JP2022532917A

JP2022532917A - クロストリジウム・ディフィシルのワクチン組成物

Info

Publication number: JP2022532917A
Application number: JP2021568804A
Authority: JP
Inventors: ジン、ロンシェン; フェルナー、フィリップ; チェン、ペン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2022-07-20
Also published as: MX2021014097A; US20220062401A1; EP3972638A4; CN114126644A; EP3972638A1; WO2020237090A1; BR112021023119A2; CA3141165A1

Abstract

ＴｃｄＢ又はＴｅｄＡホロトキシンを介してＣ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）を処置又は予防するための方法及び組成物。該組成物は、ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡの中和エピトープの１つ又は組合せに基づく、抗体、ナノボディ（ＶＨＨ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）等の免疫原又は結合剤を特徴とする。免疫原がエンドソームｐＨでＴｃｄＢによる細孔形成に必要なコンフォメーション変化を阻害する場合。さらに、免疫原は、被切断結合のＣＰＤ切断側への移動、及びＣＰＤに対するＧＴＤの適切な配向を阻害するため、毒素を活性化するのに必要なＧＴＤの切断を阻害する。本発明はまた、ＣＤＩの処置のためのワクチン、例えば、ＴｃｄＢ又はＴｃｃＬＡを標的とするワクチンについても記載する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１９年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／８５１，０４０号の利益を主張し、その明細書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府が後援する研究又は開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＡＩ１２５７０４及びＲ０１ＡＩ１３９０８７、並びに国防総省／国防脅威削減局によって授与された助成金番号ＨＤＴＲＡ１－１６－Ｃ－０００９及びＨＤＴＲＡ１－１８－１－００３５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表への参照
出願人は、規則１３ｔｅｒ．１（ａ）に基づいて提出されたＵＣＩ＿１９＿１６＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５と題する添付文物Ｃ／ＳＴ．２５テキストファイルの形式で記録された情報は、提出された国際出願の一部を形成する情報と同一であると主張する。配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のホロトキシンを中和すること、より具体的には、クロストリジウム・ディフィシル感染症を処置するための治療用組成物及び方法に関する。

クロストリジウム・ディフィシルは、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって緊急の抗生物質耐性の脅威の上位３つに分類されており、先進国においてＣ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）は、抗生物質関連下痢及び胃腸炎関連死の最も一般的な原因となっている。ＣＤＩの病理は、主に２つの相同外毒素、ＴｃｄＡとＴｃｄＢによって媒介され、これらは結腸上皮を標的にして破壊し、下痢と大腸炎を引き起こす。ＣＤＩの病因におけるこれら２つの毒素の相対的な役割は完全には理解されていないが、最近の研究では、ＴｃｄＢはＴｃｄＡよりも毒性が高く、宿主の炎症性及び自然免疫応答を誘導するためにより重要であることが示されている。

ＴｃｄＡ（約３０８ｋＤａ）及びＴｃｄＢ（約２７０ｋＤａ）は、４つの機能ドメイン、すなわちＮ末端グルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴＤ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、中央膜貫通送達及び受容体結合ドメイン（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ）、及びＣ末端結合反復オリゴペプチド（ＣＲＯＰ）ドメインを含む（図１Ａ）。毒素がＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ及びＣＲＯＰを介して細胞表面受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入することは広く認められている。エンドソームの酸性化は毒素のコンフォメーション変化を引き起こし、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤに細孔を形成させ、エンドソーム膜を越えてＧＴＤ及びＣＰＤを送達する。

サイトゾルでは、ＣＰＤは真核生物に特異的なイノシトールヘキサキスホスファート（ＩｎｓＰ６、フィチン酸としても知られている）によって活性化され、続いて自己タンパク質分解を受けてＧＴＤを放出する。次にＧＴＤは、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＣＤＣ４２等のＲｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼをグルコシル化する。Ｒｈｏタンパク質のグルコシル化はそれらの機能を阻害し、アクチン細胞骨格の変化、細胞円形化、そして最終的にはアポトーシス細胞死を引き起こす。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢのフラグメントについては、多数の構造が報告されており、これらの毒素ドメインの機能について多数の洞察が得られている。しかしながら、個々の文書がホロトキシンの超三次構造内でどのように相互作用するか、ホロトキシンが低ｐＨ及びＩｎｓＰ６等の環境及び細胞キュー（これらは中毒をもたらす）に正確に段階的に動的に応答する方法は不明である。

抗ＴｃｄＢ中和抗体（ベズロトクスマブ）は、ＣＤＩ患者の最大３５％が再発し、多くの患者が複数回の処置を必要とする可能性があるため、再発感染の予防として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近承認された。しかしながら、この抗体はＣＤＩの処置にもＣＤＩの予防にも適応されていない。

本発明の目的は、独立請求項に明記されているように、クロストリジウム・ディフィシルのホロトキシン（すなわち、ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ）の中和を可能にする治療用組成物及び方法を提供することである。本発明の実施形態は、従属請求項に記載されている。本発明の実施形態は、それらが相互に排他的でない場合、互いに自由に組み合わせることができる。

本発明は、Ｃ．ディフィシルの一次ホロトキシン（ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ）を中和する１つ以上の単離されたポリペプチドを含む治療用組成物を記載する。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、ホロトキシンに結合し、その毒性（機能）を阻害し、それによって該ホロトキシン中和する基で構成される。

さらに、本発明は、Ｃ．ディフィシルの一次ホロトキシン（ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ）を中和する方法を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｃ．ディフィシルのホロトキシン（ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ）の免疫原を産生し、免疫原を宿主に導入して、免疫原に対する免疫応答を誘発することを含む。別の実施形態では、宿主は、免疫原上のホロトキシン塩基に特異的な抗体を産生する。

さらに、本発明は、Ｃ．ディフィシルのホロトキシン（ＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ）に特異的なワクチンを設計及び製造する方法を特徴とし得る。

本発明を任意の理論又はメカニズムに限定することを望まないが、本発明の免疫原は無毒であり、それらを潜在的により安全にするため、本発明のワクチンは（例えば、ＣＤＩに対するトキソイドワクチンと比較して）有利である可能性があると考えられ；本発明の免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高収率及び高純度で産生され得、それらを産生、処方、及び保存することをより安価にし（ワクチンの産生は困難である可能性がある）；本発明の免疫原は、（トキソイドにおける破壊された抗原構造と比較して）それらの天然の３Ｄ構造を保持し、したがって、ワクチンとしての免疫応答を誘発するためにより効率的である可能性があり；本発明の免疫原は小さく、既知の中和エピトープを含み、したがって、免疫原は、中和抗体の産生を誘発するためにより効率的である可能性がある。さらに、これらの免疫原は（ホロトキシン全体と比較して）より小さく、より特異的なＴｃｄＢの領域に向けられているため、より良い免疫応答をもたらす可能性がある。本発明は、ホロトキシン全体よりも小さいが、小さい（例えば、１５－ｍｅｒ）ペプチドよりも大きいポリペプチド：明確に定義された３Ｄ構造を有する中型ペプチドを提供する。

本明細書に記載の任意の特徴又は特徴の組合せは、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかなように、任意のそのような組合せに含まれる特徴が相互に矛盾しないことを条件として、本発明の範囲内に含まれる。本発明の追加の利点及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲で明らかである。

本発明の特徴及び利点は、添付の図面に関連して提示される以下の詳細な説明を検討することから明らかになるであろう。

図１Ａは、全長ＴｃｄＢホロトキシンの概略図を示し、ＴｃｄＢ：ＧＴＤ（赤）：ＣＰＤ（紫）；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ（黄色）；ＣＲＯＰ（青）とおおよそのＶＨＨ結合領域のドメイン構成を示す。

図１Ｂは、ＴｃｄＢホロトキシンの３Ｄ構造の概略図を示している。明確にするため、結晶化を促進するために使用された３つのＶＨＨを省略した（ＧＴＤ；ＣＰＤ；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ；ＣＲＯＰ）。

図２Ａは、短い繰り返し（ＳＲ、細い青いバー）及び長い繰り返し（ＬＲ、太い黒いバー）の構成を示すＣＲＯＰドメインの概略図を示す。破線は、４つのＣＲＯＰユニット（Ｉ～ＩＶ）の境界を示す。

図２Ｂは、ＣＲＯＰドメインの拡大図を示すが、ＴｃｄＢの残りの部分は表面表現である。

図２Ｃは、４つのＣＲＯＰユニットの重ね合わせを示す。各ＣＲＯＰユニットのＬＲは、約１３２～１４６°のねじれを引き起こす。

図２Ｄは、ＣＲＯＰドメインを毒素の残りの部分に接続するヒンジ領域が、ＴｃｄＢの中心に位置し、ＧＴＤ、ＣＰＤ、及びデリバリー／ＲＢＤに囲まれていることを示す。図２Ｅは、ＣＲＯＰドメインを毒素の残りの部分に接続するヒンジ領域が、ＴｃｄＢの中心に位置し、ＧＴＤ、ＣＰＤ、及びデリバリー／ＲＢＤに囲まれていることを示す。

図３Ａは、ＳＡＸＳ研究におけるカーブフィット分析を示しており、ＣＲＯＰドメインがｐＨ依存性のコンフォメーション変化を受けることを示す。ＴｃｄＢホロトキシンの構造に基づく理論的なＫｒａｔｋｙプロットは、ｐＨ５．０（上のパネル）での実験的な散乱プロファイルとほぼ同じであるが、ｐＨ７．４（下のパネル）での散乱プロファイルとは異なる。

図３Ｂは、ＸＬ－ＭＳによって同定された異なるＴｃｄＢドメイン間の架橋ペプチドを示す。

図３ＣはＸＬ－ＭＳの結果を示し、ＴｃｄＢが中性ｐＨで「閉じた」コンフォメーションをとることができ、ＣＲＯＰドメインの中央部分とＣ末端先端がＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの約３０Å以内に移動することを示唆する。

図３Ｄは、ＴｃｄＢホロトキシンの２つの制限構造状態のモデルを示す。ＧＴＤに結合した７Ｆのアクセプター色素及びＣＲＯＰドメインに結合したＢ３９（星）上のドナー色素（六角形）を示す。

図３Ｅは、ｐＨ５．０（ｎ＝４９８）及びｐＨ７．０（ｎ＝５９４）での色素標識ＶＨＨとの複合体におけるＴｃｄＢからの平均化されていないＦＲＥＴ効率の母集団ヒストグラムを示す。

図４Ａは、ＴｃｄＢの細孔形成中間状態を示す。５ＤはＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤに結合し、細孔形成領域と直接相互作用する。細孔形成領域をリボンモデルで示し、残りの毒素を表面モデルで示す。

図４Ｂは、１．０σで輪郭が描かれた細孔形成領域の一部の代表的な２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップを示し、これを、最終的な精緻化されたモデルでオーバーレイする。

図４Ｃは、大きなクロストリジウムグルコシル化毒素（ＬＣＧＴ）ファミリーの種々のメンバー間の細孔形成領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＴｃｄＢ＊、ＴｃｄＢ、及びＴｃｄＢ２は、それぞれＭ６８株、ＶＰＩ１０４６３株、及びＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株によって生成される。ＴｃｄＢ＊及びＴｃｄＡの二次構造を、それぞれ上部と下部に示す。目に見える電子密度を持たないＴｃｄＢホロトキシンの残基１０３２－１０４７を、「ｘ」で示す。

図４Ｄは、酸性ｐＨ（紫）のＴｃｄＢ及び中性ｐＨ（オレンジ）のＴｃｄＡが、細孔形成領域において劇的に異なるコンフォメーションを採用することを示す。２つの構造を、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤに基づいて重ね合わせた。

図４Ｅは、カルセイン色素放出アッセイを示す。ＴｃｄＢ（０～２５ｎＭ）を、５Ｄ又は７Ｆの存在下又は非存在下で、ｐＨ４．６の５０ｍＭカルセインをロードしたリポソームで試験した。

図４Ｆは、膜脱分極アッセイを示す。リポソームを、膜貫通ＫＣｌ勾配の存在下でバリノマイシンを添加することにより、正の内部電圧で極性化した。膜電位を、電圧感受性蛍光色素ＡＮＳ（８－アニリノナフタレン－１－スルホン酸）を使用して測定した。３分後、様々な濃度の５Ｄ又は７Ｆを含むＴｃｄＢを添加した。データを平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として表す。

図５Ａは、ＴｃｄＢの一次配列におけるβフラップ、３ヘリカルバンドル（３－ＨＢ）、及びヒンジの位置を示す概略図を示す。

図５Ｂは、ＴｃｄＢホロトキシンにおけるアポＣＰＤ（灰色のコイル）と、ＩｎｓＰ６と結合したＣＰＤフラグメントとの重ね合わせを示す。アポＣＰＤの亜鉛原子は球として表示され、ＩｎｓＰ６はスティックモデルである。

図５Ｃは、βフラップ、３－ＨＢ、及びヒンジがＴｃｄＢの中心に共局在することを示している。図５Ｄは、βフラップ、３－ＨＢ、及びヒンジがＴｃｄＢの中心に共局在することを示している。

図６は、様々なナノビーズサブユニットワクチンの抗体価を示す。

本発明の化合物、組成物、及び／又は方法が開示及び説明される前に、本発明は特定の合成方法又は特定の組成物に限定されず、したがって、当然変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

ここで図１～６を参照すると、本発明は、ＣＤＩを潜在的に処置及び予防するために、Ｃ．ディフィシルの一次ホロトキシン（すなわち、ＴｃｄＢ及びＴｃｄＡ）を中和する治療組成物及び方法を特徴とする。さらに、本発明は、Ｃ．ディフィシルのホロトキシンのためのワクチンを製造する方法を特徴とする。

本明細書で使用される場合、Ｃ．ディフィシル由来のＴｃｄＢの配列は、Ｍ６８株に由来する（ＷＰ＿００３４２６８３８．１、以下の表１を参照されたい）。全てのアミノ酸番号はこの配列を参照する。

表１及び図１Ａを参照すると、ＴｃｄＢホロトキシンは、アミノ酸１～５４４のＮ末端グルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴＤ）、アミノ酸５４５～８４１のシステインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、アミノ酸８４２～１８３４の送達ドメイン／受容体結合ドメイン（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ）、及びアミノ酸１８３５～２３６７のＣ末端結合反復オリゴペプチド（ＣＲＯＰ）ドメインを有する。さらに、３つの中和エピトープ：Ｅ３（ＧＴＤでは、アミノ酸２３～６３を含む）；７Ｆ（アミノ酸１４７～５３８を包含する切断部位にすぐ横に並置されたＧＴＤのＣ末端）；及び５Ｄ（アミノ酸１１０５～１３５８を含むＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの一部）がある。中和エピトープに含まれる領域は一次アミノ酸配列では線形ではないが、３Ｄでクラスター化してエピトープを形成する。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ．ディフィシルの一次ホロトキシンを中和する１つ以上の単離されたポリペプチドを含む治療用組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、ホロトキシンに結合し、毒性／機能を阻害し、それによって該ホロトキシンを中和する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、結合剤又は他の薬物の免疫原又は標的として使用され得る。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの様々な免疫原を生成した（表２を参照されたい）：ＴｃｄＢ－ＦＬ（全長ＴｃｄＢ）；ＧＴＤ（アミノ酸１～５４３、配列番号２）、ＴＤ（アミノ酸７９８～１８０５、配列は示していない）；ＴＤ３（アミノ酸１２８６～１８０５、配列は示していない）；ＣＲＯＰ４（アミノ酸２２３５～２３６７、配列は示していない）；及びＴＤ１（アミノ酸１０７２～１４５２、細孔Ｂエピトープ、配列番号３）。ＴＤは転座ドメインを指す。

以下の表２は、免疫原として、又は結合剤若しくは他の薬物の標的として使用され得るポリペプチド配列の非限定的な例を記載する。

ここで表２を参照すると、本発明は、ここに列挙された配列に限定されない、単離されたポリペプチドを特徴とする。配列番号２は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１～５４３を指す。配列番号３は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１０７２～１４５２を指し、アミノ酸１０７２～１４５２は細孔形成に必要な転座ドメインの一部である。配列番号５は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１０５２～１４７２を指す。配列番号６は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１０２２～１５０２を指す。配列番号７は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１～５３３を指す。配列番号８は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１～５９３を指す。配列番号９は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１～５７３を指す。配列番号１０は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１１０５～１３５８を指し、５Ｄエピトープを包含する領域である。配列番号１１は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸２３～６３を指し、Ｅ３エピトープを包含する領域である。配列番号１２は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１４７～５３８を指し、Ｆ７エピトープを包含する。配列番号１３は、ヒンジ領域に対応するＣ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１７９２～１８４５を指す。配列番号１４は、３－ＨＢ領域に対応するＣ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸６６６～８４１を指す。配列番号１５は、ベータフラップ領域に対応するＣ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸７４１～８４１を指す。配列番号１６は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸１～５４１を指す。配列番号１７は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸１０７３～１４５２を指す。配列番号１８は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸２２～６２を指す。配列番号１９は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸１４６～５３６を指す。配列番号２０は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸１７８９～１８４０を指す。配列番号２１は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸６６４～８４２を指す。配列番号２２は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡのアミノ酸７４３～８４２を指す。

いくつかの実施形態では、ヒンジエピトープは、標的化され得る。本明細書で使用される場合、ヒンジエピトープは、ヒンジ（アミノ酸１７９２～１８３４）、３－ＨＢ（アミノ酸７６６－８４１）、及びβフラップ（アミノ酸７４２～７６５）のうちの１つ、２つ、又は３つ全てを含む。これらの３つの構造単位はアミノ酸配列で分離されているが、３Ｄで共にクラスター化されている。

いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その配列と少なくとも５０％同一であるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その配列と少なくとも６０％同一であるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その配列と少なくとも７５％同一であるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その配列と少なくとも９０％同一であるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その配列と少なくとも９８％同一であるペプチドを含む。

本発明はまた、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む免疫原を特徴とする。いくつかの実施形態では、免疫原は、本発明による２つのポリペプチドに特異的な二価免疫原である。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチドが混合される。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチドは共有結合している。いくつかの実施形態では、免疫原は、本発明による３つのポリペプチドに特異的な三価免疫原である。いくつかの実施形態では、３つのポリペプチドが混合される。いくつかの実施形態では、２つ又は３つのポリペプチドは共有結合している。いくつかの実施形態では、免疫原は、本発明による４つのポリペプチドに特異的な四価免疫原である。いくつかの実施形態では、４つのポリペプチドが混合される。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、又は４つのポリペプチドが共有結合している。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ．ディフィシルの一次ホロトキシンを中和する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、該方法は、Ｃ．ディフィシルのホロトキシンの免疫原を産生すること、及び免疫原に対する免疫応答を誘発するように免疫原を宿主に導入することを含み、宿主は、免疫原に基づいてホロトキシンに特異的な抗体を産生する。

本明細書で使用される場合、「免疫原」は、宿主において免疫応答を誘発することができる任意の化合物を指し得る。免疫原の非限定的な例としては、結合剤、ＶＨＨ又はナノボディと呼ばれる重鎖のみの抗体の抗原結合領域（Ｖ_Ｈ）、抗体、抗体フラグメント、小分子又は薬物を挙げることができる。その他の適切な免疫原も検討され得る。本明細書で使用される場合、「宿主」は、マウス又はヒト等であるがこれらに限定されない哺乳動物を指し得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ．ディフィシルのホロトキシンに特異的なワクチンを設計及び製造する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、上記の表２に列挙された配列のいずれかの免疫原を含み得るが、これに限定されない。特定の実施形態では、ワクチンは、表２に上に列挙された配列に類似した免疫原又はワクチン、例えば切断バージョン、拡大バージョン、又は相同であるものを含む。本発明は、細孔Ｂエピトープ（配列番号３）を使用する最初のマウスＣＤＩワクチンを提供する。本発明は、マウスワクチンに限定されず、ヒト等の他のワクチンを含む。

本発明はまた、コンビナトリアルケミストリーを使用して３つの異なるＴＬＲアゴニストを一緒に連結して１つのアジュバント複合体を形成する、新規のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）トリアゴニストアジュバントプラットフォームを用いて抗原を製剤化することを記載する。ＴＬＲトリアゴニストアジュバントのパネルの免疫調節活性を評価し、それらが、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎｖｉｖｏで、特有の抗原特異的免疫応答を誘発するかどうかを見出すことができる。上位の候補物質を、効果的なワクチンの生成を支援するために評価してもよい。

本発明はまた、ワクチンの設計及び製造のための戦略を記載する。例えば、本発明は、最適化されたミクロスフェア捕捉システムを使用するワクチン抗原（Ａｇ）捕捉及びｉｎｖｉｖｏ送達プラットフォームを記載する。タグ又は他の化学的架橋剤を使用して、抗原をミクロスフェアに付着させることができる。例えば、Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）系又はｉｎｖｉｖｏ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して、抗原の配列を含むプラスミドから発現される。ストレプトアビジンでコーティングされたミクロスフェアを、トリス－ＮＴＡビオチンリンカーと結合し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において又はＩＶＴＴ反応から発現されたタンパク質を捕捉するために使用することができる。得られたＡｇ結合ミクロスフェアは、ＴＬＲアゴニストアジュバントの有無にかかわらず直接投与され、抗体放出のダイナミクス及びアイソタイプをモニターする。Ａｇをビーズあたり約２００，０００の密度でコーティングした。免疫原性の研究により、堅牢で耐久性のあるＡｇ特異的応答が明らかになった。これは、ミクロスフェアへの結合による複雑な混合物からの特定のタンパク質の分離を示し、直接免疫原性試験を高スループットでスケーラブルな様式で実施することができる。本発明は、この特定の方法に限定されず、本発明は、Ｈｉｓタグに限定されない。

ワクチン製剤を表３に従って製造した。マウスに様々な製剤を注射（ＳＣ）した。プライムは０日目であり、ブースト１は１４日目であり、１群あたり４匹のマウスがいた。表３及び図６は、測定された中点力価を示す。Ａｇは抗原単独を表し、ＡＶはＡｄｄａｖａｘを表し、ＡＶ＋ＴＬＲは、Ａｄｄａｖａｘ、ＣｐＧ、ＭＰＬＡ、ＴＬＲ２，６を表す。図６は抗体力価を示す。Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの非毒性セグメントによる免疫化は、マウスで高い抗体レベルを誘導する。抗体レベルは３ｌｏｇ超増加する。免疫応答は、（完全長の毒素である２３６７アミノ酸と比較して）３８１アミノ酸の免疫原に対して特異的である。３８１アミノ酸の免疫原に対して誘導された抗体は、全長毒素にも反応する。

本発明はまた、抗体又は結合剤の抗毒素活性を改善するための方法、及び目的の複数のエピトープ（例えば、本明細書の毒素上の複数の中和エピトープ）を同時に標的とするマルチドメイン抗体又は結合剤を開発するための方法を記載する。

本発明は、ＣＤＩの処置のために（例えば、薬物、小分子、結合剤等を用いて）ＴｃｄＢを不活性化するための中和エピトープを標的化することを記載する。本発明はまた、中和エピトープに基づくワクチンの開発について記載する。免疫原又はワクチンは、例えば、その毒性の前提条件である個々のドメインの生物学的機能を阻害することによって、又は細胞を攻撃する前にその不活性化につながる細胞外活性化を促進することによって、ホロトキシンを不活性化することができる。

例
以下は、本発明の非限定的な例である。当該例は、いかなる方法でも本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。等価物又は代替物は、本発明の範囲内にある。

方法
Ｃ．ディフィシルのＭ６８株によって産生されたＴｃｄＢを使用した。ＴｃｄＢホロトキシン及びそのＧＴＤを前述のように発現させた。４つのＶＨＨ（５Ｄ、Ｅ３、７Ｆ、及びＢ３９）、ＶＰＩ１０４６３株によって生成されたＴｃｄＢのＧＴＤ（残基１～５４２、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}と呼ばれる）、及びＴｃｄＢの切断型Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ（残基１０７２～１４３３）、ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}）、及びＴＤ１（Ｃ末端に１０×Ｈｉｓタグを持つ残基１０７２～１４５２）をコードする遺伝子を、全てのタンパク質のＮ末端に６×Ｈｉｓ／ＳＵＭＯ（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｍｔ３ｐ）タグが導入された改変ｐＥＴ２８ａベクターにクローニングした。ＴｃｄＢフラグメント（残基１～１８０５、ＴｃｄＢ^{１－１８０５}）を、ＳＵＭＯタグとＴｃｄＢ^{１－１８０５}の間に導入されたツインＳｔｒｅｐタグ及びＣ末端の６×Ｈｉｓタグを持つ改変されたｐＥＴ２２ｂベクターにクローニングした。全ての変異体を２ステップＰＣＲによって生成し、ＤＮＡシーケンシングによって検証した。

５Ｄ、Ｅ３、７Ｆ、Ｂ３９、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}、ＴｃｄＢ^{１－１８０５}、ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}、及びＴＤ１を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＬ２１－Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現させた。細菌をカナマイシン又はアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で培養した。ＯＤ_６００が約０．８に達したとき、温度は１６℃に低下した。１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル－ｂ－Ｄ－チオガラクトピラノシド）で発現を誘導し、１６℃で一晩継続した。遠心分離により細胞を回収し、使用するまで－８０℃で保存した。

Ｈｉｓ_６タグ付きＴｃｄＢ、ＧＴＤ、及びＨｉｓ_６－ＳＵＭＯタグ付き５Ｄ、Ｅ３、７Ｆ、Ｂ３９、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}、ＴｃｄＢ^{１－１８０５}、ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}、及びＴＤ１を、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、４００ｍＭＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液中でＮｉ^２＋－ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸、Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティー樹脂を使用して精製した。タンパク質を高イミダゾールバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、４００ｍＭＮａＣｌ、及び３００ｍＭイミダゾール）で溶出し、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１ｍＭＴＣＥＰ、及び４０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液に対して、４℃で透析した。５Ｄ、Ｅ３、７Ｆ、Ｂ３９、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}、ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}、及びＴＤ１のＨｉｓ_６－ＳＵＭＯタグを、ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断した。これらのタンパク質、並びにＴｃｄＢホロトキシン及び未切断型Ｈｉｓタグを持つＧＴＤを、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５を含む緩衝液でＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製し、ＮａＣｌ勾配で溶出した。ＴｃｄＢ^{１－１８０５}は、ＳＵＭＯプロテアーゼで切断された後、ストレプトアビジンレジンを使用してさらに精製した。

ＴｃｄＢ－５Ｄ－Ｅ３－７Ｆ複合体を、精製されたＴｃｄＢホロトキシンを３つの精製されたＶＨＨと１：２：２：２のモル比で氷上で２時間混合することによってアセンブルした。次いで、複合体を２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５でのＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィー、続いて２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１ｍＭＴＣＥＰ及び４０ｍＭＮａＣｌでのＳｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。ＧＴＤ－Ｅ３、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}－７Ｆ、ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}－５Ｄ複合体を、精製されたＧＴＤ、ＧＴＤ^{ＶＰＩ１０４６３}及びＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}をそれぞれＥ３、７Ｆ及び５Ｄと、１：２のモル比で氷上で２時間混合することによって作製し、続いて、ＭｏｎｏＱイオン交換カラム（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００増加ＳＥＣ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１ｍＭＴＣＥＰ、及び４０ｍＭＮａＣｌ）を使用してさらに精製する。全てのタンパク質複合体を約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、使用するまで－８０℃で保存した。

Ｘ線小角散乱（ＳＥＣ－ＳＡＸＳ）実験と組み合わせたタンデムオンラインサイズ排除クロマトグラフィーを、前述のようにＳＳＲＬビームライン４－２で実施した。精製したＴｃｄＢホロトキシンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、５ｍＭＤＴＴ、又は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＴＴを含むバッファーに交換し、次いで２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＳＥＣ－ＳＡＸＳデータを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００ＩｎｃｒｅａｓｅＰＣ３．２／３００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してｐＨ５．０及び７．４で収集した。

ＴｃｄＢのＤＳＳＯ架橋のため、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＴｃｄＢホロトキシン（５０μＬ、１０μＭ）をＤＳＳＯと１：１００のモル比で室温で１時間反応させた。５０倍過剰の重炭酸アンモニウムを１０分間添加することにより架橋反応をクエンチし、得られた生成物をＦＡＳＰプロトコルを使用して酵素消化に供した。簡潔には、架橋タンパク質をＭｉｌｉｐｏｒｅＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）ＵｌｔｒａｃｅｌＰＬ－３０（３０ｋＤａフィルター）に移し、還元／アルキル化して、前述のようにＬｙｓ－Ｃ／トリプシンで順次消化した。得られた消化物を脱塩し、ペプチドＳＥＣによって分画した。架橋ペプチドを含む画分を、その後のＭＳ^ｎ分析のため収集した。この作業では、３つの生物学的複製を実施した

ＬＣＭＳ^ｎ分析を、ＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓ（商標）質量分析計と組み合わせたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉＭａｔｅ３０００システムをオンラインで使用して実施した。５０ｃｍ×７５μｍのＡｃｃｌａｉｍ（商標）ＰｅｐＭａｐ（商標）Ｃ１８カラムを使用して、３００ｎＬ／分の流速で８２分間で１％～２５％のＡＣＮのグラジエントでペプチドを分離した。ＤＳＳＯ架橋ペプチドの同定を最大化するため、２つの異なるタイプの取得方法を利用した。

ＴｃｄＢの単一分子ＦＲＥＴ分析の場合、ＶＨＨ－７Ｆ及びＢ３９はそれぞれ、標識のためネイティブシステインにアクセスできないようにする埋め込み（ｂｕｒｉｅｄ）ジスルフィド結合を含む。システイン残基を、突然変異誘発によって７ＦのＮ末端（－１の位置）又はＢ３９（Ｇ４２Ｃ）の表面に露出したループに導入した。変異型ＶＨＨの発現及び精製は、精製中に全てのバッファーで５ｍＭＤＴＴを使用したことを除いて、野生型タンパク質と同様であった。精製された７Ｆをアクセプター色素（Ａｌｅｘａ－６４７マレイミド）で標識し、Ｂ３９をドナー色素（Ａｌｅｘａ－５５５マレイミド）で標識した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。標識効率を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法によって９０％超であると決定した。精製した５Ｄを、ＥＺ－ＬｉｎｋＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｐＨ６．８でビオチン化し、Ｎ末端アミンを優先的に標識した。Ａｌｅｘａ－６４７標識７Ｆ、Ａｌｅｘａ－５５５標識Ｂ３９、及びビオチン標識５Ｄと複合体を形成したＴｃｄＢホロトキシンを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＳＥＣを使用してさらに精製して過剰なＶＨＨを除去した。

ストレプトアビジンを添加する前に、洗浄した石英スライドをビオチン化ウシ血清アルブミンで不動態化し、続いて２％Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ２０３と０．２％Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ２０６（ＮＯＦＡｍｅｒｉｃａＣｏｒｐ．）の混合物で不動態化した。この処置の後、事前に形成されたＴｃｄＢ－３ＶＨＨ複合体は、単一分子間の光学分解能を達成するために使用される１００ｐＭ濃度よりも桁違いに高い濃度においてスライドへの非特異的結合を示さなかった。

このような低タンパク質濃度では、非共有結合したＶＨＨが部分的に解離するため、測定を迅速に行う必要があり、各ｐＨ条件で７回の表面処理を繰り返す必要があった。試料を、プリズムベースの全反射照明蛍光顕微鏡を使用して撮像した。試料を、Ａｌｅｘａ－６４７の場合は６３７ｎｍ（ＣｏｈｅｒｅｎｔＩｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）のレーザーダイオードで、Ａｌｅｘａ－５５５の場合は５３２ｎｍ（ＬａｓｅｒＱｕａｎｔｕｍＵＳＡ．カリフォルニア州フリーモント）のダイオードポンプ（ｄｉｏｄｅｐｕｍｐｅｄ）固体レーザーで励起した。ドナーチャネル用の５８５／７０バンドパスフィルター及びアクセプターチャネル用の６７０／３０バンドパスフィルター（ＩＤＥＸＨｅａｌｔｈ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ．ニューヨーク州ロチェスター）を有する６４５ｎｍダイクロイックミラーを備えるＯｐｔｏｓｐｌｉｔレシオメトリックイメージスプリッター（ＣａｉｒｎＲｅｓｅａｒｃｈＬｔｄ、英国フェイバーシャム）を使用して、ドナーとアクセプターからの発光を分離した。複製された画像を、１０Ｈｚのフレームレートで単一のｉＸｏｎＤＵ－８９７ＥＭＣＣＤカメラ（ＡｎｄｏｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国ベルファスト）に中継した。

複製画像を相互相関させ、ベースラインを超える強度の回折限界スポットの時間トレースを抽出するため、自作のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトでデータを処理した。個々の複合体の経時的な蛍光強度のトレースから、単一の時間ステップでベースラインに対して反相関光退色を示した単一のドナー及びアクセプター色素を含む複合体のみを選択した。反相関光退色事象の大きさから、分子ごとのγ正規化を実施することができ、これにより、絶対ＦＲＥＴ効率の報告を可能にする。ＦＲＥＴ効率を、ガウス関数に適合したヒストグラムに編集した。

ＦＲＥＴの変化が光物理的変化の結果ではないことを確認するために、相対量子収率及び蛍光異方性を、遊離色素、色素標識ＶＨＨ、及びＴｃｄＢと複合体を形成した個々の色素標識ＶＨＨについて測定した。全ての測定を、ｐＨ７（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７）及びｐＨ５（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５）でｓｍＦＲＥＴと同じ緩衝液を使用して１０ｎＭの色素濃度で実施した。

アンサンブル蛍光は、２．０ｍｍの励起スリット及び２．０ｍｍの発光スリットを使用してＩＳＳＰＣ１光子計数分光蛍光光度計で記録した。Ａｌｅｘａ－５５５及びＡｌｅｘａ－６４７で標識されたサンプルを、それぞれ５３２ｎｍ及び６３７ｎｍで励起した。蛍光に使用される試料の濃度を、同じキュベットを使用した吸光度測定から決定した。発光強度は、発光極大についての２０ｎｍウィンドウの合計として採用した。相対量子収率は、強度をｐＨ７での遊離色素の発光に正規化することによって計算した。異方性測定値を、２．０ｍｍの励起スリット及び２．０ｍｍの発光スリットで収集した。発光を、ドナーとアクセプターでそれぞれ５６７ｎｍ及び６７０ｎｍで記録した。全ての測定を３回行い、平均及び標準誤差として報告した。

動的光散乱（ＤＬＳ）を、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＳ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して実施した。ＴｃｄＢを、室温で２００μｌの容量のキュベット内のＰＢＳバッファー中０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でアッセイした。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒバージョン７．１３ソフトウェアを使用してデータを分析した。

カルセイン色素放出アッセイでは、製造業者のプロトコルに従って、ＡｖａｎｔｉＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒを使用した押出法によってリポソームを調製した。簡潔には、指定のモル比の脂質（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄ）をクロロホルム中で混合し、次いで窒素ガス下で乾燥させ、一晩真空下に置いた。乾燥した脂質を再水和し、５ラウンドの凍結融解サイクルにかけた。単層ベシクルを、ＡｖａｎｔｉＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒを製造業者の指示に従って使用し、２００ｎｍの細孔膜を通して押し出すことによって調製した。

５５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、及び３０％のコレステロール（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む乾燥脂質を１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭカルセインに再懸濁した。遊離カルセイン色素を、脱塩（Ｚｅｂａ）によってカルセインに捕捉されたリポソームから分離した。蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２ｅキュベットモジュールで４９３ｎｍで励起し、５２５ｎｍで発光して測定した。アッセイでは、リポソームを１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１ｍＭＥＤＴＡで希釈して、最終濃度を０．３ｍＭにし、蛍光シグナルが安定するまでインキュベートした。ＴｃｄＢのみ（０～２５ｎＭ）、又はＴｃｄＢ：ＶＨＨ＝１：２のモル比で５Ｄ又は７ＦとプレインキュベートしたＴｃｄＢを添加し、蛍光強度を７分間記録した。０．１％ＴｒｉｏｎＸ－１００を加えることにより反応を停止させた。蛍光変化のパーセンテージを、（（Ｆ－Ｆ_開始時）／（Ｆ_終了時－Ｆ_開始時））として計算した。カルセイン色素放出の初期速度を、曲線の直線部分の傾きから推定した。実験を独立して３回繰り返した。

膜の脱分極を、いくつかの変更を加えて前述のように測定した。簡潔には、５５％ＤＯＰＣ、１５％ＤＯＰＳ、３０％コレステロールで構成されるリポソームを２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）で調製した。トランス陽性の膜電位（＋１３５ｍＶ）を作り出すために、リポソームを２００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）で希釈して、最終濃度を０．１ｍＭにした。膜電位を、１２μＭＡＮＳを使用してモニターした。バリノマイシンを０秒の時点で添加し、最終濃度を３０ｎＭにした。１８０秒で、１００ｎＭＴｃｄＢホロトキシンのみ、又は０．０２～１μＭ５Ｄ又は１μＭ７ＦとプレインキュベートしたＴｃｄＢを添加し、４９０ｎｍでの蛍光強度を３８０ｎｍの励起で７分間モニターした。バチルス・アネウリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来の２μＭグラミシジンを添加することにより反応を停止させた。グラミシジンの存在下での最大変化に対する蛍光変化を、（（Ｆ－Ｆ_開始時）／（Ｆ_終了時－Ｆ_開始時））として計算した。実験を独立して３回繰り返した。

ＴｃｄＢ自己プロセシングアッセイを、２５μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で実施し、これは、０．４μＭのＴｃｄＢホロトキシン又はＴｃｄＢ^{１－１８０５}、ＩｎｓＰ６が、７Ｆ（２μＭ）の有無にかかわらず、指定の濃度で含んだ。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次にＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸して、反応をクエンチした。試料を４～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで調べ、ＴｃｄＢフラグメントをクーマシーブルー染色で視覚化した。

全長ＴｃｄＢの結晶構造
Ｃ．ディフィシルのＭ６８株からの完全長ＴｃｄＢホロトキシンを、十分に検証されたバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）系で発現し、高い均一性まで精製した。広範な結晶化スクリーニング及び最適化、並びにシンクロトロンでの多数の結晶の試験の後、ＴｃｄＢと３つの中和ＶＨＨ（５Ｄ、Ｅ３、及び７Ｆ）で構成されるヘテロ四量体複合体の結晶に対する最良のＸ線回折データを３．８７Åの分解能で収集した。ＴｃｄＢ－ＶＨＨ複合体を、エンドソームにおける生理学的に適切なｐＨであるｐＨ５．２で結晶化した（図１Ａ、図１Ｂ、及び表２）。ＴｃｄＢホロトキシンの完全な構造は、構造の柔軟性が高いために目に見える電子密度がない２つの小さな領域（残基９４４～９４９及び１０３２～１０４７）を除いて構築された（図１Ｂ）。

結晶構造は、ＴｃｄＢが３つの主要なコンポーネントで構成されていることを示している。ＧＴＤ（残基１～５４４）及びＣＰＤ（残基５４５～８４１）は、広範なドメイン間相互作用を含む中心的な要素を形成する。Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ（残基８４２～１８３４）は拡張モジュールを形成し、一方の側でＧＴＤとＣＰＤの両方と相互作用し、ＧＴＤ／ＣＰＤから離れた方向を指す。最も顕著な知見は、ＣＰＤとＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの接合部から出現し、フックのようにＧＴＤの周りを湾曲するように反対方向に約１３０Å伸びる細長いＣＲＯＰドメイン（残基１８３５～２３６７）である（図１Ｂ）。エンドソームｐＨでのＴｃｄＢの全体的な構成は、ＣＲＯＰがＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤと並行して相互作用する、中性ｐＨでのＥＭ研究から得られたＴｃｄＢ及びＴｃｄＡの構造モデルとは異なる。さらに、ＴｃｄＢの疎水性細孔形成領域（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの残基９５７～１１２９）は、中性ｐＨ付近のＴｃｄＡフラグメントで見られるものとは異なるコンフォメーションで観察された。これは、中和抗体（５Ｄ）によって「凍結」されたエンドソームｐＨでのＴｃｄＢのめったに見られない孔形成中間状態を表している可能性がある。

ＣＲＯＰドメインの特有の構造
ＴｃｄＢのＣＲＯＰは、２０～２３残基の２０回の短い反復（ＳＲと呼ばれる）と３０残基の４回の長い反復（ＬＲと呼ばれる）を含む２種類の反復配列で構成される（図２Ａ）。各ＳＲは、βヘアピンとそれに続く柔軟なループで構成され、各ＬＲには、前のＳＲのβヘアピンと一緒にねじれた逆平行βシートを形成する３つのβ鎖がある。ＣＲＯＰの湾曲は、ＳＲで構成されるβ－ソレノイドの真っ直ぐな棒状のセグメントが散在するＬＲによって中断され、約１３２～１４６°のねじれを引き起こすために発生する（図２Ｂ、図２Ｃ）。構造的に、ＣＲＯＰは４つの同等のユニット（ＣＲＯＰＩ～ＩＶと呼ばれる）に分割でき、それぞれがＳＲ１－ＳＲ２－ＳＲ３－ＬＲ－ＳＲ４－ＳＲ５モジュールで構成される（図２Ｃ）。ＣＲＯＰＩ～ＩＶの重ね合わせにより、約０．９～２．６ÅのＣα二乗平均平方根偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）が得られた。

興味深いことに、他の全てのＳＲと同様に、認識されないＳＲモジュール（残基１８１５～１８３４）がＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤのＣ末端で識別された。この新たなＳＲは、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤを細長いＣＲＯＰに接続するため、上流の長いループ及び短いαヘリックスと共に構造的に異なるモジュール（残基１７９２～１８３４）（ここでは「ヒンジ」と呼ばれる）を形成する。さらに、ヒンジは、ＣＰＤの活性化に重要なＣＰＤの３本鎖βシート（残基７４２～７６５、βフラップと呼ばれる）、並びにＧＴＤ、ＣＰＤ、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ、及びＣＲＯＰに囲まれた隙間にある３ヘリカルバンドル（残基７６６～８４１、３－ＨＢと称される）と直接相互作用する（図２Ｄ、図２Ｅ）。その戦略的な位置のため、このヒンジは、ＴｃｄＢの４つのドメイン全ての間の構造的通信を仲介するように調製されている。このヒンジの機能的役割は、この領域の欠失が毒性を劇的に減少させたことを示す以前の研究によって裏付けられている。さらに、ヒンジの近くの超可変配列は、高毒性のＣ．ディフィシル０２７リボタイプ及び他の低毒性株によって生成されるＴｃｄＢ変異体によって示される毒性及び抗原性の違いに寄与する可能性がある。

ＴｃｄＢは中性及び酸性ｐＨで異なる構造を示す
ＴｃｄＢホロトキシンの構造は酸性ｐＨで成長した結晶に由来するため、その溶液構造を、それぞれｐＨ５．０及びｐＨ７．４のＳＡＸＳ（ＳＥＣ－ＳＡＸＳ）と組み合わせたオンラインサイズ排除クロマトグラフィーを使用してさらに調べた。カーブフィット分析は、この結晶構造に基づいて計算された散乱プロファイルがｐＨ５．０での実験的な散乱プロファイルとほぼ同じであることを示し、ＴｃｄＢの溶液構造がｐＨ５．０での結晶構造に類似していることを示唆している。しかしながら、ｐＨ７．４での実験ＳＡＸＳデータと結晶構造の計算されたプロファイルとの間の散乱プロファイルの中角（中角ｑ）領域での不一致は、ＴｃｄＢが中性ｐＨで異なるコンフォメーションをとることを示唆している（図３Ａ）。Ｇｕｉｎｉｅｒ及びＰ（ｒ）分析では、ｐＨ５．０及び７．４で同様のＲ_ｇ値が示されたが、ｐＨ５．０（約２３３．０Å）のＤ_ｍａｘはｐＨ７．４（約２０５．０Å）よりも長かった。ｐＨ５．０でのＴｃｄＢのＤ_ｍａｘは、この結晶構造から予測された値（約２４７Å）に匹敵する。しかしながら、ｐＨ７．４でのＴｃｄＢホロトキシンの短いＤ_ｍａｘは、ＧＴＤ、ＣＰＤ、及びＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤで構成されるＴｃｄＢコアから予測される値（約２０３Å）に匹敵する。したがって、ｐＨ７．４では、細長いＣＲＯＰがＴｃｄＢコアに向かってスイングし、よりコンパクトなコンフォメーションをとる可能性があることを示唆している。

ｐＨ７．４でのＣＲＯＰのコンフォメーションをよりよく特徴付けるため、ＸＬ－ＭＳ戦略を用いて、スルホキシドを含むＭＳ切断可能な架橋剤であるＤＳＳＯ（ジスクシンイミジルスルホキシド）を使用し、ＴｃｄＢのドメイン間相互作用を決定した。合計で８７の架橋が特定されており、ｐＨ７．４のＴｃｄＢにおける２７のドメイン間相互作用と６０のドメイン内相互作用を表す。それらの中で、８対、４対及び８対の固有の架橋ペプチドを、それぞれＧＴＤとＣＰＤ、ＧＴＤとＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤ、及びＣＰＤとＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの間で特定した（図３Ｂ）。ＸＬ－ＭＳデータをこの結晶構造にマッピングすると、これらの架橋のほとんど全てが３０Åの距離カットオフを満たし、ＴｃｄＢの結晶構造との良好な相関関係を示した。

興味深いことに、ＣＲＯＰとＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの間で７対の架橋ペプチドが同定され、これは、この結晶構造で測定した場合、９０Å～２１０Åの範囲のＣα－Ｃα距離に対応する。これは、ＴｃｄＢのＣＲＯＰが、この結晶構造で観察されるよりも中性ｐＨでＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤにはるかに近づく可能性があることを示唆している。具体的には、残基Ｋ１９６５及びＫ１９７７の周りのＣＲＯＰの中央部分、及び残基Ｋ２２３４及びＫ２２４９の周りのＣＲＯＰのＣ末端先端は、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤの約３０Å以内で移動できなければならない（図３Ｃ）。この新たなコンフォメーションは、ＳＡＸＳ研究から得られたｐＨ７．４でのＴｃｄＢのＤ_ｍａｘと一致し、中性ｐＨでのＴｃｄＡの「閉じた」コンフォメーションに類似する。ＸＬ－ＭＳは、安定した構造に加えて動的及び一時的な接触の捕捉を可能にするため、ＴｃｄＢが中性ｐＨで「閉じた」ＴｃｄＡのようなコンフォメーションで過ごす時間は不明のままである。

ＣＲＯＰのｐＨ依存性の構造的柔軟性
次に、ｓｍＦＲＥＴを使用して、ＣＲＯＰのｐＨ依存性のコンフォメーション変化を調べた。ｓｍＦＲＥＴは、タンパク質構造及びコンフォメーション変化を調べるための確立された方法であり、不均一又は動的な混合物中の個々の種を識別することができる。ＴｃｄＢには９つのシステイン残基があり、Ｃ６９９はＣＰＤ機能に不可欠であるため、毒素を化学的に標識するのではなく、３つのＶＨＨ（７Ｆ、Ｂ３９、及び５Ｄ）を分子ツールとして使用してＴｃｄＢを標識及び捕捉した。具体的には、アクセプター色素（Ａｌｅｘａ－６４７）は、ＴｃｄＢホロトキシンのコアを標識する７Ｆの－１位に導入されたシステイン残基に結合した。ドナー色素（Ａｌｅｘａ－５５５）は、ＣＲＯＰｓＩＶ（ＰＤＢコード：４ＮＣ２）に特異的に結合するＢ３９に結合した。ＴｃｄＢホロトキシンの構造を考えると、２つの色素間の距離は約４７Åである。これらの２つの色素標識ＶＨＨ間のエネルギー移動は、ＣＲＯＰの動きをモニターする（図３Ｄ）。アンサンブルＦＲＥＴ研究に基づくＴｃｄＢのコンフォメーション変化に影響を与えないビオチン標識５Ｄを、不動態化された石英顕微鏡スライドへのＴｃｄＢの免疫プルダウンに使用した。３つのＶＨＨはＴｃｄＢでプレアセンブリされ、複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

個々のヘテロ四量体ＴｃｄＢ－ＶＨＨ複合体の経時的な蛍光強度のトレースから、単一の時間ステップでベースラインに対して反相関光退色を示した単一のドナー及びアクセプター色素を含む複合体のみを選択した。反相関光退色事象の大きさを用いて、分子ごとのγ正規化を実施し、これにより絶対ＦＲＥＴ効率の報告を可能にする。ＦＲＥＴ効率をヒストグラムに編集し、ｐＨ５．０と７．０の両方で単一のＦＲＥＴピークが明らかになった（図３Ｅ）。単一のピークの存在は、１００ミリ秒の時間ビニングよりも速い静的構造又は動的平均化と一致し、これは単一のＦＲＥＴペアでは区別することができない。

ｐＨ５．０（０．５３２±０．０１５）及びｐＨ７．０（０．４８４±０．００７）で平均ＦＲＥＴ効率に統計的に有意な差が観察され、ＴｃｄＢがｐＨ依存性のコンフォメーション変化を示すという概念を裏付けている（図３Ｅ）。ｐＨ５．０での色素標識ＶＨＨ間の平均ＦＲＥＴ効率からの単純な計算では、４９．９±０．０５Åの推定距離が得られ、これは、酸性ｐＨ（約４７Å）でのＴｃｄＢホロトキシンの結晶構造と一致している。同様の結果がｐＨ５．５及びｐＨ５．２５で観察された。ｐＨ７．０では、平均ＦＲＥＴ効率は、標識部位間の距離が５１．５±０．０５Åに増加することを示唆した。単一のＦＲＥＴペアは、残りのＴｃｄＢに対してＣＲＯＰを配置するには不十分であり、コンフォメーションダイナミクスの変化は、ＦＲＥＴから距離への単純な変換に影響を与る。見かけの平均ＦＲＥＴのこのわずかな増加は、ｐＨ５．０（０．１４１±０．０２６）と比較してｐＨ７．０（０．１１３±０．００２）での分布幅の統計的に有意な２５％の減少を伴い、これはコンフォメーションダイナミクスの速度の増加と一致している。

これまでのところ、ＴｃｄＢでは、結晶構造、ＳＡＸＳ、及びｓｍＦＲＥＴの研究によって支持される酸性ｐＨでの「開いた」コンフォメーション、並びにＳＡＸＳ及びＸＬ－ＭＳによって明らかにされた中性ｐＨでの「閉じた」コンフォメーションである２つの制限構造状態が特定されている（図３Ｄ）。これらのデータは、ＣＲＯＰが中性ｐＨでＴｃｄＢのコアに関連するコンフォメーションの集合をサンプリングする可能性が高く、そのようなタンパク質ダイナミクスはｓｍＦＲＥＴの１００ミリ秒の積分時間では解明されないことをあわせて示唆している。ＣＲＯＰとＴｃｄＢコアの間の安定した接触の欠如、及びＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤとＣＲＯＰを接続するヒンジの潜在的な構造的再配置により、このようなコンフォメーションサンプリングが可能になる。

エンドソームｐＨでのＴｃｄＢの孔形成中間状態
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤは、ＧＴＤ及びＣＰＤをサイトゾルに送達する細孔を形成するためにエンドソームの酸性化時に放出されると予測される疎水性の細孔形成領域（残基９５７～１１２９）を保護するのに役立つ。ＴｃｄＢの細孔形成活性は、ｉｎｖｉｔｒｏで観察される細胞壊死にも寄与する。酸性ｐＨでのＴｃｄＢホロトキシンと中性ｐＨでのＴｃｄＡフラグメントの構造比較により、細孔形成領域の相同Ｃ末端部分（ＴｃｄＢの残基１０３２～１１３４及びＴｃｄＡの残基１０３３～１１３５）に劇的な違いがあることが明らかになった（図４Ａ、図４Ｂ）。ＴｃｄＡでは、この領域は混合α／β構成を採用しており、疎水性残基は、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤのβシートによって主に形成される連続した溝で遮蔽されている（図４Ｃ、図４Ｄ）。しかしながら、ＴｃｄＢの酸性コンフォメーションでは、おそらく高い柔軟性のために、残基１０３２～１０４７に見られる電子密度はなく、これらの残基がエンドソームｐＨで毒素コアから展開及び分離したことを示している。さらに、ＴｃｄＡにおけるα２に相当するＴｃｄＢ残基がループ状に展開し、ＴｃｄＡにおけるβ３及びα３の一部に相当するＴｃｄＢ残基が、ＴｃｄＡにある元のα３と同じ面積を占める新たなヘリックスへとアセンブルされる。この遷移のため、ＴｃｄＡにおけるα３のＣ末端部分に相当するＴｃｄＢにおける疎水性残基（残基１０８４～１０９４）は、拡張ループとして膨らんだ。興味深いことに、コンフォメーション変化は、ＴｃｄＢが５Ｄによって結合されている領域には広がらず、これは、ＴｃｄＡで観察されたものと同様のコンフォメーションを維持する。

細孔形成領域で観察されたコンフォメーション変化に対する酸性ｐＨ及び５Ｄの寄与をさらに分析するため、ｐＨ８．５で５Ｄと複合体を形成したＤｅｌｉｖｅｒｙ／ＲＢＤのフラグメントＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}の結晶構造を決定した（表２）。ＴｃｄＢ^{１０７２－１４３３}においてｐＨ８．５で観察された細孔形成領域は、ＴｃｄＡのような中性ｐＨコンフォメーションをとることがわかった。したがって、この知見は、ＴｃｄＢホロトキシンで観察された細孔形成領域の新規コンフォメーションがエンドソームｐＨによって誘導される中間状態を表している可能性が高いことを示唆している。

さらに、５ＤのＴｃｄＢへの結合様式はｐＨ８．５と５．２でほぼ同じであり、５Ｄの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）全てが関与していることがわかった。５Ｄの全体的な結合親和性は、細孔形成領域の外側のＴｃｄＢ残基が関与する広範な極性及び疎水性相互作用によってさらに強化される。したがって、５ＤはＴｃｄＢにおけるβ４－β５のコンフォメーションを修正することができ、これによりβ４－β５－α４モジュールのｐＨによるコンフォメーション変化が防止される。以前の突然変異誘発研究は、ＴｃｄＢにおける５Ｄ結合部位の周りに導入された突然変異が、細孔形成及び細胞毒性を効果的に阻害し、５Ｄの標的となるＬ１１０７（Ｌ１１０７Ｋ）を単独で突然変異させると、毒性が１，０００分の１を超えることを示した。これらの知見は、５ＤがエンドソームｐＨでのＴｃｄＢによる細孔形成に必要なコンフォメーション変化を阻害する可能性が高いことを示唆している。

この仮説を試験するため、５ＤがＴｃｄＢの膜挿入にどのように影響するかを、２つの補完的なアッセイを使用して調べた。カルセインに捕捉されたリポソームを透過性にするＴｃｄＢの能力をモニターすることにより、ＴｃｄＢがタンパク質濃度依存的な様式でｐＨ４．６でのカルセイン放出速度を増加させることがわかった（図４Ｅ）。ＴｃｄＢを５Ｄとプレインキュベートすると、ＴｃｄＢによる色素放出の速度が大幅に低下した。対照として、ＧＴＤに結合する７Ｆは、ＴｃｄＢによって誘導される色素放出に影響を与えなかった。リポソーム中のバリノマイシン誘発膜電位を消散させるためのＴｃｄＢに対する５Ｄ又は７Ｆの影響をさらに研究すると、７Ｆではなく５ＤがＴｃｄＢの膜脱分極する能力を低下させることがわかった（図４Ｆ）。

まとめると、これらの知見は、５Ｄが細孔形成領域が必要なｐＨ誘導性のコンフォメーション変化を完了するのを防ぐことによってＴｃｄＢを中和することを示唆する。特に、５Ｄによって認識される細孔形成領域は、大きなクロストリジウム菌のグルコシル化毒素（ＬＣＧＴ）のファミリー間で高度に保存されており、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ、Ｃ．ノービイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）α毒素（Ｔｃｎα）、Ｃ．ソルデリ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）致死及び出血性毒素（ＴｃｓＬ及びＴｃｓＨ）、並びにパーフリンジェンスＣ．（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素（ＴｐｅＬ）を含む（図４Ｃ）。したがって、細孔形成領域のこの部分は、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、他のＬＣＧＴ、又は他の適切な標的を標的とする広域スペクトルワクチン及び抗体の開発のための優れた標的となる。

ＴｃｄＢの自己プロセシングの調節
細胞侵入時のＩｎｓＰ６によるＣＰＤの活性化は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの病理を調節する上で重要なステップである。全体として、ＴｃｄＢホロトキシン及びＩｎｓＰ６結合ＣＰＤフラグメント（ＰＤＢ：３ＰＥＥ）のａｐｏ－ＣＰＤの構造は、βフラップ（図５Ａ、図５Ｂ）を除いて、非常に類似している（約１．１Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）。ａｐｏ－ＣＰＤの構造を、ＴｃｄＢ（Ｇ^５４２ＳＬ^５４４）（ＰＤＢ：３ＰＡ８）の切断配列に基づいて、ＩｎｓＰ６又はペプチド阻害剤に結合したＣＰＤフラグメントの構造と比較したところ、βフラップが部分的にＴｃｄＢホロトキシンのＣＰＤのＰ１基質ポケットを占有して基質の結合を防ぐことがわかった。ＣＰＤフラグメントでは、ＩｎｓＰ６は、βフラップの約９０°の回転を引き起こし（図５Ｂ）、これは、活性部位及び基質ポケットを適切に順序付けることによってＣＰＤを活性化する。しかしながら、ＴｃｄＢホロトキシンでは、このようなβフラップの回転は不可能であり、そうしないと、後続の３－ＨＢと立体的に衝突するためである（図５Ｄ）。

ＩｎｓＰ６によるアロステリック調節に加えて、いくつかの研究は、ＣＲＯＰがＴｃｄＢ自己プロセシング（ａｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）にも影響を与えることを示唆した。ＩｎｓＰ６誘導性ＧＴＤ切断の効率は、ＴｃｄＢホロトキシンと、ヒンジ及びＣＲＯＰ（残基１～１８０５）のない切断型ＴｃｄＢとを使用して比較した。ＩｎｓＰ６によって誘発されるＧＴＤの切断はＴｃｄＢ^{１－１８０５}でははるかに効率的であることがわかり、ＣＲＯＰ及びヒンジがＴｃｄＢホロトキシンにおいてＣＰＤ機能を阻害するのに役立つことが示唆された。さらに、ＣＲＯＰがない場合、ヒンジを運ぶＴｃｄＢフラグメント（残基１～１８３２）は、ヒンジを持たないもの（残基１～１７９５）よりも弱いＩｎｓＰ６依存性のＧＴＤ切断を示した。これらのデータは、ヒンジがＴｃｄＢ自己プロセシングの調節に関与していることを示唆している。特に、ＴｃｄＢホロトキシンでは、ヒンジがβフラップ及び３－ＨＢと相互作用し、４つのドメイン全てを接続するＴｃｄＢの「心臓」を形成する（図５Ｃ、図５Ｄ）。βフラップ及び３－ＨＢは、ＩｎｓＰ６結合とＣＰＤ活性化の間をつなぐのに重要であるため、ＣＲＯＰのｐＨ依存性の動きに関連するヒンジの構造的再配列は、ＣＰＤ機能の調節に寄与する可能性がある。

ＶＨＨ７Ｆ及びＥ３は、ＧＴＤ上の２つの異なる中和エピトープを明らかにする
７ＦはＧＴＤ切断を阻害するが、ＣＰＤと直接相互作用しない。代わりに、７ＦはＧＴＤのＣ末端に結合し、切断部位（Ｌ５４４）にすぐに並置される。特に、７ＦのＣＤＲ３は、被切断結合の上流にあるαヘリックス（残基５２５～５３９）、及び隣接するαヘリックス（残基１３７～１５８）に、広範な極性及び疎水性相互作用で結合する。このような相互作用は、ＣＰＤ切断部位への被切断結合の移動、及びＣＰＤに対するＧＴＤの適切な配向を妨害し、したがってＧＴＤの切断を阻害する。

Ｅ３は、ＧＴＤを特異的に標的とすることにより、Ｒｈｏのグルコシル化を阻害し、ＴｃｄＢの細胞変性効果を遮断する。ＧＴＤフラグメント又はＴｃｄＢホロトキシンを使用して独立して解明された２つの結晶構造では、Ｅ３は同様の方法でＮ末端の４ヘリックスバンドル（残基１～９０）に結合する。より具体的には、Ｅ３は、ＧＴＤの第２及び第３のヘリックス（残基２１～６４）を、広範な極性及び疎水性相互作用で認識する。ＧＴＤ－Ｒｈｏ複合体の構造は報告されていないため、Ｅ３がＧＴＤ－Ｒｈｏの相互作用又は触媒作用にどのように影響するかは不明である。相同な４ヘリックスバンドルは、他のＬＣＧＴメンバーのグルコシルトランスフェラーゼドメインにも見られ、グルコシルトランスフェラーゼドメインの原形質膜結合に関与している可能性があり、Ｅ３がＧＴＤの膜結合を妨げる可能性があることを示唆している。したがって、ＧＴＤ－Ｅ３複合体の構造は、ＴｃｄＢ及び潜在的に他のＬＣＧＴメンバーに対抗するための新たな戦略として、これらのメカニズムをさらに検証及び活用するための基盤を築く。

本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、添付の特許請求の範囲を超えない修正を加えることができることは当業者には容易に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。いくつかの実施形態では、この特許出願に提示された図面は、角度、寸法比等を含む縮尺で描かれる。いくつかの実施形態では、図は代表的なものにすぎず、特許請求の範囲は図の寸法によって限定されない。いくつかの実施形態では、「含む」という句を使用する本明細書に記載された発明の説明は、「本質的にからなる」又は「からなる」と説明され得る実施形態を含み、したがって、「本質的にからなる」又は「からなる」という句を使用する本発明の１つ以上の実施形態を請求するための書面による説明要件を満たす。

以下の特許請求の範囲に記載されている参照番号は、この特許出願の審査を容易にするためだけのものであって、例示的なものであり、特許請求の範囲を図面内の対応する参照番号を有する特定の特徴に限定することを意図するものではない。

配列表４＜２２３＞ＴＤ１免疫原（アミノ酸１０７２～１４５２）＋ペプチドリンカー＋１０×Ｈｉｓタグ
配列表４＜２２３＞ペプチドリンカー
配列表４＜２２３＞Ｈｉｓタグ

Claims

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のホロトキシンを中和する１つ以上の単離されたポリペプチドを含む組成物であって、前記単離されたポリペプチドは、前記ホロトキシンに結合し、その毒性を阻害する配列からなる群から選択される配列の配列を含む、組成物。
前記単離されたポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２の配列を含む、請求項１に記載の組成物。
前記ホロトキシンがＴｃｄＢ又はＴｃｄＡである、請求項１に記載の組成物。
前記単離されたポリペプチド配列が、細胞を攻撃する前にその不活性化をもたらすＴｃｄＢの細胞外活性化を促進することによって毒性を阻害するか、又は細孔形成に必要なＴｃｄＢにおけるコンフォメーション変化を阻害するか、又はＴｃｄＢの活性化を阻害するか、又はＲｈｏグルコシル化を阻害し、それによってＴｃｄＢを中和する、請求項１に記載の組成物。
Ｃ．ディフィシルのホロトキシンを中和する方法であって、Ｃ．ディフィシルのホロトキシンの免疫原を産生すること、及び前記免疫原に対する免疫応答を誘発するように前記免疫原を宿主に導入することを含み、宿主は、前記免疫原に基づく前記ホロトキシンに対して特異的な抗体を産生する、方法。
前記ホロトキシンがＴｃｄＢ又はＴｃｄＡである、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２の配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が小分子である、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が結合剤である、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が抗体である、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が抗体フラグメントである、請求項５に記載の方法。
前記免疫原がナノボディである、請求項５に記載の方法。
前記免疫原が２つのポリペプチドに特異的な二価免疫原である、請求項５に記載の方法。
前記２つのポリペプチドが混合される、請求項１３に記載の方法。
前記２つのポリペプチドが共有結合している、請求項１３に記載の方法。
免疫原が３つのポリペプチドに特異的な三価免疫原である、請求項５に記載の方法。
３つのポリペプチドが混合される、請求項１６に記載の方法。
前記２つ又は３つのポリペプチドが共有結合している、請求項１６に記載の方法。
前記免疫原が４つのポリペプチドに特異的な四価免疫原である、請求項５に記載の方法。
前記４つのポリペプチドが混合されている、請求項１９に記載の免疫原。
前記２つ、３つ、又は４つのポリペプチドが共有結合している、請求項１９に記載の免疫原。
ホロトキシンＣ．ディフィシルに特異的なワクチンを設計及び製造する方法であって、
ａ）免疫原の配列を含むプラスミドからタグ付きタンパク質を発現させること、
ｂ）ミクロスフェア上にタグ付けされたタンパク質を捕捉すること、
ｃ）免疫応答を生成するために前記結合したミクロスフェアを宿主に投与すること、
を含む、方法。
前記ホロトキシンがＴｃｄＢ又はＴｃｄＡである、請求項２２に記載の方法。
前記タグ付けされたタンパク質がＨｉｓタグ付きである、請求項２２に記載の方法。
前記タグ付けされたタンパク質がｉｎｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）系によって発現される、請求項２２に記載の方法。
前記タグ付けされたタンパク質が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）においてｉｎｖｉｖｏで発現される、請求項２２に記載の方法。
前記免疫原が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２の配列を含む、請求項２２に記載の方法。
前記免疫原が小分子である、請求項２２に記載の方法。
前記免疫原が抗体である、請求項２２に記載の方法。
前記免疫原が抗体フラグメントである、請求項２２に記載の方法。
前記免疫原がナノボディである、請求項２２に記載の方法。