回収されたrARUの量は可溶性タンパク質の合計の23%を示す。
発現および精製のために使用されたベクターpRSETC−BRU−Kmrを標準的なクローニング技術を用いて構築した(Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual (1989))。rBRUをコードする毒素B遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列はクローニングした毒素B遺伝子に由来し(Barroso et
al..Nucleic Acids Res 1 8:4004 (1990)) 、そして図6に示す。この遺伝子フラグメントは、622アミノ酸長のタンパク質をコードし、分子量は約70kDaである。カナマイシン耐性遺伝子を、次にそのベクター中にサブクローニングした。得られたベクターpRSETC−BRU−KmrはrBRUを発現する。
1リットルのEscherichia coli pRSETC−BRU−Kmrを37℃で25時間、振盪インキュベーターで増殖させた。細胞を、遠心分離し、そして0.2%カザミノ酸を含む0.1リットルのリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した。採取時の培養物の上性は、6.2のpHを有した。細胞を超音波処理により墓石、そして細胞砕片を遠心分離により除去した。10×溶解物を図9、レーン3に示す。
C.difficile毒素A(CDTA)に対する抗体。ネイティブ毒素Aに対する抗体を、C.difficileから単離された毒素Awoコーティング抗原として使用したELISA、および細胞傷害性のインビトロ中和によってにより測定した(Lverlv et al.Infect.Immun.35:1147−1150 (1982))。ヒト小腸上皮HT−29細胞(ATCC HTI3 38)を、5%CO2雰囲気下で10%の仔ウシ血清を補充したMcCov5A培地を有する96ウェルプレート中に維持した。HT−29細胞を選択した。なぜなら、それらは、その表面に高密度の糖レセプターにおそらく起因してCDTAに対して高感度であるからである。連続的に2倍の希釈の血清を、0.4μg/mlのCDTAとともに30分で室温でインキュベートした。CDTA血清混合物を、ウェルに、最終容量0.2ml中に、1ウェルあたり最終濃度20ng(HT−29細胞についての最小細胞傷害性用量の約200倍)の毒素Aで添加した。中和力価を、細胞傷害性を完全に中和した最高希釈の逆数として表す。
(実施例6:CDTA中和抗体)
その結合体の第三注射の後7日で得た個々の血清を、ヒト小腸上皮HT−29細胞に対するCDTAの細胞傷害性用量の約200倍のその中和について個々にアッセイした。その結合体で免疫したマウスからのすべての血清は、64以上の中和力価を有した。各結合体についての中和力価の幾何平均の範囲を表2に示す。
Hsd/ICRマウスに、SF−rARU、SF−rARUsuccまたはrARUを、上記実施例4に記載のように注射した。第三注射の後1週間で、そのマウスに、致死用量(150ng)のCDTAで腹腔内チャレンジした。結合体またはrARUのいずれかをワクチン接種したほぼすべてのマウスが保護された。注射されたrARUの量に基づいて、rARUおよびSF−rARUは、抗CDTAの類似のレベルを惹起した。浴されるように、SF−rARUsuccは、他の2つの免疫原よりもより低いレベルの抗CDTAを惹起したがレシピエントは比較的保護された。
Claims (2)
- 稀なコドンを変更することも、稀なtRNAを供給することもなく、ATリッチな遺伝子配列によってコードされる組換えタンパク質を産生する方法であって、
該方法は、
選択圧力の下でE.coli細菌を培養する工程であって、該細菌は、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列と、カナマイシン耐性をコードするヌクレオチド配列とを含む発現系を含む核酸を含むように改変されており、該両方のヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに作動可能に連結されている、工程;
を包含し、
それにより、該タンパク質は、少なくとも100mg/L培養物のレベルで産生され;
そして
該培養する工程は、指数増殖期が完了した後の20時間〜24時間の期間にわたり該プロモーターを誘導することによって行われ、
該タンパク質は、Clostridium difficileの毒素Aの反復単位(rARU)および/またはClostridium difficileの毒素Bの反復単位(rBRU)の組換えアミノ酸配列からなり、
該rARUは、図3に示されるアミノ酸配列(配列番号2)を有するポリペプチドまたはそのフラグメントであり、
該rBRUは、図7に示されるアミノ酸配列(配列番号4)を有するポリペプチドまたはそのフラグメントであり、
該Clostridiumアミノ酸配列は90kDaを超える分子量を有する、
方法。 - 前記タンパク質のClostridium配列が98kDaを超える分子量を有する、請求項1に記載の方法。
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