KR20230007557A - 키메라 폴리펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20230007557A
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제드 제이.더블유. 빌치우스
스튜어트 에이. 지페르스
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카이트 파마 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신규 펩티드 (예를 들어, 링커) 및 링커를 포함하는 폴리펩티드 조성물 (예를 들어, 융합 단백질) 및 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 펩티드 (예를 들어, 링커)는 태그로서 유용하고, 융합 단백질 (예를 들어, 항원 결합 분자, scFv)을 조작하는데 유용하다. 본원에 기재된 폴리펩티드 링커는 연결된 펩티드의 가요성을 용이하게 하여 적절한 폴딩, 입체형태 및 면역원성 감소를 가능하게 한다.

Description

키메라 폴리펩티드 및 그의 용도 {CHIMERIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/562,223을 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 9월 20일에 생성된 상기 ASCII 카피는 KPI-005WO_ST25.txt로 명명되고, 9,531 바이트 크기이다.
기술 분야
본 개시내용은 신규 펩티드 및 이러한 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물 (예를 들어, 링커, 키메라 폴리펩티드, 항원 결합 분자), 및 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.
항체를 포함한 항원 결합 분자는 면역요법 및 고체 상-기반 용도 예컨대 바이오센서, 친화성 크로마토그래피, 및 면역검정에 사용된다. 이들 항체 및 항원 결합 분자는 그의 표적에 특이적으로 결합하는 그의 능력에 의해 그의 유용성을 획득한다.
융합 단백질은 생명공학적 및 생물요법적 용도에서 사용될 때 종종 펩티드-기반 링커 서열을 필요로 할 수 있으며, 이는 소정 범위의 과학적으로 관련된 용도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 링커는 보다 큰 분자에 목적하는 구조적 및/또는 기능적 특성을 부여하기 위해 스페이서 모이어티로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 보다 큰 분자에 구조적 또는 기능적 특성은 거의 또는 전혀 부여할 수 없지만, 보다 큰 분자를 특유하게 확인시켜주는 구별 특색 (예를 들어, "마커" 또는 "바이오마커" 또는 "태그")으로서 간단하게 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 펩티드 서열을 포함하는 보다 큰 분자에 대해 지시된 항체에 대한 결합 부위로서 작용할 수 있는 인식가능한 특색을 부여하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 특히 융합 단백질의 적절한 발현, 폴딩, 확인 및 활성을 허용하는 신규 펩티드 서열을 제공한다. 본원에 기재된 신규 펩티드는 융합 단백질 (예를 들어, scFv) 내의 도메인을 연결하여 개별 펩티드 도메인의 가요성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. ScFv는 대부분의 CAR 구축물의 결합 도메인을 포함한다. scFv는 IgG 가변 경쇄 및 중쇄 및 이들 2개의 도메인을 연결하는 가요성 펩티드 (예를 들어, 링커)를 포함한다. 링커는 도메인을 단일 단백질 구축물 내로 연결하기에 충분히 길어야 한다. 추가로, 링커 또는 태그 구축물은 잠재적 면역원성 원인이 아닌 것이 바람직하다.
통상적으로 사용되는 링커는 측쇄의 고유 가요성 및 단순성으로 인해 글리신-글리신-글리신-글리신-세린 (G4S) (서열식별번호(SEQ ID NO): 32)의 반복부를 포함하며, 이는 치료 용도에서 덜 면역원성일 수 있다. 18-잔기 휘트로우(Whitlow) 링커 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1)는 문헌 [Whitlow et al. in 1993]에서 최초로 기재되었다. 본원에 기재된 펩티드는 또한 펩티드 태그로서 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 본원에 기재된 펩티드 (예를 들어, 링커)에 융합된 폴리펩티드를 포함한다.
컨센서스 서열 BPXXXZ를 포함하는 본원에 기재된 신규 키메라 폴리펩티드는 치료적 개입에 유용한 융합 단백질 내로의 혼입에 적합한 바람직한 속성 (예를 들어, 가요성 및 감소된 면역원성)을 조합한다.
한 측면에서, 본 발명은 6-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 BPXXXZ를 포함하는 펩티드를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 펩티드를 제공하며, 여기서 컨센서스 서열은 KPGSGE (서열식별번호: 4)이다. 또 다른 실시양태에서, 컨센서스 서열은 GKPGSGE (서열식별번호: 5) 또는 GKPGSGG (서열식별번호: 6)이다.
한 측면에서, 본 발명은 6-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 BPXXXZ를 포함하는 펩티드를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, 여기서 펩티드는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1), GSGKPGSGEG (서열식별번호: 13), GKPGSGEG (서열식별번호: 14), 또는 SGKPGSGE (서열식별번호: 15)가 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 펩티드를 제공하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 펩티드를 제공하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이고, 여기서 펩티드는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1), GSGKPGSGEG (서열식별번호: 13), GKPGSGEG (서열식별번호: 14), 또는 SGKPGSGE (서열식별번호: 15)가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 펩티드를 제공하며, 각각의 X는 독립적으로 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 펩티드를 제공하며, X는 독립적으로 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 리신 (K)이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 펩티드를 제공하며, 각각의 X는 독립적으로 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G)이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, Z는 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)으로부터 선택된 음으로 하전된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, Z는 글루탐산 (E)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 펩티드를 제공하며, 여기서 컨센서스 서열은 GKPGSGE (서열식별번호: 5) 또는 GKPGSGG (서열식별번호: 6)이다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 서열은 GKPGSGE (서열식별번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 컨센서스 서열 GSGKPGSGEGG (서열식별번호: 31)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 컨센서스 서열의 1개 이상의 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반복부는 인접해 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 반복부는 1-4개의 아미노산만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 xxxGKPGSGExxxGKPGSGExxx (서열식별번호: 3)이며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1), GSGKPGSGEG (서열식별번호: 13), GKPGSGEG (서열식별번호: 14) 또는 SGKPGSGE (서열식별번호: 15)가 아니다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1)가 아니다. 특정 실시양태에서, 링커는 GSGKPGSGEG (서열식별번호: 13)가 아니다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 GKPGSGEG (서열식별번호: 14)가 아니다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 SGKPGSGE (서열식별번호: 15)가 아니다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 6-20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 10-20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 14-19개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 15-17개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 15-16개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 16개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20)의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19), 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19), 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19), 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나에서 발견되는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 6개의 동일한 아미노산을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 아미노산 서열은 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19), 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나에서 발견되는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 7, 적어도 8 또는 적어도 9개의 동일한 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19), 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20)의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 제1 폴리펩티드; 제2 폴리펩티드; 및 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 항원 결합 분자이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인이고, 제2 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 링커, 태그)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 링커 또는 융합 단백질)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 링커 또는 융합 단백질)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 링커 또는 융합 단백질)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 측면 또는 실시양태와 조합될 수 있다. 본 발명을 그의 상세한 설명과 함께 기재하였지만, 상기 상세한 설명은 예시를 위해 의도되고 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정된다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
본원에 언급된 특허 및 과학 문헌은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 비공개된 미국 특허 출원은 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 해외 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참고문헌, 사전, 문헌, 원고, 및 과학 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 도면, 및 실시예를 포함한 하기 상세한 설명, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
상기 및 추가의 특색은 하기 상세한 설명을 첨부 도면과 함께 참조할 때 보다 분명하게 인지될 것이다. 그러나 도면은 단지 예시를 위한 것이고, 제한을 위한 것이 아니다.
도 1은 예시적인 펩티드 (예를 들어, 링커) 서열의 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도 2는 각각 서열식별번호: 1, 21-25, 1 및 26-30을 포함하는 펩티드의 에피토프 맵핑 ELISA 실험 결과의 막대 그래프를 보여준다.
도 3은 각각 서열식별번호: 32, 9-11 및 17을 포함하는 폴리펩티드 링커의 항체 결합 프로파일의 결과의 막대 그래프를 보여준다.
도 4는 펩티드 KL2 (서열식별번호: 10), KL3 (서열식별번호: 11), KL4 (서열식별번호: 7), KL5 (서열식별번호: 12), KL6 (서열식별번호: 8), 및 G4S2 (서열식별번호: 18)를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제시하는 세포를 사용하여 수행된 유동 세포측정법 실험의 결과를 보여주는 일련의 플롯이다.
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해되도록, 먼저 특정 용어를 하기에 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "또는"과 "및" 둘 다를 포함하고 포괄하는 것으로 이해된다.
용어 "및/또는"이 본원에서 사용되는 경우 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로 구체적으로 개시하는 것으로서 받아들여져야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A (단독), 및 B (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에 사용된 용어 "예를 들어" 및 "즉"은 단지 예로서 사용되고, 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 명세서에서 명시적으로 열거된 항목들 만을 지칭하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
용어 "또는 그 초과", "적어도", "보다 더" 등, 예를 들어, "적어도 하나"는 언급된 값보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 초과를 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. 또한 임의의 더 큰 수 또는 그 사이의 분율도 포함된다.
반대로, 용어 "이하"는 언급된 값보다 적은 각각의 값을 포함한다. 예를 들어, "100개 이하의 뉴클레오티드"는 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 및 0개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 임의의 더 적은 수 또는 그 사이의 분율도 포함된다.
용어 "복수의", "적어도 2", "2 이상", "적어도 두번째" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 초과를 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. 또한 임의의 더 큰 수 또는 그 사이의 분율도 포함된다.
명세서 전체에 걸쳐 단어 "포함하는" 또는 변형 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 입증되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위 (즉, ±10%)를 의미할 수 있다. 따라서, "약"은 언급된 값보다 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 또는 0.001% 초과 또는 미만 내인 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 약 5 mg은 4.5 mg 및 5.5 mg 사이의 임의의 양을 포함할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 상기 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 개시내용에서 제공되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그러한 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분율 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 단위, 접두어, 및 기호는 시스템 인터내셔날 드 유니테스(Systeme International de Unites) (SI) 허용 형태를 사용하여 나타내어진다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press; "The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press; 및 "The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press]은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반 사전을 제공한다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 작용제를 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 제제에 대한 예시적인 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피하, 복막내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 비경구 경로를 통해, 예를 들어, 경구로 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여를 포함한다. 투여는 또한, 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 사용된 항원 결합 분자, 항체, 또는 그의 항원 결합 분자는, 항원 및 제1 결합 분자, 항체, 또는 그의 항원 결합 분자 사이의 상호작용이 참조 결합 분자, 참조 항체, 또는 그의 항원 결합 분자가 항원과 상호작용하는 능력을 차단, 제한, 억제, 또는 달리 감소시키는 경우에, 참조 항체 또는 그의 항원 결합 분자와 "교차-경쟁"한다. 교차 경쟁은 완전할 수 있고, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 완전히 차단하거나, 또는 이는 부분적일 수 있고, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어: 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA); 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA); 샌드위치 경쟁 검정 (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); 1-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15), 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552), 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)를 사용하여 하나의 항원 결합 분자가 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다.
"항원"은 면역 반응을 촉발하거나 또는 항체 또는 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 항원은 내인성으로 발현될 수 있고, 즉 게놈 DNA에 의해 발현될 수 있거나, 또는 재조합적으로 발현될 수 있다. 항원은 특정 조직, 예컨대 암 세포에 특이적일 수 있거나, 또는 광범위하게 발현될 수 있다. 또한, 보다 큰 분자의 단편이 항원으로서 작용할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다.
용어 "동종"은 한 개체로부터 유래되고 이어서 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 임의의 물질, 예를 들어, 동종 T 세포 이식을 지칭한다.
용어 "형질도입" 및 "형질도입된"은 외래 DNA를 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다 (문헌 [Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)] 참조). 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 그의 임의의 조합이다.
"암"은 신체 내에서의 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 조절되지 않는 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하는 악성 종양의 형성을 야기하고, 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 림프종, 백혈병, 골수종, 및 다른 백혈구 악성종양을 포함한 면역계의 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 다발성 골수종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (NHL), 원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBC), 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 형질전환된 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종 (SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) (비 T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것을 포함한 환경적으로 유발된 암, 다른 B 세포 악성종양, 및 상기 암의 조합으로부터 유래된 종양의 종양 크기를 감소시키는데 사용될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 암은 다발성 골수종이다. 특정한 암은 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 반응성일 수 있거나, 또는 암은 불응성일 수 있다. 불응성 암은 수술적 개입으로 수정될 수 없는 암을 지칭하고, 이러한 암은 처음부터 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 비반응성이거나 또는 암이 시간의 경과에 따라 비반응성이게 된다.
본원에 사용된 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 수의 감소, 전체 또는 무진행 생존의 증가, 기대 수명의 증가, 또는 종양과 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전으로서 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 방지, 예를 들어, 백신을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "시토카인"은 특정 항원과의 접촉에 반응하여 한 세포가 방출하는 비-항체 단백질을 지칭하고, 여기서 시토카인은 제2 세포와 상호작용하여 제2 세포에서의 반응을 매개한다. 시토카인은 세포에 의해 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 대상체에게 투여될 수 있다. 시토카인은 대식세포, B 세포, T 세포, 및 비만 세포를 포함하는 면역 세포에 의해 방출되어 면역 반응을 전파할 수 있다. 시토카인은 수용자 세포에서 다양한 반응을 유도할 수 있다. 시토카인은 항상성 시토카인, 케모카인, 염증유발성 시토카인, 이펙터, 및 급성기 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨 (IL) 7 및 IL-15를 포함하는 항상성 시토카인은 면역 세포 생존 및 증식을 촉진하고, 염증유발성 시토카인은 염증성 반응을 촉진할 수 있다. 항상성 시토카인의 예는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15, 및 인터페론 (IFN) 감마를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 염증유발성 시토카인의 예는 IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, 종양 괴사 인자 (TNF)-알파, TNF-베타, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 2, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 가용성 세포간 부착 분자 1 (sICAM-1), 가용성 혈관 부착 분자 1 (sVCAM-1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF-C, VEGF-D, 및 태반 성장 인자 (PLGF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이펙터의 예는 그랜자임 A, 그랜자임 B, 가용성 Fas 리간드 (sFasL), 및 퍼포린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 급성기-단백질의 예는 C-반응성 단백질 (CRP) 및 혈청 아밀로이드 A (SAA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"케모카인"은 세포 화학주성 또는 지향성 이동을 매개하는 시토카인 유형이다. 케모카인의 예는 IL-8, IL-16, 에오탁신, 에오탁신-3, 대식세포-유래 케모카인 (MDC 또는 CCL22), 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1 또는 CCL2), MCP-4, 대식세포 염증 단백질 1α (MIP-1α, MIP-1a), MIP-1β (MIP-1b), 감마-유도된 단백질 10 (IP-10), 및 흉선 및 활성화 조절 케모카인 (TARC 또는 CCL17)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료제, 예를 들어, 조작된 CAR T 세포의 "치료 유효량", "유효 용량", "유효량", 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용될 때 대상체를 질환 발병으로부터 보호하거나, 또는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "림프구"는 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포를 포함한다. NK 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 대표하는 세포독성 (세포 독성) 림프구 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 거부한다. 이는 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 과정을 통해 작용한다. 이들은 세포를 사멸시키기 위해 활성화를 필요로 하지 않기 때문에 "자연 킬러"로 명명된다. T-세포는 세포-매개-면역 (어떠한 항체도 수반되지 않음)에서 주요 역할을 한다. 그의 T-세포 수용체 (TCR)가 이들을 다른 림프구 유형으로부터 구별한다. 면역계의 특수 기관인 흉선은 T 세포의 성숙을 주로 담당한다. 6가지 유형의 T-세포, 즉 헬퍼 T-세포 (예를 들어, CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (또한 TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포로도 알려짐), 기억 T-세포 ((i) 줄기 기억 TSCM 세포, 예컨대 나이브 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이지만, 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포 특유의 수많은 기능 속성을 나타냄; (ii) 중심 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, IL-2를 분비하지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 않음, (iii) 그러나, 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만, 이펙터 시토카인 예컨대 IFNγ 및 IL-4를 생산함), 조절 T-세포 (Treg, 억제자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 조절 T 세포), 자연 킬러 T-세포 (NKT) 및 감마 델타 T-세포가 존재한다. 다른 한편으로는, B-세포는 체액성 면역 (항체가 수반됨)에서 주요한 역할을 한다. 이는 항체 및 항원을 제조하고, 항원-제시 세포 (APC)의 역할을 수행하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B-세포로 변한다. 포유동물에서, 미성숙 B-세포는 골수에서 형성된다.
용어 "유전자 조작된", "조작된", 또는 "변형된"은 코딩 또는 비-코딩 영역 또는 그의 부분을 결실시키는 것에 의해 또는 안티센스 기술에 의해 유전자에서 결손을 생성하거나, 또는 코딩 영역 또는 그의 부분을 도입하여 단백질의 발현을 증가시키는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포를 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형되는 세포는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (HSC), 배아 줄기 세포 (ES), 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포), 림프구 (예를 들어, T 세포)이다. 외인성 구축물, 예컨대, 예를 들어, 프리-TCR 알파 단백질, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 세포가 변형될 수 있고, 이는 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있다.
"면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 표적화하고/거나, 이에 결합하고/거나, 이에 대해 손상을 입히고/거나, 이를 파괴시키고/거나, 이를 척추동물의 신체로부터 제거하는, 면역계의 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (Ab, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의한, 질환을 앓고 있거나 또는 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환의 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 대상체의 치료를 지칭한다. 면역요법의 예는 T 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. T 세포 요법은 입양 T 세포 요법, 종양-침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT™), 및 동종 T 세포 이식을 포함할 수 있다. 그러나, 관련 분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 조건화 방법이 임의의 이식된 T 세포 요법의 유효성을 증진시킬 것임을 인식할 것이다. T 세포 요법의 예는 미국 특허 공개 번호 2014/0154228 및 2002/0006409, 미국 특허 번호 5,728,388, 및 국제 공개 번호 WO 2008/081035에 기재되어 있다.
면역요법의 T 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 조혈 줄기 세포 집단; 유도된 만능 줄기 세포 (iPS), 배아 줄기 세포 (ES)로부터 시험관내 분화될 수 있거나, 또는 T 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. T 세포는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 또한, T 세포는 관련 기술분야에서 입수가능한 1종 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 통상의 기술자에게 공지된 다수의 기술, 예컨대 피콜(FICOLL)™ 분리 및/또는 분리반출술을 사용하여 대상체로부터 수집된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. T 세포 요법을 위한 T 세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748에 개시되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"eACT™"로 약칭될 수 있고 또한 입양 세포 전달로도 공지되어 있는 용어 "조작된 자가 세포 요법"은 환자 자신의 T 세포를 수집하고, 후속하여 1종 이상의 특정 종양 세포 또는 악성종양의 세포 표면에서 발현된 1종 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 이를 유전자 변경하는 방법이다. 본원에 사용된 "환자"는 암 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 앓고 있는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "시험관내 세포"는 생체외 배양된 임의의 세포를 지칭한다. 특히, 시험관내 세포는 T 세포를 포함할 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 어떠한 제한도 존재하지 않는다. 본원에 사용된, 본 발명의 펩티드는 링커로서 기능할 수 있다 (예를 들어, 2개의 펩티드 또는 폴리펩티드를 연결함). 본원에 사용된, 본 발명의 펩티드는 바이오마커 또는 태그로서 기능할 수 있다. 용어 펩티드, 태그 또는 링커는 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어는 통상적으로 관련 기술분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 보다 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "자극"은 자극 분자와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되는 1차 반응을 지칭하고, 여기서 결합은 신호 전달 사건을 매개한다. "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체이다. "자극 리간드"는 항원 제시 세포 (예를 들어, APC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 T 세포 상의 자극 분자와 특이적으로 결합함으로써, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드이다. 자극 리간드는 항-CD3 항체, 펩티드가 로딩된 MHC 부류 I 분자, 초효능제 항-CD2 항체, 및 초효능제 항-CD28 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "공동자극 신호"는 1차 신호, 예컨대 TCR/CD3 라이게이션과 조합되어, T 세포 반응, 예컨대 비제한적으로, 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향 조절로 이어지는 신호를 지칭한다.
본원에 사용된 "공동자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상의 분자를 포함한다. 공동자극 리간드의 결합은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공동자극 리간드는 자극 분자에 의해, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 신호를 유도한다. 공동자극 리간드는 3/TR6, 4-1BB 리간드, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD30 리간드, CD40, CD7, CD70, CD83, 포진 바이러스 진입 매개자 (HVEM), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), ILT4, 이뮤노글로불린-유사 전사체 (ILT) 3, 유도성 공동자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM), B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프독소 베타 수용체, MHC 부류 I 쇄-관련 단백질 A (MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 단백질 B (MICB), OX40 리간드, PD-L2, 또는 프로그램화된 사멸 (PD) L1을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 공동-자극 리간드는, 제한 없이, T 세포 상에 존재하는 공동-자극 분자, 예컨대 비제한적으로 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), 자연 킬러 세포 수용체 C (NKG2C), OX40, PD-1, 또는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14 (TNFSF14 또는 LIGHT)와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써 T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너이다. 공동자극 분자는 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (알파; 베타; 델타; 엡실론; 감마; 제타), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, CD83 리간드, CD84, CD86, CD8알파, CD8베타, CD9, CD96 (Tactile), CDl-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig 알파 (CD79a), IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGBl, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CDl la/CD18), MHC 부류 I 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG (CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자, SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1, 또는 VLA-6, 또는 그의 단편, 말단절단물, 또는 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "저하시키는" 및 "감소시키는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 원래의 것보다 낮은 임의의 변화를 나타낸다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 상대적인 용어이며, 이전-측정과 이후-측정 사이의 비교를 필요로 한다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 완전한 고갈을 포함한다.
대상체의 "치료" 또는 "치료하는"은 증상, 합병증 또는 상태의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발, 또는 질환과 연관된 생화학적 지표를 역전시키거나, 경감시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 느리게 하거나 또는 방지할 목적으로 대상체에게 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 프로세스 또는 대상체에의 활성제의 투여를 지칭한다. 한 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 부분 완화를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 완전 완화를 포함한다.
퍼센트 동일성을 계산하기 위해, 비교되는 서열은 전형적으로 서열 사이의 최대 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GCG 프로그램 패키지이고, 이는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학교)를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 퍼센트 서열 동일성을 결정할 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬시키는데 사용된다. 서열은 그의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 매칭 (알고리즘에 의한 결정 시 "매칭된 폭")을 위해 정렬된다. 특정 실시양태에서, 표준 비교 행렬 (PAM 250 비교 행렬에 대해 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)이 또한 알고리즘에 의해 사용한다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
상세한 설명
키메라 또는 융합 폴리펩티드를 제조 (예를 들어, 설계, 조작)하기 위한 수단을 제공하는 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 링커) 서열은 융합 단백질의 적절한 발현, 폴딩 및 활성을 허용한다. 본 발명은 특히 신규 폴리펩티드 (예를 들어, 링커) 및 이를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 펩티드 (예를 들어, 링커, 태그) 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 펩티드 (예를 들어, 링커, 태그) 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 펩티드 (예를 들어, 링커, 태그) 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 펩티드 링커, 펩티드 링커에 의해 연결된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물 및 관련 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및 제약 조성물을 포함하는 신규 조성물이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 (예를 들어, 링커, 태그)는 1개 이상의 폴리펩티드에 융합된다. 기재된 링커 서열은 링커에 의해 연결된 폴리펩티드의 발현 및 활성 (예를 들어, 항원 결합)이 내구성있고 최적이도록 2개의 관심 펩티드/폴리펩티드를 작동가능하게 연결한다. 펩티드 링커 또는 태그는 폴리펩티드 내의 C-말단, N-말단, 또는 임의의 위치에서 융합되어 목적하는 기능을 달성할 수 있다.
펩티드 링커
컨센서스 서열 XYPXXXZX를 포함하는 본원에 기재된 신규 키메라 폴리펩티드 링커는 치료적 개입에 유용한 융합 단백질 내로의 혼입에 적합한 바람직한 속성을 조합한다. 한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XYPXXXZX를 포함하는 링커를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이다. 본 발명자들은 컨센서스 서열 내의 아미노산 잔기의 간격 및 전하 둘 다가 링커 서열의 항체 인식에 더하여 링커의 기능성에 기여한다는 것을 발견하였다.
한 측면에서, 본 발명은 6-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 BPXXXZ를 포함하는 링커를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 링커를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 링커를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 리신 (K)이고, Z는 글리신 (G) 또는 음으로 하전된 아미노산이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 컨센서스 서열 XBPXXXZX를 포함하는 링커를 제공하며, 여기서 X는 글리신 (G) 또는 세린 (S)이고, B는 양으로 하전된 아미노산이고, Z는 글리신 (G)이고, P는 프롤린이다.
일부 실시양태에서, Z는 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)으로부터 선택된 음으로 하전된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, Z는 글루탐산 (E)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 제공하며, 여기서 컨센서스 서열은 GKPGSGE (서열식별번호: 5) 또는 GKPGSGG (서열식별번호: 6)이다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 서열은 GKPGSGE (서열식별번호: 5)이다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18)의 아미노산 서열을 포함한다.
링커 펩티드 서열은 1개 이상의 관심 단백질을 연결하기 위한 임의의 적절한 길이일 수 있고, 바람직하게는 그것이 연결하는 펩티드 중 하나 또는 둘 다의 적절한 폴딩 및/또는 기능 및/또는 활성을 허용하기에 충분히 가요성이도록 설계된다. 따라서, 링커 펩티드는 10개 이하, 11개 이하, 12개 이하, 13개 이하, 14개 이하, 15개 이하, 16개 이하, 17개 이하, 18개 이하, 19개 이하, 또는 20개 이하의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 7개 및 20개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 19개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 18개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 17개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 16개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 15개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 14개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 13개 이하의 아미노산, 적어도 7개 및 12개 이하의 아미노산 또는 적어도 7개 및 11개 이하의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 15-17개의 아미노산을 포함하고, 특정한 실시양태에서, 16개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 10-20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 14-19개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 15-17개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 15-16개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 16개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 또는 양으로 하전된 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 또는 음으로 하전된 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커, 융합 단백질, CDR(들) 내의, 또는 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 분자 (또는 그의 단편)의 프레임워크 영역(들) 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
본 개시내용에 포괄되는 보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포괄할 수 있고, 이는 전형적으로 생물계 내에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들은 펩티드모방체 및 다른 역전 또는 역위 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 부류로 나뉘어질 수 있다:
소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu;
염기성 (음으로 하전됨): His, Lys, Arg;
쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 예를 들어 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 영역 내로, 또는 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다. 예시적인 보존적 아미노산 치환이 하기 표 A에 제시된다.
표 A
Figure pat00001
Figure pat00002
일부 실시양태에서, 링커는 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20)의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 6-20개의 아미노산 및 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커를 제공한다.
일부 실시양태에서, 링커 아미노산 서열은 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), 또는 GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나에서 발견되는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 5, 6, 7, 8개 또는 적어도 9개의 동일한 아미노산을 함유한다.
한 측면에서, 본 발명은 8-20개의 아미노산 및 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나에서 발견되는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 6개의 동일한 아미노산을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 링커를 제공한다.
일부 실시양태에서, 링커 아미노산 서열은 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), 또는 GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20) 중 어느 하나에서 발견되는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 7, 적어도 8개 또는 적어도 9개의 동일한 아미노산을 함유한다.
융합 단백질
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 제1 폴리펩티드; 제2 폴리펩티드; 및 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 폴리펩티드 조성물 및 폴리펩티드 조성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 기재되며, 여기서 폴리펩티드 조성물은 본원에 개시된 링커 서열에 의해 연결된 제1 및 제2 펩티드/폴리펩티드를 포함한다. 본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명에 따른 링커가 제1 및 제2 펩티드의 최적의 가요성 및 길이 둘 다를 제공하여 입체 장애를 피하게 하고 정확한 폴딩을 허용한다는 것을 발견하였다.
이러한 방식으로 생성된 폴리펩티드 조성물은 통상적으로 융합 또는 키메라 단백질/폴리펩티드로 지칭되고, 전형적으로 적절한 시스템에서 폴리펩티드 조성물을 코딩하는 핵산 서열의 발현 (예를 들어, 전사, 번역)에 의해 이루어진다. 융합 및/또는 키메라 폴리펩티드를 제조하는 수단은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1992) New York] 참조).
본원에 기재된 폴리펩티드 조성물에서, 2개의 폴리펩티드 (예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드)는 상기 기재된 링커 폴리펩티드 중 임의의 것에 의해 재조합적으로 연결될 수 있고, 링커는 2개의 폴리펩티드 사이에 배치된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20)를 포함하는 링커에 의해 재조합적으로 연결된 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 2개의 폴리펩티드는 2개의 상이한 단백질 또는 동일한 단백질의 전장 단백질, 단백질 단편 또는 부분, 기능적 단백질 단편 또는 부분, 기능적 단백질 도메인 등을 포함한 임의의 아미노산 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 전형적으로, 펩티드 결합에 의해 전적으로 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하고, 이는 자연적으로 (예를 들어, 단리, 본질적 정제 또는 정제) 또는 합성에 의해 (예를 들어, 화학적 합성에 의해) 생산될 수 있다. 비-숙주 DNA 분자의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드를 포함하는 "아미노산 잔기"는 펩티드 결합 및/또는 펩티드 결합과 상이한 결합에 의해 연결된 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 D-배위 또는 L-배위일 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 언급된 폴리펩티드는 재조합 핵산의 발현에 의해 생산된 단백질, 펩티드 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 조성물은 링커 서열에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 "기능적 단편" 또는 "부분"은 성숙 또는 천연 단백질의 목적하는 생물학적 활성 중 하나 이상을 보유하기에 충분한 (예를 들어, 치료될 장애에 대한 치료적 또는 개선적 생물학적 활성을 보유하기에 충분한) 전체 성숙 또는 천연 단백질보다 작은 것을 지칭하도록 의도된다. 따라서, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드는, 예를 들어 변형이 기능적 작용제를 코딩하는 폴리펩티드의 능력을 실질적으로 방해하지 않는 방식으로 아미노산이 삽입, 결실 및/또는 치환된 폴리펩티드 서열로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 링커 또는 폴리펩티드 링커는 2개의 단백질 서열을 연결하도록 (예를 들어, 잇도록, 링크하도록) 설계된 펩티드 서열을 지칭하며, 여기서 링커 펩티드 서열은 전형적으로 자연에서 2개의 단백질 서열 사이에 배치되지 않는다. 본 발명의 문맥에서, 어구 "링크된" 또는 "이어진" 또는 "연결된"은 일반적으로, 자연에서 일반적으로 존재하지 않는 폴리펩티드를 생산하기 위한 2개의 인접한 또는 이웃한 아미노산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 연결은 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄)의 아미노산 서열의 공유 연결을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 연결된 단백질은 서로 인접하거나 이웃하고, 연결될 경우 그의 각각의 작동성 및 기능을 유지한다. 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드를 포함하는 펩티드는 1개 이상의 아미노산을 포함하는 개재된 펩티드 링커에 의해 연결된다. 이러한 링커는 키메라 폴리펩티드의 목적하는 발현, 활성 및/또는 입체형태적 배치를 허용하는 바람직한 가요성을 제공할 수 있다. 전형적인 아미노산 링커는 일반적으로 가요성이도록 또는 2개의 단백질 모이어티 사이에 구조, 예컨대 알파-헬릭스를 개재시키도록 설계된다. 링커는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있거나, 또는 내부적으로 삽입될 수 있다.
링커를 포함하는 폴리펩티드 조성물에서, 링커 펩티드 서열 (예를 들어, 아미노산 서열)의 5' 단부 (예를 들어, 말단)는 하나의 단백질 서열 (제1 펩티드) (예를 들어, 전장 단백질 또는 단백질 도메인, 단편 또는 변이체)의 3' 단부에 인접하고 공유 연결되며, 추가로 링커 아미노산 서열의 3' 단부는 또 다른 단백질 서열 (제2 펩티드)의 5' 말단에 인접하고 공유 연결된다.
항원 결합 분자
일부 측면에서, 융합 단백질은 항원 결합 분자이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인이고, 제2 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 연결하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 링커의 사용은 최적의 가요성 및 길이를 허용하여 입체 장애를 피하게 하고 항원 결합 도메인의 정확한 폴딩을 허용하는 이점을 제공한다. 제1 및 제2 펩티드의 적절한 입체형태는 항원 인식 및 결합에 필수적이다.
본원에 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환가능하게 사용되고, 항체의 부분, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 부분, 전형적으로 항체의 아미노-말단 단부를 의미하며, 중쇄에서는 약 100-130개의 아미노산 및 경쇄에서는 약 90 내지 115개의 아미노산을 포함하고, 항체 사이에서 서열상 광범위하게 상이하고, 특정한 항원에 대한 특정한 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 영역에서 집중되고, 한편 가변 도메인에서 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 주로 항체의 항원과의 상호작용 및 특이성을 담당한다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자의 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 추가 실시양태에서, 가변 영역은 설치류, 인간 또는 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 추가 실시양태에서, 가변 영역은 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 추가 실시양태에서, 가변 영역은 토끼 가변 영역이다. 다른 실시양태에서, 가변 영역은 인간 CDR 및 비-인간 (예를 들어, 토끼, 뮤린, 래트 또는 비-인간 영장류) 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 가변 영역은 비-인간 (예를 들어, 토끼, 뮤린, 래트 또는 비-인간 영장류) CDR 및 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
용어 "VH", "VH 도메인" 및 "VH 쇄"는 상호교환가능하게 사용되고, 항원 결합 분자, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "중쇄"가 항체와 관련하여 사용될 때, 이는 IgG의 하위부류 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 부류를 생성하는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지칭될 수 있다.
용어 "VL", "VL 도메인" 및 "VL 쇄"는 상호교환가능하게 사용되고, 항원 결합 분자, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "경쇄"가 항체와 관련하여 사용될 때, 이는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로 지칭될 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적 실시양태에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
"항원 결합 분자", "항원 결합 부분" 또는 "항체 단편"은 분자가 유래된 항체의 항원 결합 부분 (예를 들어, CDR)을 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체, 및 항원 결합 분자로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 펩티바디 (즉, 펩티드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 분자)는 적합한 항원 결합 분자의 또 다른 예이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 과다증식성 질환에 수반되는 세포 상의 항원 또는 바이러스 또는 박테리아 항원에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 분자는 그의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함하는, 항체 또는 그의 단편이다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 분자는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다.
본원에 사용된 용어 "단일-쇄 항체" 및 "단일 쇄 가변 단편 (scFv)"은 상호교환가능하게 사용되고, VL 및 VH 영역이 링커를 통해 연결되어 연속 단백질 쇄를 형성한 항원 결합 분자를 의미하며, 여기서 링커는 단백질 쇄 자체가 폴딩되어 1가 항원 결합 부위를 형성하도록 하기에 충분히 길다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-26 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83 (1988)] 참조). FMC63 (Nicholson et al., (1997) Mol. Immunol. 34: (16-17) 1157-65)은 scFv의 구체적 예이고, CD19에 특이적이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 scFv이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 컨센서스 서열 BPXXXZ, XBPXXXZX 또는 예시적인 링커 서열 (예를 들어, KPGSGE (서열식별번호: 4), GKPGSGE (서열식별번호: 5), GKPGSGG (서열식별번호: 6), GGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (서열식별번호: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (서열식별번호: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (서열식별번호: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (서열식별번호: 12), STSGSGKPGSGEGST (서열식별번호: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (서열식별번호: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 19) 또는 GGGGSGGGGSGGGGGS (서열식별번호: 20))을 포함하는, scFv를 포함한 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 서열을 포함하는 분자 및 이러한 분자, 항원 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시하는 세포가 또한 제공되며, 본 개시내용의 측면을 형성한다.
본원에 사용된 용어 "결합 친화도"는 분자 (예를 들어, 항원 결합 분자 예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수 (Kd) 및 평형 회합 상수 (Ka)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 수많은 방식으로 측정되고/거나 표현될 수 있다. Kd는 koff/kon 비율로 계산되는 반면에, Ka는 kon/koff 비율로 계산된다. kon은 예를 들어 항원에 대한 항체의 회합률 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어 항원에 대한 항체의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 표준 기술, 예컨대 비아코어(BIAcore)® 또는 키넥사(KinExA) 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자는 단일 쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 본원에 기재된 바와 같은 링커에 의해 연결되어 scFv (예를 들어, 본 개시내용의 항원 결합 분자)를 형성한다. 일부 실시양태에서, VH는 링커의 N 말단에 위치하고, VL은 링커의 C 말단에 위치한다. 다른 실시양태에서, VL은 링커의 N 말단에 위치하고, VH는 링커의 C 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 약 5, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 또는 적어도 약 100개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 약 8개의 아미노산 내지 약 18개의 아미노산 (예를 들어, 16개의 아미노산)을 포함한다.
키메라 항원 수용체
항원 결합 분자는 CAR 또는 TCR의 성분을 형성할 수 있고, CAR 또는 TCR이 관심 표적을 인식하도록 지시하는 역할을 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, CAR 또는 TCR과 관련하여, 항원 결합 분자는 CAR 또는 TCR을 목적하는 표적으로 지시하여 그 표적과 회합하게 하는 CAR 또는 TCR의 임의의 성분을 의미한다. 구체적 실시양태에서, CAR 또는 TCR의 항원 결합 분자 성분은 본원에 기재된 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 동일한 항체 또는 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. CAR 또는 TCR에서 사용되는 항원 결합 분자는 관심 표적에 결합하는 것으로 공지되어 있거나 예상되는 항체로부터 유래될 수 있다.
T 세포는, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR 양성 (CAR+) T 세포는 CAR을 발현하도록 조작된다. CAR은, 예를 들어, 특정한 종양 항원에 대해 특이성을 갖는 세포외 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함할 수 있고, 이는 적어도 1개의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 부분에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 이는 적어도 1개의 활성화 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결되고; 성분은 임의의 순서로 배열될 수 있다. 공동자극 도메인은 예를 들어 CD28 또는 4-1BB로부터 유래될 수 있고, 활성화 도메인은 예를 들어 CD3-제타의 임의의 형태로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 공동자극 도메인을 갖도록 설계된다. CAR scFv는 모든 정상 B 세포, 및 NHL, CLL, 및 비-T 세포 ALL와 같은 B 세포 악성종양을 포함한 B 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 막횡단 단백질인, 예를 들어, CD19를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 공동자극 도메인이 개별 폴리펩티드 쇄로서 발현되도록 조작된다. CAR T 세포 요법 및 구축물의 예는 미국 특허 공개 번호 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, 및 2014/0050708에 기재되어 있고, 이는 임의의 목적상 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용의 항원 결합 분자는 또한 완전 인간 모노클로날 항체일 수 있고, 그로부터 scFv가 생성될 수 있고, 이는 이어서 본원에 제공된 CAR 또는 TCR의 성분을 형성할 수 있다. 완전 인간 모노클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙할 임의의 수의 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 인간 말초 혈액 세포 (예를 들어, B 림프구 함유)의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) 형질전환, 인간 B-세포의 시험관내 면역화, 삽입된 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 세포의 융합, 인간 이뮤노글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 단리, 또는 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 개시내용에 기초한 다른 절차를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
비-인간 동물에서 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 절차가 개발되어 있다. 예를 들어, 1개 이상의 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 다양한 수단에 의해 불활성화된 마우스가 제조되었다. 불활성화된 마우스 유전자를 대체하도록 인간 이뮤노글로불린 유전자가 마우스 내로 도입되었다. 이러한 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 계통 내로 도입된다 (또한 문헌 [Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58] 참조).
또한, 원하는 경우, 본원에 기재된 다양한 도메인 및 영역은 항원 결합 분자 (예를 들어, scFv) 및 활성화 도메인과 별개의 쇄에서 소위 "트랜스" 배위로 발현될 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 활성화 도메인은 하나의 쇄 상에서 발현될 수 있는 한편, 항원 결합 분자 및/또는 세포외 도메인 및/또는 막횡단 도메인 및/또는 공동자극 도메인은 (CAR 또는 TCR의 목적하는 구축에 따라) 별개의 쇄 상에서 발현될 수 있다.
추가적으로, 본 개시내용의 CAR의 성분들의 N에서 C-말단, 또는 세포외에서 세포내 순서는 원하는 대로 변경될 수 있다. 항원 결합 분자 (scFv)는 표적 항원과 회합되기 위해 세포외일 것이고, 세포막에서 가장 먼 scFv의 N 말단 단부에 리더 또는 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 링커를 포함하는, 항체 및 항원 결합 분자, 예컨대 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 서열을 포함하는 분자, 및 이러한 분자를 제시하는 세포에 관한 것이다.
발현 벡터
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 링커 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 링커 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트에 관한 것이다.
관련 기술분야에 공지된 임의의 벡터가 본 개시내용에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터 (AAV), 렌티바이러스 벡터, 또는 그의 임의의 조합이다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 1, 2개, 또는 그 초과의 벡터가 사용될 수 있다.
재조합 세포
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 링커 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 본원에 기재된 바와 같은 링커 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 링커 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 시험관내 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 시험관내 세포에 관한 것이다.
적합한 숙주 세포는 포유동물, 식물, 조류 (예를 들어, 조류 시스템), 곤충, 효모, 및 박테리아를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 세포 배양 및 폴리펩티드의 발현을 허용하는 임의의 포유동물 세포가 본 발명에 따라 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적 예는 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), HeLa 세포; BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NSO/l, ECACC 번호 85110503); 인간 망막아세포 (PER.C6 (크루셀(CruCell), 네덜란드 라이덴)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 섬유육종 세포주 (예를 들어, HT-1080); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포, 또는 현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간세포암 세포주 (Hep G2), 인간 세포주 CAP 및 AGE1.HN, 및 글리코토페(Glycotope)의 패널을 포함한다.
본 발명에 적합한 숙주 세포의 비제한적 예는 효모의 경우 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica); 곤충의 경우 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) 및 만투카 섹타(Manduca sexta); 및 박테리아의 경우 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 페르프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실레(Clostridia difficile); 및 양서류로부터의 크세노푸스 라에비스(Xenopus Laevis)로부터 유래된 세포 및 세포주를 포함한다.
추가적으로, 임의의 수의 이용가능한 하이브리도마 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하이브리도마 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/거나 최적 성장 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현을 위해 상이한 배양 조건을 필요로 할 수 있다는 것을 인지할 것이며, 필요에 따라 조건들을 변형시킬 수 있을 것이다.
실시예
본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 실시양태에 따라 구체적으로 기재되었지만, 하기 실시예는 단지 본 발명의 화합물을 예시하는 역할을 하며, 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 링커 컨센서스 서열을 확인하기 위한 에피토프 맵핑
GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1)의 링커 서열을 포함하는 CAR에 대한 항체 클론 8 및 16의 특이적 결합을, 전장 서열식별번호: 1, 및 N- 또는 C-말단이 말단절단되고 N-말단 상에 비오틴 모이어티를 함유하거나 또는 C-말단 상에 비오틴 모이어티와 함께 리신 잔기를 함유하는 변이체 (서열식별번호: 21-30)의 에피토프 맵핑 ELISA 실험에 사용하였다.
단백질 G로 사전-코팅된 플레이트 (피어스(Pierce))를 사용하여 96-웰 플레이트 포맷으로 항체를 포획하였다. 플레이트를 PBST 완충제 중에서 6x 세척한 후, 표적 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 추가의 6x 세척을 수행하고, 항체를 스트렙타비딘-HRP와 함께 추가로 인큐베이션하였다. PBST에서 최종 6x 세척 시, 신호가 검출되었고, 이를 증진된 화학발광 키트 (ECL, 지이 헬스케어(GE Healthcare)) 및 바리오스칸 플래쉬(Varioskan Flash) 플레이트 판독기 (써모 피셔(Thermo Fisher))를 통해 정량화하였다. 도 2에 제시된 에피토프 맵핑 ELISA 실험의 결과는, 둘 다의 항체가 전장 18mer (서열식별번호: 1)에 결합하지만, 클론 8은 7mer 하위서열 GKPGSGE (서열식별번호: 5)에 특이적으로 결합하고, 클론 16은 5mer 하위서열 KPGSG (서열식별번호: 16)에 특이적으로 결합한다는 것을 입증하였다. 종합해서, 이들 데이터를 사용하여 클론 8 및 16에 대한 최소 결합 에피토프에 기초하여 컨센서스 서열을 생성하였다.
실시예 2: 예시적인 링커 서열의 항체 결합 프로파일
링커 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1) 또는 링커 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 2)를 포함하는 CAR에 대한 항체 패널 또는 항-CD19 scFv 클론 FMC63의 특이적 결합을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 각각 KIP-1, KIP-4, 및 KIP-3 항체로부터의 예시적인 링커 서열의 항체 결합 프로파일을 결정하였다. 또한, 도 1에 기재된 링커 서열 KL1 (서열식별번호: 9), KL2 (서열식별번호: 10), KL3 (서열식별번호: 11), 및 말단절단된 휘트로우 링커 (서열식별번호: 17)를 포함하는 펩티드를 본 검정에 포함시켰다. 단백질 G로 사전-코팅된 플레이트 (피어스)를 사용하여 96-웰 플레이트 포맷으로 항체를 포획하였다. 플레이트를 PBST 완충제 중에서 6x 세척한 후, 표적 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 추가의 6x 세척을 수행하고, 항체를 스트렙타비딘-HRP와 함께 추가로 인큐베이션하였다. PBST에서 최종 6x 세척 시, 신호가 검출되었고, 이를 증진된 화학발광 키트 (ECL, 지이 헬스케어) 및 바리오스칸 플래쉬 플레이트 판독기 (써모 피셔)를 통해 정량화하였다. 도 3에 제시된 항체 프로파일 ELISA 실험의 결과는 본 발명에 따른 링커의 항체 결합의 폭을 입증하였다.
실시예 3: 키메라 링커를 포함하는 CAR 발현 세포의 유동 세포측정법 결과
링커 서열 서열식별번호: 1 (FMC63 WT), 또는 서열식별번호: 2 (FMC63 G4S)를 포함하는 각각의 CAR 구축물의 발현을 확인하기 위해 대조군으로서 단백질 L을 사용하여 CAR T 세포를 유동 세포측정법을 통해 검정하였다. 이들 결과는 T 세포의 표면 상에서의 CAR 구축물의 발현을 확인시켜주었다. 도 4에 제시된 바와 같이, CAR T 세포는 scFv FMC63 및 24C1 scFv와 관련하여 생산되었다. KL2 (서열식별번호: 10), KL3 (서열식별번호: 11), KL4 (서열식별번호: 7), KL5 (서열식별번호: 12), KL6 (서열식별번호: 8), 및 G4S2 (서열식별번호: 18) 링커가 scFv의 VL 및 VH 도메인을 연결하는데 사용되었다.
서열 및 서열식별번호
본 개시내용은 다수의 핵산 및 폴리펩티드 서열을 포함한다. 편의상, 하기 표 B는 각각의 서열을 그의 적절한 서열식별번호와 상호관련시킨다.
표 B
Figure pat00003
Figure pat00004
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험에 지나지 않는 것을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 하기 청구범위에 제시된 바와 같다.
청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구범위 요소를 수식하는 것은 그 자체에 의해 한 청구범위 요소의 또 다른 청구범위 요소에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법을 수행하는 행위의 일시적인 순서를 내포하는 것이 아니라, 특정 명칭을 갖는 하나의 청구범위 요소를 (서수 용어 사용을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구범위 요소를 구별하기 위한 라벨로만 사용된다.
본원의 명세서에서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수형은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 군의 구성원 중 하나, 하나 초과, 또는 모두가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 달리 관련된다면 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 달리 관련된 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한 1개 초과의 또는 전체 군 구성원이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 달리 관련된 실시양태를 포함한다. 추가로, 본 발명이 모든 변경, 조합 및 순열을 포괄한다는 것을 이해해야 하며, 달리 나타내지 않는 한 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하지 않는 한, 열거된 청구범위 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 항목, 서술적 용어 등은 동일한 기본 청구범위 (또는 관련된 임의의 다른 청구범위)를 인용하는 또 다른 청구범위에 도입된다. 요소가 목록으로 제시된 경우 (예를 들어, 마쿠쉬 군 또는 유사한 형식), 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되며, 임의의 요소(들)이 상기 군으로부터 제거될 수 있음을 이해해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소, 특색 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면이 이러한 요소, 특색 등으로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다는 것을 이해해야 한다. 단순성을 위해, 그러한 실시양태는 모든 경우에 본원에서 너무 많은 단어로 구체적으로 제시되지는 않았다. 또한, 구체적 배제가 명세서에서 언급되었는지 여부와 무관하게, 본 발명의 임의의 실시양태 또는 측면은 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 배경을 설명하고 그의 실시와 관련된 추가의 상세한 내용을 제공하기 위해 본원에서 언급된 공개, 웹사이트 및 다른 참고 자료는 본원에 참조로 포함된다.
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