CN103945861B - 胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含与延伸的重组多肽(XTEN)相连接的GLP‑2蛋白或其变体的组合物，编码该组合物的分离核酸和含有该核酸的载体和宿主细胞，以及制备该组合物和使用该组合物治疗GLP‑2相关病症的方法。

Description

胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2011年9月12日的美国临时申请序列号61/573,748的优先权，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是一种内分泌肽，其在人类中是通过胰高血糖素原的翻译后蛋白水解切割而产生的33个氨基酸的肽；这是一个还释放相关胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的过程。GLP-2由肠内分泌L细胞以营养依赖型的方式产生并分泌。GLP-2通过刺激隐窝细胞的增殖和减少肠细胞凋亡而向肠黏膜上皮细胞提供营养。GLP-2通过特异性的GLP-2受体发挥其作用，但在肠道内的响应由间接途径介导，在该间接途径中受体不在上皮上表达而在肠神经元上表达。(Redstone,HA等，The Effect of Glucagon-Like Peptide-2Receptor Agonists on Colonic Anastomotic Wound Healing.Gastroenterol ResPract.(2010)；2010:Art.ID:672453)。
GLP-2的作用是多样的，包括导致肠吸收和营养同化增强的肠营养效应(ntestinatrophic effect)(Lovshin,J.和D.J.Drucker,Synthesis,secretion andbiological actions of the glucagon-like peptides.Ped.Diabetes(2000)1(1):49-57)；抗炎活性；粘膜愈合和修复；肠通透性降低；和肠系膜血流量增加(Bremholm,L.等，Glucagon-like peptide-2increases mesenteric blood flow inhumans.Scan.J.Gastro.(2009)44(3):314-319)。外源性施用的GLP-2在人类和啮齿类动物中造成了许多影响，包括减缓胃排空、增加肠血流量和肠生长/粘膜表面面积、增强肠功能、减少骨质分解和神经保护作用。GLP-2可能以内分泌的方式发挥作用，使肠生长和代谢与营养摄入相关联。然而，在发炎的粘膜中，GLP-2的作用是抗增殖，在增加IGF-1表达的同时减少促炎细胞因子的表达，促进发炎粘膜的愈合。
对于广泛的病症，包括结肠直肠癌、炎性肠病、肠易激综合征和创伤，许多患者需要手术切除小肠或大肠。进行了末端空肠造口术而没有结肠的短肠综合征(SBS)患者，由于去除了分泌L细胞而降低了响应于膳食的GLP-2的释放。患有活动性克罗恩病或溃疡性结肠炎的患者的内源性血清GLP-2浓度升高，提示对粘膜损伤的正常适应性反应的可能性(Buchman,A.L.等，Teduglutide,a novel mucosally active analog of glucagon-likepeptide-2(GLP-2)for the treatment of moderate to severe Crohn'sdisease.Inflammatory Bowel Diseases,(2010)16:962–973)。
外源性施用的GLP-2和GLP-2类似物已被证明在动物模型中促进肠上皮细胞的生长和修复，包括增强啮齿动物中小肠切除后的营养吸收和减轻全肠胃外营养诱发的发育不全，以及证明了动物模型中死亡率减少和疾病相关的组织病理学改善，诸如吲哚美辛诱发型肠炎，硫酸葡聚糖诱发型结肠炎和化疗诱发型粘膜炎。因此，GLP-2和相关类似物可能是用于短肠综合征、肠易激综合征、克罗恩病和其他肠病的治疗(Moor,BA等，GLP-2receptoragonism ameliorates inflammation and gastrointestinal stasis in murine post-operative ileus.J Pharmacol Exp Ther.(2010)333(2):574-583)。然而，由于二肽酰肽酶IV(DPP-IV)切割，天然GLP-2的半衰期为大约7分钟(Jeppesen PB等，Teduglutide(ALX-0600),a dipeptidyl peptidase IV resistant glucagon-like peptide 2analogue,improves intestinal function in short bowel syndrome patients.Gut.(2005)54(9):1224-1231；Hartmann B等，(2000)Dipeptidyl peptidase IV inhibition enhancesthe intestinotrophic effect of glucagon-like peptide-2in rats andmice.Endocrinology 141:4013–4020)。已经确定了第2位的丙氨酸置换成甘氨酸的GLP-2序列的修饰阻断了由DPP-IV引起的降解，将称为替度鲁肽(teduglutide)类似物的半衰期延长至0.9-2.3小时(Marier JF,Population pharmacokinetics of teduglutidefollowing repeated subcutaneous administrations in healthy participants andin patients with short bowel syndrome and Crohn's disease.J Clin Pharmacol.(2010)50(1):36-49)。然而，在短肠综合征患者中利用替度鲁肽的临床试验要求每天施用GLP-2，以实现临床益处(Jeppesen PB,Randomized placebo-controlled trial ofteduglutide in reducing parenteral nutrition and/or intravenous fluidrequirements in patients with short bowel syndrome.Gut(2011)60(7):902-914)。
对治疗蛋白质的化学修饰可以改变其体内清除率和随后的半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果其结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，药理学活性蛋白质的药理学功能可能受阻。其他方法包括Fc结构域与治疗性蛋白质的基因融合，这增加了治疗蛋白质的大小，因此降低了通过肾的清除率。此外，Fc结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。融合到Fc的GLP-2的形式已经在与患有术后肠梗阻相关的胃肠炎症的小鼠模型中进行评估(Moor,BA等，GLP-2receptor agonism ameliorates inflammation and gastrointestinal stasisin murine post-operative ileus.J Pharmacol Exp Ther.(2010)333(2):574-583)。遗憾的是，Fc结构域未能在重组表达期间有效折叠，并易于形成被称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解并且功能性蛋白质必须从错误折叠的聚集物复性，这是耗时、低效且昂贵的过程。
发明内容
因此，仍然非常需要GL-2组合物和制剂，其作为对GLP-2相关病症或疾病的预防和/或治疗方案的一部分施用时的半衰期以及活性和生物利用度的保留均增加，可以低频率施用、但是更安全并且生产上较不复杂且成本较低。本发明满足了这种需求并提供了相关的优势。本发明涉及新型GLP-2组合物及其用途。具体地，本文提供的组合物特别用于胃肠病症的治疗或改善。一方面，本发明提供了融合蛋白的组合物，其包含重组胰高血糖素样蛋白-2(“GLP-2”)和一个或多个延伸的重组多肽(“XTEN”)。主题XTEN通常是具有非重复序列和非结构化构象的多肽，它作为GLP-2肽的融合配偶体是有用的，在其中它赋予所得融合蛋白增强的性能。在一个实例中，一个或多个XTEN与GLP-2或其序列变体相连接，产生GLP-2-XTEN融合蛋白(“GLP2-XTEN”)。本发明还提供了包含所述融合蛋白的药物组合物及其用于治疗GLP-2相关病症的用途。一方面，GLP2-XTEN组合物较之未与XTEN相连接的重组GLP-2具有增强的药代动力学和/或物理化学性质，这允许更方便的给药，并导致一个或多个与胃肠病症相关的参数改善。本文所公开的实施方案中的GLP2-XTEN融合蛋白展现出一个或多个改善的性质或其任意组合，和/或展现出本文所详述的实施方案的任何组合。在一些实施方案中，本发明的GLP2-XTEN组合物不含有选自聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段的组分。
在一个实施方案中，本发明提供了包含XTEN的重组GLP-2融合蛋白，其中XTEN的特征在于a)XTEN包含至少36、或至少72、或至少96、或至少120、或至少144、或至少288、或至少576、或至少864、或至少1000、或至少2000、或至少3000个氨基酸残基；b)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成XTEN总氨基酸残基的至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％；c)XTEN基本上是非重复性的使得(i)XTEN不含三个连续的相同氨基酸，除非该氨基酸是丝氨酸；(ii)XTEN序列的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％由非重叠序列基序组成，所述序列基序中的每一个包含约9个至约14个或12个由三种、四种、五种或六种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个非重叠序列基序中出现不超过两次；或(iii)XTEN序列的子序列评分小于10；d)如通过GOR算法所确定的，XTEN具有超过90％、或超过95％、或超过99％的无规卷曲形成；e)如通过Chou-Fasman算法所确定的，XTEN具有少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；f)当通过TEPITOPE算法分析时，XTEN缺乏预测的T细胞表位，其中由所述算法进行的所述预测的TEPITOPE阈值评分的阈值为-9；其中当用尺寸排阻色谱法或可比的方法测量时，所述融合蛋白展现出至少约4、或至少约5、或至少约6、或至少约7、或至少约8、或至少约9、或至少约10、或至少约11、或至少约12、或至少约15、或至少约20的表观分子量因子，当采用治疗有效量向受试者施用时，所述融合蛋白展现出肠营养效应。在前述的实施方案中，XTEN可以具有要素(a)-(d)中的任意一项或(a)-(d)的任意组合。在前述的另一个实施方案中，该融合蛋白展现出至少约200kDa、或至少约400kDa、或至少约500kDa、或至少约700kDa、或至少约1000kDa、或至少约1400kDa、或至少约1600kDa、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa、或至少约3000kDa的表观分子量。在前述的另一个实施方案中，当向受试者施用时，该融合蛋白展现出长于约24、或约30、或约48、或约72、或约96、或约120、或约144小时的终末半衰期，其中该受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在一个实施方案中，该融合蛋白的XTEN的特征在于XTEN序列的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％由非重叠序列基序组成，其中所述基序选自表3。在一些实施方案中，该融合蛋白的XTEN的特征进一步在于天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于XTEN总氨基酸序列的10％、或小于5％、或小于2％。在其他实施方案中，该融合蛋白的XTEN的进一步特征在于甲硫氨酸和色氨酸残基的总和小于XTEN总氨基酸序列的2％。在另外其他的实施方案中，该融合蛋白的XTEN的特征进一步在于XTEN含有少于5％的带正电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，所施用的融合蛋白的肠营养效应与未与XTEN相连接并采用可比的剂量向受试者施用的相应GLP-2相比，是其肠营养效应的至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约100％，或至少约120％，或至少约150％，或至少约200％。在一个实施方案中，肠营养效应在选自小鼠、大鼠、猴和人的受试者明显。在前述的实施方案中，所述施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。在另一个实施方案中，在施用1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的融合蛋白后确定肠营养效应。在另一个实施方案中，肠营养效应选自肠生长、绒毛上皮增生增加、隐窝细胞增殖增加、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后的愈合增加、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡减少、溃疡形成减少、肠粘连减少和肠功能增强。
在一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白的施用导致小肠重量增加至少约10％，或至少约20％，或至少约30％。在另一个实施方案中，所述施用导致小肠长度增加至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％。
在一个实施方案中，当进行最佳比对时，融合蛋白的GLP-2序列与选自表1所列序列的序列具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或约100％的序列同一性。在另一个实施方案中，融合蛋白的GLP-2包括人GLP-2。在另一个实施方案中，融合蛋白的GLP-2包括来源于除人以外的物种的GLP-2，诸如牛GLP-2、猪GLP-2、羊GLP-2、鸡GLP-2和犬GLP-2。在一些实施方案中，融合蛋白的GLP-2具有取代Ala2的氨基酸置换，其中该置换是甘氨酸。在又一个实施方案中，融合蛋白的GLP-2具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。
在GLP2-XTEN融合蛋白的一个实施方案中，XTEN与GLP-2的C端相连接。在其中XTEN与GLP-2的C端相连接的GLP2-XTEN融合蛋白的另一个实施方案中，该融合蛋白进一步包含连接GLP-2和XTEN组分的1个至约50个氨基酸残基的间隔区序列。在一个实施方案中，该间隔区序列是单个甘氨酸残基。
在GLP2-XTEN融合蛋白的一个实施方案中，XTEN的特征在于：(a)总XTEN氨基酸残基为至少36至约3000、或约144至约2000、或约288至约1000个氨基酸残基；和(b)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成XTEN总氨基酸残基的至少约90％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％。
在GLP2-XTEN融合蛋白的一个实施方案中，该融合蛋白包含一个或多个XTEN，其与选自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一项的具有可比长度的序列相比并进行最佳比对时，具有至少80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。在另一个实施方案中，该融合蛋白包含XTEN，其中序列为表4中的AE864。在另一个实施方案中，该融合蛋白序列含有与图28中所述的序列具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性的序列。
在一个实施方案中，当采用体外GLP2R细胞试验进行分析时，包含GLP-2和XTEN的融合蛋白以小于约30nM、或约100nM、或约200nM、或约300nM、或约370nM、或约400nM、或约500nM、或约600nM、或约700nM、或约800nM、或约1000nM、或约1200nM、或约1400nM的EC50与GLP-2受体结合。在另一个实施方案中，当采用体外GLP2R细胞试验进行分析时，该融合蛋白保留未与XTEN相连接的相应GLP-2的效力的至少约1％，或约2％，或约3％，或约4％，或约5％，或约10％，或约20％，或约30％。在本段的前述实施方案中，GLP2R细胞可以是人重组GLP-2胰高血糖素家族受体钙优化的细胞，或另一种包含本领域已知的GLP2R的细胞。
表13和32中列出了具有与一个或多个XTEN相连接的单个GLP-2的融合蛋白的非限制性实例。在一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白组合物，其与来自表13或表33序列相比具有至少约80％的序列同一性，或者与来自表13或表33序列相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列同一性。然而，本发明还提供了用表1的GLP-2序列中的任一项置换表33中的序列，和用表4的任意XTEN序列置换表33中的序列。在一些实施方案中，GLP-2和XTEN进一步包含连接GLP-2和XTEN组分的1个至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其中该间隔区序列任选地包含可被包括内源性哺乳动物蛋白酶在内的蛋白酶所切割的裂解序列。此类蛋白酶的实例包括但不限于FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、FXa、凝血酶、弹性酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶(sortase)A，或者选自表6的序列。在一个实施方案中，具有裂解序列的融合蛋白组合物含有与来自表34的序列相比具有至少约80％序列同一性的序列，或者与来自表34的序列相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％序列同一性的序列。然而，本发明还提供了用表1的GLP-2序列中的任一项置换表34的序列中的GLP-2，和用表4的任意XTEN序列置换表34的序列中的XTEN，和用表6中的任意裂解序列置换表34的序列中的裂解序列。在具有与XTEN相连接的主题裂解序列的实施方案中，蛋白酶对裂解序列的切割将XTEN从融合蛋白中释放出来。在包含将XTEN连接至GLP-2的裂解序列的融合蛋白的一些实施方案中，当其通过裂解序列的切割而从XTEN释放出来时，GLP-2组分变成有生物活性的，或其与GLP-2受体结合的能力提高，其中经切割的蛋白质所得的活性与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比为至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。在前述的一个实施方案中，该裂解序列可被表6的蛋白酶所切割。在另一个实施方案中，该融合蛋白包含通过两个异源裂解序列与GLP-2相连接的XTEN，该异源裂解序列可被不同的蛋白酶切割，可以是表6的序列。在前述的一个实施方案中，经切割的GLP2-XTEN与GLP-2受体结合的能力提高。
本发明提供了所述实施方案的融合蛋白组合物，其包含特征如上文所述的GLP-2和XTEN，可以具有不同的N端至C端构型。在GLP2-XTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了一种式I的融合蛋白：
(GLP-2)-(XTEN) I
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物，包括表1的序列，并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种式II的融合蛋白：
(XTEN)-(GLP-2) II
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物，包括表1的序列，并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式III：
(XTEN)-(GLP-2)-(XTEN) III
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物(例如，包括表1的序列)，并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式IV：
(GLP-2)-(XTEN)-(GLP-2) IV
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物(例如，包括表1的序列)，并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，例如，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式V：
(GLP-2)-(S)x-(XTEN)y V
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物，包括表1的序列；S是具有1个至约50个氨基酸残基、可任选地包括与限制性位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔区序列；x为0或1；并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。在式V的实施方案中，该包含裂解序列的间隔区序列是能被选自因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20的哺乳动物蛋白酶所切割的序列。在式V融合蛋白一个实施方案中，该GLP-2包括人GLP-2。在式V融合蛋白的另一个实施方案中，该GLP-2包括来源于除人以外的物种的GLP-2，例如，牛GLP-2、猪GLP-2、羊GLP-2、鸡GLP-2和犬GLP-2。在式V融合蛋白的另一个实施方案中，该GLP-2具有取代Ala2的氨基酸置换，并且其中该置换是甘氨酸。在式V融合蛋白的另一个实施方案中，该GLP-2具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。在式V融合蛋白的另一个实施方案中，该融合蛋白包含间隔区序列，其中该间隔区序列是甘氨酸残基。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式VI：
(XTEN)x-(S)x-(GLP-2)-(S)y-(XTEN)y VI
其中对于每次出现独立地，GLP-2是如本文所定义的GLP-2蛋白或类似物(例如，包括表1的序列)；S是具有1个至约50个氨基酸残基、可任选地包括与限制性位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔区序列；x是0或1，并且y是0或1，其中x+y≥1；并且XTEN是如本文所定义的延伸的重组多肽，例如，包括当进行最佳比对时，与来自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列展现出至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，XTEN是AE864。在式VI的实施方案中，该包含裂解序列的间隔区序列是能被包括但不限于因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20的哺乳动物蛋白酶所切割的序列。
在一些实施方案中，向有需要的受试者施用治疗有效剂量的式I-VI之一的融合蛋白可导致该融合蛋白的治疗窗内所花的时间，与未与XTEN相连接并按可比剂量向受试者施用的相应GLP-2相比，增加至少两倍，或至少三倍，或至少四倍，或至少五倍，或至少10倍或更多倍。在其他情况下，向有需要的受试者施用治疗有效剂量的式I-VI的一个实施方案的融合蛋白可导致维持治疗有效剂量方案所必需的连续剂量之间的时间，与按可比剂量施用未与XTEN相连接的相应GLP-2相比，增加至少48h，或至少72h，或至少约96h，或至少约120h，或至少约7天，或至少约14天，或至少约21天。
可以采用本文所公开的任何合适的体外分析(例如，表32的分析或实施例中描述的分析)就活性的保留(包括在任何引入的XTEN释放切割位点切割后)对本文所述的实施方案的融合蛋白组合物进行评估，以确定在GLP-2因子相关病症的治疗中用作治疗剂的构型的适合性。在一个实施方案中，与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比，该融合蛋白展现出至少约2％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的活性。在另一个实施方案中，与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比，通过对引入的连接GLP-2和XTEN组分的裂解序列进行酶切而从该融合蛋白中释放的GLP-2组分展现出至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的生物活性。
在一些实施方案中，包含GLP-2和一个或多个XTEN的融合蛋白在治疗窗内仍然导致血液浓度，其中该融合蛋白当向受试者施用时展现出较之未与XTEN相连接的GLP-2增强的药代动力学特性，其中增强的特性包括但不限于终末半衰期更长、曲线下面积更大、治疗窗内血液浓度保持的时间增加、治疗窗内导致血液浓度的连续剂量之间的时间增加、当施用连续剂量时Cmax和Cmin血液浓度之间的时间增加，以及随时间推移所需施用的累积剂量较之未与XTEN相连接的GLP-2降低。向其施用GLP-2-XTEN组合物的受试者可以包括但不限于小鼠、大鼠、猴和人。在一些实施方案中，当按可比剂量向受试者施用相应的GLP-2时，与未与XTEN相连接的相应重组GLP-2相比，向受试者施用的融合蛋白的终末半衰期增加至少约三倍，或至少约四倍，或至少约五倍，或至少约六倍，或至少约八倍，或至少约十倍，或至少约20倍，或至少约40倍，或至少约60倍，或至少约100倍或甚至更长。在其他实施方案中，向受试者施用的融合蛋白的终末半衰期为至少约12h，或至少约24h，或至少约48h，或至少约72h，或至少约96h，或至少约120h，或至少约144h，或至少约21天或更长。在其他实施方案中，增强的药代动力学特性通过在该融合蛋白的治疗窗内血液浓度保持一段时间的事实反映出来，与未与XTEN相连接的相应GLP-2当按可比剂量向受试者施用相应的GLP-2时相比，所述一段时间长至少约两倍，或至少约三倍，或至少约四倍，或至少约五倍，或至少约六倍，或至少约八倍，或至少约十倍，或至少约20倍，或至少约40倍，或至少约60倍，或至少约100倍。半衰期和治疗窗内所花时间的增加允许与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比以较低频率给药，并且降低向受试者施用的融合蛋白量(以nmol/kg等效量表示)。在一个实施方案中，采用治疗有效剂量方案，向有需要的受试者施用三剂或更多剂的GLP2-XTEN融合蛋白导致在融合蛋白血液水平的至少两个连续的Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加，与未与XTEN相连接并采用可比剂量方案向受试者施用的相应GLP-2相比，增加至少两倍，或至少三倍，或至少四倍，或至少五倍，或至少六倍，或至少八倍，或至少10倍，或至少约20倍，或至少约40倍，或至少约60倍，或至少约100倍或更高。在一个实施方案中，采用治疗有效量向有需要的受试者施用的GLP2-XTEN导致GLP2-XTEN融合蛋白的血液浓度在至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、或至少约2000ng/ml、或至少约3000ng/ml、或至少约4000ng/ml、或至少约5000ng/ml、或至少约10000ng/ml、或至少约15000ng/ml、或至少约20000ng/ml、或至少约30000ng/ml、或至少约40000ng/ml以上保持至少约24小时、或至少约48小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或至少约144小时。在另一个实施方案中，以合适剂量向受试者施用的GLP2-XTEN导致在单剂施用后GLP2-XTEN融合蛋白的浓度曲线下面积为至少100000hr*ng/mL、或至少约200000hr*ng/mL、或至少约400000hr*ng/mL、或至少约600000hr*ng/mL、或至少约800000hr*ng/mL、或至少约1000000hr*ng/mL、或至少约2000000hr*ng/mL。在一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白具有能导致在维持治疗有效剂量方案所必需的连续剂量之间的时间增加的终末半衰期，较之未与XTEN相连接并按可比剂量施用的GLP-2的方案，所述时间为连续剂量之间至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天。
在一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白的特征在于，当等效量(以nmol/kg表示)的融合蛋白和缺少XTEN的相应GLP-2各自向可比的受试者施用时，该融合蛋白在该受试者中达到的终末半衰期与缺少XTEN的相应GLP-2相比长至少约3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少15倍或至少20倍。在另一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白的特征在于，当比缺少XTEN的相应GLP-2的量少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍(以nmol/kg表示)的融合蛋白各自向环有胃肠病症的可比受试者施用时，该融合蛋白在该受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果。在另一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白的特征在于，当采用给药间隔以连续剂量向受试者施用该融合蛋白时，所述给药间隔与缺少XTEN并采用其他等效的nmol/kg量向可比的受试者施用的相应GLP-2的给药间隔相比长至少约2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少15倍或至少20倍，该融合蛋白在该受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2相比相似的血液浓度。在另一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白的特征在于，当采用给药间隔以连续剂量向受试者施用该融合蛋白时，所述给药间隔与缺少XTEN并采用其他等效的nmol/kg量向可比的受试者施用的相应GLP-2的给药间隔相比长至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少15倍或至少20倍，该融合蛋白在该受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果。在另一个实施方案中，该GLP2-XTEN融合蛋白展现出本段前述的所有特征或任意组合。在本段的实施方案中，向其施用该主题组合物的受试者可包括但不限于小鼠、大鼠、猴和人。在一个实施方案中，该受试者是大鼠。在另一个实施方案中，该受试者是人。
在一个实施方案中，向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白得到与施用未与XTEN相连接的相应GLP-2所见的效果相比更强的治疗效果。在另一个实施方案中，有效量的融合蛋白的施用在患肠炎的受试者中得到与未与XTEN相连接并采用可比的nmol/kg量向可比受试者施用的相应GLP-2相比更强的治疗效果。以上，该受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在前述的一个实施方案中，该受试者是人，并且肠炎是克罗恩病。在前述的另一个实施方案中，该受试者是大鼠受试者，并且该肠炎由吲哚美辛诱发。在本段的前述实施方案中，所述更强的治疗效果选自体重增加、小肠长度、小肠组织的TNFα含量降低、粘膜萎缩减少、穿孔性溃疡的发病率降低和绒毛高度。在一个实施方案中，向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白导致小肠重量增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约10％、或至少约20％、或至少约30％或至少约40％。在另一个向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白的实施方案中，所述施用导致小肠长度增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％或至少约40％。在另一个向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白的实施方案中，所述施用导致体重增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％。在另一个向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白的实施方案中，所述施用导致TNFα含量与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比降低至少约0.5ng/g、或至少约0.6ng/g、或至少约0.7ng/g、或至少约0.8ng/g、或至少约0.9ng/g、或至少约1.0ng/g、或至少约1.1ng/g、或至少约1.2ng/g、或至少约1.3ng/g、或至少约1.4ng/g小肠组织或更多。在另一个向受试者施用GLP2-XTEN融合蛋白的实施方案中，所述施用导致绒毛高度增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约11％，或至少约12％。在本段的前述实施方案中，该融合蛋白以1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、12个或更多个连续剂量施用，其中该剂量为至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。
在一个实施方案中，该GLP2-XTEN重组融合蛋白包含通过能被哺乳动物蛋白酶切割的裂解序列与XTEN相连接的GLP-2，该哺乳动物蛋白酶包括但不限于因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20，其中该哺乳动物蛋白酶对裂解序列的切割使GLP-2序列从XTEN序列中释放出来，并且所释放的GLP-2序列展现出的受体结合活性与未切割的融合蛋白相比增加至少约30％。
本发明提供了生产该GLP2-XTEN融合蛋白的方法。在一些实施方案中，生产包含融合到一个或多个延伸的重组多肽(XTEN)上的GLP-2的融合蛋白的方法，包括提供包含编码任一本文所述实施方案的融合蛋白的重组核酸的宿主细胞；在允许该融合蛋白表达的条件下培养该宿主细胞；并回收该融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，该宿主细胞是原核细胞。在该方法的另一个实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在该方法的另一个实施方案中，该融合蛋白是从宿主细胞胞质中以基本上可溶的形式回收的。在该方法的另一个实施方案中，该重组核酸分子含有当进行最佳比对时与选自表13所列的DNA序列或其互补链具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或约100％的序列同一性的序列。
本发明提供了编码该GLP2-XTEN融合蛋白的分离核酸、载体、和包含该载体和核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其包含与选自表13的DNA序列或其互补链具有至少70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种核苷酸序列或其互补链，该核苷酸序列编码任一本文所述的融合蛋白实施方案中的融合蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含本段前述实施方案的核酸的表达载体或分离的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含前述表达载体的宿主细胞。
此外，本发明提供了药物组合物，其包含任一本文所述的前述实施方案的融合蛋白和药学可接受的载体。另外，本发明提供了药物组合物，其包含任一本文所述的前述实施方案的融合蛋白，用于治疗受试者的胃肠病症。在一个实施方案中，向患有胃肠病症的受试者施用治疗有效量的该药物组合物导致在该融合蛋白治疗窗内维持该融合蛋白血液浓度的时间与未与XTEN相连接并以可比量向受试者施用的相应GLP-2相比至少长三倍。在另一个实施方案中，采用治疗有效剂量方案向患有胃肠病症的受试者施用三剂或更多剂的该药物组合物导致融合蛋白血液水平的至少两个连续的Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加，与未与XTEN相连接并采用可比剂量方案向受试者施用的相应GLP-2相比增加至少四倍。在另一个实施方案中，静脉内、皮下或肌肉内向受试者施用包含至少约5、或最少约10、或最少约25、或最少约100、或最少约200nmol/kg该融合蛋白的药物组合物导致融合蛋白血液水平在1000ng/ml以上维持至少72小时。在本段的前述实施方案中，所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowelsyndrome)、盲管(cul-de-sac)综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎和胃肠缺血。在本段的前述实施方案中，该受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据任一本文所述的实施方案的GLP2-XTEN融合蛋白，其用于制备治疗本文所述的胃肠病症的药物。
本发明提供了在一种治疗受试者胃肠病症的方法中使用的、根据任一本文所述的实施方案的GLP2-XTEN融合蛋白，该方法包括向受试者施用治疗有效量的该融合蛋白。在一个实施方案中，所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowel syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎和胃肠缺血。在一种治疗受试者胃肠病症的方法中使用的融合蛋白的另一个实施方案中，采用治疗有效剂量方案向受试者施用两个或更多个连续剂量的该融合蛋白导致，与缺少XTEN并采用为GLP-2所确立的治疗有效剂量方案施用的相应GLP-2相比，融合蛋白血液水平的连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间延长。在一种治疗受试者胃肠病症的方法中使用的融合蛋白的另一个实施方案中，向受试者施用较小量(以nmol/kg表示)的该融合蛋白，与缺少XTEN的相应GLP-2(当在其他等效剂量方案下向受试者施用时)相比，导致该融合蛋白达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果。以上，所述治疗效果选自GLP-2的血液浓度、肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、提高或刺激粘膜完整性、钠损失减少、减轻或预防肠道内的细菌移位或使其最小化、增强、激活或加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。
本发明提供了在治疗受试者胃肠病症的药物方案中使用的、根据任一本文所述的实施方案的GLP2-XTEN融合蛋白。在一个实施方案中，该药物方案包括含有该GLP2-XTEN融合蛋白的药物组合物。在另一个实施方案中，该药物方案进一步包括测定在受试者中达到治疗效果所需的药物组合物的量的步骤，其中所述治疗效果选自肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、粘膜完整性增强、钠损失减少、预防肠道内的细菌移位、加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。在另一个实施方案中，该药物方案包括以有效量向受试者施用两个或更多个逐次剂量的药物组合物，其中所述施用导致至少一个、两个或三个与胃肠病症相关的参数的提高，较之未与XTEN相连接、并采用可比的nmol/kg的量施用的GLP-2，大至少5％，或10％，或20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％或90％。在前述的一个实施方案中，所述提高的参数选自GLP-2的血液浓度增加、肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、粘膜完整性增强、钠损失减少、预防肠道内的细菌移位、加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。在另一个实施方案中，该药物方案包括每7天、或10天、或14天、或21天、或28天或更多天施用一次治疗有效量的该药物组合物。在前述的一个实施方案中，所述有效量为至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。在该方案的实施方案中，所述施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。
本发明提供了治疗受试者胃肠病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向所述受试者施用包含有效量的药物组合物的组合物，该药物组合物包含本文所述的GLP2-XTEN融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，所述有效量为至少至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。在该方法的另一个实施方案中，该药物组合物的施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。在该方法的另一个实施方案中，该有效量的施用导致该融合蛋白在受试者中展现出大于约30小时的终末半衰期，其中该受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在前述的实施方案中，所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowel syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎和胃肠缺血。在该方法的另一个实施方案中，该方法用于治疗患有因化学治疗剂导致的小肠损伤的受试者，该化学治疗剂诸如但不限于5-FU、六甲蜜胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、多柔比星脂质体、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链佐星、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鸟嘌呤(tioguanine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、拓扑替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。在该方法的另一个实施方案中，该药物组合物的施用在所述受试者中导致肠营养效应。在该方法的又另一个实施方案中，该药物组合物的施用在所述受试者中导致肠营养效应，其中该肠营养效应，与未与XTEN相连接的并且采用可比的剂量向受试者施用的相应GLP-2相比，是其肠营养效应的至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约100％，或至少约120％，或至少约150％或至少约200％。在前述的一个实施方案中，在施用完1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的融合蛋白之后确定肠营养效应。在前述的另一个实施方案中，该肠营养效应选自肠营养效应选自肠生长、绒毛上皮增生增加、隐窝细胞增殖增加、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后的愈合增加、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡减少和肠功能增强。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含包装材料和含有包含本文所述的GLP2-XTEN融合蛋白的药物组合物的至少第一容器，以及一张关于重建该药物组合物和/或向受试者施用该药物组合物的说明书。
以下是本发明非限制的示例性实施方案：
第1项 一种包含胰高血糖素样蛋白-2(GLP-2)和延伸的重组多肽(XTEN)的重组融合蛋白，其中所述XTEN的特征在于：
(a)所述XTEN包含至少36个氨基酸残基；
(b)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的超过约80％；
(c)所述XTEN基本上是非重复性的，使得(i)所述XTEN不含三个连续的相同氨基酸，除非所述氨基酸是丝氨酸；(ii)所述XTEN序列的至少约80％由非重叠序列基序组成，所述序列基序中的每一个包含约9个至约14个由四种至六种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个非重叠序列基序中出现不会超过两次；或(iii)所述XTEN序列的子序列评分小于10；
(d)如通过GOR算法所确定的，所述XTEN具有超过90％的无规卷曲形成；
(e)如通过Chou-Fasman算法所确定的，所述XTEN具有少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；和
(f)当通过TEPITOPE算法分析时，所述XTEN缺乏预测的T细胞表位，其中通过所述算法进行的所述预测的TEPITOPE阈值评分的阈值为-9，
其中所述融合蛋白展现出至少约为4的表观分子量因子，并且当采用治疗有效量向受试者施用时，展现出肠营养效应。
第2项 如第1项所述的重组融合蛋白，其中所述肠内营养效应与未与XTEN相连接的相应GLP-2当采用可比剂量向受试者施用相应GLP-2时相比，是其肠营养效应的至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约100％，或至少约120％，或至少约150％，或至少约200％。
第3项 如第1项所述的重组融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
第4项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述施用是皮下、肌肉内或静脉内施用。
第5项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中在施用1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的所述融合蛋白后确定所述肠营养效应。
第6项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述肠营养效应选自肠生长、绒毛上皮增生增加、隐窝细胞增殖增加、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后的愈合增加、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡减少和肠功能增强。
第7项 如第6项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠重量增加至少约10％，或至少约20％，或至少约30％。
第8项 如第6项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠长度增加至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％。
第9项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当进行最佳比对时，所述GLP-2序列与选自表1中序列的序列有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性。
第10项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2包括人GLP-2。
第11项 如第9项-第11项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2选自牛GLP-2、猪GLP-2、羊GLP-2、鸡GLP-2和犬GLP-2。
第12项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2具有取代Ala2的氨基酸置换，并且其中所述置换是甘氨酸。
第13项 如第1项-第9项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTK ITD。
第14项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述XTEN与所述GLP-2的C端相连接。
第15项 如第14项所述的重组融合蛋白，其进一步包含连接所述GLP-2和XTEN组分的、1个至约50个氨基酸残基的间隔区序列。
第16项 如第15项所述的重组融合蛋白，其中所述间隔区序列是甘氨酸残基。
第17项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述XTEN的特征在于：
(a)总XTEN氨基酸残基为至少36个至约3000个氨基酸残基；和(b)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的至少约90％；
第18项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述XTEN的特征在于天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的10％。
第19项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述XTEN的特征在于甲硫氨酸和色氨酸残基的总和小于所述XTEN总氨基酸序列的2％。
第20项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当进行最佳比对时，所述XTEN与选自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列相比具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或约100％的序列同一性。
第21项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当进行最佳比对时，所述XTEN当与来自表4的AE864序列相比具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或约100％的序列同一性。
第22项 如第1项-第9项中的任一项或第13项所述的重组融合蛋白，其中所述融合蛋白序列具有的序列与图28中所示的序列有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性。
第23项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当向受试者施用时，所述融合蛋白展现出为至少约30小时的终末半衰期。
第24项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当采用体外GLP2R细胞试验分析时，所述融合蛋白以小于约30nM、或约100nM、或约200nM、或约300nM、或约370nM、或约400nM、或约500nM、或约600nM、或约700nM、或约800nM、或约1000nM、或约1200nM、或约1400nM的EC50与GLP-2受体结合，其中所述GLP2R细胞是人重组GLP-2胰高血糖素家族受体钙优化的细胞。
第25项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当采用体外GLP2R细胞试验进行分析时，所述融合蛋白保留未与XTEN相连接的相应GLP-2的效力的至少约1％，或约2％，或约3％，或约4％，或约5％，或约10％，或约20％，或约30％，其中所述GLP2R细胞是人重组GLP-2胰高血糖素家族受体钙优化的细胞。
第26项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于
(a)当以nmol/kg为单位的等效量的融合蛋白和缺少XTEN的相应GLP-2各自向可比的受试者施用时，所述融合蛋白在所述受试者中达到的终末半衰期与缺少XTEN的相应GLP-2相比长至少约3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20倍；
(b)当所述融合蛋白以比缺少XTEN的相应GLP-2少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍的以nmol/kg为单位的量各自向患有胃肠病症的可比受试者施用时，所述融合蛋白在所述受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果；
(c)当采用给药间隔以连续剂量向受试者施用所述融合蛋白时，所述给药间隔与缺少XTEN并采用等效的nmol/kg量向可比受试者施用的相应GLP-2的给药间隔相比长至少约2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，所述融合蛋白在所述受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2相比相似的血液浓度；或
(d)当采用给药间隔以连续剂量向受试者施用所述融合蛋白时，所述给药间隔与缺少XTEN并采用等效的nmol/kg量向可比受试者施用的相应GLP-2的给药间隔相比长至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，所述融合蛋白在所述受试者中达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果。
第27项 如第26项所述的重组融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
第28项 如第27项所述的重组融合蛋白，其中所述受试者是大鼠。
第29项 如第26项-第28项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致与使用未与XTEN相连接的相应GLP-2所观察到的效果相比更强的治疗效果。
第30项 如第26项-第29项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中有效量的所述融合蛋白的施用在患肠炎的受试者中导致与未与XTEN相连接的相应GLP-2当采用可比的nmol/kg量向可比受试者施用相应GLP-2时相比更强的治疗效果。
第31项 如所述的重组融合蛋白第26项-第30项中的任一项，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
第32项 如第31项所述的重组融合蛋白，其中所述受试者是人，并且所述肠炎是克罗恩病。
第33项 如第31项所述的重组融合蛋白，其中所述受试者是大鼠受试对象，并且所述肠炎是由吲哚美辛诱发的。
第34项 如第29项-第33项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述更强的治疗效果选自体重增加、小肠长度、小肠组织的TNFα含量降低、粘膜萎缩减少、穿孔性溃疡的发病率降低和绒毛高度。
第35项 如第34项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠重量增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％。
第36项 如第34项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠长度增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％。
第37项 如第34项所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致体重增加，其与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％。
第38项 如第34项所述的重组融合蛋白，其中所述小肠组织TNFα含量的降低与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约0.5ng/g，或至少约0.6ng/g，或至少约0.7ng/g，或至少约0.8ng/g，或至少约0.9ng/g，或至少约1.0ng/g，或至少约1.1ng/g，或至少约1.2ng/g，或至少约1.3ng/g，或至少约1.4ng/g小肠组织或更高。
第39项 如第34项所述的重组融合蛋白，其中所述绒毛高度与未与XTEN相连接的相应GLP-2相比大至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约11％，或至少约12％。
第40项 如第29项-第39项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述融合蛋白以1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、12个或更多个连续剂量施用。
第41项 如第30项-第40项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述有效量为至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。
第42项 如前述项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2通过裂解序列与所述XTEN相连接，所述裂解序列能被选自因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20的哺乳动物蛋白酶所切割，其中所述哺乳动物蛋白酶对所述裂解序列的切割使所述GLP-2序列从所述XTEN序列中释放出来，并且其中所释放的GLP-2序列与未切割的融合蛋白相比展现出至少约30％的受体结合活性增加。
第43项 一种生产包含融合到一个或多个延伸的重组多肽(XTEN)上的GLP-2的融合蛋白的方法，其包括：
(a)提供包含编码如第1至42项中任一项所述的融合蛋白的重组核酸的宿主细胞；
(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和
(c)回收所述融合蛋白。
第44项 如第43项所述的方法，其中：
(a)所述宿主细胞是原核细胞；或
(b)所述融合蛋白是从所述宿主细胞胞质中以基本上可溶的形式回收的。
第45项 如第43项所述的方法，其中所述重组核酸分子具有当进行最佳比对时与选自表13所示的DNA序列的序列有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或约100％序列同一性的序列，或其互补体。
第46项 一种分离的核酸，其包含：
(a)与选自表13的DNA序列有至少70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或约100％序列同一性的核酸序列，或其互补体；或
(b)编码第1至42项中的任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列，或其互补体。
第47项 一种表达载体或分离的宿主细胞，其包含如第43项-第46项中的任一项所述的核酸。
第46项
第48项 一种宿主细胞，其包含如第47项所述的表达载体。
第49项 一种药物组合物，其包含如第1项-第41项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
第50项 如第1项所述的重组融合蛋白，其根据式V配置：
(a)(GLP-2)-(S)x-(XTEN) (V)
其中对于每次出现独立地，
(b)GLP-2是当进行最佳比对时，与选自表1中序列的序列有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或约100％序列同一性的序列；
(c)S是间隔区序列，其具有1个至约50个氨基酸残基，能够任选地包括与限制性位点相容的来自表6的裂解序列或氨基酸；且
x为0或1。
第51项 如第50项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2包括人GLP-2。
第52项 如第50项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2选自牛GLP-2、猪GLP-2、羊GLP-2、鸡GLP-2和犬GLP-2。
第53项 如第51项或第52项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2具有取代Ala2的氨基酸置换，并且其中所述置换是甘氨酸。
第54项 如第50项所述的重组融合蛋白，其中所述GLP-2具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。
第55项 如第50项-第54项中的任一项所述的重组融合蛋白，其包含间隔区序列，其中所述间隔区序列包含甘氨酸残基。
第56项 如第50项-第55项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当最佳比对时，所述XTEN与选自表4、表8、表9、表10、表11和表12中的任一个的、具有可比长度的序列相比，具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性。
第57项 如第50项-第55项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当最佳比对时，所述XTEN与来自表4的AE864序列相比具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性。
第58项 如第49项所述的药物组合物，其中向患有胃肠病症的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物导致在所述融合蛋白的治疗窗内维持所述融合蛋白血液浓度的时间与施用未与XTEN相连接并以可比量向受试者施用的相应GLP-2相比至少长三倍。
第59项 如第49项所述的药物组合物，其中采用治疗有效剂量方案向患有胃肠病症的受试者施用三剂或更多剂的所述药物组合物导致融合蛋白血液水平的至少两个连续的Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加，与施用未与XTEN相连接并采用可比剂量方案向受试者施用的相应GLP-2相比增加至少四倍。
第60项 如第59项或第60项所述的药物组合物，其中所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowelsyndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎和胃肠缺血。
第61项 如第49项所述的药物组合物，其中在向受试者静脉内、皮下或肌肉内施用包含至少约5、或最少约10、或最少约25、或最少约100、或最少约200nmol/kg所述融合蛋白的所述药物组合物之后，所述融合蛋白的血液水平在1000ng/ml以上维持至少72小时。
第62项 如第61项所述的药物组合物，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
第63项 一种根据第1项-第41项中的任一项所述的重组融合蛋白，其用于制备治疗胃肠病症的药物。
第64项 如第63项所述的重组融合蛋白其中所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowel syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎、缺血和中风。
第65项 一种根据第1项-第41项中的任一项所述的重组融合蛋白，其用于治疗受试者的胃肠病症的方法中，包括向受试者施用治疗有效量的所述融合蛋白。
第66项 根据第65项使用的所述重组融合蛋白，其中所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowelsyndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎、缺血和中风。
第67项 根据第65项使用的所述重组融合蛋白，其中采用治疗有效剂量方案向受试者施用两个或更多个连续剂量的所述融合蛋白导致与缺少XTEN并采用为GLP-2所确立的治疗有效剂量方案施用的相应GLP-2相比，融合蛋白血液水平的连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间延长。
第68项 根据第65项使用的所述重组融合蛋白，其中与按照等效的剂量方案向受试者施用的缺少XTEN的相应GLP-2相比，向受试者施用以nmol/kg为单位的较小量的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应GLP-2可比的治疗效果。
第69项 根据第68项使用的所述重组融合蛋白，其中所述治疗效果选自GLP-2的血液浓度、肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、提高或刺激粘膜完整性、钠损失减少、减轻或预防肠道内的细菌移位或使其最小化、增强、激活或加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。
第70项 一种在治疗受试者胃肠病症的药物方案中使用的重组融合蛋白，所述方案包括含有如第1项-第41项中的任一项所述的融合蛋白的药物组合物。
第71项 如第70项所述的重组融合蛋白，其中所述药物方案进一步包括确定在受试者中达到治疗效果所需的药物组合物的量的步骤，其中所述治疗效果选自肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、粘膜完整性增强、钠损失减少、预防肠道内的细菌移位、加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。
第72项 如第70项所述的重组融合蛋白，其中所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowelsyndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎、缺血和中风。
第73项 如第70项所述的重组融合蛋白，其中用于治疗患有胃肠病症的受试者的所述药物方案包括以有效量向受试者施用两个或更多个连续剂量的药物组合物，其中所述施用导致至少一个、两个或三个与胃肠病症相关的参数的改善，与未与XTEN相连接并采用可比的nmol/kg量施用的GLP-2相比，所述改善大至少5％，或10％，或20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％，或90％。
第74项 如第73项所述的重组融合蛋白，其中所述改善的参数选自GLP-2的血液浓度增加、肠系膜血流量增加、炎症减少、增重增加、腹泻减少、粪便湿重减少、肠创伤愈合、血浆瓜氨酸浓度增加、CRP水平降低、对甾类激素治疗的需要减少、粘膜完整性增强、钠损失减少、预防肠道内的细菌移位、加速手术后肠道的恢复、预防炎性肠病的复发和维持能量稳态。
第75项 如第70项所述的重组融合蛋白，其中所述疗法包括每7天、或10天、或14天、或21天、或28天或更多天施用一次治疗有效量的如第49项所述的药物组合物。
第76项 如第75项所述的重组融合蛋白，其中所述有效量为至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。
第77项 如第73项-第76项中的任一项所述的重组融合蛋白，其中所述施用是皮下、肌肉内或静脉内施用。
第78项 一种治疗受试者胃肠病症的方法，其包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含有效量的如第49项所述的药物组合物。
第79项 如第78项所述的方法，其中所述有效量为至少约5，或最少约10，或最少约25，或最少约100，或最少约200nmol/kg。
第80项 如第79项所述的方法，其中所述融合蛋白在所述受试者中展现出大于约30小时的终末半衰期。
第81项 如第78项-第80项中的任一项所述的方法，其中所述胃肠病症选自胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowelsyndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、因癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖症、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖症、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖症、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID诱发的胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎、缺血和中风。
第82项 如第81项所述的方法，其中所述胃肠病症是克罗恩病。
第83项 如第78项-第82项中的任一项所述的方法，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
第84项如第78项-第83项中的任一项所述的方法，其中所述施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。
第85项 如第78项-第84项中的任一项所述的方法，其中所述施用在所述受试者中导致肠营养效应。
第86项 如第85项所述的方法，其中所述肠营养效应与未与XTEN相连接并采用可比的剂量向受试者施用的相应GLP-2相比，是其肠营养效应的至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约100％，或至少约120％，或至少约150％，或至少约200％。
第87项 如第85项或第86项所述的方法，其中在施用1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的所述融合蛋白后确定肠营养效应。
第88项 如所述的方法第85项-第87项中的任一项所述的方法，其中所述肠营养效应选自肠生长、绒毛上皮增生增加、隐窝细胞增殖增加、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后的愈合增加、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡减少和肠功能增强。
具体涉及的是，重组GLP2-XTEN融合蛋白可以展现出一种或多种本文所公开的性质或其任意组合。
援引并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确且单独地被指明而通过引用的方式并入。
附图说明
本发明的特征和优势可以参考以下详述和阐述示例性实施方案的附图来进一步解释。
图1是SegScore算法逻辑流程图的示意图。在该图中使用下面的图例：I、J——在贯穿整个序列的控制回路中使用的计数器；HitCount——此变量是追踪子序列在区组(block)内遇到相同的子序列多少次的计数器；SubSeqX——此变量代表正在检查冗余度的子序列；SubSeqY——此变量代表针对其检查SubSeqX的子序列；BlockLen——此变量代表用户确定的区组长度；SegLen——此变量代表区段的长度。对该程序进行硬编码以对长度为3、4、5、6、7、8、9和10的子序列生成评分；Block——此变量代表长度为BlockLen的字串。该字串由来自输入XTEN序列的字母组成，并且由i计数器的位置来确定；SubSeqList——这是保存所有生成的子序列评分的列表。
图2示出了为了确定重复性而对具有11个氨基酸的假设XTEN应用SegScore算法。将由N个氨基酸组成的XTEN序列分成N-S+1个长度为S(在这种情况下S＝3)的子序列。对所有子序列进行成对比较，并计算相同子序列的平均数，在这种情况下得到的子序列评分为1.89。
图3示出了使用供体XTEN序列生成截短的XTEN序列。图3A提供了AG864的序列，其中下划线的序列用于生成AG576序列。图3B提供了AG864的序列，其中下划线的序列用于生成AG288序列。图3C提供了AG864的序列，其中下划线的序列用于生成AG144序列。图3D提供了AE864的序列，其中下划线的序列用于生成AE576序列。图3E提供了AE864的序列，其中下划线的序列用于生成AE288序列。
图4是XTEN的组装、生产和评估中的代表性步骤的示意流程图。
图5是编码融合蛋白的GLP2-XTEN多核苷酸构建体的组装中代表性步骤的示意流程图。将单个寡核苷酸501退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其与来自文库的其他序列基序连接以生成包含期望长度的XTEN 504的集合体(pool)，并且也与较小浓度的含有BbsI和KpnI限制位点的寡核苷酸503连接。凝胶纯化所得的连接产物集合体，切下含有期望长度的XTEN的条带，得到分离的含有塞序列(stopper sequence)的XTEN基因505。将XTEN基因克隆到填充载体(stuffer vector)。在这种情况下，该载体编码任选的CBD序列506和GFP基因508。然后用BbsI/HindIII进行消化以除去507和508并放置终止密码子。然后将所得产物克隆到经BsaI/HindIII消化的、含有GLP-2编码基因的载体内，得到编码GLP2-XTEN融合蛋白的基因500。
图6是在编码包含GLP-2和XTEN的融合蛋白的基因的组装、其表达和作为融合蛋白回收、及其作为候选GLP2-XTEN产物评估中代表性步骤的示意流程图。
图7示出了全部以N端至C端方向显示的示例性GLP2-XTEN融合蛋白(图7A-H)的示意图。图7A示出GLP2-XTEN融合蛋白(100)的两种不同构型，每种构型包含单个GLP-2和XTEN，第一种构型具有与GLP-2(103)的C端连接的XTEN分子(102)，而第二种构型具有与GLP-2(103)的N端连接的XTEN分子。图7B示出GLP2-XTEN融合蛋白(100)的两种不同构型，每种构型包括单个GLP-2、间隔区序列和XTEN，第一种构型具有与间隔区序列(104)的C端连接的XTEN分子(102)和与GLP-2(103)的C端连接的间隔区序列，而第二种构型具有与间隔区序列(104)的N端连接的XTEN分子和与GLP-2(103)的N端连接的间隔区序列(104)。图7C示出GLP2-XTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包含两个分子的单一GLP-2和一个分子的XTEN，第一种构型具有与第一GLP-2的C端连接的XTEN并且第一GLP-2与第二GLP-2的C端连接，而第二种构型处于相反方向，其中XTEN连接至第一GLP-2的N端并且该第一GLP-2连接至第二GLP-2的N端。图7D示出GLP2-XTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包含两个分子的单一GLP-2、间隔区序列和一个分子的XTEN，第一种构型具有与间隔区序列的C端连接的XTEN和与第一GLP-2的C端连接的间隔区序列并且第一GLP-2与第二GLP-2的C端连接，而第二种构型处于相反方向，其中XTEN与间隔区序列的N端连接并且间隔区序列与第一GLP-2的N端连接并且第一GLP-2与第二GLP-2的N端连接。图7E示出GLP2-XTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包括两个分子的单一GLP-2、间隔区序列和一个分子的XTEN，第一种构型具有与第一GLP-2的C端连接的XTEN和与间隔区序列的C端连接的第一GLP-2并且间隔区序列与第二GLP-2分子的C端连接，而第二种构型处于相反构型，XTEN与第一GLP-2的N端连接，第一GLP-2与间隔区序列的N端连接，而间隔区序列与第二GLP-2分子的N端连接。图7F示出GLP2-XTEN融合蛋白(105)的构型，每种构型包含一个分子的GLP-2和与该GLP-2的N端和C端连接的两个分子的XTEN。图7G示出与两个XTEN连接的单个GLP-2的构型(106)，第二XTEN通过间隔区序列与GLP-2分开。图7H是与两个XTEN连接的两个GLP-2的构型(106)，其中第二XTEN与第一GLP-2的C端和第二GLP-2的N端连接，第二GLP-2在GLP2-XTEN的C端。
图8是编码图7的相应GLP2-XTEN多肽的GLP2-XTEN基因的示例性多核苷酸构建体(图8A-H)的示意图；全部以5'至3'的方向示出。在这些说明性实例中，所述基因编码GLP2-XTEN融合蛋白，该GLP2-XTEN融合蛋白具有一个GLP-2和XTEN(200)；或一个GLP-2、一个间隔区序列和一个XTEN(200)；两个GLP-2和一个XTEN(201)；或两个GLP-2、间隔区序列和一个XTEN(201)；一个GLP-2和两个XTEN(205)；或两个GLP-2和两个XTEN(206)。在这些图示中，多核苷酸编码以下组分：XTEN(202)、GLP-2(203)和可以包含裂解序列的间隔区氨基酸(204)，所有序列在框内连接。
图9是使用不同的加工策略设计GLP2-XTEN表达载体的示意图。图9A示出编码与GLP-2编码序列3'端融合的XTEN的示例性表达载体。注意，该载体中不需要额外的前导序列。图9B示出了编码与GLP-2编码序列3'端融合的XTEN的表达载体，其具有CBD前导序列和TEV蛋白酶位点。图9C示出了CBD和TEV加工位点已被优化的N端前导序列(NTS)所替代的表达载体。图9D示出了编码NTS序列、XTEN、GLP-2编码序列和第二个XTEN编码序列的表达载体。
图10示出了XTEN编码基因的组合基因组装的过程。在这种情况下，该基因由6个碱基片段组装，并且每个片段能以4个不同的密码子形式(A、B、C和D)获得。这允许在组装12氨基酸基序中有4096的理论多样性。
图11示出了融合蛋白GLP2-2G_AE864的表征数据。图11A是GLP2-2G-XTEN_AE864批号AP690的SDS-PAGE凝胶，如实施例16中所述。如图所示，该凝胶示出了分子量标准的泳道和2或10μg参照标准品的泳道。图11B示出了GLP2-2G-XTEN_AE864批号AP690与667、167、44、17和3.5kDa的分子量标准相比的尺寸排阻色谱分析的结果，如实施例16中所述。
图12示出了GLP2-2G-XTEN_AE864批号AP690的ESI-MS分析，如实施例16中所述，主峰在83,142Da，指示全长完整GLP2-2G-XTEN，检测到83,003Da的其他小峰，这表示脱His的GLP2-2G-XTEN占全部蛋白质的<5％。
图13示出了GLP-2受体结合试验的结果，如实施例17中所述。
图14示出了GLP2-2G-XTEN_AE864在C57Bl/6小鼠中皮下(SC)施用后的药代动力学结果。如实施例18中所述，采用抗XTEN/抗XTEN夹心ELISA和抗GLP2/抗XTEN夹心ELISA二者对样品进行融合蛋白浓度分析，对两个试验的结果均作图。
图15示出了GLP2-2G-XTEN_AE864在Wistar大鼠中以两个不同剂量水平皮下施用后的药代动力学结果，这是采用抗XTEN/抗XTEN夹心ELISA和抗GLP2/抗XTEN夹心ELISA二者进行的，如实施例19中所述，对两个试验的结果均作图。
图16示出了GLP2-2G-XTEN_AE864在雄性食蟹猴中以单个剂量水平(2mg/kg)皮下(正方形)或静脉内(三角形)施用融合蛋白后的药代动力学结果。如实施例20中所述，采用抗GLP2/抗XTEN ELISA对样品进行融合蛋白浓度分析。
图17示出了来自三个物种的GLP2-2G-XTEN半衰期的异速增长定标的线性回归，其用于预测人类中240小时的投影半衰期，如实施例20中所述。
图18示出了来自载体组和治疗组的大鼠小肠重量和长度的结果，如实施例21中所述。
图19示出了葡聚糖硫酸钠(DSS)鼠模型中体重变化的结果，各组用载体、GLP2-2G肽(无XTEN)或GLP2-2G-XTEN处理，如实施例21中所述。
图20示出了来自载体回肠(图20A)和空肠(图20B)以及GLP2-2G-XTEN回肠(图20C)和空肠(图20D)组的DSS模型小鼠的代表性组织病理学切片，如实施例21中所述。
图21示出了吲哚美辛诱导型肠炎的克罗恩病的大鼠模型的第1项研究的结果，其中各组用载体、GLP2-2G肽(无XTEN)或GLP2-2G-XTEN处理并进行分析，如实施例21中所述。图21A示出了实验结束时的体重结果。图21B示出了各组小肠长度的结果。图21C示出了各组小肠重量的结果。图21D示出了各组小肠溃疡形成长度和溃疡形成百分比的结果。图21E示出了各组小肠粘连和横贯溃疡形成(transulceration)评分的结果。图21F示出了各组小肠长度和炎症百分比的结果。图21G示出了各组小肠的TNFα试验的结果。
图22示出了吲哚美辛诱导型肠炎的克罗恩病的大鼠模型的第2项研究的结果，其中各组用载体、GLP2-2G肽(无XTEN)或GLP2-2G-XTEN处理并进行分析，如实施例21中所述。图22A示出了各组小肠的横贯溃疡形成评分。图22B示出了各组小肠的粘连评分。
图23示出了在吲哚美辛诱导型肠炎的克罗恩病的大鼠模型的第2项研究中，来自载体-无吲哚美辛(图23A)、载体-吲哚美辛(图23B)和GLP2-2G-XTEN处理组(图22C和D)的代表性组织病理学切片，如实施例21中所述。
图24示出了患病的、经载体处理的、经GLP2-2G肽处理的和经GLP2-2G-XTEN处理的大鼠中，小肠长度(图24A)、绒毛高度(图24B)和粘膜萎缩、溃疡形成和浸润测量值的组织病理学评分(图24C)的结果，如实施例21中所述。星号表示与载体(患病)对照组有统计学显著差异的组。
图25示出了胰高血糖素-XTEN构建体样品相对于具有已知分子量的蛋白质标准品(标出的)所测量的尺寸排阻色谱分析结果，图形输出是吸光度对保留体积，如实施例25中所述。胰高血糖素-XTEN构建体是1)胰高血糖素-Y288；2)胰高血糖素Y-144；3)胰高血糖素-Y72；和4)胰高血糖素-Y36。结果表明表观分子量随着XTEN部分长度的增加而增加。
图26示出了，如实施例26所述，在食蟹猴中皮下或静脉内施用单剂量的与不同长度的非结构化多肽相连接的GFP的不同组合物之后的药代动力学曲线(血浆浓度)。该组合物是GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576和XTEN_AD836-GFP。注射后在不同的时间对血液样品进行分析，并采用用于捕获的抗GFP多克隆抗体和用于检测的相同多克隆抗体的生物素化制剂，通过ELISA测定血浆中GFP的浓度。结果呈现为血浆浓度对给药后的时间(小时)，并且显示特别是XTEN_AD836-GFP的半衰期大大增加，该组合物具有最长的XTEN序列长度。最短序列长度的构建体GFP-L288具有最短的半衰期。
图27示出了来自XTEN_AE864融合至GFP的N端的融合蛋白的稳定性研究的样品的SDS-PAGE凝胶(参见实施例27)。GFP-XTEN在食蟹猴血浆和大鼠肾裂解物中37℃孵育长达7天。另外，还对向食蟹猴施用的GFP-XTEN进行评估。在第0天、第1天和第7天抽取样品，并用SDS-PAGE进行分析，随后通过采用抗GFP抗体的Western分析进行检测。
图28示出了GLP2-2G_AE864的氨基酸序列。
发明详述
在描述本发明实施方案之前，应当理解，这些实施方案仅作为例子提供，并且可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本领技术人员现在将可以想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。冲突时，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是示例说明性的而不旨在限制。本领技术人员现在会想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
定义
除非另外规定，在本申请的上下文中，以下术语具有属于它们的含义。
除非上下文另外清楚地指明，说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其间可以插入非氨基酸。这些术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(例如与标记组分偶联)而修饰的氨基酸聚合物。
本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单字母或三字母密码指定氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式：甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
应用于序列并在本文使用的术语“非天然存在的”指没有哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补、或与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共享不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”指物质具有的与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和力，易于溶解于水、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本缺乏对水的亲和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可以根据其疏水性来表征。已经发展了许多量表。一个实例是由Levitt,M等,J Mol Biol(1976)104:59发展的量表，其在Hopp,TP等,Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中列出。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别关注的亲水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”，当用于蛋白质时，是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式。“变体”，当用于蛋白质时，是与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，保留了生物活性蛋白的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，变体蛋白质与参考生物活性蛋白质相比可以共享至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白质部分”包括例如通过定点诱变、编码基因合成、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰的蛋白质。
术语“序列变体”意指与其天然或原始序列相比已经通过一个或多个氨基酸插入、删除或置换而修饰的多肽。插入可能位于蛋白质的一个末端或两个末端，和/或可能定位于氨基酸序列的内部区域之内。一个非限制性的实例是XTEN序列在生物活性有效负载蛋白质序列内的插入。在缺失变体中，本文所述的多肽中的一个或多个氨基酸残基被去除。因此，缺失变体包括有效负载多肽序列的所有片段。在置换变体中，多肽的一个或多个氨基酸残基被去除而替换成其他残基。在一个方面，置换在本质上是保守的，并且这类型的保守置换是本领域熟知的。
如本文使用的“内部XTEN”是指已插入GLP-2序列内的XTEN序列。内部XTEN可以通过将XTEN序列插入GLP-2序列的两个相邻氨基酸之间而构建，或者其中XTEN取代GLP-2的一部分内部序列。
如本文使用的“末端XTEN”是指已融合至GLP-2的N端或C端之上或之中或融合至位于GLP-2的N端或C端的蛋白水解切割序列的XTEN序列。末端XTEN可融合至GLP-2的天然末端。或者，末端XTEN可以取代GLP-2的末端序列。
术语“XTEN释放位点”是指GLP2-XTEN融合蛋白中可以被哺乳动物蛋白酶所识别并切割，从而实现从该GLP2-XTEN融合蛋白中释放XTEN或一部分XTEN的裂解序列。如本文所用，“哺乳动物蛋白酶”意指通常存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可以被工程化成能被各种哺乳动物蛋白酶(又被称为“XTEN释放蛋白酶”)所切割，该蛋白酶例如是FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、FXa、FIIA(凝血酶)、弹性酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP-20，或任何存在于受试者中接近该融合蛋白的蛋白酶。可以使用其他能够识别限定的切割位点的等效蛋白酶(内源性的或外源性的)。切割位点可以根据所使用的蛋白酶来调整和定制。
术语“以内”，当提及与第二多肽相连接的第一多肽时，包括分别将第一或第二多肽的N端连接至第二或第一多肽的C端的连接，还包括第一多肽向第二多肽的序列中的插入。例如，当XTEN在GLP-2多肽“之内”连接时，该XTEN可与GLP-2多肽的N端或C端相连接，或者可在GLP-2多肽的任何两个氨基酸之间插入。
用于本文目的的“活性”是指融合蛋白组分的作用或效果，其与融合蛋白相应的天然生物活性蛋白质组分的作用或效果一致，其中“生物活性”是指体外或体内的生物学功能或效果，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性、细胞或生理反应或本领域公知的有效负载GLP-2的效果。
如本文使用的术语“ELISA”是指如本文所述的或本领域已知的酶联免疫吸附试验。
“宿主细胞”包括可以是或已经是主题载体的受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然、意外或有意的突变，后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或者总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的掺杂组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。对于本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的对应物区别开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在对应物相区别，因为浓度或每体积的分子数目一般大于其天然存在的对应物。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的”核酸是从所述核酸的天然来源中正常伴随的至少一种掺杂核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子。例如，分离的多肽编码核酸不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的多肽编码核酸分子与天然细胞中存在的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括正常表达所述多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，此时，例如，核酸分子处于不同于天然细胞核酸分子的染色体内或者染色体外位置。
“嵌合”蛋白含有至少一个融合多肽，其包含至少一个与天然存在的位置不同的序列位置的区域。所述区域可以正常存在于不同的蛋白质中并且在融合多肽中聚集在一起；或者它们可以正常存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中处于新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或者通过产生并翻译其中肽区域以期望的关系编码的多核苷酸来产生。
“偶联的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可互换使用。这些术语指通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方式使两个或多个化学元素、序列或组分结合在一起。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列是有效连接的。一般而言，“有效连接”表示被连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或框内。“框内融合”指两个或多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF正确阅读框的方式结合形成连续更长的ORF。因此，得到的重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个区段的单个蛋白质(所述区段在自然中通常不会如此连接)。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，序列中彼此邻接的残基在多肽一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
“异源的”意指衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。例如，从其天然编码序列中取出并有效连接至不同于天然序列的编码序列的富含甘氨酸序列是异源的富含甘氨酸序列。术语“异源的”当应用于多核苷酸、多肽时是指所述多核苷酸或多肽衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分偶联。
术语“多核苷酸的互补体”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互补体可以与参考序列杂交，而具有完全保真性。
“重组的”当应用于多核苷酸时意指该多核苷酸是重组步骤的各种组合的产物，所述重组步骤可包括克隆、限制性消化和/或连接步骤以及导致重组蛋白在宿主细胞中表达的其他程序。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们指含有能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以涵盖整体编码区或其区段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因。
“同源性”或“同源的”或“序列同一性”指两个或多个多核苷酸序列之间的或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用例如BestFit等程序来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80来优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些序列，并且与那些序列相比具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％和甚至更优选99％的序列同一性。同源的多肽优选具有至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95-99％、最优选100％相同的序列同一性。
“连接”指在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键而使它们连接在一起的过程。为了使DNA片段或基因连接在一起，DNA末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后即是相容的。然而，可能必须首先将通常由核酸内切酶消化后产生的交错末端转化成平末端以使它们适合连接。
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括提及多核苷酸将以比其他序列可检测地更大程度(例如，超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。一般而言，杂交的严格性部分地以进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是如下条件：其中pH 7.0至8.3下的盐浓度小于约1.5M Na离子、通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短的多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30℃并且对于长的多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃—例如，“严格的条件”可以包括在37℃下50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，以及在0.1×SSC/1％SDS中于60℃下至65℃下三次洗涤，每次15分钟。备选地，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1至2×SSC不等，其中SDS以约0.1％存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和pH下特定序列的热力学熔点低约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见Sambrook,J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的经剪切和变性的鲑精DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50％v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
术语“百分同一性”、“序列同一性百分比”和“％同一性”在应用于多核苷酸序列时是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这样的算法可以以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以在整个确定的多核苷酸序列的长度上测量百分同一性，或者可以在较短长度上，例如在获自较大的确定的多核苷酸序列的片段长度上测量百分同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文在表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可测量百分同一性的长度。序列同一性百分比如下计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定匹配位置的数目(此处在两个多肽序列中均出现相同残基)，将匹配位置的数目除以比较窗口内的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。当比较不同长度的序列时，最短的序列限定了比较窗口的长度。在计算序列同一性时，不考虑保守置换。
有关本文鉴定的多肽序列的“百分(％)序列同一性”被定义为：在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分序列同一性并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分从而导致最佳比对后，询问序列中与第二个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括对被比较的序列的全长实现最佳比对所需的任何算法。可以对整体确定的多肽序列长度测量百分同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多肽序列的片段长度测量百分同一性，所述片段例如是至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文在表格、附图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可测量百分同一性的长度。
在多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”是指序列中的内部同源性程度，例如给定长度的相同核苷酸序列的频率。例如，重复性可以通过分析相同序列的频率来测定。
“载体”是优选在适当宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”是被引入适当宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的适合的宿主细胞。
“血清降解抗性”在应用于多肽时是指多肽在血液或其组分中抵抗降解的能力，该降解通常与血清或血浆中的蛋白酶有关。血清降解抗性可以通过使蛋白质与人(或视情况为小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在约37℃混合通常一定天数(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测量。可对这些时间点的样品进行Western印迹分析，并使用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白质中的标签。如果蛋白质在western印迹上显示单条带，其中蛋白质大小与注射的蛋白质大小相同，则没有发生降解。在该示例性方法中，通过Western印迹法或等效技术判断，50％的蛋白质被降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换使用，并且在本文中使用时意指的计算为ln(2)/Kel终末半衰期。Kel是通过log浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归而计算的终末消除速率常数。半衰期通常指活生物体中储存的施用物质的半数被正常生物过程代谢或消除所需的时间。
“主动清除”意指除过滤以外的将蛋白质从循环中去除的机制，该机制包括由细胞、受体、代谢或蛋白质降解所介导的从循环中的去除。
“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，指特定氨基酸或多肽序列表现出的表观分子量的相对增加或降低的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱法(SEC)或类似方法通过与球状蛋白质标准品相比较来确定，并且以“表观kDa”单位来度量。表观分子量因子是表观分子量和实际分子量之间的比例；后者通过基于氨基酸组成而加合组成中每种类型氨基酸的计算分子量来预测，或通过在SDS电泳凝胶中与分子量标准品比较而进行估算来预测。实施例中描述了对代表性蛋白质的表观分子量和表观分子量因子的确定。
术语“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，以nm为单位)，通过假设它是穿过溶液并受溶液粘性抵抗的主体来测量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量与‘表观分子量因子’相关联，表观分子量因子是更直观的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状和致密度)决定。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利号6,406,632和7,294,513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质在最小流体动力学半径下可以具有的最致密的三维结构。一些蛋白质具有随机和开放的非结构化或‘线性’构象，因此与类似分子量的典型球形蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。
“生理条件”指活宿主中的一组条件以及模拟活受试者的那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了用于体外分析的许多生理相关条件。一般而言，生理缓冲液包含生理浓度的盐并且被调节至中性pH，范围从约6.5至约7.8，优选约7.0至约7.5。许多生理缓冲液在Sambrook等(2001)中列出。生理相关温度为约25℃至约38℃，优选约35℃至约37℃。
“反应基团”是可以与另一反应基团偶联的化学结构。反应基团的实例是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基团可以被活化以促进与另一反应基团的偶联。活化的非限制性实例是羧基与碳二亚胺反应，羧基转化为活化的酯，或者羧基转化为叠氮化物官能。
“控释剂”、“缓释剂”、“贮库制剂”和“持续释放剂”可互换使用，指与多肽在缺乏这些物质而施用时的释放持续时间相比能够延长本发明多肽释放持续时间的物质。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，导致不同的治疗量。
术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂与之结合或对之具有特异性的结构或结合决定簇。
本文使用的术语“有效负载”指具有生物活性或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素、凝血因子和生长因子。有效负载还可以包含基因融合或化学偶联的部分，例如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影剂。这些偶联部分可以通过连接体连接至多肽的其余部分，所述连接体可以是可裂解的或不可裂解的。
本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。在本发明上下文中，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或降低生物活性蛋白质效应的任何其他分子。
术语“激动剂”以最广泛的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。适合的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小有机分子等。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。
“抑制常数”或“Ki”可互换使用，意指酶-抑制剂复合物的解离常数，或该抑制剂对该酶的结合亲和力的倒数。
本文使用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“减轻(palliating)”或“缓解(ameliorating)”可互换使用，意指施用药物或生物剂以达到治疗益处、以治愈现有的病症或减小现有病症的严重性，或达到预防益处，预防或降低发作的可能性或出现病症的严重性。所谓治疗益处是指被治疗的潜在病症或与潜在病症相关的一种或多种生理症状的消除或缓解，使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能依然罹患所述潜在病症。
本文使用的“治疗效果”或“治疗益处”指生理效应，包括但不限于人或其他动物中疾病的缓和、缓解或预防，或者指除此以外增强人或动物的生理或精神状态，这是由施用本发明融合蛋白而非诱导生成针对生物活性蛋白质具有的抗原表位的抗体的能力引起的。为了预防益处，组合物可以被施用给处于发展特定病症风险的受试者或者报告了病症的一种或多种生理症状的受试者，尽管可能还未作出(例如，克罗恩病)的诊断。
本文使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的药物或生物活性蛋白质的量，当以一次或重复剂量施用给受试者时，能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益影响。这种影响不一定绝对是有益的。治疗有效量的确定在熟练技术人员的能力之内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
本文使用的术语“治疗有效剂量方案”指连续施用多剂(即，至少2个或更多个)单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白质的计划表，其中所述剂量以治疗有效量给予，以对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益的影响。
I).通用技术
除非另有说明，在本发明的实践中采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技术范围内。参见J.等，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press,2001；“Current protocols in molecular biology”,F.M.Ausubel等编，1987；“Methods in Enzymology”系列，Academic Press,San Diego,CA.；“PCR 2:apractical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编，Oxford UniversityPress,1995；“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.和Lane,D.编，Cold SpringHarbor Laboratory,1988；“Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics”，第11版，McGraw-Hill,2005；和Freshney,R.I.,“Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique”，第4版，John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000，这些内容均通过引用整体并入本文。
II).胰高血糖素样-2蛋白
本发明部分地涉及包含GLP-2和一种或多种延伸的重组多肽(XTEN)从而产生GLP2-XTEN融合蛋白组合物的融合蛋白组合物。
“胰高血糖素样蛋白-2”或“GLP-2”在本文中共同指人类胰高血糖素样肽-2、人类GLP-2的物种同系物和具有至少一部分成熟GLP-2的生物活性的非天然序列变体，包括变体，例如但不限于，用甘氨酸替换成熟序列2位的丙氨酸(“2G”)以及用Val、Glu、Lys、Arg、Leu或Ile替换2位丙氨酸的变体。已经如美国专利或申请号5,789,379；5,834,428；5,990,077；5,994,500；6,184,201；7,186,683；7,563,770；20020025933和20030162703中所述分离、合成、表征或克隆了GLP-2或序列变体。
人类GLP-2是33个氨基酸的肽，与GLP-1一起从小肠和大肠的上皮中的肠内分泌细胞共分泌。胰高血糖素原基因的180个氨基酸的产物在胰腺A细胞和肠L细胞中以组织特异性的方式翻译后加工为33个氨基酸的GLP-2(Orskov等,FEBS Lett.(1989)247:193-196；Hartmann等,Peptides(2000)21:73-80)。在胰腺A细胞中，主要的生物活性激素是由PCSK2/PC2裂解的胰高血糖素。在肠L细胞中，PCSK1/PC1释放GLP-1、GLP-2、胰高血糖素样肽和胃泌酸调节肽。GLP-2作为多效性肠营养激素起作用，具有广泛的效应，包括促进粘膜生长和营养吸收、肠稳态，胃活动的调节、胃酸分泌和肠己糖转运、肠通透性的降低以及肠系膜血流量的增加(Estall JL,Drucker DJ(2006)Glucagon-like peptide-2.Annual Rev Nutr26:391–411)，(Guan X等.(2006)GLP-2receptor localizes to enteric neurons andendocrine cells expressing vasoactive peptides and mediates increased bloodflow.Gastroenterology 130:150–164；Stephens J等.(2006)Glucagon-like peptide-2acutely increases proximal small intestinal blood flow in TPN-fed neonatalpiglets.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 290:R283–R289；Nelson DW等.(2007)Localization and activation of GLP-2receptors on vagal afferents in therat.Endocrinology148:1954–1962)。由GLP-2介导的效应是通过GLP-2受体的结合和激活而触发的，GLP-2受体是胰高血糖素/促胰液素G蛋白偶联受体超家族的成员，位于肠(Bjerknes M,Cheng H(2001)Modulation of specific intestinal epithelialprogenitors by enteric neurons.Proc Natl Acad Sci USA98:12497–12502)和迷走神经(Nelson等，2007)、上皮下肌纤维母细胞(Orskov C等，(2005)GLP-2stimulates colonicgrowth via KGF,released by subepithelial myofibroblasts with GLP-2receptors.Regul Pept 124:105–11)和一部分肠上皮细胞(Thulesen J等，(2000)Potential targets for glucagon-like peptide 2(GLP-2)in the rat:distributionand binding of i.v.injected(125)I-GLP-2.Peptides 21:1511–1517)上。此外，GLP-2在炎症事件期间的肠适应、修复和保护中具有重要作用，包括促炎细胞因子的效应的改善(Sigalet DL等.(2007)Enteric neural pathways mediate the anti-inflammatoryactions of glucagon-like peptide 2.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol293:G211–G221)。GLP-2还增强了患有短肠综合征(SBS)的啮齿动物或人类的营养吸收和肠适应(Jeppesen等,(2001)Gastroenterology 120:806-815)。
在一方面，本发明涉及在GLP2-XTEN融合蛋白组合物中包含与人类GLP-2相同的GLP-2序列，这些序列与GLP-2序列具有同源性，这些序列为天然的，如来自人类、非人类灵长类动物、哺乳动物(包括家畜)，保留了天然人类GLP-2的至少部分生物活性或生物功能。在一个实施方案中，GLP-2是非天然GLP-2序列变体、片段或天然序列的模拟物，保留了相应天然GLP-2的至少部分生物活性，例如但不限于用甘氨酸置换成熟GLP-2肽序列的2位的丙氨酸(“GLP-2-2G”)。在另一个实施方案中，融合蛋白的GLP-2具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。可通过标准同源性搜索技术，如NCBI BLAST，或在公共数据库如化学文摘服务数据库(Chemical Abstracts Services Databases)(例如，CAS注册)、GenBank、通用蛋白质资源(The Universal Protein Resource)(UniProt))和订阅提供的数据库如GenSeq(例如，Derwent)中发现与GLP-2具有同源性的序列。
表1提供了本发明的GLP2-XTEN融合蛋白所包含的GLP-2的氨基酸序列的非限制性列表。可通过将个体突变改组到表1序列的氨基酸之中或之间或通过置换表1序列的氨基酸来构建将要并入融合蛋白组合物中的任何GLP-2序列或同源衍生物。可评估得到的GLP-2序列的活性，并且保留了天然GLP-2的至少部分生物活性的那些序列可用于包含在本发明的融合蛋白组合物中。在一些实施方案中，可并入GLP2-XTEN中的GLP-2包括与选自表1的氨基酸相比具有至少约80％序列同一性，或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质。
表1：GLP-2氨基酸序列
名称(来源) 氨基酸序列
GLP-2(人) HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体1SEQ ID NO:3美国专利号7,186,683 HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD
GLP-2变体2SEQ ID NO:5美国专利号5,789,379 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体3 HVDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体4 HEDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体5 HKDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体6 HRDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体7 HLDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2变体8 HIDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
GLP-2(小鼠) HADGSFSDEMSTILDNLATRDFINWLIQTKITD
GLP-2(大鼠) HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD
GLP-2(牛) HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITD
GLP-2(牛变体) HGDGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITD
GLP-2(猪) HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITDSL
GLP-2(猪变体) HGDGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITDSL
GLP-2(羊) HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKI
GLP-2(羊变体) HGDGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKI
GLP-2(犬) HADGSFSDEMNTVLDTLATRDFINWLLQTKITD
GLP-2(犬变体) HGDGSFSDEMNTVLDTLATRDFINWLLQTKITD
GLP-2(鸡) HADGTFTSDINKILDDMAAKEFLKWLINTKVTQ
GLP-2(鸡变体) HGDGTFTSDINKILDDMAAKEFLKWLINTKVTQ
GLP-2(火鸡) HADGTFTSDINKILDDMAAKEFLKWLINTKVTQ
GLP-2(火鸡变体) HGDGTFTSDINKILDDMAAKEFLKWLINTKVTQ
GLP-2(光滑爪蟾(Xenopus laevis)) HADGSFTNDINKVLDIIAAQEFLDWVINTQETE
本发明组合物的GLP-2不限于天然的、全长GLP-2多肽，而且包括重组形式以及具有序列变体的生物活性形式和/或药理学活性形式，或其片段。例如，应当理解，可在GLP-2中进行多种氨基酸缺失、插入和置换来产生展现出野生型GLP-2的一种或多种生物活性或药理学性质的变体。多肽序列中氨基酸的保守置换的实例在表2中示出。在GLP-2与本文公开的特定序列相比的序列同一性小于100％的GLP2-XTEN的实施方案中，本发明涉及其他19种天然L-氨基酸中的任一种对给定GLP-2的给定氨基酸残基的置换，该置换可以在GLP-2序列中的任何位置，包括相邻的氨基酸残基。在一些实施方案中，并入GLP2-XTEN中的GLP-2变体具有置换成熟肽2位的丙氨酸(A)的甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(K)或异亮氨酸(I)。这种置换可赋予对二肽酰肽酶-4(DPP-4)的抗性。在一个实施方案中，用甘氨酸置换GLP-2序列2位的丙氨酸。如果任一种置换导致了不期望的生物活性变化，则可使用备选的氨基酸之一，并通过本文所述的方法(例如，表32的试验)或使用例如在美国专利号5,364,934(通过引用将其内容整体并入)中所述的保守和非保守突变的任何技术和指南或使用本领域公知的方法来评估构建体蛋白质。此外，变体可包括，例如，其中在GLP-2的全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽，其保留天然肽的一些(如果不是全部)生物活性；例如，结合GLP-2受体的能力和/或激活GLP-2受体的能力。
表2：示例性保守氨基酸置换
无论是展现出与相应野生型GLP-2相同的或比之更好的生物活性还是备选地相对于野生型GLP-2展现出基本上改善的或降低的生物活性，GLP-2的序列变体包括但不限于，通过一个或多个氨基酸的插入、缺失、删除或置换而具有与野生型GLP-2的序列不同的氨基酸序列的多肽。此类GLP-2变体是本领域已知的，包括在美国专利号7,186,683或美国专利号5,789,379、5,994,500中所述的那些变体，通过引用将所有这些专利并入本文。
III).延伸的重组多肽
在一个方面，本发明提供了可作为融合蛋白配偶体用于连接至和/或并入GLP-2序列从而产生GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN多肽组合物。XTEN通常是在生理条件下没有或具有低程度的二级或三级结构的非天然存在的、基本上非重复的序列的多肽。XTEN通常具有约36至约3000个氨基酸，这些氨基酸中大多数或全部是小的亲水性氨基酸。如本文所用的“XTEN”明确排除了完整抗体或抗体片段(例如单链抗体和Fc片段)。XTEN具有融合蛋白配偶体的作用，因为它们起到多种作用，当连接至GLP-2蛋白而产生GLP2-XTEN融合蛋白时带来某些期望的药代动力学、物理化学和药学性质。此类GLP2-XTEN融合蛋白组合物与未连接XTEN的相应GLP-2相比具有增强的性质，从而使得它们在如下文更加充分描述的某些胃肠病症的治疗中是有用的。
将要融合至生物活性蛋白质的XTEN的选择标准通常涉及XTEN的物理化学性质和构象结构的属性，其转而用于为融合蛋白组合物带来增强的性质。XTEN的非结构化特征和物理/化学性质部分是由不成比例地限制于4-6个亲水性氨基酸的总体氨基酸组合物、可量化的非重复性设计的氨基酸连接以及XTEN多肽的长度而导致的。在对于XTEN共同的而对于多肽不是共同的有利特征中，本文公开的XTEN的性质与绝对一级氨基酸序列是不相关的，如由表4中的多种示例性序列所证明的，这些序列在不同长度范围内拥有相似的性质，其中许多性质在实施例中得到证明。本发明的XTEN展现出一种或多种以下有利性质：构象柔性、二级结构减少或缺乏、高度的水溶性、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合、限定程度的电荷和增强的流体动力学(或Stokes)半径；使得它们尤其可用作融合蛋白配偶体的性质。转而，包含融合至XTEN的GLP-2的融合蛋白的增强的性质的非限制性实例包括增加的总溶解性和/或代谢稳定性、降低的蛋白酶水解敏感性、降低的免疫原性、当皮下或肌内施用时降低的吸收速率、降低的肾清除率、增强的与底物的相互作用以及增强的药代动力学性质。本发明的GLP2-XTEN组合物的增强的药代动力学性质包括较长的终末半衰期(例如，2倍、3倍、4倍或更多)、增加的曲线下面积(AUC)(例如，25％、50％、100％或更多)、较小的分布体积、皮下或肌内注射后较慢的吸收(与未连接XTEN并通过相似途径施用的GLP-2相比)，使得Cmax较低，这转而导致GLP-2的副作用减少，共同地导致施用至受试者的GLP2-XTEN组合物的融合蛋白提供治疗活性的时间长度延长。在一些实施方案中，GLP2-XTEN组合物包含允许持续释放生物活性GLP-2的裂解序列(在下文更加充分描述)。当皮下或肌内施用时，具有这样的裂解序列的GLP2-XTEN可作为贮剂(depot)。特别考虑到，本发明的主题GLP2-XTEN融合蛋白可展现出本文公开的改善性质中的一种或多种或任意组合。在一些实施方案中，GLP2-XTEN组合物与未连接至XTEN并以类似方式施用的GLP-2相比允许较低的给药频率。这种GLP2-XTEN融合蛋白组合物具有治疗如本文所述的某些GLP-2相关疾病、障碍或病症的效用。
用于确定蛋白质如包含本发明XTEN的组合物的物理化学性质的多种方法和试验是本领域已知的。此类性质包括但不限于二级或三级结构、溶解性、蛋白质聚集、熔融性质、污染和含水量。此类方法包括分析性离心、EPR、HPLC离子交换、HPLC-尺寸排阻色谱法(SEC)、反相HPLC、光散射、毛细管电泳、圆二色性、差示扫描量热法、荧光、HPLC-离子交换、IR、NMR、拉曼光谱法和UV/可见光谱法。在Arnau等,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中公开了另外的方法。
将GLP2-XTEN的XTEN组分设计为在生理条件下表现得像变性的肽序列，尽管聚合物的长度延长。“变性的”描述了以肽骨架的大的构象自由度为特征的肽在溶液中的状态。大多数肽和蛋白质在高浓度变性剂的存在下或高温下采用变性构象。变性构象的肽具有，例如，特征性圆二色性(CD)谱，并以缺乏长程相互作用为特征，如通过NMR确定的。本文中“变性构象”和“非结构化构象”作为同义词使用。在一些实施方案中，本发明提供了在生理条件下类似于大部分缺乏二级结构的变性序列的XTEN序列。在其他情况下，XTEN序列在生理条件下基本上没有二级结构。在上下文中使用的“大部分缺乏”是指如通过本文所述的方法所测量或确定的，XTEN序列的少于50％的XTEN氨基酸残基对二级结构有贡献。在上下文中使用的“基本上缺乏”是指如通过本文所述的方法所测量或确定的，XTEN序列的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或至少约99％的XTEN氨基酸残基对二级结构没有贡献。
在本领域已经建立了多种方法来辨别给定多肽中二级结构和三级结构的存在与否。特别是，可通过分光技术，例如通过“远紫外”光谱区(190-250nm)的圆二色谱法来测量二级结构。二级结构元素如α-螺旋和β-折叠各自产生CD谱的特征形状和幅度。如美国专利申请公开号20030228309A1中所述的，还可以通过某些计算机程序或算法，如众所周知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.等(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson算法(“Gor算法”)(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR method forpredicting protein secondary structure from amino acid sequence.MethodsEnzymol 266:540-553)来预测多肽序列的二级结构。对于给定的序列，这些算法可预测是否存在一些二级结构或根本不存在二级结构，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基的总数和/或百分比，或预计导致无规卷曲形成(其缺乏二级结构)的序列的残基的百分比。可使用例如fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1的万维网网站的Chou-Fasman算法和npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_gor4.html的Gor算法(两者均在2012年9月5日访问)来对多肽序列进行分析。
在一个实施方案中，主题融合蛋白组合物中所用的XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比。在另一个实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的β-折叠百分比。在一些实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比和0％到小于约5％的β-折叠百分比。在一个实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有小于约2％的α-螺旋百分比和小于约2％的β-折叠百分比。该融合蛋白组合物的XTEN序列具有如通过GOR算法确定的高度无规卷曲百分比。在一些实施方案中，XTEN序列具有如通过GOR算法确定的至少约80％、更优选地至少约90％、更优选地至少约91％、更优选地至少约92％、更优选地至少约93％、更优选地至少约94％、更优选地至少约95％、更优选地至少约96％、更优选地至少约97％、更优选地至少约98％和最优选地至少约99％的无规卷曲。在一个实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比和0％到小于约5％的β-折叠百分比和如通过GOR算法确定的至少约90％的无规卷曲。在另一个实施方案中，该融合蛋白组合物的XTEN序列具有如通过GOR算法确定的小于约2％的α-螺旋百分比和小于约2％的β-折叠百分比、至少约90％的无规卷曲。
1.非重复序列
考虑到GLP2-XTEN实施方案的XTEN序列基本上是非重复性的。通常，重复性氨基酸序列具有聚集或形成更高级结构的倾向，如通过天然重复性序列如胶原蛋白和亮氨酸拉链所例证。这些重复性氨基酸还倾向于形成产生晶体或假晶体结构的接触。相反，非重复序列的低聚集倾向使得能够设计具有相对较低的带电氨基酸频率的长序列XTEN，如果序列为重复性的则这些带电氨基酸将可能聚集。通过评估一种或多种以下特征可观察到主题XTEN的非重复性。在一个实施方案中，“基本上非重复的”XTEN序列在序列中不具有为相同氨基酸类型(除非该氨基酸是丝氨酸)的三个连续的氨基酸，在这种情况下，不超过三个连续的氨基酸为丝氨酸残基。在另一个实施方案中，如下文更加充分描述的，“基本上非重复的”XTEN序列包含9-14个氨基酸残基的基序，其中所述基序由3、4、5或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中在任何一种基序中的任意两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中重复不超过两次。
可以通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其他方法来测定多肽或基因的重复性程度。根据本发明，本文公开了将在计算特定多肽如XTEN的重复性程度中使用的算法，并且提供了通过算法分析的序列的实例(参见下文的实施例)。在一个实施方案中，可根据方程式1给出的公式计算预定长度的多肽的重复性(下文称“子序列评分”)：
其中：m＝(多肽的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝序列i中每个独特子序列出现的累计数
开发了称作“SegScore”的算法以应用上述方程式来定量多肽如XTEN的重复性，从而提供子序列评分，其中通过确定长度为“s”的独特子序列在设定长度中出现的次数(“计数”)，除以预定长度的序列中子序列的绝对数来分析预定氨基酸长度的序列的重复性。图1描绘了SegScore算法的逻辑流程图，而图2描绘了对于具有11个氨基酸的虚构XTEN和3个氨基酸残基的子序列长度如何推导出子序列评分的示意图。例如，200个氨基酸残基的预定多肽长度具有192个重叠的9-氨基酸子序列和198个3-mer子序列，但是任何给定的多肽的子序列评分将取决于独特子序列的绝对数和每个独特的子序列(意思是不同的氨基酸序列)在预定序列长度中出现的频率。
在本发明的背景下，“子序列评分”是指每个独特的3-mer读框在累计XTEN多肽的200个连续氨基酸中出现的总数除以200个氨基酸序列中独特3-mer子序列的绝对数。此类由重复和非重复性多肽的200个连续氨基酸推导的子序列评分的实例在实施例30中提出。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个XTEN的GLP2-XTEN，其中XTEN具有小于12、更优选地小于10、更优选地小于9、更优选地小于8、更优选地小于7、更优选地小于6，并且最优选地小于5的子序列评分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含两个XTEN的GLP2-XTEN，其中至少一个XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5或更小的子序列评分。在又一个实施方案中，本发明提供了包含至少两个XTEN的GLP2-XTEN，其中具有36个或更多个氨基酸的每个个体XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5或更小的子序列评分。在本段的实施方案中，将XTEN表征为基本上非重复性的。
在一个方面，本发明的XTEN的非重复性特征以及在XTEN中占主导地位的氨基酸的特定类型(而不是绝对的一级序列)，赋予了GLP2-XTEN融合蛋白的一种或多种增强的物理化学和生物学性质。这些增强的性质包括与包含具有重复序列的多肽的融合蛋白相比，得到的GLP2-XTEN的融合蛋白在宿主细胞中更高的表达程度、编码XTEN的基因的更大的遗传稳定性、更大的溶解度、较低的聚集倾向和增强的药代动力学。这些增强的性质允许更高效的生产、更低的商品成本，和/或促进含有极高蛋白质浓度(在一些情况下超过100mg/ml)的含有XTEN的药物制剂的配制。在一些实施方案中，将这些实施方案的XTEN多肽序列设计为具有低内部重复度，以便当施用于哺乳动物时降低或基本上消除免疫原性。由主要限于仅三种氨基酸如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的短的重复基序组成的多肽序列，当施用于哺乳动物时，尽管在这些序列中缺乏预测的T细胞表位，但仍可产生相对较高的抗体效价。这可能是由多肽的重复性质导致的，因为已经证明具有重复表位(包括蛋白质聚集体、交联的免疫原和重复性碳水化合物)的免疫原是高度免疫原性的，并且可以，例如，导致引起B细胞激活的B细胞受体的交联(Johansson,J.等.(2007)Vaccine,25:1676-82；Yankai,Z.等.(2006)Biochem Biophys Res Commun,345:1365-71；Hsu,C.T.等.(2000)Cancer Res,60:3701-5)；Bachmann MF等.Eur J Immunol.(1995)25(12):3445-3451)。
2.示例性序列基序
本发明涵盖了包含多个较短序列或基序的单元的、用作融合配偶体的XTEN，其中所述基序的氨基酸序列基本上是非重复性的。甚至使用多聚化产生XTEN序列的序列基序文库，利用“结构单元”方法，可满足非重复性质。而XTEN序列可由仅有4种不同类型的序列基序的多个单元组成，因为该基序自身通常由非重复性氨基酸序列组成，将整个XTEN序列设计为使得该序列基本上是非重复性的。
在一个实施方案中，XTEN具有大于约36至约3000、或约100至约2000、或约144至约1000个氨基酸残基或更长的基本上非重复的序列，其中至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，并且其中每个基序具有约9-36个氨基酸残基。如本文所用的，“非重叠”是指个体基序不共有氨基酸残基而是以线性方式连接至其他基序或氨基酸残基。在其他实施方案中，至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有9-14个氨基酸残基。在其他实施方案中，至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选的是，序列基序由大量(例如，90％或更多)或仅少量亲水性氨基酸组成，以使得整个序列具有非结构化的、柔性的特征。XTEN中包括的氨基酸的实例为，例如，精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方案中，XTEN序列主要具有4-6种类型的氨基酸，这些氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)，排列为长度大于约36至约3000、或约100至约2000、或约144至约1000个氨基酸残基的基本上非重复的序列。在一些实施方案中，XTEN序列由4、5或6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)的氨基酸组成。在一些实施方案中，XTEN具有大于约36至约1000、或约100至约2000、或约400至约3000个氨基酸残基的序列，其中至少约80％的序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有9-36个氨基酸残基，并且其中每种基序的至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或100％由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其他实施方案中，至少约90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有9-36个氨基酸残基，其中所述基序由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过40％，或约30％，或约25％。在其他实施方案中，至少约90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过40％，或30％，或约25％。在其他实施方案中，至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的12个氨基酸残基。
在另外其他的实施方案中，XTEN包含大于约36至约3000个氨基酸残基的基本上非重复的序列，其中至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列由9-14个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中所述基序由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中任何一种基序中的任何两个连续氨基酸残基的序列在该序列基序中重复不超过两次。在其他实施方案中，至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的XTEN序列由12个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中所述基序由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中任何一个序列基序中的任何两个连续的氨基酸残基的序列在该序列基序中重复不超过两次。在其他实施方案中，至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的XTEN序列由12个氨基酸残基的非重叠序列基序组成，其中所述基序由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成，并且其中任何一个序列基序中的任何两个连续的氨基酸残基的序列在该序列基序中重复不超过两次。在其他实施方案中，XTEN由12个氨基酸序列基序组成，其中氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，并且其中任何一个序列基序中的任何两个连续的氨基酸残基在该序列基序中重复不超过两次，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过30％。前述实施方案是基本上非重复性XTEN序列的实例。下文详述了另外的实例。
在一些实施方案中，本发明提供了包含一个、或两个、或三个、或四个、五个、六个或更多个约36至约1000个氨基酸残基或累积约100至约3000个氨基酸残基的非重复性XTEN序列的GLP2-XTEN组合物，其中该序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表3的氨基酸序列的四个或更多个非重叠序列基序的多个单元组成，其中整个序列仍然基本上是非重复性的。在一些实施方案中，XTEN包含非重叠序列基序，其中该序列的约80％、或至少约85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％或约100％由选自表3的单一基序家族的非重叠序列的多个单元组成，从而产生家族序列。应用于基序的家族是指XTEN具有选自表3的基序分类的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD，并且选择XTEN中任何并非来自基序家族的任何其他氨基酸来获得所需性质，如允许通过编码核苷酸引入限制位点，引入裂解序列，或获得对GLP2-XTEN的GLP-2组分的更好的连接。在XTEN家族的一些实施方案中，XTEN序列包含AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族、或BD家族的非重叠序列基序的多个单元，得到的XTEN展现出上述同源性范围。在XTEN家族的其他实施方案中，给定家族的每个XTEN具有来自表3的相同家族的至少四种不同的基序；例如，AD或AE或AF或AG或AM等的四个基序。在其他实施方案中，XTEN包含来自表3的一个或多个基序家族的基序序列的多个单元，其选择用于获得期望的物理化学性质，包括下文更加充分描述的如净电荷、缺乏二级结构、或可通过基序的氨基酸组成赋予的缺乏重复性的性质。在本段上文所述的实施方案中，可选择并入XTEN中的基序或基序的一部分并使用本文所述的方法进行组装，以获得约36、约42、约72、约144、约288、约576、约864、约1000、约2000至约3000个氨基酸残基或任何中间长度的XTEN。可用于并入主题GLP2-XTEN中的XTEN家族序列的非限制性实例在表4中示出。旨在使相对于表4提到的特定序列具有表4中所示的序列，而广泛提到AE144序列，例如，意在涵盖任何具有144个氨基酸残基的AE序列；例如，AE144_1A、AE144_2A等，或广泛提到AG144序列，例如，意在涵盖任何具有144个氨基酸残基的AG序列，例如，AG144_1、AG144_2、AG144_A、AG144_B、AG144_C等。
表3：12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
·表示当以不同排列一起使用时产生“家族序列”的个体基序序列
表4:XTEN多肽
在其他实施方案中，GLP2-XTEN组合物包含约36至约3000个氨基酸残基或约144至约2000个氨基酸残基或约288或约1000个氨基酸残基的一种或多种非重复性XTEN序列，其中至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％的序列由非重叠的36氨基酸序列基序组成，该项充选自表8-11的多肽序列中的一个或多个，作为家族序列，或其中基序选自两个或更多个基序家族。
在一些实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN组分有少于100％的氨基酸由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6个氨基酸组成，或小于100％的序列由来自表3的序列基序或表4和表8-12的序列组成，或与表4的XTEN相比具有小于100％的序列同一性，在这些实施方案中，其他氨基酸残基选自任何其他14种天然L-氨基酸，但优选地选自亲水性氨基酸，使得XTEN序列含有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的亲水性氨基酸。不是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的XTEN氨基酸散置于整个XTEN序列中，位于序列基序之内或之间，或者集中于XTEN序列的一个或多个短序列段中。在GLP2-XTEN的XTEN组分包含除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)之外的氨基酸的情况下，期望氨基酸不是疏水性残基并且应该基本上不能给予XTEN组分的二级结构。在XTEN的构建中不受青睐的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。此外，可以将XTEN序列设计为含有少于5％或少于4％或少于3％或少于2％或少于1％或不含以下的氨基酸：半胱氨酸(为了避免二硫化物的形成和氧化)、甲硫氨酸(为了避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(为了避免脱酰胺作用)。因此，在一些实施方案中，除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)之外还包含其他氨基酸的GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN组分将具有这样的序列，其中如通过Chou-Fasman算法所测定的，少于5％的残基对α-螺旋和β-折叠有贡献，并且如通过GOR算法所测定的，具有至少90％或至少约95％或更多的无规卷曲形成。
3.序列长度
在另一方面，本发明提供了用于并入GLP2-XTEN组合物中的不同长度的XTEN，其中基于在融合蛋白中要获得的性能或功能来选择XTEN序列的长度。根据预期性能或功能，GLP2-XTEN组合物包含可作为载体的短或中长度的XTEN和/或较长的XTEN序列。然而，并非意在限制，XTEN或XTEN的片段包括约6至约99个氨基酸残基的短区段、约100至约399个氨基酸残基的中等长度和约400至约3000个氨基酸残基的较长长度。因此，主题GLP2-XTEN包含长度为约6、或约12、或约36、或约40、或约100、或约144、或约288、或约401、或约500、或约600、或约700、或约800、或约900、或约1000、或约1500、或约2000、或约2500或多达约3000个氨基酸残基长度的XTEN或XTEN片段。在其他情况下，XTEN序列的长度可以为约6至约50、或约100至150、约150至250、约250至400、约400至约500、约500至900、约900至1500、约1500至2000、或约2000至约3000个氨基酸残基。在不对GLP2-XTEN组合物的生物活性产生不利影响的情况下，XTEN的精确长度可以改变。在一个实施方案中，在本文公开的GLP2-XEN中所用的一种或多种XTEN具有36个氨基酸、42个氨基酸、144个氨基酸、288个氨基酸、576个氨基酸或864个氨基酸的长度，并且可选自XTEN家族序列中的一个；即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。在另一个实施方案中，本文所用的一种或多种XTEN选自XTEN_AE864、XTEN_AE576、XTEN_AE288、XTEN_AE144、XTEN_AE42、XTEN_AG864、XTEN_AG576、XTEN_AG288、XTEN_AG144和XTEN_AG42或表4中的其他XTEN序列。在GLP2-XTEN的实施方案中，与选自表4的基序或XTEN或具有类似长度的其片段相比，所述一个或多个XTEN或XTEN序列的片段独立地展现出至少约80％的序列同一性，或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含第一和至少第二XTEN序列，其中XTEN序列中残基的累计长度大于约100至约3000或约400至约1000个氨基酸残基，并且XTEN可以是相同的或它们可以在序列或长度上是不同的。如本文所用的“累计长度”，当向GLP2-XTEN融合蛋白中并入超过一个XTEN时，意在包含氨基酸残基的总长度。
如下文更充分描述的，公开了这样的方法，其中通过选择XTEN的长度以使施用至受试者的融合蛋白具有目标半衰期或其他物理化学性质来设计GLP2-XTEN。当将XTEN用作载体时，本发明利用了以下发现：增加非重复性、非结构化多肽的长度增强了XTEN的非结构化性质，并相应地增强了包含XTEN载体的融合蛋白的生物学和药代动力学性质。通常，并入融合蛋白组合物中的约400个残基的较长XTEN累计长度产生与较短的累计长度(例如短于约280个残基)相比更长的半衰期。如实施例中更充分描述的，即使是由重复次序的单一家族序列基序(例如，表3中的四个AE基序)构建的，XTEN的长度的成比例增加也产生这样的序列：与较短的XTEN长度相比，如通过GOR算法所确定的，具有更高比例的无规卷曲形成，或者如通过Chou-Fasman算法所确定的，具有减少的α-螺旋或β-折叠含量。此外，如实施例中所述，增加非结构化多肽融合配偶体的长度产生了与具有较短序列长度的非结构化多肽配偶体的融合蛋白相比终末半衰期不成比例增加的融合蛋白。
在XTEN主要作为载体的一些实施方案中，本发明涵盖包含一个或多个XTEN的GLP2-XTEN组合物，其中融合蛋白的累计XTEN序列长度大于约100、200、400、500、600、800、900或1000至约3000个氨基酸残基，其中当施用至受试者时，该融合蛋白与未连接至XTEN并以可比剂量施用的GLP-2相比展现出增强的药代动力学性质。在前述的一个实施方案中，一个或多个XTEN序列展现出与选自表4的序列的至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％或更大的同一性，并且其余载体序列(如果有的话)包含至少90％的亲水性氨基酸，并且少于约2％的总序列由疏水性或芳香性氨基酸或半胱氨酸组成。下文更加充分地描述了与未连接至XTEN的GLP-2相比GLP2-XTEN的增强的药代动力学性质。
在另一方面，本发明提供了由较长的“供体”XTEN序列产生短或中等长度的XTEN的方法，其中通过在N端或C端截短产生较长的供体序列，或从供体序列内部产生片段，从而产生短或中等长度的XTEN。在如图3A-C中示意性描绘的非限制性实例中，可将864个氨基酸残基的AG864序列截短以产生具有144个残基的AG144、具有288个残基的AG288、具有576个残基的AG576或其他中等长度，同时可将AE864序列(如在图3D、图3E中所描绘的)截短以产生AE288或AE576或其他中等长度。特别考虑到此方法可与本文所述的任何XTEN实施方案或与表4或表8-12中所列的任何序列一起使用以产生期望长度的XTEN。
4.净电荷
在其他实施方案中，XTEN多肽具有通过并入氨基酸残基而赋予的非结构化特征，该氨基酸残基具有净电荷，并且在该XTEN序列中包含低比例的或不包含疏水性氨基酸。总净电荷和净电荷密度通过改变XTEN序列中带电(正或负)氨基酸的含量来控制，其中净电荷通常表示为多肽中对带电状态作出贡献的氨基酸超出那些被具有相反电荷的残基所抵消的残基的百分比。在一些实施方案中，组合物的XTEN的净电荷密度可能高于+0.1或低于-0.1电荷/残基。本文的蛋白质或肽的“净电荷密度”是指净电荷除以蛋白质或前肽中氨基酸的总数。在其他实施方案中，XTEN的净电荷可以是约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％或更多。在一些实施方案中，XTEN序列包含由其他残基如丝氨酸或甘氨酸分开的带电残基，这导致更好的表达或纯化行为。基于该净电荷，一些XTEN具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或者甚至6.5的等电点(pI)。在一个实施方案中，XTEN将具有1.5-4.5的等电点并且在生理条件下携带净负电荷。
由于人或动物的大部分组织和表面具有净负电荷，在一些实施方案中将XTEN序列设计为具有使含有组合物的XTEN与多种表面如血管、健康组织或多种受体之间的非特异性相互作用最小化的净负电荷。不受特定理论的束缚，由于单独携带净负电荷并且分布于整个XTEN多肽序列的XTEN多肽氨基酸之间的静电排斥，XTEN可以采用开放构象。在一些实施方案中，将XTEN序列设计为具有由其他残基如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸或甘氨酸分开的至少90％或95％的带电残基，这导致电荷更均匀的分布、更好的表达或纯化行为。净负电荷在XTEN的延伸的序列长度上的这种分布可导致非结构化构象，转而可导致流体动力学半径的有效增大。在优选的实施方案中，通过并入谷氨酸残基来赋予主题XTEN以负电荷。通常，在整个XTEN序列上谷氨酸残基被均匀地间隔开。在一些情况下，XTEN可含有约10-80、或约15-60、或约20-50个谷氨酸残基/20kDa XTEN，这可以导致XTEN具有将具有非常相似的pKa的带电残基，这可增加产物的电荷均匀性并锐化其等电点，增强得到的GLP2-XTEN融合蛋白的物理化学性质，以便并因此简化纯化程序。例如，在需要具有负电荷的XTEN时，XTEN可仅选自AE家族序列，由于并入的谷氨酸，其具有大约17％的净电荷，或可包括不同比例的表3中含有谷氨酸的基序以提供期望程度的净电荷。AE XTEN的非限制性实例包括但不限于表4或表9的AE36、AE42、AE48、AE144、AE288、AE576、AE624、AE864和AE912多肽序列或其片段。在一个实施方案中，可对表4或表9的XTEN序列进行修饰以包括谷氨酸残基，从而获得期望的净负电荷。因此，在一个实施方案中，本发明提供了XTEN，其中所述XTEN序列含有约1％、2％、4％、8％、10％、15％、17％、20％、25％或甚至约30％的谷氨酸。在一些情况下，XTEN可含有约10-80、或约15-60、或约20-50个谷氨酸残基/20kDa XTEN，这可以导致XTEN具有将具有非常相似的pKa的带电残基，这可增加产物的电荷均匀性并锐化其等电点，增强得到的GLP2-XTEN融合蛋白的物理化学性质，以便并因此简化纯化程序。在一个实施方案中，本发明涉及除谷氨酸之外还将天冬氨酸残基并入XTEN中以便得到净负电荷。
不受特定理论的束缚，期望具有较高净负电荷的GLP2-XTEN组合物的XTEN与多种带负电的表面如血管、组织或多种受体具有较少的非特异性相互作用，这将进一步有助于降低主动清除率。相反，考虑到吞噬细胞在肠的炎性过程中的已知贡献，据认为具有低(或无)净电荷的GLP2-XTEN组合物的XTEN与可增强相关GLP-2的生物活性的表面将具有较高程度的相互作用。
在期望无净电荷的其他情况下，XTEN可选自例如AG家族XTEN成分，如表3的AG基序或表3的那些接近于不具有净电荷的AM基序。AG XTEN的非限制性实例包括但不限于表4或表11的AG42、AG144、AG288、AG576和AG864多肽序列或其片段。在另一个实施方案中，XTEN可包含不同比例的AE和AG基序，以便具有对于给定用途而言被认为是最佳的或维持给定物理化学性质的净电荷。
本发明的组合物的XTEN通常没有或具有低含量的带正电氨基酸。在一些实施方案中，XTEN可具有少于约10％的带正电荷的氨基酸残基、或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％、或少于约1％的带正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涉及这样的构建体：其中将有限数量的带正电荷的氨基酸如赖氨酸并入XTEN中，以允许赖氨酸的ε胺与GLP-2肽上的反应性基团、连接桥或将偶联至XTEN骨架的药物或小分子上的反应性基团之间偶联。在前述的一个实施方案中，XTEN具有约1至约100个赖氨酸残基、或约1至约70个赖氨酸残基、或约1至约50个赖氨酸残基、或约1至约30个赖氨酸残基、或约1至约20个赖氨酸残基、或约1至约10个赖氨酸残基、或约1至约5个赖氨酸残基，或备选地仅单个赖氨酸残基。使用前述含有赖氨酸的XTEN，构建包含XTEN、GLP-2和在GLP-2-相关疾病或病症的治疗中有用的化学治疗剂的融合蛋白，其中并入XTEN成分的药剂的分子的最大数目取决于并入XTEN中的、具有反应性侧链(例如，半胱氨酸)的赖氨酸或其他氨基酸的数目。因此，本发明还提供了具有1至约10个半胱氨酸残基、或约1至约5半胱氨酸残基、或备选地仅单个半胱氨酸残基的XTEN，其中构建了包含XTEN、GLP-2和在GLP-2-相关疾病或病症的治疗中有用的化学治疗剂的融合蛋白，其中并入XTEN成分的药剂的分子的最大数目取决于半胱氨酸数。
由于疏水性氨基酸为多肽提供结构，本发明提供的XTEN中的疏水性氨基酸的含量通常将少于5％、或少于2％、或少于1％的疏水性氨基酸含量。在一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN成分中的甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸含量通常少于5％、或少于2％，并且最优选地少于1％。在另一个实施方案中，XTEN将具有少于10％的带正电荷的氨基酸残基、或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％的带正电荷的氨基酸残基的序列，甲硫氨酸和色氨酸残基的总数将少于2％，并且天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总数将少于总XTEN序列的5％。
5.低免疫原性
在另一方面，本发明提供了其中XTEN序列具有低程度的免疫原性或基本上无免疫原性的组合物。几种因素可导致XTEN的低免疫原性，例如，非重复序列、非结构化构象、高度溶解度、低程度的或缺乏自聚集、序列中低程度的或缺乏蛋白水解位点和XTEN序列中低程度的或缺乏表位。
构象表位是由蛋白质抗原的多种不连续的氨基酸序列构成的蛋白质表面的区域所形成的。蛋白质的精确折叠使这些序列成为可被宿主体液免疫系统识别为“外源物”的定义明确的、稳定的空间构型或表位，从而导致蛋白质的抗体的产生或细胞介导的免疫应答的激活。在后一种情况下，个体中对蛋白质的免疫应答深受T细胞表位识别的影响，T细胞表位识别是该个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性的功能。MHC II类肽复合物通过T细胞表面上的同源T细胞受体的结合以及某些其他共受体如CD4分子的交叉结合可诱导T细胞中的激活状态。激活导致细胞因子的释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体或作为完全的细胞免疫应答激活T杀伤细胞。
肽结合给定的MHC II类分子以便在APC(抗原呈递细胞)表面上呈递的能力取决于许多因素；最重要的是其一级序列。在一个实施方案中，通过设计抵抗在抗原呈递细胞中的抗原加工的XTEN序列和/或选择不能良好结合MHC受体的序列而获得较低程度的免疫原性。本发明提供了具有基本上非重复性的XTEN多肽的GLP2-XTEN融合蛋白，其设计用于降低与MHC II受体的结合，以及避免针对T细胞受体或抗体结合的表位的形成，从而导致低程度的免疫原性。避免免疫原性可至少部分地有助于XTEN序列的构象柔性的结果；即，由于氨基酸残基的选择和次序而缺乏二级结构。例如，特别感兴趣的是在可导致构象表位的水溶液中或生理条件下采取紧密折叠构象的倾向较低的序列。使用常规治疗实践和剂量施用包含XTEN的融合蛋白通常不会导致XTEN序列的中和抗体的形成，并且也降低了GLP2-XTEN组合物中GLP-2融合配偶体的免疫原性。
在一个实施方案中，在主题融合蛋白中采用的XTEN序列可基本上没有被人类T细胞识别的表位。先前已公开了出于产生较低免疫原性的蛋白质的目的而对此类表位的消除；参见，例如WO 98/52976、WO 02/079232和WO 00/3317，将这些参考通过引用并入。已公开了对人类T细胞表位的分析(Stickler,M.等(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特别感兴趣的是能够寡聚体化而不产生T细胞表位或非人类序列的肽序列。这如下实现：测定这些序列的同向重复的T细胞表位的存在和6-mer至15-mer特别是9-mer非人类序列的出现，然后改变对XTEN序列的设计以消除或破坏表位序列。在一些实施方案中，通过限制预测能结合MHC受体的XTEN的表位的数量，XTEN序列基本上是无免疫原性的。随着能够结合至MHC受体的表位的数量的降低，T细胞激活的能力以及T细胞辅助功能伴随降低，B细胞激活或上调降低以及抗体产生减少。低程度的预测的T细胞表位可通过表位预测算法如实施例31中所示的TEPITOPE(Sturniolo,T.等(1999)Nat Biotechnol,17:555-61)来确定。蛋白质中给定的肽框架的TEPITOPE评分为将该肽框架结合至多种最常见的人类MHC等位基因的Kd的log值(离解常数，亲和力，解离速率)，如在Sturniolo,T.等(1999)NatureBiotechnology 17:555)中所公开的。评分范围在至少20个logs个，从约10至约-10(相当于10e10Kd至10e-10Kd的结合约束)，并且通过避免在MHC上展示肽的过程中充当锚定残基的疏水性氨基酸如M、I、L、V、F而可以降低。在一些实施方案中，并入GLP2-XTEN中的XTEN组分在约-5、或-6、或-7、或-8、或-9的TEPITOPE阈值评分时或在-10的TEPITOPE评分时不具有预测的T细胞表位。如本文所用的，评分“-9”将是比评分-5更严格的TEPITOPE阈值。
在另一个实施方案中，通过限制来自XTEN序列的已知的蛋白水解位点，减少将XTEN加工为可结合至MHC II受体的小肽，使得本发明的XTEN序列(包括并入主题GLP2-XTEN融合蛋白的那些)基本上无免疫原性。在另一个实施方案中，通过使用基本上无二级结构的序列，使得XTEN序列基本上无免疫原性，由于该结构的高熵而赋予许多蛋白酶以抗性。因此，降低的TEPITOPE评分以及从XTEN消除已知的蛋白水解位点使得XTEN组合物(包括GLP2-XTEN融合蛋白组合物的XTEN)基本上不能够被哺乳动物受体(包括免疫系统的那些受体)结合。在一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN可具有与哺乳动物受体的>100nM Kd的结合，或对哺乳动物细胞表面或循环多肽受体大于500nM Kd或大于1μM Kd。
此外，非重复序列和XTEN的表位的相应缺乏限制了B细胞结合XTEN或被XTEN激活的能力。重复序列得到识别，并且能够形成与甚至少数B细胞的多价接触，并且由于多个T细胞独立性受体的交联而能够刺激B细胞增殖和抗体产生。相反，虽然XTEN可与许多不同的B细胞在其延伸序列上接触，但由于序列重复性的缺乏，每个个体B细胞可与个体XTEN仅进行一种或少数接触。不受任何理论的束缚，XTEN通常具有刺激B细胞增殖并因此刺激免疫应答的较低倾向。在一个实施方案中，GLP2-XTEN与未融合至XTEN的相应的GLP-2相比具有降低的免疫原性。在一个实施方案中，将多达3个肠胃外剂量的GLP2-XTEN施用至哺乳动物，在1:100的血清稀释度时产生可检测的抗-GLP2-XTEN IgG，而在1:1000的稀释度时不产生。在另一个实施方案中，将多达3个肠胃外剂量的GLP2-XTEN施用至哺乳动物，在1:1000的血清稀释度时产生可检测的抗-GLP-2IgG，而在1:10,000的稀释度时不产生。在另一个实施方案中，将多达3个肠胃外剂量的GLP2-XTEN施用至哺乳动物，在1:10,000的稀释度时产生可检测的抗-XTEN IgG，而在1:1,000,000的稀释度时不产生。在前述的实施方案中，哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔或食蟹猴。
相对于具有高度重复性的序列，具有非重复序列的XTEN的额外特征是非重复性的XTEN形成与抗体的较弱接触。抗体为多价分子。例如，IgG具有两个相同的结合位点，IgM含有10个相同的结合位点。因此，针对重复序列的抗体可形成与此重复序列的高亲合力的多价接触，这可影响此类重复序列的效价和/或消除。相反，针对非重复性XTEN的抗体可产生单价相互作用，导致更低的免疫清除可能性，使得GLP2-XTEN组合物可在循环中保留延长的一段时间。
6.增加的流体动力学半径
在另一方面，本发明提供了XTEN，其中该XTEN多肽具有高流体动力学半径，使得并入XTEN的GLP2-XTEN融合蛋白具有相应的增加的表观分子量。如实施例25中所述的，XTEN与治疗性蛋白质序列的连接产生了GLP2-XTEN组合物，与不连接至XTEN的治疗性蛋白质相比，该组合物可具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量和增加的表观分子量因子。例如在需要延长半衰期的治疗性应用中，具有高流体动力学半径的XTEN并入包含治疗性蛋白质的融合蛋白中而产生的组合物可有效地增大组合物的流体动力学半径以超过大约3-5nm的肾小球孔隙大小(相当于约70kDA的表观分子量)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic andbiodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.AdvDrug Deliv Rev 55:1261-1277)，从而导致循环蛋白质的肾清除率降低，而终末半衰期相应延长以及其他增强的药代动力学性质。蛋白质的流体动力学半径取决于其分子量及其结构，包括形状或紧密度。不受特定理论的束缚，由于肽的个体电荷之间的静电排斥或由缺乏赋予二级结构的潜能的序列中特定氨基酸所赋予的内在柔性，XTEN可采取开放构象。XTEN多肽的开放的、延伸的和非结构化的构象，与具有二级结构和/或三级结构的可比序列长度和/或分子量的多肽如典型的球状蛋白质相比，可具有更大比例的流体动力学半径。用于确定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如在美国专利号6,406,632和7,294,513中所述的。实施例25的结果表明，长度渐增的XTEN的加入导致流体动力学半径、表观分子量和表观分子量因子等参数的成比例增加，从而允许将GLP2-XTEN裁减至期望的特征截止表观分子量或流体动力学半径。因此，在某些实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白可配置为具有XTEN，使得融合蛋白可具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约10nm、或12nm、或至少约15nm的流体动力学半径。在前述的实施方案中，由GLP2-XTEN融合蛋白中的XTEN所赋予的大的流体动力学半径可导致得到的融合蛋白的肾清除率的降低，导致终末半衰期的相应延长，平均滞留时间的增加，和/或肾清除率的降低。
当GLP2-XTEN融合蛋白的分子量由尺寸排阻色谱分析获得时，XTEN的开放构象由于低程度的二级结构而导致融合蛋白的表观分子量的增加。在一些实施方案中，包含GLP-2和至少第一或多个XTEN的GLP2-XTEN展现出至少约200kDa、或至少约400kDa、或至少约500kDa、或至少约700kDa、或至少约1000kDa、或至少约1400kDa的表观分子量。因此，包含一个或多个XTEN的GLP2-XTEN融合蛋白展现出为该融合蛋白的实际分子量的约2倍、或约3倍、或约4倍、或约8倍、或约10倍、或约12倍、或约15倍、或约20倍的表观分子量。在一个实施方案中，任何本文公开的实施方案的分离的GLP2-XTEN融合蛋白在生理条件下展现出大于约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约10、或约15、或超过约20的表观分子量因子。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白在生理条件下相对于该融合蛋白的实际分子量具有约3至约20、或约5至约15、或约8至约14、或约10至约12的表观分子量因子。
IV).GLP2-XTEN组合物
本发明部分涉及包含连接至一个或多个XTEN的GLP-2的融合蛋白组合物，其中当施用至受试者时，该融合蛋白将用于替代或增强现有的GLP-2。本发明满足了增加向有需要的受试者外源性施用GLP-2的终末半衰期的长期需要。增加治疗性蛋白质的循环半衰期的一种方法是确保蛋白质的肾清除率降低。增加循环半衰期的另一种方法是降低由受体、蛋白质的活性代谢或其他内源性机制介导的治疗性蛋白质的主动清除。二者均是通过将蛋白质偶联至聚合物而实现的，该聚合物在一些情况下能够赋予蛋白质以增加的分子大小(或流体动力学半径)，并且因此降低肾清除率，并且在其他情况下，干扰蛋白质与清除受体或其他有助于代谢或清除的蛋白质的结合。因此，本发明的某些目标包括但不限于提供具有较长的循环或终末半衰期的改善的GLP-2分子，减少GLP-2组合物的必要施用的数量或频率，以及提高治疗GLP-2-相关疾病或胃肠病症的能力，与目前可用的GLP-2制剂相比更有效率、更有效、更经济地得到临床症状的改善和总体健康，并且具有更高的安全性。
在第一方面，为了满足这些要求，本发明提供了包含共价连接至一个或多个XTEN的生物活性GLP-2从而产生GLP2-XTEN融合蛋白组合物的分离的融合蛋白组合物。主题GLP-2-XTEN可介导野生型GLP-2的一种或多种生物活性或治疗活性。GLP2-XTEN可重组产生或通过将GLP-2化学偶联至XTEN而产生。在一个实施方案中，GLP-2是天然GLP-2。在另一个实施方案中，GLP-2是保留天然GLP-2的至少一部分生物活性的天然序列的序列变体。在一个实施方案中，GLP-2是当进行最佳比对时，与选自表1中的序列的序列具有至少90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，GLP-2是用甘氨酸置换成熟GLP-2肽的2号残基处的丙氨酸的序列变体。在一个实施方案中，GLP2-XTEN包含具有序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD的GLP-2。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个XTEN、包含GLP-2N-和/或C-末端修饰形式的GLP2-XTEN融合蛋白。
主题组合物的GLP-2，特别是表1中公开的那些，以及其相应的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的，并且描述和序列可获自公开数据库例如化学文摘服务数据库(ChemicalAbstracts Services Databases)(例如，CAS登记)、GenBank、通用蛋白质资源(TheUniversal Protein Resource)(UniProt)和订购数据库例如GenSeq(例如,Derwent)。多核苷酸序列可以是编码给定GLP-2的野生型多核苷酸序列(例如，全长或成熟的)，或者在一些情况下，序列可以是野生型多核苷酸序列的变体(例如，编码野生型生物活性蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸的DNA序列已经例如为在特定物种中表达而被优化；或者编码野生型蛋白变体的多核苷酸，例如定点突变体或等位基因变体。技术人员完全有能力使用本领域公知的方法和/或结合本文提供以及在实施例中更全面描述的指导和方法利用GLP-2的野生型或共有的cDNA序列或密码子优化序列变体来产生本发明涉及的GLP2-XTEN构建体。
在一些实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白保留天然GLP-2的至少一部分生物活性。本发明的GLP2-XTEN融合蛋白能够结合并激活GLP-2受体。在一个实施方案中，当使用体外GLP-2受体结合试验(如本文所述的或本领域已知的其他试验)进行评估时，本发明的GLP2-XTEN融合蛋白具有小于约30nM、或约100nM、或约200nM、或约300nM、或约400nM、或约500nM、或约600nM、或约700nM、或约800nM、或约1000nM、或约1200nM、或约1400nM的EC50值。在另一个实施方案中，当使用体外GLP2R细胞试验(如实施例中所述的或本领域已知的其他的试验)进行分析时，本发明的GLP2-XTEN融合蛋白保留未与XTEN相连接的相应GLP-2的效力的至少约1％，或约2％，或约3％，或约4％，或约5％，或约10％，或约20％，或约30％。
在一些实施方案中，本发明的GLP2-XTEN融合蛋白具有肠营养、创伤愈合和抗炎活性。在一些实施方案中，当施用至受试者时，GLP2-XTEN融合蛋白组合物展现出本文公开的一种、两种、三种或更多种胃肠相关参数的改善，这种参数改善与通过未与XTEN连接的相应GLP-2成分获得的这些参数相比高至少约20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％，或90％，或100％，或120％，或140％，至少约150％。所述参数可以尤其是选自以下的测定的参数：GLP-2的血药浓度，肠系膜血流量增加，炎症降低，增重增加，腹泻减少，粪便湿重降低，肠创伤愈合，血浆瓜氨酸浓度的增加，CRP水平的降低，类固醇治疗需求的减少，增强或刺激粘膜的完整性，钠损失减少，维持体重所需的肠外营养减少，最小化、减轻或防止肠中的细菌移位，增强、刺激或加速手术后肠的复原，防止炎性肠病的复发，或获得或维持能量稳态。在一个实施方案中，当施用至手术切除肠(例如，短肠综合征)或患有克罗恩病的受试者时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，将GLP2-XTEN融合蛋白施用至受试者导致更高的增加小肠重量和/或长度的能力。在另一个实施方案中，当向患有克罗恩病(自然获得的或实验诱导的)的受试者施用时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，GLP2-XTEN融合蛋白展现出至少高约10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％或至少约90％的减少溃疡形成的能力。在另一个实施方案中，当向患有克罗恩病(自然获得的或实验诱导的)的受试者施用时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，该融合蛋白展现出使炎性细胞因子减少至少约20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或至少约90％的能力。在另一个实施方案中，当向患有克罗恩病(自然获得的或实验诱导的，例如施用吲哚美辛)的受试者施用时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，GLP2-XTEN融合蛋白展现出高至少约10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或至少约90％的减少粘膜萎缩的能力。在另一个实施方案中，当向患有克罗恩病(自然获得的或实验诱导的，例如施用吲哚美辛)的受试者施用时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，GLP2-XTEN融合蛋白展现出高至少约5％、或至少约6％、或7％、或8％、或9％、或10％、或11％、或12％、或15％或至少约20％的提高肠绒毛高度的能力。在另一个实施方案中，当向患有克罗恩病(自然获得的或实验诱导的，例如，施用吲哚美辛)的受试者施用时，与未与XTEN相连接并以nmol/kg的可比剂量和剂量方案施用的相应GLP-2相比，GLP2-XTEN融合蛋白展现出高至少约10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或至少约90％的增加体重的能力。在本段的前述实施方案中，受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
本发明的组合物包括当施用于受试者时对于调节或预防或改善与GLP-2相关的胃肠病症有用的融合蛋白，所述胃肠病症例如但不限于溃疡、胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、短肠综合征(short bowel syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、由癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠道损伤(bowel trauma)、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID相关胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、与癌症化疗相关的粘膜炎和过敏性肠病、隐窝炎、缺血和中风。
特别关注的是GLP2-XTEN融合蛋白组合物，对其获得与天然GLP-2相比提高的药代动力学参数、增加的溶解度、增加的稳定性或一些其他增强的药学性质，从而提供具有提高效力、安全性或导致减少给药频率和/或改善患者管理的组合物。本文公开的实施方案的GLP2-XTEN融合蛋白展现出改善的性质和/或如本文详细描述的实施方案的一种或多种或任意组合。因此，考虑各种目的而设计并制备主题GLP2-XTEN融合蛋白组合物，包括通过以下方式提高生物活性GLP-2的治疗效力：例如与未连接XTEN的GLP-2相比，在施用给受试者时，增加体内暴露或GLP2-XTEN在治疗窗内维持的时长。
在一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含连接至单一XTEN(例如，以上所述的XTEN)的单一GLP-2分子。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN包含连接至两个XTEN的单一GLP-2，其中XTEN可以是相同的或者它们可以是不同的。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含连接至第一和第二XTEN的单一GLP-2分子，其中GLP-2是与选自表1的蛋白质序列具有至少约80％序列同一性，或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列，并且第一和第二XTEN各自为与选自表4的一个或多个序列或其片段具有至少约80％序列同一性，或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含与表33和表34的序列具有至少约80％序列同一性，或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列。
1.GLP2-XTEN融合蛋白构型
本发明提供了具有以特定N-端至C-端构型连接的GLP-2和XTEN组分的GLP2-XTEN融合蛋白组合物。
在GLP2-XTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了一种式I的融合蛋白：
(GLP-2)-(XTEN) I
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列，并且XTEN是如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于与表4中所列的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种式II的融合蛋白：
(XTEN)-(GLP-2) II
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列，并且XTEN是如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于与表4中所述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式III：
(XTEN)-(GLP-2)-(XTEN) III
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列，并且XTEN是如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于表4中所述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式IV：
(GLP-2)-(XTEN)-(GLP-2) IV
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列，并且XTEN是如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于与表4中所述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式V：
(GLP-2)-(S)x-(XTEN) V
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列；S是具有1至约50个氨基酸残基、可任选地包括与限制性位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔区序列；x为0或1；并且XTEN为如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于与表4中所述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在GLP2-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VI：
(XTEN)x-(S)x-(GLP-2)-(S)y-(XTEN)y VI
其中对于每次出现独立地，GLP-2为本文所定义的GLP-2蛋白或变体，包括与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列；S是具有1至约50个氨基酸残基、可任选地包括与限制性位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔区序列；x为0或1，y为0或1，其中x+y>1；并且XTEN为如本文所述的延伸的重组多肽，包括但不限于与表4中所列的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
式I-VI的实施方案包含GLP2-XTEN构型，其中长度为约36个氨基酸到3000个氨基酸的一个或多个XTEN(例如，选自表4的序列或其片段，或展现出与其至少约90-95％或更大的序列同一性的序列)连接至GLP-2的N-端或C-端。式V的实施方案进一步提供了其中XTEN经由可任选地包含与限制性位点相容的氨基酸或可包括裂解序列(例如，下文更充分描述的表5和表6的序列)的间隔区序列连接至GLP-2的构型，以使得在限制性位点的情况下，将XTEN编码的序列整合至GLP2-XTEN构建体中，在裂解序列的情况下，XTEN可通过适合于裂解序列的蛋白酶的作用而从融合蛋白中释放。在式V的一个实施方案中，该融合蛋白包含是单个甘氨酸残基的间隔区序列。
2.具有间隔区序列和裂解序列的GLP2-XTEN融合蛋白构型
在另一方面，本发明提供了配置有并入XTEN或与之相邻的一种或多种间隔区序列的GLP2-XTEN，该XTEN设计用于并入或增强对组合物的功能或性质，或有助于对融合蛋白组合物的组装或制造。此类性质包括但不限于裂解序列的包含，如TEV或表6中的其他裂解序列，以允许组分的释放，与核苷酸限制性位点相容的氨基酸的包含，以允许将编码XTEN的核苷酸连接至编码GLP-2的核苷酸或促进表达载体的构建，和设计为降低GLP2-XTEN融合蛋白区域中的空间位阻的连接体。
在一个实施方案中，可在XTEN序列与GLP-2组分之间引入间隔区序列以降低空间位阻，使得GLP-2组分可以采取其期望的三级结构和/或适当地与其靶受体相互作用。关于间隔区和鉴定期望的间隔区的方法参见例如George等(2003)Protein Engineering 15:871–879，明确地通过引用的方式并入。在一个实施方案中，间隔区包含长度为1-50个氨基酸残基或者长度为约1-25个残基或约1-10个残基的一个或多个肽序列。除裂解位点外，间隔区序列可以包含20种天然L氨基酸的任何一个，并且将优选地具有类似于XTEN的性质，因为1)它们将包含无空间位阻的亲水性氨基酸，例如但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)和天冬氨酸(D)；和2)将基本上是非重复性的。此外，将间隔区序列设计为避免引入T细胞表位；以上以及在实施例中描述了对其的确定。在一些情况下，间隔区可以是多聚甘氨酸或多聚丙氨酸，或者主要是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基组合的混合物。在一个实施方案中，除裂解位点氨基酸外，间隔区序列具有由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的约1-10个氨基酸，并且基本上没有二级结构；例如，如通过Chou-Fasman和/或GOR算法确定的，小于约10％或小于约5％。在一个实施方案中，间隔区序列是GPEGPS。在另一个实施方案中，间隔区序列是单个甘氨酸残基。在另一个实施方案中，间隔区序列是连接至表6的裂解序列的GPEGPS。
在一个特定的实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含在有效负载的GLP-2序列与并入该融合蛋白中的一个或多个XTEN之间的连接处连接的一个或多个间隔区序列，其中该间隔区序列包含与编码限制性位点的核苷酸相容的氨基酸。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含在有效负载的GLP-2序列与并入该融合蛋白中的信号序列之间的连接处连接的一个或多个间隔区序列，其中该间隔区序列包含裂解序列(例如，TEV)以在表达后释放GLP2-XTEN。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含在有效负载的GLP-2序列与并入该融合蛋白中的一个或多个XTEN之间的连接处连接的一个或多个间隔区序列，其中该间隔区序列包含与编码限制性位点的核苷酸相容的氨基酸，并且所述氨基酸和所述一个或多个间隔区序列氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白包含在有效负载的GLP-2序列与并入该融合蛋白中的一个或多个XTEN之间的连接处连接的一个或多个间隔区序列，其中该间隔区序列包含与编码限制性位点的核苷酸相容的氨基酸，并且所述一个或多个间隔区序列选自表5的序列。每个间隔区序列的确切序列选定为与用于特定GLP2-XTEN构建体的表达载体中的克隆位点相兼容。对于其中单一XTEN连接至N端或C端的实施方案，将仅需要在两个组分的连接处的单个间隔区序列。对于本领域技术人员显而易见的是，当以合成方式产生整个GLP2-XTEN基因时，将从该构建体中省略包含与限制性位点相容的氨基酸的间隔区序列，而不是使用GLP-2和XTEN编码基因进行连接。
表5：与限制性位点相容的间隔区序列
间隔区序列 限制性内切酶
GSPG BsaI
ETET BsaI
PGSSS BbsI
GAP AscI
GPA FseI
GPSGP SfiI
AAA SacII
TG AgeI
GT KpnI
GAGSPGAETA SfiI
ASS XhoI
在另一方面，本发明提供了具有并入间隔区序列中的裂解序列的GLP2-XTEN构型。在一些实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白组合物中的间隔区序列包含一个或多个裂解序列，这些裂解序列是相同的或不同的，其中裂解序列可通过蛋白酶作用以从该融合蛋白中释放XTEN序列。在一个实施方案中，设计裂解序列向GLP2-XTEN中的并入以允许在从XTEN组分释放时变得有活性或活性更强的GLP-2的释放。裂解序列位于与GLP-2序列足够近，一般在GLP-2序列末端的18、或12、或6、或2个氨基酸之内，使得与GLP-2连接的任何其余残基在裂解之后不明显干扰GLP-2的活性(例如，诸如结合至GLP-2受体)，而提供对蛋白酶的足够接近以能够实现裂解序列的裂解。在一些情况下，包含裂解序列的GLP2-XTEN还将具有在GLP-2与该裂解序列或XTEN与该裂解序列之间的一种或多种间隔区序列氨基酸，以促进蛋白酶接近裂解序列；包含任何天然氨基酸(包括作为优选的氨基酸的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸)的间隔区氨基酸。在一个实施方案中，裂解位点是可通过哺乳动物受试者内源性蛋白酶裂解的序列，使得GLP2-XTEN可以在施用给受试者之后被裂解。在此类情况下，GLP2-XTEN可以用作GLP-2的前药或循环贮剂。在前述的特定构建体中，GLP2-XTEN将具有一个或多个连接至N端和/或C端的XTEN，使得XTEN可以被释放，从而留下游离的GLP-2的活性形式。在前述构建体的一个实施方案中，通过裂解序列的裂解而从融合蛋白释放的GLP-2与完整的GLP2-XTEN融合蛋白相比展现出生物活性至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍的增加。
本发明涉及的裂解位点的实例包括但不限于可被哺乳动物内源性蛋白酶或被非哺乳动物蛋白酶裂解的多肽序列，所述哺乳动物内源性蛋白酶选自FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20，所述非哺乳动物蛋白酶例如TEV、肠激酶、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)和分选酶A。已知被前述蛋白酶和其他蛋白酶裂解的序列是本领域已知的。本发明涉及的示例性的裂解序列和序列内各自的切割位点及序列变体在表6中提供。因此，裂解序列，尤其是表6中的那些对在炎症期间存在的内源性蛋白酶敏感的裂解序列，将提供GLP-2的释放，在GLP2-XTEN的某些实施方案中，其提供从完整形式的GLP2-XTEN释放的GLP-2组分的更高程度的活性，以及施用于受试者的高剂量GLP2-XTEN的额外安全裕度。例如，已经证明，克罗恩病和发炎的肠中许多金属蛋白酶增多(D Schuppan和T Freitag..Fistulising Crohn’sdisease:MMPs gone awry.Gut(2004)53(5):622–624)。在一个实施方案中，本发明提供了包含有效地放置的一个或多个裂解序列以在裂解时从融合蛋白释放GLP-2的GLP2-XTEN，其中所述一个或多个裂解序列与选自表6的序列具有至少约86％、或至少约92％或更大的序列同一性。在另一个实施方案中，包含裂解序列的GLP2-XTEN与选自表34的序列相比将具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，位于切割位点两侧的仅两个或三个氨基酸(共计4至6个氨基酸)被加入裂解序列，裂解序列转而被加入至该实施方案的GLP2-XTEN中。在其他实施方案中，加入的表6的裂解序列可具有针对已知序列中任何一个或两个或三个氨基酸的一个或多个缺失或插入或一个或两个或三个氨基酸置换，其中所述缺失、插入或置换导致减少或增加的对蛋白酶的敏感性而非没有敏感性，从而导致改变GLP-2从XTEN释放的速率的能力。示例性置换示于表6。
表6:蛋白酶裂解序列
↓指示裂解位点 NA：不适用
*斜杠之前、之间或之后的多个氨基酸的列出指示在该位置可以被置换的可选氨基酸；“-”表示任何氨基酸可以置换中间列中所示的相应氨基酸。
3.示例性GLP2-XTEN融合蛋白序列
含有与一个或两个XTEN连接(在N端或C端连接)的单个GLP-2的融合蛋白序列的非限制性实例在表13和表32中提供。在一个实施方案中，GLP2-XTEN组合物将包含与选自表13或表33的GLP2-XTEN具有至少约80％序列同一性、备选地与来自表13或表33的GLP2-XTEN相比具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列同一性的融合蛋白。然而，本发明还涉及用表1的任何GLP-2序列置换表13或表33的GLP2-XTEN的GLP-2组分，和/或用表4的任何序列置换表13或表33的GLP2-XTEN的XTEN组分。在优选的实施方案中，上述实例得到的GLP2-XTEN保留了未与XTEN连接的相应GLP-2的至少一部分生物活性；例如，结合和激活GLP-2受体和/或导致肠营养、增殖或创伤愈合效应的能力。在本段上文描述的前述融合蛋白中，GLP2-XTEN融合蛋白还可以包含一个或多个裂解序列；例如表6的序列；所述裂解序列位于GLP-2与XTEN之间。在包含裂解序列的一些实施方案中，完整的GLP2-XTEN组合物在其完整形式下与未与XTEN连接的相应GLP-2相比具有较低的生物活性但较长的半衰期，但设计为当施用于受试者时，GLP-2组分通过内源性蛋白酶在裂解序列处裂解而逐渐从融合蛋白释放，于是GLP-2组分展现出活性，即有效结合至GLP-2受体的能力。在非限制性实例中，具有裂解序列的GLP2-XTEN与来自表34的序列相比具有约80％的序列同一性，或与来自表34的序列相比具有约85％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性。然而，本发明还涉及用表1的任何GLP-2序列置换表34的GLP2-XTEN的GLP-2组分、用表4的任何序列置换表34的GLP2-XTEN的XTEN组分和用表6的任何裂解序列置换表34的GLP2-XTEN的裂解组分。在一些情况下，本段前述实施方案的GLP2-XTEN作为前药或循环贮剂，与未与XTEN连接的GLP-2相比产生较长的终末半衰期。在此类情况下，可向受试者施用较高浓度的GLP2-XTEN，以便与未与XTEN连接的GLP-2相比，维持较长一段时间的治疗性血药水平，因为较小比例的循环组合物是具有活性的。
可使用如本文所述的试验和体内参数来评估该实施方案的GLP2-XTEN组合物的生物活性(例如，实施例的分析或表32的分析)，或使用实施例中所述的方法或本领域已知的用于评估GLP-2生物活性以确定构型或GLP-2序列变体的适合性的其他方法来评估在GLP-2缺陷临床模型或人体临床试验中的药效学效应，并且认为与天然GLP-2序列相比保留了至少约40％、或约50％、或约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或更多生物活性的那些GLP2-XTEN组合物(包括在任何并入的释放XTEN的裂解位点裂解后)适合用于GLP-2-相关疾病的治疗。
V).本发明的GLP2-XTEN组合物的性质
(a)GLP2-XTEN药代动力学性质
本发明的目的在于提供与未和XTEN连接的GLP-2相比具有增强的药代动力学的GLP2-XTEN融合蛋白。可通过将给定的XTEN连接至GLP-2而增强的GLP-2的药代动力学性质包括但不限于终末半衰期、曲线下面积(AUC)、Cmax、分布体积，与未和XTEN连接的GLP-2相比将生物活性GLP2-XTEN在治疗窗内维持在最小有效剂量或血液单位浓度以上较长的一段时间，和生物利用度；允许较低给药频率或增强药理效应的性质，从而导致在胃肠病症治疗中的增强的效用。
已报道天然GLP-2在人体内具有大约7分钟的终末半衰期(Jeppesen PB等,Teduglutide(ALX-0600),a dipeptidyl peptidase IV resistant glucagon-likepeptide 2analogue,improves intestinal function in short bowel syndromepatients.Gut.(2005)54(9):1224-1231；Hartmann B等(2000)Dipeptidyl peptidase IVinhibition enhances the intestinotrophic effect of glucagon-like peptide-2inrats and mice.Endocrinology141:4013–4020)，而类似物替度鲁肽在人体内展现出大约0.9-2.3hr的终末半衰期(Marier JF,Population pharmacokinetics of teduglutidefollowing repeated subcutaneous administrations in healthy participants andin patients with short bowel syndrome and Crohn's disease.J Clin Pharmacol.(2010)50(1):36-49)。技术人员将会理解，GLP2-XTEN实施方案的药代动力学性质将与未和XTEN连接的GLP-2的可比形式即重组体、天然序列或替度鲁肽样类似物进行比较。
由于XTEN赋予的增强的性质，当以通过本文所述的方法确定为适合用于组合物的剂量和剂量方案使用GLP2-XTEN时，GLP2-XTEN融合蛋白组合物的施用可达到循环浓度，从而与可比剂量的未与XTEN连接的相应GLP-2相比在较长的一段时间内产生期望的药理学或临床效应。如本文所用的，“可比剂量”指以可比的方式施用给受试者的活性GLP-2药效团(例如，GLP-2)的相等mol/kg的剂量。在本领域应理解，“可比剂量”的GLP2-XTEN融合蛋白将代表更大重量的物质，但在施用的融合蛋白剂量中具有基本上相同的摩尔当量的GLP-2。
在一个实施方案中，本发明提供了通过将一个或多个XTEN连接至融合蛋白的GLP-2组分而提高融合蛋白的药代动力学的GLP2-XTEN，其中融合蛋白的表观分子量因子增加至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约7倍，或至少约8倍，或至少约10倍，或至少约12倍，或至少约15倍，并且其中当向受试者施用时，与未与XTEN连接的相应GLP-2相比，GLP2-XTEN的终末半衰期增加至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约7倍，或至少约8倍，或至少约10倍或更多。在前述的实施方案中，其中融合蛋白包含并入GLP2-XTEN中的至少两个XTEN分子，XTEN可以是相同的或它们可以具有不同的序列组成(和净电荷)或长度。XTEN与选自表4的序列相比可以具有至少约80％的序列同一性，或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。不受特定理论的束缚，如上所述，期望具有较高净电荷的GLP2-XTEN组合物的XTEN与将会进一步有助于降低主动清除的多种带负电的表面如血管、组织或多种受体具有较少的非特异性相互作用。相反，考虑到炎症应答过程中肠中炎症细胞的已知关联，预期具有低(或无)净电荷的GLP2-XTEN组合物的XTEN与增强相关的GLP-2的生物活性的表面具有较高程度的相互作用。因此，本发明提供了其中融合蛋白的效力、生物利用度和半衰期可通过对GLP2-XTEN组合物中XTEN的类型和长度的选择和布置来进行调整的GLP2-XTEN。因此，本发明涉及其中来自表1的GLP-2和来自表4的XTEN组合并以选自式I-VI中任一者的构型而产生以使得该构建体具有增强的药代动力学性质和降低的系统清除率的组合物。本发明进一步利用了以下事实：某些与清除受体的结合降低(由于结合速率的降低或解离速率的增加)的配体，可以通过N端或C端阻碍并且使用该末端作为与组合物的另一多肽的连接而实现，无论是GLP-2的另一分子、XTEN还是间隔区序列导致结合降低。对GLP2-XTEN融合蛋白的特定构型的选择可通过本文公开的方法来检测，以确认降低与清除受体的结合程度以便实现主动清除率降低的那些构型。
在一个实施方案中，本发明提供了具有增强的药代动力学性质的GLP2-XTEN，其中GLP2-XTEN是与选自表13、表32或表33中任一个的序列相比具有至少约80％的序列同一性或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的序列。在其他实施方案中，具有增强的药代动力学性质的GLP2-XTEN包含与来自表1的、与一个或多个XTEN连接的序列相比具有至少约80％的序列同一性或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列同一性的GLP-2序列，来自表1的、与一个或多个XTEN连接的序列与来自表4的序列相比具有至少约80％的序列同一性或备选地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列同一性。对于主题组合物，具有较长的终末半衰期的GLP2-XTEN通常是优选的，以改善患者的便利性，增大给药间隔以及降低获得持续效应所需的药物的量。在本段中所述的以上实施方案中，融合蛋白的施用导致本文公开为可用于评估受试者的状况的至少一种、两种、三种或更多参数的改善；例如，维持血药浓度、维持肠道功能、防止与胃肠病症如结肠炎、短肠综合征或克罗恩病相关的症状的发作、与未和融合蛋白连接的相应的GLP-2组分相比使用较低剂量的融合蛋白和以可比剂量或剂量方案施用于受试者。备选地，在本段中描述的上述实施方案中，融合蛋白的施用导致本文公开为可用于评估受试者的状况的至少一种参数的改善，其中使用可比剂量的融合蛋白，但使用与未和融合蛋白连接并施用于受试者的相应GLP-2组分相比具有大2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或10倍、或20倍的给药间隔的给药方案进行施用并施用于受试者。在前述的实施方案中，为了达到参数改善而施用的以毫摩尔/kg为单位的总剂量比未与XTEN连接的相应GLP-2组分低至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约8倍，或至少约10倍。
如实施例中对包含XTEN的融合蛋白的药代动力学特征更全面描述的，观察到增加XTEN序列的长度导致包含XTEN的融合蛋白终末半衰期不成比例的增加。因此，本发明提供了包含XTEN的GLP2-XTEN融合蛋白，其中选择XTEN为施用给受试者的GLP2-XTEN组合物提供目标半衰期。在一些实施方案中，本发明提供了包含XTEN的单体GLP2-XTEN融合蛋白，其中选择XTEN为施用给受试者的GLP2-XTEN带来与以可比剂量施用的未连接XTEN的相应GLP-2相比终末半衰期的增加，其中所述增加为与未连接XTEN的GLP-2相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍或更高的终末半衰期的增加。在另一个实施方案中，与未连接XTEN的可比剂量的相应GLP-2相比，向有需要的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN导致长至少12h、或至少约24h、或至少约48h、或至少约72h、或至少约96h、或至少约144h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天的终末半衰期。在另一个实施方案中，与未连接XTEN并以可比剂量施用的相应GLP-2相比，向有需要的受试者施用治疗有效剂量的GLP2-XTEN融合蛋白可导致在连续剂量之间维持融合蛋白的治疗有效血药水平所需的连续剂量之间时间增加至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天或至少约21天。在本领域中应理解，维持治疗有效血药水平的连续剂量之间的时间将根据受试者的生理状态而发生极大变化，并且应当理解，克罗恩病患者与接受针对短肠综合征的相同制剂的患者相比可能需要更频繁和更长时间施用GLP-2制剂。尽管如前所述，但是据认为，本发明的GLP2-XTEN与未连接XTEN的GLP-2相比允许如上所述的较低的给药频率。在一个实施方案中，使用治疗有效量向受试者施用GLP2-XTEN导致GLP2-XTEN融合蛋白的血药浓度维持在高于至少500ng/ml、或至少约1000ng/ml、或至少约2000ng/ml、或至少约3000ng/ml、或至少约4000ng/ml、或至少约5000ng/ml、或至少约10000ng/ml、或至少约15000ng/ml、或至少约20000ng/ml、或至少约30000ng/ml、或至少约40000ng/ml，持续至少约24小时、或至少约48小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或至少约144小时。
在一个实施方案中，本发明提供了GLP2-XTEN融合蛋白，与未连接XTEN并以可比剂量施用于受试者的相应GLP-2相比，其展现出至少约50％、或者至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约300％、或至少约500％、或至少约1000％、或至少约2000％的AUC增加。在另一个实施方案中，以合适的剂量将GLP2-XTEN施用于受试者导致单次剂量后GLP2-XTEN融合蛋白的曲线浓度下面积为至少100000hr*ng/mL、或至少约200000hr*ng/mL、或至少约400000hr*ng/mL、或至少约600000hr*ng/mL、或至少约800000hr*ng/mL、或至少约1000000hr*ng/mL、或至少约2000000hr*ng/mL。GLP2-XTEN的药代动力学参数可以通过标准方法测定，包括给药、以时间间隔取血样和使用ELISA、HPLC、放射性分析或本领域已知或本文描述的其他方法分析蛋白质，随后标准计算数据以推导半衰期和其他PK参数。
与未连接XTEN的GLP-2相比，PK参数的升高允许减少GLP2-XTEN组合物的剂量，尤其是对于接受胃肠病症的常规预防或慢性治疗的那些受试者。在一个实施方案中，根据维持与相应量的未连接XTEN的GLP-2可比的曲线下面积所需的剂量方案，与未连接XTEN的相应GLP-2相比，施用少约2倍、或少约3倍、或少约4倍、或少约5倍、或少约6倍、或少约8倍、或少约10倍或更多的较小摩尔当量的融合蛋白。在另一个实施方案中，根据与相应量的未连接XTEN的GLP-2相比在至少约24小时、或至少约48h、或至少72h、或至少96h、或至少120h内维持高于至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、或至少约2000ng/ml、或至少约3000ng/ml、或至少约4000ng/ml、或至少约5000ng/ml、或至少约10000ng/ml、或至少约15000ng/ml、或至少约20000ng/ml、或至少约30000ng/ml、或至少约40000ng/ml的血药浓度所需的剂量方案，与未连接XTEN的相应GLP-2相比，施用少约2倍、或少约3倍、或少约4倍、或少约5倍、或少约6倍、或少约8倍、或少约10倍或更多的较小摩尔量的融合蛋白。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白需要较低频率的给药来治疗具有胃肠病症的受试者，其中大约每隔4天、大约每隔7天、大约每隔10天、大约每隔14天、大约每隔21天、或大约每月向受试者施用融合蛋白，并且该融合蛋白达到了与未连接XTEN的相应GLP-2可比的曲线下面积。在其他实施方案中，根据获得治疗结果或临床参数所需的剂量方案向受试者施用比未连接XTEN的GLP-2的相应量小约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的融合蛋白的较小累计摩尔量，然而融合蛋白达到了与未连接XTEN的相应GLP-2至少可比的曲线下面积。累计较小量是至少约一周、或约14天、或约21天、或约一个月时间段的测量值。
(b)GLP2-XTEN的药理学和药学性质
本发明提供了包含与XTEN共价连接的GLP-2的GLP2-XTEN组合物，与未连接XTEN的GLP-2相比，XTEN可具有增强的性质，还提供了增强该组合物的两个GLP-2组分各自的治疗活性和/或生物活性或效应的方法。此外，GLP2-XTEN融合蛋白提供了超越化学偶联物例如GLP-2的聚乙二醇化构建体的显著优势，值得注意的事实是，重组GLP2-XTEN融合蛋白可以在宿主细胞表达系统中制备，这可以减少产物的研发和生产阶段的时间和花费，并且得到与聚乙二醇化的偶联物相比更均一确定的产物，该产物和GLP2-XTEN代谢物具有更低的毒性。
作为治疗剂，GLP2-XTEN具有优于不包含XTEN的治疗剂的许多优势，包括以下非限制性增强性质中的一个或多个：增加的溶解度，增加的热稳定性，减少的免疫原性，增加的表观分子量，减少的肾清除，减少的蛋白水解，减少的代谢，增强的治疗效力，较低的有效治疗剂量，增加的生物利用率，增加的能够维持患者没有增加的结肠炎、肠炎或克罗恩病的症状的剂量间时间，静脉、皮下或肌内施用GLP2-XTEN组合物的能力，当静脉、皮下或肌内施用时“修改的”吸收率，增强的冻干稳定性，增强的血清/血浆稳定性，增加的终末半衰期，增加的血流溶解度，降低的中和抗体的结合，降低的活性清除，减少的副作用，降低的免疫原性，底物结合亲和力的保留，降解稳定性，冻融稳定性，对蛋白酶的稳定性，对遍在蛋白化的稳定性，容易施用，与其他药物赋形剂或载体的相容性，在受试者中的持久性，增加的存储稳定性(例如，增加的半衰期)，生物体或环境中减少的毒性等。本文公开的实施方案的GLP2-XTEN融合蛋白展现出如本文详述的改进的性质和/或实施方案的一种或多种任意组合。增强的性质的净效应在于GLP2-XTEN组合物的使用在施用给GLP-2相关病症的受试者时，与未连接XTEN的GLP-2相比导致增强的治疗效果和/或生物效应，导致与较小给药频率相关的经济效益或导致改善的患者依从性。
在一个实施方案中，XTEN作为融合配偶体增加了GLP-2有效负载的溶解度。因此，当期望增强GLP-2的药学或物理化学性质例如水溶解度或稳定性的程度时，并入融合蛋白的XTEN序列的长度和/或基序家族组成可以各自被选择为赋予各自融合蛋白不同的溶解度和/或稳定性程度，使得GLP2-XTEN组合物的整体药学性质被增强。GLP2-XTEN融合蛋白可以使用本文所述的方法构建并分析以确认物理化学性质，并且按需要调整XTEN以得到期望的性质。在一个实施方案中，GLP2-XTEN具有的水溶解度比未连接融合蛋白的GLP-2大至少约25％，或者比未连接融合蛋白的相应GLP-2大至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％、或至少约400％、或至少约500％、或至少约1000％。
本发明提供了从宿主细胞制备并回收与未连接XTEN的GLP-2相比具有增强的溶解度并容易回收的表达的GLP2-XTEN的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：用编码具有累积序列长度大于约100、或大于约200、或大于约400、或大于约800个氨基酸残基的一个或多个XTEN组分的GLP2-XTEN的多核苷酸转化宿主细胞，在宿主细胞中表达GLP2-XTEN融合蛋白，并以可溶的形式回收表达的融合蛋白。在前述的实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白的XTEN可与选自表4的一个或多个XTEN具有至少约80％的序列同一性，或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％的序列同一性，并且GLP-2可与选自表1的GLP-2具有至少约80％的序列同一性，或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或100％的序列同一性，并且GLP2-XTEN组分可以为选自式I-VI的任何一个的N端至C端构型。
本发明提供了产生GLP2-XTEN组合物的方法，该GLP2-XTEN组合物与未连接XTEN的相应GLP-2相比可以使GLP-2组分在施用于有需要的受试者时在治疗水平下维持至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍的更长的时间段。在本领域应理解，“可比剂量”的GLP2-XTEN融合蛋白代表更大重量的物质，但在融合蛋白剂量中具有近似相同摩尔数的GLP-2，和/或相对于未连接XTEN的GLP-2的剂量将具有相同的近似nmol/kg浓度。产生可使GLP-2组分维持在治疗水平的组合物的方法包括以下步骤：鉴于给定剂量和剂量方案选择适合偶联至GLP-2的XTEN以提供期望的药代动力学性质，产生使用本文所述的构型编码GLP2-XTEN的表达构建体，利用包含编码基因的表达载体转化适当的宿主细胞，表达并回收GLP2-XTEN，GLP2-XTEN施用于受试者，随后通过测定确认药代动力学性质、GLP2-XTEN融合蛋白的活性(例如，结合受体的能力)和施用的组合物的安全性。受试者可选自小鼠、大鼠、猴和人。通过所述方法，本文提供的GLP2-XTEN可通过将GLP-2的循环浓度维持在治疗水平持续延长的一段时间而导致施用的组合物的效力增强。
在另一方面，本发明的GLP2-XTEN组合物能够产生肠营养效应。如本文所用的，“肠营养效应”是指受试者如小鼠、大鼠、猴或人在施用含有GLP-2的组合物后表现出以下的至少一项：肠增长、增加的绒毛上皮增生、增加的隐窝细胞增殖、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后愈合增强、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡降低或肠功能的加强。GLP2-XTEN组合物可以内分泌的方式起作用以将肠增长和代谢与营养摄取联系起来。GLP-2和相关的类似物可用于治疗短肠综合征、克罗恩病、骨质疏松症，并且在本文所述的其他胃肠病症中，可以在癌症化疗期间作为辅助治疗。在一个实施方案中，当使用有效量施用于受试者时，GLP2-XTEN能够产生至少一种、或两种、或三种或更多种肠营养效应。
本发明GLP2-XTEN组合物的特征(包括功能特征或生物和药理活性以及所得到的参数)通过本领域已知用于测量期望特征的任何适合的筛选测定来确定。本发明提供了测定不同组成或构型的GLP2-XTEN融合蛋白的方法以提供具有期望程度的生物和/或治疗活性以及安全性特征的GLP2-XTEN。使用特定的体外、体内和离体生物测定来评估每种构型的GLP2-XTEN和/或待加入GLP2-XTEN的GLP-2组分的活性，包括但不限于实施例的测定、表32的测定、炎性细胞因子水平的确定、GLP-2血药浓度、ELISA测定或肠功能检查以及临床终点如在本领域已知的之中，出血、炎症、结肠炎、腹泻、粪便湿重、体重减轻、钠损失、肠溃疡、肠梗阻、瘘管和脓肿、存活。前述测定或终点还可用于临床前测定以评估GLP-2序列变体(作为单个组分或作为GLP2-XTEN融合蛋白来测定)，并可与天然人类GLP-2进行比较以确定它们是否具有与天然GLP-2或其某些部分相同程度的生物活性，使得它们适合包含在GLP2-XTEN中。在一个实施方案中，本发明提供了与未连接XTEN并使用可比剂量施用至受试者的相应GLP-2相比展现出至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％或至少约120％或至少约150％或至少约200％的肠营养效应的GLP2-XTEN融合蛋白。
剂量优化对于所有药物都是重要的。GLP2-XTEN的治疗有效剂量或治疗有效量随诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及施用的融合蛋白在个体中引起期望应答的能力等因素而变化。例如，标准化的单剂量GLP-2对于具有多样肺部病症或异常临床参数(例如，中和抗体)的所有患者不总是有效的。这些因素的考虑完全在普通技术人员能力范围内，目的是确定GLP2-XTEN的治疗或药理学有效量和适当的给药方案以及会导致不足效力而无法实现临床改善的量。
本发明的方法包括施用连续剂量的治疗有效量的GLP2-XTEN持续足以达到和/或维持期望参数或临床效应的一段时间，并且治疗有效量的此类连续剂量建立了GLP2-XTEN的治疗有效剂量方案，即融合蛋白组合物的连续施用剂量安排，其中以一定的量给予剂量，该量对GLP-2相关疾病状态或病症(包括但不限于本文所述的那些)的任何临床指征或症状、方面、测定的参数或特征产生持续的有益效应。预防有效量是指对于预防生理或临床结果或事件的必要时间段所需的GLP2-XTEN的量；所述生理或临床结果或事件例如是，肠系膜血流量降低、出血、炎症、结肠炎、腹泻、粪便湿重、体重减轻、钠损失、肠溃疡、肠梗阻、瘘管和脓肿、排便频率的改变、葡萄膜炎、儿童生长不良或维持GLP-2的血药浓度高于阈值水平，例如，100ng/ml的GLP-2等效量(或大约2200ng/ml的GLP-2-2G_XTEN_AE864)或30pmol/L。在治疗方法中，对于受试者，施用于受试者的GLP2-XTEN的剂量为约0.2-500mg/kg/剂量(2.5nmol/kg–6250nmol/kg)、或约2-300mg/kg/剂量(25nmol/kg–3750nmol/kg)、或约6至约100mg/kg/剂量(75nmol/kg/剂量–1250nmol/kg/剂量)、或约10至约60mg/kg/剂量(125nmol/kg/剂量–750nmol/kg/剂量)。合适的剂量还可以取决于可影响对药物的响应的其他因素；例如，手术切除肠的受试者与肠易激综合征相比通常需要更高的剂量。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含含有与一个或多个XTEN序列连接的GLP-2的GLP2-XTEN融合蛋白组合物和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物，导致至少一种公开的参数或生理状况的较大改善，或与对由施用包含未连接XTEN的GLP-2的药物组合物并以可比剂量施用而介导的参数、病症或临床结果的影响相比导致更有利的临床结果。在前述的一个实施方案中，通过施用治疗有效剂量的GLP2-XTEN药物组合物获得所述改善。在前述的另一个实施方案中，通过使用治疗有效剂量方案(如本文所定义的)施用多种连续剂量的GLP2-XTEN药物组合物持续给药周期长度而获得所述改善。
在许多情况下，GLP-2在不同年龄或疾病程度的受试者中的治疗水平已经被确立并可获自公开的文献或陈述于含有GLP-2的批准产品的药物标签上。在其他情况下，可为新组合物确立治疗水平，包括本公开内容的那些GLP2-XTEN融合蛋白。为给定组合物确立治疗水平和给药方案的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGraw-Hill(2005))。例如，通过在具有目标疾病或病症的受试者中使用剂量放大研究来确定效力或期望的药理效应、不良事件的出现并测定循环血药水平，可以针对给定受试者或受试者群测定给定药物或生物制剂的治疗性血药水平。剂量放大研究可以通过在受试者或受试者群中监测生理或生化参数的代谢研究来评估GLP2-XTEN的活性，如本领域已知或本文描述的有关以下的参数：与GLP-2相关的疾病有关的一个或多个参数，或与特定适应症的有益结果有关的临床参数，以及确定无效剂量、不良事件、最小有效剂量等的观察和/或测量参数，以及确立测定或推导的循环血药水平的药代动力学参数的测量。然后可以将结果与符合前述测定参数或效应水平的治疗剂的施用剂量和血药浓度相关联。通过这些方法，一系列剂量和血药浓度可以与发生期望效应的最小有效剂量及最大剂量和血药浓度及其可维持的时间相关联，从而确立该组合物的治疗性血药水平和给药方案。因此，通过前述方法，确立Cmin血药水平和Cmax血药水平，低于Cmin血药水平时，GLP2-XTEN融合蛋白将不具有期望的药理效应，而高于Cmax血药水平将出现副作用。
通过本文描述的方式或通过本领域已知的其他方法，本领域技术人员可以确认施用的GLP2-XTEN维持在治疗性血药水平而保持了足够的安全性(从而建立“治疗窗”)以维持期望的间隔时间内的生物活性或者需要调整剂量或XTEN的长度或序列。而且，确定保持GLP2-XTEN在治疗窗内的适当剂量和给药频率确立了治疗有效剂量方案；使用治疗有效剂量的融合蛋白对给有相应需要的受试者施用多个连续剂量的计划表导致连续的Cmax峰和/或Cmin谷，其保持在治疗有效浓度之上并且导致与目标疾病相关的至少一个测量参数的改善。在一个实施方案中，以适当剂量施用给受试者的GLP2-XTEN导致GLP2-XTEN融合蛋白的血药浓度高于最小有效浓度以维持给定的活性或效应(如通过实施例或表32的分析所确定的)，维持时段是以可比剂量施用的未连接XTEN的相应GLP-2的至少约2倍；备选地是以可比剂量施用的未连接XTEN的相应GLP-2的至少约3倍；备选地为至少约4倍；备选地为至少约5倍；备选地为至少约6倍；备选地为至少约7倍；备选地为至少约8倍；备选地为至少约9倍，备选地至少约10倍或至少约20倍或更长。本文使用的“适当剂量”指当药物或生物制剂施用给受试者时会导致期望的治疗或药理效应和/或在治疗窗内血药浓度的剂量。例如，含有GLP-2或XTEN的包含GLP-2的融合蛋白的血清或血浆水平可通过浊度法、ELISA、HPLC、放射免疫测定法或通过免疫电泳法来测量(Jeppesen PB.Impaired meal stimulated glucagon-like peptide 2response in ileal resected short bowel patients with intestinalfailure.Gut.(1999)45(4):559-963；实施例18-21的分析)。GLP-2或GLP-2变体的表型鉴定可通过包括等电点聚焦(IEF)(Jeppsson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5690-93,1994)在内的许多方法或通过DNA分析(Kidd等,Nature,304:230-34,1983；Braun等,Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,34:761-64,1996)来实现。
在一个实施方案中，使用治疗有效剂量方案施用至少2剂量、或至少3剂量、或至少4剂量或更多剂量的GLP2-XTEN导致融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至使用可比剂量方案施用给受试者的未连接至XTEN的融合蛋白的相应生物活性蛋白的至少约3倍；备选地至少约4倍；备选地至少约5倍；备选地至少约6倍；备选地至少约7倍；备选地至少约8倍；备选地至少约9倍或至少约10倍。在另一实施方案中，以治疗有效剂量方案施用的GLP2-XTEN导致与使用GLP-2的治疗有效剂量方案施用给受试者的未连接至XTEN的相应生物活性蛋白相比，在使用药物组合物的融合蛋白的较低频率给药或较低总剂量(以摩尔计)时实现一个或两个或三个或更多测量参数的类似改善。所述测量参数包括本文公开的临床、生化或生理参数、或者本领域已知用于评估患有GLP-2相关病症的受试者的其他参数。可被分析用于评估GLP2-XTEN融合蛋白的活性的参数或生理效应的非限制性实例包括实施例、表32的分析或用于检测以下的测试或分析：肠系膜血流量降低、出血、炎症、结肠炎、腹泻、粪便湿重、钠损失、体重减轻、肠溃疡、肠梗阻、瘘管和脓肿、排便频率的改变、葡萄膜炎、儿童生长不良或维持GLP-2的血药浓度高于阈值水平，例如，100ng/ml的GLP-2等效量(或大约2200ng/ml的GLP-2-2G_XTEN_AE864)，以及由肠炎实验动物模型获得的参数，如体重增加、小肠长度、降低的小肠TNFα含量、降低的粘膜萎缩、减少的穿孔性溃疡发生率和绒毛高度。
在一些实施方案中，完整的GLP2-XTEN融合蛋白表现出GLP-2组分的生物活性，而在其他情况下，GLP-2组分的生物活性主要是在通过使用本文所述的构型和序列作用于并入GLP2-XTEN融合蛋白的裂解序列的蛋白酶的作用而从融合蛋白裂解或释放GLP-2后表现的。在上述描述中，将GLP2-XTEN设计为当连接至XTEN时降低GLP-2组分对GLP-2受体的结合亲和力，而当通过将并入GLP2-XTEN序列的裂解序列裂解而从XTEN释放时恢复或增强亲和力。在前述的一个实施方案中，本发明提供了一种包含通过裂解序列连接至至少第一XTEN的GLP-2的分离融合蛋白，其中该融合蛋白在裂解前具有小于10％的生物活性(例如，受体结合)，并且其中通过在裂解序列处的蛋白水解裂解而从融合蛋白释放的GLP-2与未连接XTEN的天然GLP-2相比具有至少约40％、至少约50％、至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％活性的生物活性。
在一个方面，本发明提供了设计为降低融合蛋白的主动清除，从而增大施用于受试者的GLP2-XTEN的终末半衰期，而仍保留生物活性的GLP2-XTEN组合物。不受任何特定理论的束缚，据认为本发明的GLP2-XTEN具有通过向GLP-2中加入非结构化XTEN而降低分子的主动清除获得的相对较高的和/或持续的活性。在循环系统以及在血管外间隙中可发生GLP-2的摄取、清除和灭活。
VI).GLP2-XTEN组合物的用途
在另一方面，本发明提供了在治疗方法中使用的GLP2-XTEN融合蛋白，所述治疗方法包括获得由GLP-2介导的或改善的胃肠病症的有益效应的治疗。如本文所用的，“胃肠病症”意指包括但不限于胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征(short-gutsyndrome)、短肠综合征(short bowel syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、由癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、肥胖、脂肪泻、自身免疫性疾病、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID相关胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎和胃肠诱发性缺血。
本发明提供了在治疗患有GLP-2相关疾病、障碍或胃肠病症的受试者(如人)以获得有益效应的方法中使用的GLP2-XTEN融合蛋白，从而解决使用具有相对短的终末半衰期、需要重复施用或具有不利的药物经济学的GLP-2制剂的其他治疗方法的缺点和/或限制。GLP-2天然、重组或合成蛋白质具有短半衰期的事实需要频繁给药以实现临床益处，这导致在此类患者管理中的困难。
在一个实施方案中，治疗方法包括向患有胃肠病症的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN组合物。在治疗方法的另一个实施方案中，GLP2-XTEN组合物的施用导致与胃肠病症相关的一种、两种、三种或更多生物化学、生理学或临床参数的改善。在前述方法中，施用的GLP2-XTEN包含与连接至至少第一XTEN的表1的GLP-2具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％的序列同一性的GLP-2，第一XTEN与选自表4和表8-12中任一个的XTEN具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％的序列同一性。在前述方法的另一个实施方案中，施用的GLP2-XTEN具有与来自表13、32或33的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，治疗方法包括将治疗有效量的GLP2-XTEN组合物以一个或多个剂量施用于患有胃肠病症的受试者，其中与未连接XTEN并使用可比量施用的GLP-2相比所述施用导致在至少2倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍的更长时期内对与疾病相关的一种、两种、三种或更多生物化学、生理学或临床参数或治疗效果的改善。在另一个实施方案中，治疗方法包括向患有GLP-2缺陷的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN组合物，其中与未连接XTEN的GLP-2相比，所述施用导致在至少2倍、或至少3倍、或至少4倍的更长持续时间内对临床相关参数或症状发作的预防或降低至低于临床相关血药浓度。在另一个实施方案中，治疗方法包括向患有胃肠病症的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN，其中与未连接XTEN并施用类似的nmol/kg量施用的GLP-2相比，所述施用导致至少与胃肠病症相关的一种、两种或三种参数的至少5％、或10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％的更大改善。在治疗方法的前述实施方案中，施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。在治疗方法的前述实施方案中，该受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在治疗方法的前述实施方案中，治疗效果或参数尤其包括但不限于，GLP-2的血药浓度、肠系膜血流量增加、炎症降低、增重增加、腹泻减少、粪便湿重降低、肠道伤口愈合、血浆瓜氨酸浓度的增加、CRP水平的降低、类固醇治疗需求的减少、增强或刺激粘膜的完整性、钠损失减少、最小化、减轻或防止肠中的细菌易位增强、刺激或加速手术后肠的复原；防止炎性肠病的复发；或达到或维持能量稳态。
在一个实施方案中，该治疗方法用于治疗具有由化疗药物引起的小肠损伤的受试者，所述化疗药物例如，但不限于，5-FU、六甲蜜胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体多柔比星、亚叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链佐星、替加氟尿嘧啶、替莫唑胺、噻替哌、硫鸟嘌呤、硫代鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在通过所述的方法施用治疗之前，可获得对胃肠病症的诊断。可通过本领域已知的标准护理方法来诊断胃肠病症。例如溃疡可通过内窥镜法或通过血液、呼吸和胃组织活检(例如，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的存在)对食道、胃和肠的钡x射线来诊断。吸收不良综合征可通过监测血液中的营养水平或粪便中的脂肪水平的血液检查或粪便检查来诊断，血液中的营养水平或粪便中的脂肪水平是吸收不良综合征的诊断指标。脂肪泻可通过抗体测试来诊断，抗体测试可包括测试抗肌内膜抗体(IgA)、抗转谷氨酰胺酶(IgA)、抗麦醇溶蛋白(IgA和IgG)和总血清IgA。内窥镜法或小肠活检可用于检测异常肠内衬，其中诸如压扁的绒毛的症状为脂肪泻的诊断指标。热带口炎性腹泻可通过使用小肠活检或对化疗的响应来检测吸收障碍或感染进行诊断。炎性肠病可通过结肠镜检法或通过结合临床症状的钡剂灌肠之后的x射线法来检测，其中结肠壁的炎症、出血或溃疡是炎性肠病如溃疡性结肠炎或克罗恩病的诊断指标。
在治疗方法的一些实施方案中，向受试者施用GLP2-XTEN导致生化、生理或临床参数的一个或多个的改善，改善幅度大于使用相同的试验所测定或基于测量的临床参数的未连接XTEN的相应GLP-2组分导致的改善幅度。在前述的一个实施方案中，向有需要的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN组合物，与可比量的未连接XTEN的相应GLP-2相比，在施用2-7天后导致受试者中约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或更多的成人短肠综合征(SBS)患者的肠胃外营养(PN)依赖性的更大降低。在另一个实施方案中，使用治疗有效剂量方案向有需要的受试者施用GLP2-XTEN，与未连接XTEN的相应GLP-2的可比的治疗有效剂量方案相比，在施用开始7、10、14、21或30天后导致受试者体重增加10％，或约20％，或约30％，或约40％，或约50％或更多。在另一个实施方案中，向有需要的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN组合物，与可比量的未连接XTEN的相应GLP-2相比，在施用2-7天后导致受试者中约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％或更多的成人短肠综合征(SBS)患者的粪便湿重的更大的降低。在另一个实施方案中，向有需要的受试者施用治疗有效量的GLP2-XTEN组合物，与可比量的未连接XTEN的相应GLP-2相比，在施用2-7天后导致受试者中约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％或更多的成人短肠综合征(SBS)患者的钠损失的更大降低。
在治疗方法的一些实施方案中，(i)与在其他相同剂量方案下的未连接XTEN的相应GLP-2相比，向有需要的受试者施用少约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约6倍、或约8倍、或约10倍的较小摩尔量的GLP2-XTEN融合蛋白，并且该融合蛋白达到了与未连接XTEN的相应GLP-2可比的曲线下面积和/或可比的治疗效果；(ii)与在其他相同剂量下的未连接XTEN的相应GLP-2相比，以更少的频率施用GLP2-XTEN融合蛋白(例如，每隔三天、约每隔7天、约每隔10天、约每隔14天、约每隔21天、或约每月)，并且该融合蛋白达到了与未连接XTEN的相应GLP-2可比的曲线下面积和/或可比的治疗效果；或(iii)与在其他相同剂量方案下的未连接XTEN的相应GLP-2相比，施用累计较小摩尔量的至少低约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的融合蛋白，并且GLP2-XTEN融合蛋白达到了与未连接XTEN的相应GLP-2可比的曲线下面积和/或可比的治疗效果。累计较小量是在至少约1周、或约14天、或约21天、或约1个月的时间内测量的。在治疗方法的前述实施方案中，可通过任何本文所述的测量的参数来确定治疗效果，包括但不限于GLP-2的血药浓度、表32的分析或用于检测除本领域已知的GLP-2相关疾病外的以下各项的分析：肠系膜血流量降低、出血、炎症、结肠炎、腹泻、粪便湿重、体重减轻、钠损失、肠溃疡、肠梗阻、瘘管和脓肿、排便频率的改变、葡萄膜炎、儿童生长不良或维持GLP-2的血药浓度高于阈值水平例如100ng/ml的GLP-2等效量(或大约2200ng/ml的GLP-2-2G_XTEN_AE864)。
本发明提供了在用于治疗患有胃肠病症的受试者的药物方案中使用的GLP2-XTEN融合蛋白。在一个实施方案中，该方案包含含有本文所述的GLP2-XTEN融合蛋白的药物组合物。在另一个实施方案中，药物方案进一步包含确定在受试者体内获得治疗效果所需的药物组合物的量的步骤。在另一个实施方案中，用于治疗患有胃肠病症的受试者的药物方案包括以两个或更多连续剂量向受试者施用有效量的药物组合物，与未连接XTEN并使用可比的nmol/kg量施用的GLP-2相比，其中所述施用导致与胃肠病症相关的至少一种、两种、或三种参数的至少高5％、或10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％的改善。在药物方案的另一个实施方案中，有效量为至少约5、或至少约10、或至少约25、或至少约100、或至少约200nmol/kg或前述的任何中间量。在另一个实施方案中，用于治疗患有胃肠病症的受试者的药物方案包括大约每隔3、6、7、10、14、21、28天或更多天施用治疗有效量的药物组合物一次。在另一个实施方案中，用于治疗患有胃肠病症的受试者的药物方案包括施用GLP2-XTEN药物组合物，其中所述施用是皮下的、肌肉内的或静脉内的。在另一个实施方案中，用于治疗患有胃肠病症的受试者的药物方案包括施用治疗有效量的药物组合物，其中所述治疗有效量导致将融合蛋白的血药浓度维持在融合蛋白的治疗窗内的时间比未连接XTEN并以可比剂量施用于受试者的相应GLP-2至少长3倍。
本发明进一步想到，根据本文提供的方法使用的GLP2-XTEN可与其他治疗方法和组合物(例如，抗炎药如类固醇或NSAIDS)结合施用，该其他治疗方法和组合物可用于治疗GLP-2相关病症或GLP-2是或可能是其辅助治疗的疾病。
在另一方面，本发明提供了在制备用于治疗GLP-2相关病症的药物的方法中使用的GLP2-XTEN融合蛋白。在一个实施方案中，制备药物的方法包括将与表1的GLP-2具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％的序列同一性的GLP-2序列连接至与选自表4和表8-12中任一个的XTEN具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的至少第一XTEN，其中GLP2-XTEN保留了天然GLP-2的至少部分生物活性，并且进一步混合GLP2-XTEN与至少一种药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，GLP2-XTEN具有与选自表13、32或33中任一者的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的序列。
在另一方面，本发明提供了一种设计GLP2-XTEN组合物以获得期望的药代动力学、药理学或药学性质的方法。一般而言，如图4-6所示，设计和制备融合蛋白和本发明组合物的步骤包括：(1)选择GLP-2(例如，天然蛋白质、表1的序列、具有活性的类似物或衍生物)以治疗特定病症；(2)选择将对得到的GLP2-XTEN赋予期望的PK和理化特征的XTEN(例如，将GLP2-XTEN组合物施用给受试者导致融合蛋白与未连接XTEN的GLP-2相比在治疗窗内维持更长时段)；(3)确立GLP2-XTEN的期望的N端至C端构型，以达到期望的效力或PK参数；(4)确立编码所构造的GLP2-XTEN的表达载体的设计；(5)用该表达载体转化适合的宿主；和(6)表达和回收得到的融合蛋白。对于期望半衰期增加或最小有效浓度之上维持时段增加的那些GLP2-XTEN，当将单个XTEN加入GLP2-XTEN时，所选择用于加入的XTEN将一般具有至少约288、或约432、或约576、或约864、或约875、或约912、或约923个氨基酸残基。在另一实施方案中，GLP2-XTEN可包含前述长度的第一XTEN和约36、或约72、或约144、或约288、或约576、或约864、或约875、或约912、或约923、或约1000或更多个氨基酸残基的至少第二XTEN。
另一方面，本发明提供了制备GLP2-XTEN组合物以与天然GLP-2相比改善生产容易度、导致增加的稳定性、增加的水溶解度和/或配制容易度的方法。在一个实施方案中，本发明包括增加GLP-2的水溶解度的方法，包括使GLP-2与一个或多个XTEN连接的步骤，使得可以实现与未融合状态的GLP-2相比得到的GLP2-XTEN的可溶形式在生理条件下更高的浓度。在一些实施方案中，所述方法产生GLP2-XTEN融合蛋白，其中在生理条件下的水溶解度比未融合的GLP-2大至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约400％、或至少约600％、或至少约800％、或至少约1000％、或至少约2000％。有助于使并入融合蛋白时GLP-2的水溶性增强的XTEN的性质的因素包括XTEN融合配偶体的高溶解性和溶液中XTEN分子之间的低自聚集程度。在前述的一个实施方案中，GLP2-XTEN包含连接至具有至少约36、或约48、或约96、或约144、或约288、或约576、或约864个氨基酸残基的GLP-2，其中在生理条件下融合蛋白的溶解性比未连接XTEN的相应GLP-2大至少3倍，或备选地，比未连接XTEN的GLP-2大至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或至少60倍或更大。在前述的一个实施方案中，GLP-2与连接至至少一个XTEN的表1的GLP-2具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性，该XTEN与选自表4和表8-12中任一者的XTEN具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性。
在另一实施方案中，本发明包括增加GLP-2存储期的方法，包括使GLP-2与选定的一个或多个XTEN连接的步骤，使得与未融合状态的GLP-2相比，得到的GLP2-XTEN的存储期限延长。本文使用的存储期限指溶液或某种其他存储制剂中GLP-2或GLP2-XTEN的功能活性保持稳定而无过度活性损失的时段。本文使用的“功能活性”指本领域已知的药理效应或生物活性，例如结合受体或配体或底物的能力、或引发上调的活性、或表现与GLP-2相关的一种或多种已知功能活性。降解或聚集的GLP-2一般与保持在溶液中的GLP-2相比具有降低的功能活性或降低的生物利用率。本方法延长GLP-2加入融合蛋白时的存储期限的能力的促进因素包括XTEN融合配偶体的增加的水溶解度、溶液中降低的自聚集和增加的热稳定性。具体说，XTEN的低聚集倾向有利于配制含有较高药物浓度的GLP-2的药物制剂的方法，并且XTEN的热稳定性促进GLP2-XTEN融合蛋白在延长的时段维持可溶和功能活性的性质。在一个实施方案中，所述方法产生具有“延长的”或“延伸的”存储期限的GLP2-XTEN融合蛋白，其相对于经历相同存储和处理条件的标准品而言表现出更高的活性。所述标准品可以是未融合的全长GLP-2。在一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种药学上可接受的赋形剂配制分离的GLP2-XTEN的步骤，所述赋形剂增强了XTEN维持其非结构化构象以及GLP2-XTEN在制剂中比相应未融合GLP-2维持更长时间的可溶性的能力。在一个实施方案中，所述方法包括使GLP-2与选自表4的一个或多个XTEN连接以产生GLP2-XTEN融合蛋白，得到的溶液当经历与标准品相同的存储和处理条件并在给定时间点比较时，保留标准品功能活性的大于约100％、或标准品功能活性的大于约105％、110％、120％、130％、150％或200％，从而增加了其存储期。
存储期还可以根据存储后保留的功能活性来评估，标准化为存储开始时的功能活性。具有由延长或延伸的功能活性表现的延长或延伸的存储期限的本发明GLP2-XTEN融合蛋白与经受相同条件下相同时段的未连接XTEN的等同GLP-2相比保留约50％更多的功能活性、或约60％、70％、80％、或90％更多的功能活性。例如，包含与选自表4的一个或多个XTEN序列融合的GLP-2的本发明GLP2-XTEN融合蛋白在各种升高的温度条件下在溶液中可保留其原始活性约80％或更多，持续多达2周、或4周、或6周、或12周或更长的时段。在一些实施方案中，当在80℃加热10分钟时，GLP2-XTEN在溶液中保留其原始活性的至少约50％、或约60％、或至少约70％、或至少约80％、和最优选至少约90％或更多。在其他实施方案中，当在37℃加热或维持约7天时，GLP2-XTEN在溶液中保留其原始活性的至少约50％、优选至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或备选地至少约90％或更多。在另一实施方案中，GLP2-XTEN融合蛋白在约1小时至约18小时的时段暴露于约30℃至约70℃的温度后保留其功能活性的至少约80％或更多。在本段描述的上述实施方案中，在给定时间点，GLP2-XTEN的保留活性将是未连接XTEN的相应GLP-2的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍。
VII).本发明的核酸序列
本发明提供了编码GLP2-XTEN嵌合融合蛋白的分离的多核酸以及与编码GLP2-XTEN嵌合融合蛋白的多核酸互补的序列，包括其同源变体。另一方面，本发明涵盖产生编码GLP2-XTEN嵌合融合蛋白的多核酸以及与编码GLP2-XTEN嵌合融合蛋白的多核酸互补的序列(包括其同源变体)的方法。一般而言，如图4-6所示，产生编码GLP2-XTEN融合蛋白的多核苷酸序列并表达得到的基因产物的方法包括组装编码GLP-2和XTEN的核苷酸，框内连接这些组分，将编码基因引入适合于宿主细胞的表达载体，用该表达载体转化适合的宿主细胞，并在引起或允许融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件下培养该宿主细胞，从而产生生物活性的GLP2-XTEN多肽，其可作为分离的融合蛋白通过本领域已知的标准蛋白质纯化方法回收。分子生物学中标准的重组技术可用来制备本发明的多核苷酸和表达载体。
根据本发明，使用编码GLP2-XTEN的核酸序列(或其互补体)来产生指导GLP2-XTEN融合蛋白在适当的宿主细胞中表达的重组DNA分子。多种克隆策略适合进行本发明，其中许多用来产生包含本发明的GLP2-XTEN组合物的融合蛋白的编码基因或其互补体的构建体。在一些实施方案中，所述克隆策略用来产生编码包含至少第一GLP2和至少第一XTEN多肽的单体GHXTEN的基因或其互补体。在前述的一个实施方案中，所述基因包含编码GLP2的序列或序列变体。在其他实施方案中，所述克隆策略用于产生编码单体GLP2-XTEN的基因，该基因包含编码至少第一分子的GLP2的核苷酸或其互补体和编码第一和至少第二XTEN的核苷酸或其互补体，该基因用于转化宿主细胞以表达GLP2-XTEN组合物的融合蛋白。在本段描述的上述实施方案中，基因还可以包含编码间隔区序列的核苷酸，其也编码裂解序列。
在设计期望的XTEN序列时发现，尽管在产生XTEN编码序列时使用“结构单元”分子方法，仍可实现本发明组合物的XTEN的非重复性质。这通过使用编码上述肽序列基序的多核苷酸文库来实现，所述多核苷酸然后被连接和/或多聚化以产生编码XTEN序列的基因(参见图4、5、8、9和实施例)。因此，虽然表达的融合蛋白的XTEN可以由少达四个不同序列基序的多个单元组成，但是因为基序本身由非重复氨基酸序列组成，所以使得整体XTEN序列是非重复的。因此，在一个实施方案中，XTEN编码多核苷酸包含框内有效连接的编码非重复序列或基序的多个多核苷酸，并且其中得到的表达的XTEN氨基酸序列是非重复的。
在一种方法中，首先制备含有对应于GLP2-XTEN融合蛋白的DNA序列的构建体。在这些实施方案中，其中哺乳动物天然GLP-2序列应用于融合蛋白中。编码该组合物的GLP-2的DNA获自cDNA文库，该cDNA文库使用标准方法从被认为加工GLP-2mRNA并以可检测的水平表达它的组织或分离细胞制备。使用常规分子生物学技术，用含有例如约20至100个碱基的探针筛选文库，所述探针被设计为通过杂交鉴定目标GLP-2基因。探针的最佳候选物是代表与GLP-2高度同源的序列的那些，并且应该足够长并足够明确以使假阳性最小化，但是可以在一个或多个位置是简并性的。如果必要，编码序列可以使用描述于Sambrook等(同上)的常规引物延伸方法获得，以检测可能未逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间体。然后可以利用聚合酶链反应(PCR)方法来扩增靶DNA或RNA编码序列以获得足以制备含有GLP-2基因的GLP2-XTEN构建体的材料。然后可以进行试验以证实杂交全长基因是期望的GLP-2基因。通过这些常规方法，DNA可以常规获自从这些来源制备的cDNA文库。在其中GLP-2类似物(具有一个或多个氨基酸置换，如表1的序列)用于制备GLP2-XTEN构建体的那些实施方案中，GLP-2编码基因通过本领域已知的标准合成方法(例如，自动核酸合成，使用例如Engels等(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734 1989)描述的方法之一)产生，其中利用从公开可获得的数据库、专利或参考文献获得的DNA序列。此类方法是本领域熟知的并且详细描述于科学文献和专利文献中。例如，序列可以获自Chemical Abstracts Services(CAS)登记号(由American Chemical Society公开)和/或可通过ncbi.nlm.nih.gov万维网可用的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网页获得的GenBank登记号(例如，Locus ID,NP_XXXXX和XP_XXXXX)Model Protein标识符，其对应于含有目标蛋白质或蛋白质片段或变体的氨基酸序列的CAS Registry或GenBank数据库中的条目。对于本文提供的此类序列标识符，与这些CAS和GenBank和GenSeq登记号的每一个相关的提要页以及引用的杂志出版物(例如，PubMed ID号(PMID))各自的全部内容通过引用的方式并入，特别是关于其中描述的氨基酸序列。在一个实施方案中，GLP-2编码基因编码表1任何一个的蛋白质或其片段或变体。
在包含单个GLP-2的表达的融合蛋白的情况下，编码本发明GLP2-XTEN蛋白质的GLP-2部分的基因或多核苷酸则然后可被克隆入构建体，所述构建体可以是质粒或其他载体，受控于用于在生物系统中高水平蛋白质表达的适当转录和翻译序列。在后一步骤中，通过与编码GLP-2的基因邻近和符合读框地克隆到构建体内，编码XTEN的第二基因或多核苷酸与编码GLP-2基因的N端和/或C端的核苷酸遗传融合。该第二步骤通过连接或多聚化步骤而发生。在本段描述的上述实施方案中，可以理解，产生的基因构建体可以备选地是编码各自融合蛋白的各自基因的互补体。
可以一步或多步制备编码XTEN的基因，其为通过完全合成或者通过与酶促过程组合的合成，如限制酶介导的克隆、PCR和重叠延伸，包括在实施例中更全面描述的方法。例如，可以使用本文公开的方法来将编码XTEN的多核苷酸短序列连接成具有期望长度和序列的更长的XTEN基因。在一个实施方案中，该方法连接两个或更多个密码子优化的寡核苷酸，该寡核苷酸编码约9至14个氨基酸、或约12至20个氨基酸、或约18至36个氨基酸、或约48至约144个氨基酸、或约144至约288或更长、或前述基序或区段长度范围的任意组合的XTEN基序或区段序列。
备选地，使用公开的方法使XTEN编码序列多聚化成具有期望长度的更长序列；例如，编码36个氨基酸的XTEN的基因可以被二聚化成编码72个氨基酸的基因，然后144，然后288等。即使使用多聚化，通过设计为使用的最短单元的基序所选择的密码子，XTEN多肽可以被构建为使得XTEN编码基因具有低重复性或实际上无重复性，这可以降低编码基因在转化宿主中的重组并增加稳定性。
使用标准的基因合成技术，从寡核苷酸组装编码具有非重复序列的XTEN的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算法进行基因设计。在本发明的一个方法中，如上所述，产生然后组装相对较短的XTEN编码多核苷酸构建体的文库。然后如图5和图8所示，将得到的基因与编码GLP-2或GLP-2区的基因进行组装，并用得到的基因转化宿主细胞并产生和回收GLP2-XTEN，用于如本文所述对其性质进行评价。
在一些实施方案中，设计GLP2-XTEN序列用于通过包含N末端序列(NTS)XTEN而不是使用本领域已知的前导序列来优化表达。在一个实施方案中，NTS是通过包含在与编码融合蛋白的基因连接时确定能导致优化表达的XTEN基因中的编码核苷酸而产生的。在一个实施方案中，表达的GLP2-XTEN的N-末端XTEN序列针对在真核细胞(例如但不限于CHO、HEK、酵母和本领域已知的其他细胞类型)中的表达进行优化。
多核苷酸文库
另一方面，本发明提供了编码XTEN序列的多核苷酸的文库，其用于组装编码期望长度和序列的XTEN的基因。
在某些实施方案中，XTEN编码文库构建体包含编码固定长度的多肽区段的多核苷酸。作为初始步骤，可以组装编码9-14个氨基酸残基的基序的寡核苷酸文库。在一个优选实施方案中，组装编码12个氨基酸的基序的寡核苷酸文库。
可以使XTEN编码序列区段二聚化或多聚化成更长的编码序列。二聚化或多聚化可以通过连接、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术来进行。该过程可以重复多次，直至得到的XTEN编码序列达到序列组织和期望长度，从而提供XTEN编码基因。应理解，可以使编码例如12个氨基酸的基序的多核苷酸的文库二聚化和/或连接成编码36个氨基酸的多核苷酸文库。本发明涵盖编码不同长度基序的文库；例如9-14个氨基酸的基序，产生编码27至42个氨基酸的文库。反过来，编码27至42个氨基酸和优选36个氨基酸(如实施例所述)的文库可以顺序二聚化成含有依次更长的多核苷酸的文库，所述多核苷酸编码期望长度的XTEN序列，用于引入编码如本文公开的GLP2-XTEN融合蛋白的基因内。
优化编码XTEN的DNA序列的更有效的方法基于组合文库。可分段设计和合成编码XTEN的基因，以便为每个区段获得多个密码子形式。这些区段可随机组装为基因文库，以使得每个文库成员编码相同的氨基酸序列，而文库成员包含大量密码子形式。可针对导致截短产物的高水平表达和/或低丰度的基因对此类文库进行筛选。组合基因组装的过程示于图10中。图10中的基因由6个碱基片段组装，并且每个片段能以4个不同的密码子形式获得。这允许4096的理论多样性。
在一些实施方案中，文库由编码限于特定序列XTEN家族的氨基酸的多核苷酸组装；所述家族例如表3的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在其他实施方案中，文库包含编码表3的基序家族序列的两个或更多个的序列。编码36mer的文库的代表性非限制性多核苷酸序列的名称和序列在表8-11中提供，并且用于产生它们的方法在各自的实施例中更全面地描述。在其他实施方案中，编码XTEN的文库从以随机顺序连接的编码氨基酸的多核苷酸密码子区段构建，其中所述密码子的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)氨基酸的密码子。文库可转而用于顺序二聚体化或连接以实现编码48、72、144、288、576、864、875、912、923、1318个氨基酸、或多至约3000个氨基酸的总长度以及中间长度的XTEN序列的多核苷酸序列文库，其中编码的XTEN作为GLP2-XTEN融合蛋白的组分表达时可以具有本文公开的性质的一种或多种。在一些情况下，多核苷酸文库序列还可以包含用作“测序岛”的其他碱基，如下文更全面描述的。
图5是本发明实施方案中XTEN多核苷酸构建体和GLP2-XTEN多核苷酸构建体组装中的代表性非限制性步骤的示意性流程图。将单个寡核苷酸501退火成序列基序502，例如12氨基酸基序("12-mer")，其连接至文库的其他序列基序以产生包含期望长度的XTEN 504的集合体，并与含有BbsI和KpnI限制位点的寡核苷酸503连接。凝胶纯化得到的连接产物的集合体并切下具有期望长度的XTEN的条带，从而产生具有塞序列的分离的XTEN基因505。将XTEN基因克隆到填充载体中。在这种情况下，载体编码任选的CBD序列506和GFP基因508。然后用BbsI/HindIII进行消化以去除507和508并放置终止密码子。然后将得到的产物克隆到经BsaI/HindIII消化的、含有编码GLP-2的基因的载体内，从而产生编码GLP2-XTEN融合蛋白的基因500。编码XTEN和前体序列的多核苷酸的非详尽性列表在表7-12中提供。
表7：XTEN和前体序列的DNA序列
可以将XTEN编码基因的文库克隆到本领域已知的一个或多个表达载体内。为了有利于鉴定良好表达的文库成员，可以将文库构建为与报告蛋白融合。合适的报告分子的非限制性实例是绿色荧光蛋白、萤光素酶(luciferace)、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。通过筛查，可以鉴定可在所选的宿主生物体中高浓度表达的短XTEN序列。随后，可以产生随机XTEN二聚体的文库并且重复针对高水平表达的筛查。随后，可以针对许多性质例如表达水平、蛋白酶稳定性或与抗血清的结合来筛选得到的构建体。
本发明一个方面提供了编码融合蛋白的组分的多核苷酸序列，其中该序列的产生经历了密码子优化。特别关注的是目标为提高多肽组合物表达和改善编码基因在生产宿主中遗传稳定性的密码子优化。例如，密码子优化对于富含甘氨酸或者具有高度重复的氨基酸序列的XTEN序列是特别重要的。使用计算机程序进行密码子优化(Gustafsson,C.等(2004)Trends Biotechnol,22:346-53)，一些计算机程序使核糖体中止最小化(CodaGenomics Inc.)。在一个实施方案中，可以通过构建密码子文库进行密码子优化，其中文库的所有成员编码相同的氨基酸序列但是其中密码子使用不同。可以针对高度表达和遗传稳定的成员来筛查此类文库，所述成员特别适合大规模产生含有XTEN的产物。当设计XTEN序列时，可以考虑许多性质。可以使编码DNA序列中的重复性最小化。此外，可以避免或最大程度减少生产宿主很少使用的密码子的使用(例如，在大肠杆菌中的AGG和AGA精氨酸密码子和一个亮氨酸密码子)。在大肠杆菌的情况下，两个甘氨酸密码子GGA和GGG很少在高表达蛋白质中使用。因此，编码XTEN序列的基因的密码子优化可能是非常期望的。具有高水平甘氨酸的DNA序列倾向于具有可导致不稳定性或低表达水平的高GC含量。因此，可能时，优选选择密码子以使XTEN编码序列的GC含量适合用于产生XTEN的生产生物体。
任选地，编码全长XTEN的基因可包含一个或多个测序岛。在该上下文中，测序岛是短延伸序列，其不同于XTEN文库构建体序列并且包含全长XTEN编码基因中不存在或期望存在的限制位点。在一个实施方案中，测序岛是如下序列
5’-AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGT-3’。在另一个实施方案中，测序岛是序列
5’-AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGT-3’。
在一个实施方案中，使用公开的方法构建多核苷酸文库，其中文库的所有成员编码相同的氨基酸序列，但是序列中各自氨基酸的密码子使用是不同的。可以针对高度表达和遗传稳定的成员来筛查此类文库，所述成员特别适合大规模产生含有XTEN的产物。
任选地，可以对文库中的克隆进行测序以消除含有某些不期望的序列的分离物。短XTEN序列的初始文库允许氨基酸序列的某种改变。例如，可以使一些密码子随机化以使许多亲水性氨基酸可以出现在特定位置。在反复多聚化的过程中，除了针对高水平表达筛选以外，可以针对其他特征例如溶解度或蛋白酶抗性来筛查得到的文库成员。
一旦选择了编码具有期望长度和性质的XTEN的基因，通过将其与编码GLP-2的基因相邻且符合读框地，或备选地与编码连接至末端XTEN的间隔区/裂解序列的核苷酸符合读框地克隆至构建体内，使其与编码GLP-2基因的核苷酸在期望的位置遗传融合。根据待编码的GLP2-XTEN，本发明提供了前述的各种排列。例如，编码例如上述式III所示的包含GLP-2和两个XTEN的GLP2-XTEN融合蛋白的基因，该基因将具有编码GLP-2的多核苷酸和编码两个XTEN的多核苷酸，所述两个XTEN在组成和序列长度上可以相同或不同。在前述的一个非限制性实施方案中，GLP-2多核苷酸将编码天然GLP-2，并且编码C端XTEN的多核苷酸将编码AE864，并且编码N端XTEN的多核苷酸将编码AE912。如GLP2-XTEN多核苷酸构建体组装中的代表性步骤的示意流程图中的图5所示，将GLP-2基因克隆到XTEN构建体中的步骤可以通过连接或多聚化步骤而进行。将单个寡核苷酸501退火成序列基序502如12氨基酸基序(“12-mer”)，其连接至来自文库的其他序列基序，该基序可多聚化以产生包含期望长度的XTEN504的集合体，以及连接至较小浓度的含有BbsI和KpnI限制位点的寡核苷酸503。基序文库可限于特定序列XTEN家族；例如，表3的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。如图5所示，在这种情况下，XTEN多核苷酸编码36个氨基酸残基的长度，但可通过该过程获得更长的长度。例如，可通过连接、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似的克隆技术来进行多聚化。凝胶纯化得到的连接产物的集合体并切下具有期望长度的XTEN的条带，从而产生具有塞序列的分离的XTEN基因505。可以将XTEN基因克隆到填充载体中。在这种情况下，载体编码任选的CBD序列506和GFP基因508。然后用BbsI/HindIII进行消化以去除507和508并放置终止密码子。然后将得到的产物克隆到经BsaI/HindIII消化的、含有编码GLP-2的基因的载体内，从而产生编码GLP2-XTEN融合蛋白的基因500。对本领域技术人员显而易见的是，可应用该方法产生备选构型的以及具有不同XTEN长度的构建体。
如图8所示，可将编码GLP2-XTEN融合蛋白的构建体设计为组分XTEN、GLP-2和间隔区序列的不同构型。在一个实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5'至3')—GLP-2和XTEN的组分的单体多肽的多核苷酸序列或与之互补的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5'至3')—XTEN和GLP-2的组分的单体多肽的多核苷酸序列或与之互补的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5'至3')—XTEN、GLP-2和第二XTEN的组分的单体多肽的多核苷酸序列或与之互补的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5'至3')—GLP-2、间隔区序列和XTEN的组分的单体多肽的多核苷酸序列或与之互补的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建体包含编码以下顺序(5'至3')—XTEN、间隔区序列和GLP-2的组分的单体多肽的多核苷酸序列或与之互补的多核苷酸序列。间隔区多核苷酸可以任选地包含编码裂解序列的序列。对于本领域技术人员显而易见的是，前述的其他排列或多聚体也是可能的。
本发明还涵盖包含XTEN编码多核苷酸变体的多核苷酸，该变体与以下序列相比具有高百分比的序列同一性：(a)来自表7的多核苷酸序列，或(b)与(a)的多核苷酸互补的序列。具有高百分比的序列同一性的多核苷酸是与前述(a)或(b)相比具有至少约80％核酸序列同一性、备选地至少约81％、备选地至少约82％、备选地至少约83％、备选地至少约84％、备选地至少约85％、备选地至少约86％、备选地至少约87％、备选地至少约88％、备选地至少约89％、备选地至少约90％、备选地至少约91％、备选地至少约92％、备选地至少约93％、备选地至少约94％、备选地至少约95％、备选地至少约96％、备选地至少约97％、备选地至少约98％和备选地至少约99％核酸序列同一性或者可以在严格条件下与靶多核苷酸或其互补体杂交的多核苷酸。
核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列同一性还可以通过使用已知软件或计算机程序例如BestFit或Gap成对比较程序(GCG Wisconsin Package,GeneticsComputer Group,575Science Drive,Madison,Wis.53711)来常规确定。BestFit利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics.1981.2:482-489)来发现两个序列之间同一性或相似性的最佳区段。Gap进行总体比对：所有的一个序列与所有的另一个类似序列，采用Needleman和Wunsch的方法(Journal of MolecularBiology.1970.48:443-453)。当使用序列比对程序例如BestFit来确定序列同源性、相似性或同一性的程度时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵来优化同一性、相似性或同源性评分。
“互补的”核酸序列是能够根据标准的Watson-Crick互补规则进行碱基配对的那些核酸序列。如本文使用的术语“互补序列”指基本上互补的核酸序列，可以通过上文列出的相同核苷酸比较来评估，或者定义为能够在严格条件(例如本文描述的那些严格条件)下与编码GLP2-XTEN序列的多核苷酸杂交。
然后可以将得到的编码GLP2-XTEN嵌合融合蛋白的多核苷酸单独克隆到表达载体中。将核酸序列通过多种程序插入载体。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入适当的限制内切核酸酶位点。载体组分一般包括但不限于信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的一个或多个(图9)。含有这些组分中的一个或多个的适宜载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。此类技术是本领域熟知的并且详细描述于科学文献和专利文献中。
各种载体是可公开获得的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式，它们可以方便地经历重组DNA过程，并且载体的选择将往往依赖于将其引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是当引入宿主细胞时整合至宿主细胞基因组中并与其已整合至其中的染色体一起复制的载体。
本发明提供了含有复制和控制序列的质粒载体的使用，所述复制和控制序列与宿主细胞相容并被宿主细胞识别，并且与GLP2-XTEN基因有效连接以用于GLP2-XTEN融合蛋白的控制表达。载体通常带有复制位点以及编码能够在转化的细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。对于多种细菌、酵母和病毒，此类载体序列是熟知的。可以使用的有用的表达载体包括例如染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。“表达载体”指DNA构建体，其包含与合适的控制序列有效连接的DNA序列，所述控制序列能够影响编码融合蛋白的DNA在合适的宿主中的表达。要求是这些载体在选择的宿主细胞中可复制并且可存活。可以根据需要使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
合适的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物以及已知的细菌质粒例如colEI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(描述于Smith等,Gene 57:31-40(1988))、pMB9及其衍生物、质粒例如RP4、噬菌体DNA例如噬菌体I的许多衍生物例如NM98 9，以及其他噬菌体DNA例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母噬菌体例如2μm质粒或2μm质粒的衍生物，以及着丝粒和整合型酵母穿梭载体；用于真核细胞的载体，例如用于昆虫和哺乳动物细胞的载体；由质粒和噬菌体DNA组合产生的载体，例如经修饰具有噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。还可在本发明中使用的酵母表达系统包括但不限于非融合pYES2载体(Invitrogen)，融合pYESHisA,B,C(Invitrogen)、pRS载体等。
载体的控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。启动子可以是任何DNA序列，其在所选的宿主细胞中展示出转录活性，并且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
指导编码GLP2-XTEN的DNA在哺乳动物细胞中转录的合适启动子的实例为SV40启动子(Subramani等,Mol.Cell.Biol.1(1981),854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等,Science 222(1983),809-814)、CMV启动子(Boshart等,Cell 41:521-530,1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp,Mol.Cell.Biol,2:1304-1319,1982)。载体还可以携带诸如UCOE(普遍存在的染色质开放元件)等序列。
在丝状真菌宿主细胞中使用的合适的启动子的实例为，例如，ADH3启动子或tpiA启动子。其他有用的启动子的实例为衍生自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。优选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。还可在本发明中使用的酵母表达系统包括但不限于非融合pYES2载体(Invitrogen)、融合pYESHisA,B,C(Invitrogen)、pRS载体等。
适合用于原核宿主表达载体的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等,Nature,275:615(1978)；Goeddel等,Nature,281:544(1979)]，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acid Res.,8:4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子，例如tac启动子[deBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]，它们都与编码GLP2-XTEN多肽的DNA有效连接。用于细菌系统的启动子还可以含有与编码GLP2-XTEN多肽的DNA有效连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
本发明涉及其他表达系统的使用，包括例如杆状病毒表达系统，可以使用非融合转移载体和融合转移载体，所述非融合转移载体例如但不限于pVL941(Summers等,Virology 84:390-402(1978))、pVL1393(Invitrogen)、pVL1392(Summers等,Virology 84:390-402(1978)和Invitrogen)和pBlueBacIII(Invitrogen)，所述融合转移载体例如但不限于pAc700(Summers等,Virology 84:390-402(1978))、pAc701和pAc70-2(等同于pAc700，具有不同的阅读框)、pAc360(Invitrogen)和pBlueBacHisA,B,C(Invitrogen)。
如果需要的话，编码GLP2-XTEN的DNA序列也可以有效地连接至合适的终止子，如hGH终止子(Palmiter等,Science 222,1983,pp.809-814)或TPI1终止子(Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,pp.419-434)或ADH3(McKnight等,The EMBO J.4,1985,pp.2093-2099)。表达载体还可包含位于启动子下游和GLP2-XTEN序列自身的插入位点的上游的一组RNA剪接位点，包括从腺病毒获得的剪接位点。表达载体中还可包含位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。特别优选的聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp,同上)、来自腺病毒5Elb区域的聚腺苷酸化信号、hGH终止子(DeNoto等,Nucl.Acids Res.9:3719-3730,1981)。表达载体还可包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，如腺病毒2三重前导序列；和增强子序列，如SV40增强子。
在一个实施方案中，编码GLP2-XTEN融合蛋白组合物的多核苷酸在C端与适合表达宿主系统的N端信号序列融合。信号序列通常在易位和分泌过程中通过蛋白水解的方式从蛋白质上去除，产生确定的N端。已经描述了用于包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物系统在内的大多数表达系统的多种信号序列。每种表达系统的优选实例的非限制性列表在本文随后给出。对于大肠杆菌表达的优选信号序列是OmpA、PhoA和DsbA。对于酵母表达的优选信号肽是ppL-α、DEX4、转化酶信号肽、酸性磷酸酶信号肽、CPY或INU1。对于昆虫细胞表达的优选信号序列是sexta脂动激素前体、CP1、CP2、CP3、CP4、TPA、PAP或gp67。对于哺乳动物表达，优选的信号序列是IL2L、SV40、IgGκ和IgGλ。
在另一实施方案中，可能包含良好表达的独立蛋白质结构域的前导序列可以与GLP2-XTEN序列的N端融合，由蛋白酶裂解位点隔开。虽然可以使用不抑制在设计的蛋白水解位点处的裂解的任何前导肽序列，但是优选实施方案中的序列将包括稳定的良好表达的序列，使得整个组合物的表达和折叠不受显著不利地影响，并且优选地，表达、溶解度和/或折叠效率显著地提高。文献中已经描述了许多适合的前导序列。适合的序列的非限制性列表包括麦芽糖结合蛋白、纤维素结合结构域、谷胱甘肽S转移酶、6xHis标签、FLAG标签、血凝素标签和绿色荧光蛋白。前导序列还可以通过文献和上文中详细描述的方法，通过特别是在ATG起始密码子之后的第二个密码子位置中的密码子优化来进一步改善。
分别用于连接编码GLP2-XTEN的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列并将它们插入含有复制所需信息的合适载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook,J.等,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual,”第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)。
在其他实施方案中，本发明提供了包含优化表达的多核苷酸序列的构建体和制备所述构建体的方法，所述多核苷酸序列编码具有XTEN特征的至少约20至约60个氨基酸，其可以包含在XTEN载体编码序列的N端(换言之，编码20-60个编码优化氨基酸的多核苷酸与编码位于GLP-2N端的XTEN组分的多核苷酸在框内连接)，以促进翻译起始，以允许蛋白质N端的XTEN融合物在不存在辅助结构域的情况下表达。前述的一个优势是，序列不需要随后裂解，从而减少了产生含有XTEN组合物的步骤的数目。如在实施例中更详细描述的，优化的N端序列具有非结构化蛋白质的属性，但是可以包含编码为其促进翻译起始和增强表达的能力而选择的氨基酸的核苷酸碱基。在前述的一个实施方案中，优化的多核苷酸编码与AE912相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一个实施方案中，优化的多核苷酸编码与AM923相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AE48相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在前述的另一实施方案中，优化的多核苷酸编码与AM48相比具有至少约90％序列同一性的XTEN序列。在一个实施方案中，优化的多核苷酸NTS包括与选自以下的序列或其互补体具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列：
AE 48：5’-
ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTACCCCGGGTAGCGGTACTGCTTCTTCCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCTTCTGGTGCAACCGGCTCTCCAGGTGCTTCTCCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCA-3’
和
AM 48：5’-
ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTGCATCCCCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACCGGCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACTGGCTCTCCA-3’。
以这种方式，产生编码单体GLP2-XTEN融合蛋白的嵌合DNA分子。任选地，可将该嵌合DNA分子转移或克隆到作为更适合的表达载体的另一构建体。此时，可以用该嵌合DNA分子转化能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞。根据细胞宿主的类型，可以通过熟知的方法将含有目标DNA区段的载体转移到宿主细胞。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、脂质转染或电穿孔可用于其他细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。一般参见Sambrook等,同上。
转化可以使用或不使用载体例如表达载体来进行。然后，转化的宿主细胞在适合表达编码GLP2-XTEN的嵌合DNA分子的条件下培养。
本发明还提供了用于表达本文公开的单体融合蛋白组合物的宿主细胞。在本发明中使用的哺乳动物细胞系的实例是COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、BHK-21(ATCC CCL 10))和BHK-293(ATCC CRL1573；Graham等,J.Gen.Virol.36:59-72,1977)、BHK-570细胞(ATCC CRL10314)、CHO-K1(ATCC CCL61)、CHO-S(Invitrogen11619-012)和293-F(Invitrogen R790-7)。tk-ts13BHK细胞系也可从ATCC获得，登录号为CRL1632。此外，许多其他细胞系可在本发明中使用，包括大鼠Hep I(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠HepII(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL1548)、TCMK(ATCC CCL139)、人肺细胞(ATCC HB 8065)、NCTC1469(ATCC CCL9.1)、CHO(ATCC CCL61)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220,1980)。
合适的酵母宿主细胞的实例包括酵母属的种(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属的种(Schizosaccharomyces spp.)的细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)的菌株。其他酵母包括栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse,Nature,290:140[1981]；1985年5月2日公布的EP 139,383)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574；Louvencourt等,J.Bacteriol.,737[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、维克汉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等,Bio/Technology,8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德国毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等,J.Basic Microbiol.,28:265-278[1988])；假丝酵母(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(Case等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979])；许旺酵母(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1900年8月31日公布的EP394,538)。甲基营养型酵母在此处是合适的，并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，选自由以下组成的属：汉森酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。合适的酵母细胞的其他实例为克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，如汉逊酵母属(Hansenula)例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)或毕赤酵母属(Pichia)例如巴斯德国毕赤酵母(P.pastoris)的菌株(参见，Gleeson等,J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465；美国专利号4,882,279)。作为这类酵母的典型的特定物种列表可参见C.Anthony,TheBiochemistry of Methylotrophs,269(1982)。用异源DNA转化酵母细胞并由此产生异源多肽的方法在例如美国专利号4,599,311、美国专利号4,931,373、美国专利号4,870,008、5,037,743和美国专利号4,845,075中有所描述，其全部通过引用并入。
其他真菌细胞的实例为丝状真菌的细胞，该丝状真菌例如是曲霉属的种(Aspergillus spp.)、脉孢菌属的种(Neurospora spp.)、镰孢属的种(Fusarium spp.)或木霉属的种(Trichoderma spp.)，特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉的菌株。曲霉属的种在蛋白质表达中的应用例如在EP 272 277、EP 238 023、EP 184 438中描述。尖镰孢(F.oxysporum)的转化例如可以如Malardier等,1989,Gene 78:147-156所述进行。木霉属的种(Trichoderma spp.)的转化例如可以如EP 244 234所述进行。
可用于本发明的其他适合的细胞包括但不限于原核宿主细胞菌株，例如大肠杆菌(例如，菌株DH5-α)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，或者假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌株。合适的原核生物的非限制性示例包括以下属的那些：游动放线菌属(Actinoplanes)；古生物球菌属(Archaeoglobus)；蛭弧菌属(Bdellovibrio)；包柔氏螺旋体属(Borrelia)；绿屈挠菌属(Chloroflexus)；肠球菌属(Enterococcus)；埃希氏菌属(Escherichia)；乳酸杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；海洋杆菌属(Oceanobacillus)；副球菌属(Paracoccus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)；链霉菌属(Streptomyces)；热原体属(Thermoplasma)；和弧菌属(Vibrio)。
通过根据选择性标记确定的表型来选择转化的细胞，该选择性标记通常是抗药性或在特定营养物例如亮氨酸缺乏时的生长能力。在酵母中使用的优选的载体为美国专利号4,931,373中公开的POT1载体。编码GLP2-XTEN的DNA序列的前面可以是例如如上所述的信号序列和任选的前导序列。转染哺乳动物细胞和表达引入细胞中的DNA序列的方法在例如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982),601-621；Southern和Berg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982),327-341；Loyter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982),422-426；Wigler等,Cell14(1978),725；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7(1981),603,Graham和vander Eb,Virology 52(1973),456；以及Neumann等,EMBO J.1(1982),841-845中有所描述。
通过例如磷酸钙介导的转染将克隆的DNA序列引入培养的哺乳动物细胞中(Wigler等,Cell 14:725-732,1978；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603-616,1981；Graham和Van der Eb,Virology52d:456-467,1973)，利用许多可购买到的试剂如FuGENEG Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)或脂质转染胺(Invitrogen)或通过电穿孔(Neumann等,EMBO J.1:841-845,1982)进行转染。为了鉴定和选择表达外源DNA的细胞，通常将可赋予选择性表型(选择性标记)的基因与目标基因或cDNA一起引入细胞中。优选的选择性标记包括赋予对药物如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、博莱霉素(zeocin)和氨甲蝶呤的抗性的基因。选择性标记可以是可扩增的选择性标记。优选的可扩增的选择性标记为二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。选择性标记的其他实例是本领域技术人员公知的，并且包括报告分子，如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。选择性标记由Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.,通过引用并入本文)综述。本领域技术人员将能够很容易地选择合适的选择性标记。可使用任何已知的选择性标记，只要其能够与编码基因产物的核酸同时被表达。
可将选择性标记在单独质粒上与目标基因同时引入细胞中，或可以将它们引入相同的质粒上。在相同的质粒上，选择性标记和目标基因可以受控于不同启动子或相同启动子，后一配置产生双顺反子信息。这种类型的构建体是本领域已知的(例如，Levinson和Simonsen,美国专利号4,713,339)。将称作“载体DNA”的额外DNA加至要引入细胞中的混合中也是有利的。
细胞摄取DNA后，使它们在合适的生长培养基中生长，通常1-2天，以开始表达目标基因。如本文所用的术语“合适的生长培养基”是指含有细胞生长和目标GLP2-XTEN表达所需的营养物和其他组分的培养基。培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需的糖、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。对于γ-羧化蛋白质的生产，培养基将含有维生素K，优选地浓度为约0.1μg/ml至约5μg/ml。然后应用药物选择来针对以稳定的方式表达选择性标记的细胞的生长进行选择。对于已用可扩增的选择性标记转染的细胞，可增加药物浓度来针对克隆序列的增加的拷贝数进行选择，从而增加表达水平。然后针对目标GLP-2多肽变体的表达来筛选稳定转染的细胞的克隆。
然后在允许GLP2-XTEN融合蛋白表达的条件下将转化的或转染的宿主细胞培养在合适的营养培养基中，之后可从培养物中回收得到的肽。用于培养细胞的培养基可以是适合宿主细胞生长的任何常规培养基，如含有适当补充剂的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可从商业供应者获得或可以根据公布的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。诸如温度、pH等培养条件是以前用于为了表达而选择的宿主细胞的那些条件，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
基因表达可以在样品中直接测量，例如通过常规的Northern印迹法，以定量mRNA的转录[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)，或使用适当标记的探针的原位杂交，基于本文提供的序列。或者，可以使用可以识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。所述抗体转而可以被标记并且可以进行测定，其中双链体结合至表面，使得双链体在表面形成时，可以检测结合至双链体的抗体的存在。
备选地，基因表达可以通过荧光方法以免疫学方式测量，例如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定或选择性标记的检测，以直接定量基因产物的表达。用于免疫组织化学染色和/或样品流体测定的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。适当地，抗体可以针对天然序列GLP-2多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与GLP-2融合并编码特异抗体表位的外源序列来制备。选择性标记的实例是本领域技术人员熟知的并且包括报告分子，例如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
表达的GLP2-XTEN多肽产物可以通过本领域已知的方法或通过本文公开的方法纯化。可以使用诸如过滤、亲和纯化(例如，使用抗-GLP-2抗体柱)、盐分级分离、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、羟基磷灰石吸附色谱法、疏水性相互作用色谱法和凝胶电泳等程序；每一种经修改以回收和纯化由各自的宿主细胞产生的融合蛋白。通过常规化学纯化手段如高效液相色谱法可获得额外的纯化。一些表达的GLP2-XTEN可能需要在分离和纯化期间重折叠。纯化方法描述于Robert K.Scopes,Protein Purification:Principles andPractice,Charles R.Castor(编著),Springer-Verlag 1994,和Sambrook等,同上。多步纯化分离还描述于Baron等,Crit.Rev.Biotechnol.10:179-90(1990)和Below等,J.Chromatogr.A.679:67-83(1994)。对于治疗目的，优选的是，本发明的GLP2-XTEN融合蛋白基本上是纯的。因此，在本发明的一个优选实施方案中，将本发明的GLP2-XTEN纯化至至少约90-95％同质性，优选至少约98％同质性。例如，可通过凝胶电泳、HPLC和氨基末端氨基酸测序来评估纯度。
VIII).药物组合物
本发明提供了包含GLP2-XTEN的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的GLP2-XTEN融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体。本发明的GLP2-XTEN多肽可以根据已知方法配制，以制备药学上有用的组合物，由此多肽与药学上可接受的载体媒介物(例如水溶液、缓冲液、溶剂和/或药学上可接受的悬液、乳液、稳定剂或赋形剂)混合。非水溶剂的实例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。通过将具有期望纯度的活性GLP2-XTEN成分与任选的如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)中所述的生理上可接受的载体、赋形剂(例如，氯化钠、钙盐、蔗糖或聚山梨醇酯)或稳定剂(例如，蔗糖、海藻糖、棉子糖、精氨酸、钙盐、甘氨酸或组氨酸)混合来制备药物组合物的制剂，以便以冻干制剂或水溶液形式存储。
在一个实施方案中，药物组合物可以作为冻干粉末提供，以在施用前重建。在另一个实施方案中，药物组合物可以液体形式提供，其可以直接施用给患者。在另一个实施方案中，组合物作为在用于施用该组合物的预填充注射器中的液体提供。在另一个实施方案中，组合物作为可并入泵中的预填充小瓶中的液体提供。
药物组合物可通过任何合适的手段或途径进行施用，包括皮下、通过输液泵皮下、肌内、静脉内或经由肺途径。应当理解，优选的途径将随受体的疾病和年龄以及所治疗的病症的严重程度而变化。
在一个实施方案中，液体形式的或重建后(当作为冻干粉末提供时)的GLP2-XTEN药物组合物包含与XTEN连接的GLP-2，在将GLP-2药物组合物施用至有需要的受试者后，该组合物能够使GLP-2-相关活性增加至血液中正常GLP-2血浆水平的至少10％，持续至少约72小时，或至少约96小时，或至少约120小时，或至少约7天，或至少约10天，或至少约14天，或至少约21天。在另一个实施方案中，在将GLP-2药物组合物施用至有需要的受试者后，液体形式的或重建后(当作为冻干粉末提供时)并施用于受试者的GLP2-XTEN药物组合物能够使GLP2-XTEN的浓度增加至至少500 ng/ml，或至少1000 ng/ml，或至少约2000 ng/ml，或至少约3000 ng/ml，或至少约4000 ng/ml，或至少约5000 ng/ml，或至少约10000 ng/ml，或至少约15000 ng/ml，或至少约20000 ng/ml，或至少约30000 ng/ml，或至少约40000 ng/ml，持续至少约24小时，或至少约48小时，或至少约72小时，或至少约96小时，或至少约120小时，或至少约144小时。特别考虑到，本段前述实施方案的药物组合物可配制为包括一种或多种赋形剂、缓冲剂或本领域已知能够与通过静脉内途径或皮下途径或肌内内途径给药相兼容的其他成分。因此，在本段中上文所述的实施方案中，皮下、肌内或静脉内施用该药物组合物。
本发明组合物可以使用多种赋形剂配制。适合的赋形剂包括微晶纤维素(例如，Avicel PH102、Avicel PH101)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵)(例如Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(Methocel K100M,Premium CR Methocel K100M,Methocel E5,)、硬脂酸镁、滑石、柠檬酸三乙酯、乙基纤维素水分散液和硫酸鱼精蛋白。缓释剂还可以包括载体，其可以包括例如溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂。药学上可接受的盐也可以用于这些缓释剂，例如矿物盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。组合物还可以含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇，以及诸如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂等物质。脂质体也可用作载体。
在另一实施方案中，本发明组合物包封于脂质体中，已经证明了脂质体在以受控方式经延长时段递送有益活性剂中的效用。脂质体是含有内陷水容积的闭合双层膜。脂质体还可以是具有单个膜双层的单层小囊泡或具有多个膜双层的多层小囊泡，每个膜双层与下一个膜双层由水层隔开。得到的膜双层的结构使得脂质的疏水性(非极性)尾部朝向双层中心，而亲水性(极性)头部朝向水相。在一个实施方案中，脂质体可以用柔性的水溶性聚合物包被，该聚合物避免被单核吞噬细胞系统的器官(主要是肝和脾)摄取。用于包裹脂质体的适合的亲水性聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙烯酸酯、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列，如美国专利号6,316,024；6,126,966；6,056,973；6,043,094中描述的，这些专利的内容通过引用的方式整体并入。
脂质体可以由本领域已知的任何脂质或脂质组合构成。例如，如美国专利号6,056,973和5,874,104所公开的，形成小囊泡的脂质可以是天然存在的或合成的脂质，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。还如美国专利号6,056,973所公开的，形成小囊泡的脂质还可以是糖脂、脑苷脂或阳离子脂质，例如1,2-二油烯基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2,3,-双十四烷基氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1[(2,3,-二油烯基氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)；或二甲基双十八烷基铵(DDAB)。如美国专利号5,916,588和5,874,104所公开的，胆固醇也可以适当范围存在以赋予小囊泡稳定性。
其他脂质体技术描述于美国专利号6,759,057；6,406,713；6,352,716；6,316,024；6,294,191；6,126,966；6,056,973；6,043,094；5,965,156；5,916,588；5,874,104；5,215,680；和4,684,479中，其内容通过引用的方式并入本文。它们描述了脂质体和脂质涂覆的微泡及其生产方法。因此，本领域技术人员考虑本发明公开内容和这些其他专利的公开内容，能够生产用于本发明多肽的延长释放的脂质体。
对于液体制剂，期望的性质是制剂以如下形式提供：能够穿过25、28、30、31、32号针头以供静脉内、肌肉内、关节内或皮下给药。在另一个实施方案中，期望的性质是该制剂以能够雾化为用于吸入治疗的合适粒径的气雾剂的形式提供。
渗透泵可以在片剂、丸剂、胶囊或可植入装置中用作缓释剂。渗透泵是本领域熟知的，并且本领域技术人员可容易地从在提供用于延长释放药物递送的渗透泵方面有经验的公司获得。实例有ALZA的DUROSTM；ALZA的OROSTM；Osmotica Pharmaceutical的OsmodexTM系统；Shire Laboratories的EnSoTrolTM系统；和AlzetTM。描述渗透泵技术的专利是美国专利6,890,918；6,838,093；6,814,979；6,713,086；6,534,090；6,514,532；6,361,796；6,352,721；6,294,201；6,284,276；6,110,498；5,573,776；4,200,0984；和4,088,864，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其他专利的公开内容，能够生产用于本发明多肽的延长释放的渗透泵。
注射器泵也可用作缓释剂。此类装置描述于美国专利4,976,696；4,933,185；5,017,378；6,309,370；6,254,573；4,435,173；4,398,908；6,572,585；5,298,022；5,176,502；5,492,534；5,318,540；和4,988,337，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其他专利的公开内容，能够生产用于本发明组合物的延长释放的注射器泵。
IX).药物试剂盒
另一方面，本发明提供了有利于使用GLP2-XTEN多肽的试剂盒。该试剂盒包括本文提供的药物组合物、标识该药物组合物的标签和关于所述药物组合的存储、重建和/或施用给受试者的说明。在一些实施方案中，试剂盒优选地包括：(a)在施用给有需要的受试者时足以治疗胃肠病症的量的GLP2-XTEN融合蛋白组合物；(b)一定量的药学上可接受的载体；和(c)一起的即时注射或用无菌水、缓冲液或右旋糖重建的制剂；还有标识GLP2-XTEN药物和存储和操作条件的标签，以及批准的该药物的适应症的插页，关于用于预防和/或治疗经批准的适应症的GLP2-XTEN药物的重建和/或施用的说明，适当剂量和安全性信息，以及标识药物批号和有效期的信息。在前述的另一实施方案中，试剂盒可以包括可以携带GLP2-XTEN组合物的适宜稀释剂的第二容器，其使用将为使用者提供适当浓度的待递送给受试者的GLP2-XTEN。
实施例
实施例1:XTEN_AD36基序区段的构建
以下实施例描述了编码36个氨基酸的基序序列的密码子优化基因的集合的构建。作为第一步，基于pET载体构建填充载体pCW0359，其包含T7启动子。pCW0359编码纤维素结合结构域(CBD)和TEV蛋白酶识别位点，随后是两侧具有BsaI、BbsI和KpnI位点的填充序列。插入BsaI和BbsI位点，使得它们在消化之后产生相容的突出端。填充序列之后是截短形式的GFP基因和His标签。填充序列含有终止密码子，因此携带填充质粒pCW0359的大肠杆菌细胞形成非荧光的菌落。用BbsI和KpnI消化填充载体pCW0359以除去填充区段，并且得到的载体片段通过琼脂糖凝胶纯化来分离。该序列被称为XTEN_AD36，反映了基序的AD家族。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GESPGGSSGSES、GSEGSSGPGESS、GSSESGSSEGGP或GSGGEPSESGSS。通过将以下对的磷酸化的合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AD1正向：AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC
AD1反向：ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC
AD2正向：AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC
AD2反向：ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT
AD3正向：AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC
AD3反向：ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA
AD4正向：AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC
我们还退火磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI区段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0401的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AD36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AD36序列具有良好的表达水平。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0401筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的区段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AD36区段的39个克隆。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表8。
表8:36-mer基序的DNA和氨基酸序列
实施例2:XTEN_AE36区段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的XTEN序列的密码子文库。XTEN序列被称为XTEN_AE36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GSPAGSPTSTEE、GSEPATSGSE TP、GTSESA TPESGP或GTSTEPSEGSAP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AE1正向：AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA
AE1反向：ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT
AE2正向：AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC
AE2反向：ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT
AE3正向：AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC
AE3反向：ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT
AE4正向：AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC
AE4反向：ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI区段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0402的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AE36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AE36序列显示良好表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0402筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的区段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AE36区段的37个克隆。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表9。
表9:36-mer基序的DNA和氨基酸序列
实施例3:XTEN_AF36区段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。所述序列被称为XTEN_AF36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GSTSESPSGTAP、GTSTPESGSASP、GTSPSGESSTAP或GSTSSTAESPGP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AF1正向：AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC
AF1反向：ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA
AF2正向：AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC
AF2反向：ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT
AF3正向：AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC
AF3反向：ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT
AF4正向：AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC
AF4反向：ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI区段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0403的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AF36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AF36序列显示良好的表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0403筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的区段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AF36区段的44个克隆。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表10。
表10:36-mer基序的DNA和氨基酸序列
实施例4:XTEN_AG36区段的构建
构建了编码长度为36个氨基酸的序列的密码子文库。所述序列被称为XTEN_AG36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12mer肽：GTPGSGTASSSP、GSSTPSGATGSP、GSSPSASTGTGP或GASPGTSSTGSP。通过将以下对的磷酸化合成寡核苷酸对退火来获得插入序列：
AG1正向：AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC
AG1反向：ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT
AG2正向：AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC
AG2反向：ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT
AG3正向：AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC
AG3反向：ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA
AG4正向：AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC
AG4反向：ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC
我们还退火磷酸化寡核苷酸3KpnIstopper正向：AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnIstopper反向：CCTCGAGTGAAGACGA。将退火的寡核苷酸对连接，得到具有不同长度的产物的混合物，所述不同长度代表与一个BbsI/KpnI区段连接的12mer重复序列的不同数目。将对应于长度为36个氨基酸的产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物分离并连接到BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359。得到的称为LCW0404的文库中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明XTEN_AG36序列已经与GFP基因在框内连接，并且大多数XTEN_AG36序列显示良好表达。
我们通过将它们压印在含IPTG的琼脂平板上，针对高水平荧光从文库LCW0404筛选了96个独立克隆。通过PCR评估相同的独立克隆，并鉴定了含有具有36个氨基酸的区段以及强荧光的48个独立克隆。对这些独立克隆进行测序并鉴定了含有正确XTEN_AG36区段的44个克隆。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表11。
表11:36-mer基序的DNA和氨基酸序列
实施例5:XTEN_AE864的构建
由XTEN_AE36的连续二聚化成AE72、144、288、576和864来构建XTEN_AE864。从37个不同的XTEN_AE36区段构建XTEN_AE72区段的集合。将携带所有37个不同的36-氨基酸区段的大肠杆菌的培养物混合并分离质粒。用BsaI/NcoI消化该质粒库以产生小片段作为插入序列。用BbsI/NcoI消化相同的质粒库以产生大片段作为载体。将插入序列和载体片段连接，导致长度倍增，并且将连接混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞以获得XTEN_AE72的菌落。
将XTEN_AE72区段的该文库称为LCW0406。对来自LCW0406的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE144的文库LCW0410。对来自LCW0410的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE288的文库LCW0414。从文库随机选取两个独立克隆LCW0414.001和LCW0414.002并进行测序以证实同一性。对来自LCW0414的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE576的文库LCW0418。我们针对高水平的GFP荧光从文库LCW0418筛选了96个独立克隆。对通过PCR具有正确大小的插入序列和强荧光的8个独立克隆进行测序，并且基于测序和表达数据选择2个独立克隆(LCW0418.018和LCW0418.052)将来使用。
使用如上所述相同的二聚化过程，通过组合XTEN_AE576的LCW0418.018和XTEN_AE288的LCW0414.002构建XTEN_AE864的特定克隆pCW0432。
实施例6:XTEN_AM144的构建
从37个不同的XTEN_AE36区段、44个XTEN_AF36区段和44个XTEN_AG36区段开始构建XTEN_AM144区段的集合。
将携带所有125个不同的36-氨基酸区段的大肠杆菌培养物混合并分离质粒。用BsaI/NcoI消化该质粒库以产生小片段作为插入序列。用BbsI/NcoI消化相同的质粒库以产生大片段作为载体。将插入序列和载体片段连接，导致长度倍增，并且将连接混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞以获得XTEN_AM72的菌落。
将XTEN_AM72区段的该文库称为LCW0461。对来自LCW0461的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到文库LCW0462。针对蛋白质表达筛选来自文库LCW0462的1512个独立克隆。将个体菌落转移至96孔板并培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜自动诱导培养基并培养20-30h。使用在395nm激发和在510nm发射的荧光分析仪测量表达。192个独立克隆显示了高水平表达，并且进行DNA测序。文库LCW0462中大多数克隆显示了良好表达和类似的理化性质，表明大多数XTEN_AM36区段的组合产生有用的XTEN序列。选择来自LCW0462的30个独立克隆作为XTEN_AM144区段的优选集合，用于构建含有多个XTEN区段的多功能蛋白质。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列于表12。
表12:AM144区段的DNA和氨基酸序列
实施例7:XTEN_AM288的构建
将整个文库LCW0462如实施例6所述二聚化，得到被称为LCW0463的XTEN_AM288克隆文库。使用实施例6中描述的方案筛选来自文库LCW0463的1512个独立克隆。对176个高表达的克隆进行测序，并且选择40个优选的XTEN_AM288区段来构建含有具有288个氨基酸残基的多个XTEN区段的多功能蛋白质。
实施例8:XTEN_AM432的构建
通过重组来自XTEN_AM144区段文库LCW0462的区段和来自XTEN_AM288区段文库LCW0463的区段，产生了XTEN_AM432区段的文库。该新的XTEN_AM432区段文库被称为LCW0464。从分别携带LCW0462和LCW0463的大肠杆菌的培养物分离质粒。使用实施例6描述的方案筛选来自文库LCW0463的1512个独立克隆。对176个高表达克隆进行测序，并且选择39个优选的XTEN_AM432区段来构建更长的XTEN并构建含有具有432个氨基酸残基的多个XTEN区段的多功能蛋白质。
同时，我们使用XTEN_AM144和XTEN_AM288的优选区段构建了XTEN_AM432区段的文库LMS0100。筛选该文库产生了选择用于进一步构建的4个独立克隆。
实施例9:XTEN_AM875的构建
用BsaI和KpnI消化填充载体pCW0359以去除填充区段，并且得到的载体片段通过琼脂糖凝胶纯化进行分离。
我们退火磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnI正向引物：AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnI反向：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGCTTGC，以引入编码氨基酸GASASGAPSTG并且内部具有限制酶AscI识别核苷酸序列GGCGCGCC的测序岛A(SI-A)。将退火的寡核苷酸对与上述制备的BsaI和KpnI消化的填充载体pCW0359连接，以产生含有SI-A的pCW0466。然后，我们使用实施例5描述的相同二聚化方法通过在C端重组来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432区段和来自pCW0466的SI-A区段而产生XTEN_AM443区段文库。将该新的XTEN_AM443区段文库称为LCW0479。
我们使用实施例5描述的相同的二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443区段的文库LCW0479的区段和来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432区段而产生XTEN_AM875区段文库。将该新的XTEN_AM875区段文库称为LCW0481。
实施例10:XTEN_AM1318的构建
我们退火磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnI正向引物：AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnI反向：CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG，以引入编码氨基酸GPEPTGPAPSG并且内部具有限制酶FseI识别核苷酸序列GGCCGGCC的测序岛A(SI-B)。将退火的寡核苷酸对与如实施例9使用的BsaI和KpnI消化的填充载体pCW0359连接，以产生含有SI-B的pCW0467。然后，我们使用实施例5描述的相同二聚化方法，通过在C端重组来自实施例8的43个优选的XTEN_AM432区段和来自pCW0467的SI-B区段而产生XTEN_AM443区段文库。将该新的XTEN_AM443区段文库称为LCW0480。
我们使用实施例5描述的相同的二聚化方法，通过重组来自XTEN_AM443区段文库LCW0480的区段和来自XTEN_AM875区段文库LCW0481的区段而产生XTEN_AM1318区段文库。将该新的XTEN_AM1318区段文库称为LCW0487。
实施例11:XTEN_AD864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例1所列XTEN_AD36区段开始组装XTEN_AD864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AD864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。对XTEN_AD576的一个中间构建体进行测序。在PK实验中对该克隆在食蟹猴中评估并测量半衰期为约20h。
实施例12:XTEN_AF864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例3所列XTEN_AF36区段开始组装XTEN_AF864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AF864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。对XTEN_AF540的一个中间构建体进行测序。在PK实验中对该克隆在食蟹猴中评估并测量半衰期为约20h。XTEN_AF864的全长克隆具有优良溶解度，并且显示在食蟹猴中超过60h的半衰期。将第二组XTEN_AF序列组装为包括实施例9所述的测序岛。
实施例13:XTEN_AG864的构建
使用几轮连续的二聚化，我们从实施例4所列XTEN_AD36区段开始组装XTEN_AG864序列的集合。将这些序列如实施例5所述来组装。评估了来自XTEN_AG864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。XTEN_AG864的全长克隆具有优良的溶解度，并且显示在食蟹猴中超过60h的半衰期。
实施例14:产生和评估含有GLP-2和AE_XTEN的GLP2-XTEN的方法
用于产生和评价GLP2-XTEN组合物的一般方案示于图6，并且构成本实施例的一般描述的基础。GLP-2肽及序列变体可重组制备。用于制备GLP-2肽的示例性重组方法尤其包括以下所述，这对本领域技术人员而言将是显而易见的。通常，通过以下步骤制备本文所定义和/或所述的GLP-2肽或序列变体：构建编码期望的肽的核酸，将该核酸以与编码一个或多个XTEN的核酸的符合读框的方式克隆到表达载体中，转化宿主细胞(例如，细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)，表达该核酸以产生期望的GLP2-XTEN。在体外和在原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是本领域普通技术人员已知的。参见例如美国专利号4,868,122和Sambrook等,Molecular Cloning—ALaboratory Manual(第三版),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。
使用已公开的方法和本领域普通技术人员已知的方法，结合示例性实施例中提供的指导，技术人员可以构建并且评估包含XTEN、GLP-2和如本文所公开的或本领域已知的GLP-2变体的GLP2-XTEN融合蛋白。因此，本实施例将被解释为仅仅是示例性的，而不是以任何方式限制所述方法；许多变化对于普通技术人员是明显的。在本实施例中，构建包含连接至基序AE家族的XTEN的GLP-2的GLP2-XTEN。
图4和图5提供了用于产生编码XTEN的多核苷酸的一般方案。图5是在本发明一个实施方案中XTEN多核苷酸构建体的组装的代表性步骤的示意流程图。将单个寡核苷酸501退火为序列基序502，如12氨基酸基序(“12-mer”)，它与来自文库的其他序列基序连接，该基序可多聚化以产生包含期望长度的XTEN 504的集合体，并且与较小浓度的含有BbsI和KpnI限制性位点503的寡核苷酸连接。基序文库可限制为特定的序列XTEN家族；例如表3中的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。如图5所示，该例中XTEN的长度是864个氨基酸残基，但通过该方法可以达到更短或更长的长度。例如，多聚化可以借助连接、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术来进行。对所得的连接产物集合体进行凝胶纯化，并且切下含有期望长度的XTEN的条带，得到具有塞序列的分离的XTEN基因505。可将XTEN基因克隆到填充载体。在这种情况下，载体编码任选的CBD序列506和GFP基因508。然后用BbsI/HindIII进行消化以去除507和508并放置终止密码子。然后将所得产物克隆到经BsaI/HindIII消化的、含有GLP-2编码基因的载体中，得到编码GLP2-XTEN融合蛋白的基因500。正如对于本领域普通技术人员而言显而易见的，这些方法可应用于构建具有备选构型且具有不同XTEN长度的构建体。
编码GLP-2的DNA序列可以方便地通过本领域中已知标准程序从适宜细胞来源制备的cDNA文库得到，从基因组文库得到，或可以使用从可公开获得的数据库、专利或参考文献中得到的DNA序列以合成的方式来构建(如，自动化核酸合成)，特别是当引入序列变体(例如，GLP-2-2G)时。在本实施例中，使用了GLP-2-2G序列。然后，将编码蛋白质的GLP-2部分或其互补体的基因或多核苷酸能够克隆到构建体，例如本文描述的那些构建体，它们可以是质粒，或者是在生物系统中为高水平蛋白质表达而受控于合适的转录和翻译序列的其他载体。通过连接或多聚化步骤，可将编码XTEN部分或其互补体的第二基因或多核苷酸与编码GLP-2基因的末端的核苷酸进行遗传融合，方法是将其以与编码GLP-2的基因相邻且符合读框的方式克隆到构建体中。以这种方式，编码(或互补于)GLP2-XTEN融合蛋白的嵌合DNA分子在构建体中产生。任选地，将编码第二XTEN的基因插入并符合读框地内部连接至编码GLP-2编码区的核苷酸。任选地，将这种嵌合DNA分子转移或克隆到作为更加适合的表达载体的构建体中，例如适合于原核宿主细胞如大肠杆菌、真核宿主细胞如酵母或哺乳动物宿主细胞如CHO、BHK等的载体。在这一点上，能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞被嵌合DNA分子转化。如上所述，可将含有目标DNA区段的载体根据细胞宿主的类型通过已知的方法转移到合适的宿主细胞。
在适当改进以用于激活启动子的常规营养培养基中培养含有GLP2-XTEN表达载体的宿主细胞。诸如温度、pH等培养条件是之前用于为表达而选择的宿主细胞的那些条件，并且对于普通技术人员是显然的。此融合蛋白表达之后，收集培养液并从细胞团块中分离，保留得到的粗提取物用于纯化融合蛋白。
直接在样品中测定基因表达，例如，通过常规的Southern印迹法、定量mRNA的转录的Northern印迹法[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交，根据在本文提供的序列使用适当标记探针。或者，通过免疫荧光的方法，比如细胞免疫组织化学染色以直接定量基因产物的表达，来测量基因表达。用于免疫组织化学染色和/或样品液体测定的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可以利用基于本文提供的序列的合成肽制备针对GLP-2序列多肽的抗体，或者是针对与GLP-2融合并编码特定抗体表位的外源序列的抗体。选择性标记的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括报告分子，如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
经本领域已知的方法纯化GLP2-XTEN多肽产物。诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分级分离、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、羟磷灰石吸附色谱、疏水作用色谱或凝胶电泳等程序都是可在纯化中使用的技术。在Robert K.Scopes,Protein Purification:Principlesand Practice,Charles R.Castor编著,Springer-Verlag 1994,和Sambrook等(同上)中描述了具体的纯化方法。在Baron等,Crit.Rev.Biotechnol.10:179-90(1990)和Below等,J.Chromatogr.A.679:67-83(1994)中也描述了多步纯化分离。
如图6所示，分离的GLP2-XTEN融合蛋白然后根据它们的化学与活性性质来表征。使用本领域已知的标准方法针对例如序列、纯度、表观分子量、溶解度和稳定性对分离的融合蛋白进行表征。然后评估符合预期标准的融合蛋白的活性，这可以通过使用一种或多种本文公开的测定或使用实施例或表32的测定来测量本文描述的GLP-2相关参数之一而在体外或体内进行测量。
此外，将GLP2-XTEN融合蛋白施用给一种或多种动物种以确定标准药代动力学参数和药效学性质，如实施例18-21中所述。
通过生产、表达和回收GLP2-XTEN构建体的反复过程，随后使用本文公开的方法或本领域已知的其他方法对其进行表征，包含GLP-2和XTEN的GLP2-XTEN组合物可以由本领域普通技术人员制备和评估以确认预期特性，如增强的溶解度、增强的稳定性、改进的药代动力学和降低的免疫原性，导致与相应的未融合GLP-2相比总体增强的治疗活性。对于不具有期望特性的那些融合蛋白，可通过这些方法构建、表达、分离和评估不同的序列以获得具有这些性质的组合物。
实施例15：GLP2-XTEN基因和载体的构建
设计和构建寡核苷酸，使得整个GLP-2基因可通过在48℃退火温度的条件下经由设计的互补突出端使这些寡核苷酸贴合在一起而进行组装。互补区域保持不变，但寡核苷酸的其他区域发生变化，以便产生基因中约50％的密码子改变而不是单一的天然基因序列中的文库。进行PCR，以产生如典型的包含寡核苷酸的多种组合并且在琼脂糖凝胶上呈现为成片条带的组合基因文库。进行抛光PCR以使用与基因的5’和3’末端互补的一组扩增引物扩增那些具有正确终点的组装体。然后对这种PCR的产物进行凝胶纯化，仅取～100bp长度的预期GLP-2最终基因产物的条带。用BsaI和NdeI消化这种凝胶纯化的产物，并连接至含有编码CBD前导序列和AE864XTEN的DNA的同样消化的构建体，以产生GLP2-XTEN_AE864基因，并在BL21gold感受态细胞中进行转化。挑取来自该转化的菌落放入96深孔板中的500μl SB培养液中并过夜生长至饱和。在用20μl这些培养物接种500μl自诱导培养基后将这些培养物储存在4℃下，并且使这些培养物在26℃下生长>24小时。生长之后，使用荧光读板仪测量100μl这些自诱导培养基培养物的GFP荧光。GFP荧光与产生的GLP2-XTEN_AE464分子数成正比，因此是总表达的读数。鉴定最高表达的克隆，并在来自该克隆的原始饱和过夜培养物的SB中开始新的1ml过夜培养。利用这些新的培养物进行小量制备，并对得到的质粒进行测序以确定确切的核苷酸组成。将大肠杆菌分离株称为菌株AC453，并且鉴定为产生期望的GLP-2_2G-XTEN_AE864融合蛋白的菌株。预裂解表达的产物(具有CBD前导序列和TEV裂解序列)的DNA和氨基酸序列和最终产物GLP-2-2G-XTEN_AE864(TEV裂解后)的氨基酸序列在表13中提供。
表13:GLP2-XTEN DNA和氨基酸序列
实施例16：包含融合至XTEN_AE864的GLP-2-2G的融合蛋白的表达和纯化
用于表达的宿主菌株，AmE025，来源于大肠杆菌W3110，一种具有K-12背景的菌株，具有fhuA基因的缺失并且具有整合至染色体的λDE3原噬菌体。宿主细胞含有质粒pCW1010(AC616)，其编码与pCW812(AC453)所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。最终构建体包含编码来自于热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的纤维素体锚定蛋白质凝聚区纤维素结合结构域(CBD)的基因(登记号#ABN54273)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别位点(ENLYFQ)、GLP2-2G序列和受T7启动子控制的AE864氨基酸XTEN序列。该蛋白质在具有B.Braun Biostat B控制器的5L玻璃夹套发酵罐中表达。简言之，用宿主菌株AmE025的起子培养物接种2L发酵分批培养基。在37℃下培养6小时后，开始50％的葡萄糖进料。培养20小时后，将温度降至26℃，并且加入1M IPTG来诱导表达。在45小时的总发酵运行时间后，通过离心收获培养物，得到湿重～1kg的细胞团块。将这些团块冷冻储存在-80℃下直至开始进行纯化。
裂解、热絮凝和澄清
得到的细胞糊状物在环境温度下以～4ml/1g细胞糊状物的比例重新悬浮于20mMTris-HCl pH 7.5,50mM NaCl中。通过在800-900巴的工作压力下2次通过APV 2000均质器来裂解细胞。裂解后，将匀浆在热交换器中加热至～85℃，并保持20分钟以使宿主细胞蛋白质凝结，然后快速冷却至～10℃。通过在Sorvall RC-3C离心机中使用Sorvall H6000A转子以4,000rpm离心60min来使冷却的匀浆变澄清。将上清液倒出，通过60SP03A Zeta PlusEXT深层过滤器(3M)，然后通过0.2μm LifeASSURE PDA无菌胶囊并在4℃下储存过夜。
利用ToyopearlSuperQ-650M树脂的初始阴离子交换捕获
在环境温度下使用3柱步骤从澄清的裂解物中分分离出GLP2-2G-XTEN。使用Toyopearl SuperQ-650M(Tosoh)阴离子交换树脂捕获GLP2-2G-XTEN，该阴离子交换树脂选择带负电的XTEN多肽尾部并去除大部分宿主细胞蛋白质。适当比例的SuperQ-650M柱用5柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl平衡，并且将裂解物以120cm/hr的线性流速加载至柱上。然后用3倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl和3倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl洗柱，直至紫外吸光度回到基线。利用7倍柱体积20mM NaCl Tris-HCl，pH 7.5中从150mM NaCl到300mM NaCl的线性梯度来洗脱GLP2-2G-XTEN蛋白质。收集所有级分并通过SDS-PAGE进行分析，合并并储存在2-8℃下。在Super Q捕获步骤之后产物的纯度确定为～80％。
利用GEMacroCapQ树脂的中间阴离子交换捕获
利用20mM Tris-HCl pH 7.5将得到的SuperQ集合体稀释～4倍，以使导电性降低至<10mS/cm。适当比例的MacroCap Q阴离子交换柱(GE Life Sciences)选择全长完整的XTEN多肽尾并去除大部分内毒素和任何残留的宿主细胞蛋白质和DNA。将柱用5倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl平衡。以120cm/hr的线性流速加载稀释的SuperQ集合体。然后用3倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl，然后3倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl来洗涤该柱，直至紫外吸光度回到基线。用12倍柱体积20mM Tris-HCl pH 7.5中从150mM NaCl到300mM NaCl的线性梯度来洗脱GLP2-2G-XTEN蛋白质。收集所有级分并通过SDS-PAGE进行分析，合并并储存在2-8℃下。在MacroCap Q中间步骤之后产物的纯度确定为>95％。
使用Toyopearl Phenyl-650M树脂的疏水相互作用色谱法(HIC)
将适量的固体NaCl盐溶解在MacroCap Q集合体中以调节负载至4M NaCl，然后通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。适当比例的Toyopearl Phenyl-650M(Tosoh)柱选择GLP2有效负载的疏水性残基并去除残留的XTEN片段和内毒素。该柱用5倍柱体积的20mM Tris-HClpH 7.5、4M NaCl平衡。以60cm/hr的线性流速加载MacroCap Q集合体。然后用3倍柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5、4M NaCl来洗涤该柱。用20mM Tris-HCl pH 7.5中逐步降低至1.2MNaCl的梯度来洗脱GLP2-2G-XTEN蛋白质。将洗脱峰分级分离并通过SDS-PAGE进行分析以确认成功捕获和GLP2-2G-XTEN的洗脱。在最后的抛光步骤之后产物的纯度确定为>95％。将得到的集合体浓缩至～11mg/ml并使用30KDa MWCO Pellicon XL 50超滤盒(Ultrafiltration Cassette)(Millipore)将缓冲液更换为20mM Tris-HCl pH 7.5、135mMNaCl制剂缓冲液。将纯化批次的GLP2-2G-XTEN称为AP690并在-80℃下储存待用。
SDS-PAGE分析
对加载在NuPAGE 4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen)上的2μg、5μg和10μg的AP690进行SDS-PAGE分析，然后在恒定的200V下运行35分钟。结果(图11A)表明AP690蛋白质无宿主细胞杂质，并且其迁移至160kDa标记物附近，其为该分子量的有效负载的XTEN融合蛋白和组合物的预期结果。
内毒素含量
使用EndoSafe PTS测试盒(Carles River)来评估批号AP690的内毒素水平并确定为3.5EU/mg的蛋白质，使得批号AP690适于注射至测试动物，以进行药代动力学或药效学研究。
分析尺寸排阻HPLC
使用Phenomenex BioSep-SEC-s4000(7.8mm x 600mm)柱进行凝胶过滤分析。利用50mM磷酸盐pH 6.5、300mM NaCl的流动相在流速0.5ml/min下对20μg AP690GLP2-2G-XTEN融合蛋白进行分析。使用OD215nm来监测洗脱。使用来自Phenomenex的尺寸排除检查标准品利用以下标记物进行柱校准：甲状腺球蛋白(670kDa)、IgG(156kDa)、BSA(66kDa)和卵清蛋白(17kDa)。结果(图11B)表明，83.1kDa实际分子量的融合蛋白的表观分子量为1002kDa，表观分子量因子为12.5。
通过ESI-MS进行的完整质量确定
通过使用Extract-Clean C18柱(Discovery Sciences)的固相提取对200μg的AP690GLP2-2G-XTEN蛋白进行脱盐。将0.1％甲酸、50％乙腈中的脱盐蛋白溶液以4μl/min输入QSTAR XL质谱仪(AB Sciex)。800-1400amu范围内获得多电荷TOF谱。通过在10-100kDa范围内的Bayesian重构获得零电荷谱(图12)。全长完整GLP2-2G-XTEN的实验分子量确定为83,142Da，检测到83,003Da的额外小峰，代表<总蛋白的5％的脱-His GLP2-2G-XTEN。
实施例17：通过钙通量效价分析对GLP2-XTEN体外受体结合的表征
使用GPCRProfiler试验(Millipore)进行受体结合分析，以评估GLP2-2G-XTEN制剂(包括AP690)。该分析应用了转染的GLP2R细胞系(Millipore,Cat#HTS164C)，该细胞系由用GLP2G-蛋白偶联受体和在GLP2受体激动后刺激钙通量的Gα蛋白稳定转染的Chem-11人细胞组成。通过加入连续稀释的GLP2-2G-XTEN、合成的GLP2-2G肽(无XTEN)和合成的天然GLP2肽来进行分析，并且通过FLIPR TETRA仪器(Molecular Devices)使用无洗涤钙测定试剂盒(Molecular devices)实时监测钙通量。用图13中所示的结果推导出GLP2-2G-XTEN的EC50值为370nM而GLP2-2G肽为7nM。结果表明，GLP2-2G-XTEN能够结合并激活GLP-2受体，与GLP2-2G相比具有约2％的效力。
实施例18：在小鼠体内对GLP2-XTEN的药代动力学评价
在皮下(SC)施用后评价融合蛋白GLP2-2G-XTEN_AE864在C57Bl/6小鼠体内的药代动力学性质。以0.25mg/mL(8mL/kg)对雌性C57Bl/6小鼠皮下注射2mg/kg(25nmol/kg)的GLP2-2G-XTEN(批号AP498A)。在以下时间点的每一个时处死三只小鼠：给药前、给药后0.08、4、8、24、48、72、96和120小时。从小鼠采集血样并在每个时间间隔放置在预冷的肝素化管中，并通过离心分离以回收血浆。分析样品的融合蛋白浓度，这通过抗-XTEN/抗-XTEN夹心ELISA(AS1405)和抗-GLP2/抗-XTEN夹心ELISA(AS1717)进行，并使用WinNonLin对结果进行分析以获得PK参数。终末半衰期拟合24小时到120小时。将结果示于表14和图14中，两种分析显示了基本上等价的结果，确定了31.6-33.9h的终末半衰期。
表14：GLP2-2G-XTEN-864的药代动力学
实施例19：在大鼠体内对GLP2-XTEN的药代动力学评价
在皮下施用两种不同剂量水平之后，评价融合蛋白GLP2-2G-XTEN_AE864在Wistar大鼠体内的药代动力学性质。实验之前，将导管经外科插入雌性Wistar大鼠的颈静脉。将插有导管的动物随机分成两组，每组有三只大鼠。通过以下的皮下注射将融合蛋白GLP2-2G-XTEN(批号AP510)施用于每只大鼠：1)低剂量2mg/kg(25nmol/kg)；或2)高剂量16mg/kg(200nmol/kg)。在给药前、施用测试化合物后0.08、4、8、24、48、72、96、120和168小时(10个时间点)通过每只大鼠的颈静脉导管将血样(～0.2mL)收集至预冷的肝素化管中。通过离心将血液处理为血浆，分成两份用于进行ELISA分析。分析样品的融合蛋白浓度，这通过抗-XTEN/抗-XTEN夹心ELISA(AS1602)和抗-GLP2/抗-XTEN夹心ELISA(AS1705)进行，并使用WinNonLin对结果进行分析以获得PK参数。终末半衰期拟合48小时到168小时。结果示于表15和图15中，两种分析显示出基本等价的结果，并确定了37.5-49.7h的终末半衰期，大大超过了报道的GLP-2和GLP2-2G的终末半衰期。此外，在以25nmol/kg和200nmol/kg单次皮下施用至大鼠后GLP2-2G-XTEN的药代动力学谱与Cmax和AUC的大致线性方式的增加具有剂量正比关系。
表15：GLP2-2G-XTEN-864的药代动力学
实施例20：在食蟹猴体内对GLP2-XTEN的药代动力学评价
在以单次剂量水平皮下或静脉内施用融合蛋白后评价融合蛋白GLP2-2G-XTEN_AE864在雄性食蟹猴体内的药代动力学性质。在0时间对3只雄性食蟹猴静脉注射2mg/kg(25nmol/kg)GLP2-2G-XTEN，对3只雄性食蟹猴皮下注射2mg/kg(25nmol/kg)GLP2-2G-XTEN。在给药前和研究的第一阶段施用融合蛋白后大约0.083h(5min)、1、2、4、8、24、48、72、96、120、168、216、264和336小时从每只猴子采集血样至预冷的肝素化管。使动物“洗脱”6周时间(第1阶段最后收集时间点后的4周)，将这些组进行交叉(SC到IV和IV到SC)，并且再次利用相同剂量的GLP2-2G-XTEN融合蛋白给药。在研究的第二阶段中在给药前和给药后大约0.083h(5min)、1、2、4、8、24、48、72、96、120、168、216、264、336、384、432和504小时采集血样。通过离心将所有血样处理为血浆并分成两份用于ELISA分析。分析样品的融合蛋白浓度，这通过抗-GLP2/抗-XTEN ELISA(AS1705)进行，并且使用WinNonLin对结果进行分析以获得PK参数。结果示于表16和图16中，确定了静脉施用的GLP2-2G-XTEN_AE864融合蛋白的终末半衰期为110h，皮下施用为120h。生物利用度为96％，这表明GLP2-2G-XTEN在皮下施用后被快速并接近完全吸收。
表16：GLP2-2G-XTEN-864的药代动力学
用来自三个物种(小鼠、大鼠和猴)的数据，用PK分析的累积结果对GLP2-2G_AE864终末半衰期、清除率和分布体积进行异速增长定标。如图17所示，通过推算体重和每个药代动力学参数之间的log线性关系来预测70kg的人的药代动力学值。终末半衰期、分布体积和清除率的数据示于表17中。预测的人的终末半衰期为240h，大大超过了报道的人体中替度鲁肽的3.2h的终末半衰期(Marier,J-F等.Pharmacokinetics,Safety,and Tolerabilityof Teduglutide,a Glucagon-Like Peptide-2(GLP-2)Analog,Following MultipleAscending Subcutaneous Administrations in Healthy Subjects.J Clin Pharmacol(2008)48:1289-1299)。还可使用清除率(Cl)和分布体积(Vd)的预测值0.693×Vd/Cl来评估在人体内的终末半衰期。应用该公式得到人体内230h的预测终末半衰期，其与由动物T1/2数据推断的值是一致的，并且大大超过了天然GLP-2和GLP2-2G的报道的终末半衰期。
表17：GLP2-2G-XTEN-864的药代动力学的异速增长定标
*预测值
实施例21：在动物模型中对GLP2-XTEN的药效学评价
使用正常大鼠中的肠营养生长和对小鼠DSS-结肠炎和大鼠克罗恩病的效力的临床前模型来评估GLP2-2G-XTEN_AE864融合蛋白的体内药理学活性。
在正常大鼠中对GLP2-2G-XTEN-AE864的体内评估
为了确定GLP2-XTEN的肠营养生长性质，测定大鼠中的小肠生长作为主要的药效学终点。将GLP2-2G-XTEN-AE864融合蛋白、GLP2-2G肽或载体经由皮下注射至重200-220克的雄性Sprague-Dawley大鼠(每组10-12只大鼠)。利用先前公开的12.5nmol/kg(0.05mg/kg)、每日两次、持续12天的方案给药GLP2-2G肽。以25nmol/kg、每日一次持续12天给药GLP2-2G-XTEN。处死后，进行中线切口，取出小肠，伸展至其最大长度并记录长度。从内腔中冲洗掉粪便并记录小肠湿重。利用ANOVA模型应用针对成对比较的Tukey/Kramer事后测试来分析小肠长度和重量数据，在p＝0.05具有显著性。
结果：利用GLP2-2G肽处理12天(12.5nmol/kg/剂量，使用标准的每日两次的给药方案)导致小肠重量24％的显著增加(图18A)。对于小肠长度无显著影响。施用等摩尔数的GLP2-2G-XTEN 12天以上的研究(25nmol/kg/剂量，每日一次)导致小肠重量31％的相似的显著增加。与利用GLP2-2G肽看到的结果相比，GLP2-2G-XTEN处理的大鼠的小肠显示出长度的9％(10cm)的显著增长，并且明显比来自载体处理的对照动物的组织厚(图18)。
结论：研究结果表明GLP2-2G-XTEN对小肠生长的诱导与使用等量nmol/kg剂量的GLP2-2G肽一样好或好于GLP2-2G肽。
在小鼠急性DSS-诱导的结肠炎模型中对GLP2-2G-XTEN-AE864的体内评估
为了确定GLP2-XTEN的功效，在肠道炎症性结肠炎小鼠模型中对GLP2-2G-XTEN-AE864融合蛋白进行了评估。通过利用溶解在饮用水中的4.5％的右旋糖酐硫酸钠(DSS)喂养小鼠10天直至观察到～20％的体重减轻而在雌性C57Bl/6小鼠(9-10周龄)中诱导小肠结肠炎。给予幼稚的、未处理过的对照组(第1组)以正常饮用水，持续该实验的持续时间。DSS处理的组(第2-7组)用载体(组2)、GLP2-2G肽(无XTEN)(第3组)或GLP2-2G-XTEN(批号AP5100(第4-7组)进行皮下处理。处理剂量和方案在下表18中列出；BID施用GLP-2G肽1-10天，而在早上QD施用融合蛋白，在1-10天的晚上施用载体对照。测量的参数包括体重(每日记录的)和以下终点，在实验的第10天确定：结肠重量和长度、小肠重量和长度以及胃重量。将组织在福尔马林中固定，然后转移至乙醇中用于染色和组织病理学。利用针对成对比较的Tukey/Kramer事后检测的ANOVA模型来分析解剖学数据，在p＝0.05具有显著性。
表18：处理组
结果：在处死当天对体重、结肠长度和重量、小肠重量和长度以及胃重量的治疗效果进行评估。虽然DSS处理的小鼠与对照小鼠相比显示出预期的体重的显著降低(参见图19)，但是用GLP2-2G肽处理的小鼠和用任何剂量的GLP2-2G-XTEN处理的任何小鼠组在实验过程中均未显示出体重减轻的降低。至于对结肠、小肠和胃的治疗效果，具有统计学显著变化的参数为与对照组1和2相比GLP2-2G-XTEN高剂量组(6mg/kg)以及与第1组相比GLP2-2G-XTEN中等剂量组(2mg/kg)的小肠重量的增加(数据未示出)。GLP2-2G肽在目前的研究中不诱导测定组织的显著生长。对第2组(DSS/载体处理的)和第4组(DSS/GLP2-2G-XTEN 6mg/kgqd处理的)进行组织病理学检查。检查的结果表明来自载体处理的小鼠的小肠样品显示出中等和显著程度的粘膜萎缩(参见图20A、图20B)。粘膜由矮化的绒毛(高度减小的)稀疏填满，并减小了绒毛的厚度。相反，来自用6mg/kg GLP2-2G-XTEN qd处理的小鼠的小肠样品显示出具有密集地填充有柱状上皮和杯状细胞的细长绒毛的正常的粘膜结构(参见图20C、图20D)。该结果支持以下结论：在该实验条件下，用GLP2-2G-XTEN融合蛋白进行处理保护了小肠免受DSS的炎症影响，维持正常绒毛和粘膜结构。
GLP2-2G-XTEN与GLP2-2G肽在大鼠克罗恩病吲哚美辛诱导的炎症模型中的功效
为了确定使用单次剂量或每日一次给药(qd dosing)的GLP2-XTEN的功效，在三个独立研究中在吲哚美辛诱导型肠炎的克罗恩病大鼠模型中对GLP2-2G-XTEN-AE864融合蛋白进行评估。
研究1：使用在实验的第0天和第1天施用的吲哚美辛在80只雄性Wistar大鼠(Harlan Sprague Dawley)中诱导肠炎。将大鼠分成7个处理组用于根据表19进行处理。
表19：处理组
从实验的第3天开始按照日程表施用所有处理。每天测量体重。对组3和组5每天等摩尔给药。在第2天(第二次吲哚美辛给药后24小时)，将动物预先处死并进行分析。在处理前30分钟，对大鼠静脉注射1ml 1％的伊文思蓝染料，以便通过组织病理学分析使溃疡和炎症程度可视化。将大鼠麻醉(SOP 1810)，取血样以使用抗-XTEN/抗-GLP2ELISA方法确定GLP-2-2G-XTEN的浓度。使大鼠安乐死，然后进行尸检并通过对肠道进行肉眼检查粘连的存在来评分；即，无＝0，轻微＝1，中度＝2，严重＝3。取出小肠并记录各自的长度。在各小肠中，做出纵向切口并对内部进行检查。记录溃疡面积的程度和长度的评分；即，无＝0，少＝1，多重＝2，或连续的＝3。对于TNFα的确定，将肠样品解冻并用DPBS将总共20ml进行均质化。将上清液平衡至室温并通过ELISA(R&D系统，Cat.RTA00，批次281687，exp.07SEP11)测定TNFα。第1组的样品未经稀释进行测定。将第2-7组的样品1:4稀释。对于组织病理学，用盐水轻轻洗涤小肠以去除粪便并吸干以去除过量的流体。对各小肠称重，然后处理用于组织病理学检查以定量炎症的程度；即，0％＝0，1-33％＝1，34-66％＝2，67-100％＝3。
结果：体重和多种小肠参数的值和评分示于图21中。第2组对照动物与第1组健康对照的参数和评分的变化表明该模型代表疾病过程。体重(图21A)的结果表明与疾病对照(第2组)相比，GLP2-2G不具有体重的显著增加，而GLP-2-2G-XTEN组表明了显著的增加。小肠长度(图21B)的结果表明GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白处理的显著增加，后者导致与非疾病对照(组1)相等的长度。小肠重量(图21C)的结果表明与疾病对照组2相比，0.5mg/kg GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白两个组的显著增加。基于小肠的总值病理学评分，GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白处理导致溃疡形成的显著减少(图21D)，其中6mg/kg融合蛋白导致显著不同于非疾病对照(第1组)的评分。基于粘连和横贯溃疡形成评分(图21E)，GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白治疗与疾病对照(第2组)相比显示出显著降低，其中2mg/kg和6mg/kg融合蛋白导致并非显著不同于非疾病对照(第1组)的评分。基于小肠炎症的评分(图21F)，GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白处理均未显示出对炎症的显著效应。基于TNFα测定(图21G)，GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN融合蛋白处理与疾病对照组2相比显示出显著降低的细胞因子水平。
结论：研究结果表明在改善吲哚美辛诱导型小肠损伤中，使用相等的nmol/kg给药，GLP2-2G-XTEN提供了与GLP2-2G肽一样好或好于GLP2-2G肽的功效。
研究2：使用在实验的第0天和第1天施用的吲哚美辛，在80只雄性Wistar大鼠(Harlan Sprague Dawley)中诱导肠炎。将大鼠分为8个处理组以根据表20进行治疗。
表20：处理组
从实验的第3天开始按照日程表施用所有处理。每天测量体重。在第2天(第二次吲哚美辛给药后24小时)，将动物预先处死并进行分析。在处理前30分钟，对大鼠静脉注射1ml1％的伊文思蓝染料，以便通过组织病理学分析使溃疡和炎症程度可视化。将大鼠麻醉，取血样以使用抗-XTEN/抗-GLP2ELISA方法确定GLP-2-2G-XTEN的浓度。使大鼠安乐死，然后进行尸体检剖并通过对肠道进行肉眼检查粘连的存在来评分；即，无＝0，轻微＝1，中度＝2，严重＝3。取出小肠并记录各自的长度。在各小肠中，做出纵向切口并对内部进行检查。记录溃疡面积的程度和长度的评分；即，无＝0，少＝1，多重＝2，或连续的＝3。用盐水轻洗掉粪便并吸干以去除过量的流体，并将各小肠称重，然后处理用于组织病理学检查以定量炎症程度；即，0％＝0，1-33％＝1，34-66％＝2，67-100％＝3。
结果：各参数的评分图示于图22中。在载体阴性对照组，由于吲哚美辛处理导致的总病理变化在回肠和空肠中是最严重的，通过对该组的评估具有8.5-9的总疾病评分。其中各GLP-2-2G肽和GLP-2-2G-XTEN处理组、每日两次递送的GLP-2-2G肽、每日一次递送的GLP-2-2G-XTEN和以6mg/kg或2mg/kg的单次剂量的GLP-2-2G-XTEN与吲哚美辛处理的载体对照组相比导致显著改善的评分。在横贯溃疡形成评分中，根据总疾病评分相同处理组达到统计学显著性(图22A，其中星号表示与载体组相比具有统计学显著差异)。在粘连评分分析中，吲哚美辛处理的载体对照组接近最大评分3(图22B)。用GLP-2-2G-XTEN进行每日一次的处理提供了几乎完全防止粘连，并且单次高剂量6mg/kg GLP-2-2G-XTEN组与载体对照相比达到统计学上的显著差异(图中的星号代表统计学显著差异)，每日两次给药GLP-2-2G肽的组也是如此。在小肠长度分析(将无吲哚美辛处理的组归一化为100％)中，用GLP-2-2G-XTEN进行每日一次处理的组和每日两次给药GLP-2-2G肽的组与吲哚美辛处理的载体对照组相比达到统计学上的显著差异。组织病理学评估结果与总病理学发现基本相似。载体对照组由于吲哚美辛处理导致的组织病理学变化在回肠和空肠中是最严重的。载体对照组显示出严重的粘膜萎缩、溃疡形成和渗透(图23A)。每日两次GLP-2-2G肽和每日一次GLP-2-2G-XTEN处理的保护作用在回肠中是最明显的，但在空肠中也可看到。第3组具有一只具有基本上正常组织的大鼠(图23B)，而两只大鼠各自显示出溃疡形成和渗透但无萎缩，两只大鼠具有与载体对照疾病组2具有相似的组织病理学变化。第4组(图23D)表明了两只具有基本正常组织的大鼠的保护作用，一只大鼠显示出无萎缩或溃疡但具有轻微的渗透，一只大鼠不具有萎缩但具有轻微的溃疡和渗透，并且一只大鼠具有与载体对照疾病组2相似的组织病理学变化。第7组表明一只具有基本正常组织的大鼠的保护作用，两只大鼠不具有溃疡形成或渗透但显示出肌肉萎缩，并且两只大鼠具有与载体对照疾病组2相似的组织病理学变化。第8组(图23C)表明保护作用以及一只大鼠无溃疡形成或渗透，一只大鼠具有降低的溃疡形成和渗透，并且三只大鼠具有与载体对照疾病组2相似的组织病理学变化。ELISA结果表明在第二天的第4组和第8组的所有动物以及第7组的三只大鼠中可检测到GLP-2-2G-XTEN融合蛋白。
该结果支持以下结论：在该实验条件下，用GLP2-2G-XTEN融合蛋白进行处理提供了对肠免于吲哚美辛炎症效应的显著保护，其中2mg/kg的日剂量显示出最大效应，并且6mg/kg或2mg/kg的单次剂量显示出一些参数的显著功效。
研究3：进行第三吲哚美辛诱导型炎症研究以验证先前的结果并测试附加剂量方案。使用在实验的第0天和第1天根据表21施用的吲哚美辛在雄性Wistar大鼠(HarlanSprague Dawley)中诱导肠炎。
表21：处理组
从实验的第-3天开始按照日程表施用所有处理。每天测量体重。在第2天(24小时后第二次吲哚美辛给药)，将动物预先处死并进行分析。取出小肠并记录各自的长度。对样品的子集进行定量组织病理学。大鼠小肠样品由近端空肠的3cm切口和分别从幽门收集的15cm和30cm中间空肠的3cm切口组成。将样品在10％中性缓冲福尔马林中固定。将样品修整为对于损伤存在与否无偏倚的多个切片。将这些切片放置在盒中，嵌入石蜡中，在大约4微米厚度切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。由董事会认证兽医病理学家用显微镜对载玻片进行评估，并且对绒毛高度以及渗透/炎症、粘膜萎缩、绒毛/隐窝外观、脓肿/溃疡形成进行评分。使用1-4严重程度分级量表，其中1＝最低，2＝轻度、3＝中度，4＝显著的/严重，反映了病理学检查所见的细胞反映的组合。利用针对成对比较的Tukey/Kramer事后检测的ANOVA模型来对小肠长度进行分析，在p＝0.05具有显著性。利用具有针对p值的Bonferroni校正的Mann Whitney U检验将非参数组织学评分变量与载体对照进行比较，以产生0.05的总α。
结果：如在最初的研究中所见的，GLP2-2G-XTEN处理的患病大鼠与载体处理的患病大鼠相比具有小肠长度的增加(图24A)。这种增加与绒毛高度的显著增加有关(图24B)。高剂量(总剂量125nmol/kg)和低剂量(总剂量75nmol/kg)的GLP2-2G-XTEN处理的组显示出绒毛高度的显著增加；肽处理的大鼠中所见的绒毛高度的增加不显著。也存在粘膜萎缩的显著降低，因为高剂量和低剂量GLP2-2G-XTEN处理的大鼠比载体处理的患病大鼠展示出显著较低的粘膜萎缩(图24C)。虽然在GLP2-2G-XTEN和GLP2-2G肽处理后存在展示出粘膜溃疡和混合细胞渗透的降低的趋势，但是这些结果对于三个处理组中的任何一个都不具有显著性。
结论：组织病理学结果支持以下结论：GLP2-2G-XTEN在改善吲哚美辛诱导型小肠损伤中提供了与GLP2-2G肽一样好或比GLP2-2G肽更好的功效。此外，以75nmol/kg给药一次或以25nmol/kg给药三次GLP2-2G-XTEN等效于以12.5nmol/kg给药十次GLP2-2G肽。
实施例22：用于评估包含GLP-2的GLP2-XTEN的人类临床实验设计
如实施例18-20中所证明的，将XTEN融合至GLP-2-2甘氨酸的C端与对于GLP-2或GLP-2-2G肽的天然形式已知的半衰期相比导致改善的半衰期，认为这将实现给药频率的降低，但当使用此类含有GLP2-XTEN的融合蛋白组合物时仍产生临床疗效。进行将GLP2-XTEN融合蛋白与GLP-2(或GLP-2-2G肽)制剂进行对比的人类临床试验来建立与结合GLP2-XTEN的融合蛋白组合物的现有形式或实验形式相比的功效和优势。此类研究包含三期。首先，在成人患者体内进行I期安全性和药代动力学研究以确定在人体内的最大耐受量和药代动力学以及药效学(例如，正常健康志愿受试者)，以及限定在进一步的研究中将跟踪的潜在毒性和不良反应。进行I期研究，其中通过期望途径施用如本文公开的升高的单次剂量的GLP2-XTEN组合物(例如，通过皮下、肌内或静脉途径)，并且在限定的时间间隔测量生化、PK和临床参数以及不良事件。Ib期研究将接着进行多次给药，也在限定的时间间隔测量生化、PK和临床参数。这将允许最小有效剂量和最大耐受量的确定，并建立剂量和构成活性组分的治疗窗的循环药物的阈值和最大浓度。由该信息，获得了允许GLP2-XTEN组合物的较小施用频率(与未连接XTEN的GLP-2相比)但仍保留药理学响应的剂量和剂量方案。此后，在患有GLP-2相关疾病的患者体内进行II期和III期临床试验，从而验证在该剂量条件下GLP2-XTEN组合物的有效性和安全性。可在患有任何疾病的患者体内进行临床试验，其中期望天然GLP-2或对给定疾病的护理标准提供临床效益。例如，此类适应症包括胃炎、消化障碍、吸收不良综合征、短肠综合征、短肠综合征、盲管综合征、炎性肠病、乳糜泻、热带口炎性腹泻、血丙种球蛋白过少口炎性腹泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠炎、化疗诱发的肠炎、肠易激综合征、小肠损伤、小肠粘膜损伤、由癌症化疗导致的小肠损伤、胃肠损伤、腹泻病、肠功能不全、酸诱发的肠损伤、精氨酸缺乏症、特发性精子减少症、肥胖、分解代谢疾病、发热性中性粒细胞减少症、糖尿病、肥胖、脂肪泻、自身免疫性疾病、食物过敏、低血糖、胃肠屏障紊乱、脓毒症、细菌性腹膜炎、烧伤诱发的肠损伤、胃肠蠕动减少、肠衰竭、化疗相关的菌血症、肠创伤、肠缺血、肠系膜缺血、营养不良、坏死性小肠结肠炎、坏死性胰腺炎、新生儿喂养不耐受、NSAID相关胃肠损伤、营养不足、胃肠道的全肠胃外营养损伤、新生儿营养不足、辐射诱发的肠炎、辐射诱发的肠损伤、粘膜炎、隐窝炎、缺血和中风。在治疗之前、期间或之后试验监测患者的与各自的适应症相关的生理学和临床参数；例如，体重增加、炎症、细胞因子水平、疼痛、肠功能、食欲、发热、创伤愈合、葡萄糖水平；增强或加速饥饿饱腹感；相对于安慰剂或阳性对照组追踪的参数。使用标准统计学方法确定功效结果。在该研究中也接着进行毒性和不良事件研究以证实当以所述方式使用时该化合物是安全的。
实施例23：具有裂解序列的GLP2-XTEN
可通过FXIa释放的C端XTEN
如图7所示，可利用位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，可将释放位点裂解序列并入含有由FXIa蛋白酶(EC 3.4.21.27，Uniprot P03951)识别和裂解的氨基酸序列的GLP2-XTEN。特定地，在该序列的精氨酸之后通过FXIa蛋白酶将氨基酸序列KLTRAET切下。在固有的或接触性激活的凝结途径中，FXI是位于FVIII之前紧邻的促凝剂蛋白酶。通过FXIIa对酶原的蛋白水解切割由FXI产生活性FXIa。严格控制FXIa的产生，并且使其仅在对于适当止血需要凝结时发生。因此，通过KLTRAET裂解序列的并入，从GLP-2去除XTEN结构域，同时激活与GLP2-XTEN接近的固有凝结途径。
可通过弹性蛋白酶-2释放的C端XTEN
如图7所示，可利用包含位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，释放位点包含由弹性蛋白酶-2蛋白酶(EC 3.4.21.37,Uniprot P08246)识别和裂解的氨基酸序列。特定地，在该序列的4位后将序列LGPVSGVP[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]切下。弹性蛋白酶由中性粒细胞组成型表达，并且始终存在于循环中，但特别是在急性炎症期间。因此作为长的活性GLP2-XTEN循环，在炎症响应(例如，肠的炎症)过程中将其一部分裂解，尤其是局部裂解，从而在炎症部位例如其中最需要GLP-2的克罗恩病中产生寿命较短的GLP-2集合体。
可由MMP-12释放的C端XTEN
如图7中所示，包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白可利用位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，释放位点包含由MMP-12蛋白酶(EC 3.4.24.65,Uniprot P39900)识别和裂解的氨基酸序列。尤其是将序列GPAGLGGA[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]在该序列的4位后切断。MMP-12在全血中组成型表达。因此，作为GLP2-XTEN循环，将其一部分裂解，从而产生待用的寿命较短的GLP-2的集合体。在本发明组合物的期望特征中，这产生了不断地释放预防量的GLP-2的循环前药贮剂，在炎症响应过程中例如其中最需要GLP-2的克罗恩病中具有较高释放量。
可由MMP-13释放的C端XTEN
如图7中所示，包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白可利用位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，释放位点包含由MMP-13蛋白酶(EC 3.4.24.-,Uniprot P45452)识别和裂解的氨基酸序列。尤其是将序列GPAGLRGA[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]在4位后切断。MMP-13在全血中组成型表达。因此，作为长寿命GLP2-XTEN循环，将其一部分裂解，从而产生待用的寿命较短的GLP-2的集合体。在本发明组合物的期望特征中，这产生了不断地释放预防量的GLP-2的循环前药贮剂，在炎症响应过程中例如在其中最需要GLP-2的克罗恩病中具有较高释放量。
可由MMP-17释放的C端XTEN
如图7中所示，包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白可利用位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，释放位点包含由MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-,Uniprot Q9ULZ9)识别和裂解的氨基酸序列。尤其是将序列APLGLRLR[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]在该序列的4位后切断。MMP-17在全血中组成型表达。因此，作为GLP2-XTEN循环，将其一部分裂解，从而产生待用的寿命较短的GLP-2的集合体。在本发明组合物的期望特征中，这产生了不断地释放预防量的GLP-2的循环前药贮剂，在炎症响应过程中例如在其中最需要GLP-2的克罗恩病中具有较高释放量。
可由MMP-20释放的C端XTEN
如图7中所示，包含融合至GLP-2的C端的XTEN蛋白的GLP2-XTEN融合蛋白可利用位于GLP-2和XTEN组分之间的XTEN释放位点裂解序列产生。在表34中提供了示例性序列。在这种情况下，释放位点包含由MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-,Uniprot O60882)识别和裂解的氨基酸序列。尤其是将序列PALPLVAQ[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]在4位后切断(由箭头指示)。MMP-20在全血中组成型表达。因此，作为GLP2-XTEN循环，将其一部分裂解，从而产生待用的寿命较短的GLP-2的集合体。在本发明组合物的期望特征中，这产生了不断地释放预防量的GLP-2的循环前药贮剂，在炎症响应过程中例如在其中最需要GLP-2的克罗恩病中具有较高释放量。
对C端XTEN释放率的优化
可产生前述实施例的构建体的变体，其中C端XTEN的释放率可以改变。由于由XTEN释放蛋白酶释放XTEN的速率取决于XTEN释放位点的序列，所以通过改变XTEN释放位点中的氨基酸序列，可以控制XTEN释放的速率。许多蛋白酶的序列特异性是本领域熟知的，并且记载在几个数据库中。在这种情况下，使用基质的组合文库[Harris,JL等(2000)Proc NatlAcad Sci U S A,97:7754]或通过以下对[Schellenberger,V等(1993)Biochemistry,32:4344]中所述的基质混合物的裂解映射蛋白酶的氨基酸特异性。一个备选方案为通过噬菌体展示对最优蛋白酶裂解序列的鉴定[Matthews,D.等(1993)Science,260:1113]。利用变体序列制备构建体，并使用用于检测XTEN的标准试验分析XTEN的释放。
实施例24：大XTEN分子的生物分布
为了证实具有长XTEN融合的构建体可穿透组织，在小鼠中使用荧光成像测试了三种荧光标记的构建体(aHer2-XTEN-864-Alexa 680、aHer2-XTEN-576-Alexa 680和aHer2-XTEN-288-Alexa 680)的生物分布。aHer2有效负载为特异性结合Her2抗原的scFv片段，Her2抗原未在正常组织中发现(并因此不应该影响正常动物体内的生物分布)。该研究还包括作为对照抗体的荧光标记的Herceptin-Alexa 680。给予小鼠每种药剂的单次静脉注射。72小时后，使所有组安乐死，并使用荧光成像对肝脏、肺、心脏、脾和肾脏进行离体成像。数据在表22中示出。
结论：所有构建体显示出对所有测定的组织的显著穿透。XTEN_576和XTEN_288组的较低的总荧光信号归因于在72小时的分布周期中较短的XTEN构建体的清除率的增加。对于包括抗体对照在内的所有组观察到相对于总信号的肺荧光的相似比例，支持了在这些条件下XTEN融合蛋白构建体在组织中是生物相容性的。
表22：器官的荧光信号
实施例25：具有不同有效负载的XTEN融合蛋白的分析型尺寸排阻色谱分析
对包含各种治疗蛋白和增加长度的非结构化重组蛋白的融合蛋白进行尺寸排阻色谱分析。示例性的测定使用TSKGel-G4000SWXL(7.8mm×30cm)柱，其中在20mM磷酸盐(pH6.8)、114mM NaCl中以0.6ml/min的流速分离浓度为1mg/ml的40μg的纯化胰高血糖素融合蛋白。用OD214nm和OD280nm监测色谱曲线。使用BioRad的尺寸排阻校准标准来进行所有分析的柱校准；分子量标准包括甲状腺球蛋白(670kDa)，牛γ-球蛋白(158kDa)，鸡卵清蛋白(44kDa)，马肌红蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。胰高血糖素-Y288、胰高血糖素-Y144、胰高血糖素-Y72、胰高血糖素-Y36的代表性色谱曲线在图25中重叠显示。数据显示每种化合物的表观分子量是和连接的XTEN序列的长度成比例的。然而，数据也显示了每种构建体的表观分子量显著大于对球状蛋白质所预期的表观分子量(如通过与在相同测定中运行的标准蛋白质相比较所显示的)。根据对所评价的所有构建体的SEC分析，表观分子量、表观分子量因子(用表观分子量与计算分子量的比值表示)和流体动力学半径(RH，以nm计)在表23中示出。结果表明，576个氨基酸或更大的不同XTEN的加入赋予融合蛋白以约339kDa至760的表观分子量，并且864个氨基酸或更大的XTEN赋予融合蛋白以大于至少约800kDA的表观分子量。表观分子量与实际分子量成比例增加的结果符合用来自几个不同基序家族(即，AD、AE、AF、AG和AM)的XTEN构建的融合蛋白增加至少4倍，比例高达约17倍。此外，具有576个氨基酸或更多的XTEN融合配偶体加入具有各种有效负载的融合蛋白(在与Y288融合的胰高血糖素的情况下为288个残基)，导致7nm或者更大的流体动力学半径；远远超出了大约3-5nm的肾小球孔径。因此，相对于相应的未融合生物有效负载蛋白质，预期包含生长激素和XTEN的融合蛋白具有降低的肾清除率，有助于增加终末半衰期和提高治疗或生物效应。
表23：对多种多肽的SEC分析
实施例26:与GFP融合的延伸多肽在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中测试GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576和XTEN_AD836-GFP的药代动力学以确定非结构化多肽的组成和长度对PK参数的影响。在注射后的各个时间分析血样，并且使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和用于检测的相同多克隆抗体的生物素化制品，通过ELISA测量血浆中的GFP浓度。结果总结于图26中。结果显示半衰期随XTEN序列的增长而出乎意料地增加。例如，测定GFP-XTEN_L288(在XTEN中具有288个氨基酸残基)的半衰期为10小时。非结构化的多肽融合配偶体的长度加倍至576个氨基酸使得多种融合蛋白构建体(即，GFP-XTEN_L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y576)的半衰期增加至20-22h。非结构化的多肽融合配偶体长度进一步增加至836个残基导致XTEN_AD836-GFP的半衰期为72-75h。因此，聚合物长度从288个残基增加288个残基到576个残基使得体内半衰期增加约10h。然而，多肽长度从576个残基增加260个残基到836个残基使得半衰期增加多于50h。这些结果显示非结构化的多肽长度存在令人惊奇的阈值，这导致体内半衰期超比例增加。因此，与较短长度的多肽相比，包含延伸的非结构化多肽的融合蛋白预期具有增强的药代动力学的性质。
实施例27：XTEN的血清稳定性
使含有与GFP的N端融合的XTEN_AE864的融合蛋白在食蟹猴血浆和大鼠肾脏裂解物中在37℃下孵育7天。在时间0、第1天和第7天取样并通过SDS PAGE分析，随后用Western分析检测并用针对GFP的抗体检测，如图27所示。XTEN_AE864的序列在血浆中经7天显示可忽略的降解迹象。然而，XTEN_AE864在大鼠肾脏裂解物中经3天迅速降解。在血浆样品中检测融合蛋白的体内稳定性，其中如上所述对GFP_AE864进行免疫沉淀并通过SDS PAGE进行分析。注射后长达7天所取的样品显示出非常少的降解迹象。结果证明了GLP2-XTEN对血清蛋白酶引起的降解的抗性；这是GLP2-XTEN融合蛋白药代动力学性质增强的一个因素。
实施例28：通过连接至XTEN而增加肽有效负载的溶解度和稳定性
为了评估XTEN增强溶解度和稳定性的物理化学性质的能力，制备和评估胰高血糖素加较短长度XTEN的融合蛋白。在pH为中性的Tris缓冲盐水中制备测试物质，并通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法表征Gcg-XTEN溶液以确定蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。数据列于表24中。为了比较的目的，测量了在相同的缓冲液中60μM(0.2mg/mL)的未修饰胰高血糖素的溶解度极限，并且结果证明对于添加的所有长度的XTEN，实现了溶解度的明显增加。重要的是，在大多数情况下，制备胰高血糖素-XTEN融合蛋白来达到目标浓度，但没有进行评估以确定给定构建体的最大溶解度极限。然而，在胰高血糖素连接到AF-144XTEN的情况下，测定了溶解度极限，其中结果实现了与未连接至XTEN的胰高血糖素相比，溶解度增加60倍。另外，评估了胰高血糖素-AF144GLP2-XTEN的稳定性，发现液体制剂在冷冻条件下稳定至少六个月，而在37℃下稳定大约一个月(数据未显示)。
该数据支持以下结论：较短长度的XTEN多肽连接到生物活性蛋白例如胰高血糖素，能够通过得到的融合蛋白而显著地增强该蛋白质的溶解度，也赋予了较高蛋白质浓度下的稳定性。
表24：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
测试物质 溶解度
胰高血糖素 60μM
胰高血糖素-Y36 >370μM
胰高血糖素-Y72 >293μM
胰高血糖素-AF108 >145μM
胰高血糖素-AF120 >160μM
胰高血糖素-Y144 >497μM
胰高血糖素-AE144 >467μM
胰高血糖素-AF144 >3600μM
胰高血糖素-Y288 >163μM
实施例29：通过预测算法对序列二级结构的分析
通过某些计算机程序或算法，例如熟知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.等(1974)Biochemistry，13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson或“GOR”方法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996)，GOR method for predicting protein secondarystructure from amino acid sequence.Methods Enzymol.Methods Enzymol 266:540-553)可以评估氨基酸序列的二级结构。对于给定的序列，此算法可以预测是存在一些二级结构还是根本不存在二级结构，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列残基的总数和/或百分比，或表示为被预测导致无规卷曲形成的序列的残基的百分比。
已经使用两种算法工具Chou-Fasman和GOR方法评估了来自XTEN“家族”的几种代表性的序列以评估这些序列中的二级结构水平。Chou-Fasman工具由William R.Pearson和弗吉尼亚大学在“Biosupport”互联网网站上提供，URL定位于万维网上的.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1，如2009年6月19日所存在的。GOR工具由Pole Informatique Lyonnai在网络蛋白序列分析互联网站提供，URL定位于万维网上的.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl，如2008年6月19日所存在的。
在分析的第一步，用这两种算法分析单个XTEN序列。AE864组合物是由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的四种12个氨基酸序列基序的多个拷贝构建的具有864个氨基酸残基的XTEN。该序列基序的特征在于以下事实：基序中和整个序列中存在有限的重复性，因为任何两个连续氨基酸的序列在任意一个12个氨基酸基序中重复不超过2次，而且全长的XTEN中没有3个连续氨基酸是相同的。通过Chou-Fasman和GOR算法(后者需要17个氨基酸的最小长度)分析AF 864序列从N端开始逐渐增长的部分。通过将FASTA格式序列输入预测工具并运行分析来分析序列。分析的结果呈现于表25中。
结果显示，经Chou-Fasman计算，AE和AG家族的短XTEN(多达至少288个氨基酸残基)不具有α-螺旋或β-折叠，但通过GOR算法预测的无规卷曲的百分比的量从78-99％不等。随着504个残基的XTEN长度增加至大于1300，通过Chou-Fasman算法分析的XTEN具有0至约2％的α-螺旋或β-折叠的预测百分比，同时无规卷曲的计算百分比增加至94-99％。那些具有α-螺旋或β-折叠的XTEN是那些具有一处或多处三个连续丝氨酸残基的序列，这导致预测的β-折叠形成。然而，甚至这些序列仍存在接近99％的无规卷曲形成。
本文提供的数据表明：1)由具有连续氨基酸有限重复性的G、S、T、E、P和A的多个序列基序构建的XTEN经预测存在极少量的α-螺旋和β-折叠；2)增加XTEN的长度不明显增加α-螺旋或β-折叠形成的概率；和3)通过增加由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的非重复12-mer来逐渐增加XTEN序列的长度，导致无规卷曲形成百分比的增加。结果进一步表明，具有有限重复性(包括在任意一个基序中具有不超过2个相同的连续氨基酸的那些)的本文限定的XTEN序列(包括例如，由G、S、T、E、P和A的序列基序产生的XTEN)预期具有非常有限的二级结构。表3的序列基序的任意顺序或组合可用来构建XTEN多肽，这导致XTEN序列基本没有二级结构，虽然三个连续的丝氨酸并非优选的。然而，三个连续系列的不利性质可通过增加XTEN的长度而得到改善。预期这些序列具有在本文公开的本发明的GLP2-XTEN实施方案中所述的特征。
表25：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算
*H:α-螺旋E:β-折叠
实施例30：多肽序列的重复性分析
在本实施例中，评估了氨基酸序列中不同多肽(包括几种XTEN序列)的重复性。可通过定量较短序列在整个多肽中出现的次数来评估多肽氨基酸序列的重复性。例如，200个氨基酸残基长度的多肽有总共165个重叠的36-氨基酸“区组”(或“36-mers”)和198个3-mer“子序列”，但是独特的3-mer子序列的数目将取决于在此序列内重复的量。对于该分析，通过确定经应用以下方程而获得的子序列评分来评估不同的多肽序列的重复性：
其中：m＝(多肽的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝每个独特的子序列在序列i中出现的累计数
在本实施例的分析中，在利用图1所示算法的计算机程序中使用上述方程确定表26的多肽的子序列评分，其中将子序列长度设定为3个氨基酸。得到的子序列评分是多肽内的重复程度的反映。
示于表26中的结果表明，由2或3种氨基酸类型组成的非结构化多肽具有高子序列评分，而具有低水平内部重复性的由6种氨基酸G、S、T、E、P和A的12氨基酸基序组成的多肽具有小于10的子序列评分，并且在一些情况下小于5。例如，L288序列具有两种氨基酸类型，并具有短的高度重复序列，致使子序列评分为50.0。多肽J288具有3种氨基酸类型，但也有短的重复序列，致使子序列评分为33.3。Y576也有3种氨基酸类型，但不是由内部重复序列组成，反映在前200个氨基酸的子序列评分为15.7。W576由4种类型的氨基酸组成，但具有较高的内部重复水平，例如，“GGSG”，致使子序列评分为23.4。AD576由四种类型的12个氨基酸基序组成，每个基序由4种类型的氨基酸组成。由于个体基序的低内部重复水平，前200个氨基酸的总体子序列评分是13.6。相反，由4个基序组成的XTEN含有6种类型的氨基酸，每个基序都具有低水平的内部重复性，因此具有较低的子序列评分；即，AE864(6.1)、AF864(7.5)和AM875(4.5)，而由包含五种类型的氨基酸的四个基序组成的XTEN居于中间，即AE864，评分为7.2。
结论：结果表明每个由非重复的4至6种氨基酸类型组成的12个氨基酸子序列基序组合成较长的XTEN多肽，得到基本上非重复的整体序列，如由小于10(在许多情况下小于5)的整体平均子序列评分所指示的。即使在此序列中每个子序列基序都可能被多次使用，情况也一样。相反，由较少数目的氨基酸类型构建的聚合物导致较高的平均子序列评分，其中由两种氨基酸类型组成的多肽比由三种氨基酸类型组成的多肽具有更高的评分。
表26：多肽序列的平均子序列评分计算
实施例31：TEPITOPE评分的计算
9mer肽序列的TEPITOPE评分可以通过如Sturniolo[Sturniolo,T.等(1999)NatBiotechnol,17:555]所描述的增加口袋潜能来计算。在本实施例中，为个体HLA等位基因计算单独的TEPITOPE评分。作为实例，表27显示了在高加索人群中高频率出现的HLA*0101B的口袋潜能。为了计算具有序列P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9的肽的TEPITOPE评分，增加了表27中相应的个体口袋潜能。具有序列FDKLPRTSG的9mer肽的HLA*0101B评分是0、-1.3、0、0.9、0、-1.8、0.09、0、0的总和。
为了评估长肽的TEPITOPE评分，可以对序列的所有9mer子序列重复该过程。可对由其他HLA等位基因编码的蛋白质重复此过程。表28-31给出了在高加索人群中高频率出现的HLA等位基因的蛋白质产物的口袋潜能。
通过该方法计算的TEPITOPE评分为大约-10至+10。然而，在P1位置缺乏疏水性氨基酸的9mer肽(FKLMVWY)具有-1009到-989的计算的TEPITOPE评分。此数值在生物学上是无意义的，并且反映如下事实：疏水性氨基酸作为HLA结合的锚定残基，而且认为在P1缺乏疏水性残基的肽不是HLA的结合剂。因为大多数XTEN序列缺乏疏水性残基，9mer子序列的所有组合都将具有-1009至-989的TEPITOPE。此方法证实XTEN多肽可能具有很少或没有预测的T细胞表位。
表27：HLA*0101B等位基因的口袋潜能
表28：HLA*0301B等位基因的口袋潜能
表29：HLA*0401B等位基因的口袋潜能
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 1.4 - -1.1 -0.3 - -1.7
E -999 0.1 -1.2 1.5 - -2.4 0.2 - -1.7
F 0 0.8 0.8 -0.9 - -1.1 -1 - -1
G -999 0.5 0.2 -1.6 - -1.5 -1.3 - -1
H -999 0.8 0.2 1.1 - -1.4 0 - 0.08
I -1 1.1 1.5 0.8 - -0.1 0.08 - -0.3
K -999 1.1 0 -1.7 - -2.4 -0.3 - -0.3
L -1 1 1 0.8 - -1.1 0.7 - -1
M -1 1.1 1.4 0.9 - -1.1 0.8 - -0.4
N -999 0.8 0.5 0.9 - 1.3 0.6 - -1.4
P -999 -0.5 0.3 -1.6 - 0 -0.7 - -1.3
Q -999 1.2 0 0.8 - -1.5 0 - 0.5
R -999 2.2 0.7 -1.9 - -2.4 -1.2 - -1
S -999 -0.3 0.2 0.8 - 1 -0.2 - 0.7
T -999 0 0 0.7 - 1.9 -0.1 - -1.2
V -1 2.1 0.5 -0.9 - 0.9 0.08 - -0.7
W 0 -0.1 0 -1.2 - -1 -1.4 - -1
Y 0 0.9 0.8 -1.6 - -1.5 -1.2 - -1
表30：HLA*0701B等位基因的口袋潜能
表31：HLA*1501B等位基因的口袋潜能
表32：示例性生物活性、示例性测定和适应症
表33：包含GLP-2和末端XTEN的示例性GLP2-XTEN
*序列名称反映了GLP-2和XTEN的N端至C端构型(按照家族名称和长度)
表34：包含GLP-2、裂解序列和XTEN序列的示例性GLP2-XTEN
*序列名称反映了GLP-2、XTEN(按照家族名称和长度)和由对该序列有活性的蛋白酶名称表示的裂解序列的N端至C端构型。

Claims (16)

1.一种重组融合蛋白，包含在N端的序列为SEQ ID NO:1的胰高血糖素样蛋白-2-2G(GLP-2-2G)和在C端的延伸的重组多肽XTEN-AE864，至少一个甘氨酸残基位于所述GLP-2-2G和XTEN-AE864之间，其中所述XTEN-AE864的序列与SEQ ID NO:96所示序列显示100％序列同一性，其中所述融合蛋白展现出：(i)至少为4的表观分子量因子；(ii)当使用用于钙通量的体外G蛋白偶联受体GLP2实验进行分析时，效力为未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G的2％；以及(iii)当采用与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G相比少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍的以nmol/kg计的量向受试者施用时，与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G可比的肠营养效应。
2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述肠内营养效应与未与XTEN-AE864相连接的相应GLP-2-2G当采用可比剂量向受试者施用相应GLP-2-2G时相比，是其肠营养效应的100％以上。
3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。
4.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述施用是皮下、肌肉内或静脉内施用。
5.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中在施用1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的所述融合蛋白后确定所述肠营养效应。
6.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述肠营养效应选自肠生长、绒毛上皮增生增加、隐窝细胞增殖增加、隐窝和绒毛轴高度增加、肠吻合术后的愈合增加、小肠重量增加、小肠长度增加、小肠上皮细胞凋亡减少和肠功能增强。
7.如权利要求6所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠重量增加至少10％。
8.如权利要求6所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠长度增加至少5％。
9.如权利要求1-8中的任一项所述的重组融合蛋白，其中当向受试者施用时，所述融合蛋白展现出为至少30小时的终末半衰期。
10.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述受试者是人，并且在患有克罗恩病的受试者中施用有效量的所述融合蛋白产生与使用可比剂量向可比受试者施用未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G相比更大的治疗效应。
11.如权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠重量增加，其与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G相比大至少10％。
12.如权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其中所述施用导致小肠长度增加，其与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G相比大至少5％。
13.一种分离的核酸，其包含：
(a)SEQ ID NO.681的核酸序列，或其互补体；或
(b)编码权利要求1至12中的任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列，或其互补体。
14.一种表达载体或分离的宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸。
15.一种宿主细胞，其包含如权利要求14所述的表达载体。
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中的任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
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