BR122016023101B1 - Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile - Google Patents

Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE O COMPREENDE, BEM COMO CÉLULA RECOMBINANTE DERIVADA DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE A presente invenção refere-se a polipeptídeos compreendendo sequência de aminoácidos revelada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 761, onde o poli-peptídeo que compreende pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido é modificado quimicamente por 1-etil-3-(3-dimetiaminopropil) carbodiimida) (EDC) ou N- Hi-droxisuccinimida (NHS), bem como a composição imunogênica compreendendo os referidos polipeptídeos e a célula recombinante ou progênie da mesma compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica os referidos polipeptídeos. A célula recombinante pode ser derivada de uma célula de Clostridium difficile, em particular, Clostridium difficile 1351, Clostridium difficile 3232, Clostridium difficile 7322, Clostridium difficile 5036, Clostridium difficile 4811, e Clostridium difficile VP I 11186. Os polipeptídeos e composições podem ser utilizados na cultura de C. difficile e na produção de toxinas C. difficile.

Description

[001] O presente pedido reivindica o benefício do U.S. Provisional Patent Applicarion 61/716,605, depositado em 21 de outubro de 2012, o qual está aqui incorporado para referência em sua totalidade. CAMPO
[002] A presente invenção é direcionada a composições e métodos relacionados às toxinas de Clostridium difficile mutantes.
ANTECEDENTES
[003] O Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria anaeróbica gram-positiva que é associada com as doenças gastrointestinais em humanos. A colonização do C. difficile usualmente ocorre no cólon se a flora intestinal natural é diminuída pelo tratamento com antibióticos. Uma infecção pode levar a uma diarreia associada aos antibióticos e algumas vezes a colite pseudomembranosa através da secreção das toxinas de glicosilação, toxina A e toxina B (308 e 270 kDa, respectivamente), que são fatores de virulência primária do C. difficile.
[004] A toxina A e a toxina B são codificadas dentro do local de patogenicidade 19 kb (PaLoc) pelso genes tcdA e tcdB, respectivamente, as cepas de C. difficile tem este local substituído por uma sequência de par base 115 alternativa.
[005] Ambas a toxina A e a toxina B são citotoxinas potentes. Estas proteínas são glucosiltransferases homólogas que inativam GTPases pequenos da família Rho/Rac/Ras. O rompimento resultante na sinalização causa uma perda das junções célula-célula, desregulação do citoesqueleto de actina, e/ou apoptose, resultando em uma diarreia secretória profunda que é associada com as infecções por Clostridium difficile (CDI).
[006] Na última década, os números e a gravidade dos surtos de C. difficile em hospitais, casas de repouso, e outras unidades de cuidados a longo prazo aumentaram dramaticamente. Os fatores chave nesta escalação incluem o aparecimento de cepas patogênicas hipervirulentas, uso elevado de antibióticos, métodos de detecção elevados, e exposição elevada a esporos nas unidades de saúde.
[007] O metronidazolo e a vancomicina representam o padrão atualmente aceito de cuidados para o tratamento com antibióticos para a doença associada ao C. difficile (CDAD). Entretanto, cerca de 20% dos pacientes recebendo tal tratamento vivenciam uma recorrência da infecção após um primeiro episódio de CDI, e até cerca de 50% destes pacientes sofrem de recorrências adicionais. O tratamento das recorrências representa um desafio muito significante, e a maioria das recorrências usualmente ocorrem dentro de um mês do episódio anterior.
[008] Portanto, há uma necessidade por métodos e composições terapêuticas e/ou imunogênicas do mesmo direcionadas ao C. difficile.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] Estes e outros objetos são proporcionados aqui pela invenção.
[010] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma toxina C. difficile mutante A. A toxina mutante A inclui uma mutação nas posições de resíduos 285, 287, 700, 972, e 978 quando comparado a uma toxina do tipo selvagem A. Em uma modalidade, a toxina mutante A inclui a SEQ ID NO: 183. Em uma modalidade, a toxina mutante A é menos citotóxica do que a toxina do tipo selvagem A correspondente. Em uma modalidade, a toxina mutante A inclui pelo menos um resíduo de aminoácido que é quimicamente modificado. Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado que inclui a SEQ ID NO: 183.
[011] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma toxina C. difficile mutante B. A toxina mutante B inclui uma mutação nas posições de resíduos 286, 288, 698, 970, e 976 quando comparado a uma toxina do tipo selvagem B. Em uma modalidade, a toxina mutante B inclui a SEQ ID NO: 184. Em uma modalidade, a toxina mutante B é menos citotóxica do que a toxina do tipo selvagem B correspondente. Em uma modalidade, a toxina mutante B inclui pelo menos um resíduo de aminoácido que é quimicamente modificado. Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado que inclui a SEQ ID NO: 184.
[012] A invenção ainda refere-se a composições e métodos para o uso na cultura de C. difficile e na produção de toxinas C. difficile. Em um aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura incluindo um vegetal hidrolisado e uma célula de C. difficile. Em uma modalidade preferida, o hidrolisado é um hidrolisado de soja. Mais preferencialmente, o hidrolisado de soja é um hidrolisado de soja SE50MK.
[013] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura incluindo uma fonte de nitrogênio e uma célula de C. difficile. Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio é um extrato de levedura. Preferencialmente, o extrato de levedura é um HY YEST 412 (Kerry Biosciences).
[014] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura incluindo um vegetal hidrolisado, um extrato de levedura, e uma célula de C. difficile. Em uma modalidade, o meio não contém uma fonte de carbono.
[015] Em uma modalidade preferida, o meio ainda inclui uma fonte de carbono. Os inventores descobriram que a fermentação do C. difficile em um meio de cultura inclui pelo menos uma fonte de carbono proporcionou valores altos de OD600 e altos rendimentos de produção de toxina, quando comparado a fermentação sem uma fonte de carbono. Em uma modalidade, a fonte de carbono é glicose, manitol, frutose e/ou manose.
[016] Em uma modalidade, a célula de C. difficile não é geneticamente modificada. Em outra modalidade, a célula de C. difficile é uma célula de C. difficile recombinante. Em uma modalidade, a célula de C. difficile carece de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina. Em outra modalidade, a célula inclui um promotor constitutivo. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor de ferredoxina de Clostridium sporogenes (fdx). Em uma outra modalidade, a célula não inclui um promotor cromossômico regulado nativo.
[017] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para culturar C. difficile. O método inclui culturar uma célula C. difficile em um meio. Em uma modalidade, o meio inclui hidrolisado de soja e/ou extrato de levedura. Em uma modalidade preferida, o meio ainda inclui uma fonte de carbono. Preferencialmente, a fonte de carbono é glicose.
[018] Em uma modalidade, a etapa de culturação é realizada sob condições anaeróbicas.
[019] Em uma modalidade, o C. difficile cresce como uma cultura de semente. Em uma modalidade, a cultura de semente é iniciada pela inoculação a partir da cultura armazenada que cresceu no meio.
[020] Em uma modalidade, o C. difficile cresce como uma cultura de fermentação. Em uma modalidade, a cultura de fermentação foi inoculada a partir de uma cultura de semente que cresceu no meio. Em um aspecto alternativo, a invenção refere-se aos métodos para culturar o C. difficile. O método inclui culturar uma célula C. difficile em um meio de anticorpo monoclonal.
[021] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir uma toxina C. difficile. O método inclui culturar uma célula C. difficile em um meio. O método ainda inclui isolar uma toxina C. difficile a partir de tal meio.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[022] A figura 1 A-H: alinhamento da sequência da toxina C. difficile do tipo selvagem A a partir das cepas 630, VPI10463, R20291, CD196, e uma toxina mutante A tendo uma SEQ ID NO: 4, usando um alinhamento CLUSTALW, parâmetros de padrão.
[023] A figura 2 A-F: alinhamento da sequência da toxina C. difficile do tipo selvagem B a partir das cepas 630, VPI10463, R20291, CD196, e uma toxina mutante B tendo uma SEQ ID NO: 6, usando um alinhamento CLUSTALW, parâmetros de padrão.
[024] A figura 3: um gráfico mostrando a identificação das cepas de C. difficile de toxina negativa do tipo selvagem. O meio de cultura das 13 cepas de C. difficile foi testado por ELISA para a toxina A. como ilustrado, sete cepas expressaram a toxina A e 6 cepas não (cepas 1351, 3232, 7322, 5036, 4811 e VPI 11186).
[025] A figura 4 A e B: resultados de SDS-PAGE ilustrando que o mutante triplo A (SEQ ID NO: 4), o mutante duplo (SEQ ID NO: 5), e o mutante triplo B (SEQ ID NO: 6) não glicosila o Rac1 ou o RhoA GTPases em um ensaio de glicosilação in vitro com um UDP-14C- glicose; sendo que 10 μg a 1 ng da toxina do tipo selvagem B não glicosila o Rac1.
[026] A figura 5: um Western blot indicando a revogação da atividade de protease de cisteina nas toxinas mutantes A e B (SEQ ID Nos: 4 e 6, respectivamente), quando comparado a observação dos fragmentos clivados das toxinas do tipo selvagem A e B (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente). Veja o exemplo 13.
[027] A figura 6: gráfico mostrando que as toxinas mutantes triplas A e B (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) exibe uma toxicidade residual quando testada em altas concentrações (por exemplo, cerca de 100 μg/ml) por um ensaio de toxicidade in vitro em células IMR-90.
[028] A figura 7: gráfico mostrando que os valores EC50 são similares para a toxina mutante tripla B (SEQ ID No:6) e para a toxina mutante hepta B (SEQ ID NO:8).
[029] A figura 8: gráfico representando os resultados a partir dos testes de toxicidade in vitro em que os níveis de ATP (RLUs) são plotados contra as concentrações elevadas do mutante triplo TcdA (SEQ ID NO:4) (painel superior) e o mutante triplo TcdB (SEQ ID NO: 6) (painel inferior). A toxicidade residual da toxina mutante A e B pode ser completamente revogada com os anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A (painel superior-pAb A e mAbs A3-25 + A60-22) e a toxina mutante B (painel inferior-pAb B).
[030] A figura 9: imagens da morfologia de célula IMR-90 em 72 horas após o tratamento. O painel A mostra células de controle tradadas simuladas. O painel B mostra a morfologia de células seguidas do tratamento com um mutante não ativado de formalinaa TcdB (SEQ ID NO: 6). O painel C mostra a morfologia da célula seguida do tratamento com um mutante inativado EDC TcdB (SEQ ID NO: 6). O painel D mostra a morfologia da célula seguida do tratamento com uma toxina do tipo selvagem B (SEQ ID NO: 2). O painel E mostra a morfologia da célula seguida do tratamento com um mutante triplo TcdB (SEQ ID NO: 6). Os resultados similares são observados para os tratamentos com TcdA.
[031] A figura 10: gráfico mostrando um anticorpo neutralizando os títulos como descrito no exemplo 25 (estudo muCdiff2010-06).
[032] A figura 11 A-B: gráfico mostrando um anticorpo neutralizando os títulos como descrito no exemplo 26 (estudo muCdiff2010-07).
[033] A figura 12: gráfico mostrando as respostas dos anticorpos de neutralização contra as toxinas A e B em ramisters após quatro horas de imunizações como descrito no Exemplo 27 (estudo hamC.difficile2010-02).
[034] As figuras 13 A-B: gráfico mostrando a resposta de anticorpo de neutralização em ramisters após a vacinação com as toxinas mutantes genéticas inativadas quimicamente e toxóides da Lista Biológica, como descrito no Exemplo 27 (estudo hamC.difficile2010-02).
[035] A figura 14: curvas de sobrevivência para os três grupos imunizados de ramisters quando comparado aos controles não imunizados, descritos no Exemplo 28 (estudo hamC.difficile2010-02, continuado).
[036] A figura 15: gráfico mostrando a resposta de anticorpo de neutralização relativo contra as formulações diferentes de toxinas mutantes de C. difficile em ramisters (estudo hamC.difficile2010-03), como descrito no Exemplo 29.
[037] As figuras 16 A-B: gráficos mostrando uma resposta de anticorpo de neutralização relativo forte contra as toxinas mutantes genéticas inativadas quimicamente A e B (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) em macacos cinomolgos, como descrito no Exemplo 30.
[038] A figura 17: sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeias leve (VL) e pesada (HL) de A3-25 mAb IgE. Peptídeo de sinal-destacado; CDRs- em itálico e sublinhado; região constante- em negrito e sublinhado (sequência completa não mostrada).
[039] A figura 18: gráfico mostrando a titulação de anticorpos monoclonais de toxina A individuais em um ensaio de neutralização de toxina usando níveis de ATP (quantificados por RLU-unidades de luz) como um indicador de viabilidade celular. Em comparação ao controle de toxina (4xEC50), mAbs A80-29, A65-33, A60-22 e A3-25 aumentaram os efeitos de neutralização na toxina A com concentração, mas não ao nível do controle anti-toxina A de coelho positivo. mAbs A50-10, A56-33, e A58-46 não neutralizaram a toxina A. O único controle de célula foi 1 -1,5x106 RLUs.
[040] A figura 19: mapeamento de 8 grupos de epítopos da toxina B mAbs pela BiaCore.
[041] A figura 20 A-C: atividades de neutralização sinergéticas de combinações de toxina A mAbs: adicionando diluições diferentes de anticorpos neutralizantes A60-22, A65-33, e A80-29 para aumentar as concentrações de A3-25 mAb aumentaram sinergicamente a neutralização da toxina A independentemente da diluição. O RLUs de controle apenas da toxina A (4x EC50) é ilustrado (<0,3x106) e os controles apenas de célula foram 2-2,5x106 RLUs como retratado nos gráficos mostrados na figura 20B e na figura 20C.
[042] A figura 21: atividades de neutralização sinérgica da toxina B mAbs: neutralização da toxina B por mAbs 8-26, B60-2 e B59-3 ilustrado na figura 21A. A neutralização da toxina B é sinergicamente aumentada após a combinação de B8-26 com diluições de B59-3 (figura 21B).
[043] A figura 22: Western blot mostrando que a expressão Rac1 GTPases é reduzida nos extratos da toxina mutante genética B ( SEQ ID NO: 6) de 24 a 96 horas, mas não nos extratos da toxina do tipo selvagem B (SEQ ID NO: 2) tratados. As manchas também mostraram que Rac1 é glicosilado nos extratos tratados de toxina B, mas não nos extratos tratados de toxina mutante genética B.
[044] A figura 23 A-K: gráfico representando os resultados a partir de testes in vitro em que os níveis de ATP (RLUs) são plotados ao contrário aumentando as concentrações do meio de cultura de C. difficile e conjunto de soro pool (■); toxina crua (colheita de cultura) da cepa respectiva e do conjunto de soro de ramister (•); toxina purificada (toxina comercial obtida pela List Biologicals) e o conjunto de soro de ramister (A); toxina crua (▼), controle; e toxina purificada (♦), controle. As toxinas das cepas respectivas foram adicionadas as células em valores 4xEC50. A figura 23 mostra que a compoisção imunogênica incluindo o TcdA mutante (SEQ ID NO: 4) e o TcdB mutante (SEQ ID NO: 6), sendo que as toxinas mutantes foram inativadas com EDC, de acordo com, por exemplo, o Exemplo 29, Tabela 15, descrita aqui, os anticorpos de neutralização induzidos que exibiram uma atividade de neutralização contra as toxinas a partir de pelo menos as 16 cepas de CDC diferentes seguintes de C. difficile, em comparação ao controle apenas da toxina respectiva: 2007886 (Figura 23A); 2006017 (Figura 23B); 2007070 (Figura 23C); 2007302 (Figura 23D); 2007838 (Figura 23E); 2007886 (Figura 23F); 2009292 (Figura 23G); 2004013 (Figura 23H); 2009141 (Figura 23I); 2005022 (Figura 23J); 2006376 (Figura 23K).
[045] A figura 24: ilustração de uma inativação EDC/NHS exemplar de toxinas de C. difficile mutantes, resultando em pelo menos três tipos possíveis de modificações: ligadas em cruz, adutos de glicina, e adutos de beta-alanina. O painel A ilustra ligações cruzadas. Os resíduos carboxílicos de toxinas mutantes triplas são ativados pela adição de EDC e NHS. Os ésteres ativados reagem com as aminas primárias para formar as ligações de amida estáveis, resultando em ligações em cruz intermoleculares. O painel B ilustra a formação de adutos de glicina. Após a inativação, os ésteres ativados residuais são temperados pela adição de glicina para formar as ligações de amida estáveis. O painel C ilustra a formação de adutos de beta-alanina. Três moles de NHS podem reagir com mole de EDC para formar uma beta-alanina ativada. Este então reage com as aminas primárias para formar as ligações de amida estáveis.
[046] A figura 25: ilustração de uma inativação EDC/NHS exemplar de toxinas C. difficile mutantes, resultando em pelo menos um dos seguintes tipos de modificações: (A) ligadas em cruz, (B) adutos de glicina, e (C) adutos de beta-alanina.
[047] Figura 26: gráfico representando os resultados a partir de um ensaio de toxicidade in vitro em que os níveis de ATP (RLUs) (72 hr ATP) são plotadas ao contrário aumentando as concentrações de TcdB do tipo selvagem, comercialmente obtida pela List Biologicals (□), TcdB mutante triplo (SEQ ID NO: 86)(<), e TcdB mutante penta (SEQ ID NO: 184) (■). As células IMR-90 (­) foram usadas como controle.
[048] A figura 27: mostrando uma inibição competitiva de toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 86)-citotoxidade mediada pela toxina mutante penta B (SEQ ID NO: 184) nas células IMR -90, (72 hr ATP ensaio). -•- representa a toxina mutante penta B (SEQ ID NO: 184)(“PM-B”); -A- representa a mutante tripla (TM) em 200 ng/mL.
[049] A figura 28: gráfico mostra o OD final e o resultado de título de toxina mutante tripla B (mg/l) seguindo uma fermentação de perfusão (CDF-5126). -•- representa ODGQQ nm; -A- representa a taxa de fluxo de perfusão (volumes do fermentador/2,0h); -■representa glicose (g/L); - •- representa o toxóide B (mutante triplo, SEQ ID NO: 86).
[050] A figura 29: gráfico mostrando o OD final e o resultado de título de toxina mutante tripla B (mg/l) a partir de outra cultura de perfusão (CDF-5127). -•- representa ODGQQ nm; -A- representa a taxa de fluxo de perfusão (volumes do fermentador/2,0h); -■representa glicose (g/L); - •- representa um toxóide B (mutante triplo, SEQ ID NO: 86).
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[051] SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de aminoácido para a toxina 630 C. difficile do tipo selvagem A (TcdA).
[052] SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácido para a toxina 630 C. difficile do tipo selvagem B (TcdB).
[053] SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácido para o TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 285 e 287, quando comparado a SEQ ID NO: 1.
[054] SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 285, 287, e 700, quando comparado a SEQ ID NO: 1.
[055] SEQ ID NO: 5 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante tendo uma mutação nas posições 286 e 288, quando comparado a SEQ ID NO: 2.
[056] SEQ ID NO: 6 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante tendo uma mutação nas posições 286, 288, e 698, quando comparado a SEQ ID NO: 2.
[057] SEQ ID NO: 7 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 269, 272, 285, 287, 460, 462, e 700, quando comparado a SEQ ID NO: 1
[058] SEQ ID NO: 8 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante tendo uma mutação nas posições 270, 273, 286, 288, 461, 463, e 698, quando comparado a SEQ ID NO: 2
[059] SEQ ID NO: 9 estabelece uma sequência de DNA codificando a toxina 630 C. difficile do tipo selvagem A (TcdA).
[060] SEQ ID NO: 10 estabelece uma sequência de DNA codificando a toxina 630 C. difficile do tipo selvagem B (TcdB).
[061] SEQ ID NO: 11 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 3
[062] SEQ ID NO: 12 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 4
[063] SEQ ID NO: 13 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 5
[064] SEQ ID NO: 14 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 6
[065] SEQ ID NO: 15 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA R20291 C. difficile do tipo selvagem.
[066] SEQ ID NO: 16 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 15.
[067] SEQ ID NO: 17 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA CD196 C. difficile do topo selvagem.
[068] SEQ ID NO: 18 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 17.
[069] SEQ ID NO: 19 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA VPI10463 C. difficile do tipo selvagem.
[070] SEQ ID NO: 20 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 19.
[071] SEQ ID NO: 21 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB R20291 C.difficile do tipo selvagem.
[072] SEQ ID NO: 22 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 21.
[073] SEQ ID NO: 23 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB CD196 C.difficile do tipo selvagem.
[074] SEQ ID NO: 24 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 23.
[075] SEQ ID NO: 25 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB VPI10463 C.difficile do tipo selvagem.
[076] SEQ ID NO: 26 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 25.
[077] SEQ ID NO: 27 estabelece uma sequência de DNA de um local de patogenicidade do VPI10463 C.difficile do tipo selvagem.
[078] SEQ ID NO: 28 estabelece a sequência de aminoácido para os resíduos 101 a 293 da SEQ ID NO: 1.
[079] SEQ ID NO: 29 estabelece a sequência de aminoácido para resíduos 1 a 542 da SEQ ID NO: 1.
[080] SEQ ID NO: 30 estabelece a sequência de aminoácido para resíduos 101 a 293 da SEQ ID NO: 2.
[081] SEQ ID NO: 31 estabelece a sequência de aminoácido para resíduos 1 a 543 da SEQ ID NO: 2.
[082] SEQ ID NO: 32 estabelece a sequência de aminoácido para resíduos 543 a 809 da SEQ ID NO: 1.
[083] SEQ ID NO: 33 estabelece a sequência de aminoácido para resíduos 544 a 767 da SEQ ID NO: 2.
[084] SEQ ID NO: 34 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdA mutante, sendo que os resíduos 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655, e 700 podem ser qualquer aminoácido.
[085] SEQ ID NO: 35 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante, sendo que 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698, e 751 podem ser qualquer aminoácido.
[086] SEQ ID NO: 36 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de anticorpo de neutralização do TcdA C. difficile (A3-25 mAb).
[087] SEQ ID NO: 37 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização do TcdA C. difficile (A3-25 mAb).
[088] SEQ ID NO: 38 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia leve variável do anticorpo de neutralização de TcdA C. difficile (A3-25 mAb).
[089] SEQ ID NO: 39 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia leve variável de anticorpo de neutralização de C. difficile TcdA (A3-25 mAb).
[090] SEQ ID NO: 40 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia leve variável de anticorpo de neutralização de TcdA C. difficile (A3-25 mAb).
[091] SEQ ID NO: 41 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia pesada variável de anticorpo de neutralização de C. difficile TcdA (A3-25 mAb).
[092] SEQ ID NO: 42 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia pesada variável de anticorpo de neutralização de C. difficile TcdA (A3-25 mAb).
[093] SEQ ID NO: 43 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia pesada variável de anticorpo de neutralização de C. difficile TcdA (A3-25 mAb).
[094] SEQ ID NO: 44 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 3.
[095] SEQ ID NO: 45 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 4.
[096] SEQ ID NO: 46 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 5.
[097] SEQ ID NO: 47 estabelece uma sequência de DNA codificando a SEQ ID NO: 6.
[098] SEQ ID NO: 48 estabelece uma sequência de nucleotídeo oligonucleotídeo imunoestimulatório ODN CpG 24555.
[099] SEQ ID NO: 49 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0100] SEQ ID NO: 50 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal de uma cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0101] SEQ ID NO: 51 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0102] SEQ ID NO: 52 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0103] SEQ ID NO: 53 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0104] SEQ ID NO: 54 estabelece a sequência de aminoácido para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0105] SEQ ID NO: 55 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0106] SEQ ID NO: 56 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0107] SEQ ID NO: 57 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0108] SEQ ID NO: 58 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0109] SEQ ID NO: 59 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B8-26 mAb).
[0110] SEQ ID NO: 60 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0111] SEQ ID NO: 61 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0112] SEQ ID NO: 62 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0113] SEQ ID NO: 63 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0114] SEQ ID NO: 64 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0115] SEQ ID NO: 65 estabelece a sequência de aminoácido para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0116] SEQ ID NO: 66 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0117] SEQ ID NO: 67 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0118] SEQ ID NO: 68 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0119] SEQ ID NO: 69 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0120] SEQ ID NO: 70 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B59-3 mAb).
[0121] SEQ ID NO: 71 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0122] SEQ ID NO: 72 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0123] SEQ ID NO: 73 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0124] SEQ ID NO: 74 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0125] SEQ ID NO: 75 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0126] SEQ ID NO: 76 estabelece a sequência de aminoácido para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0127] SEQ ID NO: 77 estabelece a sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0128] SEQ ID NO: 78 estabelece a sequência de aminoácido para o peptídeo de sinal da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0129] SEQ ID NO: 79 estabelece a sequência de aminoácido para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0130] SEQ ID NO: 80 estabelece a sequência de aminoácido para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0131] SEQ ID NO: 81 estabelece a sequência de aminoácido para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de TcdB C. difficile (B9-30 mAb).
[0132] SEQ ID NO: 82 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante, sendo que um resíduo nas posições 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698, e 751 podem ser qualquer aminoácido.
[0133] SEQ ID NO: 83 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 269, 272, 285, 287, 460, 462, e 700, quando comparado a SEQ ID NO: 1, sendo que a metionina na posição 1 é ausente.
[0134] SEQ ID NO: 84 estabelece a sequência de aminoácido para a toxina C. difficile mutante A tendo uma mutação nas posições 285, 287, e 700, quando comparado a SEQ ID NO: 1, sendo a metionina na posição 1 é ausente.
[0135] SEQ ID NO: 85 estabelece a sequência de aminoácido para a toxina C. difficile mutante B tendo uma mutação nas posições 270, 273, 286, 288, 461, 463, e 698, quando comparado a SEQ ID NO: 2, sendo que a metionina na posição 1 é ausente.
[0136] SEQ ID NO: 86 estabelece a sequência de aminoácido para a toxina C. difficile mutante B tendo uma mutação nas posições 286, 288, e 698, quando comparado a SEQ ID NO: 2, sendo que a metionina na posição 1 é ausente.
[0137] SEQ ID NO: 87 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2004013 C. difficile do tipo selvagem.
[0138] SEQ ID NO: 88 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2004111 C. difficile do tipo selvagem.
[0139] SEQ ID NO: 89 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2004118 C. difficile do tipo selvagem.
[0140] SEQ ID NO: 90 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2004205 C. difficile do tipo selvagem.
[0141] SEQ ID NO: 91 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2004206 C. difficile do tipo selvagem.
[0142] SEQ ID NO: 92 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2005022 C. difficile do tipo selvagem.
[0143] SEQ ID NO: 93 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2005088 C. difficile do tipo selvagem.
[0144] SEQ ID NO: 94 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2005283 C. difficile do tipo selvagem.
[0145] SEQ ID NO: 95 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2005325 C. difficile do tipo selvagem.
[0146] SEQ ID NO: 96 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2005359 C. difficile do tipo selvagem.
[0147] SEQ ID NO: 97 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2006017 C. difficile do tipo selvagem.
[0148] SEQ ID NO: 98 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007070 C. difficile do tipo selvagem.
[0149] SEQ ID NO: 99 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007217 C. difficile do tipo selvagem.
[0150] SEQ ID NO: 100 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007202 C. difficile do tipo selvagem.
[0151] SEQ ID NO: 101 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007816 C. difficile do tipo selvagem.
[0152] SEQ ID NO: 102 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007838 C. difficile do tipo selvagem.
[0153] SEQ ID NO: 103 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007858 C. difficile do tipo selvagem.
[0154] SEQ ID NO: 104 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2007886 C. difficile do tipo selvagem.
[0155] SEQ ID NO: 105 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2008222 C. difficile do tipo selvagem.
[0156] SEQ ID NO: 106 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2009078 C. difficile do tipo selvagem.
[0157] SEQ ID NO: 107 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2009087 C. difficile do tipo selvagem.
[0158] SEQ ID NO: 108 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2009141 C. difficile do tipo selvagem.
[0159] SEQ ID NO: 109 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 2009292 C. difficile do tipo selvagem.
[0160] SEQ ID NO: 110 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2004013 C. difficile do tipo selvagem.
[0161] SEQ ID NO: 111 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2004111 C. difficile do tipo selvagem.
[0162] SEQ ID NO: 112 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2004118 C. difficile do tipo selvagem.
[0163] SEQ ID NO: 113 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2004205 C. difficile do tipo selvagem.
[0164] SEQ ID NO: 114 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2004206 C. difficile do tipo selvagem.
[0165] SEQ ID NO: 115 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2005022 C. difficile do tipo selvagem.
[0166] SEQ ID NO: 116 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2005088 C. difficile do tipo selvagem.
[0167] SEQ ID NO: 117 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2005283 C. difficile do tipo selvagem.
[0168] SEQ ID NO: 118 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2005325 C. difficile do tipo selvagem.
[0169] SEQ ID NO: 119 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2005359 C. difficile do tipo selvagem.
[0170] SEQ ID NO: 120 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2006017 C. difficile do tipo selvagem.
[0171] SEQ ID NO: 121 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2006376 C. difficile do tipo selvagem.
[0172] SEQ ID NO: 122 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007070 C. difficile do tipo selvagem.
[0173] SEQ ID NO: 123 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007217 C. difficile do tipo selvagem.
[0174] SEQ ID NO: 124 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007302 C. difficile do tipo selvagem.
[0175] SEQ ID NO: 125 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007816 C. difficile do tipo selvagem.
[0176] SEQ ID NO: 126 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007838 C. difficile do tipo selvagem.
[0177] SEQ ID NO: 127 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007858 C. difficile do tipo selvagem.
[0178] SEQ ID NO: 128 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2007886 C. difficile do tipo selvagem.
[0179] SEQ ID NO: 129 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2008222 C. difficile do tipo selvagem.
[0180] SEQ ID NO: 130 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2009078 C. difficile do tipo selvagem.
[0181] SEQ ID NO: 131 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2009087 C. difficile do tipo selvagem.
[0182] SEQ ID NO: 132 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2009141 C. difficile do tipo selvagem.
[0183] SEQ ID NO: 133 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 2009292 C. difficile do tipo selvagem.
[0184] SEQ ID NO: 134 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 014 C. difficile do tipo selvagem.
[0185] SEQ ID NO: 135 estabelece a sequência de para TcdA 015 C. difficile do tipo selvagem.
[0186] SEQ ID NO: 136 estabelece a sequência de para TcdA 020 C. difficile do tipo selvagem.
[0187] SEQ ID NO: 137 estabelece a sequência de para TcdA 023 C. difficile do tipo selvagem.
[0188] SEQ ID NO: 138 estabelece a sequência de para TcdA 027 C. difficile do tipo selvagem.
[0189] SEQ ID NO: 139 estabelece a sequência de para TcdA 029 C. difficile do tipo selvagem.
[0190] SEQ ID NO: 140 estabelece a sequência de para TcdA 046 C. difficile do tipo selvagem.
[0191] SEQ ID NO: 141 estabelece a sequência de para TcdB 014 C. difficile do tipo selvagem.
[0192] SEQ ID NO: 142 estabelece a sequência de para TcdB 015 C. difficile do tipo selvagem.
[0193] SEQ ID NO: 143 estabelece a sequência de para TcdB 020 C. difficile do tipo selvagem.
[0194] SEQ ID NO: 144 estabelece a sequência de para TcdB 023 C. difficile do tipo selvagem.
[0195] SEQ ID NO: 145 estabelece a sequência de para TcdB 027 C. difficile do tipo selvagem.
[0196] SEQ ID NO: 146 estabelece a sequência de para TcdB 029 C. difficile do tipo selvagem.
[0197] SEQ ID NO: 147 estabelece a sequência de para TcdB 046 C. difficile do tipo selvagem.
[0198] SEQ ID NO: 148 estabelece a sequência de para TcdA 001 C. difficile do tipo selvagem.
[0199] SEQ ID NO: 149 estabelece a sequência de para TcdA 002 C. difficile do tipo selvagem.
[0200] SEQ ID NO: 150 estabelece a sequência de para TcdA 003 C. difficile do tipo selvagem.
[0201] SEQ ID NO: 151 estabelece a sequência de para TcdA 004 C. difficile do tipo selvagem.
[0202] SEQ ID NO: 152 estabelece a sequência de para TcdA 070 C. difficile do tipo selvagem.
[0203] SEQ ID NO: 153 estabelece a sequência de para TcdA 075 C. difficile do tipo selvagem.
[0204] SEQ ID NO: 154 estabelece a sequência de para TcdA 077 C. difficile do tipo selvagem.
[0205] SEQ ID NO: 155 estabelece a sequência de para TcdA 081 C. difficile do tipo selvagem.
[0206] SEQ ID NO: 156 estabelece a sequência de para TcdA 117 C. difficile do tipo selvagem.
[0207] SEQ ID NO: 157 estabelece a sequência de para TcdA 131 C. difficile do tipo selvagem.
[0208] SEQ ID NO: 158 estabelece a sequência de para TcdB 001 C. difficile do tipo selvagem.
[0209] SEQ ID NO: 159 estabelece a sequência de para TcdB 002 C. difficile do tipo selvagem.
[0210] SEQ ID NO: 160 estabelece a sequência de para TcdB 003 C. difficile do tipo selvagem.
[0211] SEQ ID NO: 161 estabelece a sequência de para TcdB 004 C. difficile do tipo selvagem.
[0212] SEQ ID NO: 162 estabelece a sequência de para TcdB 070 C. difficile do tipo selvagem.
[0213] SEQ ID NO: 163 estabelece a sequência de para TcdB 075 C. difficile do tipo selvagem.
[0214] SEQ ID NO: 164 estabelece a sequência de para TcdB 077 C. difficile do tipo selvagem.
[0215] SEQ ID NO: 165 estabelece a sequência de para TcdB 081 C. difficile do tipo selvagem.
[0216] SEQ ID NO: 166 estabelece a sequência de para TcdB 117 C. difficile do tipo selvagem.
[0217] SEQ ID NO: 167 estabelece a sequência de para TcdB 131 C. difficile do tipo selvagem.
[0218] SEQ ID NO: 168 estabelece a sequência de para TcdA 053 C. difficile do tipo selvagem.
[0219] SEQ ID NO: 169 estabelece a sequência de para TcdA 078 C. difficile do tipo selvagem.
[0220] SEQ ID NO: 170 estabelece a sequência de para TcdA 087 C. difficile do tipo selvagem.
[0221] SEQ ID NO: 171 estabelece a sequência de para TcdA 095 C. difficile do tipo selvagem.
[0222] SEQ ID NO: 172 estabelece a sequência de para TcdA 126 C. difficile do tipo selvagem.
[0223] SEQ ID NO: 173 estabelece a sequência de para TcdB 053 C. difficile do tipo selvagem.
[0224] SEQ ID NO: 174 estabelece a sequência de para TcdB 078 C. difficile do tipo selvagem.
[0225] SEQ ID NO: 175 estabelece a sequência de para TcdB 087 C. difficile do tipo selvagem.
[0226] SEQ ID NO: 176 estabelece a sequência de para TcdB 095 C. difficile do tipo selvagem.
[0227] SEQ ID NO: 177 estabelece a sequência de para TcdB 126 C. difficile do tipo selvagem.
[0228] SEQ ID NO: 178 estabelece a sequência de para TcdA 059 C. difficile do tipo selvagem.
[0229] SEQ ID NO: 179 estabelece a sequência de para TcdB 059 C. difficile do tipo selvagem.
[0230] SEQ ID NO: 180 estabelece a sequência de aminoácido para TcdA 106 C. difficile do tipo selvagem.
[0231] SEQ ID NO: 181 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 106 C. difficile do tipo selvagem.
[0232] SEQ ID NO: 182 estabelece a sequência de aminoácido para TcdB 017 C. difficile do tipo selvagem.
[0233] SEQ ID NO: 183 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 285, 287, 700, 972, e 978 quando comparado a SEQ ID NO: 1.
[0234] SEQ ID NO: 184 estabelece a sequência de aminoácido para a TcdB mutante tendo uma mutação nas posições 286, 288, 698, 970, e 976 quando comparado a SEQ ID NO: 2.
[0235] SEQ ID NO: 185 até a SEQ ID NO: 195 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante exemplar.
[0236] SEQ ID NO: 196 até a SEQ ID NO: 212 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0237] SEQ ID NO: 213 até a SEQ ID NO: 222 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0238] SEQ ID NO: 223 até a SEQ ID NO: 236 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0239] SEQ ID NO: 237 até a SEQ ID NO: 243 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0240] SEQ ID NO: 244 até a SEQ ID NO: 245 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0241] SEQ ID NO: 246 até a SEQ ID NO: 249 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0242] SEQ ID NO: 250 até a SEQ ID NO: 253 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0243] SEQ ID NO: 254 estabelece a sequência de aminoácido para uma toxina mutante exemplar.
[0244] SEQ ID NO: 255 até a SEQ ID NO: 263 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0245] SEQ ID NO: 264 até a SEQ ID NO: 269 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0246] SEQ ID NO: 270 até a SEQ ID NO: 275 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante exemplar.
[0247] SEQ ID NO: 276 até a SEQ ID NO: 323 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0248] SEQ ID NO: 324 até a SEQ ID NO: 373 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0249] SEQ ID NO: 374 até a SEQ ID NO: 421 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0250] SEQ ID NO: 422 até a SEQ ID NO: 471 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0251] SEQ ID NO: 472 até a SEQ ID NO: 519 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0252] SEQ ID NO: 568 até a SEQ ID NO: 615 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0253] SEQ ID NO: 520 até a SEQ ID NO: 567 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0254] SEQ ID NO: 616 até a SEQ ID NO: 663 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
[0255] SEQ ID NO: 664 até a SEQ ID NO: 711 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante A exemplar.
[0256] SEQ ID NO: 712 até a SEQ ID NO: 761 cada uma estabelece uma sequência de aminoácido para uma toxina mutante B exemplar.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0257] Surpreendentemente os inventores descobriram, entre outras coisas, uma toxina de C. difficile mutante A e uma toxina B, e métodos dos mesmos. Os mutantes são caracterizados, em parte, por ser imunogênicos e exibirem uma toxicidade reduzida comparado com uma forma do tipo selvagem da toxina respectiva. A presente invenção também refere-se a partes imunogênicas do mesmo, equivalentes biológicos do mesmo, e polinucleotídeos isolados que incluem sequências de ácido nucléico codificando qualquer um dos acima mencionados.
[0258] As composições imunogênicas descritas aqui inesperadamente demonstraram a capacidade de provocar novos anticorpos de neutralização contra as toxinas C. difficile e eles podem ter a capacidade de conferir uma proteção ativa e/ou passiva contra um desafio de C. difficile. Os novos anticorpos são direcionados contra vários epítopos de toxina A e de toxina B. Os inventores ainda descobriram que umja combinação de pelo menos dois anticorpos monoclonais de neutralização podem exibir um efeito sinérgico inesperado na respectiva neutralização in vitro da toxina A e da toxina B.
[0259] As composições inventivas descritas aqui podem ser usadas para tratar, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a ocorrência de, diminuir a gravidade de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, uma doença associada ao C. difficile (CDAD), síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual a composição não foi administrada.
[0260] Além disso, os inventores descobriram uma célula de C. difficile asporogênica recombinante que pode expressar estavelmente a toxina A e a toxina B de C. difficile mutante, e novos métodos para a produção do mesmo.
COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS
[0261] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica que inclui uma toxina de C. difficile mutante. A toxina de C. difficile mutante inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma mutação em um domínio de glicosiltransferase e pelo menos uma mutação em um domínio de protease de cisteína, relativo a uma toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0262] O termo “tipo selvagem”, como usado aqui, refere-se a forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídio do tipo selvagem é uma sequência presente em um organismo que pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificado por manipulação humana. A presente invenção também refere-se a polinucçleotídeos isolados que incluem sequências de ácido nucléico codificando qualquer um dos acima mencionados. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de qualquer uma das composições acima mkencionadas pra tratar, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir a ocorrência de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, uma doença associada ao C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual a composição não é administrada, assim como os métodos para a preparação de tais composições.
[0263] Como usado aqui, uma “composição imunogênica” ou “imunógeno” refere-se a uma composição que provoca uma resposta imune em um mamífero ao qual a composição e administrada.
[0264] Uma “resposta imune” refere-se ao desenvolvimento de um humoral benéfico (mediado por anticorpo) e/ou uma resposta celular (mediada por células T específicas de antígeno ou seus produtos de secreção) direcionadas contra a toxina C. difficile em um paciente recipiente. A resposta imune pode ser humoral, celular ou ambas.
[0265] A resposta imune pode ser uma resposta ativa induzida pela administração de uma composição imunogênica, um imunógeno. Alternativamente, a resposta imune pode ser uma resposta passiva induzida pela administração de um anticorpo ou de células T preparadas.
[0266] A presença de uma resposta imune humoral (mediada por anticorpo) pode ser determinada, por exemplo, por ensaios com base em célula conhecidos na arte, tal como um ensaio de anticorpo de neutralização, ELISA, etc.
[0267] Uma resposta imune celular é tipicamente provocada pela apresentação de epítopos de polipeptídeo em associação com moléculas MHC de Classe I ou Classe II para ativar as células de ajuda T+ CD4 específicas de antígeno e/ou células T citotóxicas CD8+. A resposta também pode envolver a ativação de monócitos, macrófagos, células Nk, basófilos, células dendríticas, astrócitos, células micróglia, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata. A presença de uma resposta imunológica mediada por célula pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4 +) ou ensaios CTL (linfócitos T citotóxicos) conhecidos na arte.
[0268] Em uma modalidade, uma composição imunogênica é uma composição de vacina. Como usado aqui, uma “composição de vacina” é uma composição que provoca uma resposta imune em um mamífero ao qual a composição é administrada. A composição de vacina pode proteger o mamífero imunizado contra o desafio subsequente pelo agente de imunização ou um agente reagente em cruz imunologicamente. A proteção pode ser completa ou parcial com relação a redução nos sintomas ou na infecção quando comparado a um mamífero não vacinado sob as mesmas condições.
[0269] As composições imunogênicas descritas aqui são reativas em cruz, que se refere a ter uma característica de ser capaz de provocar uma resposta imune eficaz (por exemplo, uma resposta imune humoral) contra uma toxina produzida por outra cepa de C. difficile que é diferente da cepa a partir da qual a composição é derivada. Por exemplo, as composições imunológicas (por exemplo, derivadas de C. difficile 630) descritas aqui podem provocar anticorpos reativos em cruz que podem se ligar a toxinas produzidas pelas cepas de C. difficile (por exemplo, toxinas produzidas por C. difficile R20291 e VPI10463). Veja, por exemplo, o exemplo 37. A reatividade em cruz é um indicativo do potencial de proteção em cruz do imunógeno bacteriano, e vice versa.
[0270] O termo “protetivo em cruz” como usado aqui, refere-se a capacidade da resposta imune induzida por uma composição imunogênica de prevenir ou atenuar uma infecção por uma cepa bacteriana diferente ou espécies do mesmo gênero. Por exemplo, uma composição imunogênica (por exemplo, derivada de C. difficile 630) descrita aqui pode induzir uma resposta imune eficaz em um mamífero para atenuar uma infecção de C. difficile e/ou para atenuar uma doença de C. difficile causda por uma cepa outra que não a 630 (por exemplo, C. difficile R20291) em mamíferos.
[0271] Os mamíferos exemplares nos quais a composição imunogênica ou o imunógeno provoca uma resposta imune inclui qualquer mamífero, tais como, por exemplo, camundongo, ramisters, primatas e humanos. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica ou imunógeno provoca uma resposta imune em um humano ao qual a composição é administrada.
[0272] Como descrito acima, a toxina A (TcdA) e a toxina B (TcdB) são glucosiltransferases homólogas que inativam os GTPases pequenos da família Rho/Rac/Ras. A ação de TcdA e TcdB em células alvo de mamíferos depende de um mecanismo multi-etapas de endocitose mediada por receptor, translocação de membrana, processamento autoproteolítico, e monoglucosilação de GTPases. Muitas destas atividades funcionais têm sido descritas para regiões diferentes dentro da sequência primária das toxinas, e as toxinas têm sido imaginadas para mostrar que estas moléculas são similares em estrutura.
[0273] O gene do tipo selvagem para TcdA tem cerca de 8130 nucleotídeos que codificam uma proteína tendo um peso molecular deduzido de cerca de 308-kDa, tendo cerca de 2710 aminoácidos. Como usado aqui, um TcdA de C. difficile do tipo selvagem inclui TcdA de C. difficile a partir de qualquer cepa de C. difficile do tipo selvagem. Um TcdA de C. difficile do tipo selvagem pode incluir uma sequência de aminoáciso TcdA de C. difficile do tipo selvagem tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade para a SEQ ID NO: 1 (comprimento completo) quando otimamente alinhada, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de espaço padrão.
[0274] Em uma modalidade preferida, o TcdA de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 1, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile 630 (também divulgada no número de acesso no GenBank YP_001087137.1 e/ou CAJ67494.1). A cepa C. difficile 630 é conhecida na arte como sendo uma cepa 012 de ribotipo PCR. A SEQ ID NO: 9 descreve o gene do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile 630, que também é divulgada no número de acesso do GenBank NC_009089.1.
[0275] Outro exemplo de um TcdA C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 15, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile R20291 (também divulgada no número de acesso do GenBank YP_003217088.1). A cepa C. difficile R20291 é conhecida na arte como sendo uma cepa hipervirulenta e a cepa 027 de ribotipo PCR. A sequência de aminoácido para TcdA a partir da cepa de C. difficile R20291 tem cerca de 98% de identidade para a SEQ ID NO:1. A SEQ ID NO: 16 descreve o gene do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile R20291, que também é divulgada no número de acesso do GenBank NC_013316.1.
[0276] Um exemplo adicional de um TcdA C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 17, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile CD196 (também divulgada no número de acesso do GenBank CBA61156.1). O CD196 é uma cepa de um surto canadense recente, e é conhecido na arte como cepa 027 de ribotipo PCR. A sequência de aminoácido para TcdA a partir da cepa C. difficile CD196 tem cerca de 98% de identidade com a SEQ ID NO: 1, e tem cerca de 100% de identidade com a TcdA a partir da cepa C. difficile R20291. A SEQ ID NO: 18 descreve o gene do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile CD196, que também é divulgada no número de acesso do GenBank FN538970.1.
[0277] Outros exemplos de uma sequência de aminoácido para um TcdA de C. difficile do tipo selvagem inclui a SEQ ID NO: 19, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile VPI10463 (também divulgada no número de acesso do GenBank CAA63564.1). A sequência de aminoácido para TcdA a partir da cepa C. difficile VPI10463 tem cerca de 100% (99.8%) de identidade com a SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 20 descreve o gene do tipo selvagem para TcdA a partir da cepa C. difficile VPI10463, que também é divulgada no número de acesso do GenBank X92982.1.
[0278] Os exemplos adicionais de um TcdA de C. difficile do tipo selvagem incluem o TcdAa partir de cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas a partir do Centro para Controle e Prevenção de Doenças (CDC, Atlanta, GA). Os inventores descobriram que a sequência de aminoácido de TcdA das cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas do CDC incluem pelo menos cerca de 99,3% a 100% de identidade, quando otimamente alinhado, aos resíduos de aminoácidos de 1 a 821 da SEQ ID NO: 1 (TcdA a partir de C. difficile 630). Veja a Tabela 1.
[0279] Os inventores também descobriram que a sequência de aminoácido de TcdA das cepas de C. difficile do tipo selvagem podem incluir pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, a cerca de 100% de identidade, quando alinhado otimamente (por exemplo, quando as sequências de comprimento completo são otimamente alinhadas) a SEQ ID NO: 1.
[0280] Tabela 1: cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas a partir do CDC e a porcentagem de identidade dos resíduos de aminoácidos 1-821 de TcdA a partir da cepa de C. difficile do tipo selvagem respectiva para os resíduos de aminoácidos 1-821 da SEQ ID NO: 1, quando otimamente alinhados. Tabela 1: Cepas de C. difficile do tipo selvagem a partir de CDC
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[0281] Portanto, em uma modalidade, a sequência de aminoácido de TcdA de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de pelo menos cerca de 500, 600, 700, ou 800 resíduos contíguos, que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99%, ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com a uma sequência de igual comprimento entre os resíduos de 1 a 900 da SEQ ID NO: 1 quando otimamente alinhados, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão. Os exemplos incluem as cepas descritas acima (por exemplo, R20291, CD196, etc) e aquelas listadas na Tabela 1.
[0282] Em outra modalidade, a sequência de aminoácido de TcdA de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, preferencialmente cerca de 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com qualquer sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs: 87-109 quando otimamente alinhados. Veja Tabela 1-a.
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[0283] O gene do tipo selvagem para TcdB tem cerca de 7098 nucleotídeos que codificam uma proteína com um peso molecular deduzido de cerca de 270 kDa, tendo cerca de 2366 aminoácidos. Como usado aqui, um TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui um TcdB de C. difficile de qualquer cepa de C. difficile do tipo selvagem. O TcdB de C. difficile do tipo selvagem pode incluir uma sequência de aminoácido do tipo selvagem tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2 quando otimamente alinhados, tal como pelo programa GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão. Em uma modalidade preferida, o TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile 630 (também divulgada no número de acesso do GenBank YP_001087135.1 e/ou CAJ67492). A SEQ ID NO: 10 descreve o gene do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile 630, que também é divulgada no número de acesso do GenBank NC_009089.1.
[0284] Outro exemplo de um TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 21, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile R20291 (também divulgada no número de acesso do GenBank YP_003217086.1 e/ou CBE02479.1). A sequência de aminoácido para TcdB a partir da cepa C. difficile R20291 tem cerca de 92% de identidade com a SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 22 descreve o gene do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile R20291, que também é divulgada no número de acesso do GenBank NC_013316.1.
[0285] Um exemplo adicional de um TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 23, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile CD196 (também divulgada no número de acesso do GenBank YP_003213639.1 e/ou CBA61153.1). A SEQ ID NO: 24 descreve o gene do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile CD196, que também é divulgada no número de acesso do GenBank NC_013315.1. A sequência de aminoácido para TcdB a partir da cepa C. difficile CD196 tem cerca de 92% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
[0286] Outros exemplos de uma sequência de aminoácido para um TcdB de C. difficile do tipo selvagem incluem a SEQ ID NO: 25, que descreve a sequência de aminoácido do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile VPI10463 (também divulgada no número de acesso do GenBank P18177 e/ou CAA37298). A sequência de aminoácido para TcdB a partir da cepa C. difficile VPI10463 tem 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2. A SEQ ID NO: 26 descreve o gene do tipo selvagem para TcdB a partir da cepa C. difficile VPI10463, que também é divulgada no número de acesso do GenBank X53138.1.
[0287] Os exemplos adicionais de um TcdB de C. difficile do tipo selvagem incluem TcdB a partir de cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas a partir do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC, Atlanta, GA). Os inventores também descobriram que a sequência de aminoácido de TcdB a partir das cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas a partir do CDC incluem pelo menos cerca de 96% to 100% de identidade, quando otimamente alinhados, para os resíduos de aminoácidos de 1 a 821 da SEQ ID NO: 2 (TcdB de C. difficile 630). Veja a Tabela 2.
[0288] Tabela 2: cepas de C. difficile do tipo selvagem obtidas a partir do CDC e a % de identidade dos resíduos de aminoácidos de 1821 do TcdB a partir da cepa de C. difficile do tipo selvagem respectiva pra os resíduos de aminoácidos de 1-821 da SEQ ID NO: 2, quando otimamente alinhados.
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[0289] Portanto, em uma modalidade, a sequência de aminoácido de TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência de pelo menos cerca de 500, 600, 700, ou 800 resíduos contíguos, que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, preferencialmente cerca de 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com a uma sequência de igual comprimento entre os resíduos de 1 a 900 da SEQ ID NO: 2 quando otimamente alinhados, tal como pelo programa GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão. Os exemplos incluem as cepas descritas acima (por exemplo, R20291, CD196, etc) e aquelas listadas na Tabela 2.
[0290] Em outra modalidade, a sequência de aminoácido de TcdB de C. difficile do tipo selvagem inclui uma sequência tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, preferencialmente cerca de 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com qualquer sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs: 110-133 quando otimamente alinhados. Veja tabela 2-a.
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[0291] Os genes para as toxinas A e B (tcdA e tcdB) são parte de um local genético 19,6-kb (local de patogenicidade, PaLoc) que inclui 3 estruturas pequenas de leitura aberta adicionais (ORFs), tcdD, tcdE, e tcdC, e pode ser considerado útil para virulência. O PaLoc é conhecido por ser estável e conservado nas cepas toxigênicas. Está presente no mesmo local de integração cromossômica em todas cepas toxigênicas que tem sido analisada até o momento. Nas cepas não toxigênicas, o local de patogenicidade (PaLoc) não está presente. Portanto, uma característica das cepas de C. difficile do tipo selvagem descritas aqui é a presença de um local de patogenicidade. Outra característica preferida das cepas de C. difficile do tipo selvagem descritas aqui é a produção de ambos o TcdA e o TcdB.
[0292] Em uma modalidade, a cepa de C. difficile do tipo selvagem é uma cepa tendo um local de patogenicidade que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% idêntica a aquela do C. difficile 630 ou VPI10463. A sequência de patogenicidade total de C. difficile VPI10463, é registrado no banco de dados EMBL com o número de acesso X92982, também mostrado na SEQ ID NO: 26. As cepas na qual o PaLoc é idêntico a aquela cepa de referência VPI10463 são referidos como toxinotipo 0. As cepas dos toxinotipos I-VII, IX, XII-XV, e XVIII-XXIV produzem ambos o TcdA e o TcdB apesar das variações em seus genes de toxina.
[0293] No N-terminal das toxinas, o domínio de glucosiltransferase é localizado. A atividade de glucosiltransferase das toxinas é associada a função citotóxica das toxinas. Sem estar limitado pelo mecanismo ou pela teoria, acredita-se que a atividade de glucosiltransferase em ambas as toxinas catalisa a monoglucosilação das proteínas de ligação GTP pequenas na superfamília Rho/Rac/Ras. Após a glicosilação destas proteínas de ligação ao GTP, as proteínas de ligação, a fisiologia celular é modificada dramaticamente, resultando em uma perda da integridade estrutural e ruptura dos caminhos de sinalização essenciais das células hospedeiras infectadas pelas toxinas. O motivo Asp-Xaa-Asp (DXD), que é envolvido com manganês, difosfato de uridina (UDP), e ligação de glicose, é uma característica típica para o domínio de glucosiltransferase. Sem estar limitado pelo mecanismo ou pela teoria, acredita-se que os resíduos críticos para a atividade catalítica, tais como o motivo DXD, não variam entre um TcdB a partir de uma cepa “histórica” conhecida, tal como 630, e o TcdB a partir de uma cepa hipervirulenta, tal como R20291. O motivo DXD é localizado nos resíduos de 285 a 287 do TcdA C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1, e nos resíduos de 286 a 288 de um TcdB de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2.
[0294] Os algoritmos de alinhamento globais (por exemplo, os programas de análise de sequência) são conhecidos na arte e podem ser usados para alinhar otimamente duas ou mais sequências de toxina de aminoácido para determinar se a toxina inclui um motivo de assinatura particular (por exemplo, DXD no domínio de glucosiltransferase, DHC no domínio de protease de cisteína descrito abaixo, etc.). A sequência alinhada otimamente é comparada a uma sequência de referência respectiva (por exemplo, SEQ ID NO:1 para TcdA ou SEQ ID NO: 2 para TcdB) para determinar a existência do motivo de assinatura. O “alinhamento ótimo” refere-se a um alinhamento dando a maior porcentagem de pontuação de identidade. Tal alinhamento pode ser realizado usando programas de análise de sequência conhecidos. Em uma modalidade, um alinhamento CLUSTAL (tal como o CLUSTALW) sob os parâmetros padrão é usado para identificar as toxinas do tipo selvagem compatíveis comparando a sequência de consulta contra a sequência de referência. A numeração relativa dos resíduos de aminoácidos conservados é com base na numeração de resíduo da sequência de aminoácido de referência para levar em conta as inserções ou deleções (por exemplo, cinco aminoácidos ou menos) dentro da sequência alinhada.
[0295] Como usado aqui, o termo “de acordo com a numeração de” refere-se a numeração dos resíduos de uma sequência de referência quando uma dada sequência de aminoácido ou polinucleotídeo é comparada a uma sequência de referência. Em outras palavras, o número ou a posição de resíduo de um dado polímero é designado em relação a sequência de referência em vez da posição numérica atual do resíduo dentro da sequência de aminoácido ou polinucleotídeo.
[0296] Por exemplo, uma dada sequência de aminoácido, tal como aquela da cepa de C. difficile do tipo selvagem hipervirulenta, pode ser alinhada para uma sequência de referência (por exemplo, tal como aquela da cepa de C. difficile do tipo selvagem histórica, por exemplo, 630) introduzindo espaços, se necessário, para otimizar as combinações de resíduos entre as duas sequências. Nestes casos, embora aos espaços estejam presentes, a numeração do resíduo na sequência de polinucleotídeo ou aminoácido é feita em relação a sequência de referência a qual ela foi alinhada. Como usado aqui, uma “sequência de referência” refere-se a uma sequência definida usada como base para uma comparação de sequência.
[0297] A menos que estabelecido o contrário, todas as referências aqui para as posições dos aminoácidos de um TcdA referem-se a numeração da SEQ ID NO: 1. A menos que estabelecido o contrário, todas as referências aqui às posições de aminoácido de um TcdB referem-se a numeração da SEQ ID NO: 2.
[0298] O domínio de glucosiltransferase do TcdA, como usado aqui, pode começar no resíduo exemplar 1, 101, ou 102, e pode terminar no resíduo exemplar 542, 516, ou 293 de um TcdA de C. difficile do tipo selvagem, por exemplo, a SEQ ID NO: 1. Qualquer posição de resíduo mínima pode ser combinada com uma posição de resíduo máxima entre os resíduos 1 e 542 do TcdA para definir uma sequência para o domínio de glucosiltransferase contanto que a região de motivo DXD seja incluída. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio de glucosiltransferase do TcdA inclui a SEQ ID NO: 27, que é idêntica aos resíduos 101-293 da SEQ ID NO: 1, e inclui a região de motivo DXD. Em outra modalidade, o domínio de glucosiltransferase do TcdA inclui a SEQ ID NO: 28, que é idêntica aos resíduos 1-542 da SEQ ID NO: 1.
[0299] O domínio de glucosiltransferase do TcdB, como usado aqui, pode começar no resíduo exemplar 1, 101, ou 102, e pode terminar no resíduo exemplar 543, 516, ou 293 de um TcdB de C. difficile do tipo selvagem, por exemplo, da SEQ ID NO: 2. Qualquer posição de resíduo mínimo pode ser combinada com uma posição de resíduo máximo entre os resíduos 1 e 543 do TcdB para definir uma sequência para o domínio de glucosiltransferase contanto que a região de motivo DXD seja incluída. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio de glucosiltransferase do TcdB inclui a SEQ ID NO: 29, que é idêntica aos resíduos 101-293 da SEQ ID NO: 2, e inclui a região de motivo DXD. Em outra modalidade, o domínio de glucosiltransferase do TcdB inclui a SEQ ID NO: 30, que é idêntica aos resíduos 1-543 da SEQ ID NO: 2.
[0300] Sem estar limitado pelo mecanismo ou pela teoria, acredita- se que o N-terminal do TcdA e/ou TcdB seja clivado por um processo autoproteolítico para o domínio de glucosiltransferase ser translocado e liberado no citosol da célula hospedeira, onde pode interagir com Rac/Ras/Rho GTPases. O TcdA de C. difficile do tipo selvagem tem mostrado ser clivado entre L542 e S543. O TcdB de C. difficile do tipo selvagem tem mostrado ser clivado entre L543 e G544.
[0301] O domínio de protease de cisteína é associado com uma atividade protreolítica autocatalítica da toxina. O domínio de protease de cisteína é localizado abaixo do domínio de glucosiltransferase e pode ser caracterizado pelo aspartato tríade catalítico, histidina e cisteína (DHC), por exemplo, D589, H655, e C700 de um TcdA do tipo selvagem, e D587, H653, e C698 de um TcdB do tipo selvagem. Sem estar limitado pelo mecanismo ou pela teoria, acredita-se que a tríade catalítica é conservada entre a toxina de uma cepa “histórica”, tal 630, e o TcdB de uma cepa hipervirulenta, tal como R20291.
[0302] O domínio de protease de cisteína de TcdA, como usado aqui, pode iniciar no resíduo exemplar 543, e pode terminar no resíduo exemplar 809 769, 768, ou 767 de um TcdA do tipo selvagem, por exemplo, SEQ ID NO: 1. Qualquer posição de resíduo mínima pode ser combinada com uma posição de resíduo máxima entre 543 e 809 do TcdA do tipo selvagem para definir uma sequência para o domínio de protease de cisteína contanto que a região de motivo DHC de tríade catalítica seja incluída. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio de protease de cisteína do TcdA inclui a SEQ ID NO: 32, que tem a região de motivo DHC localizada nos resíduos 47, 113, e 158 da SEQ ID NO: 32, que correspondem respectivamente a D589, H655, e C700 de um TcdA do tipo selvagem de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. A SEQ ID NO: 32 é idêntica aos resíduos de 543 a 809 da SEQ ID NO: 1, TcdA.
[0303] O domínio de protease de cisteína do TcdB, como usado aqui, pode iniciar no resíduo exemplar 544, e pode terminar no resíduo exemplar 801, 767, 755, ou 700 de um TcdB do tipo selvagem, por exemplo, a SEQ ID NO: 2. Qualquer posição de resíduo mínima pode ser combinada com uma posição de resíduo máxima entre 544 e 801 de um TcdB do tipo selvagem para definir a sequência para o domínio de protease de cisteína contanto que a região de motivo DHC de tríade catalítica seja incluída. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio de protease de cisteína do TcdB inclui a SEQ ID NO: 33, que inclui a região de motivo DHC localizada nos resíduos 44, 110, e 115 da SEQ ID NO: 33, que correspondem respectivamente a D587, H653, e C698 de um TcdB do tipo selvagem de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. A SEQ ID NO: 33 é idêntica aos resíduos 544 a 767 da SEQ ID NO: 2, TcdB. Em outra modalidade, o domínio de protease de cisteína do TcdB inclui os resíduos 544-801 da SEQ ID NO: 2, TcdB. TOXINA MUTANTE
[0304] Na presente invenção, a composição imunogênica inclui uma toxina de C. difficile mutante. O termo “mutante,” como usado aqui, refere-se a uma molécula que exibe uma estrutura ou sequência que seja diferente da sequência ou estrutura do tipo selvagem correspondente, por exemplo, tendo ligações em cruz quando comparado a estrutura do tipo selvagem correspondente e/ou tendo pelo menos uma mutação, quando comparado a sequência do tipo selvagem correspondente quando otimamente alinhados, tal como pelo programa GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão. O termo “mutante” como usado aqui ainda inclui uma molécula que exibe uma propriedade funcional (por exemplo, uma glucosiltransferase revogada e/ou uma atividade de protease de cisteína revogada) que difere da molécula do tipo selvagem correspondente.
[0305] Uma toxina de C. difficile a partir de qualquer uma das cepas de tipo selvagem descritas acima pode ser usada como uma fonte da qual uma toxina C. difficile mutante é produzida. Preferencialmente, C. difficile 630 és uma fonte da qual uma toxina C. difficile mutante é produzida.
[0306] A mutação pode envolver uma substituição, deleção, truncamento ou modificação dos resíduos de aminoácidos do tipo selvagem normalmente localizados naquela posição. Preferencialmente, a mutação é uma substituição de aminoácido não conservativa. A presente invenção também contempla os polinucleotídeos isolados que incluem as sequências de ácido nucléico codificando qualquer uma das toxinas mutantes descritas aqui.
[0307] Uma substituição de aminoácido “não conservativa”, como usado aqui, refere-se a uma troca de um aminoácido de uma classe por um aminoácido de uma outra classe, de acordo com a seguinte tabela 3:
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[0308] Os exemplos de uma substituição de aminoácido não conservativo incluem uma substituição sendo que um resíduo de ácido aspártico (Asp, D) é substituído por um resíduo de alanina (Ala, A). Outros exemplos incluem a substituição do resíduo de ácido aspártico (Asp, D) por um resíduo de asparagina (Asn, N); substituindo um resíduo de arginina (Arg, R), ácido glutâmico (Glu, E), lisina (Lys, K), e/ou histidina (His, H) com um resíduo de alanina (Ala, A).
[0309] Uma substituição conservativa refere-se a uma troca entre aminoácidos da mesma classe, por exemplo, de acordo com a Tabela 3.
[0310] As toxinas mutantes da invenção podem ser preparadas por técnicas conhecidas na arte para preparar as mutações, tais como, por exemplo, mutagênese direcionada ao local, mutagênese usando um mutagênico (por exemplo, luz UV), etc. Preferencialmente, a mutagênese direcionada ao local é usda. Alternativamente, uma molécula de ácido nucléico tendo uma sequência objetiva pode ser diretamente sintetizada. Tais métodos de síntese química são conhecidos na arte.
[0311] Na presente invenção, a toxina de C. difficile mutante inclui pelo menos uma mutação em um domínio de glucosiltransferase, relativo a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade, o domínio de glucosiltransferase inclui pelo menos duas mutações. Preferencialmente, a mutação diminui ou revoga a atividade de enzima de glucosiltransferase da toxina, quando comparado a atividade de enzima de glucosiltransferase da toxina C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0312] Os resíduos de aminoácidos exemplares em um domínio de glucosiltransferase do TcdA que pode se submeter a uma mutação incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: W101, D269, R272, D285, D287, E460, R462, S541, e L542, quando comparado ao TcdA de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Os resíduos de aminoácidos exemplares que podem se submeter a uma mutação incluem E514, S517, e W519, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1.
[0313] As mutações exemplares em um domínio de gluucosiltransferase do TcdA incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: W101A, D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A, S541A, e L542G, TcdA de C. difficile do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, o domínio de glucosiltransferase do TcdA inclui uma mutação L542G, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem. Em outra modalidade preferida, o domínio de glucosiltransferase do TcdA inclui uma mutação D285A e uma D287A, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem.
[0314] Os resíduos de aminoácidos exemplares em um domínio de glucosiltransferase do TcdB que pode se submeter a uma mutação incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: W102, D270, R273, D286, D288, N384, D461, K463, W520, e L543, quando comparado a uma toxina B de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. Outros resíduos de aminoácidos exemplares que podem se submeter a uma mutação incluem E515, S518, e W520, quando comparado a uma toxina B de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2.
[0315] As mutações exemplares em um domínio de glucosiltransferase do TcdB incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: W102A, D270A, D270N, R273A, D286A, D288A, N384A, D461A, D461R, K463A, K463E, W520A, e L543A, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, o domínio de glucosiltransferase do TcdB inclui um L543A, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem. Em outra modalidade preferida, o domínio de glucosiltransferase do TcdB inclui uma mutação D286A e uma mutação D288A, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem.
[0316] Qualquer uma das mutações descritas aqui acima pode ser combinada com uma mutação em um domínio de protease de cisteína. Na presente invenção, uma toxina de C. difficile mutante inclui pelo menos uma mutação em um domínio de protease de cisteína, relativo a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, a mutação diminui ou revoga a atividade de protease de cisteína da toxina, quando comparado a uma atividade de protease de cisteína de uma toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0317] Os resíduos de aminoácidos exemplares em um domínio de protease de cisteína do TcdA que podem se submeter a uma mutação incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: S543, D589, H655, e C700, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. As mutações exemplares em um domínio de glucosiltransferase do TcdA incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: S543A, D589A, D589N, H655A, C700A, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, o domínio de protease de cisteína do TcdA inclui uma mutação C700A, quando comparado a um TcdA de C. difficile do tipo selvagem.
[0318] Os resíduos de aminoácidos exemplares em um domínio de protease de cisteína do TcdB que podem se submeter a uma mutação incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: G544, D587, H653, e C698, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. As mutações exemplares em um domínio de glucosiltransferase do TcdB incluem pelo menos um dos seguintes, ou qualquer combinação dos mesmos: G544A, D587A, D587N, H653A, C698A, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, o domínio de protease de cisteína do TcdB inclui uma mutação C698A, quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem. Os resíduos de aminoácidos adicionais em um domínio de protease de cisteína do TcdB que podem se submeter a uma mutação incluem: K600 e/ou R751, quando comparado a um TcdB do tipo selvagem. As mutações exemplares incluem K600E e/ou R751E.
[0319] Portanto, a toxina de C. difficile mutante inventiva inclui um domínio de glucosiltransferase tendo uma mutação e um domínio de protease de cisteína tendo uma mutação, relativa a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade, a toxina mutante inclui pelo menos uma mutação no domínio de glucosiltransferase e pelo menos uma mutação no domínio de protease de cisteína. Em uma modalidade preferida, a toxina mutante A inclui pelo menos uma mutação D285, D287, e C700. Em uma modalidade preferida, a toxina mutante B inclui pelo menos uma mutação D286, D288, e C698. As toxinas mutantes podem incluem qualquer outra, individualmente ou em combinação, descritos aqui.
[0320] Um TcdA C. difficile mutante exemplar inclui um domínio de glucosiltransferase incluindo a SEQ ID NO: 29 tendo uma substituição de aminoácido nas posições 285 e 287, e um domínio de protease de cisteína compreendendo a SEQ ID NO: 32 tendo uma substituição de aminoácido na posição 158, relativa a toxina C. difficile do tipo selvagem A correspondente. Por exemplo, tal como o TcdA C. difficile mutante inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 4, sendo que a metionina inicial não está presente opcionalmente. Em outra modalidade, a toxina de C. difficile mutante A inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 84.
[0321] Outros exemplos de uma toxina de C. difficile mutante A incluem a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, que tem a mutação D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A, e C700A, quando comparado com a SEQ ID NO: 1, sendo que a metionina inicial não está presente opcionalmente. Em outra modalidade, a toxina C. difficile mutante A inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 83.
[0322] Outro TcdA mutante exemplar inclui a SEQ ID NO: 34, sendo que o resíduo nas posições 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655, e 700 pode ser qualquer aminoácido.
[0323] Em algumas modalidades, a toxina de C. difficile mutante exibe um processamento autoproteolítico diminuído ou revogado quando comparado com a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Por exemplo, o TcdA de C. difficile mutante pode incluir uma mutação em um dos seguintes resíduos, ou qualquer combinação dos mesmos: S541, L542 e/ou S543, quando comparado com o TcdA de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, o TcdA C. difficile mutante inclui pelo menos um dos seguintes mutations, ou qualquer combinação dos mesmos: S541A, L542G, e S543A, quando comparado com o TcdA de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0324] Outro TcdA C. difficile mutante exemplar inclui uma mutação S541A, L542, S543 e C700, quando comparado com o TcdA de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0325] Uma toxina de C. difficile mutante B exemplar inclui um domínio de glucosiltransferase compreendendo a SEQ ID NO: 31 tendo uma substituição de aminoácido nas posições 286 e 288, e um domínio de protease de cisteína compreendendo a SEQ ID NO: 33 tendo uma substituição de aminoácido na posição 155, relativa a toxina C. difficile do tipo selvagem B correspondente. Por exemplo, tal TcdB de C. difficile mutante inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 6, sendo que a metionina inicial não está presente opcionalmente. Em outra modalidade, a toxina C. difficile mutante A inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 86.
[0326] Outros exemplos de um Tcdb de C. difficile mutante incluem a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 8, que tem a mutação D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A, e C698A, quando comparado com a SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 8 sendo que a metionina inicial não está presente opcionalmente. Em outra modalidade, a toxina C. difficile mutante A inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 85.
[0327] Outro exemplo de TcdB mutante inclui a SEQ ID NO: 35, sendo que o resíduo nas posições 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655, e 700 pode ser qualquer aminoácido.
[0328] Como outro exemplo, um Tcdb de C. difficile mutante pode incluir uma mutação nas posições 543 e/ou 544, quando comparado com a o TcdB de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, o Tcdb de C. difficile mutante inclui uma mutação L543 e/ou G544, quando comparado com o TcdB de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Mais preferencialmente, o Tcdb de C. difficile mutante inclui uma mutação L543G e/ou G544A, quando comparado com o TcdB de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0329] Outro exemplo de Tcdb de C. difficile mutante inclui uma mutação L543G, G544A e C698, quando comparado com o TcdB de C. difficile do tipo selvagem correspondente.
[0330] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado tendo uma mutação em qualquer posição a partir dos resíduos de aminoácidos de 1 a 1500 de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2, para definir uma toxina de C. difficile mutante B exemplar. Por exemplo, em uma modalidade, o polipeptídio isolado inclui uma mutação entre os resíduos de aminoácido 830 e 990 da SEQ ID NO: 2. As posições exemplares para as mutações incluem as posições 970 e 976 de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, a mutação entre os resíduos 830 e 990 é uma substituição. Em uma modalidade, a mutação é uma substituição não conservativa sendo que um resíduo de aminoácido Asp (D) e/ou a Glu (E) é substituído por um resíduo de aminoácido que não seja neutralizado após a acidificação, tal como, por exemplo, lisina (K), arginina (R), e histidina (H). As mutações exemplares incluem: E970K, E970R, E970H, E976K, E976R, E976H da SEQ ID NO: 2, para definir uma toxina de C. difficile mutante B.
[0331] Em uma modalidade, o polipeptídeio isolado inclui as seguintes substituições D286A/D288A/C698A/E970K/E976K (SEQ ID NO: 184). O E970 e E976 são conservados na toxina B de todas as cepas de C. difficile observadas (veja tabela 2-a, SEQ ID NOs: 110133), exceto nas cepas do ribotipo 078 e do ribotipo 126 (veja tabela 35 e Tabela 37). Nas toxinas B das cepas do ribotipo 078 e do ribotipo 126, há uma glicina-970 (G970) em vez de glutamato-970. Portanto, em uma modalidade, o polipeptídio isolado inclui uma mutação no G970 e E976, tal como, por exemplo, G970K e E976K. As toxinas mutantes descritas acima e aqui podem exibir uma citotoxidade reduzida quando comparado com a toxina do tipo selvagem correspondente. Veja Exemplos 8 e 15).
[0332] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado tendo uma mutação em qualquer posição a partir dos resíduos de aminoácidos de 1 a 1500 de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1, para definir um a toxina de C. difficile mutante A exemplar. Por exemplo, em uma modalidade, o polipeptídio isolado inclui uma mutação entre os resíduos de aminoácido 832 e 992 da SEQ ID NO: 1. As posições exemplares para as mutações incluem as posições 972 e 978 de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a mutação entre os resíduos 832 e 992 é uma substituição. Em uma modalidade, a mutação é uma substituição não conservativa sendo que um resíduo de aminoácido Asp (D) e/ou a Glu (E) é substituído por um resíduo de aminoácido que não seja neutralizado após a acidificação, tal como, por exemplo, lisina (K), arginina (R), e histidina (H). As mutações exemplares incluem: D972K, D972R, D972H, D978K, D978R, D978H da SEQ ID NO: 1, para definir uma toxina de C. difficile mutante A.
[0333] Em uma modalidade, o polipeptídio isolado inclui as seguintes substituições D285A/D287A/C700A/D972K/D978K (SEQ ID NO: 183). Os resíduos D972 e D978 são conservados em uma toxina A a partir de todas as cepas de C. difficile avaliadas (veja tabela 1-a, SEQ ID NOs: 87-109). As toxinas mutantes descritas acima e aqui podem exibir uma citotoxidade reduzida quando comparado com a toxina do tipo selvagem correspondente.
[0334] O seguinte descreve toxinas mutantes exemplares adicionais. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA inclui (i) a SEQ ID NO: 185; (ii) um polipeptídio da SEQ ID NO:185 tendo pelo menos 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:185; ou (iii) um fragmentoo de pelo menos 250, 280 ou 300 aminoácidos da SEQ ID NO:185. Em outra modalidade, a toxina mutante TcdB inclui (iv) a SEQ ID NO:186; (v) um polipeptídio da SEQ ID NO:186 tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:186; ou (vi) um fragmentoo de pelo menos 250, 280 ou 300 aminoácidos da SEQ ID NO:186.
[0335] Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA consiste de menos do que 600, 675, 650, 625, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, ou 225 aminoácidos. Em uma modalidade, a toxina mutante consiste de menos do que 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, 600, 575, 550, ou 525 aminoácidos. Em uma modalidade, a toxina mutante inclui pelo menos 200, 225, 250, 270, 280, 300 ou 310 aminoácidos da SEQ ID NO:185 ou pelo menos 200, 225, 250, 270, 280, 300 ou 310 aminoácidos de um polipeptídio tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:185. Em uma modalidade a toxina mutante inclui pelo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 ou 610 aminoácidos da SEQ ID NO: 186 ou pelo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 ou 610 aminoácidos de um polipeptídio tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:186.
[0336] Em uma modalidade, a toxina mutante inclui uma proteína de fusão que inclui A) (i) SEQ ID NO:185 ; (ii) um polipeptídio da SEQ ID NO:185 tendo pelo menos 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:185; ou (iii) um fragmentoo de pelo menos 250, 280 ou 300 aminoácidos da SEQ ID NO:185 fundido a B) (iv) SEQ ID NO:186;(v) um polipeptídio da SEQ ID NO:186 tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:186; ou (vi) um fragmentoo de pelo menos 250, 280 ou 300 aminoácidos da SEQ ID NO:186. Em uma outra modalidade o N-terminal da SEQ ID NO: 185 é adjacente ao C- terminal da SEQ ID NO: 186. Em uma outra modalidade o N-terminal da SEQ ID NO: 185 é adjacente ao N-terminal da SEQ ID NO: 186. Em uma outra modalidade o C-terminal da SEQ ID NO:185 é adjacente ao C-terminal da SEQ ID NO:186. Outros exemplos de uma toxina mutante incluem um polipeptídio tendo qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, e SEQ ID NO: 195.
[0337] Em outra modalidade, a toxina mutante inclui um polipeptídio hibrido e/ou fusão que inclui qualquer combinação das sequências de aminoácidos selecionadas a partir de qualquer um dos seguintes: SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236. SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, e SEQ ID NO: 243. Por exemplo, em uma modalidade, a toxina mutante inclui uma sequência de aminoácido como estabelecida em qualquer um dos seguintes: SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, ou SEQ ID NO: 275.
[0338] Outro exemplo de um a toxina mutante inclui um fragmentoo de uma toxina do tipo selvagem. Um “fragmentoo” da toxina mutante TcdA como usado aqui refere-se a uma sequência de peptídeo que tenha menos aminoácidos consecutivos totais do que a sequência de toxina TcdA de C. difficile do tipo selvagem correspondente, por exemplo, uma sequência que inclua menos do que 2710 aminoácidos consecutivos totais. O fragmentoo da toxina mutante TcdA pode ainda incluir uma mutação de um resíduo de aminoácido como descrito aqui. Um “fragmentoo” de uma toxina mutante TcdB como usado aqui refere-se a uma sequência de peptídeo que tenha menos aminoácidos consecutivos totais do que a sequência de toxina TcdB de C. difficile do tipo selvagem correspondente, por exemplo, uma sequência que inclua menos do que 2366 aminoácidos totais consecutivos. O fragmentoo da toxina mutante TcdB pode ainda incluir uma mutação de um resíduo de aminoácido como descrito aqui. Tais sequências de toxina mutante exemplares incluem SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA inclui pelo menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 2000 aminoácidos consecutivos de uma toxina mutante A do tipo selvagem, como descrito aqui, por exemplo, na SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a toxina mutante inclui um fragmentoo de uma toxina A mutada geneticamente descrita aqui. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdB inclui pelo menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 2000 aminoácidos consecutivos de uma toxina mutante B do tipo selvagem, como descrito aqui, por exemplo, na SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a toxina mutante inclui um fragmentoo de uma toxina B mutada geneticamente descrita aqui. Em uma modalidade, a toxina mutante inclui no máximo 3000, 2710, 2500, 2400, 2366, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, ou 300 aminoácidos consecutivos. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor mínimo para definir uma taxa compatível. Em outra modalidade, a toxina mutante é fundida em pelo menos um outro peptídeo ou pelo menos uma outra toxina mutante de uma maneira que resulte na produção de uma molécula hibrida.
[0339] O fragmentoo exemplar adicional da toxina mutante TcdA inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 374 até a SEQ ID NO: 421. Outro fragmentoo exemplar de uma toxina mutante TcdA inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 472 até a SEQ ID NO: 519. Os exemplos adicionais da toxina mutante TcdB incluem um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 422 até a SEQ ID NO: 471. Outro exemplo de fragmentoo de toxina mutante TcdB inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 568 até a SEQ ID NO: 615.
[0340] O seguinte descreve outro exemplo de toxinas mutantes. Em uma modalidade, a toxina mutante inclui um TcdA que inclui ou consiste de pelo menos 3, pelo menos 4, ou pelo menos 5 mutações de resíduos de aminoácidos selecionadas a partir de um grupo consistindo de: W101, D287, E514, D285, S517, W519, e C700, por exemplo, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Nas modalidades adicionais; os mutantes de TcdA incluem ou consistem de pelo menos 3, pelo menos 4, ou pelo menos 5 mutações selecionadas a partir de um grupo consistindo de: substituições W101A, D287A, E514Q, D285A, S517A, W519A, e C700A substituições e uma deleção W101.
[0341] Outro exemplo de toxina mutante TcdA inclui as substituições de aminoácidos W101, D287A, e E514Q, por exemplo, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Uma outra modalidade proporciona uma proteína de TcdA incluindo ou consistindo de substituições de aminoácido W101A, D287A, E514Q, e W519A. outra modalidade específica da invenção é uma proteína TcdA incluindo ou consistindo de substituições de aminoácido W101A, D287A, E514Q, W519A, e C700A.
[0342] Em outra modalidade, a toxina mutante TcdA inclui as mutações W101A, D287A, E514Q e D285A, por exemplo, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a toxina mutante TcdA inclui as mutações W101A, D287A, E514Q e S517A.
[0343] Em outra modalidade, uma outra mutação pode ser adicionada a um TcdA mutante, por exemplo, uma mutação C700A. em modalidades adicionais, até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 outras mutações podem ser adicionadas a qualquer toxina mutante TcdA das modalidades descritas aqui.
[0344] Outros exemplos de uma toxina mutante TcdA incluem a sequência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, ou SEQ ID NO: 211. Em outra modalidade, a toxina mutante TcdA inclui a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 210. Ainda em outra modalidade, a toxina mutante TcdA inclui uma mutação nas posições W101, D287, E514, W519 e C700; sendo que W101 é substituído com qualquer aminoácido exceto triptofano, D287 é substituído com um aminoácido, mas ácido aspártico, E514 é substituído com qualquer aminoácido, mas ácido glutâmico, W519 é substituído com qualquer aminoácido, mas triptofano e C700 é substituído com qualquer aminoácido, mas cisteína, como estabelecido na SEQ ID NO: 212.
[0345] Os exemplos adicionais de uma toxina mutante TcdA incluem um polipeptídio tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou em pelo menos 99% idêntica a sequência de referência original (por exemplo, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 ou SEQ ID NO: 212 ou SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 86).
[0346] Em uma outra modalidade, a toxina mutante TcdA inclui mutações em mais do que 12 resíduos de aminoácidos, em mais do que 11 resíduos de aminoácidos, em mais do que 10 resíduos de aminoácidos, em mais do que 9 resíduos de aminoácidos, em mais do que 8 resíduos de aminoácidos, em mais do que 7 resíduos de aminoácidos, em mais do que 6 resíduos de aminoácidos, em mais do que 5 resíduos de aminoácidos, em mais do que 4 resíduos de aminoácidos, em mais do que 3 resíduos de aminoácidos, em mais do que 2 resíduos de aminoácidos, ou 1 resíduo de aminoácidos, por exemplo, relativo a SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 e SEQ ID NO: 212 ou SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 86.
[0347] O seguinte descreve outras toxinas mutantes exemplares. Em uma modalidade, a toxina mutante é um TcdB mutante que inclui pelo menos 3, pelo menos 4, ou pelo menos 5 mutações nos resíduos de aminoácidos selecionadas a partir de um grupo consistindo de: W102, D288, E515, D286, S518, W520, e C698, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a toxina mutante TcdB inclui pelo menos 3, pelo menos 4, ou pelo menos 5 mutações selecionadas a partir de um grupo consistindo de: substituições de W102A, D288A, E515Q, D286A, S518A, W520A, e C698A e uma deleção de W102. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdB inclui a sequência de aminoácido estabelecido na SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, ou SEQ ID NO: 221. Ainda em outra modalidade, a toxina mutante TcdB inclui uma mutação nas posições W102, D288, E515, W520 e C698; sendo que W102 é substituído por qualquer aminoácido exceto triptofano, o D288 é substituído por qualquer aminoácido, mas ácido aspártico, o E515 é substituído por qualquer aminoácido, mas ácido glutâmico, o W520 é substituído por qualquer aminoácido, mas triptofano e o C698 é substituído por qualquer aminoácido, mas cisteína, como estabelecido na SEQ ID NO: 222.
[0348] Os exemplos adicionais de uma toxina mutante TcdB incluem um polipeptídio tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a sequência original de referência da SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, ou SEQ ID NO: 222.
[0349] Em uma outra modalidade, a toxina mutante TcdB inclui mutações em mais do que 12 resíduos de aminoácidos, em mais do que 11 resíduos de aminoácidos, em mais do que 10 resíduos de aminoácidos, em mais do que 9 resíduos de aminoácidos, em mais do que 8 resíduos de aminoácidos, em mais do que 7 resíduos de aminoácidos, em mais do que 6 resíduos de aminoácidos, em mais do que 5 resíduos de aminoácidos, em mais do que 4 resíduos de aminoácidos, em mais do que 3 resíduos de aminoácidos, em mais do que 2 resíduos de aminoácidos, ou 1 resíduo de aminoácido, por exemplo, relativo a SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, e/ou SEQ ID NO: 222.
[0350] Um exemplo adicional de toxina mutante TcdA inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 276 até a SEQ ID NO: 323. O exemplo adicional de uma toxina mutante TcdB inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 324 até a SEQ ID NO: 373.
[0351] O seguinte descreve outro exemplo de toxinas mutantes. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA inclui uma sequência de aminoácido: (a) tendo 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, ou 100%) para a SEQ ID NO: 224 ou SEQ ID NO: 245; e/ou b) que é um fragmentoo de pelo menos "n" aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 224 ou SEQ ID NO: 245, sendo que "n" é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540, ou mais).ou de um polipeptídio tendo 80% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 224 ou a SEQ ID NO: 245 e que compreende um epítopo da SEQ ID NO: 224 e/ou SEQ ID NO: 245.
[0352] Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, ou SEQ ID NO: 236. As modalidades exemplares adicionais de uma toxina mutante TcdA inclui a sequência de aminoácido estabelecida em qualquer um dos seguintes: SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, e/ou SEQ ID NO: 263.
[0353] Em uma modalidade, a toxina mutante TcdB inclui uma sequência de aminoácido (a) tendo 80% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247; e/ou b) que é um fragmentoo de pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247, ou de um polipeptídio tendo 80% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247 e que compreende um epítopo da SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247.
[0354] Em uma modalidade, a toxina mutante TcdB inclui uma sequência de aminoácido: (a) tendo 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, ou mais) par a SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247; e/ou (b) que é um fragmentoo de pelo menos "n" aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247, ou de um polipeptídio tendo 50% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 247, sendo que "n" é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540, ou mais).
[0355] Em uma modalidade, a toxina mutante TcdB inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, ou SEQ ID NO: 243. As modalidades de exemplos adicionais de uma toxina mutante TcdB inclui a sequência de aminoácido estabelecida em qualquer uma das seguintes: SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, e/ou SEQ ID NO: 269.
[0356] Um exemplo adicional da toxina mutante TcdA inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 520 até a SEQ ID NO: 567. Os exemplos adicionais de uma toxina mutante TcdB incluem um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 616 até a SEQ ID NO: 663.
[0357] O seguinte descreve ainda exemplos adicionais das toxinas mutantes. Em uma modalidade, a toxina mutante TcdA inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 664 até a SEQ ID NO: 711. Os exemplos adicionais de uma toxina mutante TcdB incluem um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 712 até a SEQ ID NO: 761.
[0358] Os polipeptídios da invenção podem incluir um resíduo de metionina inicial, em alguns casos como um resultado de um processo mediado por célula hospedeira. Dependendo, por exemplo, da célula hospedeira usada em um procedimento de produção recombinante e/ou a fermentação ou condições de crescimento da célula hospedeira, é conhecido na arte que a metionina de N-terminal codificada pelo códon de iniciação de tradução pode ser removida de um polipeptídio após a tradução em células ou a metionina de N- terminal pode permanecer presente em um polipeptídio isolado.
[0359] Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado incluindo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 4, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em uma modalidade, a metionina inicial da SEQ ID NO: 4 está ausente. Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado incluindo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 84, que é idêntico a SEQ ID NO: 4, mas para uma ausência da metionina inicial.
[0360] Em outro aspecto, o polipeptídio isolado inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 6, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em uma modalidade, a metionina inicial da SEQ ID NO: 6 está ausente. Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado incluindo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 86, que é idêntico a SEQ ID NO: 6, mas para uma ausência de uma metionina inicial.
[0361] Em um outro aspecto, o polipeptídio isolado inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado incluindo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 83, que é idêntico a SEQ ID NO: 7, mas para uma ausência de uma metionina inicial. Ainda em outro aspecto, o polipeptídio isolado inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 8, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em uma modalidade, o polipeptídio isolado inclui a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 85, que é idêntico a SEQ ID NO: 8, mas para uma ausência de uma metionina inicial.
[0362] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 4, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 6, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 7, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente. Ainda em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 8, sendo que a metionina inicial (na posição 1) não está presente opcionalmente.
[0363] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 83. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 84. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 85. Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 86.
CITOTOXIDADE
[0364] Além de gerar uma resposta imune em um mamífero, as composições imunogênicas descritas aqui descritas aqui também têm reduzido a citotoxidade comparado a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, as composições imunogênicas são seguras e tem uma citotoxidade de mínima a nenhuma (por exemplo, cerca de 6-8 log10 de redução), relativo a citotoxidade de uma toxina do tipo selvagem respectiva, para administração em mamíferos.
[0365] Como usado aqui, o termo citotoxidade é um termo entendido na arte e refere-se a uma morte de célula apoptótica e/ou um estado em que uma ou mais funções biológicas ou bioquímicas usuais de uma célula são aberrantemente comprometidas, quando comparado a uma célula idêntica sob condições idênticas, mas na ausência do agente citotóxico. A toxicidade pode ser quantificada, por exemplo, em células ou em mamíferos uma vez que a quantidade de um agente necessária para induzir 50% de morte celular (isto é, EC50 ou ED50, respectivamente) ou por outros métodos conhecidos na arte.
[0366] Os ensaios para indicar a citotoxidade são conhecidos na arte, tais como os ensaios de arredondamento celular (veja, por exemplo, Kuehne et al. Nature. 7 de Outubro de 2010; 467(7316):711- 3). A ação do TcdA e do TcdB faz com que as células arredondem (por exemplo, perde morfologia) e morram, e tal fenômeno é visível pela luz do microscópio. Veja, por exemplo, a Figura 9.
[0367] Os ensaios de citotoxidadeexemplares adicionais conhecidos na arte incluem ensaios de glicosilação relativos a imagiologia com fósforo de Ras marcado com [14C]ensaios de glicose (como descrito em Busch et al., J Biol Chem. 31 de julho de 1998; 273(31):19566-72), e preferencialmente o ensaio de citotoxidade in vitro Exemplos abaixo sendo que EC50 pode se referir a uma concentração de uma composição imunogênica composição imunogênica que exibe pelo menos cerca de 50% de efeito citopatogênico (CPE) em uma célula, preferencialmente uma célula de fibroblasto diploide humano (por exemplo, uma célula IMR90 (ATCC CCL-186TM), quando comparada a uma célula idêntica sob condições idênticas na ausência da toxina. O ensaio de citotoxidade in vitro também pode ser usado para avaliar a concentração de uma composição que iniba pelo menos cerca de 50% de um efeito citopatogênico induzido por toxina de C. difficile do tipo selvagem (CPE) em uma célula, preferencialmente uma célula de fibroblasto diplóide humana (por exemplo, uma célula IMR90 (ATCC CCL-186TM), quando comparado a uma célula idêntica sob condições idênticas na ausência da toxina. Os ensaios de citotoxidade exemplares adicionais incluem aqueles descritos em Doern et al., J Clin Microbiol. Agosto 1992; 30(8):2042-6. A citotoxidade também pode ser determinada medindo os níveis de ATP nas células tratadas com toxina. Por exemplo, um substrato com base em luciferase tais como CELLTÍTULOGLO® (Promega) pode ser usado, que emite uma luminescência medida como uma unidade de luz relativa (RLU). Em tal ensaio, a viabilidade da célula pode ser direcionada proporcional a quantidade de ATP nas células ou nos valores de RLU.
[0368] Em uma modalidade, a citotoxidade da composição imunogênica é reduzida por pelo menos cerca de 1000, 2000, 3000, 4000, 5000-, 6000-, 7000-, 8000-, 9000-, 10000-, 11000-, 12000-, 13000-dobras, 14000-dobras, 15000-dobras, ou mais, quando comparado a toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Veja, por exemplo, Tabela 20.
[0369] Em uma outra modalidade, a citotoxidade da composição imunogênica é reduzida por pelo menos cerca de 2-log10, mais preferencialmente por cerca de 3-log10, e mais preferencialmente por cerca de 4-log10 ou mais, relativo a toxina do tipo selvagem correspondente sob condições idênticas. Por exemplo, um TcdB de C. difficile mutante pode ter um valor EC50 de cerca de 10-9 g/ml como medido em um ensaio de efeito citopático padrão (CPE), quando comparado a um TcdB de C. difficile do tipo selvagem exemplar que pode ter um valor EC50 de pelo menos cerca de 10-12 g/ml. Veja, por exemplo, Tabelas 7A, 7B, 8A e 8B nos exemplos da seção abaixo.
[0370] Ainda em outra modalidade, a citotoxidade da toxina de C. difficile mutante tem um EC50 de pelo menos cerca de 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1000 μg/ml ou maior, como medido por, por exemplo, um ensaio de citotoxidade in vitro, tais como um descrito aqui. Portanto, em uma modalidade preferida, as composições imunogênicas e as toxinas mutantes são biologicamente seguras para a administração a mamíferos.
[0371] Sem estar limitado pelo mecanismo ou teoria, um TcdA tendo uma mutação D285 e D287, quando comparado ao TcdA do tipo selvagem, e um TcdB tendo uma mutação D286 e uma D288, quando comparado ao TcdB do tipo selvagem, esperava-se que fossem defeituosos na atividade de glicosiltransferase e, portanto, defeituosos na indução de um efeito citopático. Além disso, uma toxina tendo uma mutação no motive DHC foi esperada como sendo defeituosa no processamento autocatalítico, e, portanto, estar sem qualquer efeito citotóxico.
[0372] Entretanto, os inventores surpreendentemente descobriram, entre outras coisas, que o TcdA mutante exemplar tendo a SEQ ID NO: 4 e o TcdB mutante exemplar tendo a SEQ ID NO: 6 exibiram inesperadamente uma citotoxidade (embora reduzido significantemente das toxinas de C. difficile 630 do tipo selvagem) em vez de exibir uma atividade de glucosiltransferase disfuncional e uma atividade de protease de cisteína disfuncional. Sem estar limitado pelo mecanismo ou teoria, acredita-se que as toxinas mutantes afetem a citotoxidade através de um novo mecanismo. Apesar disso, o TcdA mutante exemplar tendo a SEQ ID NO: 4 e o TcdB mutante exemplar tendo a SEQ ID NO: 6 foram surpreendentemente imunogênicos. Veja os exemplos abaixo.
LIGAÇÃO EM CRUZ
[0373] Embora as ligações cruz químicas de uma toxina do tipo selvagem tenham um potencial de falhar na inatividade da toxina, os inventores ainda descobriram que a ligação cruzada quimicamente de pelo menos um aminoácido de uma toxina mutante ainda reduz a citotoxidade de uma toxina mutante, relativo a uma toxina mutante com carência de ligações em cruz químicas, e relativo a toxina do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, a toxina mutante é purificada antes do contato com o agente de ligação em crua química.
[0374] Além disso, em vez de um potencial dos agentes de ligação em cruz química para alterar os epítopos úteis, os inventores surpreendentemente descobriram que a toxina de C. difficile mutante modificada geneticamente tendo pelo menos um aminoácido quimicamente ligado em cruz resultou em composições imunogênicas que provocaram anticorpos de neutralização múltiplos ou fragmentos de ligação do mesmo. Portanto, os epítopos associados com as moléculas de anticorpos de neutralização associados a epítopos foram inesperadamente retidas seguindo a ligação em cruz química.
[0375] A ligação em cruz (também referida como uma “inativação química” ou “inativação” aqui) é um processo de juntar quimicamente duas ou mais moléculas por uma ligação covalente. Os termos “reagentes de ligação em cruz,” “agentes de ligação em cruz,” e “ligadores em cruz” referem-se a moléculas que são capazes de reagir com e/ou anexar quimicamente a grupos funcionais (aminas primárias, sulfidrilos, carboxils, carbonils, etc) nos peptídeos, polipeptídios, e/ou proteínas. Em uma modalidade, a molécula pode conter dois ou mais finais reativos que são capazes de reagir com e/ou quimicamente anexar a grupos funcionais específicos (aminas primárias, fulfidrilos, carboxils, carbonils, etc) nos peptídeos, nos polipeptídeos e/ou proteínas. Preferencialmente, o agente de ligação em cruz química é solúvel em água. Em outra modalidade preferida, o agente de ligação em cruz química é um ligador em cruz heterobifuncional. Em uma outra modalidade, o agente de ligação em cruz química não é um ligador em cruz bifuncional. Os agentes de ligação em cruz químicos são conhecidos na arte.
[0376] Em uma modalidade preferida, o agente de ligação em cruz é um agente de ligação em cruz de comprimento zero. Um ligador em cruz de “comprimento zero” refere-se a um agente de ligação em cruz que mediará ou produzirá uma ligação em cruz direta entre os grupos funcionais de duas moléculas. Por exemplo, na ligação cruzada de dois polipeptídios, um ligador em cruz de comprimento zero resultará na formação de uma ponte, ou uma ligação em cruz entre um grupo carboxil a partir de uma cadeia de lado de aminoácido de um polipeptídio, e um grupo amino de outro polipeptídio, sem integrar a questão extrínseca. Os agentes de ligação em cruz de comprimento zero podem catalisar, por exemplo, a formação de ligações de esteres entre as metades hidroxil e carboxil, e/ou a formação de ligações de amida entre as metades carboxil e amino primárias.
[0377] Os agentes de ligação em cruz químicos compatíveis exemplares incluem formaldeído; formalinaa; acetaldeído; propionaldeído; carbodiimidas solúveis em água (RN=C=NR’), que incluem 1-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)-Carbodiimida (EDC), 1-Etil-3-(3- Dimetilaminopropil)-Carbodiimida cloridrato, 1-Ciclohexil-3-(2- morfolinil-(4-etil)carbodiimida meto-p-toluenosulfonato (CMC), N,N‘- diciclohexilcarbodiimida (DCC), e N,N‘-diisopropilcarbodiimida (DIC), e derivados dos memsos; e N-hidroxisuccinimida (NHS); fenilglioxal; e/ou UDP-dialdeído.
[0378] Preferencialmente, o agente de ligação em cruz é EDC. Quando um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante é quimicamente modificado por um EDC (por exemplo, contatando o polipeptídio com EDC), em uma modalidade, o polipeptídio inclui (a) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (b) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico de um polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (c) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e o grupo amino do N-terminal do polipeptídio. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (d) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (e) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (f) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (g) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e o grupo amino do N-terminal de um segundo polipeptídio isolado. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui (h) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado. Veja, por exemplo, a Figura 24 e a Figura 25.
[0379] O “Segundo polipeptídio isolado” refere-se a qualquer polipeptídio isolado que esteja presente durante a reação com EDC. Em uma modalidade, o segundo polipeptídio isolado é um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante tendo uma sequência idêntica a do primeiro polipeptídio isolado. Em uma outra modalidade, o segundo polipeptídio isolado é um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante tendo uma sequência diferente do primeiro polipeptídio isolado.
[0380] Em uma modalidade, o polipeptídio inclui pelo menos duas modificações selecionadas a partir das modificações (a)-(d). Em uma modalidade exemplar, o polipeptídio inclui (a) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio e (b) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio. Em uma outra modalidade, o polipeptídio inclui pelo menos três modificações selecionadas a partir das modificações (a)-(d). Ainda em uma outra modalidade, o polipeptídio inclui as modificações (a), (b), (c), e (d).
[0381] Quando mais de um polipeptídio mutante está presente durante a modificação química por EDC, em uma modalidade, a composição resultante inclui pelo menos uma de qualquer das modificações (a)-(h). Em uma modalidade, a composição inclui pelo menos duas modificações selecionadas a partir das modificações (a)- (h). Em uma outra modalidade, a composição inclui pelo menos três modificações selecionadas a partir das modificações (a)-(h). Ainda em uma outra modalidade, a composição inclui pelo menos four modificações selecionadas a partir das modificações (a)-(h). Em uma outra modalidade, a composição inclui pelo menos uma de cada uma das modificações (a)-(h).
[0382] Em uma modalidade exemplar, a composição resultante inclui (a) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio; e (b) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio. Em uma modalidade, a composição ainda inclui (c) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e o grupo amino do N-terminal do polipeptídio; e (d) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio.
[0383] Em outra modalidade exemplar, a composição resultante inclui (e) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado; (f) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado; (g) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e o grupo amino do N-terminal de um segundo polipeptídio isolado; e (h) pelo menos uma ligação em cruz entre o grupo carboxil no C-terminal do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado.
[0384] Em uma outra modalidade exemplar, a composição resultante inclui (a) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio; (b) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio; (e) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado; d (f) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídio isolado.
[0385] Em uma modalidade preferida, o agente de ligação em cruz química inclui formaldeído, mais preferencialmente, um agente incluindo formaldeído na ausência de lisina. Glicina ou outro composto apropriado com uma amina primária pode ser usado como o inibidor nas reações com ligação em cruz. Portanto, em outra modalidade preferida, o agente químico inclui formaldeído e o uso de glicina.
[0386] Ainda em outra modalidade preferida, o agente de ligação em cruz química inclui EDC e NHS. Como é conhecido na arte, o NHS pode ser incluído nos protocolos de acoplamento EDC. Entretanto, os inventores surpreendentemente descobriram que o NHS pode facilitar em uma outra diminuição da citotoxidade da toxina de C. difficile mutante, quando comparado a toxina do tipo selvagem correspondente, quando comparado a toxina mutada geneticamente, e quando comparado a toxina tutada geneticamente que foi ligada em cruz quimicamente por um EDC. Veja, por exemplo, Exemplo 22. Portanto, sem estar limitado pelo mecanismo ou teoria, um polipeptídio de toxina mutante tendo uma metade de beta-alanina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídio (por exemplo, resultando de uma reação do polipeptídio da toxina mutante, EDC, e NHS) pode facilitar em uma outra diminuição de citotoxidade da toxina mutante, quando comparado a, por exemplo, uma toxina C. difficile (do tipo selvagem ou mutante) sendo que uma metade de beta- alanina está ausente.
[0387] O uso de EDC e/ou NHS também pode incluir o uso de glicina ou outro composto apropriado com uma amina primária como o inibidor. Qualquer composto tendo uma amina primária pode ser usado como um inibidor, tais como, por exemplo, metil éster glicina e alanina. Em uma modalidade preferida, o composto inibidor é uma amina primária hidrofílica não polimérica. Os exemplos de uma amina primária hidrofílica não polimérica incluem, por exemplo, aminoaçúcares, amino alcools, e amino poliois. Os exemplos específicos de uma amina primária hidrofílica não polimérica incluem glicina, etanolamina, glucamina, amina funcionalizada polietileno glicol, e oligômeros de amina funcionalizada etileno glicol.
[0388] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante tendo um pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido quimicamente modificada por EDC e uma amina primária hidrofílica não polimérica, preferencialmente glicina. Os adutos de glicina resultantes (por exemplo, a partir da reação de toxinas mutantes triplas tratadas com EDC, NHS, e inibidas com glicina) pode facilitar na diminuição da citotoxidade da toxina mutante quando comparado a toxina do tipo selvagem correspondente.
[0389] Em uma modalidade, quando um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante é quimicamente modificado por EDC e glicina, o polipeptídio inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídio é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma de qualquer das modificações (a)-(h) descritas acima), e pelo menos uma das seguintes modificações exemplares: (i) uma metade de glicina ligada a um grupo carboxil em um C-terminal do polipeptídio; (j) uma metade de glicina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio; e (k) uma metade de glicina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio. Veja, por exemplo, a Figura 24 e a Figura 25.
[0390] Em uma modalidade, pelo menos um aminoácido do TcdA de C. difficile mutante é ligado em cruz quimicamente e/ou pelo menos um aminoácido do TcdB de C. difficile mutante é ligado em cruz quimicamente. Qualquer uma das toxinas mutantes descritas aqui podem ser ligadas em cruz quimicamente. Em uma outra modalidade, pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e/ou SEQ ID NO: 8 é ligada em cruz quimicamente. Em uma modalidade, pelo menos um resíduo de aminoácido de um polipeptídio tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 até a SEQ ID NO: 761 é ligada em cruz. Em uma outra modalidade, pelo menos um resíduo de aminoácido de um polipeptídio tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 183 até a SEQ ID NO: 761 inclui uma modificação como descrito acima, por exemplo, qualquer uma das modificações (a)-(k), tais como (a) pelo menos uma ligação em cruz entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídio e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídio.
[0391] Por exemplo, pelo menos um aminoácido pode ser ligado em cruz quimicamente por um agente que inclui uma carbodiimida, tais como EDC. As carbodiimidas podem formar uma ligação covalente entre o carboxyl livre (por exemplo, a partir das cadeias laterais de ácido aspártico e/ou ácido glutâmico) e grupos (por exemplo, na cadeia lateral dos resíduos de lisina) para formar ligações de amida estáveis.
[0392] Como outro exemplo, pelo menos um aminoácido pode ser ligado em cruz quimicamente por um agente que inclui NHS. Os ligadores em cruz ativados por éster NHS podem reagir com as aminas primárias (por exemplo, no N-terminal de ada cadeia de polipeptídio e/ou na cadeia lateral dos resíduos de lisina) para render uma ligação de amida.
[0393] Em uma outra modalidade, pelo menos um aminoácido pode ser ligado em cruz quimicamente por um agente que inclui EDC e NHS. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 4, sendo que o resíduo de metionina na posição 1 não está presente opcionalmente, sendo que o polipeptídio inclui pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido quimicamente modificada por EDC e NHS. Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 6, sendo que o resíduo de metionina na posição 1 não está presente opcionalmente, sendo que o polipeptídio inclui pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido quimicamente modificada por EDC e NHS. Ainda em outra modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídio isolado tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8. O polipeptídio é modificado contatando o polipeptídio com EDC e NHS. Veja, por exemplo, a Figura 24 e a Figura 25.
[0394] Quando um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante é modificado quimicamente por (por exemplo, contatando) EDC e NHS, em uma modalidade, o polipeptídio inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídio é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma de qualquer das modificações (a)-(h) descritas acima), e (l) uma metade de beta-alanina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídio.
[0395] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante sendo que o polipeptídio inclui pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido quimicamente modificada por EDC, NHS, e uma amina primária hidrofílica não polimérica, preferencialmente glicina. Em uma modalidade, o polipeptídio inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídio é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma de qualquer das modificações (a)- (h) descritas acima), pelo menos uma modificação quando o polipeptídio é modificado por glicina (por exemplo, pelo menos uma de qualquer das modificações (i)-(k) descritas acima), e (l) uma metade de beta-alanina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídio. Veja, por exemplo, a Figura 24 e a Figura 25.
[0396] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante, sendo que uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídio é ligada a uma metade de beta-alanina. Em uma modalidade, uma cadeia lateral do segundo resíduo de lisina do polipeptídio é ligada a uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico e/ou a uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico. O “segundo” resíduo de lisina do polipeptídio inclui um resíduo de lisina d o polipeptídio que não é ligado a uma metade de beta-alanina. A cadeia lateral de um ácido aspártico e/ou uma cadeia lateral de um ácido glutâmico ao qual o segundo resíduo de lisina é ligado pode ser aquela do polipeptídio para formar uma ligação em cruz intramolecular, ou aquela de um segundo polipeptídio para formar uma ligação intermolecular. Em uma outra modalidade, uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido aspártico e/ou uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídio é ligado a uma metade de glicina. O resíduo de ácido aspártico e/ou o resíduo de ácido glutâmico que é ligado a uma metade glicina não é também ligada a um resíduo de lisina.
[0397] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma toxina de C. difficile mutante sendo que pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido de uma toxina C. difficile do tipo selvagem é quimicamente modificada. Em uma modalidade, pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido da toxina de C. difficile do tipo selvagem A e/ou pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido de uma toxina de C. difficile do tipo selvagem B é modificado quimicamente por EDC. Por exemplo, em uma modalidade, TcdA (SEQ ID NO: 1) e/ou Tcdb (SEQ ID NO: 2) é modificado quimicamente por EDC. Em uma outra modalidade, a toxina do tipo selvagem é modificada quimicamente por EDC e NHS. Em uma modalidade, a toxina mutante inclui uma toxina do tipo selvagem A quimicamente modificada, sendo que a toxina do tipo selvagem A é qualquer uma descrita na Tabela 1-a. Em uma outra modalidade, a toxina mutante inclui uma toxina do tipo selvagem B quimicamente modificada, sendo que a toxina do tipo selvagem B é qualquer uma descrita na Tabela 2-a.
[0398] Como um outro exemplo de um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante ligada em cruz quimicamente, pelo menos um aminoácido pode ser ligado em cruz quimicamente por um agente que inclui formaldeído. O formaldeído pode reagir com o grupo amino de um resíduo de aminoácido N-terminal e s cadeias laterais de arginina, cisteína, histidina, e lisina. O formaldeído e a glicina podem formar um aduto com base em Schiff, que pode anexar aos grupos amino N- terminal primários resíduos de arginina, e tirosina, e a um grau menor resíduos de asparagina, glutamina, histidina, e triptofano.
[0399] Um agente de ligação em cruz química é tal que reduz a citotoxidade de uma toxina se a toxina tratada tem menos toxicidade (por exemplo, cerca de 100%, 99%, 95%, 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 25%, ou 10% menos toxicidade) do que a toxina tratada sob condições idênticas, como medido, por exemplo, por um ensaio de citotoxidade in vitro, ou por uma toxicidade animal.
[0400] Preferencialmente, o agente de ligação em cruz química reduz a citotoxidade da toxina de C. difficile mutante por pelo menos cerca de uma redução de 2-log10, mais preferencialmente cerca de uma redução de 3-log10, e mais preferencialmente cerca de uma redução de 4-log10 ou mais, relativo a uma toxina mutante sob condições idênticas mas na ausência do agente de ligação em cruz química. Quando comparado a uma toxina do tipo selvagem, o agente de ligação em cruz química preferencialmente reduz a citotoxidade de uma toxina mutante por pelo menos cerca de uma redução de 5-log10, cerca de uma redução de 6-log10, cerca de uma redução de 7-log10, cerca de uma redução de 8-log10, ou mais.
[0401] Em outra modalidade preferida, a toxina de C. difficile mutante inativada quimicamente exibe valores EC50 maiores do que ou pelo menos cerca de 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1000 μg/ml ou maior, como medido por, por exemplo, um ensaio de citotoxidade in vitro, tais como um descrito aqui.
[0402] As condições de reação para contatar uma toxina mutante com o agente de ligação em cruz química estão dentro do escopo de um perito experiente na arte, e as condições podem variar dependendo do agente usado. Entretanto, os inventores surpreendentemente descobriram condições de reação ótimas para contatar um polipeptídio de toxina de C. difficile mutante com um agente de ligação em cruz química, enquanto retém epítopos funcionais e diminui a citotoxidade da toxina mutante, quando comparado a toxina do tipo selvagem correspondente.
[0403] Preferencialmente, as condições de reação são selecionadas para contatar uma toxina mutante com um agente de ligação em cruz, sendo que a toxina mutante tem uma concentração mínima de cerca de 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 mg/ml para um máximo de cerca de 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, ou 1,25 mg/ml. Qualquer valor mínimo pode ser combinado para definir uma faixa de concentrações compatíveis de uma toxina mutante para a reação. Mais preferencialmente, a toxina mutante tem uma concentração de cerca de 1,0 - 1,25 mg/ml para a reação.
[0404] Em uma modalidade, o agente usado na reação tem uma concentração mínima de cerca de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, ou 50 mM, e uma concentração máxima de cerca de 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, ou 50 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de concentrações compatíveis do agente químico para a reação.
[0405] Em uma modalidade preferida sendo que o agente inclui formaldeído, a concentração usada é preferencialmente qualquer concentração entre cerca de 2 mM a 80 mM, mais preferencialmente cerca de 40 mM. Em outra modalidade preferida sendo que o agente inclui EDC, a concentração usada é preferencialmente qualquer concentração entre cerca de 1,3 mM a cerca de 13 mM, mais preferencialmente cerca de 2 mM a 3 mM, mais preferencialmente cerca de 2,6 mM. Em uma modalidade, a concentração de EDC é de até 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2,5 g/L, 2 g/L, 1,5 g/L, 1,0 g/L, 0,5 g/L com base no volume de reação total, preferencialmente de até 1 g/L, mais preferencialmente de até 0,5 g/L.
[0406] Os períodos de reação exemplares no qual a toxina mutante é contatada com o agente de ligação em cruz química incluem um mínimo de cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 36, 48, ou 60 horas, e um máximo de cerca de 14 dias, 12 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia, ou 12 horas, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 hora. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de períodos de reação compatível.
[0407] Em uma modalidade preferida, a etapa de contatar uma toxina mutante com o agente de ligação em cruz química ocorre por um período de tempo que é suficiente para reduzir a citotoxidade da toxina de C. difficile mutante para um valor EC50 de pelo menos cerca de 1000 μg/ml em uma célula humana compatível, por exemplo, as células IMR-90, em um ensaio de citotoxidade in vitro padrão, quando comparado a uma toxina mutante idêntica na ausência do agente de ligação em cruz. Mais preferencialmente, a etapa de reação é realizada por um período que é pelo menos duas vezes mais longo, e mais preferencialmente pelo menos três vezes mais longo ou mais, já que o período de tempo suficiente para reduzir a citotoxidade de uma toxina mutante para o valor EC50 de pelo menos cerca de 1000 μg/ml em uma célula humana compatível. Em uma modalidade, o tempo de reação não excede cerca de 168 horas (ou 7 dias).
[0408] Por exemplo, em uma modalidade onde o agente inclui formaldeído, a toxina mutante é preferencialmente contatada com o agente por cerca de 12 horas, que foi mostrado como sendo um período de tempo exemplar que foi suficiente para reduzir a citotoxidade da toxina de C. difficile mutante para um valor EC50 de pelo menos cerca de 1000 μg/ml em uma célula humana compatível, por exemplo, as células IMR-90, em um ensaio de citotoxidade in vitro padrão, quando comparado a uma toxina mutante idêntica na ausência do agente de ligação em cruz. Em uma modalidade mais preferida, a reação é realizada por cerca de 48 horas, que é pelo menos cerca de três vezes tão longo quanto o período de tempo suficiente para a reação. Em tal modalidade, o tempo de reação é preferencialmente não maior do que cerca de 72 horas.
[0409] Em uma outra modalidade onde o agente inclui EDC, a toxina mutante é preferencialmente contatado com o agente por cerca de 0,5 horas, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 hora, ou mais preferencialmente cerca de 2 horas. Em uma modalidade, a toxina mutante é contata com EDC para até cerca de 5 horas, preferencialmente até cerca de 3 horas, mais preferencialmente até cerca de 2 horas. Em tal modalidade, o tempo de reação é preferencialmente não maior do que cerca de 6 horas.
[0410] O pH exemplar no qual a toxina mutante é contatada com o agente de ligação em cruz química incluem um mínimo de cerca de pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, ou 7,5, e um máximo de cerca de pH 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, ou 6,5. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de pH compatível. Preferencialmente, a reação ocorre no pH 6,5 a 7,5, preferencialmente no pH 7,0.
[0411] As temperaturas exemplares na qual a toxina mutante é contatada com o agente de ligação em cruz química incluem um mínimo de cerca de 2°C, 4°C, 10°C, 20°C, 25°C, ou 37°C, e uma temperatura máxima de cerca de 40°C, 37°C, 30°C, 27°C, 25°C, ou 20°C. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com um valor máximo para definir uma faixa de temperatura de reação compatível. Preferencialmente, a reação ocorre em cerca de 20°C a 30°C, mais preferencialmente em cerca de 25°C.
[0412] As composições imunogênicas como descrito acima podem incluir uma toxina de C. difficile mutante (A ou B). Portanto, as composições imunogênicas podem ocupar frascos separados (por exemplo, um frasco separado para uma composição incluindo uma toxina de C. difficile mutante A e um frasco separado para uma composição incluindo uma toxina de C. difficile mutante B) na preparação ou kit. As composições imunogênicas podem ser pretendidas para o uso simultâneo, sequencial, ou separado.
[0413] Em uma outra modalidade, as composições imunogênicas como descrito acima podem incluir ambas toxinas de C. difficile mutantes (A e B). Qualquer combinação de toxina de C. difficile mutante A e de toxina de C. difficile mutante B descrita pode ser combinada para uma composição imunogênica. Portanto, as composições imunogênicas podem ser combinadas em um frasco único (por exemplo, um frasco único contendo ambas as composições incluindo o TcdA de C. difficile mutante e a composição incluindo o TcdB de C. difficile mutante). Preferencialmente, as composições imunogênicas incluem um TcdA de C. difficile mutante e um TcdB de C. difficile mutante.
[0414] Por exemplo, em uma modalidade, a composição imunogênica inclui a SEQ ID NO: 4 e a SEQ ID NO: 6, sendo que pelo menos um aminoácido de cada uma das SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6 é ligado em cruz quimicamente. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui a toxina de C. difficile mutante A, que inclui a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7, e a toxina de C. difficile mutante B, que compreende a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, sendo que pelo menos um aminoácido de cada uma das toxinas de C. difficile mutante é ligada em cruz quimicamente.
[0415] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui qualquer sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 84, e SEQ ID NO: 83, e qualquer sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 86, e SEQ ID NO: 85. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui a SEQ ID NO: 84 e uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 86. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui a SEQ ID NO: 83 e uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 85. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui a SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86, e a SEQ ID NO: 85.
[0416] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica inclui um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761, e um segundo polipeptídio tendo qualquer uma das sequências selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761.
[0417] Entende-se que qualquer uma das modificações das composições inventivas, por exemplo, as composições imunogênicas incluindo uma toxina mutante A e/ou uma toxina mutante B, pode ser combinada em diferentes proporções ou quantidades para efeito terapêutico. Por exemplo, o TcdA de C. difficile mutante e TcdB de C. difficile mutante pode estar presente em uma composição imunogênica em uma proporção na faixa de 0,1:10 a 10:0,1, A:B. Em uma outra modalidade, por exemplo, o TcdB de C. difficile mutante e o TcdA de C. difficile mutante pode estar presente em uma composição imunogênica em uma proporção na faixa de 0,1:10 a 10:0,1, B:A. Em uma modalidade preferida, a proporção é de forma que a composição inclua uma quantidade total maior de um TcdB mutante do que uma quantidade total de TcdA mutante.
[0418] Em um aspecto, uma composição imunogênica é capaz de ligar a um anticorpo de neutralização ou um fragmentoo do mesmo. Preferencialmente, o anticorpo de neutralização ou fragmentoo de ligação do mesmo é um descrito aqui abaixo. Em uma modalidade exemplar, uma composição imunogênica é capaz de ligar a um anticorpo anti-toxina A ou um fragmentoo de ligação do mesmo, sendo que o anticorpo anti-toxina A ou um fragmentoo de ligação do mesmo inclui uma cadeia leve variável tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36 e uma cadeia pesada variável tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 37. Por exemplo, a composição imunogênica pode incluir o TcdA de C. difficile mutante, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 7. Como outro exemplo, a composição imunogênica pode incluir a SEQ ID NO: 84 ou a SEQ ID NO: 83.
[0419] Em outra modalidade exemplar, uma composição imunogênica é capaz de ligar a um anticorpo anti-toxina B ou um fragmentoo de ligação do mesmo, sendo que o anticorpo anti-toxina B ou fragmentoo de ligação do mesmo inclui uma cadeia leve variável de B8-26 e uma cadeia pesada variável de B8-26. Por exemplo, a composição imunogênica pode incluir um TcdB de C. difficile mutante, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 8. Como outro exemplo, a composição imunogênica pode incluir a SEQ ID NO: 86 ou a SEQ ID NO: 85.
CÉLULA RECOMBINANTE
[0420] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula recombinante ou uma progênie do mesmo. Em uma modalidade, a célula ou progênie do mesmo inclui um polinucleotídeo codificando um TcdA de C. difficile mutante e/ou um TcdB de C. difficile mutante.
[0421] Em uma outra modalidade, a célula recombinante ou a progênie do mesmo inclui uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídio tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8, quando alinhado otimamente, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de espaço padrão. Em uma modalidade, a célula recombinante ou a progênie do mesmo inclui uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídio tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 até a SEQ ID NO: 761.
[0422] Em uma outra modalidade, a célula recombinante ou a progênie do mesmo inclui uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídio tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83, ou SEQ ID NO: 85, quando alinhado otimamente, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão.
[0423] Em uma modalidade adicional, a célula recombinante ou a progênie do mesmo inclui uma sequência de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47, quando alinhado otimamente, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando os pesos de espaço padrão. A célula recombinante pode ser derivada de qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídio da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota. Preferencialmente, a célula recombinante é derivada de qualquer célula que seja compatível para expressar sequências de ácido nucléico heterólogas maiores do que cerca de 5000, 6000, preferencialmente cerca de 7000, e mais preferencialmente cerca de 8000 nucleotídeos ou mais. As células hospedeiras procarióticas podem ser qualquer bactéria gram-positiva ou gram-negativa. Nas modalidades exemplares, as células hospedeiras procarióticas carecem de polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina e/ou esporo.
[0424] A bactéria gram-negativa inclui, mas não está limitada a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma. Por exemplo, a célula recombinante pode ser derivada de uma célula Pseudomonas fluorescens, como descrito em US Patent application publication 2010013762, parágrafos [0201]- [0230], a qual está incorporada aqui para referência.
[0425] A bactéria gram-positiva inclui, mas não está limitada a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Preferencialmente, a célula é derivada de uma célula de C. difficile.
[0426] Os inventores identificaram as cepas de C. difficile do tipo selvagem que carecem de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina de C. difficile. As cepas carecendo de genes de toxina A e B endógenas incluem as seguintes cepas, que estão disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA): C. difficile 1351 (ATCC 43593™), C. difficile 3232 (ATCC BAA-1801™), C. difficile 7322 (ATCC 43601™), C. difficile 5036 (ATCC 43603™), C. difficile 4811 (ATCC 43602™), e C. difficile VPI 11186 (ATCC 700057™).
[0427] Portanto, em uma modalidade, a célula recombinante C. difficile é derivada de uma cepa descrita aqui. Preferencialmente, a célula recombinante de C. difficile ou a progênie do mesmo é derivada do grupo consistindo de C. difficile 1351, C. difficile 5036, e C. difficile VPI 11186. Mais preferencialmente, a célula recombinante C. difficile ou a progênie do mesmo é derivada de uma célula C. difficile VPI 11186.
[0428] Em uma modalidade preferida, o gene e esporulação da célula recombinante de C. difficile ou a progênie do mesmo é inativada. Os esporos podem ser infecciosos, altamente resistentes, e facilitar a persistência do C. difficile em ambientes externos aeróbicos do hospedeiro. Os esporos também podem contribuir para a sobrevivência do C. difficile dentro do hospedeiro durante a terapia antimicrobiana. Portanto, uma célula de C. difficile carecendo de um gene de esporulação é útil para produzir uma composição imunogênica segura para administração a mamíferos. Além disso, o uso de tais células facilita a segurança durante a fabricação, por exemplo, segurança para proteger a instalação, produtos futuros, e o pessoal.
[0429] Os exemplos de genes de esporulação para a inativação almejada incluem, inter alia, spoOA, spoIIE, αE, αG, e dK. Preferencialmente, o gene spo0A é inativado.
[0430] Os métodos para a inativação de um gene de esporulação de C. difficile são conhecidos na arte. Por exemplo, um gene de esporulação pode ser inativado por uma inserção almejada de um marcador selecionável, tais como, um marcador de resistência ao antibiótico. Veja, por exemplo, Heap et al., J Microbiol Methods. Janeiro de 2010; 80(1):49-55; Heap et al., J. Microbiol. Methods, setembro de 2007; 70(3):452-464; e Underwood et al., J Bacteriol. Dezembro de 2009; 191(23):7296-305. Veja também, por exemplo, Minton et al., WO2007/148091, entitled, “DNA Molecules and Methods,” incoporados aqui para referência em sua totalidade a partir das páginas 33-66, ou o US publication US 20110124109 A1 correspondente, parágrafos [00137]- [0227].
COMPOSIÇÕES RELACIONADAS A CULTURAÇÃO DE CÉLULA DE C. DIFFICILE
[0431] A invenção ainda refere-se as composições e métodos para uso na culturação de C. difficile e na produção de toxinas de C. difficile. Em um aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura compreendendo uma fonte de nitrogênio e uma célula de C. difficile.
[0432] As fontes de nitrogênio de meio de cultura compatíveis incluem: HY-SOJA (Quest), AMI-SOJA (Quest), NZ-SOJA (Quest), NZ-SOJA BL4 (Quest), NZ-SOJA BL7 (Quest), SHEFTONE D (Sheffield), SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE %) MK (DMV), PEPTONA DE SOJA (Gibco), BACTO-SOJA TON (Difco), NUTRISOJA 2207 (ADM), BAKES NUTRISOJA (ADM) NUTRISOJA FLOUR, carne de soja, BACTO-EXTRATO DE LEVEDURA (Difco) EXTRATO DE LEVEDURA (Gibco), HY-YEST 412 extrato de levedura(Quest), HY- YEST 441 extrato de levedura (Quest), HY-YEST 444 extrato de levedura (Quest), HY-YEST 455 extrato de levedura (Quest) BACTO- MALT EXTRACT (Difco), Corn Steep, e PROFLO (Traders).
[0433] Em um aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura incluindo um hidrolisado vegetal e uma célula de C. difficile. Qualquer hidrolisado vegetal pode ser compatível. Os exemplos de hidrolisados de vegetais compatíveis são hidrolisado de semente de algodão, ervilha hidrolisada, e hidrolisado de soja.
[0434] Em uma modalidade preferida, o hidrolisado de vegetais é um hidrolisado de soja. Preferencialmente, o hidrolisado de soja é SE50MK (Friesland-Campaigna). Outros exemplos de produtos de soja que podem ser usados na invenção, e suas fontes, incluem: Tekniscience: Peptona de soja A1, Peptona de soja A2, Peptona de soja A3, Peptona de planta E1, Peptona de planta ET1, e Peptona de trigo E1; Quest: HY-Soja , HY-Soja T, AMI-Soja , NZ-Soja , NZ-Soja BLA, e NZ-Soja BL7; DMV: SE50M, SE70M, SE50MK, SE50MK-NK (Friesland-Campaigna), WGE80BT, WGE80M, CNE50M, e SE70BT; Marcor: Peptona de soja Tipo AB, Peptona de soja Tipo AC, Peptona de soja Tipo SL, Peptona de soja Tipo II, e Peptona de soja Tipo F; Oxoid: Peptona de Vegetais e Peptona de Vegetais No. 1; Gibco: Peptona de Soja; e Difco: Bacsoja tônus.
[0435] As concentrações do hidrolisado vegetal no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, or 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, or 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 30 g/L. A concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0436] In another aspect, a invenção refere-se a a meio de cultura including a extrato de levedura (por exemplo, as a nitrogen source) and a Clostridium difficile cell. Most preferencialmente, the extrato de levedura is HY YEST 412 (Kerry Biosciences).
[0437] As concentrações do extrato de levedura no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, or 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, or 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de extrato de levedura no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 20 g/L. A concentração de extrato de levedura no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0438] Os inventores descobriram que o crescimento do C. difficile pode ser suportado em um meio de cultura que inclui um hidrolisado vegetal sem o extrato de levedura, e em um meio de cultura que inclui extrato de levedura sem um hidrolisado de vegetal. A cultura das células e/ou produção de toxina resultando de um meio de cultura que inclui ambos o hidrolisado de vegetal e o and extrato de levedura, entretanto, tem sido observado ser maior do que os rendimentos resultando de um meio de cultura incluindo um hidrolisado vegetal na ausência do extrato de levedura, e maior do que os rendimentos resultando de um meio de cultura incluindo o extrato de levedura na ausência de um hidrolisado de vegetal.
[0439] Portanto, os inventores descobriram que uma combinação de um hidrolisado vegetal e um extrato de levedura ajuda a suportar o crescimento máximo de C. difficile e/ou a produção de toxina. Em um aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura incluindo um hidrolisado de vegetal, extrato de levedura, e uma célula de C. difficile. O hidrolisado vegetal pode ser qualquer hidrolisado vegetal compatível conhecido na arte como descrito acima. Preferencialmente, o hidrolisado é um hidrolisado de soja. Mais preferencialmente, o hidrolisado de soja é SE50MK (Friesland-Campaigna). Em uma modalidade preferida, o extrato de levedura é HY YEST 412.
[0440] Em uma modalidade, o meio não inclui uma fonte de carbono. Os inventores observaram que o meio de cultura incluindo hidrolisado de soja / extrato de levedura na ausência de uma fonte de carbono alcança valores OD600 de 2-3 e o rendimento de produção de toxinas de 10-15 mg/L.
[0441] Entretanto, um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono foi surpreendentemente observado por aumentar a cultura das células de C. difficile e a produção de toxina, quando comparado a um meio na ausência de uma fonte de carbono. Além disso, os inventores surpreendentemente descobriram que a produção de uma toxina mutante não foi marcadamente inibida pela cultura de células C. difficile sob condições anaeróbicas incluindo uma fonte de carbono na presença de um meio incluindo um hidrolisado de soja. Portanto, em uma modalidade preferida, o meio ainda inclui uma fonte de carbono. Mais preferencialmente, em uma modalidade, o meio de cultura inclui uma fonte de carbono, sendo que o meio ainda inclui uma célula de C. difficile recombinante. Ainda mais preferencialmente, a célula de C. difficile recombinante inclui um promotor constitutivo. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor feredoxina Clostridium sporogenes (fdx). Em outra modalidade preferida, a célula C. difficile recombinante não inclui um promotor cromossômico regulado que pode ser negativamente regulado por, por exemplo, uma repressão de glucose. Em uma modalidade mais preferida, a célula de C. difficle é uma célula recombinante ou uma progênie do mesmo como descrito acima. Qualquer fonte de carbono pode ser usada no meio de cultura. As fontes de carbono compatíveis incluem glucose, dextrose, mannitol, frutose, e/ou manose. Preferencialmente, a fonte de carbono no meio de cultura é uma glucose. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura não inclui arabinose, xilose, sucrose, lactose, maltose, glicerina, ramnose, e/ou galactose.
[0442] As concentrações de uma fonte de carbono (por exemplo, glucose, mannitol, frutose, e/ou manose) no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, ou 60 g/L a um valor máximo de 150, 100, 90, 80, 75, 70, 50, 40, ou 30 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é entre 5-70 g/L. Em uma modalidade, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é cerca de 10 g/L. Em uma outra modalidade, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é maior do que 10 g/L. Em uma outra modalidade, a concentração de uma fonte de carbono (por exemplo, glucose) no meio de cultura é 45-75 g/L, preferencialmente 55-65 g/L mais preferencialmente 55-65 g/L. Em uma outra modalidade, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é cerca de 60 g/L. A concentração de fonte de carbono no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0443] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui um derivado de cloranfenicol. Os derivados de cloranfenicol exemplares incluem qualquer um de tianfenicol, florfenicol, succinato de cloranfenicol, e fluoranfenicol. Preferencialmente, o meio de cultura inclui tianfenicol. Sem estar limitado pelo mecanismo ou teoria, acredita-se que o derivado de cloranfenicol ajuda a prevenir a perda de plasmídeo durante a fermentação e no aumento da produção de células e/ou toxina, quando comparado a um meio de cultura na ausência de um derivado de cloranfenicol.
[0444] As concentrações de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 15, 20, ou 30 mg/L a um valor máximo de 100, 75, 50, ou 40 mg/L. Em uma outra modalidade, a concentração de derivado de cloranfenicol no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 0,5 g/L, 1 g/L, 1,5 g/L, 2 g/L, 2,5 g/L, 3 g/L, 3,5 g/L, 4 g/L, 4,5 g/L, ou 5 g/L a um valor máximo de 10 g/L, 9,5 g/L, 9 g/L, 8,5 g/L, 8 g/L, 7,5 g/L, 7 g/L, 6,5 g/L, 6 g/L, 5,5 g/L, 5 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura é entre 5-20 mg/L, mais preferencialmente cerca de 15 mg/L. Em uma outra modalidade, a concentração de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura é entre 1 g/L-10 g/L, preferencialmente entre 1g/L-5 g/L, mais preferencialmente cerca de 3 g/L. A concentração de derivado de cloranfenicol no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0445] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui um protetor de célula, tais como polietileno glicol, a polivinil álcool ou um poliol pluronico. Em uma modalidade, o meio de cultura inclui polietileno glicol, tais como polietileno glicol 2000 (PPG 2000).
[0446] As concentrações de uma célula protetora, tais como polietileno glicol, no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 0,01, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, or 1 ml/L a um valor máximo de 2, 1, 0,90, 0,80, 0,70, 0,60, 0,50, 0,40, 0,30, 0,20 ml/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de um protetor de célula, tais como polietileno glicol no meio de cultura é entre 0,01 ml/L a 0,0,50, mais preferencialmente cerca de 0,25 ml/L. A concentração de protetor de célula no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0447] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura inclui um hidrolisado de vegetal, extrato de levedura, e uma fonte de carbono, sendo que o hidrolisado vegetal é um hidrolisado de soja, sendo que o extrato de levedura é HY YEST 412 (Kerry Biosciences), e sendo que a fonte de carbono é glucose, mannitol, frutose, e/ou manose. Em uma modalidade mais preferida, o meio de cultura inclui um hidrolisado de soja SE50MK, HY YEST 412 extrato de levedura, glucose, e tianfenicol, a pH 7.
[0448] Em uma modalidade preferida, a proporção de meio de cultura inclui 30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, 20 g/L HY YEST 412 extrato de levedura, 10 g/L glucose, e 15 mg/L tianfenicol, a pH 7. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura inclui cerca de 30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, cerca de 20 g/L HY YEST 412 extrato de levedura, cerca de 10 g/L glucose, e cerca de 15 mg/L tianfenicol, a pH 7. O meio de cultura pode ainda incluem cerca de cerca de 0,25 ml/L PPG 2000. Em uma outra modalidade, o meio de cultura pode ainda incluem dextrose.
[0449] Em outra modalidade preferida, o meio de cultura inclui 30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, 20 g/L HY YEST 412 extrato de levedura, 60 g/L glucose, e 15 mg/L tianfenicol, a pH 7. Em outra modalidade preferida, o meio de cultura inclui cerca de 30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, cerca de 20 g/L HY YEST 412 extrato de levedura, cerca de 60 g/L glucose, e cerca de 15 mg/L tianfenicol, a pH 7. O meio de cultura pode ainda incluem cerca de 0,25 ml/L PPG 2000. Em uma outra modalidade, o meio de cultura pode ainda inclui dextrose.
[0450] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui polipropileno glicol 2000 (PPG 2000). O meio de cultura pode incluir cerca de 0,05 mL PPG 2000 a cerca de 1 ml PPG 2000/L de meio, preferencialmente o meio de cultura inclui cerca de 0,25 ml/L PPG 2000/L de meio.
[0451] O meio de cultura descrito aqui pode ser compatível para a culturação de qualquer célula C. difficile. Em uma modalidade, a célula não é geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, a célula é geneticamente modificada, tais como uma célula recombinante ou uma progênie do mesmo como descrito acima. Em uma modalidade, a célula de C. difficile é carente de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina. Em uma modalidade preferida, a célula de C. difficile é derivada de VPI 11186.
[0452] Em uma outra modalidade, a cell inclui um promotor constitutivo. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor feredoxina Clostridium sporogenes (fdx). Em outra modalidade preferida, a célula não inclui um promotor cromossômico regulado que pode ser regulado negativamente por, por exemplo, uma repressão de glucose. Em uma modalidade mais preferida, a célula de C. difficile é uma célula recombinante ou uma progênie do mesmo como descrito acima.
[0453] Os inventores também descobriram que um meio de anticorpo monoclonal suporta o crescimento de C. difficile. Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a um meio de cultura que inclui um meio de anticorpo monoclonal. Em uma modalidade, o meio é um meio SFM4MAbTM (Thermo Scientific). Mostrou-se que o meio deu valores OD600 de cerca de 10 e o rendimento de produção de toxina foi cerca de 40 mg/L.
[0454] Em uma modalidade, o pH do meio de cultura pode variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, or 7,0 a um valor máximo de 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, ou 7,1. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, o pH do meio de cultura é entre 6,0 a 8,0, mais preferencialmente, entre 6,5 a 7,5. Mais preferencialmente, o pH é 7,0.
[0455] Os títulos de pH compatíveis são conhecidos na arte, incluindo, por exemplo, NH4OH, Na2CO3, e NaOH. Preferencialmente, o título de pH é NaOH.
[0456] O meio de cultura pode incluir ingredientes contendo fosfato tais como Na2HPO4, KH2PO4. Entretanto, em uma modalidade preferida, o meio de cultura não inclui um ingrediente contendo fosfato. MÉTODOS RELACIONADOS A CULTURAÇÃO DE UMA CÉLULA DE C. DIFFICILE
[0457] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de culturação do C. difficile. O método inclui culturar uma célula de C. difficile em um meio como descrito acima.
[0458] Em uma modalidade, o crescimento de C. difficile de acordo com os métodos da invenção procede em pelo menos duas fases: crescimento da semente e fermentação. Uma cultura de semente é primeiro crescida por inoculação a partir de uma cultura de armazenamento, por exemplo, um banco de células de trabalho. A semente é usada tanto para inocular uma segunda cultura de semente quanto para inocular uma cultura de fermentação maior relativamente. Como é entendido na arte, o número de culturas de sementes usadas pode depender, por exemplo, do tamanho e volume da etapa de fermentação.
[0459] Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a um método de culturar o C. difficile. O método inclui culturar uma célula de C. difficile em um primeiro meio de cultura sob condições que facilitam o crescimento da célula; inocular um segundo meio de cultura com todo ou uma parte de tal meio após tal primeira culturação; culturar tal segundo meio sob condições que facilitem o crescimento da célula. O método pode ainda incluir isolar uma toxina de C. difficile de tal segundo meio. Em uma modalidade, o C. difficile é crescido em um primeiro meio de cultura referido como uma cultura de semente. Em uma modalidade, cultura de semente inclui um meio de cultura como descrito acima e uma inoculação a partir de uma cultura de armazenamento que foi crescida no meio.
[0460] A fase de crescimento da semente (ou fases) são geralmente realizadas para ampliar a quantidade dos microorganismos a partir da cultura de armazenamento, por isso pode ser usado como um inoculante para a fase de fermentação. A fase de crescimento de semente também pode ser realizada para permitir que os micróbios dormentes relativamente nas culturas armazenadas se tornem rejuvenescidos e cresçam nas culturas de crescimento ativamente.
[0461] O volume e a quantidade de células viáveis usadas para inocular a cultura de fermentação podem ser controlados mais precisamente se tomados a partir de uma cultura de crescimento ativamente (por exemplo, uma cultura de semente), em vez de se for tomada a partir de uma cultura de armazenamento.
[0462] Além disso, mais de uma (por exemplo, duas ou três) fases de crescimento de semente podem ser usadas para ampliar a quantidade de C. difficile para inoculação do meio de fermentação. Alternativamente, o crescimento de C. difficile na fase de fermentação pode proceder diretamente a partir da cultura armazenada pela inoculação direta, se desejado.
[0463] O primeiro meio de cultura inclui um meio de cultura como descrito acima. Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro meio de cultura inclui um hidrolisado vegetal e uma célula de C. difficile. Preferencialmente, o hidrolisado vegetal é um hidrolisado de soja, mais preferencialmente hidrolisado de soja SE50MK. Em uma outra modalidade, o primeiro meio de cultura inclui um extrato de levedura e uma célula de C. difficile. Preferencialmente, o extrato de levedura é HY YEST 412. Em uma outra modalidade, o primeiro meio de cultura inclui um hidrolisado vegetal e um extrato de levedura. Ainda em uma outra modalidade, o primeiro meio de cultura ainda inclui uma fonte de carbono. Preferencialmente, a fonte de carbono é glucose. Em uma modalidade, o meio de cultura inclui uma célula de C. difficile recombinante quando a fonte de carbono é incluída, sendo que a célula recombinante inclui um promotor constitutivo. Em uma outra modalidade, o meio de cultura ainda inclui um derivado de cloranfenicol. Preferencialmente, o meio de cultura inclui tianfenicol.
[0464] As concentrações do hidrolisado vegetal no primeiro meio de cultura (por exemplo, meio de cultura de semente) podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, ou 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, ou 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 30 g/L. A concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0465] As concentrações do extrato de levedura no primeiro meio de cultura (por exemplo, meio de cultura de semente) podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, ou 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, ou 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de extrato de levedura no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 20 g/L. A concentração de extrato de levedura no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0466] As concentrações de uma fonte de carbono no primeiro meio de cultura (por exemplo, meio de cultura de semente) podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 1, 5, 10, 15, ou 20 g/L a um valor máximo de 100, 75, 50, 40, ou 30 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é entre 5-20 g/L, mais preferencialmente cerca de 10 g/L.
[0467] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui um derivado de cloranfenicol selecionado a partir de um grupo consistindo de tianfenicol, florfenicol, succinato de cloranfenicol, e fluoranfenicol. Preferencialmente, o meio de cultura inclui tianfenicol. As concentrações de um derivado de cloranfenicol no primeiro meio de cultura (por exemplo, meio de cultura de semente) podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 15, 20, ou 30 mg/L a um valor máximo de 100, 75, 50, ou 40 mg/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura é entre 5-20 mg/L, mais preferencialmente cerca de 15 mg/L.
[0468] Em uma modalidade, o pH do primeiro meio de cultura pode variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, ou 7,0 a um valor máximo de 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, ou 7,1. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, o pH do primeiro meio de cultura é entre 6,0 a 8,0, mais preferencialmente, entre 6,5 a 7,5. Mais preferencialmente, o pH é 7,0.
[0469] Em uma modalidade preferida, o primeiro meio de cultura inclui um hidrolisado de soja, extrato de levedura HY YEST 412, glucose, tianfenicol, a pH 7. Mais preferencialmente, o meio de cultura inclui 30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, 20 g/L extrato de levedura HY YEST 412, 10 g/L glucose, 15 mg/L tianfenicol, a pH 7.
[0470] Para iniciar a fase de fermentação, uma parte ou toda a cultura de semente contendo C. difficile pode ser usda para inocular o meio de cultura de fermentação. Uma concentração apropriada da cultura de semente para udar para inocular o meio de fermentação pode ser determinado pelos peritos nesta arte e podem variar, por exemplo, de 0,1-10%. Como nos exemplos específicos, as concentrações de 0, 5, 1, 5, 5, 5, 6, 6, 25, 6, 5, 7, 8, 9, 10% podem ser usadas.
[0471] A fermentação pode ser usada para produzir a quantidade máxima de células em um ambiente anaeróbico em larga escala. Em uma modalidade, o C. difficile é crescido como uma cultura de fermentação. Em uma modalidade, a cultura de fermentação foi inoculada a partir da cultura de semente que foi crescida no meio.
[0472] O segundo meio de cultura inclui um meio de cultura como descrito acima. Por exemplo, em uma modalidade, o segundo meio de cultura inclui um hidrolisado vegetal e uma célula de C. difficile. Preferencialmente, o hidrolisado vegetal é um hidrolisado de soja, mais preferencialmente hidrolisado de soja SE50MK. Em uma outra modalidade, o segundo meio de cultura inclui um extrato de levedura e uma célula de C. difficile. Preferencialmente, o extrato de levedura é HY YEST 412. Em uma outra modalidade, o segundo meio de cultura inclui um hidrolisado vegetal e um extrato de levedura. Ainda em uma outra modalidade, o segundo meio de cultura ainda inclui uma fonte de carbono. Preferencialmente, a fonte de carbono é glucose. Em uma modalidade, o meio de cultura inclui uma célula de C. difficile recombinante quando a fonte de carbono é incluída, sendo que a célula recombinante inclui um promotor constitutivo. Em uma outra modalidade, o segundo meio de cultura ainda inclui um derivado de cloranfenicol. Preferencialmente, o meio de cultura inclui tianfenicol.
[0473] As concentrações do hidrolisado vegetal no segundo meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, ou 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, ou 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 30 g/L. A concentração de hidrolisado vegetal no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0474] As concentrações do extrato de levedura no segundo meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 20, 30, 40, ou 50 g/L a um valor máximo de 200, 150, 100, ou 75 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de extrato de levedura no meio de cultura é entre 10-50 g/L, mais preferencialmente cerca de 20 g/L.
[0475] As concentrações de uma fonte de carbono no segundo meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 g/L a um valor máximo de 150, 100, 90, 80, ou 70 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de uma fonte de carbono no meio de cultura é entre 50-70 g/L, mais preferencialmente cerca de 60 g/L. Em uma modalidade, a concentração de uma fonte de carbono no segundo meio de cultura é maior do que a concentração da fonte de carbono no primeiro meio de cultura. A concentração de fonte de carbono no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0476] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui um derivado de cloranfenicol selecionado a partir de um grupo consistindo de tianfenicol, florfenicol, succinato de cloranfenicol, e fluoranfenicol. Preferencialmente, o meio de cultura inclui tianfenicol. As concentrações de um derivado de cloranfenicol no segundo meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 5, 10, 15, 20, ou 30 mg/L a um valor máximo de 100, 75, 50, ou 40 mg/L. Em uma outra modalidade, a concentração de derivado de cloranfenicol no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 0,5 g/L, 1 g/L, 1,5 g/L, 2 g/L, 2,5 g/L, 3 g/L, 3,5 g/L, 4 g/L, 4,5 g/L, ou 5 g/L a um valor máximo de 10 g/L, 9,5 g/L, 9 g/L, 8,5 g/L, 8 g/L, 7,5 g/L, 7 g/L, 6,5 g/L, 6 g/L, 5,5 g/L, 5 g/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura é entre 5-20 mg/L, mais preferencialmente cerca de 15 mg/L. Em uma outra modalidade, a concentração de um derivado de cloranfenicol no meio de cultura é entre 1 g/L-10 g/L, preferencialmente entre 1g/L-5 g/L, mais preferencialmente cerca de 3 g/L. A concentração de derivado de cloranfenicol no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0477] Em uma modalidade, o meio de cultura ainda inclui um protetor de célula, tais como polietileno glicol, um polivinil álcool ou um poliol plurônico. Em uma modalidade, o meio de cultura inclui um polietileno glicol, tais como polietileno glicol 2000 (PPG 2000).
[0478] As concentrações de uma célula protetora, tais como polietileno glicol, no meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 0,01, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, ou 1 ml/L a um valor máximo de 2, 1, 0,90, 0,80, 0,70, 0,60, 0,50, 0,40, 0,30, 0,20 ml/L. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a concentração de um protetor de célula, tais como polietileno glicol no meio de cultura é entre 0,01 ml/L a 0,0,50, mais preferencialmente cerca de 0,25 ml/L. A concentração de protetor de célula no meio de cultura descritas aqui pode ser com base no volume total do meio de cultura.
[0479] Em uma modalidade, o pH do segundo meio de cultura podem variar, por exemplo, entre um valor mínimo de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, ou 7,0 a um valor máximo de 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, ou 7,1. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, o pH do segundo meio de cultura é entre 6,0 a 8,0, mais preferencialmente, entre 6,5 a 7,5. Mais preferencialmente, o pH é 7,0.
[0480] Em uma modalidade preferida, o segundo meio de cultura inclui hidrolisado de soja, extrato de levedura HY YEST 412, glucose, tianfenicol, a pH 7. Mais preferencialmente, o meio de cultura inclui 30 g/L hidrolisado de soja, 20 g/L extrato de levedura HY YEST 412, 60 g/L glucose, 15 mg/L tianfenicol, a pH 7.
[0481] Em uma modalidade, a culturação é realizada sob condições anaeróbicas. Em uma modalidade, as etapas de culturação dos métodos da invenção (ambas semente e fermentação) são realizadas sob condições anaeróbicas, embora as condições anaeróbicas para ambas estas fases podem ser usadas também.
[0482] As abordagens para a cultura anaeróbica de bactérias, tais como C. difficile, são conhecidas na arte e podem empregar, por exemplo, gás nitrogênio ou uma mistura de gases hidrogênio e nitrogênio. O gás pode ser borbulhado através de um meio (por exemplo, borbulhamento) durante a fermentação ou passado através da área acima do líquido em uma câmara de cultura (por exemplo, a câmara de espaço livre).
[0483] A culturação da célula de C. difficile pode ser realizada emu ma câmara anaeróbica em aproximadamente 30±1° C, 31±1° C, 32±1° C, 33±1° C, 34±1° C, 35±1° C, 36±1° C, 37±1° C, 38±1° C, ou 39±1° C, preferencialmente cerca de 37±1° C. A culturação pode ser realizada por tempos variando, por exemplo, entre um valor mínimo de 1, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas a um valor máximo de 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6, dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 48 horas, ou 36 horas, ou 24 horas. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade preferida, a culturação da célula ocorre de 11 a 48 horas, mais preferencialmente cerca de 24 horas. Em uma outra modalidade, a culturação da célula ocorre de 5 a 25 horas, 10 a 20 horas, preferencialmente cerca de 15 horas. O crescimento pode ser monitorado medindo a densidade ótica (O.D.) do meio.
[0484] Em uma modalidade, o método ainda inclui isolar as toxinas de C. difficile a partir de tal meio. As toxinas de C. difficile podem ser isoladas e/ou purificadas a partir de culturas usando métodos de purificação de proteína conhecidos. As toxinas purificadas podem então, por exemplo, ser ativadas por um tratamento de inativação.
[0485] Em um aspecto alternativo, a invenção refere-se a um método de culturar o C. difficile. O método inclui culturar uma célula de C. difficile em um meio de anticorpo monoclonal.
[0486] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a produção de uma toxina de C. difficile. O método inclui culturar uma bactéria de C. difficile em um meio, como descrito acima, sob condições para permitir a produção da toxina. O método ainda inclui isolar a toxina de C. difficile a partir do meio.
[0487] Em uma modalidade, o método inclui culturar uma célula de C. difficile em um primeiro meio sob condições que facilitem o crescimento de C. difficile; inocular um segundo meio com todo ou uma parte de tal primeiro meio após a cultura; culturar tal segunda inoculação sob condições que facilitem o crescimento de C. difficile e a produção de toxina; e isolar uma toxina de C. difficile a partir de tal segundo meio. Em uma modalidade, a culturação do primeiro ou do segundo meio incluindo o C. difficile é realizada sob condições anaeróbicas.
[0488] Em uma modalidade, a célula de C. difficile é culturada em um Sistema de cultura contínuo. Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de culturação de C. difficile em um método de perfusão. Surpreendentemente, os inventores descobriram que uma célula de C. difficile recombinante expressando uma toxina mutante pode ser culturada com sucesso em uma cultura contínua anaeróbica e em uma cultura de perfusão anaeróbica. Uma vantagem de um sistema contínuo e/ou um sistema de perfusão é que o meio fresco pode ser adicionado continuamente. Além disso, os subprodutos de toxina da produção podem ser removidos durante a produção enquanto mantém a viabilidade da célula no sistema.
[0489] O sistema de cultura contínua pode incluir proporcionar um meio fresco para as células enquanto remove simultaneamente o meio gasto e as células do biorreator. A cultura continua pode incluir uma cultura de perfusão cultura de perfusão, na qual o fluxo de saída do líquido contém um meio de cultura que é subsequencialmente livre de células ou inclui uma concentração de célula substancialmente menor do que aquela no biorreator. Em uma cultura de perfusão, as células podem ser retidas por, por exemplo, filtragem, filtragem ultrassônica, centrifugação, ou sedimentação.
[0490] Em uma modalidade, o meio gasto é removido e filtrado, que previne as células de serem removidas do biorreator. O filtro pode ser um filtro de fluxo cruzado e/ou um filtro de fluxo tangencial. Em uma modalidade, tal Sistema de filtragem compreende um filtro de fibra oco. Em uma outra modalidade, as células são prevenidas de serem removidas do biorreator por uma etapa de centrifugação. Em uma outra modalidade, as células são prevenidas de serem removidas do biorreator por uma etapa de filtragem ultrassônica. Em uma outra modalidade, as células são prevenidas de serem removidas do biorreator através de um sistema de sedimentação. Em uma outra modalidade, tal sistema de filtragem compreende um cassete de folha plana.
[0491] Ainda em outra modalidade, o sistema de perfusão compreende um filtro de fibra oco que reterá as células, mas não o produto desejado. As células são recicladas de volta para dentro do biorreator e o meio gasto contendo o produto desejado é passado através de um filtro de corte de peso molecular desejado. O filtro reterá o produto desejado. Os produtos residuais não retidos pelo filtro podem ser dispostos e reciclados.
MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA TOXINA DE C. DIFFICILE MUTANTE
[0492] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir uma toxina de C. difficile mutante. Em uma modalidade, o método inclui culturar qualquer célula recombinante ou um progênie do mesmo descritos acima, sob condições compatíveis para expressar um polipeptídio. O método ainda inclui uma etapa de isolar a toxina do meio.
[0493] Em uma outra modalidade, o método inclui culturar uma célula recombinante ou uma progênie do mesmo sob condições compatíveis para expressar um polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, sendo que a célula inclui o polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, e sendo que a mutante inclui um domínio de glucosiltransferase tendo peno menos uma mutação e um domínio de protease de cisteína tendo pelo menos uma mutação, relativo a toxina de Clostridium difficile do tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade, a célula carente de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina.
[0494] Em uma outra modalidade, o método inclui culturar uma célula de C. difficile recombinante ou uma progênie do mesmo sob condições compatíveis para expressar um polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, sendo que a célula inclui o polinucleotídeo codificando a toxina de C. difficile mutante e a célula carente de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina de C. difficile.
[0495] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir a toxina de C. difficile mutante. O método inclui as etapas de: (a) contatar uma célula de C. difficile com uma célula de Escherichia coli recombinante, sendo que a célula de C. difficile carece de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina de C. difficile e a célula de E. coli inclui um polinucleotídeo que codifica a toxina de C. difficile mutante; (b) culturar a célula de C. difficile e a célula de E. coli sob condições compatíveis para a transferência do polinucleotídeo da célula de E. coli para a célula de C. difficile; (c) selecionar a célula de C. difficile compreendendo o polinucleotídeo codificando a toxina de C. difficile mutante; (d) culturar a célula de C. difficile da etapa (c) sob condições compatíveis para expressar o polinucleotídeo; e (e) isolar a toxina de C. difficile mutante.
[0496] No método inventivo, a célula de E. coli recombinante inclui um polinucleotídeo heterólogo que codifica a toxina de C. difficile mutante, descrito aqui. O polinucleotídeo pode ser um DNA ou RNA. Em uma modalidade exemplar, o polinucleotídeo que codifica a toxina de C. difficile mutante é um otimizado por códon para o uso de códon de E. coli. Os métodos para otimizar o códon de um polinucleotídeo são conhecidos na arte.
[0497] Em uma modalidade, o polinucleotídeo inclui uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a um polinucleotídeo codificando um TcdA de C. difficile mutante, como descrito acima. Em uma modalidade, o polinucleotídeo inclui uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a um polinucleotídeo codificando um polipeptídio tendo qualquer uma das sequências selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761. Um polinucleotídeo exemplar codificando uma toxina de C. difficile mutante A inclui a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 44, e SEQ ID NO: 45.
[0498] Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo inclui uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a um polinucleotídeo codificando um TcdB de C. difficile mutante, como descrito acima. Um polinucleotídeo exemplar codificando uma toxina de C. difficile mutante B inclui a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 46, e SEQ ID NO: 47. Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo codifica a SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, ou SEQ ID NO: 86.
[0499] Em uma modalidade, a célula de E. coli que inclui o polinucleotídeo heterólogo é uma célula E. coli que hospeda estavelmente o polinucleotídeo heterólogo, que codifica a toxina de C. difficile mutante. As células de E. coli exemplares incluem uma célula selecionada partir de um grupo consistindo de MAX Efficiency® Stbl2™ E. coli Competent Cells (Invitrogen, Carlsbad, CA), One Shot® Stbl3™ Chemically Competent E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA), ElectroMAX™ Stbl4™ E. coli Competent Cells (Invitrogen ), e E. coli CA434. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira clonando o E. coli não é DH5α. Mais preferencialmente, a célula hospedeira clonando o E. coli é uma MAX Efficiency® Stbl2™ E. coli Competent Cell.
[0500] O método inventivo ainda inclui uma etapa de culturar a célula de C. difficile e a célula de E. coli sob condições compatíveis para transferir o polinucleotídeo da célula E. coli para a célula C. difficile, resultando em uma célula de C. difficile recombinante. Em uma modalidade preferida, as condições de cultura são compatíveis para transferir o polinucleotídeo da célula E. coli (a célula doadora) para dentro da célula de C. difficile (a célula receptora), e resultando em um aherança estável geneticamente.
[0501] Mais preferencialmente, as condições de cultura são compatíveis para uma conjugação bacteriana, que são conhecidas na arte. A “conjugação” refere-se a um processo particular de transferência de polinucleotídeo em que uma transferência unidirecional de um polinucleotídeo (por exemplo, de um plasmídeo bacteriano) ocorre de uma célula bacteriana (isto é, o “doador”) para outra (isto é, o “receptor”). O processo de conjugação envolve o contato da célula do doador coma célula do receptor. Preferencialmente, a célula doadora de E. coli é uma célula E. coli CA434.
[0502] As condições exemplares compatíveis (conjugação) para a transferência do polinucleotídeo da célula de E. coli para a célula de C. difficile inclui culturas de líquido de crescimento de C. difficile em um caldo infusão de cérebro coração (BHI; Oxoide) ou caldo anaeróbico de Schaedlers (SAB; Oxoide). Em uma outra modalidade, as culturas sólidas de C. difficile podem ser crescidas em um ágar de sangue fresco (FBA) ou um ágar BHI. Preferencialmente, o C. difficile é crescido a 37°C em um ambiente anaeróbico (por exemplo, 80% N2, 10% CO2, e 10% H2 [vol/vol]). Em uma modalidade, a condição compatível inclui crescer o E. coli aerobicamente em um caldo de Luria-Bertani (LB) ou em um agar LB a 37°C. para a transferencia conjugativa para o C. difficile, uma condição compatível exemplar inclui crescer o E. coli anaerobicamente em FBA. Os antibióticos podem ser incluídos no meio líquido ou sólido como é conhecido na arte. Os exemplos de tais antibióticos incluem cicloserina (250 μg/ml), cefoxitina (8 μg/ml), cloranfenicol (12,5 μg/ml), tianfenicol (15 μg/ml), e eritromicina (5 μg/ml).
[0503] O método inventivo adicionalmente inclui uma etapa de selecionar a célula de C. difficile recombinante resultante que inclui o polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante. Em uma modalidade exemplar, a célula de C. difficile recombinante é um receptor do polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante a partir de uma célula de E. coli recombinante através de conjugação.
[0504] O método inventivo inclui uma etapa de culturar a célula recombinante ou a progênie do mesmo sob condições compatíveis para expressar o polinucleotídeo codificando a toxina de C. difficile mutante, resultando na produção de uma toxina de C. difficile mutante. As condições compatíveis para uma célula recombinante para expressar o polinucleotídeo incluem condições de cultura compatíveis para o crescimento de uma célula C. difficile, que são conhecidas na arte. Por exemplo, as condições compatíveis pode incluir culturar os transformantes de C. difficile em um caldo infusão de cérebro coração (BHI; Oxoide) ou um caldo anaeróbico de Schaedlers (SAB; Oxoide). Em uma outra modalidade, as culturas de C. difficile sólidas podem ser crescidas em FBA ou agar BHI. Preferencialmente, o C. difficile é crescido a 37°C em um ambiente anaeróbico (por exemplo, 80% N2, 10% CO2, e 10% H2 [vol/vol]).
[0505] Em uma modalidade, o método inventivo inclui uma etapa de isolar a toxina de C. difficile mutante resultante. Os métodos e isolamento de uma proteína a partir de C. difficile são conhecidos na arte.
[0506] Em uma outra modalidade, o método inclui uma etapa de purificar a toxina de C. difficile mutante resultante. Os métodos de purificação de um polipeptídio, tais como cromatografia, são conhecidos na arte.
[0507] Em uma modalidade exemplar, o método ainda inclui uma etapa de contatar a toxina de Clostridium difficile mutante isolada com um agente de ligação em cruz química descritos acima. Preferencialmente, o agente inclui formaldeído, etil- 3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida, ou uma combinação de EDC e NHS. As condições de reação exemplares são descritas acima e nos exemplos na seção abaixo.
[0508] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica incluindo uma toxina de C. difficile mutante descrita aqui, produzida por qualquer método, preferencialmente por qualquer um dos métodos de modificação descritos acima.
ANTICORPOS
[0509] Surpreendentemente, as composições imunogênicas inventivas descritas acima provocaram novos anticorpos in vivo, sugerindo que as composições imunogênicas incluem uma estrutura nativa preservada (por exemplo, um epítopo antigênico preservado) da toxina de C. difficile do tipo selvagem respectiva e que as composições imunogênicas incluem um epítopo. Os anticorpos produzidos contra uma toxina de tal cepa de C. difficile podem ser capazes de ligar a uma toxina correspondente produzida por outra cepa de C. difficile. Isto é, os anticorpos e os fragmentos de ligação dos mesmos podem por “reação em cruz,” que refere-se a uma capacidade de reagir com locais antigênicos similares nas toxinas produzidas a partir de cepas de C. difficile múltiplas. A reatividade em cruz também inclui a capacidade de um anticorpo reagir com ou ligar um antígeno que não estimula sua produção, isto é, a reação entre um antígeno e um anticorpo que foi gerado contra um antígeno similar, mas diferente.
[0510] Em um aspecto, os inventores surpreendentemente descobriram anticorpos monoclonais tendo um efeito neutralizador nas toxinas de C. difficile, e os métodos de produção do mesmo. Os anticorpos inventivos podem neutralizar a citotoxidade da toxina de C. difficile in vitro, inibir a ligação da toxina de C. difficile a células de mamíferos, e/ou pode neutralizar a enterotoxicidade da toxina de C. difficile in vivo. A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados que incluem sequências de ácido nucléico codificando qualquer uma das modificações acima mencionadas. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de qualquer uma das composições acima mencionadas para tratar, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir as ocorrências de, e/ou retardar o início de uma infecção por um C. difficile, doença associada a um C. difficile, síndrome, condição sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual a composição não é administrada, assim como os métodos para a preparação ode tais composições.
[0511] Os inventores ainda descobriram que uma combinação de pelo menos dois dos anticorpos monoclonais neutralizantes podem exibir um efeito sinérgico inesperadamente na respectiva neutralização de TcdA ou TcdB. Os anticorpos antitoxina ou os fragmentos de ligação do mesmo podem ser úteis na inibição de uma infecção por C. difficile.
[0512] Um “anticorpo” é uma proteína incluindo pelo menos uma ou duas regiões variáveis de cadeia pesada (H) (abreviada aqui como VH), e pelo menos uma ou duas regiões variáveis de cadeia leve (L) (abreviada aqui como VL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominada “regiões determinando complementariedade” (“CDR”), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas “regiões estruturais” (FR). A extensão da região de estrutura e os CDRs tem sido precisamente definida (veja, Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, e Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). O termo “anticorpo” inclui imunoglobulinas intactas dos tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (assim como os subtipos dos mesmos), sendo que as cadeias leves da imunoglobulina podem ser tipos kappa ou lambda.
[0513] As moléculas de anticorpos podem ser de comprimento complete (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4). Os anticorpos podem ser de vários isótipos, incluindo: IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, ou IgE. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um isótipo IgG, por exemplo, IgG1. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo IgE.
[0514] Em uma outra modalidade, a molécula de anticorpo inclui um “fragmentoo de ligação ao antígeno” ou “fragmentoo de ligação,” como usado aqui, que se refere a uma parte de um anticorpo que se liga especificamente a uma toxina de C. difficile (por exemplo, toxina A). o fragmentoo de ligação é, por exemplo, uma molécula em que uma ou mais cadeias de imunoglobulina não seja de comprimento completo, mas que se ligue especificamente a uma toxina.
[0515] Os exemplos de partes de ligação abrangidas dentro do termo “fragmentoo de ligação” de um anticorpo incluem (i) um fragmentoo Fab, um fragmentoo monovalente consistindo de VL, VH, CL e domínios CH1; (ii) um fragmentoo F(ab’) 2, um fragmentoo bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de charneira; (iii) um fragmentoo Fd consistindo de domínios VH e CH1; (iv) um fragmentoo Fv consistindo de domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmentoo dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementariedade isolada (CDR) tendo uma estrutura de trabalho para ligar especificamente, por exemplo, uma parte de ligação ao antígeno de uma região variável.
[0516] Um fragmentoo de ligação de uma região variável de cadeia leve e um fragmentoo de ligação de uma região variável de cadeia pesada, por exemplo, os dois domínios do fragmentoo Fv, VL e VH, podem ser juntados, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que os possibilita a serem feitos como uma cadeia de proteína única na qual o par de regiões VL e VH para formar pares de regiões para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única também são abrangidos dentro do termo “fragmentoo de ligação” de um anticorpo. Estas partes de anticorpo são obtidas usando técnicas conhecidas na arte, e as posições são escaneadas e as partes são rastreadas para a utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[0517] Como usado aqui, um anticorpo que “se liga especificamente” a ou é “especifico” para um polipeptídio particular ou um epítopo em um polipeptídio particular é um anticorpo que se liga a aquele polipeptídio articular sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídio ou epítopo de polipeptídio. Por exemplo, quando se referindo a uma biomolécula (por exemplo, proteína, ácido nucléico, anticorpo, etc.) que “se liga especificamente” a um alvo, a biomolécula se liga a sua molécula alvo e não se liga em uma quantidade significante a outras moléculas em uma população heterogênea de moléculas que incluem o alvo, como medido sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio no caso de um anticorpo). A reação de ligação entre o anticorpo e seu alvo é determinativa para a presença do alvo na população heterogênea das moléculas. Por exemplo, “ligação específica” ou “se liga especificamente” refere-se a capacidade de um anticorpo ou um fragmentoo de ligação do mesmo de se ligar a uma toxina de C. difficile do tipo selvagem e/ou mutante com uma afinidade que é pelo menos duas dobras maior do que sua afinidade para o antígeno não específico.
[0518] Em uma modalidade exemplar, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico pode ser produzido por técnicas de DNA recombinantes conhecidas na arte. Por exemplo, um gene codificando a região constante Fc de uma molécula de anticorpo monoclonal de murino (ou outras espécies) pode ser digerida com as enzimas de restrição para remover a região codificando o Fc murino, e a parte equivalente de um gene codificando uma região constante Fc humano é substituída. Um anticorpo quimérico também pode ser criado por técnicas de DNA recombinante onde o DNA codificando as regiões variáveis de murino possam ser ligadas ao DNA codificando as regiões constantes humana.
[0519] Em outra modalidade exemplar, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é humanizado por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, uma vez que os anticorpos de murino são obtidos, um CDR do anticorpo pode ser substituído com pelo menos uma parte de um CDR humano. Os anticorpos humanizados também podem ser gerados substituindo as sequências de região variável Fv murino que não são envolvidas diretamente na ligação do antígeno com as sequências equivalentes a partir das regiões variáveis Fv humano. Os métodos gerais para a geração de anticorpos humanizados são conhecidos na arte.
[0520] Por exemplo, os anticorpos monoclonais direcionados na direção dos C. difficile TcdA ou C. difficile TcdB também podem ser produzidos por tecnicas padrão, tais como uma técnica de hibridoma (veja, por exemplo, Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497). Em resumo, uma linha de célula imortal é fundida a um linfócito a partir de um mamífero imunizado com C. difficile TcdA, C. difficile TcdB, ou uma toxina de C. difficile mutante descrita aqui, e os sobrenadantes da cultura das células de hibridoma resultantes são rastreados para identificar um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal que se liga ao C. difficile TcdA ou C. difficile TcdB. Tipicamente, a linha de célula imortal é derivada das mesmas espécies de mamíferos que os linfócitos. As células de hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal da invenção são detectadas rastreando os sobrenadantes da cultura de hibridoma para anticorpos que se ligam ao C. difficile TcdA ou C. difficile TcdB usando um ensaio, tais como ELISA. Os hibridomas humanos podem ser preparados de uma maneira similar.
[0521] Como uma alternativa para a produção de anticorpos por imunização e seleção, os anticorpos da invenção também podem ser identificados rastreando uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante com um C. difficile TcdA, C. difficile TcdB, ou uma toxina de C. difficile mutante descrita aqui. A biblioteca de anticorpo recombinante pode ser uma biblioteca scFv ou uma biblioteca Fab, por exemplo. Além disso, os anticorpos inventivos descritos aqui podem ser usados em estudos de ligação competitiva para identificar anticorpos anti-TcdA ou anti-TcdB adicionais e fragmentos de ligação do mesmo. Por exemplo, os anticorpos anti- TcdA ou anti-TcdB adicionais e os fragmentos de ligação dos mesmos podem ser identificados rastreando uma biblioteca de anticorpo humano e identificando moléculas dentro da biblioteca que competem com os anticorpos inventivos descritos aqui em um ensaio de ligação competitivo.
[0522] Além disso, os anticorpos abrangidos pela presente invenção incluem anticorpos recombinantes que podem ser gerados usando métodos de exibição de fago conhecido na arte. Nos métodos de exibição de fago, o fago pode ser usado para exibir os domínios de ligação de antígeno expressos a partir de um repertório ou uma biblioteca de anticorpo (por exemplo, humano ou murino). O fago expressando um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um imunógeno descrito aqui (por exemplo, uma toxina de C. difficile mutante) pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando um antígeno de marcação.
[0523] Também estão dentro do escopo da invenção os anticorpos e os fragmentos de ligação dos mesmos em que os aminoácidos específicos tenham sido substituídos, deletados, ou adicionados. Em particular, os anticorpos preferidos têm substituições de aminoácidos na região de estrutura, tais como para melhorar a ligação ao antígeno. Por exemplo, um número pequeno selecionado de resíduos de estrutura de receptor da cadeia de imunoglobulina pode ser substituído pelos aminoácidos de doador correspondentes. As localizações preferidas das substituições incluem os resíduos de aminoácido adjacentes ao CDR, ou que são capazes de interagir com um CDR. O critério para selecionar os aminoácidos a partir do doador são U.S. Pat. No. 5,585,089 (por exemplo, colunas 12-16). A estrutura aceitadora pode ser uma sequência de estrutura de anticorpo humano madura ou uma sequência de consenso.
[0524] Como usado aqui, um “anticorpo de neutralização ou um fragmentoo de ligação do mesmo” refere-se a um anticorpo respectivo ou um fragmentoo de ligação do mesmo que se liga a um patógeno (por exemplo, um C. difficile TcdA ou TcdB) e reduz a infectividade e/ou uma atividade do patógeno (por exemplo, reduz a citotoxidade) em um mamífero e/ou na cultura de célula, quando comparado a um patógeno sob condições idênticas na ausência do anticorpo de neutralização ou um fragmentoo de ligação do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo de neutralização ou fragmentoo de ligação do mesmo é capaz de neutralizar pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou mais de uma atividade biológica do patógeno, quando comparado a uma atividade biológica do patógeno sob condições idênticas na ausência do anticorpo de neutralização ou um fragmentoo de ligação do mesmo.
[0525] Como usado aqui, o termo "anticorpo antitoxina ou um fragmentoo de ligação do mesmo" refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo que se liga a toxina de C. difficile respectiva (por exemplo, uma toxina de C. difficile A ou toxina B). Por exemplo, um anticorpo de antitoxina A ou fragmentoo de ligação do mesmo refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo que se liga ao TcdA. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação do mesmo descritos aqui podem ser aumentados em qualquer mamífero, do tipo selvagem e/ou transgênico, incluindo, por exemplo, camundongo, humanos, coelhos e cabras.
[0526] Quando uma composição imunogênica descrita acima é uma que tenha sido anteriormente administrada a uma população, tais como para vacinação, a resposta do anticorpo gerada nos sujeitos pode ser usada para neutralizar as toxinas a partir da mesma cepa e a partir de uma cepa que não estimulou a produção do anticorpo. Veja, por exemplo, o Exemplo 37, que mostra os estudos relacionados a uma reatividade em cruz, gerada pela composição imunogênica, entre a cepa 630 e as toxinas de várias cepas de C. difficile do tipo selvagem.
[0527] Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo especifico para C. difficile TcdA. Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao TcdA incluem A65-33; A60-22; A80-29 e/ou, preferencialmente, A3-25.
[0528] Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para uma cepa de TcdA a partir de C. difficile do tipo selvagem, tais como aquelas descritas acima, por exemplo, para a SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para uma composição imunogênica descritas acima. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo or fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7, sendo que pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7 é ligado em cruz por formaldeído, EDC, NHS, ou uma combinação de EDC e NHS. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou o fragmentoo de anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui uma SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 83.
[0529] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação do mesmo tendo regiões de cadeia variável pesada e de cadeia variável leve que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% de identidade para as regiões de cadeia pesada variável e cadeia leve variável de A65-33; A60-22; A80-29 e/ou, preferencialmente, A3-25 também podem se ligar ao TcdA.
[0530] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de A3- 25 como estabelecido na SEQ ID NO: 37.
[0531] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou o fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de A3-25 como estabelecido na SEQ ID NO: 36.
[0532] Ainda em um outro aspecto, o anticorpo ou fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 37, e uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO: 36.
[0533] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou os fragmentos de ligação do mesmo tendo regiões determinado complementariedade (CDRs) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de A65-33; A60-22; A80-29 e/ou, preferencialmente, A3-25 também podem se ligar ao TcdA. Os CDRs da região de cadeia pesada variável de A3-25 são mostrados na Tabela 4, abaixo. Tabela 4: Sequências de aminoácido CDR de cadeia pesada variável
Figure img0011
[0534] Os CDRs da região de cadeia leve variável de A3-25 são mostrados na Tabela 5, abaixo.
Figure img0012
[0535] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo inclui sequências de aminoácido das regiões determinado complementariedade de cadeia pesada (CDRs) como mostrado na SEQ ID NOs: 41 (CDR H1), 42 (CDR H2) e 43 (CDR H3), e/ou a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRs como mostrado na SEQ ID NOs: 38 (CDR L1), 39 (CDR L2) e 40 (CDR L3).
[0536] Em uma modalidade exemplar, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile A se liga especificamente a um epítopo dentro da região N-terminal do TcdA por exemplo, um epítopo entre os aminoácidos 1-1256 do TcdA, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1.
[0537] Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile A se liga especificamente a um epítopo da região C-terminal da toxina A, por exemplo, um epítopo entre aminoácidos 1832 a 2710 do TcdA, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1. Os exemplos incluem A3- 25; A65-33; A60-22; A80-29.
[0538] Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile A se liga especificamente a um epítopo dentro da região de “translocação” da toxina C. difficile A, por exemplo, um epítopo que preferencialmente inclui os resíduos 956-1128 de um TcdA, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1, tais como um epítopo entre os aminoácidos 6591832 de um TcdA, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 1.
[0539] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para C. difficile TcdB. Por exemplo, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo pode ser específico para um TcdB de qualquer cepa de C. difficile do tipo selvagem, tais como aquelas descritas acima, por exemplo, para a SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para uma composição imunogênica descrita acima. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.
[0540] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, sendo que pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 é ligado em cruz pelo formaldeído, EDC, NHS, ou uma combinação de EDC e NHS. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 85.
[0541] Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao TcdB incluem anticorpos produzidos pelos clones B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; e/ou, preferencialmente, B8-26 descritos aqui.
[0542] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação do mesmo que também podem se ligar ao TcdB incluem aqueles tendo regiões de cadeia pesada variável e de cadeia leve variável que são pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% idênticas as regiões de cadeia pesada e de cadeia leve variável de B2-31; B5-40, B70-2; B6- 30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6, preferencialmente B8-26, B59-3, e/ou B9-30.
[0543] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de A3- 25 como estabelecido na SEQ ID NO: 49.
[0544] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de A3- 25 como estabelecido na SEQ ID NO: 60.
[0545] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de A3- 25 como estabelecido na SEQ ID NO: 71.
[0546] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de A3-25 como estabelecido na SEQ ID NO: 55.
[0547] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de A3-25 como estabelecido na SEQ ID NO: 66.
[0548] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de A3-25 como estabelecido na SEQ ID NO: 77.
[0549] A sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de C. difficile TcdB (B8-26 mAb) é estabelecida na SEQ ID NO: 49. Veja a Tabela 25-a.
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[0550] A sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização do C. difficile TcdB (B8-26 mAb) é estabelecida na SEQ ID NO: 55. Veja a tabela 25-b.
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[0551] Em uma mod alidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo inclui sequências de aminoácido de CDRs de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NOs: 51 (CDR H1), 52 (CDR H2) e 53 (CDR H3), e/ou a sequência de aminoácidos de CDRs de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NOs: 57 (CDR L1), 58 (CDR L2) e 59 (CDR L3).
[0552] A sequência de aminoácido para a cadeia pesada variável de um anticorpo de neutralização de C. difficile TcdB (B59-3 mAb) é estabelecida na SEQ ID NO: 60. Veja a tabela 26-a.
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[0553] A sequência de aminoácido para a cadeia leve variável de um anticorpo de neutralização de C. difficile TcdB (B59-3 mAb) é estabelecida na SEQ ID NO: 66. Veja a tabela 26-b.
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[0554] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo inclui sequências de aminoácido de CDRs de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NOs: 62 (CDR H1), 63 (CDR H2) e 64 (CDR H3), e/ou a sequência de aminoácidos de CDRs de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NOs: 68 (CDR L1), 69 (CDR L2) e 70 (CDR L3).
[0555] A sequência de aminoácido para a cadeia pesada de um anticorpo de neutralização de C. difficile TcdB (B9-30 mAb) é estabelecida na SEQ ID NO: 71. Veja a tabela 27-a.
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[0556] A sequência de aminoácido para a cadeia leve de um anticorpo de neutralização de C. difficile TcdB (B9-30 mAb) éestabelecida na SEQ ID NO: 77. Veja a tabela 27-b.
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[0557] Em uma modalidade, o anticorpo or fragmentoo de ligação do mesmo inclui sequências de aminoácido CDRs de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NOs: 73 (CDR H1), 74 (CDR H2) e 75 (CDR H3), e/ou a sequência de aminoácidos CDRs de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NOs: 79 (CDR L1), 80 (CDR L2) e 81 (CDR L3).
[0558] Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para um C. difficile TcdB do tipo selvagem a partir de qualquer cepa de C. difficile, tais como aquelas descritas acima, por exemplo, para a SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para uma composição imunogênica descritas acima. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo é específico para uma composição imunogênica que inclui a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, sendo que pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 é ligado em cruz pelo formaldeído, EDC, NHS, ou uma combinação de EDC e NHS.
[0559] Os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos tendo regiões de cadeia variável pesada e cadeia leve variável que são pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, preferencialmente cerca de 98%, mais preferencialmente cerca de 99% ou mais preferencialmente cerca de 100% idênticas as regiões de cadeia pesada e de cadeia leve variável de B2-31; B5-40, B70-2; B6- 30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; e/ou, preferencialmente, B8-26 também podem se ligar ao TcdB.
[0560] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de B8- 26 (SEQ ID NO: 49).
[0561] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de B8-26 (SEQ ID NO: 55).
[0562] Ainda em outro aspecto, o anticorpo ou um fragmentoo de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região de cadeia pesada variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia pesada variável de B8- 26 (SEQ ID NO: 49), e uma região de cadeia leve variável incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido de região de cadeia leve variável de B8-26 (SEQ ID NO: 55).
[0563] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos tendo CDRs de cadeias pesada variável e/ou cadeias leve variável de B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; e/ou, preferencialmente, B8-26 também podem se ligar ao TcdB.
[0564] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo inclui sequências de aminoácido das regiões determinando complementariedade de cadeia pesada (CDRs) de B8-26, e/ou a sequência de aminoácidos CDRs de cadeia leve de B8-26.
[0565] Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile toxin B se liga especificamente a um epítopo dentro da região N-terminal da toxina B, por exemplo, um epítopo entre aminoácidos 1-1256 de um TcdB, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2. Os exemplos incluem B2- 31; B5-40; B8-26; B70-2; B6-30; e B9-30.
[0566] Em uma modalidade exemplar, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile B se liga especificamente a um epítopo dentro da região C-terminal da toxina B, por exemplo, um epítopo entre aminoácidos 1832 a 2710 de um TcdB, de acordo com a numeração da SEQ ID NO: 2.
[0567] Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmentoo de ligação do mesmo específico para a toxina C. difficile B se liga especificamente a um epítopo dentro da região de “translocação” de uma toxina C. difficile B, por exemplo, um epítopo que preferencialmente inclui os resíduos 956-1128 de um TcdB, de acordo com numeração da SEQ ID NO: 2, tais como um epítopo entre aminoácidos 659-1832 de um TcdB. Os exemplos incluem B59-3; B60- 2; e B56-6.
COMBINAÇÕES DE ANTICORPOS
[0568] O anticorpo antitoxina ou o fragmentoo de ligação dos mesmos podem ser administrados em combinação com outros anticorpos antitoxina C. difficile (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, gamaglobulina policlonal) ou um fragmentoo de ligação do mesmo. As combinações que podem ser usadas incluem um anticorpo antitoxina A ou um fragmentoo de ligação dos mesmos e um anticorpo antitoxina B ou um fragmentoo de ligação dos mesmos.
[0569] Em outra modalidade, uma combinação inclui um anticorpo antitoxina A ou um fragmentoo de ligação dos mesmos e outro anticorpo antitoxina A ou um fragmentoo de ligação dos mesmos. Preferencialmente, a combinação inclui um anticorpo monoclonal antitoxina A de neutralização ou fragmentoo de ligação dos mesmos e outro anticorpo monoclonal antitoxina A de neutralização ou fragmentoo de ligação dos mesmos. Surpreendentemente, os inventores descobriram que tal combinação resultou em um efeito sinérgico na neutralização da citotoxidade da toxina A. por exemplo, uma combinação inclui uma combinação de pelo menos dois dos seguintes anticorpos monoclonais antitoxina A de neutralização: A3- 25; A65-33; A60-22; e A80-29. Mais preferencialmente, a combinação inclui o anticorpo A3-25 e pelo menos um dos seguintes anticorpos monoclonais antitoxina A de neutralização: A65-33; A60-22; e A80-29. Mais preferencialmente, a combinação inclui todos os quatro anticorpos: A3-25; A65-33; A60-22; e A80-29.
[0570] Em uma outra modalidade, a combinação inclui um anticorpo antitoxina B ou um fragmentoo de ligação dos mesmos e outro anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos. Preferencialmente, a combinação inclui um anticorpo monoclonal antitoxina B de neutralização ou fragmentoo de ligação dos mesmos e outro anticorpo monoclonal antitoxina B de neutralização fragmentoo de ligação dos mesmos. Surpreendentemente, os inventores descobriram que que tal combinação resultou em um efeito sinérgico na neutralização da citotoxidade da toxina B. Mais preferencialmente, a combinação inclui uma combinação de pelo menos dois dos seguintes anticorpos monoclonais antitoxina B de neutralização: B8- 26; B9-30 e B59-3. Mais preferencialmente, a combinação inclui todos os três anticorpos: B8-26; B9-30 e B59-3.
[0571] Ainda em outra modalidade, uma combinação inclui um anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos e outro anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos. Como estabelecido anteriormente, os inventores descobriram que uma combinação de pelo menos dois dos anticorpos monoclonais de neutralização podem exibir efeitos sinérgicos na neutralização respectiva da toxina A e da toxina B.
[0572] Em outra modalidade, os agentes da invenção podem ser formulados como uma mistura, ou ligados quimicamente ou geneticamente usndo as técnicas reconhecidas na arte resultando ali em anticorpos ligados covalentemente s (ou fragmentos de anticorpos ligados covalentemente), tendo ambas as propriedades de ligação antitoxina A e antitoxina B. a formulação combinada pode ser guiada por uma determinação de um ou mais parâmetros tais como afinidade, avidez, ou eficácia biológica do agente sozinho ou em combinação com outro agente.
[0573] Tais terapias de combinação são preferencialmente aditivas e/ou sinérgicas em sua atividade terapêutica, por exemplo, na inibição, prevenção (por exemplo, de recaída), e/ou tratamento de doenças ou distúrbios relacionados ao C. difficile. A administração de tais terapias de combinação pode diminuir a dosagem do agente terapêutico (por exemplo, o anticorpo ou uma mistura de fragmentoo de anticorpo, ou um fragmentoo de anticorpo ou anticorpo biespecífico fundido geneticamente ou ligado em cruz) necessária para alcançar o efeito desejado.
[0574] Entende-se que qualquer uma das composições inventivas, por exemplo, uma antitoxina A e/ou anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos, pode ser combinada em diferentes proporções ou quantidades para o efeito terapêutico. Por exemplo, a antitoxina A e o anticorpo antitoxina B ou o respectivo fragmentoo de ligação dos mesmos pode estar presente em uma composição em uma proporção na faixa de 0,1:10 a 10:0,1, A:B. Em outra modalidade, a antitoxina A e o anticorpo antitoxina B ou respectivo fragmentoo de ligação dos mesmos pode estar presente em uma combinação em uma proporção na faixa de 0,1:10 a 10:0,1, B:A.
[0575] Em outro aspecto, a invenção refere-se um método para produzir um anticorpo de neutralização contra um C. difficile TcdA. O método inclui administrar uma composição imunogênica como descrita acima a um mamífero, e recuperar o anticorpo do mamífero. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica inclui um C. difficile TcdA mutante tendo a SEQ ID NO: 4, sendo que pelo menos um aminoácido de C. difficile TcdA mutante seja ligado em cruz quimicamente, preferencialmente por um formaldeído ou 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida. Os anticorpos de neutralização exemplares contra TcdA que podem ser produzidos incluem A65-33; A60-22; A80-29 e/ou A3-25.
[0576] Ainda em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir um anticorpo de neutralização contra um C. difficile TcdB. O método inclui administrar uma composição imunogênica como descrita acima a um mamífero, e recuperar o anticorpo do mamífero. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica inclui um C. difficile TcdB mutante tendo a SEQ ID NO: 6, sendo que pelo menos um aminoácido de C. difficile TcdB mutante é ligado em cruz quimicamente, preferencialmente por um formaldeído ou 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida. Os anticorpos de neutralização exemplares contra TcdB que podem ser produzidos incluem B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; e/ou B8-26.
FORMULAÇÕES
[0577] As composições da presente invenção (tais como, por exemplo, as composições incluindo uma toxina C. difficile mutante, composições imunogênicas, anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao anticorpo dos mesmos descritas aqui) podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas sólida e semissólida de dosagem, supositórios, formas líquidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções de infusão ou injetáveis), dispersões ou suspensões, lipossomas, e/ou forma seca, tais como, por exemplo, forma de pó liofilizado, forma seca congelada, forma seca de pulverização, e/ou forma seca de espuma. Para os supositórios, os ligantes e os carregadores incluem, por exemplo, polialquileno glicois ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo as composições inventivas. Em uma modalidade exemplar, a composição está na forma que é compatível para a solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção. Em outra modalidade exemplar, a composição é emulsificada em lipossomas ou micropartículas, tais como polilactideo, poliglicolideo, ou copolímero.
[0578] Em uma modalidade preferida, a composição é liofilizada e reconstituída extemporaneamente antes do uso.
[0579] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que incluem qualquer uma das combinações descritas aqui (tais como, por exemplo, as composições incluindo uma toxina de C. difficile mutante, composições imunogênicas, anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao anticorpo dos mesmos descritos aqui), formulados juto com um carregador aceitável farmaceuticamente. Os “carregadores aceitáveis farmaceuticamente” incluem quaisquer solventes, meio de dispersão, estabilizadores, diluentes, e/ou tampões que são compatíveis fisiologicamente.
[0580] Os estabilizadores exemplares incluem carboidratos, tais como sorbitol, mannitol, amido, dextrano, sacarose, trealose, lactose, e/ou glicose; proteínas inertes, tais como albumina e/ou caseína; e/ou outras macromoléculas maiores metabolizadas lentamente, tais como polissacarídeos tais como quitosana, ácido poliláctico, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como látex funcionalizado SEPHAROSE™ agarose, agarose, celulose, etc), aminoácidos, aminoácidos poliméricos, aminoácidos de copolímeros, e lipídios agregados (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes carregadores podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).
[0581] Preferencialmente, a composição inclui trealose. As quantidades preferidas de trealose (% por peso) incluem de um mínimo de cerca de 1%, 2%, 3%, ou 4% a um máximo de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, ou 5%. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 3% - 6% trealose, mais preferencialmente, 4,5% trealose, por exemplo, por 0,5 mL dose.
[0582] Os exemplos de diluentes compatíveis incluem água destilada, salmoura, salmoura tamponada com fosfato fisiológico, glicerina, álcool (tais como etanol), soluções de Ringer, solução de dextrose, soluções de sal Hank balanceadas, e/ou um excipiente liofilizado.
[0583] Os tampões exemplares incluem fosfato (tais como fosfato de potássio, fosfato de sódio); acetato (tais como acetato de sódio); succinato (tais como succinato de sódio); glicina; histidina; carbonato, Tris (tris(hidroximetil)aminometano), e/ou tampões de bicarbonato (tais como bicarbonato de amônio). Preferencialmente, a composição inclui um tampão tris. As quantidades preferidas de tampão tris incluem de um mínimo de cerca de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM,19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM, ou 11 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 8 mM a 12 mM tampões de tris, mais preferencialmente, 10 mM tampões de tris, por exemplo, por 0,5 mL dose.
[0584] Em outra modalidade preferida, a composição inclui um tampão de histidina. As quantidades preferidas de tampão de histidina incluem de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM,19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM, ou 11 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 8 mM a 12 mM de tampão de histidina, mais preferencialmente, 10 mM de tampão de histidina, por exemplo, por 0,5 mL dose.
[0585] Ainda em outra modalidade preferida, a composição inclui um tampão de fosfato. As quantidades preferidas de tampão de fosfato incluem de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM,19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM, ou 11 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 8 mM a 12 mM tampão de fosfato, mais preferencialmente, 10 mM tampão de fosfato, por exemplo, por 0,5 mL dose.
[0586] O pH do tampão será escolhido geralmente para estabilizar o material ativo de escolha, e pode ser determinável pelos peritos na arte por métodos conhecidos. Preferencialmente, o pH do tampão será na faixa de um pH fisiológico. Desse modo, as faixas de pH preferidas são de cerca de 3 a cerca de 8; mais preferencialmente, de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; ainda mais preferencialmente, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5; e o mais preferencialmente, em cerca de 7,0 a cerca de 7,2.
[0587] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem incluir um surfactante. Qualquer surfactante é compatível, tanto aniônico quanto catiônico não iônico anfotérico. Os surfactantes exemplares incluem os surfactantes de ésteres de polioxietileno sorbitano (por exemplo, TWEEN ®), tais como polisorbato 20 e/ou polisorbato 80; éteres de polioxietileno graxo derivados de lauril, cetil, estearil e oleil álcoois (conhecido como surfactantes Brij), tais como trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30); Triton X 100, ou t- octilfenoxipolietoxietanol; e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como os SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaureato de sorbitano, e combinações dos mesmos. Os surfactantes preferidos incluem polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano).
[0588] As quantidades preferidas de polisorbato 80 (% por peso) incluem de um mínimo de cerca de 0,001%, 0,005%, or 0,01%, a um máximo de cerca de 0,010%, 0,015%, 0,025%, ou 1,0%. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 0,005% - 0,015% polisorbato 80, o mais preferencialmente, 0,01% polisorbato 80.
[0589] Em uma modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose e fosfato 80. Em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui um tampão de tris e polisorbato 80. Em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui um tampão de histidina e polisorbato 80. Ainda em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui tampão de fosfato e polisorbato 80.
[0590] Em uma modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão de tris e polisorbato 80. Em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão de histidina e polisorbato 80. Ainda em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão de fosfato e polisorbato 80.
[0591] As composições descritas aqui podem ainda incluir componentes de origem sintética, animal, vegetal, ou petróleo, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, e/ou óleo mineral. Os exemplos incluem glicois tais como propileno glocol ou polietileno glicol.
[0592] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ainda inclui formaldeído. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica que ainda inclui formaldeído tem uma composição imunogênica, sendo que a toxina C. difficile mutante de uma composição imunogênica tenha sido contatada com um agente de ligação em cruz química que inclui formaldeído. A quantidade de formaldeído presente na composição farmacêutica pode variar de um mínimo de cerca de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,010%, 0,013%, ou 0,015%, a um máximo de cerca de 0,020%, 0,019%, 0,018%, 0,017% 0,016%, 0,015%, 0,014%, 0,013%, 0,012% 0,011% ou 0,010%. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Em uma modalidade, a composição farmacêutica inclui cerca de 0,010% formaldeído.
[0593] Em algumas modalidades alternativas, a composição farmacêutica descrita aqui não inclui formaldeído. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica que não inclui formaldeído tem uma composição imunogênica, sendo que pelo menos um aminoácido da toxina C. difficile mutante é ligada em cruz quimicamente por um agente que inclui EDC. Mais preferencialmente, em tais modalidades, a toxina C. difficile mutante não foi contatada com o agente de ligação em cruz químico que inclui formaldeído. Como uma outra modalidade exemplar, uma composição farmacêutica que está na forma liofilizada não inclui formaldeído.
[0594] Em outra modalidade, as composições descritas aqui podem incluem um adjuvante, como descrito abaixo. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta imune intrínseca a um imunógeno sem causar mudanças conformacionais no imunógeno que possam afetar a forma qualitativa da resposta imune.
[0595] Os adjuvantes exemplares incluem 3 De-O-acilado monofosforil lipídio A (MPL™) (veja GB 2220211 (GSK)); um gel de hidróxido de alumínio tais como Alhidrogel™ (Brenntag Biosector, Denmark); sais de alumínio (tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio), que podem ser usados com ou sem um agente imunoestimulantes tais como MPL ou 3-DMP, QS-21, aminoácidos monoméricos ou poliméricos tais como ácido poliglutâmico ou polilisina.
[0596] Ainda outro adjuvante exemplar é um oligonucleotídeo imunoestimulatório tais como um oligonucleotídeo CpG (veja, por exemplo, WO 1998/040100, WO2010/067262), ou uma saponina e um oligonucleotídeo imunoestimulatório, tais como um oligonucleotídeo CpG (veja, por exemplo, WO 00/062800). Em uma modalidade preferida, o adjuvante é um oligonucleotídeo CpG, o mais preferencialmente um oligodeoxinucleotídeos CpG (CpG ODN). Os CpG ODN preferidos são o da Classe B que preferencialmente ativam as células B. Em aspectos da invenção, o CpG ODN tem uma sequência de ácido nucléico 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T sendo que * indica uma ligação fosforotioato. O CpG ODN desta sequência é conhecido como CpG 24555, que é descrito no WO2010/067262. Em uma modalidade preferida, o CpG 24555 é usado junto com um sal de hidróxido de alumínio tal como Alhidrogel.
[0597] Uma outra classe de adjuvantes exemplares inclui adjuvantes de saponina, tais como Stimulon™ (QS-21, que é um glicosídeo triterpeno ou saponina, Aquila, Framingham, Mass.) ou partículas geradas dali tais como ISCOMs (complexos de estimulação imune) e adjuvante ISCOMATRIX ®. Portanto, as composições da presente invenção podem ser entregues na forma de ISCOMs, ISCOMS contendo CTB, lipossomas ou encapsulados em compostos tais como acrilatos ou poli(DL-lactideo-co-glicosideo) para formar microesferas de um tamanho adequado para absorção. Tipicamente, o termo “ISCOM” refere-se a complexos imunogênicos formados entre glicosídeos, tais como saponinas triterpenoide (particularmente Quil A), e antígenos que contém uma região hidrofóbica. Em uma modalidade preferida, o adjuvante é um adjuvante ISCOMATRIX.
[0598] Outros exemplos de adjuvantes incluem RC-529, GM-CSF e Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA).
[0599] Ainda outra classe de adjuvantes exemplares é um glicolipídio análogo incluindo N-glicosilamidas, N-glicosilureas e N- glicosilcarbamatos, cada um dos quais é substituído no resíduo de açúcar por um aminoácido.
[0600] Opcionalmente, a composição farmacêutica inclui dois ou três adjuvantes diferentes. As combinações preferidas de adjuvantes incluem qualquer combinação de adjuvantes incluindo, por exemplo, pelo menos os seguintes adjuvantes: alum, MPL, QS-21, ISCOMATRIX, CpG, e Alhidrogel. Uma combinação exemplar de adjuvantes inclui uma combinação de CpG e Alhidrogel.
[0601] Alternativamente, em uma modalidade, a composição é administrada ao mamífero na ausência de um adjuvante.
[0602] As composições descritas aqui podem ser administradas por qualquer rota de administração, tais como, por exemplo, rotas parenteral, tópico, intravenoso, mucosal, oral, subcutâneo, intraarterial, intracranial, intratecal, intraperitoneal, intranasal, intramuscular, intradermal, infusão, retal, e/ou transdermal para aplicações terapêuticas e/ou profiláticas. Em uma modalidade preferida, a rota de administração de uma composição é parenteral, mais preferencialmente, administração intramuscular. A administração intramuscular típica é realizada nos músculos do braço ou das pernas.
[0603] As composições descritas aqui podem ser administradas em combinação com terapias que são pelo menos eficazes parcialmente na prevenção e/ou tratamento da infecção por C. difficile. Por exemplo, uma composição da invenção pode ser administrada antes, simultaneamente com, ou após a bioterapia; terapia probiótica; implantes de fezes; imunoterapia (tais como imunoglobulina intravenosa); e/ou um padrão aceitado de cuidado para o tratamento com antibiótico de doença associada ao C. difficile (CDAD), tais como metronidazolo e/ou vancomicina.
[0604] Uma composição da presente invenção referindo-se a toxina A e a toxina B pode ser administrada a um mamífero em qualquer combinação. Por exemplo, uma composição imunogênica incluindo um C. difficile TcdA mutante pode ser administrado a um mamífero antes, simultaneamente com, ou após a administração de uma composição imunogênica incluindo um C. difficile TcdB mutante. Por outro lado, uma composição imunogênica incluindo um C. difficile TcdB mutante pode ser administrada a um mamífero antes, simultaneamente com, ou após a administração de uma composição imunogênica incluindo um C. difficile TcdA mutante.
[0605] Em outra modalidade, uma composição incluindo um anticorpo antitoxina A ou fragmentoo de ligação dos mesmos pode ser administrada a um mamífero antes, simultaneamente com, ou após a administração de uma composição incluindo um anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos. Por outro lado, uma composição incluindo um anticorpo antitoxina B ou fragmentoo de ligação dos mesmos pode ser administrada a um mamífero antes, simultaneamente com, ou após a administração de uma composição incluindo um anticorpo antitoxina A ou fragmentoo de ligação dos mesmos.
[0606] Em uma outra modalidade, uma composição da presente invenção pode ser administrada a um mamífero antes, simultaneamente com, ou após a administração de um carregador aceitável farmaceuticamente. Por exemplo, um adjuvante pode ser administrado antes, simultaneamente com, ou após a administração de uma composição incluindo uma toxina C. difficile mutante. Portanto, uma composição da presente invenção e um carregador aceitável farmaceuticamente podem ser embalados no mesmo frasco ou podem ser embalados em frascos separados e misturados antes do uso. As composições podem ser formuladas para uma dose única de administração e/ou uma dose múltipla de administração.
MÉTODOS PARA PROTEGER E/OU TRATAR INFECÇÕES POR C. DIFFICILE EM UM MAMÍFERO
[0607] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de induzir uma resposta imune a uma toxina de C. difficile em um mamífero. O método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição descrita aqui a um mamífero. Por exemplo, o método pode incluir administrar uma quantidade eficaz para gerar uma resposta imune para a toxina de C. difficile no mamífero.
[0608] Em uma modalidade exemplar, a invenção refere-se a um método de induzir uma resposta imune para uma toxina de C. difficile TcdA em um mamífero. O método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica que inclui um C. difficile TcdA mutante a um mamífero. Em outra modalidade exemplar, a invenção refere-se a um método de induzir uma resposta imune para um C. difficile TcdB em um mamífero. O método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica que inclui um C. difficile TcdB mutante a um mamífero.
[0609] Em uma outra modalidade, o método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica que inclui um C. difficile TcdA mutante e uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica que inclui um C. difficile TcdB mutante a um mamífero. Em aspectos adicionais, as composições descritas aqui podem ser usadas para tratar, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir a ocorrência de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintomas, e/ou complicação do mesmo em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual a composição não é administrada. O método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um mamífero.
[0610] Três síndromes clínicas causadas pela infecção por C. difficile são reconhecidas, com base na gravidade da infecção. A forma mais grave é a colite pseudomembranosa (PMC), que é caracterizada por uma diarreia profunda, dor abdominal, sinais sistêmicos de doença, e uma aparência endoscópica distintiva do cólon.
[0611] A colite associada a antibióticos (AAC) também é caracterizada por uma diarreia profusa, dor abdominal e sensibilidade, sinais sistêmicos (por exemplo, febre), e leucocitose. Dano intestinal em AAC é menos grave do que em PMC, a aparência endoscópica característica do cólon em PMC é ausente, e a mortalidade é baixa.
[0612] Finalmente, a diarreia associada a antibiótico (AAD, que também é conhecida como diarreia associada a C. difficile (CDAD) é uma síndrome suave relativamente, e é caracterizada por uma diarreia suave a moderada, carecendo de ambas as inflamações de intestino grosso (como caracterizado por, por exemplo, dor abdominal e sensibilidade) e sinais sistêmicos de infecção (por exemplo, febre).
[0613] As três síndromes distintas tipicamente ocorrem em uma ordem crescente de frequência. Isto é, PMC tipicamente ocorre menos frequentemente do que AAC, e AAD é tipicamente a apresentação clínica mais frequente da doença por C. difficile.
[0614] Uma complicação frequente de infecção por C. difficile é uma doença periódica ou recorrente, que ocorre em até 20% de todos os sujeitos que se recuperam da doença de C. difficile. A recaída pode ser caracterizada clinicamente como AAD, AAC, ou PMC. Os pacientes que recaíram uma ou mais vezes são mais prováveis de recair novamente.
[0615] Como usado aqui, as condições de infecção por um C. difficile incluem, por exemplo, uma infecção suave, suave-a-moderada, moderada, e grave por C. difficile. Uma condição de infecção por C. difficile pode variar dependendo da presença e/ou gravidade dos sintomas da infecção.
[0616] Os sintomas de uma infecção por C. difficile podem incluir sintomas fisiológicos, bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais tais como, por exemplo, diarreia; colite; colite com cólicas, febre, leucócitos fecais e inflamação na biópsia colonica; colite pseudomembranosa; hipoalbuminemia; anasarca; leucocitose; sepse; dor abdominal; assintomáticos; e/ou complicações e fenótipos patológicos presentes durante o desenvolvimento da invenção, e combinações dos mesmos, etc. Portanto, por exemplo, a administração de uma quantidade eficaz das composições descritas aqui pode, por exemplo tratar, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir a ocorrência de, e/ou retardar o início da diarreia, dor abdominal, cólicas, febre, inflamação na biópsia colonica; hipoalbuminemia; anasarca; leucocitose; sepse; assintomáticos, etc., quando comparado a um mamífero ao qual a composição não foi administrada.
[0617] Os fatores de risco de uma infecção por C. difficile podem incluir, por exemplo, uso presente ou no future imediato de antimicrobianos (qualquer agente antimicrobiano com um espectro antimicrobiano e/ou atividade contra uma bactéria anaeróbica são abrangidos, incluindo, por exemplo, antibióticos que causam ruptura de uma microbiota colonica normal, por exemplo, clindamicina, cefalosporinas, metronidazolo, vancomicina, fluoroquinolonas (incluindo levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, e ciprofloxacina), linezolida, etc.); retirada no presente ou futuro imediato de metronidazolo ou vancomicina prescrita; admissão no presente ou futuro imediato a uma unidade de saúde (tais como um hospital, unidade de saúde crônica, etc.) e trabalhadores de saúde; tratamento presente ou no futuro imediato com inibidores de bomba de prótons, antagonistas H2, e/ou metotrexato, ou uma combinação do mesmo; presente ou risco de doenças gastrointestinais, tais como doença inflamatória do intestino; passado, presente ou futuro imediato de cirurgia gastrointestinal ou procedimento gastrointestinal em um mamífero; recorrência passada ou presente de uma infecção por C. difficile e/ou um CDAD, por exemplo, pacientes que tiveram uma infecção por C. difficile e/ou um CDAD uma vez ou mais de duas vezes; e humanos com idade de pelo menos cerca de 65 ou mais.
[0618] Nos métodos descritos aqui, o mamífero pode ser um animal tais como, por exemplo, camundongo, ramisters, primatas, e humanos. Em uma modalidade preferida, o mamífero é um humano. De acordo coma presente invenção, o humano pode incluir indivíduos que tenham exibido uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo; indivíduos que tenham exibido recentemente uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo; e indivíduos que estão em risco de infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo.
[0619] Os exemplos de indivíduos que tem mostrado os sintomas de infecção por C. difficile incluem indivíduos que mostraram ou estão mostrando os sintomas descritos acima; indivíduos que tenham tido ou estão tendo uma infecção por C. difficile e/ou uma doença associada a C. difficile (CDAD); e indivíduos que tenham uma recorrência de uma infecção por C. difficile e/ou CDAD.
[0620] Os exemplos de pacientes que estão em risco de infecção por C. difficile incluem indivíduos em risco de ou que estão atualmente passando por um uso de antimicrobiano planejado; indivíduos em risco de ou que estão atualmente passando por uma retirada do metronidazolo ou vancomicina prescrito; indivíduos que estão em risco de ou estão atualmente passando por uma admissão planejada por uma unidade de saúde (tais como um hospital, unidade de cuidado crônico, etc.) e trabalhadores de saúde; e/ou indivíduos em risco de ou que estão atualmente passando por um tratamento planejado com inibidores de bomba de prótons, antagonistas H2, e/ou metotrexato, ou uma combinação dos mesmos; indivíduos que tenham tido ou estejam passando por doenças gastrointestinais, tais como doença inflamatória do intestino; indivíduos que tenham tido ou que estejam passando por cirurgia gastrointestinal ou procedimentos gastrointestinais; e indivíduos que tenham tido ou estão tendo uma recaída de uma infecção por C. difficile e/ou um CDAD, por exemplo, pacientes que tenham tido uma infecção por C. difficile e/ou um CDAD uma vez ou mais do que uma vez; indivíduos que tem cerca de 65 anos ou mais. Tais pacientes em risco podem ou não podem estar atualmente mostrando os sintomas de uma infecção por C. difficile.
[0621] Em pacientes assintomáticos, a profilaxia e/ou o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, em cerca de 10, 20, ou 30 anos de idade). Em uma modalidade, entretanto, não é necessário começar o tratamento até que o paciente alcance pelo menso cerca de 45, 55, 65, 75, ou 85 anos de idade. Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser administradas a um humano assintomático que tenha a idade de 50-85 anos.
[0622] Em uma modalidade, o método para prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir as ocorrências de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição descrita aqui a um mamífero em necessidade do mesmo, um mamífero em risco de, e/ou um mamífero suscetível a uma infecção por C. difficile. Uma quantidade eficaz inclui, por exemplo, uma quantidade suficiente para prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir as ocorrências de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual uma composição não é administrada. A administração de uma quantidade eficaz das composições descritas aqui podem, por exemplo, prevenir, diminuir o risco de, diminuir a gravidade de, diminuir as ocorrências de, e/ou retardar o início de uma diarreia; dor abdominal, cólica, febre, inflamação na biópsia colonica; hipoalbuminemia; anasarca; leucocitose; sepse; e/ou assintomáticos, etc., quando comparado a um mamífero ao qual uma composição não foi administrada. Em uma modalidade preferida, o método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica descrita aqui para um mamífero em necessidade do mesmo, o mamífero em risco de, e/ou o mamífero suscetível a uma infecção por C. difficile.
[0623] Em uma modalidade adicional, o método para tratar, diminuir a gravidade de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo em um mamífero inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição descrita aqui a um mamífero suspeito de, ou sofrendo atualmente de uma infecção por C. difficile. Uma quantidade eficaz inclui, por exemplo, uma quantidade suficiente para tratar, diminuir a gravidade de, e/ou retardar o início de uma infecção por C. difficile, doença associada a C. difficile, síndrome, condição, sintoma, e/ou complicação do mesmo, em um mamífero, quando comparado a um mamífero ao qual a composição não é administrada.
[0624] A administração de uma quantidade eficaz de uma composição pode melhorar pelo menos um sinal ou sintoma de infecção por C. difficile no sujeito, tais como aquelas descritas abaixo. A administração de uma quantidade eficaz das composições descritas aqui pode, por exemplo, diminuir a gravidade de e/ou diminuir a ocorrência de diarreia; diminuir a gravidade de e/ou diminuir a ocorrência de dor abdominal, cólica, febre, inflamação na biópsia colonica; hipoalbuminemia; anasarca; leucocitose; sepse; e/ou assintomáticos, etc., quando comparado a um mamífero ao qual a composição não foi administrada. Opcionalmente, a presença de sintomas, sinais e/ou fatores de risco de uma infecção é determinado antes de iniciar o tratamento. Em uma modalidade preferida, o método inclui administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo e/ou fragmentoo de ligação dos mesmos descrito aqui a um mamífero suspeito de, ou sofrendo atualmente de uma infecção por C. difficile.
[0625] Portanto, uma quantidade eficaz de uma composição refere-se a uma quantidade suficiente para alcançar um efeito desejado (por exemplo, um efeito terapêutico e/ou profilático) nos métodos da presente invenção. Por exemplo, a quantidade de um imunógeno para a administração pode variar de um mínimo de cerca de 1 μg, 5 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg, 200 μg, 500 μg, ou 1 mg a um máximo de cerca de 2 mg, 1 mg, 500 μg, 200 μg por injeção. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma média compatível. Tipicamente cerca de 10, 20, 50 ou 100 μg por imunógeno é usado para cada injeção humana.
[0626] A quantidade de uma composição da invenção administrada ao sujeito pode depender do tipo e da gravidade da infecção e/ou das características do indivíduo, tais como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a drogas. Também depende do grau, gravidade e tipo da doença. Uma quantidade eficaz também pode variar dependendo de fatores, tais como rota de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras terapias administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. O perito será capaz de determinar as quantidades apropriadas dependendo destes outros fatores.
[0627] Uma quantidade eficaz pode incluem uma dose eficaz ou doses múltiplas eficazes (tais como, por exemplo, 2, 3, 4 doses, ou mais) para uso nos métodos aqui. As dosagens eficazes podem necessitar ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.
[0628] Uma combinação de quantidade e frequência de dose adequada para realizar o uso terapêutico e/ou profilático é definido como um regime eficaz terapeuticamente ou profilaticamente. Em um regime terapêutico e/ou profilático, a composição é tipicamente administrada em mais do que uma dosagem até que uma resposta imune suficiente tenha sido alcançada. Tipicamente, a resposta imune é monitorada e as dosagens repetidas são dadas se a resposta imune começa a diminuir.
[0629] As composições podem ser administradas em dosagens múltiplas por um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado ensaiando um anticorpo, ou respostas de célula T ou célula B ativada para um agente terapêutico (por exemplo, uma composição imunogênica incluindo uma toxina C. difficile mutante) ao longo do tempo. Se a resposta cai, uma dosagem de reforço é indicada. EXEMPLOS
EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE CEPAS DE C. DIFFICILE DE TOXINA NEGATIVA
[0630] Para identificar as cepas de C. difficile carentes de do gene de toxina (A e B) e expressão de toxina, 13 cepas de C. difficile foram testadas. O meio de cultura de 13 cepas de C. difficile forma testadas por ELISA para a toxina A. Sete cepas expressaram a toxina A: C. difficile 14797-2, C. difficile 630, C. difficile BDMS, C. difficile W1194, C. difficile 870, C. difficile 1253, e C. difficile 2149. Veja figura 3.
[0631] Seis cepas nã oespressaram a toxina A e careceram de um local de patogenicidade inteiro: C. difficile 1351 (ATCC 43593™), C. difficile 3232 (ATCC BAA-1801™), C. difficile 7322 (ATCC 43601™), C. difficile 5036 (ATCC 43603™), C. difficile 4811 (4 ATCC 3602™), e C. difficile VPI 11186 (ATCC 700057™). O VPI 11186 foi selecionado com base em sua eficácia para assumir o plasmídeo de DNA por conjugação.
[0632] As mesmas 13 cepas foram testadas em um ensaio PCR múltiplo usando primários fora do local de patogenicidade (PaLoc; Braun et al., Gene. 1996 Nov 28;181(1-2):29-38.). Os resultados PCR demonstraram que o DNA de 6 cepas negativas de toxina A por ELISA não amplificaram quaisquer genes do PaLoc (tcdA-tcdE). As sequências flanqueando PaLoc (cdd3 e cdu2) foram apresentadas (dados não mostrados).
EXEMPLO 2: INATIVAÇÃO DO CAMINHO DE ESPORULAÇÃO EM C. DIFFICILE VPI11186
[0633] Batendo para for a a função de formação de esporo da produção de cepa C. difficile facilita a fermentação em larga escala em um ambiente de fabricação seguro. O sistema ClosTron foi usado para criar uma cepa de C. difficile asporogênica. Veja Heap et al., J Microbiol Methods. Julho 2009; 78(1):79-85. O Sistema ClosTron permite a inativação dos genes almejados com um grupo II de intron para o local direcionado de inativação insercional de um gene clostridial spo0A1. A cepa de produção de toxina-negativa VPI11186 foi submetido a inativação de esporulação pela tecnologia ClosTron. Os mutantes resistentes a eritromicina foram selecionados e a presença do cassete insercional foi confirmado por PCR (não mostrado). A incapacidade de dois clones independentes para formar os esporos foi confirmada.
EXEMPLO 3: MODIFICAÇÃO GENÉTICA DOS GENES DE TOXINA A E B PARA INATIVAR A FUNÇÃO DE CITOTOXIDADE
[0634] As estruturas de leitura abertas de toxinas mutantes A e B de comprimento completo (ORFs) com base em sequências de genoma de cepa 630Δ foram designadas para uma síntese personalizada na Blue Heron Biotech. Veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 9-14. O local ativo para a atividade glucosiltransferase responsável pela toxicidade celular foi alterado por duas substituições alélicas: D285A/D287A (veja SEQ ID NO: 3) para a toxina A, e D286A/D288A (veja SEQ ID NO: 5) para a toxina B. dois nucleotídeos foram mutados em cada códon aspartato (D) para criar o códon para alanina (A). Veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 9-14. Além disso, um par de vetores expressando toxinas mutantes carecendo de resíduos de cisteína foi construída seguindo a síntese personalizada na Blue Heron Biotech. Sete resíduos de cisteína de toxina A mutante e 9 resíduos de cisteína de toxina B mutante forma substituídas por alanina. As substituições incluem cisteínas catalíticas da protease autocatalítica de toxina A e B. também as mutações silenciosas foram introduzidas onde necessário para eliminar os locais de enzima de restrição usdos para a construção de vetor.
EXEMPLO 4: VETOR DE EXPRESSÃO pMTL84121fdx
[0635] O vetor correspondente ao plasmídeo usado para a expressão de antígeno de toxina mutante C. difficile foi selecionado a partir do sistema modulare série pMTL8000 desenvolvido pela Minton lab (veja Heap et al., J Microbiol Methods. Julho 2009; 78(1):79-85). O vetor escolhido pMTL84121fdx contém o plasmídeo C. difficile pCD6 Gram+ replicon, o marcador catP (cloranfenicol/ tianfenicol) selecionavél, o p15a Gram- replicon e a função tra, e o promotor de feredoxina C. sporogenes (fdx) e um local de clonagem múltipla distal (MCS). Os dados empíricos sugeriram que um número de copias baixas p15a replicon conferiram uma estabilidade maior em E. coli do que no ColE1 alternativo. O promotor fdx foi selecionado uma vez que este rendeu uma expressão maior do que os outros promotores testados nos experimentos com construções de repórter CAT (por exemplo, tcdA, tcdB; ou heterólogos tetR ou xylR) (dados não mostrados).
EXEMPLO 5: CLONANDO OS ORFS DE TOXINA MODIFICADA EM pMTL84121fdx
[0636] As estruturas de leitura abertas de toxina mutante A e B de comprimento completo (ORFs) com base nas sequências de genoma da cepa 630Δ foram subclonadsa usando um vetor pMTL84121 fdx de locais de clonagem múltipla NdeI e BglII usndo técnicas de biologia molecular padão. Para facilitar a clonagem, os ORFs forma flanqueados por um local NdeI proximal contendo um códon inicial e um local BglII apenas abaixo do códon parado.
EXEMPLO 6: LOCAL DE MUTAGÊNESE DIRECIONADA AO TcdA PARA CRIAR UM MUTANTE TRIPLO
[0637] O resíduo de cisteína catatítico do domínio de protease autocatalítico foi substituído (isto é, C700A para TcdA e C698A para TcdB) na SEQ ID NOs: 3 e 5, isto é, em cada um dos “mutantes duplos.” Para a mutagênese da toxina mutante A, um fragmentoo de 2,48kb NdeI-HindIII do plasmídeo de espressão de TcdA D285A/D287A foi subclonado em pUC19 (cortado com o mesmo) e a mutagênese direcionada ao local foi realizada neste templato. Uma vez que os novos alelos foram confirmados pela análise de sequência de DNA, os fragmentos NdeI-HindIII modificados foram reintroduzidos no vetor de expressão pMTL84121fdx para criar os “mutantes triplos,” isto é, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6.
EXEMPLO 7: MUTAGÊNESE DIRECIONADA AO LOCAL DO TcdB PARA CRIAR UM MUTANTE TRIPLO
[0638] Para a mutagênese de uma toxina mutante B, um fragmento de 3,29 kb NdeI-EcoNI de um plasmídeo de toxina mutante B foi modificado e reintfroduzido como o local EcoNI não está presente nos vetores de clonagem disponíveis um fragmentoo 3,5kb NdeI- EcoRV levemente maior foi subclonado em pUC19 (preparado com NdeI-SmaI). Após a mutagênese, o fragmentoo 3,3kb NdeI-EcoNI interno modificado foi extirpado e usado para substituir o fragmentoo pMTL84121fdx de vetor de expressão de toxina mutante B correspondente. Como a eficácia da clonagem desta estratégia directional foi considerada um pouco baixa, uma estratégia alternative para introduzir o alelo C698A envolvendo a substituição de um 1,5 kb DraIII foi tentada em paralelo. Ambas as estratégias independentemente renderam os recombinants desejados.
EXEMPLO 8: CRIAR VARIANTES DE TOXINA MUTANTE ADICIONAL POR MUTAGÊNESSE DIRECIONADA AO LOCAL
[0639] Pelo menos doze variants de toxina mutante de C. difficile diferentes foram construídas. As substituições alélicas foram introduzidas nos fragmentos de gene de toxina mutante N-terminal foram construídas. As substituições alélicas foram introduzidas nos fragmentos de gene de toxina mutante N-terminal por mutagênense direcionada ao local (Quickchange® kit). As toxinas recombinantes também foram projetadas como controles de referência para avaliar a capacidade deste sistema com base em plasmídeo de gerar um equivalente quantitativo de proteína em uma atividade biológica para toxinas nativas purificadas a pastir de cepas de C. difficile do tipo selvagem. Neste caso, as substituições alélicas foram introduzidas para reverter as substituições por glucosiltransferase originais. Além disso, um par de vetores de toxina mutante sem cisteína foi construído seguindo a síntese personalizada na Blue Heron Biotech.
[0640] As doze variantes de toxina incluem (1) uma toxina de C. difficile mutante A tendo uma mutação D285A/D287A (SEQ ID NO: 3); (2) uma toxina de C. difficile mutante B tendo uma mutação D286A/D288A mutation (SEQ ID NO: 5); (3) uma toxina de C. difficile mutante A tendo uma mutação D285A/D287A C700A (SEQ ID NO: 4); (4) uma toxina de C. difficile mutante B tendo uma mutação D286A/D288A C698A (SEQ ID NO: 6); (5) uma toxina recombinante A tendo a SEQ ID NO: 1; (6) uma toxina recombinante B tendo a SEQ ID NO: 2; (7) uma toxina de C. difficile mutante A tendo uma mutação C700A; (8) uma toxina de C. difficile mutante B tendo uma mutação C698A; (9) uma toxina de C. difficile mutante A tendo uma mutação C700A C597S, C1169S, C1407S, C1623S, C2023S, e C2236S; (10) uma toxina de C. difficile mutante B tendo uma mutação C698A C395S, C595S, C824S, C870S, C1167S, C1625S, C1687S, e C2232S; (11) uma toxina de C. difficile mutante A tendo uma mutação D285A, D287A, C700A, D269A, R272A, E460A, e R462A (SEQ ID NO: 7); e (12) uma toxina de C. difficile mutante B tendo uma mutação D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A, e C698A (SEQ ID NO: 8)
[0641] As toxinas penta mutantes também foram construídas por mutagênese direcionada ao local e usndo os mesmos materiais e métodos como descrito acima, por exemplo, nos exemplos 1-7. A toxina penta mutante B incluiu as seguintes substituições D286A/D288A C698A/E970K/E976K (SEQ ID NO: 184). A toxina penta mutante B foi expressa nas células VPI 11186 spo0A-negativa como descrito acima. Um uso de western blot mAb# B8-26 (SEQ ID NO: 49), que é específico para um epítopo N-terminal epítopo da toxina B, foi feito para confirmar a expressão da toxina penta mutante B. Na segunda, terceira, e quarta linhas a partir da esquerda 50 ng, 30 ng, e 10 ng do mutante triplo B (SEQ ID NO: 86), respectivamente, foram usados como uma proteína de referência. Na quinta e na sexta linhas a partir da esquerda, uma diluíção 1:100 e uma diluição 1:1000, respectivamente, do concentrado lisado de célula de toxina penta mutante B foi avaliada. A quantidade estimada de proteína na concentração de toxina penta mutante B é de cerca de 1000 ug/mL. Como mostrado nas manchas, a toxina penta mutante B (concentrada) exibiu uma faixa de proteína de tamanho esperado de cerca de 270 kD.
EXEMPLO 9: ESTABILIDADE DOS TRANSFORMANTES
[0642] Os plasmídeos rearranjados foram obtidos com as cepas lab DH5 E. coli comumente usadas. Em contraste, as transformações usando hospedeiro de E.coli Invitrogen Stbl2™ rendeu recombinantes de toxina mutante de comprimento complete grescendo de vagar após três dias de crescimento a 30oC em placas LB cloranfenicol (25 μg/ml). A eficácia de clonagem menores foram obtidos com as cepas de E.coli Stbl3™ e Stbl4™ relacionadas, embora estas linhas foram consideradas estáveis para a manutenção do plasmídeo. Os transformantes foram propagados subsequentemente em uma cultura líquido ou agar sob seleção cloranfenicol a 30oC. Também verificou-se que o uso de meio LB (Miller’s) melhora a recuperação e o crescimento de transformantes comparados com o meio com base em triptone-soja livre de animal.
EXEMPLO 10: TRANSFORMAÇÃO DE C. DIFFICILE COM GENES DE TOXINA MUTANTE GENÉTICA OU DO TIPO SELVAGEM CODIFICANDO UM pMTL84121fdx
[0643] A transformação de C. difficile por transferência de conjugal de E. coli foi feita essencialmente como descrito em Heap et al., Journal of Microbiological Methods, 2009. 78(1): p. 79-85. O CA434 hospedando E. coli foi transformado com genes de toxina mutante variante ou do tipo selvage codificando pMTL84121 fdx. O hospedeiro CA434 de E. coli é o intermediário para imobilizar os plasmídeos de expressão VPI 11186 spo0A1 nas cepas de produção de C. difficile. CA434 é um derivado de E. coli HB101. Estas cepas refugiam o plasmídeo conjugativo Tra+ Mob+ R702 que confere resistência ao Km, Tc, Su, Sm/Spe, e Hg (devido ao Tn1831). As células CA434 eletrocompetentes ou competentes quimicamente foram preparadas e os transformantes de vetor de expressão foram selecionados nas placas Miller’s LB CAM a 30oC. As colônias de crescimento menor aparecendo após 3 dias foram retiradas e ampliadas em culturas de cloranfenicol de 3 mL LB até a fase média-longa (~24h, 225 rpm, agitador orbital a 30oC). As culturas de E. coli foram colhidas por uma centrifugação em velocidae baixa (5.000g) para evitar quebrar o pelo, e os grânulos de células foram resuspensos gentilmente com uma pipeta de transferência de furo amplo em 1 mL PBS. As células foram concentradas por uma centrifugação de velocidade baixa. A maioria dos PBS foi removida por inversão e os granulos drenados foram transferidos pra uma câmara anaeróbica e resuspensos com 0,2 mL cultura de C. difficile, manchado em placas agar BHIS e deixadas para crescer por 8h ou durante a noite. No caso de transformantes de toxina mutante A, os melhores resultados foram alcançados com uma conjugação durante a noite. As manchas de células foram raspadas em 0,5 mL PBS e 0,1 mL foi banhado em um meio de seleção BHIS suplementado com 15 μg/mL tianfenicol (análogo mais potente de cloranfenicol) e D-cicloserina / cefoxitina para matar as células de doadores de E. coli. Os transformantes aparecendo após 16-24 h foram purificados por re-estrias em uma placa de BHIS nova (mais suplementos) e as culturas subsequentes foram testadas para a expressão de toxinas recombinantes ou toxinas mutantes. Os glicerois permanents e o armazenamento de semente foram preparados a partir de clones mostrando uma boa expressão. Os minipreparados de plasmídio foram também preparados a partir de culturas de 2 mL usando um kit de procedimento Qiagen modificado em que as células foram pretratadas com lisozima (não essencial). O DNA minipreparado de C. difficile foi usado como um templato para o sequÊnciamento de PCR para verificar a integridade do clone. Alternativamente, o DNA maxipreparado de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes e sequenciados de E. coli Stbl2™ lisozima.
EXEMPLO 11: ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE C. DIFFICILE DA TOXINA MUTANTE B HEPTA (SEQ ID NO: 8) E A MUTANTE TRIPLA A E B (SEQ ID NOs: 4 E 6, RESPECTIVAMENTE)
[0644] Os transformantes foram crescidos tanto em uma cultura de 2 mL (para uma análise de rotina) quanto em frascos tampados na abertura (para experimentos de evolução temporal). As amostras (2 mL) foram centrifugadas rapidamente (10.000 rpm, 30s) para concentrar as células: os sobrenadantes foram decantados e concentrados 10x (Amicon-ultra 30k); os grânulos forma drenados e congelados a -80oC. Os grânulos de células foram descongelados em gelo, resuspensos em 1mL de tampão de lise (Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA, 15% glicerol) ae sonicados (1x 20s explosão com microponta). O lisato foi centrifugado a 4oC e o sobrenadante foi concentrado em 5- dobra. As amostras do sobrenadante e o lisato foram combinados com o tampão de amostra e o tratado por calor (10 min, 80oC) antes de carregar nos géis 3-8% Tris-acetato SDS-PAGE duplicados (Invitrogen).um grl foi colorido com Coomassie, o segundo foi eletrotransferido para a análise de western.um antissoro de coelho específico de toxina B e específico de toxina A (Fitgerald; Biodesign) foram usados para detectar as variantes da toxina A e B mutante. A expressão da toxina mutante B hepta (SEQ ID NO: 8) também foi confirmada pela hibridização de western blot.
EXEMPLO 12: REVOGAÇÃO DA ATIVIDADE DE GLUCOSILTRANSFERASE DAS TOXINAS MUTANTES
[0645] As toxinas A e B mutantes duplas genéticas (DM) (SEQ ID NOs: 3 e 5, respectivamente) e as toxinas A e B mutantes triplas (TM) (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) não transferiram 14C-glicose para 10 μg de RhoA, Rac1 e Cdc42 GTPases em ensaios de glucosilação in vitro na presença de UDP-14C-glicose [30 μM], 50 mM HEPES, pH 7,2, 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, e 0,1 μg/μL BSA. Entretanto, os controles de toxina A e B do tipo selvagem (tendo a SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente) transferiram 14C-glucose para GTPases eficazmente a uma dose baixa de 10 e 1 ng cada (e dados inferiores não mostrados) (Figuras 4A e 4B), mesmo na presença de 100 μg de toxina mutante (Figura 4B) indicando pelo menos 100.000-dobras de redução comparado com as toxinas do tipo selvagem respectivas. Os resultados similares forma detectados para Cdc42 GTPase (dados não mostrados).
[0646] Especificamente, na Fig. 4B, toxina do tipo selvagem A and toxin B (1ng) or toxina mutante tripla A and toxina mutante tripla B (100 μg) foram incubadas com RhoA GTPase na presença de UDP-14C- glicose por 2 hr a 30°C. Como ilustrado, 1 ng do TcdA e TcdB do tipo selvagem transferiram 14C-glicose para RhoA, mas 100 μg de toxina mutante tripla A e toxina mutante tripla B não. Quando 1 ng de TcdA ou TcdB do tipo selvage foi cravada na reação com 100 μg de toxina mutante tripla A ou toxina mutante tripla B respectiva, a glicosilação de RhoA foi detectada, indicando a carência de inibidores de glicosilação. A sensibilidade da detecção para a atividade de glicosilação foi estabelecida para ser 1 ng de toxina do tipo selvagem em um antecedente de 100 μg de toxina mutante (proporção de 1:100.000). Os resultados mostram que as mutações no local ativo de glucosiltransferase na toxina mutante tripla A e na toxina mutante tripla B reduziu qualquer (menos do que 100.000-dobra atividade menor comparado a atividade das toxinas do tipo selvagem respectivas) atividade glucosiltransferase mensurável. Um ensaio similar também foi realizado para quantificar a atividade glucosiltransferase por precipitação de TCA do GTPases glicosilado.
EXEMPLO 13: REVOGAÇÃO DA ATIVIDADE DE PROTEASE DE CISTEÍNA AUTO-CATALÍTICA
[0647] A função de clivagem auto-catalítica foi revogada nos mutantes genéticos triplos A e B (TM) (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) quando o local de protease de cisteína foi mutado. Como ilustrado na Figura 5, as toxinas do tipo selvagem (wt) A e B (SEQ ID NOs: 3 e 5, respectivamente) são clivadas na presença de inositol-6-fosfato. As toxinas mutantes duplas A e B (SEQ ID NOs: 3 e 5, respectivamente) também são clivadas na presença de inositol-6- fosfato (dados não mostrados), similar a aquele para o tipo selvagem. A toxina A (SEQ ID NO: 3) é clivada a partir de 308 kDa em 2 fragmentos de 245 e 60 kDa. A toxina B (SEQ ID NO: 5) é clivada a partir de 270 kDa em dois fragmentos de 207 e 63 kDa. Os mutantes genéticos triplos A e B (TM) (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) permanecem não afetados a 308 e 270 kDa respectivamente, mesmo na presença de inositol-6-fosfato. Veja figura 5. Portanto, the atividade de protease de cisteína foi inativada pela modificação genética.
[0648] Mais especificamente, na figura 5, um μg de um mutante triplo A e um mutante triplo B foram incubadas por 90 minutos em temperatura ambiente (21 ± 5°C) em paralelo com um TcdA e TcdB do tipo selvagem da List Biologicals. A reação de clivagem foi realizada em 20 μL volume em Tris-HCl, pH 7,5, 2mM DTT na presença ou ausência de inositol-6-fosfato (10mM para TcdA e 0,1 mM para Tcd B). O volume inteiro da reação foi então carregado em um 3 -8% SDS/PAGE; as faixas de proteína foram visualizadas por uma coloração prata. Como ilustrado, wt Tcd A e TcdB foram clivadas em duas faixas de proteínas de 245kD e 60kD e 207kD e 63 kD, respectivamente, na presença de inositol-6-fosfato. A toxina mutante tripla A e a toxina mutante tripla B não foram clivadas, confirmando assim a mutação C700A na toxina mutante tripla A e a mutação C698A toxina mutante tripla B bloquearam a clivagem.
EXEMPLO 14: CITOTOXICIDADE RESIDUAL DAS TOXINAS MUTANTES TRIPLAS A E B (SEQ ID NOs: 4 E 6, RESPECTIVAMENTE)
[0649] As toxinas mutantes genéticas foram avaliadas para sua citotoxidade por um ensaio de citotoxidade in vitro citotoxicidade em células IMR90, uma linha de célula de fibroblasto deiplóide humano. Estas células são sensíveis a ambas as toxinas A e B. Como uma modalidade alternativa, as células de rim Vero de Cercopithecus aethiops podem ser usadas no ensaio de citotoxicidade uma vez que foram observados por ter sensibilidades razoáveis para a toxina A e B. Preferencialmente, as células de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 não são usadas no ensaio de citotoxicidade porque elas têm mostrado uma sensibilidade significantemente diminuída para as toxinas, quando comparado as linhas de células Vero e IMR90. Veja, por exemplo, Tabela 6 abaixo.
Figure img0021
[0650] As amostras de toxina wt ou toxina mutante genética diluida serialmente foram adicionadas ao crescimento de monocamadas celulares em places de cultura de tecido de 96 poços. Após a incubação a 37°C por 72h, as placas foram avaliadas para células ativas metabolicamente medindo os níveis de ATP celular pela adição de um reagente CellTítuloGlo® com base de luciferase (Promega, Madison, WI) gerando luminescencia expressa como unidades de luminescencia relativas (RLUs). Os RLUs altos mostram que as células são viáveis, os RLUs baixos mostram que as células não são metabolicamente ativas e são coloridas. O nível de citotoxicidade, expresso como EC50, é definido como a quantidade de toxina wt ou toxina mutante genética que provoca uma redução de 50% no RLUs comparado a níveis de controle de cultura em células (os detalhes deste ensaio são proporcionados abaixo). Como mostrado na Figura 6, a Tabela 7A, e Tabela 8A, os valores de EC50 de TcdA e TcdB foram cerca de 0,92 ng/mL e 0,009 ng/mL, respectivamente. Os valores de EC50 da toxina mutante tripla A e da toxina mutante tripla B foram cerca de 8600 ng/mL e 74 ng/mL, respectivamente. Apesar de uma redução de aproximadamente 10,000-dobra na citotoxicidade relative as toxinas wt, ambas toxinas mutantes genéticas ainda demonstram níveis residuais baixos de citotoxicidade. Esta citotoxicidade residual poderia ser bloqueada neutralizando os anticorpos monoclonais antitoxina indicando que foi específico para as toxinas mutantes triplas, mas não provavelmente relacionada às atividades enzimáticas conhecidas das toxinas wt t (glicosilação ou autoproteolise).
[0651] Ambas as toxinas wt exibem uma citotoxicidade potente in vitro, com pequenas quantidads das toxinas sendo suficientes para ausar vários efeitos nas células de mamíferos tais como o arredondamento da célula (efeito citopático ou CPE) e carência de atividade metabólica (como medido pelos níveis ATP). Consequentemente, dois ensaios in vitro (um ensaio CPE ou de arredondamento de célula e um ensaio ATP) tem sido desenvolvido para verificar que nenhuma citotoxicidade residual permanence nas suibstâncias de drogas de toxina mutante. Os resultados são expressos como EC50, que é a quantidade de toxina ou toxina mutante que causa 1) 50% das células para desenvolver CPE ou 2) 50% de redução nos níveis de níveis de ATP como medido em unidades de luz relativas.
[0652] No ensaio CPE, uma amostra de substancia de droga é diluída serialente e incubada com células IMR90, que são observadas para um efeito citopático potencial. O ensaio CPE é pontuado emu ma escala de 0 (células normais) a 4 (~100 % arredondamento de célula) e uma pontuação de 2 (~50% arredondamenteo da célula) é definido como valor de EC50 da amostra teste. Este método é usado para testar uma substÂncia de droga de toxina mutante na concentração de 1000 μg /mL, que é a concentração máxima tolerável que pode ser testada neste ensaio sem interferência da matriz. Consequentemente, nenhuma citotocixidade detectável é reportada como EC50 >1000 μg/ml.
[0653] O Ensaio ATP é com base na medição da quantidade de sinal de luminescencia gerado a partir de ATP, que é proporcional ao número das células ativas metabolicamente. A concentração máxima tolerável que pode ser testada sem o ensaio interferente sem ensaio ou interferência é de cerca de 200 de concentração máxima 200 μg/mL. Portanto, a citotoxidade neste ensaio é reportada como EC50 >200 μg/Ml.
[0654] As concentrações diferentes de toxina mutante A e B foram adicionadas as células em paralelo com os controles de toxina paralelos. Os pontos finais do ensaio de viabilidade determinado pelos níveis celulares usando o CellTítulo-Glo® (Promega). O grau de luminescencia é proporcional aos móveis de ATP ou número de células viáveis.
[0655] A citotoxicidade in vitro (EC50) da toxina A (wt) do tipo selvagem foi 920 pg/mL e 9 pg/mL para a toxina B. A citotoxicidade in vitro (EC50) de uma toxina mutante A (SEQ ID NO: 4) foi 8600 ng/mL e 74 ng/mL para toxina mutante B (SEQ ID NO: 6). Embora estes valores representem reduções de 9348 e 8222-dobra, respectivamente, a citotoxicidade residual foi detectada em ambas as toxinas mutantes.
[0656] Em outras palavras, a citotoxicidade das toxinas mutantes triplas A e B (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) foi reduzida significantemente no ensaio de citotoxicidade in vitro em células IMR-90 relativas a uma citotoxicidade das toxinas wt A e B (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente). Como ilustrado na Figura 6, embora ambas as toxinas mutantes triplas exibiram uma redução significante na citotoxicidade (104 dobra) relativa a toxina wt, a citotoxicidade residual foi observada em altas concentrações de ambas as toxinas mutantes triplas.
[0657] Além disso, a citotoxicidade residual de cada toxina mutante tripla poderia ser completamente neutralizada (por exemplo, pelo menos 6-8 log10 de redução na toxicidade, relativo a toxicidade da toxina do tipo selvagem) pelos anticorpos específicos de toxina. Veja Exemplo 16, abaixo.
[0658] Os ensaios de cultura de célula sãomais sensíveis para a detecção de citotoxicidade do que os modelos de animal in vivo. Quando entregue tanto por rotas i.p. quanto i.v no modelo de desafio letal de camundongo, o TcdA wt tem um LD50 de ~50 ng por camundongo enquanto que o TcdB wt é mais potente com um LD50 de ~5 ng por camundongo. Em contraste, a cultura de células com base nos ensaios in vitro descritos acima tem valores EC50 de 100 pg por poço para TcdA wt e 2 pg por poço para TcdB wt.
EXEMPLO 15: A CITOTOXICIDADE RESIDUAL DA TOXINA HEPTA MUTANTE B GENÉTICA (SEQ ID NO: 8), E A CITOTOXICIDADE DA TOXINA PENTA MUTANTE B (SEQ ID NO: 184)
[0659] Como ilustrado na Figura 7, os valores de EC50 são similares para a toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) (20,78 ng/mL) e a toxina hepta mutante B (SEQ ID NO: 8) (35,9 ng/mL) os mutantes indicando que as quatro mutações adicionais para ainda modificar o local ativo por glucosiltransferase e o local de ligação ao substrato GTPase ainda não reduziu a citotoxicidade da toxina mutante genética. Os valores de EC50 também foram similares para a toxina mutante dupla B (SEQ ID NO: 5) como elas são para as toxinas heptas mutantes e triplas (dados não mostrados). Esta observação sugere que o mecanismo para a citotoxicidade das toxinas mutantes é surpreendentemente independente do mecanismo de reconhecimento de substrato e glucosiltransferase.
[0660] A toxina penta mutante B (SEQ ID NO: 184) foi avaliada para sua citotoxicidade por um ensaio de citotoxicidade ATP in vitro em células IMR90, como descrito acima. Veja, por exemplo, Exemplo 14. Como mostrado na Figura 26, a citotoxicidade da toxina penta mutante B foi bastante reduzida, quando comparado a toxina do tipo selvagem B (por exemplo, SEQ ID NO: 2), que foi obtida comercialmente pela List Biologicals), e quando comparado a toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 86). O controle “apenas célula” refere-se a células IMR-90. Veja Tabela 62 abaixo, mostrando os valores de EC50 respectivos. TABELA 62
Figure img0022
[0661] Além disso, a toxina penta mutante B (“PM-B”) (SEQ ID NO: 184) foi avaliada para a inibição competitiva de citotoxicidade que é mediada pela toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 86) nas células IMR-90. Veja figura 27. Para preparar as amostras, a toxina mutante tripla B (TM B) (SEQ ID NO: 86) foi mantida emu ma concentração constante de 200 ng/mL (10 x EC50) em todas as células. Uma 2-dobra toxina penta mutante B diluída serialmente iniciando de 5 μg/mL foi adicionada aos poços contendo a toxina mutante tripla B. As amostras foram então transferidas para uma placa de 96 poços contendo células IMR-90, então incubada por 72 horas. Um ensaio ATP foi completado, como descrito acima, por exemplo, no Exemplo 14. Como pode ser mostrado na Figura 27, uma toxina penta mutante B inibiu competitivamente a citotoxicidade da toxina mutante tripla B.
EXEMPLO 16: A CITOTOXICIDADE RESIDUAL DAS TOXINAS MUTANTES TRIPLAS A E B (SEQ ID NOS: 4 E 6, RESPECTIVAMENTE)
[0662] Para ainda avaliar a natureza da citotoxicidade residual, as toxinas mutantes (SEQ ID NOs: 4 e 6) foram misturadas e inclubadas com anticorpos de neutralização respectivos antes e a mistura foi adicionada a uma monocamada celular de IMR90.
[0663] Os resultados (Figura 8) mostraram que a citotoxicidade residual de uma toxina mutante A e B (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) pode ser completamente revogada com os anticorpos de neutralização específicos para a toxina mutante A (painel superior, Figura 8) e a toxina mutante B (painel inferior, Figura 8). Concentrações elevadas de uma toxina mutante A (painel superior) e B (painel inferior) foram incubadas com anticorpos policlonais antitoxina de coelhos (pAb, 1:10 diluição) ou monoclonal de murino (1:50 diluição a partir de armazenamento contendo 3,0 mg IgG/mL) antes de adicionar as células IMR90. Após 72-hr de tratamento de incubação com células IMR90 a 37°C, o substrato CellTítulo-Glo® foi adicionado e as unidades de luz relativas (RLU) foram medidas em um espectrofotometro com um programa de luminescencia para medir os níveis de ATP. Quanto menor o nível de ATP, maior o de toxicidade. Os controles incluíram TcdA e TcdB adicionados em 4 vezes seus valores EC50 correspondentes.
[0664] Os relatórios publicados sugerem que as mutações no domínio de protease auto-catalítica ou glucosiltransferase das toxinas resultam em inativação completa da toxicidade. Entretanto, nossos dados não concordam com estes ralatórios publicados e isto pode ser atribuído ao aumento de concentrações toxinas mutantes altamente purificadas testadas em nossos laboratórios como oposto aos lisatos de cultura cru nos relatórios publicados; pontos de tempo aumentados no qual o arredondamento celular das células tratadas com toxina mutante foi observada (por exemplo, 24 horas, 48 horas, 72 horas, ou 96 horas) como oposto as observações feitas em menos do que 12 horas; o uso de linhas de célula que exibiram sensibilidades significantemente maiores para as toxinas nos presentes ensaios de citotoxicidade em contraste com as células adenocarcinoma colorretal humano nos ensaios de citotoxicidade divulgados nos relatórios publicados; e/ou a uma atividade ou processo desconhecido, outro que não a glicosilação, que poderia estar conduzindo a toxicidade residual das toxinas mutantes.
EXEMPLO 17: NOVO MECANISMO DE CITOTOXICIDADE DAS TOXINAS MUTANTES GENÉTICAS
[0665] Para investigar o mecanismo de uma citotoxicidade residual das toxinas mutantes genéticas, as células IMR-90 foram tratadas com a toxina wt B (SEQ ID NO: 2) ou a toxina mutante genética B (SEQ ID NO: 6), e a glicosilação de Rac1 GTPase foi estudada com o tempo do tratamento. As amostras foram coletadas de 24 a 96 horas ae os extratos de células foram preparados. O Rac1 glicosilado é distinguido do Rac1 não glicosilado por western blots com dois anticorpos para Rac1. Um anticorpo reconhece ambas as formas de Rac1 (23A8) e a outra apenas reconhece o (102) Rac1 não glicosilado. Como ilustrado na Figura 22, para a toxina B, os níveis de Rac1 totais ficaram inalterados durante o tempo com a maioria do Rac1 sendo glicosilada. O tratamento com a toxina mutante genética B (SEQ ID NO: 6), por outro lado, resultou em uma redução significante do Rac1 total, entretanto, o Rac1 não foi glicosilado em todos os pontos de tempo. Isto mostra que os níveis de Rac1 foram afetados negativamente pelo tratamento com a toxina mutante genética, mas não pena toxina wt. Como ilustrado na Figura 22, o nível de actina foi similar na toxina e nas células tratadas com a toxina mutante genética B e similar as células tratadas com mock nos pontos de tempo indicados. Isto mostrou que as toxinas mutantes genéticas exerceram uma citotoxicidade por um mecanismo que é diferente do caminho de glicosilação conduzido pela toxina do tipo selvagem.
EXEMPLO 18: TRATAMENTO QUÍMICO DAS TOXINAS MUTANTE GENÉTICA
[0666] Embora as toxinas mutantes modificadas geneticamente mostrassem uma redução de 4-log na atividade citotóxixa é preferida, outra redução (2 a 4 logs) na atividade citotóxica foi considerada. Duas estratégias de inativação química foram avaliadas.
[0667] O primiero método usa formaldeído e glicina para inativar as toxinas mutantes. A inativação por formaldeído ocorre formando uma base Schiff (imina) entre o formaldeído e as aminas primárias na proteína. As bases Schiff podem então reagir com um número de resíduos de aminoácidos (Arg, His, Trp, Tyr, Gln, Asn) para formar tanto ligações em cruz intra- ou intermolecular. Estas ligações em cruz fixam a estrutura da proteína tornando-a inativa. Além disso, o formaldeído pode reagir com a glicina para formar uma base Schiff. A base glicil Schiff pode então reagir com os resíduos de aminoácidos para formar ligações em cruz de glicina proteína intermolecular. O formaldeído reduziu a atividade citotóxica das toxinas mutantes genéticas para os limites abaixo detectáveis (redução na citotoxicidade >8 log10 para mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) e >6 log10 para mutante tripla A (SEQ ID NO: 4). Entretanto, uma reversão foi observada ao longo do tempo quando as toxinas mutantes triplas inativadas por formaldeído (FI) foram incubadas a 25°C. A reversão citotóxica pode ser prevenida pela adição de uma quantidade baixa de formaldeído (0,01-0,2%) nas soluções de armazenamento de toxinas mutantes triplas FI. Veja Exemplo 23.
[0668] Outro método usa o tratamento de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS) para gerar toxinas mutantes inativadas. Neste método, o EDC/NHS reage com os grupros carboxílicos na proteína para formar ésteres ativados. Os ésteres ativados podem então reagir com as aminas primárias na proteína para formar ligações de amina estáveis. Como com a reação de formaldeído, esta reação resulta em ligações em cruz intra- e intermolecular. A ligação de amida formada pelo tratamento com EDC/NHS é mais estável e não reversível do que a ligação de amina lábil formada pela inativação de formalinaa. Além disso para as ligações em cruz formadas pela reação dos ésteres com as aminas primárias no polipeptídeo, ambos adutos de glicina e de beta-alanina podem ser formados. Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os adutos de glicina são produzidos quando a glicina é adicionada para temperar os ésteres ativados que não reagiram. A amina da reação de glicina com o éster ativado no polipeptídio para formar ligações de amida estáveis. Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os adutos de beta-alanina são formados pela reação da beta-alanina ativada com as aminas primárias no polipeptídio. Esta reação resulta em ligações de amida estáveis. A beta-alanina ativada é produzida pela reação de três moles de NHS co um mole de EDC.
[0669] Para alcançar a redução de 2-4 logs da atividade citotóxica relativa as toxinas mutantes modificadas geneticamente (6-8 logs, relativo as toxinas nativas), as toxinas mutantes inativadas quimicamente devem ter valores de EC50 de >1000 μg/mL. Além disso para a redução na atividade citotóxica, seria vantajoso reter os epítopos chave como determinado pela análise de pontos manchados. Até hoje, um número de condições de reação tem identificado que reúne ambas a redução de citotoxicidade e o critério de reconhecimento de epítopo. Vários lotes de toxinas mutantes inativadas foram preparados para os estudos em animais e os dados analíticos de alguns lotes representativos são mostrados nas tabelas 7A e 7B, Tabela 8A e 8B.
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List =List Biologicals; CPE= ensaio de efeito citopático; EC50 = a concentração mais baixa onde 50% das células mostra citotoxicidade; mAbs= anticorpos monoclonais; neut= neutralização; ND= não feito; TM= local ativo e mutante clivado (“mutante triplo”)
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List =List Biologicals; CPE= ensaio de efeitos citopáticos; EC50 = a concentração onde 50% das células mostra citotoxicidade; mAbs= anticorpos monoclonais; neut= neutralização; ND= não feito; TM= local ativo e clivagem mutante (“mutante triplo”)
EXEMPLO 19: FERMENTAÇÃO E PURIFICAÇÃO
[0670] As fermentações foram iniciadas a partir de uma fonte congelada de um Clostridium difficile recombinante incluindo um promotor fdx descrito acima. Os armazenamentos congelados eram suspensões de células feitas para um OD600 = 2,0 e 20% de glicerol. Uma cultura iniciadora foi inoculada com 0,2 mL do armazenamento de cultura em 500mL SHYG10 de meio (30 g/L hidrolisato de soja SE50MK, 20 g/L extrato de levedura HY YEST 412, 10 g/L glicose, 15 mg/L tianfenicol, pH7). O meio foi contido em uma garrafa ventilada de 500mL. A inoculação foi realizada em um gabinete bioseguro convencional, a garrafa foi borbulhada com nitrogênio, e a garrafa foi então incubada estática (respirawdouros fechados) por ~ 16-18 horas a 37oC em um incubador convencional.
[0671] Um biorreator de dez litros contendo 8L de meio SHYG60 (30 g/L hidrolisado de soja SE50MK, 20 g/L extrato de levedura HY YEST 412, 60 g/L glicose, 15 mg/L tianfenicol, pH7) foi usado para a fase de fermentação. O conteúdo de 500mL da garrafa inóculo foram inoculados para o fermentador que foi operado a 37oC, 400 rpm (1,47 m/s) com 0,1 vvm asperção de nitrogênio. O pH foi controlado a 7,0 por auto-adição de 5N NaOH. Fernentação foi tipicamente executada por ~ 24horas para alcançar um pico de potência. O crescimento durante o curso da fermentação foi monitorado por leituras de OD600. As amostras tomadas para a toxina quantificação mutante foram giradas a ~5000xg e os grânulos resultantes foram congelados a - 70oC. Os grânulos de células forma então descongelados e resuspendos em um tampão consistindo de 20mM Tris, 3mM NaCl, 0,5 mM EDTA, pH 6,5 e sonicado a uma amplitude de 40 por 20 segundos. O lisato de célula resultante foi girado a 5,000xg por 10 min. O sobrenadante foi combinado com o tampão de carregamento e reduzindo o agente e executado em um gel 3,8% Tris-acetato PAGE a 150 volts por 50-55 min versus os padrões de toxina autênticos. O gel foi manchado durante a noite, então descorado e quantificado em um densitometro de escaneamento. Tipicamente, os valores de OD600 de ~ 10-12 foram observados com os valores de toxina de 80-120 mg/L.
[0672] A seguinte tabela é um exemplo de dados de fermentação para a toxina mutante A
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[0673] Um exemplo de dados de fermentação para a toxina mutante B é apresentado na tabela abaixo.
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[0674] As modificações da composição e dos métodos para a cultura da célula C. difficile recombinante e/ou a produção de toxinas mutantes tem sido testado e estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, embora SE50MK (e variadamente SE50MK-NK, asmbas fontes de Friesland-Campaigna) foi a escvolha preferida para a fonte de nitrogênio, uma variedade de outros hidrolisados de soja de outros fabricantes forma identificadas que funcionaram bem no processo. Um meio de cultura incluindo o hidrolisado de soja na ausência do extrato de levedura proporcionou 30-40% do rendimento esperado.
[0675] Os extratos de levdura de fabricantes alternativos mostraram suportar rendimentos equivalents. Um meio de cultura incluindo um extrato de levedura na ausência do hidrolisado de soja proporcionou 60-70% de rendimento esperado.
[0676] O uso de um meio de cultura com base em hidrolisado de soja/extrato de levedura, na ausência de uma fonte de carbono, rendeu cerca de 2-3 OD600 e cerca de 10-15 mg/L de toxina. Embora a glicose seja uma fonte de carbon preferida para a culturação, os resultados equivalentes foram obtidos com mannitol. Uma triagem de fontes de carbono em garrafas, indicou que o C. difficile também pode utilizer fructose e manose que também seria esperado para suportar um alto OD/rendimento, quando comparado ao meio de cultura na ausência de uma fonte de carbono. As fontes de carbono seguintes não parecem suportar um crescimento ótimo: arabinose, xilose, sucrose, lactose, maltose, glicerol, ramnose e galactose.
[0677] Além disso, extendendo o tempo de fermentação para 48 horas (requerendo a adição de mais glicose) não pareceu melhorar substancialmente o rendimento.
[0678] Ainda, a fermentação ao pH 6,5 e 7,5deu rendimentos emu ma faixa esperada de 80-120 mg/L. A fermentação em um pH mais extremo pH (pH 6,0 ou 8,0) ainda deu os valores de OD600 esperados, mas reduziu o rendimento (40-60 mg/L) da toxina.
[0679] A fermentação usando um meio de cultura naausência de tianfenicol resultou em uma perda de plasmídeo, por exemplo, cerca de 10-20% para um plasmídeo codificando a toxina mutante B, e cerca de 30-40% para um plasmídeo codificando a toxina mutante A. Portanto, a fermentação usndo um meio de cultura na ausência de um derivado de cloranfenicol foi viável.
[0680] Os modos alternativos de operar a fermentação também foram testados e estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, a fermentação pode ser executada a 400 rpm ou menos e a sobrecoppição do nitrogênio popde ser usada, ambas técnicas das quais foram tentadas e usadas com sucesso.
[0681] Além disso, um meio de anticorpo monoclonal SFM4MAb foi testado e mostrou dar cerca de 10 OD600 das células e cerca de 40 mg/L de toxina mutante.
[0682] Por ultimo, a adição de um ingresinete contendo fosdato na fermentação pareceu reduzir a produção de toxina, quando comparado ao meio de cultura na ausência do ingrediente contendo fosfato.
[0683] Ao final da fermentação, o fermentador é resfriado. A lama de célula é recuperada pela centrifugação continua e ressuspensa em um tampão apropriado. A lise da suspensão cellular é alcançada pela homogeneização por alta pressão. Para a toxina mutante A, o homogenado é floculado e a solução floculada submetida a centrifugação contínua. Esta solução é filtrada e então transferida para um processamento abaixo. Para a toxina mutante B, o homogenado é clareado por uma centrifugação contínua, e então transferido para o processamrnto abaixo.
[0684] A toxina mutante A (SEQ ID NO: 4) é purificada usando duas etapas de cromatografia seguidas por uma troca de tampão final. O lisado clareado é carregado em uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e a toxina mutante ligada é eluída usando um gradiente de citrato de sódio. O conjunto de produtos da coluna HIC é então carregado em uma coluna de troca de cátion (CEX) e a toxina mutante A ligada é eluída usando um gradiente de cloreto de sódio. O conjunto CEX contendo a toxina mutante A purificada é trocado no tampão final pela diafiltração. A toxina mutante A purificada é trocada no tampão intermediário de substância de droga final por diafiltração. Após a diafiltração, o retido é filtrado através de um filtro 0,2 micron antes da inativação quimicamente para a substância de droga final. A concentração de proteína é almejada a 1-3 mg/mL.
[0685] A toxina mutante B (SEQ ID NO: 6) é purificada usando duas etapas de cromatográficas seguidas por uma troca de tampão final. O lisado clareado é carregado emu ma coluna de troca de ânion (AEX), s a toxina mutante ligada é eluída usndo um gradiente de cloreto de sódio. O critrato de sódio é adicionado ao conjunto de produto a partir da coluna AEX e carregado em uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). A toxina mutante ligada é eluída usndo um gradient de citrate de sódio. O conjunto de HIC contendo o polipeptídio de toxina mutante purificada (SEQ ID NO: 6) é trocado no tampão final pela diafiltração. A toxina mutante B purificada é trocada em um tampão intermediário de substância de droga final. Após a diafiltreação, o retido é filtrado através de um filtro 0,2 micron antes da inativação quimicamente para uma substância de droga final. A concentração ode proteína é almejada a 1-3 mg/mL.
EXEMPLO 20: INATIVAÇÃO DE FORMALDEÍDO /GLICINA
[0686] Após a purificação, as toxinas mutantes A e B genéticas (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) são inativadas por 48 horas a 25°C usando 40 mM (1.2 mg/ml) de formaldeído. A inativação é realizada ao pH 7,0 ± 0,5 em 10 mM fosfato, 150 mM de tampão de cloreto de sódio contendo 40 mM (3 mg/ml) glicina. O período de inativação é configurado para exceeder três vezes o período necessário para a redução no EC50 nas células IMR90 para 1000 ug/mL. Após 48 horas, a atividade biológica é reduzida 7 a 8 log10 relativo a toxina nativa. Seguindo a incubação de 48 horas, a toxina mutante inativada é trocada em um tampão de substância de droga final por diafiltração. Por exemplo, usando um cassete de ultrafiltração de acetato de celulose regenerado 100 kD, a toxina inativada é concentrada a 1-2 mg/mL e trocada por tampão.
EXEMPLO 21: INATIVAÇÃO POR N-(3-DIMETILAMINOPROPIL)-N’- ETILCARBODIIMIDA (EDC)/N-HIDROXISUCCINIMIDA (NHS)
[0687] Após a purificação, as toxinas mutantes genéticas (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6) são inativadas por 2 horas a 25°C usando 0,5 mg EDC e 0,5 mg NHS por mg de toxina mutante genética A e B purificada (aproximadamente 2,6 mM e 4,4 mM respectivamente). A reação é tempearada pela adição de glicina a concentração final de 100 mM e as reações incubadas por 2 horas adicionais a 25°C. A inativação é realizada ao pH 7,0 ± 0,5 em 10 mM fosfato, 150 mM tampão de colreto de sódio. O period de inativação é configurado para exceder três vezes o perído necessário para a redução no EC50 nas células IMR90 para maior do que 1000 ug/mL. Após 2 horas, a atividade biológica é reduzida 7 a 8 log10 relativo a toxina nativa. Seguindo a incubação de 4 horas, a toxina mutante inativada é trocada em um tampão de substância de droga final por diafiltração. Por exemplo, usando um cassete de ultrafiltração de acetato de celulose regenerado 100 kD, a toxina inativada é concentrada a 1-2 mg/mL e trocada por tampão.
[0688] A menos que do contrário especificado, os termos abaixo como usados na seção de Exemplos refererm-se a composição produzida de acordo com a presente descrição no Exemplo 21: “toxina mutante tripla tratada com EDC/NHS-”; “toxina mutantre inativada por EDC”; “substância de droga [A/B] de toxina mutante”; “toxina mutante EI”; “toxina mutante tripla EDC/NHS.” Por exemplo, os seguintes termos são sinônimos: “toxina mutante tripla A tratada por EDC/NHS”; “toxina mutante A inativada por EDC”; “substância de droga A de toxina mutante”; “toxina mutante A EI”; “toxina mutante tripla A EDC/NHS.” Como outro exemplo, os seguintes termos são sinônimos: “toxina mutante tripla B tratada por EDC/NHS”; “toxina mutante B inativada por EDC”; “substância de droga B de toxina mutante”; “toxina mutante B EI”; “toxina mutante tripla B EDC/NHS.”
[0689] A substância de droga A de toxina mutante e a substância de droga B de toxina mutante são cada uma fabricadas usando um processo de lote, que inclui (1) fermentação das cepas C. difficile de toxina negativa (VPI 11186) contendo um plasmídeo codificando o peptídeo de toxina mutante tripla genética respectivo (em um meio incluindo hidrolisado de soja, extrato de levedura HY YESTTM 412 (Sheffield Bioscience), glicose, e tianfenicol), (2) purificação da toxina mutante genética (o “intermediário da substância de droga”) a partir de um lisato livre de célula usando procedimentos de cromatografia de interação e troca de íon pelo menos maior do que 95% de pureza, (3) inativação química por tratamento com EDC/NHS seguido por temperamento/fechamento com glicina, e (4) troca em uma matriz de tampão final.
EXEMPLO 22: CONDIÇÕES SUPORTANDO OS ESTUDOS DE INATIVAÇÃO E FORMULAÇÃO
[0690] Para otimizar a inativação química das toxinas mutante genética, projeto estatístico de experimento (DOE) foi realizado. Os fatores examinados no DOE incluiram temperatura, concentração formaldeído/glicina, tempo e concentração de EDC/NHS (Tabela 9 e 10). Para monitorar a perda de atividade biológica, os valores EC50 nas células IMR90 foram determinados. Além disso, a morfologia cellular das células IMR-90 em vários pontos de tempo pós-tratamento também foram observados. Veja figura 9, mostrandoa morfologia em 72 horas pós-tratamento. Para determiner o efeito emu ma estrutura de proteína, o reconhecimento do epítopo foi monitorado usando uma análise de ponto de mancha usando um painel de anticorpos monoclonais levantado contra diferentes domínios de toxina.
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[0691] Na inativação de formaldeído /glicina inactivation das toxinas mutantes de C. difficile, as condições de reação final foram escolhidas de forma que o nível desejado de redução na atividade citotóxica (7 a 8 log10) fosse alcançado enquanto maximiza o reconhecimento do epítopo. Veja Exemplo 20 acima.
[0692] Na inativação de EDC/NHS das topxinas mutantes de C. difficile, as condições de reação final foram escolhidas de forma que o nível desejado de redução na atividade citotóxica (7 a 8 log10) fosse alcançado enquanto maximiza o reconhecimento do epítopo. Veja Exemplo 21 acima.
[0693] Em uma modalidade alternative, a reaçã o de EDC-NHS temperada pela adição de alanina, que temperou suficientemente a reação. O uso da alanina pode resultar emu ma modificação na proteína de toxina mutante que é similar a modificação quando a reação é temperada por glicina. Por exemplo, tempera adicionando alanina pode resultar em uma metade de alanina em uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico e/ou ácido aspártico da toxina mutante. Em outra modalidade alternativa, a reação de EDC-NHS foi temperada pela adição glicina metil éster, que temperou suficientemente a reação.
[0694] A produção de toxina A e toxina B de C. difficile mutante triplo inativo quimicamente sob condições otimizadas resdultou em uma outra redução de uma citotoxicidade residual par aum nível indetectável (>1000 μg/mL - a menor concentração testada através de um ensaio CPE), enquanto retêm a antigenicidade como medido por sua reatividade aos anticorpos de neutralização específicos de toxina. Os resultados mostrados na Tabela 28 demonstram um passo a passo na redução da citotoxicidade a partir da toxina wt até as toxinas mutantes triplas tratadas por EDC/NHS. A marcação por imunofluorescencia confirmou que as toxinas mutantes triplas (SEQ ID NO: 4 e 6) e as substâncias de droga de toxina mutante exibiram ligações comparáveis às células IMR-90 sugerindo que a perda de citotoxicidade não foi devido a ligação reduzida nas células (dados não mostrados). Comparado a substância de droga de toxina mutante A, a substância de droga de toxina mutante B alcançou uma redução na citotoxicidade dobra maior, que é consistente com a potência maior dobra ~600 do TcdB comparado ao TcdA. Tabela 28.Sumário de Citotoxicidade
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Resultados do ensaio de citotoxicidade para a toxina mutante B modificado por EDC sozinho, ou por EDC e sulfo-NHS também foram avaliados. Ver Tabela 29 TABELA 29
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[0695] Condições: a toxina mutante tripla B (“TM TcdB”) (SEQ ID NO: 6) foi modificada nas proporções de peso de toxina mutante B:EDC:sulfo-NHS = 1: 0,5: 0,94. Esta proporção é o equivalente molar (corrigido para o maior MW de sulfo-NHS) para a reação EDC/NHS padrão como descrito no Exemplo 21. Para determinar o efeito de sulfo-NHS, a proporção de sulfo-NHS foi variada de 0,5x a 2x a proporção padrão. As reações duplicadas forma realizadas em 1 x PBS pH 7,0 a 25 °C, e foram iniciadas pela adição da solução EDC. Após 2 horas, as reações foram temperadas pela adição de 1 M glicina pH 7,0 (0,1 M concentração final) e incubado por ainda 2 horas. As reações temperadas foram dessalgadas alinizadas e a substância de droga de toxina mutante B (“TM TcdB-EDC”) foi concentrada usando dispositivos Vivaspin 20, e estéril filtrados em frascos estéreis e submetidos para avaliação em um ensaio de citotoxicidade.
[0696] Na mesma proporção molar, o sulfo-NHS reduziu o EC50 para cerca de 250 ug/mL quando comparado a >1000 ug/mL para NHS. Mesmo em duas vezes a proporção molar, o sulfo-NHS não aparace como eficaz como o NHS na diminuição da citotoxicidade. Veja Tabela 30. TABELA 30
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[0697] Para determiner o número e o típo de modificações, o mapeamento de peptídeo foi realizado em ambas as amostras de toxina mutante tripla Binativada EDC/NHS e EDC/sulfo- NHS. Quantidades similares de modificações de deidroalanina, adutos de glicina e ligações em cruz foram observadas em ambas as amostras. Entretanto, na amostra de sulfo-NHSa, nenhuma beta- alanina foi observada.
[0698] A toxina do tipo selvagem B (SEQ ID NO: 2) foi inativada usando o protocol padrão (veja Exemplo 21); toxina B:EDC:NHS 1:0,5:0,5, 25°C por 2 horas em 1 x PBS pH 7,0, então temperada com 1 M glicina (0,1 M concentração final) e incubada por mais 2 horas adicionais. A amostra foi dessalinizada, concentrada e submetida a um ensaio de citotoxicidade. O EC50 para estas amostras foi <244 ng/mL
EXEMPLO 23: ESTUDOS DE REVERSÃO
[0699] Para determinar ser a reversão ocorre tanto com as toxinas mutanets de C. difficile inativadas por EDC/NHS quanto com o formaldeído /glicina, as amostras de toxinas mutantes inativadas (1 mg/mL) foram incubadas a 25°C por seis semanas. As alíquotas foram removidas a cada semana e os valores de EC50 nas células IMR90 foram determinados. Uma amostra de formaldeído /glicina inativada contendo nenhum formaldeído e uma amostra contendo 0,01% formaldeído. O EC50 foi medido pelo ensaio CPE.
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[0700] A 25°C na ausência do formaldeído residual, uma reversão parcial é observada (Tabela 11). Wpós cinco semanas, a atividade citotóxica aumentou aproximadamente 3-dobras. Embora a atividade citotóxica tenha aumentado, após cinco semanas ainda tinha uma redução de 7 log10 relativa a toxina nativa. Uma reversão foi completamente prevenidapela inclusão de formalina a uma concentração de 0,010%. Nenhuma reversão foi observada na amostra de EDC/NHS inativada. Por todas as 6 semanas de incubação, os valores EC50 permaneceram no nível inicial de >1000 μg/mL para todos os quatro lotes de ambas as toxinas mutantes triplas A tratadas EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) and EDC/NHS-treated toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6). Em contraste, os valores EC50 da toxina mutante tripla A tratada FI (SEQ ID NO: 4) e toxina mutante tripla B tratada FI (SEQ ID NO: 6) não foram estáveis e diminuíram para valores de EC50 baixo não aceitáveis, indicando um aumento na citotoxicidade ou reversão de inativação. Veja Tabela 11.
[0701] Além disso para reduzir estavelmente a citotoxicidade para um nível indetectável (>1000 μg/mL, como medido pelo ensaio CPE), as toxinas mutantes inativadas usando EDC/NHS reteram epítopos importantes que são alvos dos mAbs neutralizando a toxina. Veja Tabela 31. As toxinas mutantes FI mostram uma perda dos mesmos determinantes antigênicos. Tabela 31: inativação de EDC/NHS reduziu a Citotoxicidade das Toxinas mutantes genéticas e manteve os determinantes antigênicos importantes
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a citotoxicidade como medido usando o ensaio CPE nas células IMR90 b os valores determinados por uma análise Biacore™ usando multiple neutralizing mAbs de neutralização múltiplos direcionados a vários epítopos de toxina não sobreposta c valores são medias de dois experimentos d para as três primerias fileiras, o neut mAb “1,” “2,” “3” refere-se ao mAbs A60-22, A80-29, e A65-33 para a toxina A, respectivamente. Para as três fileiras de baixo, o neut mAb “1,” “2,” “3” refere-se ao mAbs B8-26, B59-3, e B-56-15 para a toxina B, respectivamente.
Exemplo 24: ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE PRECLÍNICOS
[0702] Os objetivos preclínicos chave incluem composições de teste incluindo toxinas mutantes A e B de C. difficile em pequenos animais e primatas não humanos (NHP). Os camundongos e os ramisters foram imunizados para determiner, entre outras coisas, se as composições de C. difficile são capazes de provocar anticorpos de neutralização contra a toxina mutante A e B. Os antígenos foram testados par a indução de respostas de neutralização de soro seguindo as séries de imunizações em camundongos, ramisters, e macacos cinomolgos. As toxinas mutantes inativadas quimicamente e/ou genéticas foram formuladas tanto em um tampão neutro, tampão de fosfato de alumínio, quanto em um tampão contendo ISCOMATRIX como um adjuvante em algumas modalidades. As respostas de anticorpo de neutralização foram geralmente testadas por duas ou quatro semanas após cada reforço ou dose final.
[0703] O ensaio de neutralização de toxina demonstrou a capacidade de um antissoro neutralizar o efeito citotóxico mediado por C. difficile TcdA ou TcdB e é, portanto capaz de medir a atividade funcional dos anticorpos que estão presentes em uma. Um ensaio de neutralização de toxina foi realizado em uma linha de célula de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90, que é sensível a ambos o TcdA e o TcdB. Resumidamente, uma placa de microtítulo com 96 poços foi semeada com células IMR-90 servindo como alvo da citotoxicidade mediada por toxina. Cada amostra de soro teste foi analisada separadamente para a capacidade de neutralizar o TcdA e o TcdB. As diluições seriais aprorpiadas de teste antissoro forma misturadas com as concentrações fixadas para TcdA ou TcdB e incubada a 37°C por 90 minutos em um incubador umidificado (37°C /5% CO2) para permitir que a neutralização das toxinas ocorra. Para um controle de qualidade, todas as placas incluíram controles e padrão de referência que incluem anticorpos antitoxina de título conhecido. Após 90 minutos, a mistura antissoro de toxina foi adicionada a monocamada das células IMR-90 e as placas foram incubadas por 72 horas adicionais. Subsequentemente, um substrato CellTítulo-Glo® foi adicionado a placa de ensaio para determiner os níveis de Adenosina Trifosfato (ATP) presentes em células ativas metabolicamente e foi medido como Unidades de Luminescência Relativa (RLU). Um nível alto de ATP indica uma alta viabilidade cellular, e os níveis são diretamente proporcionais à quantidade de neutralização da toxina pelo anticorpo presente na amostra. Para os dados preclínicos, os dados RLU foram plotados contra o valor de diluição da amostra antissoro teste para gerar uma curva de encaixe de resposta de regressão de Quatro Parâmetros Logísticos (4-PL). Os títulos de neutralização foram expressos como o valor de diluição na amostra que exibiou 50% de redução na citotoxicidade.
EXEMPLO 25: ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGO: MUC. DIFFICILE2010-06
[0704] A proposta deste estudo foi avaliar a imunogenicidade de duas formas da de C. difficile mutante B (SEQ ID NO: 6), cada uma inativada quimicamente por dois métodos diferentes. Neste estudo, a toxina mutante B não tratada (SEQ ID NO: 6) (inativada geneticamente, mas não inativada quimicamente) foi usada como um controle, com e sem o adjuvante.
[0705] Os grupos de 10 camundongos forma imunizados intramuscularmente com 10 μg de um imunogênio de acordo com a Tabela 12.
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Resultados: não ouve eventos adversos nos camundongos seguindo cada administração das vacinas candidatas. Como ilustrado na Figura 10, os camundongos em cda grupo desenvolveram anticorpos de neutralização antitoxina B robustos significantes após a terceira dose com as toxinas mutantes respectivas.
[0706] Com base em um título de 12 semanas, parece que nos camundongos a toxina mutante inativada B de EDC (Grupo 2) e as toxinas mutantes inativadas por formalina (Grupo 1) geraram rspostas de neutralização potentes.
[0707] Na ausência da inativação química, a toxina mutante genética B (SEQ ID NO: 6) gerou respostas de neutralização após duas doses (Grupos 3-4, semana 8), que foram reforçadas após a terceira dose (Grupos 3-4, semana 12).
EXEMPLO 26: ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGO: MUC. DIFFICILE2010-07:
[0708] O propósito deste estudo foi avaliar a imunogenicidade das toxinas mutantes A e B de C. difficile inativadas quimicamente (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), tanto sozinhas quanto em combinação. Os imunogênios para todos os grupos foram formulados com fosfato de alumínio como um adjuvante.
[0709] Os grupos de 5 camundongos forma imunizados intramuscularmente com 10 μg de um imunogênio de acordo com Tabela 13. TABELA 13. TESTANDO AS TOXINAS MUTANTES A E B GENÉTICAS INATIVADAS QUIMICAMENTE (SEQ ID NOS: 4 E 6, RESPECTIVAMENTE) EM CAMUNDONGOS
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Resultados: não ouve eventos adversos nos camundongos seguindo cada administração das vacinas candidatas. Como ilustrado na Figura 11, após duas doses da toxina mutante inativada genética quimicamente, os anticorpos de neutralização antitoxina A (Grupos 3-5) foram reforçados ao título entre 3 e 4log10 enquanto anticorpos de neutralização antitoxina B (Grupos 1-2, 5) permaneceram de baixo a indetectável, que é consistente com os dados a partir dos estudos com camundongos descritos acima (Figura 10). Os anticorpos de neutralização antitoxina B reforçados para 2-3 log10 nos grupos 1, 2, e 5 seguindo a terceira dose (semana 12 de títulos) e alcançaram seu pico duas semanas seguindo a quarta dose (semana 14 de títulos). Os anticorpos de neutralização antitoxina A nos grupos 3-5 aumentou levemente seguindo da terceira (semana 12 títulos) e a quarta imunizações (semana 14 títulos).
EXEMPLO 27: ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE EM RAMISTERS: HAMC. DIFFICILE2010-02:
[0710] O propósito deste estudo foi avaliar a imunogenicidade e o potencial de proteção das toxinas mutantes A e B inativadas quimicamente e mutante tripla de C. difficile nos modelos de ramister dourado Syrian. O modelo de ramister dourado Syrian representa o melhor modelo de desafio disponível para simular CDAD humano. Os mesmos lotes de toxinas mutantes A e B usados no estudo com camundongo muC. difficile2010-07 forma usados neste estudo. Como um controle, foi dado para um grupo as toxinas mutantes sem o adjuvante contendo alumínio.
[0711] Os grupos de 5 ramisters dourados Syrian forma imunizados intramuscularmente com 10 μg de um imunogênio de acordo com a Tabela 14. TABELA 14. TESTANDO AS TOXINAS MUTANTES A E B INATIVADAS QUIMICAMENTE (SEQ ID NOS: 4 E 6, RESPECTIVAMENTE) EM RAMISTERS (HAMC. DIFFICILE2010-02)
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Resultados: não ouve eventos adversos observados seguido da imunização com as toxinas mutantes. Como ilustrado na Figura 12, após uma única dose das toxinas mutantes, as respostas de neutralização da antitoxina A foram entre 2-3 log10 para as toxinas mutantes inativadas por formalina (Grupos 1-2) e entre 3-4 log10 para as toxinas mutantes inativadas por EDC (Grupo 3). Após a segunda dose, os anticorpos antitoxina A potencializaram em todos os grupos. Os anticorpos antitoxina A em todos os grupos não pareceram aumentar após a terceira dose. Um resultado similar foi observado após a quarta imunização, onde um aumento no título foi observado no grupo inativado por formalina que não continha o adjuvante de alumínio (Grupo 2).
[0712] As respostas de neutralização de antitoxina B foram indetectáveis nos grupos de toxinas mutantes inativadas por formalina (Grupos 1-2) e foram apenas acima de 2 log10 para as toxinas mutantes inativadas por EDC (Grupo 3) após uma única dose. Após a segunda dose, os títulos de anticorpo de neutralização antitoxina B nos dois grupos inativados por formalina (Grupos 1-2) aumentaram para 3-4log10 enquanto que no grupo inativado por EDC (Grupo 3) aumentou para 4-5 log10. Para todos os três grupos, aumentos nos títulos de anticorpo de neutralização antitoxina B foram observados após a terceira e/ou a quarta doses, com todos os grupos alcançando um pico de título na semana 16 (após a última dose). Veja a figura 12.
[0713] Na Figura 13, o nível de respostas de anticorpo de neutralização contra as toxinas mutantes genéticas inativadas quimicamente (Figura 12) foi comparada a aquela provocadas pelo List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, California) (também referido aqui como “List Bio” ou “List Biologicals”) toxóides (isto é, toxóides comprados da List Biological Laboratories foram preparados pela inativação da formalina das toxinas do tipo selvagem; o reagente de controle usado para estabilizar o modelo de desafio de ramister).
[0714] Como usado aqui, “FI” nas figuras e nas tabelas refere-se ao tratamento com formalina/glicina das toxinas, 2 dias a 25°C, a menos que do contrário estabelecido. Como usado aqui, “EI” nas figuras e nas tabelas refere-se ao tratamento por EDC/NHS por 4 horas a 30°C, a menos que do contrário estabelecido. Na Figura 13, 5 animais ramisters foram tratados com a respectiva composição de toxina mutante, enquanto que 11 animais ramisters forma tratados com um toxóide comprado da List Biological.
[0715] Os dados na Figura 13 mostram que, nos ramisters administrados de acordo com a Tabela 14, os títulos de anticorpo de neutralização respectivos contra a toxina A (Figura 13A) e a toxina B (Figura 13B) induziram a composição imunogênica incluindo as toxinas mutantes inativadas por EDC após duas doses é menor do que os títulos de anticorpo de neutralização respectivos provocados pelos toxóides da List Biologicals.
EXEMPLO 28: ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE EM RAMISTERS: C. DIFFICILE HAM2010-02 (CONTINUADO)
[0716] Para avaliar a eficácia de proteção das toxinas mutantes, imunizados, junto com um grupo de controle dos animais não imunizados, foi dado primeiro uma dose oral de um antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para romper a flora intestinal normal. Após cinco dias, os ramisters foram desafiados com uma dose oral de esporos de C. difficile do tipo selvagem (630 cepas, 100 cfu por animal). Os animais forma monitorados diariamente por onze dias após o desafio para sinais de CDAD, que em ramisters é conhecido como cauda molhada. Usando um Sistema de pontuação clínica um número de parametros diferente, os animais que determinaram ter um CDAD grave foram sacrificados. Os parâmetros incluiram atividade seguida de estimulação, desidratação, excrement, temperature, e peso, etc., que são conhecidos na arte.
[0717] No dia 11, o estudo foi finalizado e todos os animais sobreviventes foram sacrificados. A Figura 14 mostra as curvas de sobrevivência para cada um dos três grupos imunizados (Grupos 1-3, de acordo com a Tabela 14) quando comparado aos controles não imunizados. Como pode ser visto, todos os aminais não imunizados desenvolveram um CDAD grave e requereram sacrifício entre os dias 1-3 após o desafio (0% de sobrevivência). Ambos os grupos administrados com a toxina mutante inativada por formalina tiveram 60% de curvas de sobrevivência, com animais não requerendo eutanásia até o dia 3 (Grupo 1) ou dia 4 (Grupo 2). O grupo administrado com a toxina mutante inativada por EDC tinha uma curva de sobrevivência de 80%, com 1 (fora 5) animal requerendo eutanasia no dia 7. Portanto, os ramisters foram protegidas do desafio letal com esporos de C. difficile.
EXEMPLO 29: estudo de imunogenicidade em ramisters: hamC. difficile2010-03: Imunogenicidade de toxinas mutantes de C. difficile genética e inativadas quimicamente
[0718] O propósito deste estudo foi avaliar a imunogenicidade das toxinas mutantes A e B inativadas quimicamente e dos mutanes triplos de C. difficile adjuvantados (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) no modelo de ramister dourado Syrian. Os mesmos lotes de toxinas mutantes A e B (SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente) usados nos estudos com camundongo muC. difficile2010-07 forma usdos neste estudo. Como um controle, a um grupo (Grupo 1) foi dado uma salina tamponada com fosfato como placebo.
[0719] Grupos de cinco ou dez ramisters dourados Syrian foram imunizados com um imunogênio de acordo com Tabela 15. Foi dado aos animais três doses. Além disso, os animais foram dosados a cada duas semanas.
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Resultados: Veja a figura 15. Nenhum anticorpo A ou B antitoxina foi observado no grupo de controle de placebo. Após uma dose, os anticorpos de neutralização A antitoxina foram observados entre 2-3 log10 para os grupos de toxina mutante genética (Grupo 4) e inativados por formalina (Grupo 2) e entre 3-4log10 para o grupo inativado por EDC (Grupo 3). Os anticorpos de neutralização antitoxina A aumentaram em cada um destes grupos (2-4) após a segunda imunização com as toxinas mutantes relevantes (títulos comparados na semana 2 a semana 3 na Figura 15). Após a terceira dose das toxinas mutantes (dada na semana 4), os títulos de anticorpos de neutralização antitoxina A nos Grupos 2-4 aumentaram comparado com seus títulos na semana 4.
[0720] Os anticorpos de neutralização de antitoxina B foram detectáveis após a segunda dose, sendo que os anticorpos de neutralização antitoxina B inativados por formalina (Grupo 2) e inativados por EDC (Grupo 3) aumentaram para entre 3-4 log10 e par entre 2-3 log10 para o mutante triplo genético (Grupo 4). Seguindo a terceira imunização (semana 4), os títulos de anticorpo de neutralização antitoxina B potenciados para entre 3-4 log10 para toxinas mutantes inativadas por formalina (Grupo 2) e toxinas mutantes genéticas (Grupo 4) e entre 4-5 log10 para as toxinas mutantes inativadas por EDC (Grupo 3).
[0721] Para ambos anticorpos de neutralização antitoxina A e antitoxina B, os títulos de pico foram observados na semana 6 (pós- dose 3) para todos os grupos vacinados (Grupos 2-4). Avaliação de composições imunogênicas adjuvantadas com Alhidrogel/CpG ou ISCOMATRIX
[0722] Os ramisters imunizados com a composição imunogênica incluindo uma toxina mutante inativada quimicamente formulada com Alhidrogel, ISCOMATRIX, ou Alhidrogel/CpG24555 (Alh/CpG) desenvolveu um antissoro antitoxina de neutralização robusto. Foi observado que o pico de respostas antitoxina A e antitoxina B foram 2-3- dobras maior e estatisticamente significante nos grupos imunizados com as toxinas mutantes formuladas em Alh/CpG ou ISCOMATRIX quando comparado s vacina formulada com o Alhidrogel sozinho. Veja a Tabela 32 mostrando 50% de títulos de neutralização. Os ramisters (n=10/ grupo) foram imunizados com IM a 0, 2, e 4 semanas com 10 μg cada substância de droga de toxina mutante A e substância de droga de toxina mutante B formulada com 100 μg de Alhidrogel, ou 200 μg de CpG 24555 + 100 μg de Alhidrogel, ou 10 U de ISCOMATRIX. O soro foi coletado em cada momento e analisado no ensaio de neutralização de toxina para a atividade antitoxina funcional. Os títulos principais geométricos são proporcionados na tabela 32. O asterisco (*) indica uma significância estatística (p<0,05) quando comparado aos títulos no grupo Alhidrogel.
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A eficácia de proteção da composição imunogênica incluindo as substâncias de droga de toxina mutante formulada com estes adjuvantes foi testada. Os ramisters forma imunizados e dados via oral clindamicina (30 mg/kg) na semana 5 e desafiado de acordo com o método descrito acima. Um grupo de ramisters imunizados (n=5) foi inoculado como um controle. A eficácia aumentada foi observada nos ramisters imunizados com as substâncias de droga de toxina mutante adjuvantadas tanto com Alh/CpG quanto com ISCOMATRIX (100% de sobrevivência) quando comparado ao Alhidrogel sozinho (70% de sobrevivência). Portanto, os ramisters forma protegidos de um desafio letal com esporos de C. difficile.
EXEMPLO 30: VACINAÇÃO POR CLOSTRIDIUM DIFFICILE EM MACACOS CINOMOLGOS
[0723] O propósito deste estudo foi testar a imunogenicidade de doses baixas e altas de toxinas mutantes de C. difficile inativado por formalina e inativado por EDC em macacos cinomolgos. Todas as toxinas mutantes forma formuladas em ISCOMATRIX® como um adjuvante exceto para um grupo, que serviu como um controle não adjuvantado (Grupo 5).
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Resultados: a Figura 16 mostra a resposta de anticorpo de neutralização de antitoxina nestes animais nas semanas 0, 2, 3, 4, 6, 8, e 12. Os títulos de antitoxina A foram entre 2-3 log10 para todos os cinco grupos após uma única dose (semana 2 títulos). Estes títulos potenciaram após cada dose subsequente para cada grupo. Nestes animais, não houve uma gota no título entre as semanas 3 e 4. Para todos os grupos, o pico dos títulos foi entre 4-5 log10. Em todos os momentos, o grupo sem o adjuvante ISCOMATRIX (Grupo 5) teve os títulos menores, indicando a utilidade de ISCOMATRIX no reforço das respostas imunes. O grupo de controle sem adjuvante (Grupo 5) alcançou um pico de títulos na semana 12, como fez o grupo imunizado com uma alta dose de toxinas mutantes inativadas por EDC (Grupo 4); todos os outros grupos alcançaram picos de títulos na semana 6, duas semanas após a última dose.Os títulos em todos os grupos potenciaram após a segunda dose (semana 3 no momento). Como com as respostas antitoxina A, as respostas antitoxina B não diminuíram da semana 3 para a semana 4. Após a terceira dose (semana 6 no momento), os títulos de anticorpo de neutralização antitoxina B em todos os grupos foram entre 3-4 log10, exceto no grupo inativado pore formalina de dose baixa (Grupo 1) e o grupo inativado por EDC de dose alta (Grupo 4), ambos que tiveram títulos apenas >4 log10. O pico de títulos foi observado na semana 12 para todos os grupos exceto o grupo inativado por EDC de dose baixa (Grupo 3), que tinha picos de títulos na semana 8. Todos os grupos tinham pico de títulos >4 log10.
EXEMPLO 31: PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
[0724] Embora as toxinas A e B compartilhem muita da homologia estrutural, as atividades de neutralização dos anticorpos foram consideradas específicas para toxina. Nesta invenção, vários anticorpos foram identificados ue são específicos para uma toxina individual, e direcionada a vários epítopos e domínios funcionais, e tem uma alta afinidade e uma atividade de neutralização potente em direção as toxinas nativas. Os anticorpos forma isolados a partir de camundongos que foram imunizados tanto com uma toxina mutante (FI) inativada por formalina disponível comercialmente quanto uma toxina mutante holo (SEQ ID NOs: 4 e 6) rendeu um não tóxico introduzindo mutações específicas em seu local catalítico para a produção ode toxina A e B mAb, respectivamente. O mapeamento do epítopo dos anticorpos mostrou que a vasta maioria do mAb contra a toxina A (49 de 52) foram direcionadas para o domínio terminal C não catalítico da toxina.
[0725] Os monoclonais contra a toxina B foram almejados para três domínios da proteína. De um total de 17 mAb específico para toxina B, 6 foram específicas para o N-terminal (por exemplo, aminoácidos 1-543 do C. difficile TcdB do tipo selvagem, tal como 630), 6 no C-terminal (por exemplo, aminoácidos 1834-2366 de um C. difficile TcdB do tipo selvagem, tal como 630) e 5 para o domínio de meia translocação (por exemplo, aminoácidos 799-1833 de um C. difficile TcdB do tipo selvagem, tal como 630). A abordagem de usar as toxinas de C. difficile mutante (por exemplo, SEQ ID NO: 4 e 6) como antígenos de imunização ainda oferecem uma vantage chave de apresentar a maioria, se não todos os epítopos antigênicos quando comparado ao processo de inativação por formalina que tende a afetar adversamente que tende a afetar adversamente a estrutura antigênica da toxina mutante.
EXEMPLO 32: CARACTERIZAÇÃO DA TOXINA A MAB, A3-25, QUE INCLUI UMA CADEIA LEVE VARIÁVEL TENDO UMA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DA SEQ ID NO: 36 E UMA CADEIA PESADA VARIÁVEL TENDO UMA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO SEQ ID NO: 37.
[0726] O mAb A3-25 foi de particular interesse desde que este anticorpo desafiou todas as tentativas de definer sua isotipagem de imunoglobulina (Ig) usando os kits de isotipagem comumente disponíveis para IgG, IgM e IgA. Outra análise por western blot usando um antissoro específico de cadeia H Ig mostraram que o A3-25 é do isótipo IgE, um evento raro na produção de mAb. Este foi ainda confirmado pela sequência de nucleotídeo de mRNA isolado de células de hibridmona A3-25. As sequências de aminoácido das sequências de nucleotídeo das cadeias L e H de regiões variáveis de A3-25 são conhecias na Figura 17.
[0727] A fim de avaliar o mAb A3-25 em um modelo de animal para a infencção e doença por C. difficile, seu isótipo Ig foi mudado para IgG1 murino por um enxerto molecular da região variável de cadeia H ε na cadeia pesada Y murino de acordo com os métodos publicados.
EXEMPLO 33: CAPACIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO E MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE TOXINA
[0728] Ainda, em um esforço para identificar os aticorpos de neutralização/funcionais, todos os monoclonais foram avaliados para a capacidade de neutralizar as toxinas so tipo selvagem em um ensaio de efeito citopático padrão (CPE) ou em um ensaio quantitativo e mais estringente com base em uma medição de ATP como indicador de viabilidade celular.
[0729] De um total de 52 anticorpos específicos de toxina A, quatro mAb (A3-25, A65-33, A60-22 e A80-29 (Tabela 17 e Figura 18) exibiram níveis variados de atividade de neutralização. Um ensaio de ligação competitivo BiaCore e os ensaios de inibição de hemaglutinação (HI) foram realizados para mapear os epítopos de anticorpo. Os resultados indicaram que estes anticorpos podem ser almejados para diferentes epítopos da proteína de toxina A (Tabela 17). Para ainda identificar a localização do local de ligação na proteína, os anticorpos foram avaliados individualmente em ensaios de western blot ou dot blot usando fragmentos de toxina de sequências conhecidas. Todos os 4 mAb de neutralização foram considerados direcionadod a região de C-terminal da toxina.
[0730] De um total de anticorpos específicos de toxina B, 9 foram considerados de neutralização. Dos nove mAb de neutralização, seis deles foram direcionados para o C-terminal e os outros três para o domínio de translocação da toxina B (Tabela 18). Com base em um ensaio de ligação competitiva Biacore, os nove anticorpos monoclonais de neutralização podem ser agrupados em quatro grupos de epítopos mostrado na Figura 19. TABELA 17: características da toxina A mAb selecionada
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TABELA 18: características da toxina B mAb selecionada
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EXEMPLO 34: IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS COMBINAÇÕES DE ANTICORPOS DE TOXINA A COM ATIVIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO SIGNIFICANTEMENTE AUMENTADA:
[0731] As quatro toxinas A mAb (A3-25, A65-33, A60-22 e A80- 29) mostraram uma neutralização incompleta ou parcial GDn da toxina A quando testadas individualmente no ensaio de neutralização com base em ATP. O mAb A3-25 foi o anticorpo mais potente e os outros três foram menos neutralizadores com com o A80-29 pouco acima do anterior (Figura 18). Entretanto, quando A3- 25 foi combinado com qualquer um dos outros três mAbs, um efeito sintético na neutralização foi observado em todas as três combinações que foi muito maior do que a soma total de neutralização de anticorpos individuais como mostrado na Figura 20A-C. Além disso, todas as três combinações exibiram uma capacidade de neutralização completa normalmente observada com os anticorpos policlonais antitoxina A.
EXEMPLO 35: IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS COMBINAÇÕES DE ANTICORPOS DE TOXINA B COM ATIVIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO SIGNIFICANTEMENTE AUMENTADA
[0732] Também observamos que a neutralização sinérgica com a toxina B mAbs a partir de grupos de epítopo diferente identificados pela análise BiaCore. A toxina B mAb B8-26, o mAb mais dominante do grupo 1, foi combinado com o mAbs multiplo do grupo 3. As combinações foram avaliadas em um ensaio de neutralização específico de toxina B e os resultados são mostrados na Figura 21 e na Tabela 19.
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O efeito de neutralização sinérgico foi observado quando o B8-26 foi combinado com um epítopo do grupo 3 mAb (Figura 21B), mas não qualquer outro mAb (dados não mostrados) EXEMPLO 36: TRIAGEM IN VITRO POR UM MAB PARA COMPOSIÇÕES DE TOXINA MUTANTE SEGURA E EFICAZ:
[0733] As toxinas mutantes A e B genéticas de C. difficile (por exemplo, SEQ ID NO: 4 e 6) geradas através de um projeto genético mostratam uma citotoxicidade residual usando um ensaio de citotoxicidade in vitro. Embora tenhamos alcançado ~4 log de redução na citotoxicidade para cada toxina mutante de toxina de C. difficile (Tabela 20), ainda uma inativação química das toxinas mutantes, tais como com o tratamento de formalina foi preferido. Entretanto, os tratamentos com inativação química podem ser severos e podem afetar adversamente os epítopos antigênicos chave destas toxinas ou toxinas mutantes. Tabela 20: Compação de citotoxicidade In Vitro de toxina WT, Toxina mutante tripla, e toxinas WT inativadas por formalina (FI, da List Biological) (List Biological, comercial)
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[0734] Para a otimização do bioprocesso, um projeto estatístico de experimento (DOE) foi realizado para a inativação química do Tcd A e B mutante triplo (1 mg/mL) usando um tratamento com formalina e EDC/NHS. Para otimizar a inativação por formalina do TcdA mutante triplo, variamos as concentrações de formalina/glicina (20-40 mM), pH (6,5-7,5), e temperatura (25-40°C). Para o TcdB mutante triplo, variamos a concentração de formalina/glicina de 2 a 80 mM e a temperatura e pH foram 25 °C e 7,0 respectivamente. O tempo de incubação para todos os tratamentos com formalina foi de 24 horas. Para a inativação por formalina, “40/40” nas Tabelas 21 e 23 representam as concentrações de formalina e glicina usadas na reação. Para o tratamento com EDC/NHS, variamos as concentrações de EDC/NHS de 0,25 a 2,5 mg/mg de TcdA mutante triplo e de 0,125 a 2,5 mg/mg de TcdB mutante triplo e incubado por quatro horas a 25 °C. Ao final da reação, todas as amostras foram dessalinizadas em 10 mM fosfato, pH 7,0. Após a purificação, os Tcds tratados foram analizados para uma citotoxicidade residual e o reconhecimento de mAb dos epítopos por análise mancha pontilhada. A meta foi identificar as condições de tratamento que reduziram a citotoxicidade para o nível desejado (EC50 > 1000 μg/mL) sem impactar negativamente os epítopos reconhecidos pelo painel de mAbs de neutralização (++++ ou +++). As condições de tratamento (marcadas com uma marca de seleção “J” nas Tabelas 21-24) renderam composições imunogênicas potencialmente eficazes e seguras que retiveram a reatividade para pelo menos quatro mAbs de neutralização enquanto exibia 6-8 log10 de redução na citotoxicidade, relativo citotoxicidade da toxina do tipo selvagem respectiva. Os resultados selecionados são ilustrados nas Tabelas 21 a 24. Os dados adicionais a partir das condições de tratamento vcariantes nas toxinas mutantes triplas e os dados a partir de ensaios de neutralização de toxina e citotoxicidade in vitro são mostrados na Tabela 33 e Tabela 34. Veja também, por exemplo, os Exemplos 20 e 21 acima, que proporcionam mais detalhes em relação as condições de tratamento de ligação em cruz preferidos das toxinas mutantes. Tabela 21: Citotoxicidade e neutralização de reatividade de mAb de TcdA mutante triplo inativado por formalina (SEQ ID NO: 4)
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Condições de reação de ligação em cruz química para as amostras de toxina mutante tripla A (SEQ ID NO: 4) referenciadas na Tabela 33
[0735] As amostras 1-4 forma modificadas com EDC/NHS. Condições: 30°C, 20 mM MES/150 mM NaCl pH 6,5. As reações foram iniciadas pela adição de EDC. Após 2 horas de reação, as amostras A, B, e C tinham 1 M glicina adicionada a 50 mM de concentração final de glicina. A amostra D não tinha glicina adicionada. As reações foram configuradas com diferentes proporções de peso de uma toxina mutante A (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS como indicado abaixo. 1 L44166-157A 1: 0,25: 0,25 w: w: w 2 L44166-157B 1: 1,25: 1,25 3 L44166-157C 1: 2,5: 2,5 4 L44166-157D 1: 2,5: 2,5
[0736] A amostra 5 L44905-160A 80 mM HCHO, 80 mM glicina, 80mM NaPO4 pH 7, 1mg/mL Toxina mutante A (SEQ ID NO: 4) Proteína, 48 hrs reação a 25 °C.
[0737] A amostra 6 L44166-166 EDC/NHS modificação de uma toxina mutante A (SEQ ID NO: 4) a 25 °C em 20 mM MES/150mM NaCl pH 6,5. Toxina mutante A (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS = 1:0,5:0,5. Reação iniciada por adição de EDC. Após 2 horas de reação, 1M glicina adicionada a 0,1 M glicina de concentração final e outras 2 horas de incubação. Após este período, o tampão de reação trocou para 1 X PBS em Sephadex G25.
[0738] A amostra 7 L44905-170A 80 mM HCHO, 80 mM glicina, 80mM NaPO4 pH 7, 1mg/mL Toxina mutante A (SEQ ID NO: 4) Proteína, 48 hrs de reação a 35 C. esta reaação de formalina foi direcionada como produzindo ligações em cruz excessivas de forma que a ligação ao antígeno fosse gravemente diminuída.
[0739] A amostra 8 L44897-61 32 mM HCHO/80 mM glicina, 72 hrs de reação a 25 °C.
[0740] A amostra 9 L44897-63 80 mM HCHO/80 mM glicina, 72 hrs de reação a 25 °C.
[0741] Todas as seguintes reações tiveram 24 hrs de tempo de reação.
[0742] Amostra 10 L44897-72 Tubo#1 25°C, 80 mM NaPi pH 6,5, 20 mM HCHO/20 mM glicina
[0743] Amostra 11 L44897-72 Tubo#2 25 °C, 80 mM NaPi pH 6,5, 40 mM HCHO/40 mM glicina
[0744] Amostra 12 L44897-72 Tubo#3 32,5 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 30 mM HCHO/30 mM glicina
[0745] Amostra 13 L44897-72 Tubo#4 32,5 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 30 mM HCHO/30 mM glicina
[0746] Amostra 14 L44897-72 Tubo#5 32,5 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 30 mM HCHO/30 mM glicina
[0747] Amostra 15 L44897-75 Tubo#6 25 °C, 80 mM NaPi pH 7,5, 20 mM HCHO/20 mM glicina
[0748] Amostra 16 L44897-75 Tubo#7 25 °C, 80 mM NaPi pH 7,5, 40 mM HCHO/40 mM glicina
[0749] Amostra 17 L44897-75 Tubo#8 40 °C, 80 mM NaPi pH 6,5, 20 mM HCHO/20 mM glicina
[0750] Amostra 18 L44897-75 Tubo#9 40 °C, 80 mM NaPi pH 6,5, 40 mM HCHO/40 mM glicina
[0751] Amostra 19 L44897-75 Tubo#10 40 °C, 80 mM NaPi pH 7,5, 20 mM HCHO/20 mM glicina
[0752] Amostra 20 L44897-75 Tubo#11 40 °C, 80 mM NaPi pH 7,5, 40 mM HCHO/40 mM glicina
[0753] As seguintes 8 amostras foram reagidas a 25 °C pelas vezes indicadas em 80 mM NaPi pH 7,0 contendo 78 mM HCHO e 76 mM glicina
[0754] Amostra 21 L44897-101 (pre-modificação) TxA tempo de controle zero amostra de controle, não modificada ou exposta a HCHO/glicina
[0755] Amostra 22 L44897-101, 2 hr
[0756] Amostra 23 L44897-101, 4 hr
[0757] Amostra 24 L44897-101, 6 hr
[0758] Amostra 25 L44897 102, 24 hr
[0759] Amostra 26 L44897-103, 51 hr
[0760] Amostra 27 L44897-104, 74 hr
[0761] Amostra 28 L44897-105, 120 hr
[0762] Amostra 29 (L44980-004) foi a toxina mutante A modificada por EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) (toxina mutante tripla A (SEQ ID NO: 4)- EDC). As condições de reação são: 25 °C, tampão foi 20 mM MES/150 mM NaCl pH 6,6. Toxina mutante tripla A (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS = 1:0,5:0,5 w:w:w. Reação iniciada pela adição de EDC. Após 2 horas de reação, glicina adicionada a 0,1 M concentração final e reagida outras 2 horas a 25 C. Reação terminada por dessalinização em Sephadex G25.
[0763] As seguintes 12 amostras e os 2 controles foram experimentos de reversão onde as amostras foram incubadas a 25°C e a 37 °C.
[0764] Reação 1 = 25 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 40 mM HCHO apenas (sem glicina), 24 horas de reação.
[0765] Reação 2 = 25 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 40 mM HCHO/40 mM glicina, 24 horas de reação
[0766] AmostraReação
[0767] 30 Reação #1 Semana 0, 25°C
[0768] 31 Reação #1 Semana 1, 25°C
[0769] 32 Reação #1 Semana 2, 25°C
[0770] 33 Reação #1 Semana 3, 25°C
[0771] 34 Reação #1 Semana 4, 25°C
[0772] 35 Reação #1 Semana 3, 37°C
[0773] 36 Reação #2 Semana 0, 25°C
[0774] 37 Reação #2 Semana 1, 25°C
[0775] 38 Reação #2 Semana 2, 25°C
[0776] 39 Reação #2 Semana 3, 25°C
[0777] 40 Reação #2 Semana 4, 25°C
[0778] 41 Reação #2 Semana 3, 37°C
[0779] 42 TxA Semana de controle 3, 25°C
[0780] 43 TxA Semana de controle 3, 37°C
[0781] As próximas 4 amostras foram geradas por reação para os tempos indicados a 25 °C em 80 mM NaPi pH 7,0, 40 mM HCHO/40 mM glicina
[0782] 44 L44897-116-6 29,5 hrs
[0783] 45 L44897-116-7 57,5 hrs
[0784] 46 L44897-116 -8 79,5 hrs
[0785] 44 L44897-116-6 29,5 hrs 45 L44897-116-7 57,5 hrs 46 L44897-116 -8 79,5 hrs 47 L44897-116-9 123,5 hrs
[0786] Amostra 48 L44897-139 48 hrs reação a 25 °C, 80 mM NaPi pH 7,0, 40 mM HCHO/ 40 mM glicina.
[0787] Amostra 49 L44166-204 EDC/NHS modificação de uma toxina mutante A (SEQ ID NO: 4). 25 C, tampão 1 x PBS pH7,0. Toxina mutante A (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS = 1:0,5:0,5 w:w:w. 2 horas reação com EDC/NHS, então 1 M glicina adicionada a 0,1 M concentração final e outras 2 horas de reação. Tampão trocado por Sephadex G25 em 20 mM L-histidina/100 mM NaCl pH 6,5. Tabela 34
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Condições de reação de ligação em cruz químicas para as amostras de uma toxina mutante B referenciada na Tabela 34
[0788] A toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) foi ligada em cruz quimicamente e testada de acordo com as seguintes condições de reação. As amostras L44905-86 foram testadas em um experiment envolvendo três variações de reação de formalina e duas temperaturas de incubação. Cada dia, 6 amostras foram tomadas para um total de 18 amostras. A primeria amostra na lista é o controle não trtado (que torna 19 amostras totais). O controle não tratado incluiu um polipeptídeo de toxina mutante tripla B não tratado (SEQ ID NO: 6).
[0789] Reação1 (“Rxn1”) = 80 mM HCHO, 80 mM glicina, 80mM NaPO4 pH 7, 1mg/mL Toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) Proteína
[0790] Reação2 (“Rxn2”) = 80 mM HCHO, sem glicina, 80mM NaPO4 pH 7, 1mg/mL Toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) Proteína
[0791] Reação3 (“Rxn3”) = 80 mM HCHO, sem glicina, 80mM NaPO4 pH 7, 1mg/mL Toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) Proteína + capa de Cianoboroidreto. A capa de cianoboroidreto envolvendo 80mM CNBrH4 adicionada para dessalinizar a reação final e incubada 24 hr a 36oC.
[0792] Para a amostra L34346-30A 0,5g EDC e NHS por grama de toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6), 4 horas a 30°C, em 20 mM MES, 150mM NaCl, pH 6,5.
[0793] Para a amostra L34346-30B 0,5g EDC e NHS por grama de toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6), 2 horas a 30°C seguida pela adição de glicina (concentração final de g/L) e incubada outras 2 horas a 30°C, em 20 mM MES, 150mM NaCl, pH 6,5. A única diferença entre as duas reações para L34346-30A e L34346-30B é a adição de glicina na reação L34346-30B.
EXEMPLO 37: ANTICORPOS INDUZIDOS POR COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS SÃO CAPAZES DE NEUTRALIZAR AS TOXINAS DE VÁRIAS CEPAS DE C. DIFFICILE
[0794] Para avaliar se os anticorpos induzidos por composições imunogênicas incluindo as substâncias de droga de toxina mutante podem neutralizar um amplo espectro de diversas sequências de toxina, as cepas representando ribotipos diversos e toxinotipos forma sequenciadas para identificar a extensão da diversidade genética entre as várias cepas comparado as substâncias de droga de toxina mutante. A cultura de sobrenadantes contendo toxinas secretadas de várias cepas foram então testadas em um ensaio de neutralização in vitro usando soro de ramisters imunizados para determinar a cobertura da composição imunogênica e determinar a capacidade da composição imunogênica de proteger contra as toxinas diversas das cepas clínicas circulantes.
[0795] Ambas as células HT-29 (linha de célula de carcinoma de cólon) e as células IMR-90 foram usadas para testar a neutralização das toxinas expressas a partir das cepas CDC. As células HT-29 são mais sensíveis ao TcdA; o EC50 do TcdA purificado nestas células é 100 pg/mL quando comparado a 3,3 ng/mL para TcdB. Por outro lado as células IMR-90 são mais sensíveis ao TcdB; o EC50 do TcdB purificado nestas células varia entre 9-30 pg/mL quando comparado a 0,92-1,5 ng/mL para TcdA. A especificidade do ensaio para ambos TcdA e TcdB nestas linhas de células foi confirmada usando ambos anticorpos específicos de toxina monoclonal e policlonal. Para a normalização do ensaio, os filtrados da cultura de 24 CDC isolados foram testadas em uma concentração quatro vezes seu valor EC50 respectivo. Três das cepas tiveram níveis de toxina que foram muito baixo para o teste no ensaio de neutralização.
[0796] Vinte e quatro cepas representando toxinotipos/ribotipos diversos cobrindo mais do que 95% das cepas circulantes de C. difficile nos USA e no Canada foram obtidos a partir de CDC. Entre estes isolados estavam cepas representando os ribotipos 027, 001 e 078, três cepas epidêmicas de CDAD nos Estados Unidos, Canada e UK. As cepas 2004013 e 2004118 representaram o ribotipo 027; as cepas 2004111 representaram o ribotipo 001 e as cepas 2005088, 2005325 e 2007816 representaram o ribotipo 078. Para identificar a extensão da diversidade genética entre os isolados clínicos causando a doença e as 630 cepas, os genes de toxina (tcdA e tcdB) destas cepas clínicas foram completamente sequenciados. Veja a Tabela 35. As sequências de aminoácido das toxinas foram alinhadas usando ClustalW no programa Megalign™ (DNASTAR® Lasergene®) e analisado para a identidade de sequência. Para tcdA, as análises de alinhamento genômico mostraram que todos os isolados clínicos e as cepas 630 compartilharam no todo cerca de 98-100% de identidade da sequência de aminoácido. A parte C- terminal do gene tcdA foi um pouco mais divergente. A mesma análise foi realizada para o gene tcdB que exibiu maior divergência na sequência. Notavelmente as cepas 2007838/NAP7/126 e 2007858/NAP1/unk5 exibiram os padrões mais divergentes das cepas 630 cepas nos domínios N-terminal (79-100%) e no C-terminal (88-100%; dados não mostrados).
[0797] Um poço com soro de ramister (HS) foi coletado a partir de ramisters dourados Syrian que foram imunizados com um imunogênio incluindo o TcdA mutante (SEQ ID NO: 4) e o TcdB mutante (SEQ ID NO: 6), sendo que as toxinas mutantes foram inativadas com EDC, de acordo com, por exemplo, o Exemplo 29, Tabela 15, descrito acima, e formulado com fosfato de alumínio. Os resultados na Tabela 35 mostram que pelo menos a toxina B dos respectivos sobrenadantes de cultura foram neutralizados, em um ensaio de neutralização in vitro, por soro a partir de ramisters imunizados. Tabela 35. Descrição das cepas de C. difficile a partir de CDC e a capacidade do soro de ramister immune para neutralizar várias toxinas
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Os níveis de toxina foram muito baixos para realizar o ensaio de neutralização.
[0798] Figura 23 retrata os resultados do ensaio de neutralização usando as preparações de toxina de várias cepas de C. difficile nas células IMR-90. Os dados mostram que os anticorpos de neutralização TcdB no antissoro de ramister foram capazes de neutralizar as toxinas de 21 isolados testados, incluindo as cepas hipervirulentas e as cepas de TcdA-negativo, TcdB-positivo. Pelo menos 16 cepas diferentes de C. difficile foram obtidas a partir de CDC (Atlanta, GA) (anteriormente descrito) e foram culturadas em um meio de cultura de C. difficile sob condições compatíveis como conhecido na arte e como descrito acima. Os sobrenadantes da cultura contendo as toxinas secretadas foram analisados para determiner sua citotoxicidade (EC50) nas monocamadas IMR-90 e subsequentemente testados em um ensaio de neutralização padrão in vitro em 4 vezes o EC50 usando várias diluições do soro de ramisters imunizados com a substância de droga toxina mutante A e substância de droga de toxina mutante B, formulada com fosfato de alumínio fosfato de alumínio. A toxina crua obtida a partir dos sobrenadantes de cultura de cada cepa e a toxina purificada (toxina comercial obtida a partir da List Biologicals) (não purificada dos respectivos sobrenadantes) foram testadas para citotoxicidade para as células IMR-90 usando o ensaio de citotoxicidade in vitro descrito acima.
[0799] Nas figuras 23A-K, os gráficos mostram os resultados dos testes de citotoxicidade in vitro (anteriormente descrito) em que os níveis de ATP (RLUs) são plotados contra as concentrações elevadas de: meio de cultura de C. difficile e o poço de soro de ramister (■); a toxina crua e o poço de soro de ramister (•); a toxina purificada e o poço de soro de ramister (A); um controle de toxina crua (▼); e um controle de toxina purificada (♦). As toxinas a partir das respectrivas cepas foram adicionadas as células nos valores 4xEC50.
[0800] Como mostrado na Figuras 23A-K, os ramisters que receberam o imunogênio descrito surpreendentemente desenvolveram anticorpos de neutralização que exibiram uma atividade de neutralização contra as toxinas a partir de pelo menos dos seguintes pelo menos 16 cepas diferentes CDC de C. difficile, em comparação a um controle apenas da respectiva toxina: 2007886 (Figura 23A); 2006017 (Figura 23B); 2007070 (Figura 23C); 2007302 (Figura 23D); 2007838 (Figura 23E); 2007886 (Figura 23F); 2009292 (Figura 23G); 2004013 (Figura 23H); 2009141 (Figura 23I); 2005022 (Figura 23J); 2006376 (Figura 23K). Veja também a Tabela 35 para as cepas adicionais de C. difficile a partir das cepas das quais as toxinas foram testadas e foram neutralizadas pela composição imunogênica incluindo substância de droga de toxina mutante A drug e a substância de droga de toxina mutante B, formulada em um fosfato e alumínio.
[0801] Em outro estudo, os sobrenadantes de cultura contendo toxinas secretadas de várias cepas de C. difficile (obtidas a partir de CDC e do Leeds Hospital, UK) foram testadas em um ensaio de neutralização in vitro usando soro de ramisters que foram administrados com a substância de droga de toxina mutante A e a substância de droga de toxina mutante B, formulada com Alhidrogel. Veja aTabela 36 para o projeto experimental. Os resultados são mostrados na Tabela 37 e na Tabela 38.
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EXEMPLO 38: MAPEAMENTO DE PEPTÍDEO DAS TOXINAS MUTANTES TRIPLAS EDC/NHS
[0802] Para caracterizar as toxinas mutantes triplas inativadas por EDC/NHS, os experimentos de mapeamento de toxina foram realizados em quarto lotes de toxina mutante tripla A tratada com EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) e quatro lotes de mutante tripla B tratada com EDC/NHS (SEQ ID NO: 6). Após a digestão das toxinas mutantes com tripsina, os fragmentos de peptídeo resultantes foram separados usando uma fase reversa HPLC. A análise spectral de massa foi usada para identificar as modificações que ocorrem como um resultado de um processo de inativação. Para ambas a substância de droga de toxina mutante A e a substância de droga de toxina mutante B, maior do que 95% dos peptídeos trípticos teóricos foram identificados. Os adutos de ligação cruzada e glicina (glicina foi usada como um agente de tamponamento) foram identificados. Em ambas as substâncias de droga de toxina mutante A e as substâncias de droga de toxina mutante B, os adutos de beta-alanina foram observados. Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os adutos de beta- alanina parecem resultar de uma reação de três moles de NHS com um mole de EDC que forma a beta-alanina ativada por NHS. Esta molécula pode então reagir com os grupos de lisina para formar adutos de beta-alanina (+70 Da). Nas amostras de toxina mutante tripla B tratada com EDC/NHS, níveis baixos (0,07 moles/mole de proteína) de deidroalanina (-34 Da) também foram observados. A deidroalanina é um resultado de uma dessulfonação de um resíduo de cisteína. O mesmo tipo e o memo grau de modificação foi observado em todos os quatro lotes de cada toxina mutante, indicando que o processo produz um produto consistente. O mapeamento do peptídeo (de mais de 95% de cobertura de sequência) confirma que as modificações estão presentes. Um sumário das modificações é mostrado na Tabela 39. Veja também as Figuras 24-25. Além disso, o tamanho e a carga de heterogeneidade da substância de droga de toxina mutante tripla A e a substância de droga de toxina mutante tripla B aumentou, quando comparado ao tamnho e a carga de heterogeneidade da respectiva toxina mutante tripla A e a toxina mutante tripla B na ausência de inativação química. Como resultado, os perfis da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e da cromatografia de troca de ânion (AEX) tiveram amplos picos relativamente (dados não mostrados). Tabela 39. Sumário das modificações observadas nas substâncias de droga de toxina mutante
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O grau de modificação é ca culado dividindo a área HPLC do peptídeo modificado pela área HPLC do native + peptídeo modificado.
EXEMPLO 39: PRODUÇÃO DE PRODUTO DE DROGA
[0803] A composição imunogênica de C. difficile (produto de droga) contém dois ingredientes farmacêuticos ativos (substância de droga de toxina mutante A e a substância de droga de toxina mutante B):D. Um produto de droga exemplar é uma formulação liofilizada contendo 10 mM Tris tampão pH 7,4, 4,5% (w/w) diidrato de trealose, e 0,01% (w/v) polisorbato 80, incluindo cada uma das substâncias de droga de toxina mutante A e da substância de droga de toxina mutante B. Veja na Tabela 40. A composição imunogênica é preparada por injeção resuspendendo a vacina liofilizada tanto com o diluente quanto com o diluente contendo Alhidrogel. O placebo incluirá uma solução salina estéril normal para injeção (0,9% cloreto de sódio). TABELA 40
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PREPARAÇÃO DO TAMPÃO
[0804] A água para injeção (WFI) é adicionada a um misturador. Enquanto mistura, os excipientes são adicionados e dissolvidos na solução. O pH é medido. Se requerido, o pH é ajustado para 7,4 ± 0,1 com HCl. A solução é diluída ao peso final com WFI então filtrada usando um filtro de 0,22 μm Millipore Express SHC XL150. Uma amostra de redução de materiais biológicos de pre-filtragem é tomada antes da filtragem. O tampão filtrado é amostrado para osmolaridade e Ph.
PREPARAÇÃO DA FORMULAÇÃO
[0805] As substâncias de droga de toxina mutante descongeladas são agrupadas no reservatório de formulação com base nas quantidades precalculadas na seguinte ordem de operação: 50% do volume de tampão de diluição alvo para alcançar 0,6 mg/mL é adicionado ao primerio reservatório, seguido pela adição de uma substância de droga de toxina mutante A e misturada por 5 minutos a 100 rpm. A substância de droga de toxina mutante B é então adicionada ao reservatório e a solução é ainda diluída a 0,6 mg/mL ponto de diluição e então misturada por outros 5 minutos a 100 rpm. A amostra é removida e testada para a concentração total de toxina mutante. A solução é diluída para um volume de 100 porcento com base no valor da concentração de toxina mutante em processo então misturado por 15 minutos a 100 rpm. O produto de droga formulado é amostrado para o pH e a prefiltragem de materiais biológicos. O produto de droga formulado é então filtrado usando um Millipore Express SHC XL150 para o armazenamento durante a noite, ou trazido para a linha de preenchimento para a filtragem estéril.
[0806] O volume formulado é trazido para a área de preenchimento, amostrado para materiais biológicos, e então filtrado estéril com dois filtros em série Millipore Express SHC XL150. O volume formulado é preenchido em frascos de vidro depirogenados em um volume de preenchimento alvo de 0,73 mL. Os frascos preenchidos são parcilamente parados e então carregados para o liofilizador. O ciclo de liofilização é executado como mostrado na Tabela 41. Quando completado o ciclo, a cÂmara de liofilização é preenchida de volta com nitrogênio a 0,8 atm e então os paradores são posicionados por completo. A câmara é descarregada e os frascos são tampados usando seladores de tampa de fechamento. Tabela 41. Pontos de ajuste no ciclo de liofilização do produto de droga de C. difficile
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[0807] Os dados de estabilidade de produto de droga são sumarizados na Tabela 42. Os dados sugerem que o produto de droga seja fisicamente e quimicamente estáveis durante o armazenamento a 28°C por pelo menos 3 meses ou pelo menos 1 mês a 25° ou 40°C. sob ambas condições de armazenamento, o nível de impurezas detectado pela cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) não mudou, nem foram mudanças na antigenicidade in vitro através dos últimos pontos de tempo testados. Tabela 42: Estabilidade do produtoa de droga liofilizado
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a O DP liofilizado é reconstituído com 60 mM NaCl de diluente para estes testes.
EXEMPLO 40: DILUENTES DA VACINA
[0808] Para a salina, 60 mM NaCl é usada como um diluente para o produto de droga liofilizado sem nenhum adjuvante para assegurar uma solução isotônica após a reconstituição.
[0809] Alhidrogel: Alhidrogel “85” 2% (Brenntag) é um produto de grau comercialmente disponível Good Manufacturing Practice (GMP) composto de folhas octahedral criatalinas de hidróxido de alumínio. Uma formulação de diluente Alhidrogel exemplar é mostrada na Tabela 43. A formulação exemplar pode ser usada em combinaçaõ com o produto de droga descrito acima.
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[0810] Os estudos com o adjuvante Alhidrogel mostram 100% de ligação de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B a 1 mg Al/mL Alhidrogel a partir do pH 6,0 a 7,5. A ligação máxima de ambas as substâncias de droga foi vista na maior concentração de proteína testada (300 μg/mL cada).
[0811] A ligação das proteínas ao Alhidrogel também foi testada com a formulação de produto de droga liofilizada contendo 200 μg/mL de cada substância de droga e Alhidrogel variadno de 0,25 a 1,5 mg/ml. O produto de droga foi reconstituído com diluentes contendo as concentrações variantes de Alhidrogel e o percentual de cada toxina mutante ligada foi medido. Todas as concentrações medidas de Alhidrogel demonstraram 100% de ligação dos antígenos.
[0812] As cinéticas de ligação das proteínas ao Alhidrogel na dose almejada de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B (200 μg/mL cada) também foram avaliadas. Os resultados mostram que 100% das substâncias de droga de toxina mutante foram ligadas ao Alhidrogel ao longo de um curso de tempo de 24 horas a RT.
[0813] CpG 24555 e Alhidrogel: CpG 24555 é um oligodeoxinucleotídeo 21-mer sintético (ODN) tendo uma sequência de mutação 5-TCG TCG TTTTTC GGT GCT TTT-3 (SEQ ID NO: 48). Uma formulação exemplar para uma combinação de CpG 24555 e diluentes Alhidrogel é mostrada na Tabela 44. A formulação exemplar pode ser usada em combinação com o produto de droga descrito acima.
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[0814] ISCOMATRIX®: o adjuvante ISCOMATRIX® é um adjuvante a base de saponina conhecido na arte. Uma formulação exemplar para a formulação de adjuvante ISCOMATRIX® é mostrada na Tabela 45. A formulação exemplar pode ser usda em combinação com o produto de droga descrito acima.
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EXEMPLO 41: IMUNOGEN CIDADE DE COMPOSIÇÕES DE SUBSTÂNCIA DE DROGA DE TOXINA MUTANTE ADJUVANTADA COM ALHIDROGEL EM UM MODELO NHP E COMPROVAÇÃO PRÉ- CLÍNICA DE CONCEITO
[0815] A imunogenicidade das composições de uma substância de droga de toxina mutante A e de uma substância de droga de toxina mutante B adjuvantadas com Alhidrogel em NHPs foi avaliada, especificamente em macacos cinomolgos. Os NHPs imunizados em intervalos de duas semanas (semanas 0, 2, 4) com 10μg de cada uma das composições da substância de droga de toxina mutante A e da substância de droga de toxina mutante B (formuladas com Alhidrogel) por dose, desenvolveram respostas antitoxina de neutralização robustas. Veja Tabela 46. Ambas as respostas de neutralização antitoxina A e antitoxina B alcançaram uma media de proteção apóa a Terceira imunização e permaneceram dentro ou acima da média de proteção pelo menos até a semana 33 (último período de tempo estudado).
[0816] Os macacos cinomolgos (n=8) forma imunizados IM nas semanas 0, 2 e 4 com 10 μg cada de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B formulada em 250 μg de Alhidrogel. O soro foi coletado em cada ponto de tempo e analisado no ensaio de neutralização de toxina para a atividade antitoxina funcional. Os GMTs são proporcionados na Tabela 46. A media de título de proteção proprocionada na tabela retrata a media de título de anticorpo de neutralização que correlaciona a uma redução significante na recorrência de infecção por C. difficile no julgamento da terapia de anticorpo monoclonal da Merck.
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CORRELAÇÃO DE TÍTULOS DE ANTICORPO DE PROTEÇÃO HUMANO DO JULGAMENTO DE TERAPIA DE MAB DA MERCK PARA OS TÍTULOS INDUZIDOS PELOS CANDIDATOS A VACINA DA PFIZER EM NHPS
[0817] O estudo de eficácia da fase 2 com mAbs da Merck/Medarex (Lowy et al., N Engl J Med. 21 de janeiro de 2010; 362(3):197-205) pareceu demonstrar uma correlação entre o nível de mAbs antitoxina de neutralização no soro e a prevenção de recorrência de CDAD. Após a administração de mAbs específicos de toxina a humanos, os níveis de anticorpo no soro em humanos recipientes na faixa de 10 a 100 μg/mL parece proteger contra as recorrências (70% de redução na recorrência de CDAD).
[0818] As composições imunogênicas incluindo as substâncias de droga de toxina mutante foram testadas para medir se as composições imunogênicas são capazes de induzir respostas de anticorpo de neutralização potencialmente eficazes em humanos comparando os dados publicados a partir do estudo da fase 2 da Merck/Medarex para os níveis de anticorpo induzido pelas composições imunogênicas no modelo NHP. Isto foi realizado utilizando características publicadas anteriormente dos mAbs da Merck/Medarex para converter a media destes mAbs no soro obtido a partir dos sujeitos que exibiram nenhum sinal de recorrência (10-100 μg/mL) em 50% de títulos de neutralização e comparando estes títulos (“média de título de proteção”) para os títulos observados nos modelos pre-clínicos descritos aqui. Como mostrado na Tabela 46, as composições imunogênicas incluihndo a substância de droga de toxina mutante A e a substância de droga de toxina mutante B adjuvantada com Alhidrogel geraram respostas imunes em NHPs que alcançaram a “média de proteção” após a terceira dose e tem permanecido dentro ou acima desta média até a semana 33. O nível de anticorpos de neutralização de toxina induzidos em NHPs pela composição imunogênica de C. difficile inventiva é comparável aos níveis de anticorpo no soro nos sujeitos julgados pela Merck/Medarex que pareceram estar protegidos da recorrência de CDAD.
EXEMPLO 42: IMUNOGENICIDADE DE COMPOSIÇÕES DE SUBSTÂNCIA DE DROGA DE TOXINA MUTANTE ADJUVANTADA COM ISCOMATRIX OU ALHIDROGEL/CPG 24555 (ALH/CPG) NO MODELO NHP
[0819] Nos NHPs, ambos ISCOMATRIX e Alh/CpG estatisticamente aumentaram significantemente os títulos de neutralização da antitoxina A e B quando comparado a vacina administrada com o Alhidrogel sozinho (Tabela 47). As respostas antitoxina antecedentes acima foram induzidas em pontos de tempo anteriores pela vacina administrada tanto com Alh/CpG quanto com ISCOMATRIX (semana 2-4) quando comparado ao Alhidrogel sozinho (semana 4-6), que pode ter um efeito importante na proteção da recorrência de CDAD em humanos. Comparado ao Alhidrogel, a composição imunogênica adjuvantada com Alh/CpG ou com ISCOMATRIX geraram títulos de neutralização de toxina que alcançaram a média de proteção (veja também Exemplo 41) mais rapidamente e que tem permanecido dentro ou acima desta média até a semana 33.
[0820] Como mostrado na Tabela 47, os Macacos cinomolgos foram imunizados IM nas semanas 0, 2, e 4 com 10 μg cada de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B formulada em 250 μg de Alhidrogel (n=8), ou 500 μg de CpG + 250 μg de Alhidrogel (n=10), ou 45 U de ISCOMATRIX (n=10). O soro foi coletado em cada ponto de tempo e analisado no ensaio de neutralização de toxina descrito acima para a atividade antitoxina funcional. Os GMTs são listados nas tabelas. Os asteriscos (*) indicam significância estatística (p<0,05) quando comparado aos títulos no grupo Alhidrogel. A media de título de proteção representa a média de título de anticorpo de neutralização que correlaciona uma redução significante na recorrência de infecção por C. difficile de acordo com o julgamento de terapia mAb da Merck/Medarex.
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[0821] Uma dose de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B administrada, na presença de adjuvantes ISCOMATRIX ou Alh/CpG, nos títulos de anticorpo antitoxina de neutralização gerados em NHPs também foram avaliados.em um estudo, os NHPs foram administrados em uma dose baixa (10μg) ou uma alta (100μg) de cada substância de droga de toxina mutante formulada em ISCOMATRIX. As respostas foram comparaddas em cada ponto de tempo após a imunização. Como mostrado na Tabela 48, os títulos de antitoxina de neutralização foram robustos em ambos os grupos de tratamento. Os títulos antitoxina A foram quase equivalentes na maioria dos pontos de tempo entre o grupo de dose baixa e o de dose alta, enquanto havia uma tendência para os títulos antitoxina B de serem maiores no grupo de dose alta.
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[0822] Como mostrado na Tabela 48, os Macacos cinomolgos (n=5) foram imunizados IM nas semanas 0, 2, e 4 com 10 μg ou 100 μg cada de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B formulada com 45U de ISCOMATRIX. O soro foi coletado em cada ponto de tempo e analisados no ensaio de neutralização de toxina para a atividade antitoxina funcional. Os GMTs são listados na tabela. A média de título de proteção representa a média de título de anticorpo de neutralização que correlaciona com uma redução significante na recorrência de infecção por C. difficile no julgamento de terapia mAb da Merck/Medarex.
[0823] Em um esforço de aumentar as cinéticas de respostas antitoxina B, os NHPs foram imunizados com uma dose constante de uma substância de droga de toxina mutante A (10 μg) que foi misturada com uma dosed aumentada da substância de droga de toxina mutante B (10, 50, ou 100 μg) na presença de adjuvantes ISCOMATRIX ou Alh/CpG. Em relação aos adjuvants, havia uma tendência para os grupos que receberam doses maiores de uma substância de droga de toxina mutante B (tanto 50 quanto 100 μg) para induzir respostas de neutralização antitoxina B em comparação a 10 μg dose de uma droga de toxina mutante B (Tabela 50, marcada com um * para indicar estatisticamente um aumento significante). Esta tendência foi observada na maioria dos pontos de tempo após a imunização final. Entretanto, em alguns casos, as respostas de neutralização antitoxina A mostraram estatisticamente uma diminuição significante (marcado com um A na Tabela 49) quando a quantidade de uma toxina mutante B foi aumentada.
[0824] Como mostrado na Tabela 49 e na Tabela 50, os NHPs (10 por grupo) foram imunizados IM nas semanas 0, 2, e 4 com diferentes proporções de uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B (10μg de uma substância de droga de toxina mutante A mais tanto 10, 50, ou 100 μg de uma substância de droga de toxina mutante B; projetada 10A:10B, 10A:50B e 10A:100B, respectivamente, na Tabela 49 e Tabela 50), formulada com ISCOMATRIX (45U por dose) ou com Alh/CpG/ (250 μg / 500 μg por dose). A tabela 49 mostra os títulos antitoxina A. A tabela 50 mostra títulos antitoxina B. Os GMTs são listados nas tabelas. A média de título de proteção representa a média de título de anticorpo de neutralização que correlaciona com uma redução significante na recorrência de infecção por C. difficile no julgamento de terapia mAb da Merck. O símbolo A, representa estatisticamente uma diminuição significante nos títulos de neutralização (p<0,05) comparado ao grupo 10A: 10B. o símbolo asterisco *, representa estatisticamente um aumento significante nos títulos de neutralização (p<0,05) comparado ao grupo 10A: 10B.
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Exemplo 43: estudo de toxicidade de cinco semanas dose repetida IM com uma composição imunogênica em macacos cinomolgos, com um período de recuperação de 4 semanas
[0825] O estudo de toxicidade de 5 semanas IM de dose repetida com PF-06425095 (uma composição imunogênica incluindo uma substâncis de droga de toxina mutante tripla A e uma substância de droga de toxina mutante tripla B em uma combinação com adjuvantes de hidróxido de alumínio e CpG 24555) em macacos cinomolgos foi conduzido para avaliar a toxicidade potencial e a imunogenicidade da suabtância de droga de toxina mutante tripla A e a substância de droga de toxina mutante tripla B de C. difficile em combinação com os adjuvantes de hidróxido de alumínio e CpG 24555 (PF-06425095). O PF-06425095 a 0,2 ou 0,4 mg/dose de substância de droga de toxina mutante tripla A e de substância de droga de toxina mutante tripla B (grupos de composição imunogênica de dose alta e baixa, respectivamente), 0,5 mg de alumínio como hidróxido de alumínio, e 1 mg CpG 24555 e a combinação de adjuvante sozinho (hidróxido de alumínio + CpG 24555; PF-06376915) foram administrados IM aos macacos cinomolgos (6/sex/grupo) como uma primeira dose seguida por 3 doses de reforço (Dias 1, 8, 22, e 36). Um grupo separado de animais (6/sex) recebeu 0,9% de salina isotônica em um pH aproximado de 7,0. O veículo de composição imunogênica foi composto de 10 mM Tris tampão ao pH 7,4, 4,5% diidrato de trealose, e 0,1% polisorbato 80. O veículo de controle de adjuvante foi composto de 10 mM tampão de histidina com 60 nM NaCl ao pH 6,5. O volume de dose total foi de 0,5 mL por injeção. Todas as doses foram administradas nos músculos dos quadríceps esquerdo e/ou direito. Os animais selecionados se submeteram a um período de observação de 4 semanas livre de dose para avaliar a reversibilidade de qualquer efeito observado durante a fase de dosagem do estudo.
[0826] Não houve descobertas adversas neste estudo. O PF-06425095 foi bem tolerado e produziu apenas uma reação inflamatória local sem evidência de toxicidade sistêmica. Durante a fase de dosagem, a dose dependente aumentou a partir do pre-teste em fibrinogênio (23,1% a 2,3x) nos Dias 4 e 38 e proteína reativa C nos Dias 4 (2,1x a 27,5x) e 38 (2,3x a 101,5x), e globulina (11,1% a 24,1%) no dia 36 e/ou 38, foram vistos nos grupos tratados pela composição imunogênica e foram consistentes com a resposta inflamatória esperada para a administração de uma composição imunogênica adjuvantada.
[0827] O aumento no fibrinogênio e na proteína reativa C notada no dia 4 tiveram recuperado parcialmente pelo dia 8 com o aumento no fibrinogênio (25,6% a 65,5%) e a proteína reativa C (4,5x e 5,6x) no grupo de composição imunogênica de dose alta apenas. O aumento na interleucina (IL)-6 foi observado nos grupos de composição imunogênica de dose alta e baixa no dia 1, Hora 3 (8,3x a 127,2x valores individuais dia 1, Hora 0, dose responsiva) e Dia 36, Hora 3 (9,4x a 39,5x valores individuais dia 36, Hora 0). Não houve mudança observada nas outras citocinas (IL-10, IL-12, Interferon- proteína induzível (IP-10), e fator de necrose de tumor α (TNF-α). O aumento nestas proteínas de fase agura e na citocina foram parte da resposta fisiológica normal esperada pra a administração de um antígeno estranho. Não houve alterações relacionadas ao adjuvante ou relacionadas ao PF 06425095 nestes parametros patológicos clínicos na fase de recuperação (citocinas não foram avaliadas durante a fase de recuperação). Além disso, houveram mudanças localizadas nos locais de injeção, que foram de incidência similar e gravidade no grupo de controle de adjuvante e os grupos de composição imunogênica de alta e baixa; por isso, não foram relacionados diretamente ao PF-06425095. Durante a fase de dosagem, as mudanças incluíram uma inflamação ativa crônica mínima a moderada que foi caracterizada pela separação das fibras dos músculos por infiltração de macrófagos, que geralmente continham material granular basofílico (interpretado como adjuvante contendo alumínio), linfócitos, células de plasma, neutrófilos, eosinófilos, restos necróticos, e edema. O material granular basofílico também esteve presente extracelularmente dentro destes focos de inflamação aticos crônicos. No final da fase de recuperação, havia uma inflamação cronica minima a moderada e infiltrato cellular mononuclear, e fibrose mínima. Estas descobertas de locais de injeção representam uma resposta inflamatória local para o adjuvante. Outras mudanças microscópicas incluem uma celularidade linfóide aumentada de mínimo a moderado no nó de linfa ilíaco (drenagem) e celularidade aumentada mínima nos centros germinais no baço que não foram durante a fase de dosagem no grupo de controle de adjuvante e nos grupos de composição imunogênica de alta e baixa dose. Ao final da fase de recuperação, estas descobertas microscópicas foram de menor gravidade. Estes efeitos representam uma resposta imunogênica a estimulação antigênica, e foi uma resposta farmacológica ao adjuvante ou PF-06425095. Não houve um aumento relacionado ao artigo teste nos anticorpos anti-DNA.
[0828] Com base na ausência de descobertas adversas, a não observação de um nível de efeitos adversos neste estudo é o grupo de composição imunogênica de alta dose (0,4 mg de substância de droga de toxina mutante tripla A e a substância de droga de toxina mutante tripla B/dose como PF-06425095) administrada como duas injeções de 0,5 mL para quatro doses.
EXEMPLO 44: EFICÁCIA DO SORO NHP SOROPOSITIVO TRANSFERIDO PASSIVAMENTE PARA RAMISTERS
[0829] Foi administrado aos grupos de 5 ramisters dourados Syrian uma dose oral do antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para romper a flolra intestinal normal. Após cinco dias, os ramisters foram desafiados com uma dose oral de esporos de C. difficile do tipo selvagem (630 cepas, 100 cfu por animal), e administrados intraperitonealmente (IP) com soro NHP de acordo com a Tabela 51. Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os sintomas da doença seguindo o desafio com os esporos tipicamente se manifestaram começando cerca de 30-48 horas após o desafio.
[0830] O soro NHP que foi administrado aos ramisters foi agrupado a partir de amostras de soro NHP exibindo o maior título (soro antitoxina A e soro antitoxina B) seguido por três imunizações com uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B (proporções de 10:10, 10:50, e 10:100 A:B), formulada com ISCOMATRIX (veja o Exemplo 42, Tabela 49, e Tabela 50). O soro NHP foi coletado a partir dos pontos de tempo nas semanas 5, 6, e 8 (as imunizações ocorreram nas semanas 0, 2, e 4), como descrito em Examine 42. Os resultados são mostrados nas Tabelas 52-54 abaixo. O símbolo “+” indica um meio geométrico (GM) em () que não inclui o animal #3, não respondedor. “*TB” representa o sangramento terminal, o dia em que o animal foi sacrificado, que não é o mesmo para todos os animais.
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[0831] Em outro estudo, os ramisters dourados Syrian foram administrados com uma dose de antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para romper a flora intestinal normal. Após cinco dias, os ramisters foram desafiados com uma dose oral de esporos de C. difficile do tipo selvagem (630 cepas, 100 cfu por animal), e administrados intraperitonealmente (IP) o soro NHP de acordo com a Tabela 55. Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os sintomas da doença seguindo o desafio dos esporos tipicamente se manifestaram começando cerca de 30-48 horas pos-desafio.
[0832] O soro NHP que foi administrado aos ramisters foi agrupado a partir de amostras coletadas de NHP seguido por três imunizações com uma substância de droga de toxina mutante A e uma substância de droga de toxina mutante B (proporções de 10:10, 10:50, e 10:100 A:B), formulada com Alhidrogel e CpG 24555 (veja Exemplo 42, Tabela 49, e Tabela 50). O soro NHP foi coletado a partir dos pontos de tempo nas semanas 5, 6, 8 e 12 como descrito em Examine 42. Os resultados são mostrados nas Tabelas 56-59 abaixo. O soro dos ramisters foi ainda investigado para determinar o valor de concentração inibitório (IC50), que foi determinado usando o ensaio de neutralização ode toxina descrito acima. O nível anticorpo de neutralização de toxina induzido em ramisters pela composição imunogênica de C. difficile inventiva é comparável aos níveis de anticorpo no soro no julgamento dos sujeitos pela Merck/Medarex que pareceram estar protegidos da recorrência de CDAD. Tabela 55: projeto experimental
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EXEMPLO 45: CARACTERIZAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS DE DROGA DE TOXINA MUTANTE
[0833] A estrutura primária da toxina mutante tripla A é mostrada na SEQ ID NO: 4. O resíduo NH2-terminal Met na posição 1 da SEQ ID NO: 4 é originado do códon de iniciação da SEQ ID NO: 12 e é ausente na proteína isolada (por exemplo, veja SEQ ID NO: 84). Portanto, do Exemplo 12 ao Exemplo 45, “SEQ ID NO: 4” refere-se a SEQ ID NO: 4 onde a metionina inicial (na posição 1) é ausente. Ambas toxinas mutante tripla A purificadas (SEQ ID NO: 4) (substância de droga intermediária - Lot L44993-132) e toxina mutante tripla A tratada com EDC/NHS (SEQ ID NO: 4)(“substância de droga de toxina mutante A” - Lot L44898-012) exibiu uma sequência única NH2- terminal iniciando em SLISKEELIKLAYSI (posições 2-16 a SEQ ID NO: 4).
[0834] A estrutura primária da toxina mutante tripla B é mostrada na SEQ ID NO: 6. O resíduo NH2-terminal Met na posição 1 da SEQ ID NO: 6 é originado do códon de iniciação e é ausente na proteína isolada (por exemplo, veja SEQ ID NO: 86). Portanto, do Exemplo 12 ao Exemplo 45, “SEQ ID NO: 6” refere-se a SEQ ID NO: 6 onde a metionina inicial na posição 1) é ausente. Ambas toxinas mutante tripla B purificadas (SEQ ID NO: 6) (substância de droga intermediária - Lot 010) e toxina mutante tripla B tratada com EDC/NHS (SEQ ID NO: 6) (“substância de droga de toxina mutante B” - Lot L44906-153) exibiu uma sequência única NH2-terminal iniciando em SLVNRKQLEKMANVR (posições 2-16 da SEQ ID NO: 6).
[0835] A espectroscopia de dicroísmo cirlular (CD), foi usada para avaliar a estrutura secundária e terciária da substância de droga toxina mutante A e a mutante tripla A (SEQ ID NO: 4). A espectroscopia CD também foi usada para avaliar a estrutura secundária e terciária da toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) e da substância de droga de toxina mutante B. a espectroscopia também foi usada para avaliar os efeitos potenciais do pH na estrutura. O efeito do tratamento EDC na toxina mutante tripla A foi analisdo comparando os dados CD obtidos pra a substância de droga de toxina mutante A com os dados obtidos para a toxina mutante tripla A. o efeito do tratamento EDC na toxina mutante tripla B (SEQ ID NO: 6) foi analisdo comparando os dados CD obtidos para a substância de droga de toxina mutante B com os dados obtidos para a toxina mutante tripla B.
[0836] Os dados de CD UV-longe substância de droga de toxina mutante A foram obtidos em vários pH. O espectro gravado no pH 5,07,0 é indicative de alta proporção de a-hélices na segunda estrutrura, sugerindo que a espinha do polipeptídeo da proteína adota uma conformação bem definida dominada pelas a-hélices.
[0837] O espectro CD UV-perto da substância de droga de toxina mutante A também foram obtidos. Uma elipticidade negativa forte entre 260 e 300 nm é uma indicação de que as cadeias laterais aromáticas estão em um único ambiente rígido, isto é, a substância de droga de toxina mutante A possui uma estrutura terciária. Na verdade, os aspectos da característica aparecendo dos tipos individuais de cadeias laterais aromáticas podem ser distinguidos dentro do espectro: ombro a ~290 nm e o pico negative maior a ~283 nm são devido a absorção da luz polarizada pelas cadeias laterais de triptofano ordenadas, o pico negativo a 276 nm é da cadeias laterais de tirosina, e os ombros menores a 262 e 268 nm são indicativos de resíduos de fenilalanina participantes dos contatos terciários. Os resultados de longe- e perto-UV proprocionam evidências de que a substância de droga de toxina mutante A retém compactamente uma estrutura dobrada no pH fisiológico. Quase idêntico o espectro CD longe- e perto-UV observado no pH 5,0 - 7,0 indicou que nenhuma mudança estrutural detectável aconteceu dentro desta faixa de pH. Os dados CD não puderam ser coletados no pH 3,0 e 4,0, uma vez que a proteína foi insolúvel nestes pontos de pH. Na comparação do espectro CD longe- e perto-UV da substância de droga de toxina mutante A com aqueles da toxina mutante tripla A, o espectro de ambas as proteínas são essencialmente idênticos sob todas as condições experimentais estudadas, indicando que o tratamento EDC não tinha efeitos detectáveis na estrutura secundária e terciária da toxina mutante tripla A. esta descoberta está de acordo com a filtragem de gel e os redultados analíticos de ultracentrifugação, que mostram nenhuma mudança no raio Stokes e coeficientes de sedimentação/fricção, respectivamente.
[0838] A substância de droga de toxina mutante A (assim como a toxina mutante tripla A) contém 25 resíduos de triptofano que estão separados por toda a sequência primária e podem servir como sondas fluorescentes intrínsecas convenientes. O espectro de emissão fluorescente de uma substância de droga de toxina mutante A entre 300 e 400 nm como uma função de temperatura foram obtidos. A 6,8°C a substância de droga de toxina mutante A mostra características de espectro de emissão fluorescente de triptofano após excitação a 280 nm. A emissão fluorescente máxima é observada a ~335 nm, indicando que os resíduos de triptofano estão em um ambiente não polar, típico dos interiores de proteína em vez de ambientes aquosos polares. Os resultados de espectro de emissão fluorescente, junto com os resultados dos experimentos CD apresentados neste relatório, confirmam que a substância de droga de toxina mutante A retém uma estrutura dobrada compacta.
[0839] A fluorescência da sonda extrínseca de ácido sulfônico 8- anilino-1-naftaleno (ANS) foi usada para caracterizar uma possível mudança conformacional na substância de droga de toxina mutante A e na toxina mutante tripla A após as mudanças no pH. Como pode ser visto a partir dos resultados, não há essencialmente um aumento na intensidade de fluorescência ANS tanto quando a substância de droga de toxina mutante A quanto toxina mutante tripla A são tituladas com a sonda no pH 7,0, sugerindo que nenhuma superfície hidrofóbica está exposta nas proteínas sob estas condições. A mudança do pH para 2,6 leva a um aumento dramático no rendimento da quantidade fluorescente de ANS após o aumento da concentração na sonda, até que o rendimento da quantidade fluorescente alcance uma saturação aparente. Este aumento no rendimento da quantidade de fluorescência ANS indica que no pH baixo (2,6), ambas a substância de droga de toxina mutante A e a toxina mutante tripla A se submetem a mudança conformacional induzida por pH que expõe as superfícies hidrofóbicas. Tais mudanças conformacionais indicam que a modificação induzida por EDC e a inativação da toxina mutante tripla A não restringe a plasticidade conformacional da substância de droga de toxina mutante A (DS).
[0840] O efeito do tratamento por EDC nas propriedades hidrodinâmicas da toxina mutante tripla A foi avaliado usando uma cromatografia de exclusão de tamanho em uma colune G4000 SWXL. A substância de droga de toxina mutante A e a toxina mutante tripla A foram injetadas na coluna G4000 SWXL equilibrada ao pH 7,0, 6,0, e 5,0. Os dados indicam que nenhuma diferença no raio de Stoke de uma substância de droga de toxina mutante A e de uma toxina mutante tripla A pode ser detectado usando uma cromatografia de exclusão de tamanho. Portanto, o tratamento com EDC não afetou damaticamente as propriedades hidrodinâmicas e, correspondentemente, o formato da molécula toda da toxina mutante tripla A.
[0841] Outra análise da toxina mutante tripla A e da substância de droga de toxina mutante A foi realizada usando uma técnica de espalhamento de luz a laser multi-ângulo (MALLS). O tratamento da toxina mutante tripla A com EDC resultou na geração de uma mistura heterogênea composta de várias espécies monoméricas e multiméricas. Tal heterogeneidade reflete na introdução de um grande número de ligações covalentes inter e intramoleculares induzidas por EDC entre carboxis e aminas primárias da proteína.
[0842] Os dados obtidos proporcionam características física e química da toxina mutante tripla A e da substância de droga de toxina mutante A (toxina mutante tripla A tratada com EDC) e descreve os aspectos chave de sua estrutura primária, secundária e terciária. Os dados gerados demonstram que o tratamento da toxina mutante tripla A com EDC resultou emu ma modificação covalente de sua cadeia de polipeptídeo, mas não afetou as estruturas secundária e a terciária da proteína. O tratamento com EDC leva a ligação em cruz intra e intermolecular. Os parâmetros bioquímicos e biofísicos obtidos para a substância de droga de toxina mutante A (assim como para a toxina mutante tripla A) são apresentados na Tabela 60.
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[0843] Os dados CD longe-UV da substância de droga de toxina mutante B foram obtidos em vários pH. O espectro gravado no pH 5,07,0 é indicativo da alta proporção de a-hélices na segunda estrutura, sugerindo que a espinha do polipeptídeo da proteína adota uma conformação bem definida dominada pelos a-hélices.
[0844] O espectro CD UV-perto da substância de droga de toxina mutante B também foram obtidos. Uma elipticidade negativa forte entre 260 e 300 nm é uma indicação de que as cadeias laterais aromáticas estão em um único ambiente rígido, isto é, a substância de droga de toxina mutante B possui uma estrutura terciária. Na verdade, os aspectos da característica aparecendo dos tipos individuais de cadeias laterais aromáticas podem ser distinguidos dentro do espectro: ombro a ~290 nm e o pico negative maior a ~283 nm são devido a absorção da luz polarizada pelas cadeias laterais de triptofano ordenadas, o pico negativo a 276 nm é da cadeias laterais de tirosina, e os ombros menores a 262 e 268 nm são indicativos de resíduos de fenilalanina participantes dos contatos terciários. O espectro CD longee perto-UV proprociona evidências de que a substância de droga de toxina mutante B retém compactamente uma estrutura dobrada no pH fisiológico. Muito similar ao espectro CD longe- e perto-UV observado no pH 5,0 - 7,0 indicou que nenhuma mudança estrutural secundária ou terciária detectável aconteceu dentro desta faixa de pH. Os dados CD não puderam ser coletados no pH 3,0 e 4,0, uma vez que a proteína foi insolúvel nestes pontos de pH.
[0845] Comparando o espectro CD longe e perto-UV de uma substância de droga de toxina mutante B com aquelas da toxina mutante tripla B, o espectro de ambas as proteínas é muito similar entre o pH 5,0 e 7,0, indicando que o tratamento com EDC não teve efeitos detectáveis na estrutura secundária e terciária da proteína.
[0846] A toxina mutante tripla B contém 16 resíduos de triptofano que são espalhdas em toda a sequência primária e pode servir como sondas fluorescentes intrínsecas convenientes. O espectro de emissão de fluorescência de uma substância de droga de toxina mutante B entre 300 e 400 nm como uma função de temperatura foram obtidos. A 7°C a substância de droga de toxina mutante B mostra características de espectro de emissão fluorescente de triptofano após a excitação a 280 nm. O máximo de emissão fluorescente é observado a ~335 nm, indicando que os resíduos de triptofano estão em um ambiente não polar, típico de interiores de proteína em vez de ambientes aquosos polares. Este resultado, junto com os resultados de experimentos CD (veja acima), confirmam que a substância de droga de toxina mutante B retém a estrutura dobrada compacta.
[0847] A fluorescência da sonda extrínseca de ácido sulfônico 8- anilino-1-naftaleno (ANS) foi usada para caracterizar uma possível mudança conformacional na substância de droga de toxina mutante B e na toxina mutante tripla B após as mudanças no pH. Como pode ser visto a partir dos resultados, não há essencialmente um aumento na intensidade de fluorescência ANS tanto quando a substância de droga de toxina mutante B quanto a toxina mutante tripla B são tituladas com a sonda no pH 7,0, sugerindo que nenhuma superfície hidrofóbica está exposta nas proteínas sob estas condições. A mudança do pH para 2,6 leva a um aumento dramático no rendimento da quantidade fluorescente de ANS após o aumento da concentração na sonda na presença de uma substância de droga de toxina mutante B, até que o rendimento da quantidade fluorescente alcance uma saturação aparente. Este aumento no rendimento da quantidade de fluorescência ANS indica que em um pH baixo (2,6), a substância de droga de toxina mutante B se submete a mudança conformacional induzida por pH que expõe as superfícies hidrofóbicas. Tais mudanças conformacionais indicam que a modificação induzida por EDC e a inativação da toxina mutante tripla B não restringe a plasticidade conformacional da substância de droga de toxina mutante B (DS).
[0848] O efeito do tratamento por EDC nas propriedades hidrodinâmicas da toxina mutante tripla B foi avaliado usando uma cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna G4000 SWXL. A substância de droga de toxina mutante B e a toxina mutante tripla B foram injetadas na coluna G4000 SWXL equilibrada ao pH 7,0, 6,0, e 5,0. Os dados indicam que nenhuma diferença no raio de Stoke de uma substância de droga de toxina mutante B e de uma toxina mutante tripla B pode ser detectado usando uma cromatografia de exclusão de tamanho, portanto, o tratamento com EDC não afetou damaticamente as propriedades hidrodinâmicas e, correspondentemente, o formato da molécula toda da proteína.
[0849] Outra análise da toxina mutante tripla B e da substância de droga de toxina mutante B foi realizada usando uma técnica de espalhamento de luz a laser multi-ângulo (MALLS). O tratamento da toxina mutante tripla B com EDC resultou na geração de uma mistura heterogênea composta de várias espécies monoméricas e multiméricas. Tal heterogeneidade reflete na introdução de um grande número de ligações covalentes inter e intramoleculares induzidas por EDC entre carboxis e aminas primárias da proteína.
[0850] Os dados obtidos proporcionam características física e química da toxina mutante tripla B e da substância de droga de toxina mutante B (toxina mutante tripla B tratada com EDC) e descreve os aspectos chave de sua estrutura primária, secundária e terciária. Os dados gerados demonstram que o tratamento da toxina mutante tripla B com EDC resultou em uma modificação covalente de sua cadeia de polipeptídeo, mas não afetou as estruturas secundária e a terciária da proteína. O tratamento com EDC leva a ligação em cruz intra e intermolecular. Os parâmetros bioquímicos e biofísicos obtidos para a substância de droga de toxina mutante B (assim como para a toxina mutante tripla B) são apresentados na Tabela 61.
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EXEMPLO 46: PERFUSÃO DE FERMENTAÇÃO PARA O TOXÓIDE B (MUTANTE TRIPLO)
[0851] As culturas de semente Toxóide B (mutante triplo): inocularam cada garrafa de 1L contendo 400 mL de meio com 1 ml semente, incubada a 37°C, imóvel durante a noite (~15 hrs). O OD600 final deve ser 3,0 - 4,0. Volume de funcionamento: 3L (2,7L meio+ 300 mL inóculo). Cada fermentador tinha 1 impulsor Rushton e um tubo de asperção. As condições iniciais: Temperatura: 37 °C, N2 fluxo: ~0,5 vvm, asperção. Controladores: pH controlado a 7,0 com 5N NaOH. Espuma controlada pela adição automática de PPG-2000, com 0,25 mL/L adicionado ao meio fermentador antes da esterilização.
[0852] A cultura de perfusão do C. difficile foi realizada usando uma pilha de 2 SARTOCON Slice Cassetes, 0,2 μm tamanho do poro do material filtrante HYDROSART, 0,1 metro quadrado da área de superfície por cassete. 3L foram adicionados aos fermentadores em um vidro do fermentador de 10 L. a perfusão iniciou quando o OD alcançou o alvo de ~4 por 2 horas de intervalos de velocidade aumentada como 0,75 L/hr, 1,5 L/hr, 2,25 L/hr, 3 L/hr por exemplo 1, Figura 28. A perfusão iniciar-se-a com o meio de fermentação quando o OD alcançar o alvo de ~4 por 2 horas de intervalos de velocidade aumentada como 0,75 L/hr, 1,5 L/hr, 3 L/hr, e 6 L/hr por exemplo 2, Figura 29. No sinal inicial para a perfusão, a bomba de recirculação foi iniciada na velocidade desejada a 1,3 L/min fluxo cruzado.
[0853] Exemplo 1, Figura 28: OD 50 final e título de toxóide B 243 mg/L foram obtidos.
[0854] Exemplo 2, Figura 29: OD 59 final e título de toxóide B 306 mg/L foram obtidos.
[0855] A invenção também proporciona as seguintes modalidades como definido nas cláusulas abaixo: Cláusula 1.Um polipeptídeo isolado compreendendo a SEQ ID NO: 183.
[0856] Cláusula 2.Um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 184.
[0857] Cláusula 3.uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo isolado compreendendo a SEQ ID NO: 183.
[0858] Cláusula 4.uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo isolado compreendendo a SEQ ID NO: 184.
[0859] Cláusula 5.um meio de cultura compreendendo um hidrolisado de soja, extrato de levedura, e glicose, e sendo que o meio compreende uma bactéria Clostridium difficile derivada de VPI 11186, sendo que a bactéria carece de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina, onde a bactéria compreende um polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, onde a bactéria ainda compreende um promotor feredoxina de Clostridium sporogenes (fdx).
[0860] Cláusula 6.Um método de culturar o Clostridium difficile compreendendo culturar o C. difficile em um meio, onde o meio compreende um hidrolisado de soja, extrato de levedura, e glicose, e sendo que o meio compreende uma bactéria Clostridium difficile derivada de VPI 11186, sendo que a bactéria carece de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina, onde a bactéria compreende um polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, onde a bactéria ainda compreende um promotor feredoxina de Clostridium sporogenes (fdx).
[0861] Cláusula 7.Um método para produzir uma toxina de Clostridium difficile compreendendo culturar o C. difficile em um meio sob condições compatíveis para produzir a toxina, e isolar a toxina do meio; onde o meio cmpreende um hidrolisado de soja, extrato de levedura, e glicose, e sendo que o meio compreende uma bactéria Clostridium difficile derivada de VPI 11186, sendo que a bactéria carece de um polinucleotídeo endógeno codificando uma toxina, onde a bactéria compreende um polinucleotídeo codificando uma toxina de C. difficile mutante, onde a bactéria ainda compreende um promotor feredoxina de Clostridium sporogenes (fdx).

Claims (12)

1. Polipeptídeo imunogênico, caracterizado pelo fato de que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácido reveladas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 761, onde um resíduo de lisina do polipeptídeo é ligado a uma fração beta-alanina.
2. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é modificado quimicamente por um 1-etil-3-(3-dimetiaminopropil) carbodiimida) (EDC).
3. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é modificado quimicamente por N- Hidroxisuccinimida (NHS).
4. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma cadeia lateral de resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo ou uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do peptídeo é ligada a uma fração glicina.
5. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma ligação cruzada entre a cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo.
6. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma ligação cruzada entre a cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo.
7. Polipeptídeo imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem um EC5o de pelo menos 100 g/ml.
8. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo polipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. Célula recombinante derivada de uma célula de Clostridium difficile selecionada do grupo consistindo de Clostridium difficile 1351, Clostridium difficile 3232, Clostridium difficile 7322, Clostridium difficile 5036, Clostridium difficile 4811, e Clostridium difficile VP I 11186 ou progênie da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo isolado, que compreende a sequência de aminoácido revelada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 761.
11. Célula de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Clostridium difficile VP I 11186.
12. Célula de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que um gene de esporulação da célula de Clostridium difficile é inativado.
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