CN117202921A - 用于多种免疫细胞的单链和多链合成抗原受体 - Google Patents

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普里特·M·乔杜里
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Pu LiteMQiaoduli
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Pu LiteMQiaoduli
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Abstract

本公开提供了单链和多链合成抗原受体、制备此类合成抗原受体的方法及其用于治疗疾病和病症的用途。

Description

用于多种免疫细胞的单链和多链合成抗原受体
相关申请的交叉引用
根据35 USC§119，本申请要求2021年2月19日提交的美国临时申请序列号63/151,421和2021年9月16日提交的美国临时申请号63/245,181的优先权，所述申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及单链和多链合成抗原受体。
以引用的方式并入参考序列表
本文件随附的序列表名为“NK-DNA-PRT-1-11231_ST25.txt”，创建于2022年2月21日，包含34，352，306字节数据，在IBM-PC、MS-Windows操作系统上进行机器格式化。出于所有目的，序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
CAR是合成的免疫受体，可以引导T细胞选择性地杀死肿瘤细胞。尽管CA R-T细胞取得了成功，但这种方法存在一些局限性，包括“细胞因子释放综合征”(CRS)和神经毒性等毒性。
与CAR-T相比，NK(自然杀伤)细胞天然具有溶细胞功能和抗病毒免疫功能，但缺乏可能导致GvHD的TCR。与CAR-T相比，CAR-NK细胞也不太可能导致细胞因子过度产生。
目前临床使用的第二代CAR是多种不同多肽的融合体。例如，Kymriah包含鼠的scFv(FMC63)、人的CD8铰链和跨膜结构域、人的4-1BB共刺激结构域和人的CD3z激活结构域。这些结构域以某种任意的方式缝合在一起，所得的构建体存在一些问题，例如非特异性聚集、强直信号传导和缺乏生理调节。
如果不受理论束缚，当使用单链可变片段(scFv)来设计具有双特异性、二价或双互补位抗原结合部分的CAR时，这些问题可能会更加复杂。
上述大多数下一代SAR设计的另一个主要限制是，它们主要在T细胞中活跃，而在其它免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞)中不起作用。
为了克服第二代CAR的一些设计限制，统称为下一代CAR的几种替代设计已经被阐述，包括Ab-TCR(WO 2017/070608 A1通过引用并入本文)、TCR受体融合蛋白或TFP(WO2016/187349 A1通过引用并入本文)、合成免疫受体(SIR)(参见，WO 2018/102795A1，通过引用并入本文)、三功能T细胞抗原偶联剂(Tri-TAC)(参见，WO 2015/117229 A1，通过引用并入本文)。一般来说，这些替代CAR设计缺乏一个共刺激域。
发明内容
本公开提供了单特异性、双特异性、多特异性和通用的下一代SAR设计。
本公开提供了具有特定结构的胞外、跨膜和胞质结构域的合成抗原受体(SA R)。与常规嵌合表达抗原受体(CAR)相比，例如表达一个CD3z激活结构域和一个41BB或CD28共刺激结构域的第二代CAR，SAR在免疫细胞(例如，T细胞，NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等)中表达时，表现出更好的免疫细胞活性，靶细胞杀伤力，细胞因子分泌(例如IL-2、干扰素-γ和TNFa)和体内活性。
本公开还提供了可以与本公开的SAR共同表达的新颖的辅助模块。本公开提供了包含编码多肽的核酸的载体，所述多肽用于a)细胞因子的膜锚定的低亲和力变体(例如IL-2和/或IL-15)；b)带有表位标签的膜锚定细胞因子；c)具有自杀、生存和标记功能的多用途基因开关。
本公开提供了一种产生细胞的方法，该细胞表达具有本公开的单链或的任何一个或多个的辅助模块。辅助模块可以在没有SAR的单元中表达。本公开还提供了具有短启动子和内部核糖体位点的优化载体，其针对本公开的辅助模块和/或SAR的表达进行了优化。
一方面，本公开涉及提供生理信号传导的新下一代单链SAR设计。更重要的是，在另一方面，本公开涉及下一代多链SAR设计。
另一方面，本公开涉及新颖的下一代合成抗原受体(SAR)设计，其在多种免疫细胞中具有活性，包括T细胞、NKT细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞等。公开内容涉及新颖的SAR设计，称为通用TCR-SAR(或uTCR-SAR)，其赋予T细胞受体样抗原对任何细胞的结合特异性。
本公开内容还提供了具有类T细胞结合特性的非T细胞，包括任何细胞，包括结合与MHC(或HLA)分子相关的肽抗原的能力。本公开提供了产生此类细胞的一般方法及其在治疗各种疾病中的用途。
本公开还提供了一种可用于过继细胞疗法的多用途开关，用于提供细胞存活、检测、跟踪、富集、选择和消除功能。
本公开内容还提供了用于产生涉及I型和II型跨膜蛋白的嵌合融合蛋白的通用方法。该方法可用于产生掺入I型蛋白的抗原结合结构域和II型蛋白的胞质、跨膜、铰链和/或胞外抗原结合结构域的合成抗原受体。
本文还提供了编码本文所述的任何单链、双链或多链SAR和/或辅助模块的核酸。本文还提供了共同编码本文所述的任何单链、双链和多链SAR和/或辅助模块的核酸组。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，提供了在其表面上呈递SAR的效应细胞(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、iPSC等)，其中效应细胞包含一种或多种载体，其具有一种或多种启动子，所述启动子包含编码SAR和/或任选的辅助模块的一种或多种多肽链的一种或多种核酸。
本文还提供了哺乳动物细胞，其包括编码本文所述的任何单链、双链和多链SAR和/或辅助模块的本文所述的任何核酸。本文还提供了哺乳动物细胞，其包括本文所述的任何核酸组，所述核酸组一起编码本文所述的任何单链、双链和多链SAR和/或辅助模块。
在一些实施例中，本公开内容提供，与TCR相反，本公开内容的SAR可以在任何哺乳动物细胞中表达并且具有功能活性。在一个实施方案中，哺乳动物细胞可以是T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞等。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞选自：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、T干细胞、Treg细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、iNKT(先天自然杀伤细胞)、NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC衍生的NK细胞、α/βT细胞、γ/δT细胞、iPSC衍生的T细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、iPSC。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞选自：iPSC(诱导多能干细胞)或胚胎干细胞或可以产生免疫效应细胞的造血干细胞(例如，T细胞、NK细胞或NKT细胞)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是永生化细胞系，例如NK92、NK92MI、YTS或其衍生物。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，所述受试者被诊断或鉴定为患有癌症。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，细胞是同种异体的。
此外，本文提供了可在T细胞以外的细胞中功能性表达的单链和多链TCR，所述细胞包括但不限于NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和粒细胞。
本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的任何哺乳动物细胞和药学上可接受的载体。本文还提供了包括本文描述的任何药物组合物的试剂盒。
本文还提供了药物组合物，其包括本文所述的编码本文所述任何单链、双链和多链SAR和/或辅助模块的任何核酸，或本文所述的一起编码本文所述任何单链、双链和多链SAR和/或辅助模块的任何核酸组，以及药学上可接受的载体。本文还提供了包括本文描述的任何药物组合物的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了杀死一种或多种靶抗原的靶细胞的方法，包括使靶细胞与表达根据上述任何SAR(例如分离的SAR)的效应细胞接触，其中SAR特异性结合一种或多种靶抗原。
在一些实施方案中，根据上述杀死靶细胞的任何方法，接触是在体外进行的在一些实施方案中，接触是在体外进行的。
在一些实施方案中，提供了用于检测、分离、纯化、扩增、富集和消除本文所述的任何SAR的细胞表达的方法。
本文还提供了产生表达单链、双链和多链SAR和/或辅助模块的细胞的方法，其包括将编码所述任何SAR和辅助模块的本文所述的任何核酸或编码本文所述的任何多链SAR的本文所述的任何核酸组引入哺乳动物细胞中。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是选自以下细胞，包括：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞/单核细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者被诊断或鉴定为患有癌症。本文描述的任何方法的一些实施方案还包括在引入步骤之后在液体培养基中培养细胞。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括，在引入步骤之前，从受试者获得哺乳动物细胞。
本文还提供了治疗受试者的疾病(例如，癌症、感染、过敏、免疫病症等)的方法，其包括向受试者施用有效治疗量的本文所述的任何哺乳动物细胞。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括，在施用步骤之前，从受试者获得初始细胞；引入本文所述的编码本文所述的任何单链、双链、多链SAR和/或辅助模块的任何核酸，或本文所述的共同编码任何单链的任何核酸组，将本文所述的双链、多链SAR和/或辅助模块引入初始细胞中，以产生给予受试者的哺乳动物细胞。本文所述的任何方法的一些实施方案还包括在引入步骤和施用步骤之间在液体培养基中培养施用给受试者的细胞的步骤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，异源抗原结合结构域选自：抗体、抗体片段(vL、vH、Fab等)、scFv、(scFv)2、VHH结构域、FHVH(完全人vH结构域)、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架(例如Centyrin、亲和体、ZIP结构域、适配器等)、VNAR结构域、配体、TCR，TCR和受体的可变结构域(Va、Vb、Vg、Vd)。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，异源抗原结合结构域包含scFv。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，异源抗原结合区特异性结合单一抗原。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，肿瘤抗原选自表B中列出的抗原。
在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，单链SAR包括非自然的存在的胞外抗原结合结构域、任选的接头、任选的天然存在的受体的胞外配体结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域、任选的胞质共刺激结构域和任选的胞质初级包含酪氨酸的激活基序(ITAM)的信令域。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，跨膜结构域和任选的胞质初级信号传导结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，跨膜结构域和任选的胞质初级信号传导结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，可选的主要信号域和共刺激域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，任选的初级信号传导结构域和共刺激结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，共刺激域和ITAM彼此直接邻接。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，共刺激结构域和ITAM间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。
在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，单链SAR包括非自然的存在的胞外抗原结合结构域、任选的接头、天然存在的受体的任选的胞外配体结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域、初级信号传导结构域和ITAM。
在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，单链SAR包括非自然的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域、ITAM和共刺激结构域。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，单链合成抗原受体包括非天然存在的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、第二细胞内信号传导结构域、ITAM和第一细胞内信号传导结构域。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，当从N端到C端方向或从C端到N端方向行进时，单链合成抗原受体包括异源细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、ITAM、初级信号传导结构域和共刺激结构域。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，当从N端到C端方向或从C端到N端方向行进时，单链合成抗原受体包括非天然存在的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、ITAM、第二细胞内信号传导结构域和第一细胞内信号传导结构域。
在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，胞外抗原结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，胞外抗原结合结构域和跨膜结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。
在本文描述的任何单链SAR的一些实施方案中，主要信号传导结构域来自CD 3z。在本文所述的任何单链SAR的一些实施方案中，主要信号传导结构域来自FcRγ。在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，主要信号传导域来自DAP10。在本文描述的任何单链SAR的一些实施例中，主要信号传导域来自DAP12。
本文还提供了包括编码本文所述的任何单链SAR的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括本文所述的任何核酸的载体，所述核酸包括编码本文所述的任何单链SA R的核苷酸序列。
本文还提供了包含本文描述的任何载体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或iPSC。
本文还提供了产生表达SAR细胞的方法，该方法包括将本文描述的任何核酸或本文描述的任何载体引入哺乳动物细胞中。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是选自以下任一的细胞：CD8+T细胞、CD4+T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、Treg细胞、自然杀伤T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞/单核细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是选自以下的细胞：iPSC(诱导性多能干细胞或胚胎干细胞或可以产生免疫效应细胞的造血干细胞(例如，T细胞，NK细胞或者NKT细胞)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是一种永生化细胞系，例如NK92、NK92MI或其衍生物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该哺乳动物细胞是从主体中获取的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述受试者被诊断或鉴定为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括，在引入步骤之后：将所述细胞培养在本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括，在引入步骤之前：从受试者获得哺乳动物细胞。
本文还提供了治疗受试者癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何哺乳动物细胞。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括，在施用步骤之前，从受试者获得初始细胞；以及将本文所述的任何核酸或本文所述的任何载体引入初始细胞中，以产生给予受试者的哺乳动物细胞。本文所述的任何方法的一些实施方案还包括在引入步骤和施用步骤之间在液体培养基中培养给受试者施用的细胞的步骤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。
本文提供了包含至少一个第一多肽的多链SAR，所述第一多肽包含：胞外抗原结合结构域；可选的铰链结构域、跨膜结构域；和可选的胞质结构域。
在本文所述的任何多链SAR的一些实施方案中，胞外抗原结合结构域选自：Vα、Vβ、Vγ、Vδ、vL、vH结构域、scFv、(scFv)2、VHH结构域、FHVH(全人vH结构域)、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、VNAR结构域、配体和受体。在本文所述的任何多链SAR的一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含scFv。
在本文所述的任何多链SAR的一些实施方案中，至少一个第一多肽包括与单一抗原特异性结合的胞外抗原结合区。在本文所述的任何多链SAR的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。
在本文描述的任何多链SAR的一些实施方案中，SAR缺乏ITAM，但募集包括含有ITAM的初级刺激结构域的信号传导蛋白。在本文描述的任何多链SAR的一些实施方案中，SAR募集选自CD3z、FcRγ、DAP10和/DAP10的信号传导蛋白。
在本文所述的任何多链SAR的一些实施方案中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，多链SAR的至少第一多肽SAR包括异源抗原结合结构域、任选的接头、任选的天然存在受体的胞外结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域、任选的胞质共刺激结构域和任选的包含ITAM的胞质初级信号传导结构域。在本文所述的多链SA R的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，跨膜结构域和任选的胞质初级信号传导结构域彼此直接邻接。在本文所述的多链SAR的至少第一个多肽中的任何一种实施方案中，跨膜结构域和任选的胞质初级信号传导结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至250个氨基酸)。在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，任选的初级信号传导结构域和共刺激结构域彼此直接邻接。在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，任选的初级信号传导结构域和共刺激结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。在本文所述的多链SAsR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，共刺激结构域和ITAM彼此直接邻接。在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，共刺激结构域和ITAM间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，多链SAR包括异源抗原结合结构域、任选的接头、任选的铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域、初级信号传导结构域和ITA M。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，所述至少第一多肽多链SAR多肽包括异源抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域、ITAM和共刺激结构域。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，当沿N端至C端方向或沿C端至N端方向行进时，所述至少第一多肽多链SAR的多肽包括异源抗原结合结构域、跨膜结构域、第二细胞内信号传导结构域、ITAM和第一细胞内信号传导结构域。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，当行至N端至C端方向或沿C端至N端方向时，所述多链SAR的至少第一多肽链包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、ITAM、初级信号传导结构域和共刺激结构域。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，当行至N端至C端方向或沿C端至N端方向时，所述多链SAR至少第一多肽链包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、ITAM、第二胞内信号结构域和第一胞内信号结构域。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，胞外抗原结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，胞外抗原结合结构域和跨膜结构域间隔1至500个氨基酸(例如，1至250个氨基酸，或1至50个氨基酸)。
在本文所述的多链SAR的至少第一多肽中的任何一种的实施方案中，初级信号传导结构域来自CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12的组中的一种或多种蛋白质。
从下面的详细描述和附图以及权利要求中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图说明
在以下非限制性附图中进一步描述本发明。
图1显示了不同双链单特异性、双特异性和多特异性SAR的示意图。
图2显示了包含不同形式的AABD(例如，vHH、SVH、aVH、affibody、Centyr in等)的不同双链单特异性、双特异性和多特异性SAR的示意图。
图3显示了本公开内容的单链和双链CD16-SAR在表达时可以具有的各种格式的描述。这些SAR基于CD16的整个细胞外结构域，包括其类似Ig结构域(D1和D2结构域)。
图4显示了本公开内容的CD16-SAR在表达时可以具有的各种格式的描述。这些SAR基于CD16的部分细胞外结构域。由于SAR在格式上是模块化的，CD16模块可以被衍生自NKp44、NKp46的不同模块替代，以生成不同的SAR。
图5显示了本公开内容的NKp30 SAR在表达时可以具有的各种形式的描述。由于SAR在格式上是模块化的，NKp30模块可以被衍生自NKp44、NKp46不同模块替代，以生成不同的SAR。
图6显示了当与表达CD19的RS4；11GLuc靶细胞共培养2小时后，表达指定SAR构建体的NK92细胞的Matador细胞毒性测定结果。
图7显示了与RS4；11GLuc靶细胞共培养2小时后，表达指定SAR构建体的NK92细胞的Matador细胞毒性测定结果。
图8显示了与L363-GLuc靶细胞共培养2小时后，表达指定SAR构建体的NK92细胞的Matador细胞毒性测定结果。
图9显示了与RS4；11Gluc靶细胞共培养2小时后，表达指定SAR构建体的NK92细胞的Matador细胞毒性测定结果。
图10显示当与RS4；11GLuc靶细胞共培养2小时后，表达指定SAR构建体的NK92细胞的Matador细胞毒性测定结果。
图11显示当与L363-Gluc靶细胞共培养2小时后，用表达指定SAR构建体的NK92细胞进行Matador细胞毒性测定的结果。
图12显示了制备SAR的一般描述，所述SAR包含抗原结合结构域与II型膜蛋白例如NKG2D的胞外结构域的融合
图13A-C显示了(A)当与U266细胞(NY-ESO1+/HLA-A2)共培养，通过靶向NY-ESO1肽(SEQ ID NO:10880)，表达uTCR-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)的NK92、原代NK细胞和原代T细胞来诱导细胞死亡；(B)上调TNFα(C)当T细胞与对照T2细胞或已加载该肽的T2共培养时，通过表达uTCR-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)靶向NY-ESO 1肽的原代T细胞对IFNγ的上调。
详细说明
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合，除非清楚地表明相反。具体地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其它特征组合。
除非另有说明或从上下文中隐含，以下术语和短语包括下面提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，否则下面的术语和短语不排除如本文所用的术语或短语在其所属领域中已经获得的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定实施例，而不是为了限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限制。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含”或“包括”用于指组合物、方法及其分别的组分，其对实施例有用，但可以包含未指定的元素，无论有用与否。本领域技术人员应当理解，一般而言，本文所使用的术语通常旨在为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”、术语“具有”)。术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。
一般而言，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的来进行，除非另有指示。参见(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册第4版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2013))。与本文所述的免疫学、分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医学以及药物和制药化学的实验室程序和技术，均是该领域中广泛已知并常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、药物配制、药物递送以及患者治疗。
本文使用的术语“自主抗原结合结构域”或“AABD”是指可以自主结合抗原的抗原结合结构域，即在不存在另一抗原结合结构域的情况下可以结合到抗原。示例性AABD是单个vH结构域或自主vH结构域(aVH)，通常是可以在不存在vL结构域的情况下结合抗原的单个人vH结构域(SVH)。另一个示例性AABD是完全人vH结构域(FHV H)。另一个示例性AABD是单个vL结构域或自主vL结构域，通常是在没有vH结构域的情况下可以结合抗原的单个人vL结构域(SVL)。AABD还指可以自主结合抗原的其它抗原结合结构域。在一个实施方案中，AABD是非scFv抗原结合结构域。示例性的基于非scFV的自主抗原结合结构域包括但不限于vHH结构域、人源化vHH结构域、单可变结构域TCR(svd-TCR)和非免疫球蛋白抗原结合支架例如DARPIN、affibody、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、obody、repebody、fy nomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、apronectin、anticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段。基于非scFV的自主抗原结合结构域的其它实例包括受体的配体结合结构域(例如，CD16-V158A、NKG2D)或其片段、配体的受体结合结构域(例如，APRIL、血小板生成素等)或其片段、适配器(例如，RZIP、EZIP、E4、K4、NKG2D-YA、NKG2D-AF等)或其片段、适配器结合蛋白(例如ULBP2R、ULBP2-S3等)或其片段、表位或标签(例如Streptag、FLAG标签等)、自身抗原或其片段等。
本公开描述了使用AABD，例如人VH(或vH)结构域，例如多个人VH结构域，作为构建块来制造单特异性、双特异性和多特异性SAR。在一个实施例中，本公开描述了使用AABD，例如人VH结构域，例如多个人VH结构域，作为构建块来制备单特异性、双特异性和多特异性新型SAR。
当术语“约”指可测量值例如量、持续时间等时，意在涵盖±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下偏离指定值±1％，或在一些情况下偏离指定值±0.1％，因为这样的变化适合于执行本文所公开的方法或描述本文的组合物。此外，任何值或范围(例如，小于20或类似的术语)明确地包括这些值之间或高达该值的任何整数。因此，例如，“一到五个突变”明确包括1、2、3、4和/或5个突变。
本文所述的术语“ABR”或“抗原结合受体”是指具有抗原结合结构域的任何受体。ABR的抗原结合结构域可包含scFv、vL、vH、VHH、抗体、抗体片段(例如Fab)、类抗体部分、Vα、Vβ、svd-TCR、细胞因子、受体等。在一个实施方案中，ABR具有跨膜或膜锚定结构域，使其能够在细胞表面表达。示例性ABR包括第一代CAR、第二代CAR、TFP、SIR、STAR、zSIR、cTCR、TCR、Ab-TCR、TRI-TAC或TAC等。合成抗原受体(SAR)，如本文所述，也是ABR的示例。
本文所用的术语“Ab-TCR”或“AbTCR”是指如WO 2017/070608 A1中描述的下一代CAR平台，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，Ab-TCR包含特异性结合与能够募集至少一个TCR信号传导模块的TCR模块融合的靶抗原的抗体部分。可用于构建Ab-TCR的示例性TCR模块提供于SEQ ID NO:6009-6014(表6)和WO 2017/070608A1中，其通过引用并入本文。
本文所用的术语“辅助模块”是指在免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞，例如SAR-NK细胞、SAR-T细胞或TCR-T细胞)中表达的PDL1、PDL2、CD80、CD86、crm A、p35、hNEMO-K277A(或NEMO-K277A)、hNEMO-K277A-delta-V249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E(或IKK2-SS/EE)、IKK1-S176E-S180E(或IKK1-SS/EE)、MyD88-L265P、TCL-1a、MTCP-1、CMV-141、41BBL、CD40L、vFLIP-K13、MC159、cFLIP-L/MRITα、cFLIP-p22、HTLV1 Tax、HTLV2Tax、HTLV2 Tax-RS突变体、FK BPx2-K13、FKBPx2-HTLV2-Tax、FKBPx2-HTLV2-Tax-RS、IL6R-304-vHH-Alb8-vHH、IL12f、PD1-4H1 scFV、PD1-5C4 scFV、PD1-4H1-Alb8-vHH、PD1-5C4-Alb8-vHH、CTLA4-Ipilimumab-scFv、CTLA4-Ipilimumab-Alb8-vHH、IL6-19A-scFV、IL6-19A-scFV-Alb8-vHH、sHVEM、sHVEM-Alb8-vHH、hTERT、Fx06、靶向Brd4的shRNA、IgSP-[hTRAC-op t2]、IgSP-[hTRBC-opt2]、多目的开关(例如，IL2-tBCMA、IL15-tBCMA、IL2-RQR、IL15-RQR等)、NKG2C、CD94、DAP10、DAP12、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ等的一个或多个组合，以降低、调节或改变免疫细胞的活性。在一个实施例中，辅助模块是治疗对照(例如，icapase 9)。在一些实施例中，辅助模块与SAR或TCR等免疫受体共表达，以便升高、降低、调控或修饰SAR或TCR以及在表达SAR或TCR细胞中的表达或活性。辅助模块可以使用单个载体或使用两个或更多个不同载体与SA R或TCR共同表达。在一些实施方案中，辅助模块在抗原呈递细胞例如树突细胞中表达。
如本文所用“亲和力”意在描述结合强度的量度。亲和力通常是指结合剂结合其靶标的“能力”。本领域中有多种方法用于测量“亲和力”。例如，计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。如本文所用，术语“特异性结合”意指抗体与抗原之间以至少10-6M的结合亲和力接触。在某些方面，抗体以至少约10-7M的亲和力结合，并且通常10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。
本文所用的术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆或多克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是“人源化的”、“嵌合的”、完全人的或非人的。抗体可以具有单个结构域(例如，单个vH结构域)。
本文所用的术语“抗体片段”指抗体的至少一部分，其保留与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab'h、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHl结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体(sdA b)例如vL或vH、骆驼vHH域、由抗体片段形成的多特异性抗体例如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，以及分离的CDR抗原结合片段还可以掺入单结构域抗体、大抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson，NatureBiotechnology 23:1126-1136，2005)。抗原结合片段也可以被移植到基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号:6，703，199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
本文所用的术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种多肽链中较大的一条，并且其通常决定抗体所属的类别。
本文所用的术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
“抗癌剂”是指抑制异常细胞分裂和生长、抑制肿瘤细胞迁移、抑制侵袭或防止癌症生长和转移的药剂。如本文所用的术语包括化疗剂、生物剂(例如，si RNA、病毒载体，例如递送细胞毒性基因的工程化MLV、腺病毒、疱疹病毒)、抗体等。
本文所用的术语“抗癌作用”或“抗肿瘤作用”是指可以通过多种方式表现出来的生物学作用，包括但不限于肿瘤体积的减小、癌细胞数量的减少、转移的数量、预期寿命的增加、癌细胞增殖的减少、癌细胞存活的减少或与癌症病症相关的各种生理症状的改善。“抗癌作用”还可以通过SAR首次预防癌症发生的能力来体现。
本文所用的术语“抗原”或“Ag”是指激发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。技术人员将理解任何大分子，包括实际上所有蛋白质或肽，都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用，术语“抗原”通常指被本文描述的抗原结合结构域特异性识别的结合配偶体。可以被任何抗原结合结构域特异性结合的一个或多个抗原的非限制性实例描述于表B中。
本文所用的术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指展示与主要组织相容性复合物(MHC的)在其表面。
本文所用的术语“抗感染效应”是指可以通过多种方式表现的生物效应，包括但不限于例如感染原滴度的降低、感染原菌落计数的减少、感染原的改善。与感染性疾病相关的各种生理症状。
“抗原结合结构域”或“抗原结合模块”或“抗原结合区段”或“抗原特异性结构域”(ASD)是指由于其一级、二级或三级序列、翻译后修饰和/或电荷以高度特异性与抗原结合。ASD可以以比非特定域更高的亲和力与靶标结合。抗原结合结构域可以衍生自不同来源，例如抗体(全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体)、非免疫球蛋白结合蛋白、配体或受体。在一些实施方案中，以高亲和力结合给定同源物或抗原的几乎任何分子都可以用作ASD，如本领域技术人员将理解的。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含T细胞受体(TCR)或其部分。在示例性实施方案中，在本文的表3-7中列出靶抗原和各种抗原结合结构域的序列号。在示例性实施方案中，vL、vH、scFV及其CDR区域的靶抗原和序列标识号在专利申请PCT/US 18/53247的表6A-C和专利申请PCT/US19/035096的表3-4中列出，其全部内容通过引用并完整地纳入本文。
本文所用的术语“缔合常数(Ka)”定义为受体与配体缔合的平衡常数。
“自身抗体”是指由对自身抗原特异的B细胞产生的抗体。
本文所用的术语“自身抗原”是指刺激自身免疫应答的产生，例如自身抗体的产生的内源性抗原。自身抗原的实例包括但不限于桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白3及其片段。
“亲合力”是指结合剂与其靶标之间相互作用的强度(例如，抗体与其抗原靶标、受体及其同源物等之间的相互作用的强度)。功能测定中的抗体活性(例如，流式细胞术测定或Malibu-Glo测定)也反映了抗体亲和力。
如本文所用，术语“骨架”或“结构”是指不同组分(例如，抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、信号传导结构域)的配置，其包含不同的SAR和通常是可选的任何附属模块。在一个实施例中，SAR和辅助模块由单个核酸分子编码。在另一个实施方案中，SAR由第一核酸分子编码并且辅助模块由第二核酸分子编码。在一些实施例中，辅助模块由多于一种核酸分子编码，这取决于辅助模块中的组件的数量。SAR和辅助模块的两个或更多个组件可以通过可裂解接头例如2A核糖体跳跃序列(例如P2A、T2A、F2A等)分开。SAR和辅助模块的两个或更多个组件可以通过内部核糖体进入序列(IRES)分开。示例性IRES衍生自KSHV。编码SAR和辅助模块的两个或更多个组分的核酸的表达可以由单独的启动子驱动。示例性启动子包括EF1a、EFS、EFS2、CM V、RSV、mutRSV、MNDU3、Hsp70和Hsp90。
表A1：传统的CAR架构。第一代常规CAR(常规CAR I)具有细胞内信号传导(ISD)结构域(例如CD3z)并且没有共刺激结构域。TCR融合蛋白(TFP)是常规CAR 1的另一个例子。第二代常规CAR(常规CAR 2或CAR II)具有一个共刺激结构域(例如41BB或CD28)和一个细胞内信号传导(ISD)结构域(例如CD3z)。第三代常规CAR(常规CAR 3或CAR III)具有两个共刺激结构域(例如，41BB和CD28)和一个细胞内信号传导(ISD)结构域(例如，CD3z)。Ab-TCR是包含vL-linker-TCR结构域(TCRD和vH-Linker-TCR结构域(TCRD))的双链受体，并已在PCT/US2016/058305中进行了描述。cTCR是单链、单链与半链、或双链受体，由衍生自vL和vH片段的抗原结合结构域组成，融合到一个或多个TCR恒定链(TCR-C)并导致T细胞信号传导的激活。cTCR的TCR恒定链由野生型核酸序列和相应的野生型氨基酸序列。cTCR的不同构型在PCT/US2017/064379或WO 2018/102795 A1中描述。合成免疫受体是下一代CAR在PCT/US2017/064379或WO 2018/102795 A1中描述。SIR是单链、单链与半链或双链受体。在一个实施方案中，SIR的抗原结合结构域衍生自与一条或多个TCR恒定链融合的vL和vH片段在一些实施方案中，SIR的TCR恒定链由密码子优化的核酸序列编码并且包含增强其表达和链配对的一种或多种突变。zSIR是双链受体，其包含抗原结合结构域(例如，vL、vH等)，其通过任选的接头可操作地连接至两条CD3z链或其片段，并且在PCT/US2019/035096中描述。
表A1-1至A1-19提供了本公开的单特异性、双特异性和多特异性SAR的示例性架构。使用的缩写是：SP(信号肽)；AADB(自主抗原结合域)；L(可选接头)；LL(长接头)、(AABD-L)n(带有可选接头的AABD的n个拷贝，其中n＝0、1、2、3、4或更多)、AABD1-4(针对一种或多种抗原的不同AABD)、V1(vL、vH、Va、Vb、Vg或Vd链)、Ig(Ig接头)、TCR-Ig(衍生自TCR链的Ig接头结构域)、ConP(连接肽)、TM(跨膜结构域)、CP(胞质结构域)、IC(胞内结构域)、Ca(TCRα恒定链)、Cb(TCRβ恒定链)、Cg(TCRγ恒定链)、Cd(TCRδ恒定链)、scFv(单链片段可变抗体)、scTFv(包含TCR的两个可变片段的单链片段，例如，Va和Vb)、dCa/dCb/dCg/dCd(N末端缺失的TCRα、β、γ或δ恒定链，缺少其Ig接头结构域)、TCR-ConP(TCRα、β、γ或δ恒定链的连接肽)、Ca-ConP(TCRα恒定链的连接肽)、IgCL(免疫球蛋白轻链的Ig接头)、IgCH1(免疫球蛋白重链的Ig接头)、CD3εγδECD(CD3ε、γ或δ链的胞外结构域)、CSD(共刺激结构域)、4-1BB或BB(4-1BB的共刺激结构域)、CD28或28(CD28的共刺激结构域)、CD3z或zd或z(CD3z的激活域)、NKp30-Ig(Nkp30的免疫球蛋白类似结构域)、NKp44-Ig(NKp44的免疫球蛋白类似结构域)、NKp46-Ig1-Ig2(Nk p46的免疫球蛋白类似结构域1和2)、CD16-D1(CD16的结构域1)、CD16-D2(CD16的结构域2)、scTCR(单链TCR)、胞外结构域(ECD)、激活结构域(AD)。Va、Vb、Vg、Vd(TCRα、β、γ和δ的可变结构域)、FCRG(FcRγ)、铰链结构域(Hn)。
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表A1-16示例性TCR-SAR
表A1-17示例性TCR-SAR
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表A1-19示例性TCR-SAR
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如本文所用，“有益结果”或“期望结果”可包括但不限于减轻或减轻疾病状况的严重性、防止疾病状况恶化、治愈疾病状况、预防疾病状况发展、降低患者患病的机会并延长患者的生命或预期寿命。
“结合相同的表位”意指抗体、scFv或其它抗原结合结构域结合靶抗原并具有与示例性抗体、scFv或其它抗原结合结构域相同的表位的能力。作为实例，示例性抗体、scFv或其它结合剂和其它抗体的表位可以使用标准表位作图技术来确定。本领域众所周知的表位作图技术包括分子生物学方法中的表位作图方案，第1卷。66(Glenn E.Morris，编辑，1996)Humana Press，新泽西州托托瓦。人类CD20、BCMA和人类MPL抗原的典型表位，由当前公开的scFv、SAR、抗体和其他免疫治疗药物结合，分别在专利申请PCT/US18/53247的SEQ ID NO:15149-15154、15155-15159和15160中提供，该专利申请在此完全作为参考引用并入。
在没有明确叙述的情况下并且除非另有意图，应当推断，当本公开内容涉及多肽、蛋白质、多核苷酸、抗体、SAR或其片段时，其等价物或生物学等价物意图在本公开内容的范围内。如本文所用，术语“其生物学等价物”或“变体”或“功能变体”在指代参考蛋白、抗体或其片段、受体或其片段、配体或片段时意欲与“其等价物”同义。其中，非免疫球蛋白抗原结合结构域或其片段、SAR或其片段、多肽或核酸是指具有最小同源性同时仍保持期望的结构或功能的那些。除非本文具体叙述，否则预期任何上述还包括其等同物，包括可变剪接的同种型和来自其它动物物种的等同物。例如，等同物意指至少约70％同源性或同一性，或至少80％同源性或同一性，或者至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或或者，与参考蛋白质、多肽、抗体或其片段或核酸具有至少98％的同源性或同一性，并且表现出基本上等同的生物活性。或者，当提及多核苷酸时，其等价物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补体杂交的多核苷酸。或者，当提及多肽或蛋白质时，其等价物是来自在严格条件下与编码参考多肽或蛋白质的多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸表达的多肽或蛋白质。
应当认识到，蛋白质可以彼此具有同一性或同源性并保留相似或相同的功能。如本文所用，多肽“变体”是与所列举的多肽仅在保守取代和/或修饰方面不同的多肽，从而保留了该多肽的治疗、抗原和/或免疫原性特性。多肽变体通常表现出与所鉴定的多肽至少约70％、更通常至少约90％并且最通常至少约95％的同源性。对于具有免疫反应特性的多肽，变体可以备选地通过修饰上述多肽之一的氨基酸序列并评估修饰的多肽的免疫反应性来鉴定。可以使用例如本文描述的代表性程序来制备和测试此类修饰的序列。本公开内容包括SAR和SAR组分(例如，CD16、CD32、CD64、FcRγ、DAP10、DAP12、DNAM1、0X40、2B4、KIR2DL1、KIR2DS4、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、NKG2A的胞外区、铰链区、跨膜区和胞质区、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKG2H、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和CD3z等)，其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、98.5％，与本文所述的任何氨基酸序列具有99％或99.9％同一性，同时保留生物活性。本公开内容还包括具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、与本文描述的任何序列具有98.5％、99％或99.9％同一性，同时保留生物活性。变体包括来自其它物种的同源物和选择性剪接异构体。
如本文所用，术语“CD3复合物”是指包含用于TCR激活的跨膜信号传导的多种蛋白质的细胞表面分子组装体。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。Kabat等人，J.Bio已经描述了这些特定区域。化学。252：6609-6616(1977)；Kabat等人，美国卫生与公众服务部，“具有免疫学意义的蛋白质序列”(1991)；Chothia等人，J.Mol。生物。196：901-917(1987)；和MacCallum等人，J.Mol。生物。25 262:732-745(1996)，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的CDR旨在落入本文所定义和使用的术语的范围内。如本文所使用的，抗体的不同CDR也可以通过不同定义的组合来定义。例如，vHCDR1可以基于Kabat定义，VHC DR2可以基于Chothia定义。包含上述各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基如下：
CDR定义
(残留编号对应于已识别的参考)。
可以构成本公开的SAR、双特异性抗体和其它免疫治疗剂的抗原结合结构域的示例性vL和vH区段的CDR的SEQ ID在SEQ ID NO:13204-14121和SEQ ID NO:14122-15039中提供。分别(表6A，B)PCT/US2018/053247、PCT/US2017/064379的表5-6和PCT/US2021/022641的表39，其通过引用并入本文。本公开的表3中还提供了可以构成SAR、抗体和其它免疫治疗剂的抗原结合结构域的示例性vL和vH区段的SEQ ID。本公开(例如表3)提供的vL片段和scFv的轻链CDR1、CDR2和CDR3提供于SEQ ID NO：10882-11118、11119-11355和11356-11592中。本公开(例如表3)中提供的vL片段的CDR1、CD R2和CDR3提供于SEQ ID NO：10882-11118、11119-11355和11356-11592中。本公开(例如表3)中提供的vH片段和scFv的重链CDR1、CDR2和CDR3分别在SEQ ID NO：11593-11829、11830-12066、12067-12303中提供。
在一些实施方案中，提及特异性结合靶抗原的抗原结合模块(例如Fab样或Fv样抗原结合模块)意指抗原结合模块通过(a)结合靶抗原亲和力是其对其它分子的结合亲和力的至少约10倍(例如，约10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000或更多)倍；(b)K d不大于约1/10(例如，1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1175、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小)倍其与其它分子结合的Kd结合亲和力可以通过本领域已知的方法测定，例如ELIS A、荧光激活细胞分选(FACS)分析、Malibu-Glo测定、Topanga测定或放射免疫沉淀测定(RIA)。
本文所用的“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征是不受调节的细胞生长。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语都涵盖固体和液体，例如弥漫性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前以及恶性癌症和肿瘤。术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。
“细胞疗法”或“基于细胞的疗法”或“免疫细胞疗法”或“免疫效应细胞疗法”是指涉及使用细胞来预防或治疗疾病的疗法。细胞疗法的非限制性实例包括CAR-T细胞疗法、NK细胞疗法、重组TCR-T细胞疗法、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)。
“化疗剂”是已知可用于癌症化疗的化合物。
“嵌合抗原受体”(CAR)是人工(非天然存在的)免疫细胞(例如T细胞)受体，预期使用称为过继细胞转移的技术用作癌症疗法。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。CAR是专门构建的，用于刺激T细胞激活和增殖，以响应CAR所结合的特定抗原。一般而言，CAR指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个，当其在免疫效应细胞中表达时，为细胞提供针对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内信号传导结构域”)，所述细胞质信号传导结构域包含衍生自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，该组多肽是彼此连续的。一方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的zeta链。一方面，细胞质信号传导结构域还包含衍生自至少一种如下定义的共刺激分子的一种或多种功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD27、OX40、2B4和/或CD28。在一个实施方案中，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个实施方案中，CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的前导序列，其中前导序列在CAR从细胞加工到细胞膜定位期间选择性地从抗原结合结构域(例如，scFv)上切割下来。在各种实施方案中，CAR是包含抗原特异性结构域(野生)、铰链区(HR)、跨膜结构域(TMD)、任选的共刺激结构域(CSD)和胞内信号结构域(野生)的重组多肽。第一代CAR构建体中通常不存在可选的共刺激结构域。包含不同抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)并整合了41BB共刺激结构域的若干示例第二代CAR的核酸和蛋白质序列已在PCT/US2020/014237的(表8)的SEQ ID NO:1455-1703和341-7589(表8)中呈现。
“密码子优化”或“控制物种密码子偏倚”是指特定宿主细胞的优选密码子使用。如本领域技术人员所要理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可能是有利的。本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性质，其核苷酸序列不同的多种DNA化合物可用于编码本公开内容的给定多肽。
如本文所用，“共表达”是指两种或更多种多核苷酸或基因的表达。基因可以是编码例如单一蛋白质或作为单一多肽链的嵌合蛋白质的核酸。本文描述的SAR(例如，CAR、SIR、zSIR或TCR等)可以由单个多核苷酸链编码并表达为单个多肽链，其随后被切割成不同的多肽，每个多肽代表不同的功能单元。在一些实施方案中，当SAR由两个或更多个功能性多肽单元组成时，不同的功能单元使用一个或多个多核苷酸链共表达。在一个实施方案中，共刺激由与SAR或TCR共表达但不是SAR(例如CAR、SI R、zSIR或TCR等)多肽的组成部分的辅助模块提供。在另一个实施方案中，不同的多核苷酸链通过编码可裂解接头(例如，T2A、F2A、P2A、E2A等)的核酸序列连接(表20)。在另一个实施方案中，还在可裂解接头序列的上游添加Ser-Gly-Ser-Gly(SGS G)基因序列号(SEQ ID NO：1239和1240)以增强切割效率。示例性可裂解接头和弗林氨酸裂解位点的核酸和氨基酸序列提供于表20中。编码SAR不同单元的多核苷酸可以通过IRES(内部核糖体进入位点)序列连接。在一个实施例中，SAR的不同功能单元(例如两个或更多个链)使用单个向量来表达。SAR的不同功能单元可以使用单个启动子或多个启动子来表达。在实施例中，SAR的不同功能单元使用两个或更多个向量来表达。示例性可裂解接头和弗林氨酸裂解位点的核酸和氨基酸序列提供于表20中。
“保守取代”或“保守序列修饰”是指不显著影响或改变所编码蛋白质的结合特征或功能的氨基酸修饰。例如，“保守序列修饰”指不显著影响或改变本公开的SAR的结合特征或功能的氨基酸修饰(例如，在恒定链、抗体、抗体片段或非免疫球蛋白结合域中的保守改变)。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)的氨基酸、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开内容的SAR内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文描述的结合和/或功能测定来测试改变的SAR。
“共刺激胞内信号传导结构域”或“共刺激结构域”或“CSD”是指增强T细胞的增殖、存活和/或发育的SAR部分。本公开的SAR可包括零个、一个或多个共刺激域。每个共刺激结构域包含任何一个或多个TNFR超家族成员，例如CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、BAFF-R、HVEM、CD27、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。另外的示例性共刺激结构域包括2B4、NKp30、NKp44、NKp46、GITR、CD81、CD160、DAP10和B7-H3的信号传导结构域。其它共刺激结构域(例如，来自其它蛋白质)对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施方案结合使用。共刺激结构域可以包含其所衍生的分子的整个细胞内部分、或整个天然细胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。本公开的SAR可包括零个、一个或多个共刺激域。
本文所用的术语“共刺激分子”或“共刺激受体”是指免疫细胞上的同源结合伙伴(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞等)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖、激活或细胞因子分泌。共刺激细胞外分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，有助于有效的免疫反应。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、Dap10、CD27、CD28、CD2、CD5、CD8、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CD81和4-1BB(CD137)。共刺激受体可以在T细胞以外的细胞上表达，例如NK细胞或巨噬细胞。
本文所用的术语“cTCR”指野生型TCR核酸编码序列和与并非衍生自TCR的抗原结合结构域连接的相应野生型TCR蛋白。cTCR已在(Gross，Waks，&Eshha r，1989)中进行了描述。cTCR在一些实施例中被使用并作为参考对照。例如，具有CD19结合结构域和CD19-SIR(包含突变TCR链和CD19结合结构域)的cTCR将具有不同的表达和/或对靶抗原的不同的结合亲和力。
术语“细胞质”或“胞质”是指一种制剂，例如，位于细胞细胞质中成熟形式的的蛋白质。胞质蛋白可以转运到细胞核内，但不是跨膜蛋白，也不会分泌到细胞外。
细胞因子释放综合征(CRS)是细胞疗法(例如SAR-T、双特异性T细胞接合抗体等)的并发症，表现为一系列体征和症状，如发烧、低血压、呼吸急促、肾功能障碍、肺功能障碍和/或毛细血管渗漏综合征。
本文所用的术语“退行性疾病”是指基于细胞退行性变化的持续过程的结果，影响组织或器官，这些变化会随着时间的推移而日益恶化，无论是由于正常的身体磨损还是生活方式选择，如锻炼或饮食习惯。示例性的退行性疾病包括阿尔茨海默病、克雅氏病、糖尿病(II型)和动脉粥样硬化。
本文使用的术语“衍生自”表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不意味着或包含对第一分子是从第二分子衍生过程或来源限制。例如，在抗原结合结构域衍生自抗体分子的情况下，抗原结合结构域保留足够的抗体结构，使其具有所需的功能，即结合抗原的能力。它并不意味包括对产生抗体的特定过程的限制，例如，它并不意味着提供抗原结合结构域，必须从抗体序列开始，并删除不需要的序列，或引入突变，以达到在抗原结合域。
本文使用的术语“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施方案中，二聚化分子并不天然存在于受试者中，或者不以会导致显著二聚化的浓度存在。在实施方案中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如RAD001、Rimiducid或AP20187。Rimiducid可以是约0.01-1mg/kg并且在细胞培养物中具有约0.1nM的EC50。AP20187可以单剂量或多剂量施用约2-10mg/kg/天。
本文所用的术语“与靶抗原的表达相关的疾病”或“如本文所述的疾病相关抗原”包括但不限于与如本文所述的靶抗原的表达相关的疾病或与表达靶抗原的细胞相关的病症。本文所述的抗原，包括例如增殖性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前期病症，例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或骨髓增生性疾病或白血病前期；或与表达本文所述靶抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。
本文所述“遗传修饰细胞靶向的疾病”涵盖本公开内容的遗传修饰细胞以任何方式涉及任何疾病的任何细胞，无论遗传修饰细胞是否靶向患病细胞或健康细胞以实现治疗效益。
本文所用的术语“解离常数(Kd)”定义为受体-配体(例如结合结构域-同源)相互作用解离的平衡常数。在一些实施方案中，本公开内容的SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。
如本文所用，“不同组的非天然存在的免疫受体”或“不同的SAR组”是指多种非天然存在的免疫受体或针对抗原的SAR。在实施例中，不同组的SAR具有连接至不同组信号链或“主链”的相同结合域。在一个实施例中，不同组的SAR可具有不同范围的对靶抗原的结合亲和力。在一个实施例中，不同的SAR组可以表现出不同的表达水平。
如本文所用，“表位”定义为能够引发免疫应答的抗原部分，或结合抗体或抗体片段的抗原部分。表位可以是蛋白质序列或子序列。
如本文所用，术语“接合物”是指能够在免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)和导致免疫细胞激活的肿瘤细胞。接合物包括但不限于双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤细胞接合物(BiK E)、三特异性杀伤细胞接合物(TRiKE)、或多特异性杀伤细胞接合物、或通用杀伤细胞接合物。接合物与多种免疫细胞类型兼容。
本文所用的术语“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
蛋白质(例如SAR、IL-2、IL-15等)的“功能部分”(“生物活性部分”)是指保留全长或成熟蛋白质的一种或多种功能的蛋白质部分。IL-12或IL-15的此类功能包括促进NK细胞存活、调节NK细胞和T细胞活化和增殖以及支持NK细胞从造血干细胞发育。
本文所用的“F(ab)”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个F(ab)片段和Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
如本文所用，“F(ab')2”是指通过胃蛋白酶消化完整IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包含两条单独的氨基酸链，一部分H链和一条轻链(L)通过SS键连接以结合抗原，并且其中剩余的H链部分连接在一起。“F(ab')2”片段可以分成两个单独的Fab'片段。
本文使用的术语“FcRγ”或“FCER1G”或“FCRG”或“FcRy”是指由序列号:2207代表的基因。它是二硫键接头跨膜信号传导适配器，是高亲和力IgE受体和其它Fc受体的一部分。
当关于SAR使用时，术语“功能部分”是指SAR的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为其一部分的SAR(母体SAR)的生物活性。功能部分涵盖例如SAR的那些部分，其保留识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力，其程度与母体SAR相似、相同或更高。就母体SAR而言，功能部分可包括例如母体SAR的约10％、2
5％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
本文使用的术语“柔性多肽接头”指由氨基酸例如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其单独或组合使用以将多肽链连接在一起(例如，将可变重链和可变轻链区连接在一起)。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(例如，SEQ ID NO:2431)，其中n是等于以下的正整数或大于1。例如，n＝1、n＝2、n＝3。n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一种实施方式中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly 4Ser)4或(Gly 4Ser)3。
如本文所用，“基因修饰细胞”、“重定向细胞”、“基因工程细胞”或“修饰细胞”是指表达本公开内容的SAR的细胞。在一些实施方案中，遗传修饰细胞包含编码SAR的载体。在一些实施方案中，遗传修饰细胞包含编码SAR的载体和同一载体中的一种或多种辅助分子(例如，PDL1、PDL2、crmA、MC159等)。在一些实施方案中，遗传修饰细胞包含编码SAR的第一载体和编码辅助分子的第二载体。在一些实施方案中，遗传修饰细胞包含编码SAR的第一载体和编码多于一个辅助分子的第二载体。在一些实施方案中，遗传修饰细胞包含编码SAR的第一载体和编码第一辅助分子的第二载体以及编码第二辅助分子的第三载体。
本文定义的“不依赖于HLA的TCR”或“不依赖于MHC的TCR”是能够不依赖于MHC限制而识别抗原的TCR。在示例性实施方案中，HLA非依赖性TCR可以结合细胞表面上不由MHC复合体呈递的抗原。在一个实施方案中，不依赖于HLA的TCR可以与在细胞表面上表达的抗原结合，而与MHC复合物的呈递无关。不依赖于HLA的TCR可以是天然存在的TCR。在示例性实施方案中，HLA非依赖性TCR是识别MR1(普遍表达的单态抗原呈递分子)的MC.7.G5(MC7G5)。HLA独立的TCR可以是工程化的或重组的TCR。在示例性实施方案中，不依赖于HLA的TCR是工程化的TCR，其可以结合在细胞表面上表达的蛋白质，例如CD19、CD20、间皮素、PSMS或BCMA。工程化TCR可变结构域的方法(例如，CDR移植等)是本领域已知的，并且可用于产生可结合蛋白质(例如，CD19、MSL N、PSMA等)或蛋白质的不依赖于HLA的TCR。表位在细胞外表达，独立于MHC复合体。本公开提供了具有TCR骨架的双特异性、双互补位和多特异性SAR，包括HLA独立的TCR，其包含一种或多种AABD。具有TCR(例如，HLA非依赖性TCR)骨架的本公开的SAR的AABD结构域可以完全是人的、人源化的或非人的。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个人源vH结构域的TCR(例如，HLA非依赖性TCR)。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个完全人vL结构域的TCR(例如，HLA非依赖性TCR)。
本文定义的“不依赖于HLA的TCR可变结构域”是能够以不依赖于HLA的方式结合抗原的TCR的可变结构域。HLA独立可变结构域可以是HLA独立TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的可变结构域。HLA独立的TCR可变结构域可以是单可变结构域TCR(即，svd-TCR)。HLA独立的TCR可变结构域可以是天然存在的HLA独立的可变结构域或工程化的HLA独立的可变结构域。在一个示例性实施方案中，可以使用本领域已知的技术(例如，CDR移植、筛选噬菌体展示库筛选)针对蛋白质的胞外结构域(例如，CD19、CD22、BCMA、MSLN、PSMA)产生工程化的HLA非依赖性可变结构域)。
如本文所用，“HLA限制性”或“MHC限制性”是指需要MHC分子及其肽两者的抗原识别。与“不受HLA限制”或“HLA独立”或“不受MHC限制”的抗原识别不同。
如本文所用，术语“异源基因”是指不在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括将来自一个物种的基因引入另一物种中。异源基因还包括生物体天然的、已以某种方式改变的基因(例如，突变、以多个拷贝添加、连接至非天然调节序列等)。作为另一个实例，异源基因包括在细胞的先前或未来细胞谱系或分化状态中表达的基因。异源基因与内源基因的区别在于，这些DNA序列与染色体中的基因序列没有自然关联，或者与自然界中不存在的染色体部分相关(例如，在基因通常不表达的位点上表达的基因)。
本文使用的“铰链区”(HR)是指位于SAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区域。铰链区包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工间隔区序列或其组合。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链和由多肽制成的人工间隔区，所述多肽可以小至例如IgG的Gly3或CH1和CH3结构域(例如人IgG4)。在一些实施方案中，铰链区是(i)IgG4的铰链区、CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链区和CH2，(iv)铰链区。CD8a的铰链区，(v)IgG1的铰链区、CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区或(vi)IgG1的铰链区和CH2区中的任意一种或多种。本公开的表29中提供了几个示例性铰链区域。其它铰链区域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施例结合使用。
本文所用的术语“免疫病症”是指以免疫系统功能障碍为特征的疾病。自身免疫性疾病是由于对正常身体部位的异常免疫反应而引起的疾病。自身免疫性疾病至少有80种。
本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应，例如促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞和髓源性吞噬细胞。
“免疫效应器功能”或“免疫效应器应答”、“效应器功能”是指分化细胞的专门功能。T细胞或NK细胞的效应器功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。例如，免疫效应器功能或应答是指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T或NK细胞的特性。就T细胞而言，初级刺激和共刺激是免疫效应器功能或应答的例子。在抗原呈递细胞(例如，树突细胞)的情况下，抗原呈递和细胞因子分泌是效应器功能的例子。
本文使用的“免疫应答”是指免疫包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎症反应、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃免疫。
如本文所用“白细胞介素-2”(“IL-2”)和“白细胞介素-15”(“IL-15”)是指调节T细胞和NK细胞活化和增殖的细胞因子。这些细胞因子具有许多共同的生物活性。人们发现它们结合共同的受体亚基，并可能竞争相同的受体，从而负向调节彼此的活性。多种IL-2和IL-15分子的序列是本领域已知的。一方面，IL-2是野生型IL-2或其具有70-99.9％氨基酸序列同源性的变体(例如SEQ ID NO：7833-7837)。一方面，IL-15是野生型IL-15或其具有70-99.9％氨基酸序列同源性的变体(例如SEQ ID NO：7838-7841)。在一些方面，IL-2是哺乳动物IL-2。在一些方面，IL-15是哺乳动物IL-15(例如，人类白细胞介素15(IL15)，转录物变体3，mRNA，NCBI参考序列：NM_000585.4；狗科动物白细胞介素15(IL15)，mRNA，NCBI参考序列：NM_001197188.1；猫科动物白细胞介素15(IL15)，mRNA，NCBI参考序列：NM_001009207.1)。在具体方面，IL-2或IL-15的全部或部分功能与跨膜蛋白的全部或部分相关联。一方面，NK细胞或T细胞表达融合蛋白，其包含与全部或部分跨膜蛋白融合的全部或部分IL-2或IL-15。在特定的方面，跨膜蛋白的部分包含跨膜蛋白的跨膜结构域的全部或一部分。
本文使用的术语“细胞内信号传导结构域”(野生)或“激活结构域”是指分子的细胞内信号传导部分。细胞内信号传导结构域产生促进细胞免疫效应功能的信号。免疫效应器功能的例子包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。转导效应功能信号的结构域的例子包括但不限于T细胞受体复合物的z链或其任何同源物、人CD3 zeta链、CD3多肽(γ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及其它参与T细胞转导的分子，如CD 2、CD5和CD28。其它细胞内信号传导结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施例结合使用。
在另一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可包含“初级细胞内信号传导结构域”或“激活结构域”。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些结构域。在另一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些信号传导结构域。例如，初级细胞内信号传导结构域可包含CD3z的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可包含来自共受体或共刺激分子例如CD28或41BB的细胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可包含称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号序列的ITAM的例子包括但不限于衍生自CD3-zeta、常见FcRγ(FCER1G或FcRγ或FCRG)、FcγRIIIa、FcRβ(FcEpsilonR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
本文使用的术语“分离的”是指基本上不含其它材料的分子或生物材料或细胞材料。一方面，本文所用的术语“分离的”是指与其它DNA分离的核酸，例如DN A或RNA，或蛋白质或多肽(例如，抗体或其衍生物)，或细胞或细胞器，或组织或器官。天然来源中存在的RNA、蛋白质或多肽、细胞或细胞器、组织或器官。本文所用的本文所用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括非天然存在的片段并且在天然状态下不会发现的核酸片段。本文所用的术语“分离的”在本文中也用于指从其它细胞蛋白中分离的多肽，并且旨在涵盖纯化的和重组的多肽。本文所用的术语“分离的”在本文中还用于指与其它细胞或组织分离的细胞或组织，并且意在涵盖培养的和工程化的细胞或组织。
“长接头”或“长接头结构域”是长度在25至500个氨基酸之间的接头。在一个实施方案中，长接头是约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、450、500个氨基酸和任意数目之间的长度。在一个实施方案中，长接头的长度为25至125个氨基酸。在一个实施方案中，长接头的长度在50至150个氨基酸之间。在一个实施方案中，长接头的长度在75至175个氨基酸之间。在一个实施方案中，长接头的长度在100至200个氨基酸之间。在一个实施方案中，长接头的长度在120至220个氨基酸之间。在一个实施方案中，长接头的长度在100至300个氨基酸之间。
在一个实施方案中，接头编码或包含免疫球蛋白(Ig)结构域或类似Ig结构域或其片段。本文所用的术语“Ig结构域”、“Ig接头结构域”、“类似Ig结构域”或“类似Ig接头结构域”在本公开中可互换使用。免疫球蛋白结构域是一种蛋白质结构域，由7-9条反向平行β链组成的2层夹层组成，这些β链以希腊键拓扑排列在两个β折叠中，由约125个氨基酸组成。Ig结构域可分为IgV、IgC1、IgC2或IgI。具有9个β链的IgV结构域通常比具有7个β链的IgC结构域更长。在一个实施方案中，接头包含IgV结构域或其片段。在一个实施方案中，接头包含IgC结构域或其片段。Ig结构域存在于免疫球蛋白、T细胞受体链、I类MHC、II类MHC、β2微球蛋白、辅助受体(例如CD4、CD8、CD19等)、抗原受体辅助分子(例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a)中，CD79b)，共刺激或抑制分子(例如，CD28，CD80，CD86)，NK细胞受体(例如，KIR)，白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)，IgSF CAM(例如，NCAM，ICAM，CD2等)，细胞因子受体(例如，IL-1R、CSF-1R等)、生长因子受体(例如，PDGFR)、受体酪氨酸激酶和磷酸酶、Ig结合受体、细胞骨架蛋白(例如，titin、palladin等)和其它蛋白质(例如，、CD147、CD90等)。示例性的Ig接头结构域是IgCL(SEQ ID NO:3536)和IgGl-CH1(SEQ ID NO:3537)。另外的示例性Ig接头呈现于表13中(SEQ ID NO(PRT)：3538-3569)。接头具有一个E set结构域。E set结构域是可能与免疫球蛋白和/或纤维连接蛋白类型III超家族相关的“早期”类似Ig折叠家族之一。在一个实施方案中，接头具有纤连蛋白III型结构域。
在某些实施例中，本文所述的SAR包括一个Fv样或Fc-TCR抗原结合模块，包括a)第一多肽链，其中包括第一个抗原结合域，该域包括vL、Vα或Vγ结构域，以及b)第二多肽链，其中包括第二抗原结合域，该域包括vH、Vβ或Vδ结构域。在某些实施例中，第一个肽接头与vL、Vα或Vγ结构域的C-端融合，以及/或第二个肽接头与vL、Vα或Vγ结构域的C-端融合。在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头能够彼此结合。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头衍生自免疫球蛋白重链和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含CH3抗体结构域或其变体。在一些实施方案中，肽接头中包含的免疫球蛋白重链恒定结构域(例如，CH1或CH3)衍生自IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、Ig M或IgE重链，任选地是人的。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头衍生自TCR亚基恒定区。例如，在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头衍生自a)TCRα和β亚基恒定结构域；或b)TCRγ和δ亚基恒定域。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头是合成的。在一些实施方案中，所有vL、Vα或Vγ和vH、Vβ或VδCDR均衍生自相同的抗体或TCR部分。在一些实施方案中，vL抗体结构域和vH抗体结构域包含衍生自多于一种抗体部分的抗体CDR。在一些实施方案中，vL抗体结构域包含衍生自vH抗体结构域的抗体CDR和/或vL抗体结构域包含衍生自vH抗体结构域的抗体CDR。在一些实施方案中，vL抗体结构域包含衍生自一种抗体的框架区和衍生自另一种抗体的一个或多个CDR，和/或vH抗体结构域包含衍生自一种抗体的框架区和衍生自另一种抗体的一个或多个CDR。在一些实施方案中，Vα结构域和Vβ结构域包含衍生自多于一种TCR的TCR CD R。在一些实施方案中，Vα结构域包含衍生自VβTCR结构域的CDR和/或Vβ结构域包含衍生自Vα结构域的CDR。在一些实施方案中，Vα结构域包含衍生自一种TCR的框架区和衍生自另一种TCR的一个或多个CDR，和/或Vβ结构域包含衍生自一种TCR的框架区和衍生自另一种TCR的一个或多个CDR。在一些实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域包含衍生自多个TCR的TCR CDRs。在一些实施方案中，Vγ结构域包含衍生自VδTCR结构域的CDRs和/或Vδ结构域包含衍生自Vγ结构域的CDR。在一些实施方案中，Vγ结构域包含衍生自一种TCR的框架区和衍生自另一种TCR的一个或多个CDR，和/或Vδ结构域包含衍生自一种TCR的框架区和衍生自另一种TCR的一个或多个CDR。在一些实施方案中，第一和第二多肽链例如通过共价键(例如肽或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域通过二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头通过二硫键连接。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头是与其所衍生的序列相比包含一个或多个修饰(例如，氨基酸取代、插入和/或删除)的变体。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含基本上不改变它们彼此的结合亲和力的一个或多个修饰。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含一个或多个修饰，所述修饰增加它们彼此的结合亲和力和/或引入非天然存在的二硫键。在一些实施方案中，第一和第二肽接头包含旋钮-入-孔修饰(参见，例如，Carter P.ImmunolMet hods.248:7-15，2001)。在一些实施方案中，第一和第二肽接头通过静电操纵进行修饰以增强它们彼此的缔合(参见，例如，WO2006106905和Gunasekaran K等人，J Bi ol Chem.285:19637-46，2010)。在一些实施方案中，Fv样或TCR-Fv样抗原结合模块是人的、人源化的、嵌合的、半合成的或全合成的。
一个示例性SAR构建体，包含IgCL和IgGl-CHl接头，由以下序列表示：CD 8SP-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-DAP10-opt1-Spe-CD3zCP-opt1-F-P2A-dSPE-IgSP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-DAP10-opt2-Xba-CD3zCP-opt2-F-F2A-dXBA-Nde-K13-opt(SEQID NO:5869)。该构建体中的IgGl-CHI接头(SEQ ID NO(DNA):1143，SEQ ID NO(PRT):3537)可以被表13中所示的其它类似Ig接头替换，例如Ig G2-IC-CHI1、IgG3-CHI1、IgG4-CHI1、IgAI-CHI1、IgA2-CHI1、IgD-CHI1、IgE-CHI1或IgM-CHI1。IgCL和IgG1-CH1接头也可以分别被来自于TCRα和TCRβ的类似Ig接头替代(表13)。或者IgCL和IgG1-CH1接头也可以被来自于TCRγ和TCRδ链的类似Ig接头替代(表13)。
如本文所用术语“配体”是指与受体结合的分子。特别是，配体结合另一个细胞上的受体，从而允许细胞间识别和/或相互作用。
如本文所用术语“接头”(也称为“接头结构域”或“接头区域”)是指将SAR多核苷酸的两个或更多个结构域或区域连接在一起的寡核苷酸或多肽(或编码该多肽的寡核苷酸)，或分别在本文中公开的多肽。连接体的长度可以是1至500个氨基酸或3至1500个核苷酸。在一些实施方案中，“接头”是可裂解的或不可裂解的。除非另有说明，本文使用的术语“接头”是指不可切割的接头。所述不可裂解接头可以由允许相邻蛋白结构域相对于彼此自由运动的柔性残基组成。此类残基的非限制性实例包括甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，接头包括非柔性残基。可裂解接头的实例包括2A接头(例如T2A)、类似2A接头或其功能等同物及其组合。在一些实施方案中，接头包括小核糖核酸病毒类似2A接头、猪睾丸病毒(P2A)、Thata asigna病毒(T2A)或其组合、变体和功能等价物的CHYSEL序列。在一些实施方案中，接头序列可包含导致2A甘氨酸和2B脯氨酸之间裂解的基序(参见例如T2A序列)。几个示例性可裂解接头的核酸序列提供于SEQ ID NO:1233至SEQ ID NO:1238中，并且几个示例性接头的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:3627至SEQ ID NO:3632中。本领域技术人员容易理解在此使用的其它可切割连接物。接头模块还指表13中列出的TCR和抗体接头。
在一个实施方案中，还在可裂解接头序列的上游添加Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG)基序(SEQ ID NO：3633)以增强切割效率。可裂解接头的一个潜在缺点是，留在N端蛋白质末端的小2A标签可能会影响蛋白质功能或有助于蛋白质的抗原性。为了克服该限制，在一些实施方案中，在SGSG基序的上游添加呋喃裂解位点(RAKR)(SEQ ID NO：3635)以促进翻译后残余2A肽的裂解。
本文所用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，它能够感染非分裂细胞。它们可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。
本文所用的术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人提供的自失活慢病毒载体。摩尔。瑟尔。17(8)：1453-1464(2009)。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于例如来自Oxfo rd BioMedica的LENTIVECTOR基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的并且是本领域技术人员已知的。慢病毒载体的其它实例是pLENTI-EF1a(SEQ ID NO:1)、pLENTI-EF1a-DWPRE(SEQ ID NO:2)、pCCLc-MNDU3-WPRE(SEQ ID NO:4)和pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE(SEQ ID NO：5)。在一个示例性实施方案中，编码SAR、或SAR加附加模块、或附加模块的核酸片段可以克隆在存在于pLENTI-EF1α和pCCLc-中的NheI和Sal I位点之间。使用本领域已知的方法构建MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE载体。
本文使用的“杀伤细胞免疫球蛋白样受体”或“KIR”是指由自然杀伤细胞和T细胞亚群表达的跨膜糖蛋白家族。
如本文所使用的“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何成员。
“标记基因”编码靶细胞通常不表达的蛋白质，从而可以识别成功的转导。标记基因还可用于选择性去除或富集转导细胞(例如，表达SAR的细胞)。示例性标记基因包括tEGFR、CD20、tCD19、tBCMA和RQR8。
“多用途开关”或“多用途基因”编码提供自杀、生存和标记功能的蛋白质。在一个实施方案中，所有上述功能均由单个多肽链提供。示例性多用途开关包括IL2-tBCMA、IL15-tBCMA、IL2-RQR8和IL2-tHer2等。
本文所用的“模拟表位”是大分子，通常是肽，其模拟表位的结构。由于这一特性，它会引起类似于表位引发的抗体反应。针对给定表位抗原的抗体将识别模拟该表位的模拟表位。拟表位是一种肽适体。
本文所用的术语“多链合成抗原受体”“多链SAR”是指包含两条以上多肽链的合成抗原受体。多链SAR可以是双链SAR。双链SAR包含两个膜相关结构域(例如跨膜或膜锚定结构域)。靶向CD19的示例性多链SAR是CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-Spe-SP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO(DNA):5451和SEQ ID NO(PRT):6283)。在此SAR构建体中，hu-mROO5-1 vL片段可操作地连接至CD16-F158V-FL-TMCP-v1模块，而hu-mROO5-1-vH片段可操作地连接至CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3。该SAR的两条链由Furine(F)和P2A可裂解接头序列分开。该SAR构建体还表达嘌呤霉素抗性基因(PAC)，该基因通过Furine(F)和F2A可裂解接头序列与SAR多肽分开。由于SAR采用模块化设计，CD16A-F158V-S197P-FL-v3模块和CD16-F158V-FL-TMCP-v1模块可以替换为其它信令模块，以生成具有不同信令链的SA R。此外，hu-mROO5-1 vL和hu-mROO5-vH片段可以被靶向其它抗原的抗原结合结构域(例如，vL、vH、vHH、FHVH、centyrin、svd-TCR等)替换，以产生靶向不同抗原的SAR。临时适用的表41中提供了示例性的多链SAR。(例如，SEQ ID NO：5451-5462、5483-5494、5515-5526、5547-5558、5579-5590、5611-5622、5643-5654等)。可以使用本公开中描述的方法测试这些新型SAR的表达和活性，以选择具有最佳功能活性的SAR。
如本文所用“MHC”或“主要组织相容性复合体”是指哺乳动物中由大量基因编码的细胞表面分子。MHC分子包括I类和II类。I类分子在人类中也被称为“HLA”或“人类白细胞抗原”。部分由于HLA分子表达的复杂性，HLA也可称为HL A系统。人类表达HLA-A、HLA-B和HLA-C分子，这些分子通常参与将加工的抗原呈递给CD8细胞，即HLA限制性的过程。II类分子，例如DR、DQ、DP等，通常涉及将外部衍生的肽呈递给CD4+细胞，即MHC II类限制的细胞。MHC限制一般包括I类和II类，如移植(骨髓)匹配。
本文所用的“天然的”或“自然发生的”或“内源性的”是指细胞天然的或在细胞中自然表达的基因、蛋白质、核酸(例如DNA、RNA等)或其片段。因此，T细胞的天然或内源性TCRα链多肽由一个与TCRα恒定链连接的可变结构域(Vα)组成。天然或内源性TCRα链前体多肽也由从成熟多肽中切割出来的氨基末端信号肽组成。
如本文所用，“天然受体”或“天然存在的受体”或“内源受体”或“天然受体”是指自然界中存在的并且包含抗原结合结构域或配体结合结构域的任何受体。如本文所用的术语包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。如果天然受体能够在与其靶标结合后传递细胞信号，则它可以是“天然信号传导受体”或“天然存在的信号传导受体”。天然存在的受体或天然受体是细胞天然的或在细胞中天然表达的。天然存在的信号传导受体或天然受体的实例包括但不限于CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、NKG2D等。出于公开的目的，CD3信号传导链(CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3z)不包含在“天然存在的受体”的定义中，而是被归类为信号传导适配器。
如本文所用术语“非TCR天然存在的受体”或“非TCR天然存在的信号传导受体”或“非TCR受体”或“非TCR信号传导受体”是指不是T细胞受体(TCR)的受体。非TCR受体可以在T细胞以外的细胞中表达。非TCR受体可以在缺乏CD3δ、CD3ε、CD3δ和/或CD3γ链表达的细胞中表达。“非TCR天然存在的受体”缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的跨膜结构域和/或胞质结构域。“非TCR天然存在的受体”不会招募整个TCR信号模块。在一个实施方案中，“非TCR天然存在的受体”不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα多肽。在一个实施方案中，“非TCR天然存在的受体”不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的整个编码区。在一个实施方案中，“非TCR天然存在的受体”不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的完整恒定链。在一个实施方案中，“非TCR天然存在的受体”不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的整个铰链结构域(或连接肽)。在一个实施方案中，“非TCR天然存在的受体”不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的整个跨膜结构域和胞质结构域。非TCR受体可以在T细胞以外的细胞中表达。“非TCR信号传导受体”可以包含TCR的片段，例如TCR可变结构域(例如，Vα、Vβ、Vγ、Vδ)或Ig结构域(例如，SEQ ID：1158-1175)。非TCR信号传导受体不包含整个TCR恒定链(即TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的恒定链)。
如本文所用，术语“非T细胞受体模块”或“非TCR模块”或“非TCR信号传导模块”或“NTCRM”是指缺少由T细胞受体跨膜结构域组成的序列的模块，并且还可以缺乏全部或部分T细胞受体连接肽和/或胞内结构域。NTCRM缺乏由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα跨膜结构域组成的序列。NTCRM还可缺少TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的全部或部分连接肽和/或细胞内结构域。
如本文所用，术语“非CD3适配器模块”或“非CD3适配器”或“非TCR/CD3适配器”或“非TCR/CD3信号传导适配器”或“NCAM”是指信号传导适配器它不是T细胞受体/CD3受体复合物的组成部分。在一个实施方案中，“非TCR/CD3适配器”不包含CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3δ链或其变体的跨膜区和/或胞质区。
本文所用的术语“N末端附近”是指N末端30个氨基酸内。例如，术语“可操作地连接至vL和/或vH结构域的N端或靠近N端的AABD”是指可操作地连接于vL或vH片段的N端的AABD或可操作地连接至N端2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、25或30个氨基酸，包含vL或vH结构域。类似地，术语“可操作地连接至Va和/或Vb结构域的N端或靠近N端的AABD”是指可操作地连接于Va或Vb片段的N端的AABD，或可操作地连接至N端2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23包含Va或Vb结构域的24、25或30个氨基酸。本公开内容的AABD可以直接或经由间插接头序列可操作地连接至另一结构域的N末端或附近。
如本文所用“自然杀伤细胞受体”或“NK受体”是指在自然杀伤(NK)细胞中表达的细胞表面受体，并且包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。NK受体可以是激活受体或抑制受体。示例性的活化NK受体包括NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和KIR3DS4。示例性抑制性NK受体包括CD94-NKG2A、TIGIT和CD96。
如本文所用，“自然杀伤细胞”(“NK细胞”)是指免疫系统的一类细胞毒性淋巴细胞。
如本文所用，“NKp30”或“NCR3”是编码作为天然细胞毒性受体(NC R)的蛋白质的基因(序列号：259197)，其可以帮助NK细胞裂解肿瘤细胞。如本文所用的术语包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。
如本文所用，“NKp44”或“NCR2”是编码作为天然细胞毒性受体(NC R)的蛋白质的基因(序列号：9436)。如本文所用的术语包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。
如本文所用，“NKp46”或“NCR1”是编码作为天然细胞毒性受体(NC R)的蛋白质的基因(序列号：9437)。已发现该基因编码不同亚型的五种转录变体。如本文所用的术语包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。
如本文所用，“NKG2D”或“KLRK1”是编码C型凝集素成员的蛋白质的基因(序列号：22914)。编码的跨膜蛋白的特征在于II型膜方向(具有细胞外C末端)和C型凝集素结构域的存在。如本文所用的术语包括来自其它哺乳动物物种的功能变体、同种型和同系物。
如本文所用，“非天然存在的试剂”或“非天然的”或“外源的”是指不在细胞中天然表达的试剂。换句话说，非天然存在的试剂被“工程化”以在细胞中表达。非天然存在的试剂可以是天然存在的试剂的克隆版本。示例性的非天然存在的试剂包括SAR(例如，CAR、SIR、Ab-TCR、TFP、重组TCR)。可以使用本领域已知的基因转移技术，例如慢病毒或逆转录病毒介导的基因转移，将非天然存在的试剂表达到细胞中。非天然存在的试剂可以使用外源启动子(例如，EF1α启动子)或内源启动子(例如，TCRα或TRAC启动子)在免疫细胞中表达。当内源基因(例如CD16、NKp30等)被克隆并在细胞中异位表达时，它代表了非天然存在的试剂的另一个例子。
如本文所用，“非天然存在的免疫受体”或“外源免疫受体”“非天然存在的受体”是指在免疫细胞中不天然表达的免疫受体。换句话说，非天然存在的免疫受体被“工程化”以在免疫细胞中表达。非天然存在的免疫受体可以是天然存在的免疫受体的克隆版本。或者，非天然存在的免疫受体可以是使用重组分子生物学技术产生的嵌合受体。示例性的非天然存在的免疫受体是SAR(例如，第二代CAR、SIR、cTCR、STAR、zSIR、Ab-TCR、TFP和重组TCR)。
如本文所用，“非天然存在的TCR抗原结合结构域”或“外源TCR抗原结合结构域”是指与天然存在的TCR嵌合且非天然存在的TCR恒定区可操作连接的结合结构域。换句话说，使用重组分子生物学技术“工程化”非天然存在的TCR抗原结合结构域以可操作地连接至TCR，并且此外，抗原结合结构域从不同于TCR的分子获得或衍生在自然界中发现的。本质上不同于TCR的抗原结合结构域包括抗体vH和vL片段、人源化抗体片段、嵌合抗体片段、受体配体等。
如本文所用，“非天然存在的抗原结合结构域”或“非天然存在的胞外抗原结合结构域”或“异源抗原结合结构域”是指不是天然存在的受体的一部分的抗原结合结构域。换句话说，非天然存在的抗原结合结构域是使用重组分子生物学技术“工程化”的，以可操作地连接至天然存在的信号传导受体，并且此外，抗原结合结构域是从不同于天然存在的信号受体的分子获得或衍生的。自然界中发现的信号受体。示例性异源抗原结合结构域包括抗体、抗体片段(例如，vL、vH、scFv、Fab、F(ab)2等)、单结构域抗体(例如，sVH、FHVH、vHH等)、非免疫球蛋白抗原结合结构域、单可变结构域TCR(svd-TCR)、重组TCR、HLA独立TCR、scTCR、表位、适配器、配体和受体。
如本文所用的术语“可操作地连接”或“功能性地连接”或“可操作地连接”是指第一组件和第二组件之间的功能性连接或关联，使得每个组件是有功能的。例如，可操作地连接包括调节序列和异源核酸序列之间的缔合，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。在可操作地连接的两个多肽的情况下，第一多肽以其独立于任何连接的方式起作用，而第二多肽以其在两者之间不存在连接的方式起作用。当在本公开内容的SAR的不同结构域的上下文中使用时，如本文所用的术语“可操作地连接”是指通过共价键(例如，肽键或非肽化学键)连接的结构域。在示例性实施方案中，包含可操作地连接至CD16A胞外结构域的N端的异源抗原结合结构域(例如，CD19 scF v)的SAR是指由包含以下的核酸序列编码的SAR多肽：CD19 scFv与编码CD16A胞外、跨膜和胞质结构域的核酸序列框内融合。在一个实施方案中，SAR多肽的不同结构域之间的操作连接通过肽键实现。然而，在某些实施方案中，SAR的不同结构域可以通过非肽键例如二硫键或通过化学缀合等连接。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，“百分比同一性”是指两个或更多个相同的序列。如果两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，60％同一性，任选70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％在指定区域上的同一性，或者，当未指定时，在整个序列上的同一性)，当在比较窗口上进行比较和比对以获得最大对应性时，或使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量的指定区域。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更典型地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域。酸)的长度。
可用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个示例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法分别在Altschul等人发表在(1977)Nuc.Acids Re s.25：3389-3402和(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的论文中进行了描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
两个氨基酸序列之间的相似度百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller发表于(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)的算法确定，这一算法通过使用PAM 120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4，并已纳入ALIGN程序(2.0版)。
表B列出了靶抗原的非限制性实例。本公开内容的SAR可以直接或通过本文所述的SAR适配器结合表B中列出的一种或多种(例如，2、3、4、5或更多种)靶抗原。
表B
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本公开内容的SAR包含特异性结合至包含衍生自疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原或病毒编码抗原；例如衍生自NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A4、WT1、突变型Ra s、HPV16的肽的复合物-E7、EBV-LMP2A、AFP、gp100、PSA、突变体p53、HIV-1等)和MHC I类蛋白，其中MHC I类蛋白为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-B。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-C。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A 10、HLA-A11、HLA-A 19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74或HLA-A80。在一些实施方案中，MHCI类蛋白是HLA-A02。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A*02:01-555中的任一种，例如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HL A-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A*02：10，HLA-A*02：11，HLA-A*02：12，HLA-A*02：13，HLA-A*02：14，HLA-A*02：15，HLA-A*02：16、HLA-A*02：17、HLA-A*02：18、HLA-A*02：19、HLA-A*02：20、HLA-A*02：21、HLA-A*02：22，或HLA-A*02:24。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A*02:01。HLA-A*02:01在所有白种人中的39-46％中表达，因此代表了用于本公开内容的MHC I类蛋白的合适选择。
本公开内容的SAR包含特异性结合至包含衍生自疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原或病毒编码抗原)的肽(例如衍生自NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A4、WT1、突变体Ras的肽，HPV16-E7、EBV-LMP2A、AFP、gp100、PSA、突变体p53、HIV-1等)和MHC II类蛋白，其中MHC II类蛋白是HLA-DP、HLA-DQ或HLA-博士。
本公开内容的SAR还可以结合包含衍生自疾病相关抗原的肽和来自其它物种(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、猴等)的MHC I类或II类蛋白的复合物。
如本文所用术语“受体”是指存在于细胞膜上的选择性结合一种或多种配体的多肽或其部分。
本文所用术语“区域”或“部分”当用于指代核酸分子时是指小于分子全长的一组连接的核苷酸，例如本文所述的CD3ze信号传导区。
本文所用的术语“逆转录病毒载体”是指衍生自逆转录病毒基因组的至少一部分的载体。逆转录病毒载体的实例包括MSCVneo、MSCV-pac(或MSCV-puro)、MSCV-hygro，可获自Addgene或Clontech。
本文所用术语“SAR”或“合成抗原受体”包括常规CAR(例如，包含41BB或CD28共刺激结构域和CD3z激活结构域的第二代CAR)并且还涵盖赋予细胞抗原特异性的更新方法，例如如抗体-TCR嵌合分子或Ab-TCR(WO 2017/070608 A1通过引用并入本文)、TCR受体融合蛋白或TFP(WO 2016/187349 A1通过引用并入本文)、合成免疫受体(SIR)(参见WO 2018/102795 A1，通过引用并入本文)、STAR(参见WO 2020/029774)、HLA非依赖性TCR(参见，WO2019157454A1)、三功能T细胞抗原偶联剂(Tr i-TAC或TAC)(参见，WO 2015)/117229A1，通过引用并入本文)和zSIR(参见，PCT/US2019/035096，通过引用并入本文)。双特异性和多特异性CAR已在PCT/US2021/022641中描述。如本文所用的术语“SAR”涵盖CAR以及其它抗原结合受体，包括但不限于重组TCR。
通常，本文所用的术语“SAR-T”来指代经过工程改造以表达合成抗原受体的T细胞。因此，携带这种SAR的T淋巴细胞通常被称为SAR-T淋巴细胞。SAR还可以在T细胞以外的细胞中表达，例如造血干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、NK细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中，SAR在永生化细胞系中表达，例如NK92、NK92MI或其衍生物。如本文所用的如本文所用的术语“SAR-NK”是指经过改造以表达SAR的NK细胞。
通常，本文所用的术语“SAR-T”来指已被工程化以表达合成抗原受体的T细胞(例如，αβT细胞、γδT细胞、Treg、TIL等)。因此，携带这种SAR的T淋巴细胞通常被称为SAR-T淋巴细胞。SAR还可以在T细胞以外的细胞中表达，例如造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、粒细胞、树突状细胞、细胞因子在一些实施方案中，SAR在永生化细胞系中表达，例如NK92、NK92MI或其衍生物。术语“SAR-NK”是指经过改造以表达SAR的NK(自然杀伤)细胞。
本文所用的本文所用的术语“睡美人转座子”或“睡美人转座子载体”是指衍生自睡美人转座子基因组的至少一部分的载体。
本文所用的术语“TCR恒定链”或“T细胞受体恒定区”定义为TCRα/TCR a、TCRβ1/TCRb1、TCRβ2/TCRb2、TCRγ/TCRd、TCRδ/TCRd和前TCRα的恒定链。示例性TCR恒定链列于表12中。TCR恒定链可分为几个子结构域，例如类似IgC1结构域(例如SEQ ID NO：11 68-1175；表13)、连接肽(例如SEQ ID NO：11 7 7-118 4；表14)、跨膜结构域(SEQ ID NO：1187-119 0；表15)和胞质结构域(例如SEQ ID NO：11 9 3-11 96；表16)。TCRα、TCRβ1/β2、TCRγ和TCRδ链的胞质结构域很短，通常不认为在其信号传导活动中发挥任何重要作用。本公开内容还提供了TCR链的示例性缺失突变体和变体(表12)。这些缺失突变体和变体可用于构建SAR，只要它们保留原始TCR链的一种或多种功能和生物学特性，例如与互补TCR链配对的能力、与TCR链组装的能力TCR/CD3复合物以及当与靶抗原表达细胞接合时传递T细胞信号(例如，激活NFAT途径)的能力。
本文所用的术语“单链可变区”或“scFv”是指包含至少包含一个轻链可变区的抗体片段和至少包含一个重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区例如通过合成接头例如短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，本文所用的scFv可以具有任一顺序的vL和vH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含vL-Linker-vH或可以包含vH-Linker-vL。在本公开中，scFv也被描述为vL-Gly-Ser-Linke r-vH。或者，scFv也被描述为(vL+vH)或(vH+vL)。
本文使用的术语“特异性结合”或“特异性针对”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其在存在靶标的情况下决定靶标的存在。异质分子群，包括生物分子。在一些实施方案中，特异性结合抗原的SAR或抗原结合结构域与抗原的一种或多种抗原决定簇(例如细胞表面抗原或肽/MHC蛋白复合物)反应，其结合亲和力至少为其对其它靶标的结合亲和力约为其10倍。
如本文所用的术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能区域，其在细胞内传递信息以通过确定的信号传导途径通过产生第二信使或通过响应此类信使而充当效应子来调节细胞活性。
本文所用的术语“信号传导模块”是指包含一种或多种信号传导介体或信号传导适配器的分子或分子复合物，其能够启动细胞信号。细胞信号可包括但不限于细胞信号传导途径的激活，例如NFAT、AKT、STAT或NF-κB途径。在一个示例性实施方案中，信号传导模块募集一种或多种基于酪氨酸的激活基序(ITAM)的具有细胞质免疫受体蛋白质，ITAM是信号传导复合物的一部分。例如，TCR相关信号传导模块示例性地，在NK细胞中操作的信号传导模块包括信号传导适配器，例如CD3z、FcRγ、DAP10和DAP12。
本文所用的术语“信号传导介体”或“信号传导适配器”是指当被天然或非天然信号传导受体募集时能够启动或抑制细胞信号的分子。与信号传导受体相反，信号传导适配器缺乏自己的抗原结合结构域或配体结合结构域。示例性信号传导适配器包括CD3z(CD3z)、FcRγ、DAP10、DAP12、CD3ε、CD3γ和CD3δ。在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其中一个或多个异源抗原结合结构域可操作地连接至信号传导适配器的一条或多条链的铰链结构域或跨膜结构域。在一个实施方案中，SAR包含作为TCR复合物的组分的信号传导适配器(例如，CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3ε等)。在一个实施方案中，SAR包含与TCR复合物的TCRα、β、γ和/或δ链相互作用的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含不与TCR复合物的TCRα、β、γ和/或δ链相互作用的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含跨膜结构域中具有保守天冬氨酸残基的信号传导适配器(例如，CD3ζ)，其与TCRα/β跨膜区域中的带正电的残基相互作用。在一个实施方案中，SAR包含在其跨膜结构域中缺乏保守的天冬氨酸残基的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含不是TCR复合物的组分的信号传导适配器(例如，DAP10)。在一个实施方案中，SAR包含激活细胞信号传导的信号传导适配器(例如，CD3ζ)。在一个实施方案中，SAR包含抑制细胞信号传导的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含具有一个或多个ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含具有两个或更多个ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含具有单个ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SA R包含缺乏ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其是其天然形式的二硫键接头二聚体。在一个实施方案中，信号传导适配器不是其天然形式的二硫键接头二聚体。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其在其天然状态下含有位于其跨膜区的链间二硫键。在一个实施方案中，SAR包含处于其天然状态的信号传导适配器，其含有不位于其跨膜区的链间二硫键。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其在其天然状态下含有位于其胞外区的链间二硫键。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域的长度小于10个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度小于8个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度超过10个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度超过15个氨基酸。在一个实施方案中，SAR包含诱导蛋白质磷酸化的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含诱导蛋白质去磷酸化的信号传导适配器。在一个实施例中，SAR包含与Zap70相互作用的信号传导适配器。在一个实施例中，SAR包含不与Zap70相互作用的信号传导适配器。在一个实施例中，双链SAR的两条链包含相同的信号传导导适配器(例如，CD3z和CD3z)。在一个实施方案中，双链SAR的两条链包含不相同的信号传导适配器(例如，CD3z和FcRγ或CD3z和DAP10等)。
本文所用的术语“信号传导链”或“信号传导片段”是指包含细胞信号传导受体的跨膜区和/或胞内区以及任选的胞外铰链/连接肽区的多肽。示例性信号链包括TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ恒定链。另外的示例性信号链包括包含CD16、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12、DNAM-1、NKG2D、CD32、CD64、KIR3DL1、KIR2DS 4、FcRγ和CD3z的跨膜区和/或胞内区的链。在一些实施方案中，信号链还包含CD 16、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12、DNAM-1、NKG2D、CD32、CD64、KIR3DL1、KIR2DS4、FcRγ和CD3z的铰链结构域或连接肽。
本文所用的术语“合成抗原受体”或“SAR”是指非天然存在的受体或可以在细胞表面上表达的合成受体，并且包含至少一个异源抗原结合结构域和至少一个膜相关结构域，其中膜相关结构域可以是跨膜结构域或膜锚定结构域(即GPI连接结构域)。SAR的抗原结合结构域与其膜相关结构域是异源的，即抗原结合结构域与膜相关结构域衍生自不同的来源。SAR还可包含铰链结构域、胞外配体结合结构域和/或胞质结构域。在一个实施方案中，SAR包含多肽或一组多肽，当其在效应细胞中表达时，为细胞提供对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。SAR可以是单链、两条链或多于两条链。SAR可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。SAR可以具有一个或多个异源抗原结合结构域。本文所用的术语“SAR”包括常规嵌合抗原受体(例如，第二代CAR)和下一代CAR(例如，SIR、cTCR、AbTCR、zSIR、HIT、TF P、TAC等)。本公开描述了新颖的SAR组合物，其包含衍生自CD16A、CD16B、CD64、CD 32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS 5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Sigle c3、Siglec-7、Siglec-9、CD3z、DAP10、DAP12、FcRγ、TCRαβ和TCRγδ等及其变体和片段的一个或多个区域。本公开还提供了包含上述基因和/或蛋白质的功能变体的SAR，包括来自其它物种的可变剪接同种型和同源物。临时申请的表12-18和25-31中提供了可用于构建本公开的SAR的上述基因和蛋白质的示例性区域或片段。天然受体的示例性胞外结构域提供于SEQ ID NO：10842-10877中。SAR还可以用与表12-18中提供的任何片段具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的多肽或片段构建。临时申请的第25-31条。表2-11中提供了可用于构建SAR的示例性附加组分(例如vL、vH、scFv、vHH等)的核酸和氨基酸序列。SAR还可以用与表2-18和25-31条中提供的任何具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的多肽或片段构建。本公开的示例性SAR在临时申请的表32-34中提供。SAR采用模块化设计，可以通过将SAR的一个模块与另一模块交换来构建其它SAR。可以使用本公开中描述的方法测试这些新型SAR的表达和活性，以选择具有最佳功能活性的SAR。
本文所用的术语“单链合成抗原受体”或“单链SAR”意指包含单多肽链的合成抗原受体。靶向CD19并基于CD16信号链的示例性单链SAR是CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-(vL-vH)-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:4954)。在此SA R中，靶向CD19的人源化scFv(hu-mROO5-1)可操作性连接至携带F158V和S197P突变的CD16高亲和力不可切割突变体(CD16A-F158V-S197P-FL)的胞外、跨膜和胞质结构域。-v3)。临时申请的表36-39中提供了另外的示例性单链SAR，其中不同的抗原结合结构域可操作地连接至CD16A-F158V-S197P-FL-v3模块。SEQ ID NO：5463-5482中提供了另外的示例性单链SAR。由于SAR采用模块化设计，CD16A-F158V-S197P-FL-v3模块(SEQ ID NO(DNA):1417和SEQ ID NO(PRT):3811)可以被其它模块替换，例如NKp30-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1375)、NKp44-ECDTMCP-opt2(SE Q IDNO:1389)、NKp46-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1405)、CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-2(SEQ ID NO:1405)ID NO:1434)、CD32-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1582)、CD64-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1584)、2B4-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1580)、OX40-ECDTMCP-opt2(SEQID NO:1578)、CD28-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1576)、41BB-ECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:1574)、KIR3DL1(SEQ ID NO:9644)和KIR2DS4(SEQ ID NO:9653)等生成具有不同信号链的单链SAR。SEQ ID NO：9635-9668中提供了衍生自可用于构建SAR的天然存在的受体的示例性模块。示例性的此类SA R在临时申请的SEQ ID NO：9860-9895和表41中提供。可以使用本公开中描述的方法测试这些新型SAR的表达和活性，以选择具有最佳功能活性的SAR。
本文所用的术语“合成免疫受体”或“SIR”是指一组多肽，在一些实施方案中通常为两个，当其在效应细胞中表达时，为细胞提供针对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并且与细胞内信号的产生。SIR代表WO 2018/102795 A1中描述的下一代CAR平台，该文献通过引用并入本文。在一个典型的实施方案中，SIR包含一个或多个抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、配体或受体)，其与本文所述的抗原结合，并且与一个或多个T细胞受体恒定链或区连接通过可选的接头。在一些实施方案中，该组多肽是彼此连续的。在一些实施方案中，SIR包含两组或多组两种或更多种多肽。每组SIR的多肽彼此相邻(功能性多肽单元1)，但与另一组的多肽(功能性多肽单元2)不相邻。在一些实施方案中，SIR的T细胞受体恒定链(或区)选自人源T细胞受体-α(TCR-α或TCRα或TCRa或hTCR-α或hTCRα或hTCRa或Ca)的恒定链，人T细胞受体-β1(TCR-β1或TCRβ1或TCRb1或hTCR-β1或hTCRβ1或hTCRb1或Cβ1)，人T细胞受体-β2(TCR-β2或TCRβ2或TCRb2或hTCR-β2或hTCRβ2或hTCRb2或Cβ2也称为TC R-β、TCRβ或TCRb或Cβ)、人源前T细胞受体α((preTCR-α或preTCRα或preTCRa或preCα)、人T细胞受体-γ(TCR-γ或TCRγ或TCRg或hTCR)-γ或hTCRγ或hTCRg或hTCRγ1或hTCRgamma1或Cγ)，或人T细胞受体-δ(TCR-δ或TCRd或TCRδ或hTCR-δ或hTCRd或hTCRδ或Cδ)。在一些实施方案中，TCR恒定链SIR的TCR恒定链由其野生型核苷酸序列编码，而在其它方面，SIR的TCR恒定链由非野生型的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，SIR的TCR恒定链由其密码子优化的编码序列。在一些实施方案中，SIR的TCR恒定链编码野生型多肽序列，而在其它实施方案中，SIR的TCR恒定链编码携带一种或多种突变的多肽。在一些实施方案中，SIR的TCR恒定链由其携带一种或多种突变的密码子优化序列编码。本公开内容还涵盖保留相应全长TCR链的至少一种生物学和功能特性的TCR恒定链的缺失突变体。包含靶向特定肿瘤标志物“X”(例如本文所述的那些)的抗原结合结构域(例如scFv或vHH)的SIR也称为X-SIR或XSIR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的SIR被称为CD19-SIR或CD19SIR。SIR的TCR恒定链/结构域可以衍生自最终使用SIR的相同物种。例如，对于在人类中使用，SIR的TCR恒定链衍生自人TCR恒定链或由人TCR恒定链组成可能是有益的。然而，在一些情况下，TC R恒定链最好衍生自最终将要使用SIR的相同物种，但要经过氨基酸修改以变增强TCR恒定链的表达。例如，对于在人类中使用，SIR的TCR恒定链衍生自人TCR恒定链或由人TC R恒定链组成可能是有益的，但其中某些氨基酸被来自鼠TCR恒定链的相应氨基酸取代。这种鼠源化TCR恒定链提供了SIR表达的增加。SIR或其功能部分可以在氨基或羧基末端、或在两个末端包括额外的氨基酸，这些额外的氨基酸在构成SIR的TCR或抗原结合结构域的氨基酸序列中未发现。期望地，额外的氨基酸不干扰SIR或功能部分的生物功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，额外的氨基酸与相比增强了生物活性。亲本SIR的生物活性。
本文使用的术语SVH结构域是指单一人源VH结构域抗体(VH sdAb)。因此，这些术语可以互换使用。术语SVH也可与独立的vH结构域互换使用。SVH是自主抗原结合域(AABD)的一个例子。示例性SVH是SEQ ID NO(DNA)：827-828和SEQ ID NO(PRT)：3221-3222中呈现的完全人vH结构域(FHVH)。另一个示例性SVH是存在于SEQ ID NO(DNA)：830-831和SEQ ID NO(PRT)：8223-8224中的chVH结构域。另一个示例性SVH是存在于SEQ ID NO(DNA)：850-851和SEQ ID NO(PRT)：3244-3245中的aVH结构域。其它示例性SVH结构域的SEQ ID号呈现于表5中。可用于构建本公开内容的SAR的其它SVH结构域提供于WO2016062988、WO2016113556、WO2017191476、WO2018039180、WO2019006072、WO2018237037、WO 2018119215、WO2019126756、WO2019055689和WO2020018922，其全部内容通过引用并入本文。
本文所用的术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体(或靶抗原)结合诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，例如但不限于，通过TCR/CD3进行信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变。
本文所用的术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，这些分子提供细胞质信号传导序列以便在某些免疫细胞信号传导途径方面以刺激方式来调节免疫细胞的激活。一方面，该信号是一种主要信号，例如，由TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合而引发，并且介导T细胞响应，包括但不限于、增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3 zeta、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。
本文所用的术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，任何驯养的哺乳动物或人类)。本文所用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文中可互换使用，是指需要施用本公开的组合物或药物组合物的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、牛等，优选人。
如本文所用，“开关结构域”或“二聚化结构域”通常是指在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合的基于多肽的结构。
“自杀基因”、“自杀开关”或“杀死开关”编码具有导致细胞死亡的诱导能力的蛋白质。示例性自杀基因包括HSV-TK、iCaspase 9、tEGFR、CD20、tCD19、tHer2、tBCMA、RQR8等。例如，表达CD20的细胞可以通过用抗体利妥昔单抗处理来选择性消除。类似地，可以通过用belantamab mafodotin处理选择性地消除tBCMA表达细胞，并且可以通过用赫赛汀治疗选择性地消除tHer2表达细胞。
“生存基因”、“生存开关”或“生命开关”编码向细胞提供促生存信号的蛋白质。示例性的存活基因包括膜锚定形式的IL2和膜锚定形式的IL15。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”或“T细胞”是指表达CD3(CD3+)和T细胞受体(TCR+)的细胞。在一个实施方案中，T细胞是表达CD3和TCR的天然细胞(即非重组或工程化的细胞)。
本文所用的术语“TCR”或“T细胞受体”是指形成α-β或γ-δ受体的二聚体异源细胞表面信号传导蛋白，其通常参与识别由MHC分子呈递的抗原(即抗原识别)在MHC分子的背景下)。本公开内容的TCR可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。相对于亲本TCR，本公开内容的TCR可具有存在于α链可变结构域和/或β链可变结构域中的至少一种突变。“工程化TCR”和“突变TCR”在本文中同义使用，并且通常是指相对于亲本TCR、特别是在其Va和/或Vb或Vg和/或Vd结构域中引入了一个或多个突变的TCR。工程化的TCR可以以HLA依赖性或HLA非依赖性方式与抗原结合。
例如非人类动物的基因组中并且在有性生殖期间传递给生物体后代的异源基因。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”或“T细胞”是指表达CD3(CD3+)和T细胞受体(TCR+)的细胞。在一个实施方案中，T细胞是天然表达CD3和TCR的天然细胞(即，未被工程化以表达CD3或TCR的细胞)。术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可以互换并且同义使用。例子包括但不限于幼稚T细胞(“淋巴细胞祖细胞”)、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、干记忆T细胞(Tscm)、iPSC衍生的T细胞、合成T细胞、肿瘤浸润T细胞(TIL)、αβT细胞、γδT细胞、调节性T细胞(Treg)或其组合。
本文所用的术语“非T细胞”是指不是T细胞的细胞。在一个实施方案中，非T细胞缺乏CD3和T细胞受体的细胞表面表达。在一个实施方案中，非T细胞不响应T细胞激活抗体，例如OKT3。在一个实施方案中，非T细胞缺乏CD3的表面表达。在一个实施方案中，非T细胞缺乏选自CD3ε、CD3γ和CD3δ的一条或多条CD3链的表达。在一个实施方案中，非T细胞显示TCR基因的种系构型并且未经历T细胞基因重排。在一个实施方案中，非T细胞缺乏形成功能性T细胞/CD3受体复合物的能力。示例性非T细胞包括NK细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞和上皮细胞。非T细胞可以是永生化细胞系。在示例性实施方案中，非T细胞是NK细胞系，例如NK92、NK92MI、NKG和YTS等。在一个实施方案中，非T细胞是缺乏CD3和T细胞受体表达的iPSC衍生细胞。
本文所用的术语“T细胞受体模块”或“TCRM”是指包含衍生自T细胞受体的序列的异二聚体。TCRM包含T细胞受体跨膜结构域并且还可以包含全部或部分T细胞受体连接肽和/或胞内结构域。
本文使用的术语“片段可变TCR”的“TCR-Fv”或“Fv-TCR”是指由TCR链的可变结构域形成的抗原结合模块。TCR-Fv可由Vα和Vβ结构域或由Vγ和Vδ结构域形成。TCR-Fv显示出对可变结构域所衍生自的TCR的靶抗原(例如肽/MHC复合物)的一些或全部特异性结合亲和力。在一个实施方案中，当衍生自TCR的Vα/Vβ或Vγ/Vδ链连接至其两条多肽时，本公开内容的SAR表现出形成TCR-Fv抗原结合模块的能力。
本文使用的术语“Fv”或“可变片段”是指由抗体的可变结构域形成的抗原结合模块。Fv可由vL和vH结构域形成。Fv显示出对可变结构域所衍生自的抗体的靶抗原的一些或全部特异性结合亲和力。在一个实施方案中，当衍生自抗体的vL和vH链连接至其两条多肽时，本公开内容的SAR表现出形成Fv抗原结合模块的能力。
如本文所用，“跨膜蛋白”或“膜蛋白”是位于膜上和/或膜内的蛋白质，例如生物膜的磷脂双层(例如，生物膜，例如细胞膜)。一些蛋白质仅与膜表面结合，而另一些蛋白质则具有埋在膜内的一个或多个区域和/或膜一侧或两侧的结构域。跨膜蛋白的具体例子包括CD8a、CD4、CD3z、CD16、NKp30、NKp44、NKG2D等。
如本文所用的术语，“跨膜模块”或“TMM”是指包含跨膜蛋白(例如CD 16A)的分子或分子复合物。
本文所用的术语“膜相关模块”或“MAM”是指包含跨膜蛋白(例如CD16A)或膜锚定蛋白(例如CD16B)的分子或分子复合物。如本文所用的术语涵盖跨膜蛋白，例如CD16A，和GPI(糖基磷脂酰肌醇)连接的蛋白，例如CD16B。MAM还可包含全部或部分铰链结构域和/或胞质结构域。
本文所用的“治疗剂”是指用于例如治疗、抑制、预防、减轻其影响、降低其严重程度、降低发生的可能性、减缓其进展和/或治愈其疾病的药剂。治疗剂靶向的疾病包括但不限于传染病、癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤、各种免疫细胞上表达的抗原、以及与各种血液疾病和/或炎症相关的细胞上表达的抗原。疾病。
本文使用的“治疗对照”是指用于控制SAR表达细胞的活性的元件。在一些实施方案中，用于控制本公开的SAR表达细胞的活性的治疗对照包含截短的表皮生长因子受体(tEGFR)、截短的表皮生长因子受体viii(tEGFRviii)、截短的CD30(tCD 30)、截短的CD30(tCD30)、截短的表皮生长因子受体viii(tEGFRviii)中的任一种或多种。BCMA(tBCMA)、截短的CD19(tCD19)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、人caspase 8、人caspase 9、诱导型caspase 9、嘌呤核苷磷酸化酶、亚麻苦苷酶/亚麻苦苷/葡萄糖氧化酶、脱氧核糖核苷激酶、辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚-3-乙酸(IAA)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、CD20/αCD20、CD34/胸苷激酶嵌合体、dox依赖性caspase-2、突变型胸苷激酶(HSV-TKSR39)、AP1903/Fas系统、嵌合细胞因子受体(CCR)、选择标记及其组合。临时申请表24中提供了示例性治疗对照。
本文所用的术语“治疗效果”是指可以通过多种方式表现出来的生物学效果，包括但不限于例如肿瘤体积的减小、癌细胞数量的减少、转移数量的减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少、传染原效价降低、传染原菌落计数减少、与疾病状况相关的各种生理症状的改善。“治疗效果”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首次预防疾病发生或预防疾病复发的能力来体现。
本文所用的术语“治疗有效量”是指包含一种或多种本文公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的量，以减轻疾病或病症的至少一种或多种症状，并且涉及足够量的药理学组合物以提供期望的效果。本文使用的短语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比来治疗病症的足够量的组合物。
本文所用的术语“TCR受体融合蛋白”或“TFP”是指如WO 2016/187349A1中描述的下一代SAR平台，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，TFP包含特异性结合与TCR链融合的靶抗原的抗体部分，所述靶抗原例如CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα或TCRβ。可用于构建TFP的示例性TCR链由本公开内容的SEQ ID NO:11903-11906表示并且在WO 2017/070608 A1中提供，其通过引用并入本文。结合有CD3ε链的TFP被称为CD3εTFP或TFPε。掺入CD3γ链的TFP被称为CD3γTFP或TFPγ。掺入CD3δ链的TF P被称为CD3δTFP或TFPδ。掺入CD3ε、CD3γ或CD3δ链的TFP统称为CD3ε/γ/δTF P或TFPε/γ/δ。
本文所用的术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，本文所用的术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。如本文所用的术语还应当解释为进一步包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
本文所使用的“跨膜结构域”(TMD)是指受体(例如SAR)中穿越细胞质膜的区域。本发明的SAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或II型跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合的跨膜区。其它跨膜结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施例结合使用。在一些实施方案中，TMD编码的SAR包含选自T细胞受体的α、β或Z链的跨膜结构域、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9的跨膜结构域，CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244)、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF 8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。临时申请的表28中提供了示例性跨膜结构域。本公开内容的SAR的跨膜结构域对于受体可以是天然的或非天然的。由于SAR在设计上是模块化的，在一些实施例中，一个SAR的跨膜结构域可以被另一SAR的跨膜结构域替代，只要其保留其生物学和功能特性即可。因此，基于NKp30的SAR中的NKp30跨膜结构域可以被NKp44的跨膜结构域取代。可以使用本领域已知的测定法和本公开中描述的测定法来测试所得的具有非天然跨膜结构域的SAR的细胞表面表达和功能活性。
如本文所用，“三功能T细胞抗原偶联剂”或“Tri-TAC”或“TAC”是指WO 2015/117229A1中描述的下一代SAR平台，其通过引用并入本文。靶向不同抗原的Tri-TAC可以使用本领域已知的技术，使用本公开内容中描述的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、scFv、vHH、配体和受体等)来构建。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗”、“治疗”或“改善”是指治疗性处理，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止疾病的进展或与疾病及病症相关状况的严重程度。
本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前期和癌性细胞和组织。
本文使用的“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指将多核苷酸序列(例如外源基因)引入宿主细胞中，从而转化宿主并促进表达的载体。例如，引入序列的转录和翻译。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。
本文所用的术语“病毒载体”是指从病毒获得或衍生的载体。通常，病毒是逆转录病毒，包括但不限于慢病毒和γ逆转录病毒。本公开内容的病毒载体可以是逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体。病毒载体可以基于人类免疫缺陷病毒。本公开的病毒载体可以是慢病毒载体。载体可以基于非灵长类慢病毒，例如马传染性贫血病毒(EIAV)。本发明的病毒载体在病毒包膜中包含促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白衍生自宿主细胞膜，如上所述。
本文所用的术语“zeta”或“zeta链”、“CD3-zeta”或“TCR-zet a”、“CD3ze”定义为作为GenBank Ace提供的蛋白质。BAG36664.1号或来自非人类物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基，和“zeta刺激结构域”或可选地“CD3-zeta刺激结构域”或““TCR-zeta刺激结构域”被定义为来自zeta链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，其足以在功能上传递T细胞激活所需的初始信号。
“HLA缺陷”，包括HLA-I类缺陷，或HLA-II类缺陷，或两者缺陷，是指细胞缺乏、要么不再维持、或者具有降低等表面表达水平，包括一个HLA-I蛋白异源二聚体和/或一个HLA-II异源二聚体，以至于降低或减少的水平低于其他细胞或合成方法自然可检测到的水平。
本文所用的“修饰的HLA缺陷型iPSC”是指通过引入表达与改善的分化潜力、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、持久性、免疫逃避、抗性相关但不限于相关的蛋白质的基因而进一步修饰的HLA缺陷型iPSC。抑制、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，例如非经典HLA I类蛋白(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL1 1b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP 10、DAP 12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD 113和PDL1。“修饰的HLA缺陷”的细胞还包括iPSC以外的细胞。
CD16是一种FcγR受体，已被鉴定具有两种同种型：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。除非另有说明，CD16是指CD16a和CD16b同种型以及来自人类或非人类物种的任何其它可变剪接变体。CD16a是NK细胞表达的跨膜蛋白，它与靶细胞上附着的单体IgG结合，激活NK细胞并促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可切割CD16”或“高亲和力不可切割CD16(hnCD16)”是指CD 16的天然或非天然变体。野生型CD16具有低亲和力和受到外域脱落的影响，这是一种蛋白水解裂解过程，可在NK细胞激活后调节白细胞上各种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V(或F158V或V158)是具有高亲和力的示例性CD16多态性变体。近膜区(位置189-212)中的切割位点(位置195-198)被改变或消除的CD16变体不会发生脱落。切割位点和近膜区域详细描述于WO2015148926中，其完整公开内容通过引用并入本文。CD16 S197P或S197R变体是CD16的工程化不可切割版本。包含F158V和S197P(或S197R)的CD16变体具有高亲和力并且是不可切割的。另一种示例性的高亲和力和不可切割的CD16(hnCD16)变体是工程化的CD 16，其包含衍生自CD64胞外域的3个外显子中的一个或多个的胞外域。本公开内容的CD16 SAR可包含野生型CD16序列或其天然或非天然变体，例如F158V和S197P(或S197R)，
虽然表达CD16或CD16变体的免疫细胞和iPSC是本领域已知的，但在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16或CD16变体的胞外Fc结合区的SAR。在一个实施方案中，CD16-SAR保留了结合抗体或抗体片段的Fc区的能力，但具有通过其非天然抗原结合结构域(例如，AABD、scFv、vHH、FHVH、Fv等)。在一个实施方案中，CD16SAR的抗原结合结构域可操作地连接至CD16或CD16变体的Dl结构域(SEQ ID NO:3836)的N端区域或N端区域附近，即在或靠近CD16或CD16变体胞外结构域的N端区域。在一个实施方案中，任选的接头存在于SAR的抗原结合结构域和CD16或CD16变体的D1结构域之间。临时申请表11中提供了示例性连接体。
在一个实施方案中，CD16-SAR缺乏结合抗体或抗体片段的Fc区的能力，但具有通过其非天然抗原结合结构域(例如，AABD、scFv、vHH、FHVH、Fv等)结合抗原的能力。在一个实施方案中，CD16-SAR包含一个或多个非天然抗原结合结构域(例如，AABD、scFv、vHH、FHVH、Fv等)，其结构域可通过任选的铰链操作性地连接至CD 16跨膜结构域和可选的胞质的结构域。在一个实施方案中，CD16-SAR具有在与其靶抗原结合后募集信号传导适配器(例如CD3z和/或FceRy1)的能力。SAR的结合域结合到所需的表位或抗原。例如，由SAR识别的表位由用作SAR的结合结构域的scFv识别的表位确定。例如，由于靶向CD19的SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IglCH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:2275)的抗原特异性结构域，是由衍生自hu-mROO5-1 scFv(SEQ ID NO:3027)的vL(SEQ ID NO:2543)和vH(SEQ ID NO:2785)片段组成，预期SAR靶向与scFv和/或scFv所衍生自的亲本抗体相同的表位。用于构建本公开内容的SAR和骨架的几种scFv和/或其亲本抗体识别的表位在本领域已知的。另一种确定SAR靶向的抗原表位的方法是生成其目标抗原的一系列突变体，并使用技术领域已知的方法测试这些突变体与表达SAR的细胞结合的能力，例如，使用Topanga Assay(Gopalak rishnan，R，Sci Reports，2019)。举例，以SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC(SEQID NO:2275)靶向CD19为例，可以通过生成CD19-ECD-GGSG-NLu c-4xFlag-2xStreptag-8xHis-T2A-Pac(DNA SEQ ID NO:1282)的一系列缺失和点突变体来确定其所识别的表位。这些突变体构建将被转染到合适的细胞系(例如293FT细胞)中，然后收集含有融合蛋白的上清液，并进行NLuc活性检测，以确保不同的突变CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis融合蛋白正在上清液中分泌。随后，将测试这些融合蛋白与表达CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Sp e-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:2275)构建的细胞(例如Jurkat细胞或T细胞)结合的能力。未能与表达SAR的细胞结合的突变体是包含CD19特异性SAR靶向的表位的候选物。确定特定SAR所识别的抗原表位的另一种方法可能包括使用不同的测试抗体进行功能竞争性分析。例如，表达CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC(SEQID NO:2275)SAR的T细胞可以与表达CD19的细胞系(例如RAJI细胞)一起培养，在不同测试CD19抗体的存在和缺席下，以逐渐增加的浓度。如果测试CD19抗体识别的表位与SARCD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DA P10-opt2-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:2275)所识别的表位重叠，那么预期测试抗体将以剂量依赖的方式阻止T细胞诱导的靶细胞杀伤和细胞因子产生。与测试抗体同种型的非特异性抗体将作为对照，预计不会对表达SAR的T细胞诱导的靶细胞杀伤和细胞因子产生产生影响。类似地，特定的SAR可以在Jurkat-NFAT-EGFP细胞中表达，并且测试抗体在与靶细胞系共培养时阻断表达SAR的Jurkat-NFAT-GFP细胞诱导EG FP的能力可用于确定是否测试抗体识别的表位与所述SAR识别的表位重叠。
表3
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表5
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表49：SAR所针对的典型疾病。
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在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR(例如分离的SAR)，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的(即天然的或内源的)受体或其变体。在一个实施方案中，SAR保留天然受体的结合能力和功能，但还获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的结合能力和功能。在一个实施方案中，SAR部分或完全保留天然受体的结合能力和功能。在一个实施方案中，SAR获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的结合能力和功能。
在一个实施方案中，自然存在的受体是指表达在细胞表面的任何受体(例如，免疫细胞、免疫效应细胞)。在一个示例性实施方案中，所述免疫细胞选自但不限于T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞和B细胞。在一个实施方案中，天然存在的信号传导受体在免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突细胞等)的表面上表达。
在一个实施方案中，天然存在的受体诱导细胞信号传导，即，它是天然存在的信号传导受体。天然存在的信号传导受体可以是激活受体(即，它诱导细胞激活)或抑制性受体(即，它阻断细胞激活)。在一个实施方案中，天然存在的受体是NK细胞受体，例如NK激活性受体或NK抑制性受体。在一个实施方案中，天然存在的信号传导受体可以是诱导细胞毒性的受体。在另一个实施方案中，天然存在的信号传导受体可以是提供共刺激的受体。
在一个实施例中，可用于构建本公开的SAR的天然存在的受体拥有跨膜结构域。在一个实施方案中，天然存在的受体能够募集跨膜适配蛋白。在一个实施方案中，天然存在的受体能够募集选自但不限于CD3δ、FcRγ、DAP10、DAP12或其变体或片段的跨膜适配蛋白。示例性的此类受体包括CD16A、NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D。在一个实施方案中，天然存在的受体能够募集在其跨膜区内包含带负电荷的残基(例如天冬氨酸)的跨膜适配蛋白。在一个实施方案中，天然存在的受体拥有包含带正电残基(赖氨酸或精氨酸)的跨膜结构域，该跨膜结构域与信号传导适配蛋白跨膜区内的带负电残基(例如天冬氨酸)相互作用。在一个实施方案中，天然存在的受体具有跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，天然存在的受体具有铰链(间隔区)结构域和跨膜结构域。在一个实施方案中，天然存在的受体具有铰链(空间)结构域、跨膜结构域和胞质结构域。示例性的此类受体是CD16A。在一个实施方案中，天然存在的受体具有铰链(空间)结构域、膜锚定结构域(例如GPI连接结构域)，但缺乏胞质结构域。示例性的此类受体是CD16B。
在示例性实施方案中，可用于构建本公开的SAR的天然存在的受体包括但不限于CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL 3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS 2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec3、Siglec-7、Siglec-9、TCRαβ和TCRγδ等及其变体和片段。
在一个实施例中，可用于构建本公开内容的SAR的天然存在的受体不是T细胞受体。在一个实施例中，可用于构建本公开的SAR的天然存在的受体不是TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα。在一个实施方案中，SAR不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的恒定链。在一个实施方案中，SAR不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的跨膜结构域。在一个实施方案中，SAR不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TC Rδ或前TCRα的整个胞外结构域。在一个实施方案中，可用于构建本公开内容的SAR的天然存在的非T细胞受体包含细胞内激活结构域。在一实施例中，激活域包括一个或多个ITAM。在一个实施例中，激活域包括一个或多个ITIM。在一个实施方案中，可用于构建本公开内容的SAR的天然存在的非T细胞受体包含共刺激结构域。
在示例性实施方案中，SAR包含衍生自CD3δ、FcRγ、DAP10或DAP12的细胞内激活结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至非TCR天然存在的受体的整个胞外结构域，即，不是TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前体-TCRα。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至非TCR天然存在的受体的部分胞外结构域。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至非TCR天然存在的受体的部分胞外结构域。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至NTCRM(非T细胞受体模块)的整个或部分胞外结构域。在一个实施方案中，可用于构建本公开内容的SAR的天然存在的信号传导受体不是CD4、CD8、CD28、CD27、CD16A或NKG2D。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的受体的全部或部分胞外结构域，其中所述受体不是TCR/CD3受体复合物的一部分。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的受体多肽链的整个或部分胞外结构域，其中受体多肽链不是TCR/CD3受体的一部分复杂的。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的受体或其变体或片段的全部或部分胞外结构域，其中所述受体不与所述受体结合。TCR/CD3受体复合物。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至天然存在的受体或其变体或片段的完整或部分抗原(或配体)结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至非TCR天然存在的信号传导受体或NTCRM或其变体或片段的完整或部分抗原(或配体)结合结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至非TCR信号传导受体或NTCRM的完整或部分抗原(或配体)结合结构域或变体或片段其中。在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至天然存在的信号传导受体或其变体或片段的完整或部分抗原(或配体)结合结构域，其中天然存在的信号传导受体或其变体或片段信号受体不是TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTCRα。在一个实施例中，本公开内容的SAR保留非TCR天然存在的信号传导受体的至少一些抗原结合特性。在一个实施例中，本公开内容的SAR获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的新颖的抗原结合特性。在一个实施例中，本公开内容的SAR保留非TCR天然存在的信号传导受体的至少一些抗原结合特性，并且获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的新的抗原结合特性。
在一个实施方案中，本公开提供了双链SAR，其包含衍生自TCR可变结构域(即Vα、Vβ、Vδ或Vγ)的异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至TCR的整个或部分胞外结构域。天然存在的信号受体。在一个实施方案中，天然存在的信号传导受体是NTCRM(非T细胞受体模块)。
在一个实施方案中，本公开提供了双链SAR，其包含衍生自TCR可变结构域(即Vα、Vβ、Vδ或Vγ)的异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至NTCRM的铰链结构域(非-T细胞受体模块)和/或信号传导适配器(例如，CD3z、FcRγ、DAP10、DAP10等)或其变体或片段。
在一个实施方案中，SAR不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的整个胞外结构域。在一个实施方案中，SAR不包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或前TCRα的跨膜结构域。
图1-5和表A1-1至A1-19提供了本公开的SAR的示意性表示。
在一个实施方案中，可用于构建本公开内容的SAR的天然存在的受体可包含单条多肽链或多条多肽链。天然存在的受体可以是多链受体复合物(例如，T细胞受体复合物)的组分。
在一个实施方案中，SAR包含多于一个抗原结合结构域。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源(或非天然存在的)抗原结合结构域。可用于构建本公开的SAR的示例性异源抗原结合结构域包括自主抗原结合结构域(例如，完全人vH结构域、vHH结构域、单链TCR、重组TCR或svd-TCR等)，scFv、抗体、抗体片段(vL、vH、Fab等)、非免疫球蛋白抗原结合结构域(例如Centyrin、affibody、DARPIN、ZIP结构域、适配器等)、配体、受体的胞外结构域(例如、CD16A胞外结构域、NKp30胞外结构域等)、自身抗原、TCR、TCR可变片段(例如，Va、Vb、Vg、Vd等)及其变体和片段等。在一个示例性实施方案中，所述一种或多种更多异源抗原结合结构域包括scTCR、svd-TCR或TCR模拟物scFv或其片段。在一些实施方案中，SAR获得TCR样结合能力，例如结合肽/MHC复合物的能力。
目前临床使用的第二代嵌合抗原受体构建物(例如，Axicabtagene Ciloleuc el,Lisocabtagene Maraleucel等)包含一个异源抗原结合结构域(例如，scFv)，该结构域与来自多种不同天然受体的茎(铰链)、跨膜、共刺激和细胞质结构域相连接。另一方面，本公开提供了一种SAR(例如，下一代CAR)，其包含天然存在的信号受体(例如，CD16,NKp30,NKp44,NKp46,NKG2D,KIR2DS4等)的跨膜结构域和细胞质结构域的天然结构或信号传导适配器(例如，CD3ζ，FcRγ，DAP10，DAP12等)表现出优越的生理细胞信号传导和调节，与由非天然结构的跨膜和细胞质结构域的天然存在的信号受体或信号传导适配器的SAR相比。另一方面，本公开提供了包含天然存在的信号传导受体或信号传导适配器的跨膜结构域和胞质结构域的天然构型的SAR与包含以下结构域的非天然构型的SAR相比显示出优异的体外和体内功效。天然存在的信号传导受体或信号传导适配器的跨膜和胞质结构域。
在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段的整个胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或其变体或片段的整个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至一种天然存在的受体的部分或全部胞外抗原结合结构域以及不同的天然存在的信号传导受体的跨膜结构域和胞质结构域或其变体或片段。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或变体或变体的部分胞外结构域但整个跨膜结构域和胞质结构域。其片段。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头和/或间隔子(例如，铰链结构域)可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器的跨膜结构域和任选的胞质结构域。或其变体或片段。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域。
在一个实施方案中，SAR的不同结构域通过肽键可操作地连接，即，它们是多肽链的一部分。
在一个实施例中，SAR包含细胞内激活结构域。在示例性实施方案中，SAR包含衍生自信号传导适配器的细胞内激活结构域。在示例性实施方案中，SAR包含衍生自CD3δ、FcRγ、DAP10或DAP12的细胞内激活结构域。在一个实施例中，SAR的激活结构域包含一个或多个ITAM基序。在一个实施例中，SAR包含具有一个或多个ITAM基序的激活结构域。在一个实施例中，SAR包含具有两个或更多个ITAM基序的激活结构域。在一个实施例中，SAR包含具有单个ITAM基序的激活结构域。在一个实施例中，SAR包含缺乏ITAM基序的激活结构域。在一个实施例中，SAR包含激活结构域，该激活结构域包含基于酪氨酸的基序(YINM)。在一个实施方案中，SAR包含募集PI3K和/或Grb2的p85亚基的激活结构域。在一个实施例中，SAR包含激活NFAT、PI3K、NF-κB和ERK信号传导途径中的一种或多种的激活结构域。
在一个实施方案中，SAR包含细胞内抑制结构域。在示例性实施方案中，SAR包含衍生自PD1的细胞内抑制结构域。在一个实施方案中，SAR的抑制结构域包含一个或多个ITIM基序。
在一个实施方案中，SAR能够募集信号传导适配器。在示例性实施方案中，SAR能够募集一种或多种选自但不限于CD3z、FcRγ、DAP10和DAP12的组的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR能够通过与其铰链、跨膜或胞质结构域的相互作用来募集信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR能够通过与铰链、跨膜结构域和胞质结构域中的一个或多个相互作用来募集信号传导适配器。在一个实施方案中，表达本公开内容的SAR的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞等)在其一个或多个异源抗原结合结构域结合至靶抗原时募集信号传导适配器。在一个实施方案中，表达本公开的SAR的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞等)激活、增殖、分泌细胞因子和/或调节(诱导或抑制)靶标的杀伤细胞并具有MHC限制性和/或MHC非限制性抗体类型特异性
在一个实施方案中，SAR缺乏胞质结构域。在一个实施方案中，SAR包含长度小于100个氨基酸(即，小于90、80、70、60、50、50、40、30、25、20、15、10、5或2个氨基酸长。在一个实施例中，SAR包含长度小于50个氨基酸的胞质结构域。在一个实施例中，SAR包含长度小于25个氨基酸的胞质结构域。在一个实施例中，SAR包含长度小于10个氨基酸的胞质结构域。在一个实施例中，SAR包含长度小于5个氨基酸的胞质结构域。在一个实施例中，SAR缺乏细胞内激活结构域。在一个实施方案中，SAR缺乏含有ITAM基序的胞内结构域。在一个实施方案中，SAR缺乏细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，SAR缺乏细胞内共刺激结构域。在一个实施方案中，SAR缺乏衍生自一种或多种的细胞内结构域。更多CD3z、2B4、4-1BB、CD28、ICOS、CD2、CD40、DAP10和DAP12。在一个实施方案中，SAR缺乏能够直接募集蛋白激酶或蛋白磷酸酶的胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，SAR缺乏插入天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段的跨膜结构域和胞质结构域之间的共刺激结构域。与第二代CAR相反，在一个实施例中，本公开的SAR的跨膜结构域和胞质结构域衍生自单一天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段。在另一个实施方案中，本公开内容的SAR的跨膜结构域和胞质结构域衍生自单一天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段，并且不被来自自天然存在的信号传导受体的异源共刺激结构域中断。共刺激受体。在另一个实施方案中，本公开的SAR的跨膜结构域和胞质结构域衍生自单个天然存在的信号传导受体或信号传导适配器并且彼此邻接。在另一个实施方案中，本公开的SAR的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域衍生自单个天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体并且彼此邻接，即，它们不间断地存在于一条连续链中。
在一个实施例中，SAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。在示例性实施方案中，SAR包含衍生自CD28、4-1BB、CD27、0X40、CD2、CD40、CD81或2B4或其变体的一个或多个共刺激结构域。其它共刺激域是本领域已知的并且可以用于本公开的替代实施例中。在一个实施例中，一个或多个共刺激结构域位于SAR的近膜区域中。在一个实施例中，一个或多个共刺激结构域位于I型跨膜SAR的跨膜区域的C末端。在一个实施方案中，一个或多个共刺激结构域存在于II型跨膜SAR的跨膜区域的N末端。在另一个实施例中，SAR缺乏共刺激域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一个或多个插入跨膜结构域和胞质结构域之间的共刺激结构域，所述结构域衍生自天然存在的信号传导受体(例如，CD16A或NKp30等)或信号传导适配器(例如，CD3ze、FcRγ等)或其变体或片段。在示例性实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至衍生自天然存在的信号传导受体(例如，CD16A、CD16B、CD64、NKp30等)的胞外结构域，其进而连接至铰链结构域(例如，CD 8铰链或CD28铰链)、跨膜结构域(例如，CD8或CD28跨膜结构域)、共刺激结构域(例如，4-1BB或CD28共刺激结构域)和激活结构域(例如，CD3z或FcRγ激活结构域)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:10818和10821表示。在另一个示例性实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SAR，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至衍生自信号传导适配器的胞外铰链结构域(例如，CD3ζ、FcRγ等)，其又连接至跨膜结构域(例如，CD3δ或FcRγ跨膜结构域)、共刺激结构域(例如，4-1BB、CD28、2B4或OX40共刺激结构域)和激活结构域(例如，CD3δ或FcRγ激活结构域等)。
在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域(例如，scF v、vHH、FHVH、centyrin、scTCR、svd-TCR等)，其通过任选的接头可操作地连接至氨基末端或氨基末端附近天然存在的(或天然的)信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段的胞外域。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器的铰链(或间隔区)结构域的氨基末端或氨基末端附近，或其变体或其片段。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或变体或变体的跨膜结构域的氨基末端或氨基末端附近。其片段。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或变体或片段的铰链(间隔区)结构域、跨膜结构域和胞质结构域其中。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段的跨膜结构域和胞质结构域。
在示例性实施方案中，包含SAR的天然存在的(或内源性)信号传导受体是I型(或组1)跨膜蛋白，其N末端在细胞外侧并且C末端在胞质侧。示例性的此类I型(或组1)内源受体包括CD16A、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS 2、KIR2DS3、KIR2DS4，KIR2DS5、KIR3DS1、CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF6、SL AMF7、CD27、CD100、CD160、ILT2/LILRB1、CD33、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32和CD 64等
在一个实施方案中，本公开提供了一种合成抗原受体(SAR)，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域可操作地连接至天然存在的(或天然)信号传导受体的I型跨膜的氨基末端或氨基末端附近通过可选的接头。在一个实施方案中，SAR保留天然存在的信号传导受体的结合能力和功能，但另外获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的结合能力。在一个实施方案中，一个或多个异源抗原结合结构域包含scTCR、svd-TCR或TCR模拟抗体或其片段。在一些实施例中，SAR获得类似TCR的结合能力。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其可操作地连接至作为I型跨膜蛋白的内源受体的氨基末端或氨基末端附近。在一个实施方案中，SAR包含异源(非天然)抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2的N端或N端附近，KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KI R2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF 6、SLAMF7、CD27、CD100、CD160、ILT2/LILRB1、CD33、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32或CD64。在一个实施方案中，SAR还包含N端信号肽。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个位于信号肽C末端的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过一个或多个任选接头可操作地连接至包含CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL 1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL 4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF6、SLAMF7、CD27，CD100、CD160、ILT2/LILRB1、CD33、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32或CD64的铰链(间隔区)、跨膜结构域和胞质结构域的多肽。
在一个实施方案中，天然存在的(或内源性)信号传导受体是II型(或第2族)跨膜蛋白，其C末端位于细胞外侧且N末端位于胞质侧。本公开提供了用于生成I型膜蛋白和II型膜蛋白之间的融合蛋白的一般方法，以生成融合物，其中I型膜蛋白的一个或多个模块功能性地连接至I型膜蛋白的整个或部分区域。II型膜蛋白。在示例性实施方案中，缺乏信号肽序列的I型蛋白的抗原结合结构域的N端通过任选的连接可操作地连接至II型膜蛋白的C端。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过一个或多个任选的接头可操作地连接至天然存在的(或内源)信号传导受体的羧基末端或羧基末端附近。示例性的此类II型(或第2组)内源受体包括但不限于NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2E、NKG2H、KLRG1、CD161和CD94等。在一个实施方案中，一个或多个异源抗原结合结构域(例如，vHH、FHVH、centy rin、scTCR、svd-TCR)通过一个或多个任选的接头与II型内源性受体(第2组)的C端或C端附近可操作地连接在读框内跨膜蛋白。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2E、NKG2H、KLRG1、CD161或CD94的C端或C端附近。包含连接至NKG2D C末端的Her2和Her3vHH结构域的示例性此类SAR分别由SEQ ID NO(DNA):7696-7697和SEQ ID NO(PRT):8388-8389表示。在一个实施方案中，一个或多个异源抗原结合结构域经由任选的接头可操作地连接至作为II型(组2)跨膜蛋白的内源受体的铰链结构域。在一个实施方案中，一个或多个异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至NK G2D、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2F、NKG2E、NKG2H、KLRG1、CD161或CD94的铰链结构域。
NKG2D在细胞表面的有效表达需要DAP10的存在。本文提供了通过对细胞(例如iPSC)进行基因工程改造以引入NKG2D来获得单独或与DAP10一起稳定过表达NKG 2D-SAR(即，包含NKG2D的跨膜结构域和/或胞质结构域的SAR)的效应细胞的策略。-SAR和任选的DAP10加至细胞(例如iPSC)，然后从定向的iPSC分化中获得包括NK和T细胞的效应细胞。本公开还提供了通过异位表达DAP10作为辅助模块以及包含NKG2D跨膜结构域的SAR，在缺乏DAP10或表达低水平DAP10的细胞中有效表达NKG2D-SAR的策略。
CD94/NKG2C是一种异二聚体受体，可与HLA-E结合并与DAP12(一种含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序的蛋白质)结合。CD94/NKG2C在细胞表面的有效表达需要DAP 12的存在，并且DAP 12和NKG2C跨膜结构域中的带电氨基酸介导这种相互作用。本文提供了通过对细胞(例如iPSC)进行基因工程改造以引入NKG2C-SAR来获得单独或与DAP12一起稳定过表达NKG2C-SAR(即包含NKG2C跨膜结构域的SAR)的效应细胞的策略，并且任选地将DAP12结合到细胞(例如iPSC)上，然后从定向iPSC分化中衍生出包括NK和T细胞的效应细胞。在一些实施方案中，NKG2C-SAR还与CD94或CD94-SAR共表达。
在包含过表达的NKG2C-SAR的iPSC或衍生自其的效应细胞中，所述细胞还包含过表达的CD94或CD94-SAR和/或DAP12。在一个实施方案中，NKG2C-SAR和CD94(或CD 94-SAR)和/或DAP12在单独的构建体中表达。在另一个实施方案中，NKG2C-SAR和CD94(或CD94-SAR)和/或DAP12在双顺反子或三顺反子构建体中共表达，并且通过自切割2A编码序列连接。在另一个实施方案中，NKG2C-SAR、CD94(或CD94-SAR)和DAP 12在单独的构建体中表达。
已知的CD94和/或信号传导适配器(例如，DAP10、DAP12等)的共表达来类似地有效地表达。与他们交往。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至II型跨膜天然存在的信号传导受体的羧基末端或羧基末端附近。在一个实施方案中，SAR保留天然存在的信号传导受体的结合能力和功能，但另外获得异源抗原结合结构域赋予的结合能力。在一个实施方案中，本公开提供了一种或多种异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地框内连接至II型跨膜天然存在的信号传导受体的铰链结构域或跨膜结构域以产生合成抗原受体。在一个实施方案中，所得SAR保留了天然信号传导受体的结合能力和功能，但另外获得了异源抗原结合结构域赋予的结合能力。在一个实施例中，本公开内容的SAR保留天然存在的受体的结合特性和生理调节，同时获得额外的抗原结合能力，这允许其除了天然存在的受体可以响应的那些抗原之外还响应靶抗原。
本公开内容还提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的单链SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号链或信号传导适配器或其变体的胞外结构域。本公开还提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的单链SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号链或信号传导适配器或其变体的铰链(间隔区)结构域。本公开内容还提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的单链SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号链或信号传导适配器或其变体的跨膜结构域。示例性信号链或信号传导适配器包括但不限于CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12或其变体。在一个实施方案中，信号链/接头进一步包含共刺激结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至NCAM(非CD3适配器模块)的整个或部分胞外结构域、铰链结构域或跨膜结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至信号传导适配器的整个或部分胞外结构域、铰链结构域或跨膜结构域，其中信号传导适配器(或信号传导链)不是CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ。在一个实施方案中，信号传导适配器不是FcRγ。
在一个实施方案中，单链SAR的一个或多个异源抗原结合结构域包含自主抗原结合结构域(AABD)，例如单结构域抗体、单个vH结构域、FHVH、vHH结构域、svd-TCR、非免疫球蛋白抗原结合支架(例如，DARPIN、affibody、affilin、adnectin、affitin、obodies、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段)。在一个实施方案中，单链SAR的一个或多个异源抗原结合结构域包含抗体或抗体片段(例如，vL、vH、Fab、Fab'2、scFv和scTCR等)。
由于SAR在格式上是模块化的，它们的不同域可以被其它域替换，以生成具有不同生物活性和特性的新SAR。因此，一个SAR的胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或胞质结构域可以被另一SAR的胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或胞质结构域替代，只要所得SAR具有至少一个原始SAR的生物活性(例如，抗原结合、细胞信号传导等)。在一个实施例中，本公开提供了可以将新模块(共刺激域)插入到SAR中。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的SA R，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至一种天然存在的信号传导受体的全部或部分胞外结构域，其进而可操作地连接至跨膜和胞质结构域不同的天然存在的受体或其变体的。在示例性实施方案中，包含CD16A胞外、跨膜和胞质结构域的SAR的胞外结构域被CD64的胞外结构域替代，以产生包含CD20vHH结构域、CD64胞外结构域的新SAR(SEQ ID NO:4722)，CD16A跨膜结构域和CD16A胞质结构域。
在一个实施方案中，SAR的不同结构域衍生自单个天然存在的受体或信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR的不同结构域衍生自多于一种天然存在的受体或信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至一种天然存在的受体的部分或全部抗原结合结构域以及衍生自一种或多种不同的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域。受体或其变体或片段。在示例性实施方案中，SAR从N到C末端包含CD19 scFv、CD16抗原结合结构域(D1和D2)、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z激活结构域领域。此类SAR的氨基酸序列呈现于SEQID NO:10836中。在另一个示例性实施方案中，SAR从N到C末端包含CD19 scFv、CD16A抗原结合结构域(D1和D2)、CD16A铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3z激活结构域。在另一个示例性实施方案中，SAR从N端到C端包含CD19 scFv、CD64抗原结合结构域、CD16A铰链结构域、CD 16A跨膜结构域、CD16A胞质结构域。这种SAR的氨基酸序列呈现于SEQID NO:10832中。
在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体或其变体的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域，其中铰链、跨膜结构域和胞质结构域均衍生自单一天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段。在一个实施方案中，包含SIR的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域衍生自单个天然存在的信号传导受体(例如，CD16A)或信号传导适配器(例如，CD3ze)或其变体或片段。在一个替代实施方案中，包含SIR的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域衍生自多于一种天然存在的信号传导受体(例如，CD16A的铰链结构域和跨膜结构域可操作地连接至NKp30的胞质结构域等)。或信号传导适配器(例如，CD16A的铰链和跨膜结构域可操作地连接至FcRγ的胞质结构域等)。在一个实施方案中，SAR包含一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至天然存在的信号传导受体的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域，其中铰链、跨膜结构域和胞质结构域是衍生自多于一种天然存在的信号传导受体或信号传导适配器或其变体或片段。
在一个实施方案中，本公开提供了用于生成非天然蛋白质(即，合成蛋白质)的方法，所述非天然蛋白质包含两条或多条从氨基(N)末端到羧基(C)末端具有以下通式的链：
链1：SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
链2：SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
其中SP1和SP2是从成熟多肽链上切割下来的可选信号肽；A1和A2是两个可以相互作用的蛋白质结构域，L1和L2是可选的接头，H1和H2是可选的铰链或间隔结构域，M1和M2是膜锚定或跨膜结构域，C1和C2是可选的胞质结构域。在一个实施方案中，A1和A2结构域不衍生自抗体。在一个实施方案中，A1和A2结构域不是抗体片段。在一个实施方案中，A1和A2结构域与M1和M2结构域是异源的，即，A1和M1结构域衍生自不同的蛋白质，并且类似地A2和M2结构域衍生自不同的蛋白质。在示例性实施方案中，A1和A2结构域衍生自TCR(例如，TCR的Vα和Vβ结构域)并且M1和M2结构域衍生自CD3z。在一个实施例中，A1和A2域不是自治域。在一个实施方案中，A1和A2结构域对彼此的亲和力大于它们对不相关蛋白质的亲和力。在一个实施方案中，A1和A2结构域可以彼此缔合以产生抗原结合结构域。在一个实施方案中，非天然蛋白质是合成抗原受体。在一个实施方案中，L1和L2接头是长接头。在一个实施方案中，L1和L2接头是类似Ig接头。在一个实施方案中，L1和L2接头通过一个或多个二硫键连接。在一个实施方案中，M1和M2结构域是跨膜结构域。在一个实施方案中，M1和M2结构域衍生自相同的蛋白质(例如，CD3z)。在一个实施方案中，M1和M2结构域衍生自不同的蛋白质(例如，CD3z和FcRγ)。在一个实施方案中，Ml和M2结构域在序列上是相同的和/或拥有大于70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％等)。氨基酸序列同源性。在一个实施例中，M1和M2域彼此关联。在一个实施例中，M1和M2结构域通过二硫键连接。在一个实施方案中，M1和/或M2结构域可以募集一个或多个信号传导适配器。在一个实施方案中，C1、C2结构域是细胞信号传导结构域(例如，激活结构域或共刺激结构域等)。在一个实施方案中，每条链可以拥有多于一个胞质结构域。在一个实施方案中，两条链均在细胞表面表达，其中A1-L1-H1和A2-L2-H2区段位于细胞外侧。本公开提供了编码合成蛋白的核酸、氨基酸序列、编码合成蛋白的一种或多种载体以及表达合成蛋白的细胞。
本发明还提供一种双链SAR(例如隔离双链SAR)。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至至少一个模块，所述模块包含信号传导受体的完整或部分胞外结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域，或其信号传导适配器或其变体或片段。在一个实施方案中，信号传导受体是非TCR信号传导受体。在一个实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器。在一个实施例中，信号传导适配器不是CD3ze。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含两条链，每条链包含至少一个抗原结合结构域(例如，vL、vβ、Vα、Vβ、Vγ或Vδ等)，其通过任选的肽接头可操作地连接(例如，IgCL、IgCH1等)连接至膜相关模块(MAM)，其包含信号传导受体(例如，CD16A、CD16B、NKp30等)或信号传导适配器(例如，CD3ze、FcRγ)或其变体或片段。在一些实施方案中，MAM进一步包含完整或部分胞外抗原结合结构域、信号传导受体的铰链结构域和/或胞质结构域和/或信号传导适配器的铰链和/或胞质结构域。在一个实施方案中，信号传导受体是非TCR信号传导受体。在一个实施例中，该模块是NTCRM。在一个实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(即，NCA M)。在一个实施例中，信号传导适配器不是CD3ze。在一个实施方案中，MAM不包含TC Rα、β、γ、δ、preTCRα、CD3δ、CD3ε、CD3γ或CD3δ的跨膜结构域。在一些实施方案中，第一链的至少一个抗原结合结构域(例如，vL、Vα或Vγ)与第二链的至少一个互补抗原结合结构域(例如，vH、Vβ或Vδ)缔合以形成抗原特异性结合靶抗原的结合模块(例如，Fv或Fc-TCR)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和/或第二肽接头的长度分别为约5至约500个氨基酸。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含互补链(例如，vL和vH、Vα和Vβ或Vγ和Vδ)。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原选自蛋白质、碳水化合物和脂质。在示例性实施方案中，靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。在示例性实施方案中，细胞表面抗原选自但不限于以下的一种或多种：CD2、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CD179b、CLL-1、FLT3、密蛋白18.2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7、ROR1、ROR2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16或Her2。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的复合物。在示例性实施方案中，肽抗原是表B中列出的一种或多种抗原。在示例性实施方案中，肽/MHC复合物包含衍生自NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-中的一种或多种的肽。E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSA或gp100。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含两条链，每条链包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至包含信号传导受体的铰链、跨膜和任选的胞质结构域的模块，或信号传导适配器或其变体或片段。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含两条链，每条链包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至包含信号传导受体的跨膜结构域和任选的胞质结构域、信号传导受体的跨膜结构域和任选的胞质结构域的模块。接头或其变体或片段。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含两条链，每条链包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至包含信号传导受体的跨膜结构域的模块，或信号传导适配器或变体或其片段。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含两条链，每条链包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至包含信号传导受体的胞质结构域、信号传导适配器或变体或其中的一个片段。在一个实施方案中，信号传导受体是非TCR信号传导受体。在一个实施例中，该模块是NTCRM。在一个实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(即，NCAM)。在一个实施例中，信号传导适配器不是CD3ze。
在一个实施例中，本公开提供了包括一个或多个异源抗原结合域的双链SA R，其中每个链通过可选的接头可操作地连接到包含信号受体(例如天然受体)、信号传导适配器(例如NCAM)或其变体或片段的细胞外、跨膜或胞质结构域的模块(例如NTCR M)。在一个实施方案中，包含双链SAR的信号传导受体和信号传导适配器是天然存在的。在一个实施方案中，包含双链SAR的信号传导受体和信号传导适配器是非天然存在的。在一个实施方案中，包含双链SAR的信号传导受体和信号传导适配器是非T细胞受体和非CD3适配器。在一个实施方案中，包含双链SAR的信号传导受体和信号传导适配器是天然存在的非T细胞受体和非CD3适配器。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至至少一个模块(例如NTCRM)，所述模块包含天然存在的信号传导的胞外、跨膜或胞质结构域。受体(例如，CD16A)、信号传导适配器(例如，FcRγ)或其变体或片段。
本申请一方面提供了包含与非T细胞受体模块(NTCRM)融合的一个或多个异源抗原结合结构域的构建体(例如分离的构建体)。在示例性实施方案中，NTCRM衍生自但不限于以下非TCR受体中的一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NK p44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL 2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fa s、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。
在一些实施方案中，SAR包含特异性结合靶抗原的一个或多个异源抗原结合结构域和能够募集至少一种信号传导适配器的非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(即，NCAM)。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和MHC蛋白(例如MHC I类蛋白或MHC II类蛋白)的复合物。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的SAR(例如分离的SAR)，其中所述SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含vL、Vα或Vγ结构域和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含vH、Vβ或Vδ结构域，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)，并且其中NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTCRα的TCR链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM或第二MAM不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTC Rα的TCR链的跨膜结构域。在一个实施方案中，NTCRM不包含选自i)TCRα和TCRβ、ii)TCRγ和TCRδ、或iii)preTCRα和TCRβ的两条TCR链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含选自CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3δ的CD3链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含TCR链和CD3链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含CD3z的跨膜结构域。在示例性实施方案中，NTCRM衍生自但不限于以下非TCR受体中的一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KI R3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。在一些实施方案中，信号传导适配器选自但不限于CD3δ、FcRγ、DAP10和/或DAP12或其变体或片段中的一种或多种。在一些实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(NCAM)。在一些实施方案中，信号传导适配器不是CD3ze。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域和第一MAM之间的第一肽接头。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域和第二MAM之间的第二肽接头。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和/或第二肽接头的长度分别为约5至约500个氨基酸。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在示例性实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TC R-类似Ig接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ IDNO：3562；TCR g-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，vL结构域连接至IgCL接头并且vH结构域连接至IgCH1接头。在一些实施方案中，vL结构域附接到IgCH1接头并且vH结构域附接到IgCL接头。在一些实施方案中，Vα结构域连接至Cα衍生的接头(例如TCRa-Ig3)并且Vβ结构域连接至Cβ衍生的接头(例如TCRb-Ig3)。在一些实施方案中，Vβ结构域附着至Cα衍生的接头(例如TCRa-Ig3)并且Vα结构域附着至Cβ衍生的接头(例如TCRb-Ig3)。在一些实施方案中，Vγ结构域连接至Cγ衍生的接头(例如，TCRg-Ig3)并且Vδ结构域连接至Cδ衍生的接头(例如，TCRd-Ig3)。在一些实施方案中，Vγ结构域连接至Cδ衍生的接头(例如，TCRd-Ig3)并且Vδ结构域连接至Cγ衍生的接头(例如，TCRg-Ig3)。在一些实施方案中，设想了可变结构域和接头的其它构型。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加两条多肽链的表达、亲和力和配对的突变。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含互补链(例如，vL和vH、Vα和Vβ或Vγ和Vδ)。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。在一些实施方案中，AABD选自但不限于单vH结构域(SVH)、单vL结构域(SVL)、vHH结构域、单结构域抗体、单可变结构域TCR(svd-TCR)、非免疫球蛋白抗原结合支架、受体的配体结合结构域、配体的受体结合结构域、自身抗原、适配器结合结构域、Fc结合结构域或片段或其变体。
在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。在示例性实施方案中，靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原选自蛋白质、碳水化合物和脂质。在一些实施方案中，细胞表面抗原是CD2、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CD179b、CLL-1、FLT3、密蛋白18.2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7、ROR1、ROR2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16或Her2中的一种或多种。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的复合物。在示例性实施方案中，肽/MHC复合物包含一个肽段，其衍生自NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSA或gp100中的一种或多种。
在一个实施方案中，SAR的vL和vH结构域衍生自能够以MHC依赖性方式识别细胞内肽的TCR模拟抗体。在一个实施方案中，SAR的Vα和Vβ结构域衍生自能够识别细胞表面蛋白的不依赖于HLA的TCR。在一个实施例中，SAR是双特异性或多特异性的。在一个实施方案中，本公开提供了可以结合两种或更多种MHC限制性抗原的SAR。在一个实施方案中，SAR可以结合MHC限制性和/或MHC非限制性的两种或更多种抗原。在一个实施方案中，SAR可通过其Fv或TCR-Fv结构域结合肽/MHC复合物，并通过连接至N末端或附近的一个或多个svd-TCR结合一个或多个肽/MHC复合物。其vL和vH、Vα和Vβ或Vγ和Vδ结构域的N端。在一个实施方案中，SAR可以通过其Fv、TCR-Fv结构域和/或svd-TCR结构域结合一种或多种肽/MHC复合物，并且通过连接在其Vα和Vβ或Vγ和Vδ结构域的N末端或N末端附近的一种或多种AABD(例如，vHH、FHV H、Centyrin等)结合一种或多种表面抗原。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，第一多肽还包含位于第一MAM N端的第一铰链结构域(或连接肽)或其片段(例如，跨膜结构域)，和/或第二MAM还包含位于第二MAM N-末端的第二铰链结构域(或连接肽)或其片段(例如，跨膜结构域)。在一些实施方案中，SAR包含第一MAM中的残基与第二MAM中的残基之间的二硫键和/或第一铰链域中的残基与第二铰链域中的残基之间的二硫键。在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，第一MAM还包含位于第一铰链结构域N端的第一同源抗原结合结构域或其片段，和/或第二多肽还包含第二同源抗原结合结构域或其片段位于第二铰链结构域的N端。在一个实施方案中，两个同源抗原结合结构域衍生自与两个铰链结构域相同的非T细胞受体。在一些实施方案中，第一MAM还包含第一跨膜结构域C端的第一胞质结构域。在一些实施方案中，第二MAM还包含第二跨膜结构域C端的第二胞质结构域。在一个实施例中，第一和/或第二胞质结构域是包含一个或多个ITAM的激活结构域。在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，第一多肽链进一步包含位于第一跨膜结构域C端的第一共刺激结构域。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二跨膜结构域C端的第二共刺激结构域。在一些实施方案中，根据上述任何SA R(例如分离的SAR)，第一多肽链包含多于一个位于第一跨膜结构域C端的共刺激结构域和/或第二多肽链包含多于一个共刺激结构域位于第二跨膜结构域的C端。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域的N-末端的第一信号肽。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域的N-末端的第二信号肽。
在一些实施方案中，第一和/或第二MAM和NTCRM由非T细胞的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成受体和/或信号传导适配器。
在一些实施方案中，第一和/或第二MAM和NTCRM由跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成，它们全部衍生自单个非T细胞受体和/或单个信号传导适配器或其变体。在示例性实施方案中，第一多肽链包含全部衍生自CD3δ的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域，并且第二多肽链包含全部衍生自FcRγ或CD16A的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
在一些实施方案中，第一和/或第二MAM和NTCRM由衍生自一种或多种不同非T细胞的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成。受体和/或信号传导适配器或其变体。在示例性实施方案中，第一多肽链包含CD3 z铰链结构域、CD3 z跨膜结构域和FcRγ胞质结构域，并且第二多肽链包含DAP10铰链结构域、连接至包含41-BB共刺激的胞质结构域的DAP 10跨膜结构域。域和CD3ze激活域。
在一些实施方案中，两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上是相同的并且衍生自相同的蛋白质。在一些实施方案中，两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上不同和/或衍生自不同的蛋白质。
在一些实施方案中，两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上不同和/或衍生自不同的蛋白质。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合靶抗原的双链SAR，其包含a)包含一个或多个异源抗原结合结构域的第一链，所述异源抗原结合结构域通过一个或多个任选的接头可操作地连接至信号传导受体的胞外结构域或其变体；b)包含一个或多个异源抗原结合结构域的第二链，所述异源抗原结合结构域通过一个或多个任选的接头可操作地连接至第二信号传导受体或其变体的胞外结构域。在一个实施方案中，一种或两种信号传导受体是天然存在的。在一个实施方案中，一种或两种信号传导受体是天然存在的非T细胞受体。在一个实施方案中，存在于第一链上的至少一个异源抗原结合结构域(例如，vL、Vα或Vγ等)与存在于第一链上的至少一个异源抗原结合结构域(例如，vH、Vβ或Vδ等)缔合。第二条链形成特异性结合靶抗原的抗原结合模块(例如Fv或TCR-Fv等)。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和MHC蛋白(例如MHC I类蛋白或MHC II类蛋白)的复合物。在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，在第一多肽链中的第一任选接头中的残基与第二多肽链中的第二任选接头中的残基之间存在二硫键。在一些实施方案中，第一接头和/或第二接头的长度分别为约5至约500个氨基酸。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和/或第二信号传导受体形成能够募集至少一个信号传导适配器(例如CD3δ或NCAM等)的非T细胞受体模块(NTCRM)。在一些实施方案中，信号传导适配器选自CD3δ、FcRγ、DAP10和/或DAP12。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其包含vL(抗体轻链的可变结构域)、Va(TCRa或Vα的可变结构域)、或Vg(TCRg或Vγ的可变结构域)结构域，其通过任选的接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链或其变体的全部或部分胞外抗原结合结构域；b)第二抗原结合结构域，通过任选的接头可操作地连接的vH(抗体重链的可变结构域)、Vb(TCRb或Vβ的可变结构域)或Vd结构域(TCRd或Vδ的可变结构域)第二非TCR信号传导受体链的完整或部分胞外抗原结合结构域或其变体，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域以及第二抗原的vH、Vβ或Vδ结构域结合结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)vL结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链的整个或部分胞外抗原结合结构域或其变体；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的完整或部分胞外抗原结合结构域的vH结构域，其中vL和vH结构域形成Fv样抗原结合模块其以MHC依赖性和/或MHC非依赖性方式特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)Vα结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分胞外抗原结合结构域。其中；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分胞外抗原结合结构域的Vβ结构域，其中Vα和Vβ结构域形成TCR-Fv样抗原结合以MHC依赖性方式特异性结合肽/MHC复合物的模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)Vγ结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分胞外抗原结合结构域。其中；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的完整或部分胞外抗原结合结构域的Vδ结构域，其中Vγ和Vδ结构域形成TCR-Fv样抗原以MHC依赖性或MHC非依赖性方式特异性结合抗原的结合模块。在示例性实施方案中，非TCR信号传导受体选自但不限于以下一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KI R2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR 2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其包含vL(抗体轻链的可变结构域)、Va(TCRa或Vα的可变结构域)、或Vg(TCRg或Vγ的可变结构域)结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链的整个或部分铰链结构域或其变体；b)第二抗原结合结构域，通过任选的肽可操作地连接的vH(抗体重链的可变结构域)、Vb(TCRb或Vβ的可变结构域)或Vd结构域(TCRd或Vδ的可变结构域)连接至第二非TCR信号传导受体链或其变体的完整或部分铰链结构域的接头，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的vH、Vβ或Vδ结构域-结合结构域形成Fv或TCR-Fv样抗原结合模块，特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)vL结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链的整个或部分铰链结构域或其变体；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分铰链结构域的vH结构域，其中vL和vH结构域形成Fv样抗原结合模块，其特异性地以MHC依赖性和/或MHC非依赖性方式与靶抗原结合。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体或其变体的整个或部分铰链结构域的Vα结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分铰链结构域的Vβ结构域，其中Vα和Vβ结构域形成TCR-Fv样抗原结合模块，以MHC依赖性方式特异性结合肽/MHC复合物。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分铰链结构域的Vγ结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分铰链结构域的Vδ结构域，其中Vγ和Vδ结构域形成TCR-Fv样抗原结合模块以MHC依赖性或MHC非依赖性方式特异性结合抗原。在示例性实施方案中，非TCR信号传导受体选自但不限于以下一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL 1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL 4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgC H1等)或TCR-类似Ig接头。(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其包含vL(抗体轻链的可变结构域)、Va(TCRa或Vα的可变结构域)、或Vg(TCRg或Vγ的可变结构域)结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域；b)第二抗原结合结构域，通过任选的肽可操作地连接的vH(抗体重链的可变结构域)、Vb(TCRb或Vβ的可变结构域)或Vd结构域(TCRd或Vδ的可变结构域)与第二非TCR信号传导受体链或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的接头，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第一抗原结合结构域的vH、Vβ或Vδ结构域第二抗原结合结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体链的整个或部分跨膜/膜锚定结构域的vL结构域，或其变体；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的vH结构域，其中vL和vH结构域形成Fv样抗原结合以MHC依赖性和/或MHC非依赖性方式特异性结合靶抗原的模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)Vα结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域或其变体；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的Vβ结构域，其中Vα和Vβ结构域形成TCR-Fv样抗原以MHC依赖性方式特异性结合肽/MHC复合物的结合模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)V Y结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域或其变体；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的Vδ结构域，其中Vγ和Vδ结构域形成TCR-Fv样以MHC依赖性或MHC非依赖性方式特异性结合抗原的抗原结合模块。在示例性实施方案中，非TCR信号传导受体选自但不限于以下一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS 2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SL AMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig连头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig的接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ IDNO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至非TCR信号传导受体的整个或部分跨膜/膜锚定结构域链或信号传导适配器或其变体或片段；b)第二抗原结合结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至第二非TCR信号传导受体链或信号传导适配器或其变体或片段的整个或部分跨膜/膜锚定结构域。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域特异性结合它们分别的靶抗原。在一个实施方案中，一个或两个抗原结合结构域是自主抗原结合结构域(例如，AABD，例如，vHH、FHVH、SVH、centyrin、DARPIN、svd-TCR、适配器、受体的配体结合结构域、配体的受体结合域等)。在一个实施方案中，一个或两个抗原结合结构域包含抗体、抗体片段(例如Fab)、scFv、TCR或scTC R。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一和/或第二抗原结合结构域的N末端或N末端附近。在一个实施方案中，第一和/或第二信号链包含胞质结构域，所述胞质结构域包含激活结构域和任选的共刺激结构域。
在一个实施方案中，双链SAR保留原始信号传导受体(例如非T细胞受体)的全部或部分结合特性，并且还获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的结合特性。在一个实施方案中，双链SAR保留了原始信号传导受体的全部或部分结合特性。在一个实施方案中，双链SAR另外获得由一个或多个异源抗原结合结构域赋予的结合特性。在一个实施方案中，双链SAR保留了两种信号传导受体的信号传导特性。在一个实施方案中，双链SAR获得了两种信号传导受体单独激活时所不表现出的新信号传导特性。在一个实施例中，双链SAR获得新的信号传导特性，其是单独激活时两种信号传导受体的信号传导特性的附加。在一个实施例中，双链SAR获得新的信号传导特性，其与单独激活时的两个信号传导受体的信号传导特性具有协同作用。
在一个实施方案中，包含双链SAR的一条或两条链的信号传导受体是具有单跨膜结构域的I型膜蛋白。在一个实施方案中，信号传导受体是天然存在的信号传导受体。在一个实施方案中，信号传导受体是非TCR信号传导受体。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集信号传导适配器(例如CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12等)。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集包含激活结构域的信号传导适配器。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集包含一个或多个ITAM的信号传导适配器。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集包含一个或多个ITIM的信号传导适配器。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集包含共刺激结构域的信号传导适配器。在一个实施方案中，信号传导适配器是天然存在的。在一个实施方案中，信号传导适配器是非天然存在的。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集激活细胞内信号传导途径(例如，NFAT、NF-κB、ERK、PI 3K等)的信号传导适配器。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链能够募集抑制细胞内信号传导途径(例如，NFAT、NF-κB、ERK、PI3K等)的信号传导适配器。
在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含共刺激结构域。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含激活结构域和共刺激结构域。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链包含细胞内激活结构域。在示例性实施方案中，双链SAR的一条或两条链包含衍生自信号传导适配器的细胞内激活结构域。在示例性实施方案中，双链SAR的一条或两条链包含衍生自CD3δ、FcRγ、DAP10或DAP12的细胞内激活结构域。在一个实施例中，存在于双链SAR的一条或两条链中的激活结构域包含一个或多个ITAM。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含含有一个或多个ITAM的激活结构域。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含含有两个或更多个ITAM基序的激活结构域。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含含有单个ITAM的激活域。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链缺少ITAM。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链包含含有基于酪氨酸的基序(YINM)的激活结构域。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链包含募集PI3K和/或Grb2的p85亚基的激活结构域。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包含激活NFAT、PI3K、NF-κB和/或ERK信号传导途径中的一种或多种的激活结构域。
在一个实施方案中，SAR包含细胞内抑制结构域。在示例性实施方案中，SAR包含衍生自PD1的细胞内抑制结构域。在一个实施方案中，SAR的抑制结构域包含一个或多个ITIM基序。
在一个实施方案中，SAR能够募集信号传导适配器。在示例性实施方案中，SAR能够募集一种或多种选自但不限于CD3z、FcRγ、DAP10和DAP12的组的信号传导适配器。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至两条多肽链，其中至少一条多肽链可以募集信号传导适配器。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至两条多肽链，每条多肽链可募集信号传导适配器。在一个实施方案中，一种或两种多肽包含铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，至少一种多肽包含跨膜结构域。在一个实施方案中，两种多肽均包含跨膜结构域。在一个实施方案中，至少一种多肽包含胞质结构域。在一个实施方案中，两种多肽均包含胞质结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至两条多肽链，其中至少一条多肽链可以募集信号传导适配器。在一个实施方案中，本公开提供了一种包含一个或多个异源抗原结合结构域的双链SAR，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至包含一个或多个细胞内激活结构域的两条多肽链。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个或多个异源抗原结合结构域，所述异源抗原结合结构域通过任选的接头可操作地连接至两条多肽链，其中至少一条多肽链包含细胞内激活结构域。
在一个实施方案中，信号传导适配器是非TCR/CD3信号传导适配器。在一个实施方案中，信号传导适配器不是TCR/CD3信号传导复合物的组分。在一个实施例中，信号传导适配器不是CD3ze。在一个实施例中，信号传导适配器是非天然信号传导适配器；即，自然界中不存在的信号传导适配器。在一个实施例中，信令适配器包括一个或多个ITAM。在一个实施例中，信令适配器包含一个或多个ITIM。在一个实施方案中，信号传导适配器是二硫键连接的二聚体蛋白。在一个实施方案中，信号传导适配器是I型跨膜蛋白。在一个实施方案中，信号传导适配器能够募集信号传导蛋白，例如蛋白激酶，例如ZAP70。在一个实施方案中，信号传导适配器能够激活一种或多种细胞信号传导途径，例如NFAT、NF-κB、ERK、PI3K等。
在一个实施方案中，包含双链SAR的两条链的两条非TCR信号传导受体链具有相同的类型和序列(例如，两条信号传导链均包含CD16A、NKp46或NKp30等的胞外、跨膜和胞质结构域。)。示例性的此类双链SAR由SEQ ID NO:6383-6293、4675、4696和8344表示。在一个实施方案中，双链SAR的两条信号传导链是不同类型的(例如，一条链包含胞外、跨膜)(例如，CD16A的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域，或者CD16A的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域，第二链包括CD3ze的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域等)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4695和4670表示。
在一个实施方案中，双链SAR的两条信号链衍生自相同受体(例如，两条链均衍生自CD16A)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4676表示。在一个实施方案中，双链SAR的两条信号链衍生自不同受体(例如，一条链衍生自NKp44，第二条链衍生自NKp30等)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4713表示。
在一个实施方案中，本公开提供了双链SAR，其包含衍生自非TCR受体信号传导链(例如，CD16A)的第一链和衍生自信号传导适配器(例如，CD3δ或FcRγ)的第二链。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4670表示。
在一个实施方案中，双链SAR可包含衍生自非TCR受体信号链(例如，CD16A)的第一链和衍生自TCR信号链(例如，TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、preTCRα或其变体或片段)。在一些实施例中，本公开提供了一种双链SAR，其包含一个非TCR模块(或NTCRM)和一个TCR模块(或TCRM)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO：4708-4710表示。
在一个实施方案中，异源抗原结合结构域的vL/vH、Vα/Vβ、Vγ/Vδ链与非TCR信号链之间的任选接头是类似Ig接头(SEQ ID NO(DNA)：1142-1175和SEQ ID NO(PRT)：3536-3569)如表13所示。
在一个实施方案中，用于构建双链SAR的信号传导受体是在免疫细胞表面上表达的任何受体。在一个实施方案中，信号传导受体是在免疫细胞表面表达的天然存在的信号传导受体的信号传导链。在一个示例性实施方案中，所述免疫细胞选自但不限于T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞和B细胞。可用于构建本公开的双链SAR的示例性信号传导受体包括CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KI R2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec3、Siglec-7和Siglec-9等或其变体。在进一步的实施方案中，自主抗原结合结构域(例如，完全人vH结构域、vHH、单链TCR等)、非免疫球蛋白抗原结合结构域(例如，Centyrin、亲和体等)、配体(例如，APRIL、TPO、NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA等)，以及受体的胞外结构域(例如，NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、CD16A等)、适配器结合结构域(例如，EZip、RZip、E4、R4等).)可以可操作地连接到SAR的vL、vH、Vα、Vβ、Vγ或Vδ链的氨基末端或氨基末端附近，以赋予SAR额外的抗原结合能力。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的SAR(例如分离的SAR)，其中所述SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含vL、Vα或Vγ结构域和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含vH、Vβ或Vδ结构域，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块，并且其中第一MAM和/或第二MAM形成非-T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，SAR能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施例中，第一和/或第二MAM衍生自但不限于以下信号传导适配器中的一个或多个：CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12或其变体或片段。在一个实施方案中，NTCRM由但不限于以下信号传导适配器中的一种或多种组成：CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12。在一些实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(NCAM)。在一些实施方案中，信号传导适配器不是CD3ze。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域和第一MAM之间的第一肽接头。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域和第二MAM之间的第二肽接头。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和/或第二肽接头的长度分别为约5至约500个氨基酸。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH 2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头。(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含互补链(例如，vL和vH、Vα和Vβ或Vγ和Vδ)。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。在示例性实施方案中，靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原选自蛋白质、碳水化合物和脂质。在一些实施方案中，细胞表面抗原是CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CLL-1、FLT3、密蛋白18.2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7、ROR1、RO R2、GPRC5D中的一种或多种，FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16或Her2。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的复合物。在示例性实施方案中，肽/MHC复合物包含衍生自NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-中的一种或多种的肽。E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSA或gp100。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，第一MAM进一步包含第一跨膜结构域N端的第一铰链结构域或其片段，第二MAM进一步包含第二铰链结构域或其片段位于第二跨膜结构域的N-末端。在一些实施方案中，NTCRM包含第一铰链结构域中的残基和第二铰链结构域中的残基之间的二硫键。在一些实施方案中，第一MAM还包含第一跨膜结构域C端的第一胞质结构域。在一些实施方案中，第二MAM还包含第二跨膜结构域C端的第二胞质结构域。在一个实施例中，第一和/或第二胞质结构域是包含一个或多个ITAM的激活结构域。在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，第一多肽链进一步包含位于第一跨膜结构域C端的第一共刺激结构域。在一些实施方案中，第二多肽链还包含位于第二跨膜结构域C端的第二共刺激结构域。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域的N-末端的第一信号肽。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域的N-末端的第二信号肽。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其包含vL(抗体轻链的可变结构域)、Va(TCRa或Vα的可变结构域)、或Vg(TCRg或Vγ的可变结构域)结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域；b)第二抗原结合结构域，通过任选的肽可操作地连接的vH(抗体重链的可变结构域)、Vb(TCRb或Vβ的可变结构域)或Vd结构域(TCRd或Vδ的可变结构域)连接至第二信号传导导适配器或其变体的完整或部分铰链结构域的接头，其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域与第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)vL结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域的vH结构域，其中vL和vH结构域形成特异性结合至以MHC依赖性和/或MHC非依赖性方式靶向抗原。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域的Vα结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域的Vβ结构域，其中Vα和Vβ结构域形成特异性结合的TCR-Fv样抗原结合模块以MHC依赖性方式形成肽/MHC复合物。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域的Vγ结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分铰链结构域的Vδ结构域，其中Vγ和Vδ结构域形成特异性结合的TCR-Fv样抗原结合模块以MHC依赖性或MHC非依赖性方式结合至抗原。在示例性实施方案中，信号传导适配器选自但不限于以下的一种或多种：CD3z、FcRγ、DAP10或DAP10或其变体或片段。在一些实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(NCAM)。在一些实施方案中，信号传导适配器不是CD3ze。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头。(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，信号传导适配器还包含一个或多个共刺激结构域。在示例性实施方案中，信号传导适配器包含来自CD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS的共刺激结构域，或者变体或片段其中。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)第一抗原结合结构域，其包含vL、Vα或Vγ结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至整个或部分跨膜/膜信号传导适配器的锚定结构域或其变体；b)包含vH、Vβ或Vδ结构域的第二抗原结合结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域，其中vL，第一抗原结合结构域的Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的Fv或TCR-Fv样抗原结合模块。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)vL结构域，其通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导信号传导适配器或其变体的整个或部分跨膜/膜锚定结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的vH结构域，其中vL和vH结构域形成Fv样抗原结合模块，其特异性地以MHC依赖性和/或MHC非依赖性方式与靶抗原结合。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的整个或部分跨膜/膜锚定结构域的Vα结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的Vβ结构域，其中Vα和Vβ结构域形成TCR-Fv样抗原结合模块，以MHC依赖性方式特异性结合肽/MHC复合物。在一个实施方案中，本公开提供了一种特异性结合抗原的双链SAR，其包含a)通过任选的肽接头可操作地连接至信号传导适配器或其变体的整个或部分跨膜/膜锚定结构域的Vγ结构域；b)通过任选的肽接头可操作地连接至第二信号传导适配器或其变体的全部或部分跨膜/膜锚定结构域的Vδ结构域，其中Vγ和Vδ结构域形成TCR-Fv样抗原结合模块以MHC依赖性或MHC非依赖性方式特异性结合抗原。在示例性实施方案中，信号传导适配器选自但不限于以下的一种或多种：CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12或其变体或片段。在一些实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(NCAM)。在一些实施方案中，信号传导适配器不是CD3ze。在一些实施方案中，信号传导适配器还包含一个或多个共刺激结构域。在示例性实施方案中，信号传导适配器包含来自CD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS的共刺激结构域，或者变体或片段其中。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在一些实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头。
(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ ID NO：3562；TCRg-Ig3，SEQ IDNO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含a)一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至信号传导适配器(或信号传导链)或其变体的一条链的氨基末端或氨基末端附近；b)一个或多个异源抗原结合结构域，其通过任选的接头可操作地连接至信号传导适配器(或信号传导链)或其变体的第二链的氨基末端或氨基末端附近。在实施例中，这样的SAR保留原始信令适配器(或信令链)的信令能力。在一个实施方案中，SAR还获得异源抗原结合结构域赋予的结合能力。在示例性实施方案中，信号传导适配器是可以在细胞(例如免疫细胞，例如免疫效应细胞)的质膜上表达的任何信号传导适配器(或信号传导链)。在一个示例性实施方案中，所述免疫细胞选自但不限于T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞或B细胞。可用于构建本公开的SAR的示例性信号传导适配器(或信号传导链)包括但不限于CD3z(CD3z)、FcRγ(FcεRIγ)、DAP10和DAP12等或其变体。
本公开提供了SAR，其中一个或多个异源抗原结合结构域可操作地连接至信号传导适配器的一条或多条链的胞外结构域(例如铰链或间隔结构域)。在一个实施方案中，SAR包含作为TCR复合物的组分的信号传导适配器(例如，CD3z、CD3ε、CD 3γ、CD3ε等)。在一个实施方案中，SAR包含与TCR复合物的TCRα、β、γ和/或δ链相互作用的信号传导适配器(例如，CD3z)。在一个实施方案中，SAR包含不与TCR复合物的TCRα、β、γ和/或δ链相互作用的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其在其跨膜结构域中具有保守的天冬氨酸残基，其与跨膜区或TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中的带正电荷的残基(赖氨酸或精氨酸)相互作用。在一个实施方案中，SAR包含在其跨膜结构域中缺乏保守的天冬氨酸残基的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含不是TCR复合物的组分的信号传导适配器。在一个实施例中，信号传导适配器是非CD3信号传导适配器(NCAM)。在一个实施例中，信号传导适配器不是CD3z或其变体。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，SAR包含激活细胞信号传导的信号传导适配器(例如CD3z)。在一个实施方案中，SAR包含抑制细胞信号传导的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含具有一个或多个ITAM基序的信号传导适配器(例如CD3z)。在一个实施方案中，SAR包含具有两个或更多个ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含具有单个ITAM基序的信号传导适配器(例如，FcRγ)。在一个实施方案中，SAR包含缺乏ITAM基序的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器(例如，DAP10)，其包含基于酪氨酸的基序(YINM)。在一个实施方案中，SAR包含募集PI3K和/或Grb2的p85亚基的信号传导适配器(例如，DAP10)。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其是其天然形式的二硫键接头二聚体。在一个实施方案中，信号传导适配器不是其天然形式的二硫键接头二聚体。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器(例如，CD3z)，其在其天然状态下包含位于其跨膜区域中的链间二硫键。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器(例如，DAP10和DAP12)，其在其天然状态下含有不位于其跨膜区域中的链间二硫键。在一个实施方案中，SAR包含信号传导适配器，其在其天然状态下含有位于其胞外区的链间二硫键。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，信号传导适配器的胞外结构域的长度小于10个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度小于8个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度超过10个氨基酸。在一个实施方案中，信号传导适配器的胞外结构域长度超过15个氨基酸。
在一些实施方案中，根据上述任何SAR(例如分离的SAR)，SAR包含诱导蛋白质磷酸化的信号传导适配器。在一个实施方案中，SAR包含诱导蛋白质去磷酸化的信号传导适配器。在一个实施例中，SAR包含与Zap70相互作用的信号传导适配器。在一个实施例中，SAR包含不与Zap70相互作用的信号传导适配器。在一个实施例中，双链SAR的两条链包含相同的信号传导导适配器(例如，CD3z和CD3z)。在一个实施方案中，双链SAR的两条链包含不相同的信号传导导适配器(例如，CD3z和FcRγ或CD3z和DAP10或DAP10和DAP12等)。
在一些实施方案中，根据上述包含信号传导适配器(例如分离的SAR)的任何双链SAR，双链SAR的一条或两条链包含含有共刺激结构域(例如衍生自的共刺激结构域4-1BB、CD28、2B4、OX40等)的信号传导适配器。在一个实施方案中，双链SAR的一条或两条链包括含有共刺激域(例如，衍生自4-1BB、CD28、2B4、OX40等的共刺激域)的信号传导适配器，这些共刺激域在操作上连接到激活域(例如，CD3ζ激活域)。典型的CD3ζ信号传导适配器连接到CD28和4-1BB的共刺激结构域，分别在SEQ ID NO:3493和3494中提出。典型的SARs包括OX40的共刺激结构域融合到CD3ζ的激活结构域，由SEQ ID NO:4460和4479表示。在一个实施例中，双链SAR的一条或两条链包括包含两个不同的信号传导适配器的细胞质结构域融合的信号传导适配器。一个示例性的SAR由包含DAP10和CD3ζ胞质结构域融合的链组成，由SEQID NO:4460表示。在一个实施例中，SAR包括信号传导适配器，包括CD3z(或CD3ζ)、FcRγ、DAP10和DAP12的突变体，其携带的突变可取消链间二硫键。示例性的这种信号传导适配器由SEQ ID号:3747、3753、3760、3817和3820表示。在一个实施例中，信号链包括CD3z、FcRγ、DAP10和DAP12的突变体，其在其ITAM基元中携带一个或多个突变(例如，CD3z的IXX突变体)。示例性的这种信号传导适配器由SEQ ID NO:9824表示。
可用于构建本公开内容的双链SAR的示例性抗原结合结构域包括抗体的可变结构域(例如，vL、vH)、TCR的可变结构域(例如，Va、Vb、Vg或Vd链)等)、抗体、抗体片段(例如Fab、Fab2)、自主抗原结合结构域(例如全人vH结构域、vHH、单链TCR、svd-TCR等)、scFv、非免疫球蛋白抗原结合结构域(例如，Centyrin、亲和体、ZIP结构域、适配器等)、配体和受体的胞外结构域、自身抗原、TCR、HLA非依赖性TCR、TCR的可变结构域(例如，Va、Vb、Vg、在进一步的实施方案中，自主抗原结合结构域(例如，完全人vH结构域、vHH、单链TCR等)、非免疫球蛋白抗原结合结构域(例如，Centyrin、affibody等)或其片段等。)、配体(例如，APRIL、TPO、NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA等)和受体的胞外结构域(例如，NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、CD16A等)、适配器结合结构域(例如，EZip、RZip、E4、R4等)可以可操作地连接到SAR的vL、vH、Vα、Vβ、Vγ或Vδ链的氨基末端或氨基末端附近，以赋予额外的抗原结合能力。特别行政区。
在一个实施方案中，双链SAR的两个信号传导适配器是相同类型的(例如，两条链均衍生自CD3z)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4702表示。在一个实施方案中，包含双链SAR的两个信号传导适配器属于不同类型(例如，一个信号传导适配器衍生自CD3ze，第二个信号传导适配器衍生自FcRγ等).)。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:6733表示。
在一个实施方案中，双链SAR可包含衍生自非TCR受体信号传导链(例如，CD 16A)的一条链和衍生自信号传导适配器(例如，CD3δ或FcRγ)的另一条链。示例性的此类SAR由SEQ ID NO:4670表示。
在一个实施方案中，双链SAR可包含一条包含信号传导适配器(例如，CD3z)的链和另一条包含TCR恒定链(例如，TCRα-T48C)的链。
在一个实施方案中，任选的接头是长接头。在一个实施方案中，异源抗原结合结构域的vL/vH、Vα/Vβ、Vγ/Vδ链与非TCR信号链之间的任选接头是类似Ig接头(SEQ ID NO(DNA)：1142-1175和SEQ ID NO(PRT)：3536-3569)如表13所示。
在一些实施方案中，本公开提供了具有T细胞的靶识别特性和功能的非T细胞的细胞。在一个实施方案中，本公开提供了非T细胞(即非T细胞)的细胞，其表达赋予细胞T细胞受体样靶识别和/或信号转导的受体。在一个实施方案中，本公开提供了非T细胞(即非T细胞)的细胞，其表达双链或多链受体，所述双链或多链受体赋予细胞T细胞受体样靶识别和/或信号转导。在一个实施方案中，双链或多链受体包含至少两个膜相关结构域(例如，跨膜结构域或膜锚定结构域)。在一个实施方案中，双链或多链受体包含至少两个跨膜结构域。在一个实施方案中，T细胞受体样识别包括与MH C分子呈递的肽靶标的特异性结合。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即非T细胞)缺乏T细胞链的表达和/或缺乏功能性TCR链的表达。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即非T细胞)缺乏功能性TCR/CD3复合物的表达。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即非T细胞)缺乏CD3ε、CD3γ和CD3δ或其变体或片段中的一种或多种的表达。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即非T细胞)未被工程化以外源表达CD3ε、CD3γ和CD3δ链或其变体或片段中的一种或多种。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即非T细胞)未被工程化以外源表达一条或多条TCR链或其变体或片段。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即，非T细胞)不被CD3激动性抗体激活。在一个实施方案中，不是T细胞的细胞(即，非T细胞)不被OKT3抗体激活。
在一个实施方案中，本公开提供了具有T细胞受体样靶标识别的非T细胞，其产生自NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、iPSC衍生的T细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、树突状细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系或其衍生物。在一个实施方案中，本公开提供了具有T细胞受体样靶标识别的非T细胞，其是在将单一受体引入非功能性T细胞的细胞后产生的。在一个实施方案中，本公开提供了具有T细胞受体样靶标识别的非T细胞，其在没有遗传修饰的情况下产生，涉及将四个CD3链，即CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ异位表达到非T细胞中。功能性T细胞。
在一个实施方案中，表达双链受体(例如SAR，例如uTCR-SAR)的非T细胞在特异性结合靶抗原后导致至少一种信号传导适配器的募集。在一个实施方案中，表达双链受体的非T细胞在特异性结合靶抗原后导致至少一种信号传导途径的激活。在示例性实施方案中，信号传导途径选自但不限于NFAT、NF-κB、PI3K或ERK途径。在一个实施方案中，表达双链受体的非T细胞在结合靶抗原后导致至少一种生物活性的激活。在一个实施方案中，生物活性选自但不限于细胞活化、增殖、分化、细胞因子分泌、吞噬作用、迁移或细胞毒性。
另一方面，本公开提供了具有主要组织相容性复合体(MHC)限制性抗原特异性细胞毒性的修饰细胞，例如但不限于自然杀伤(NK)细胞。MHC可以是MHC-I类、MHC-II类和MHC样分子中的任何分子。MHC样分子的非限制性实例是HLA-E。
另一方面，本公开提供了用于产生修饰细胞的方法，所述修饰细胞例如但不限于自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞，其表达具有两个跨膜/膜相关结构域和TCR样抗原识别的双链受体。该方法包括提供细胞(例如自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞)并修饰该细胞以表达具有TCR样结合特性的抗原特异性受体。修饰的细胞可以是任何细胞。常用的非限制性实例是NK-92细胞、YTS细胞和原代人NK细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供了一类具有TCR样结合特性的SAR，其可以在任何细胞类型中表达。这种具有TCR样结合特性和通用表达的SAR被称为通用TCR-SAR或uTCR-SAR或uTCR。本文提供了单链和多链(例如双链)uTCR-SAR，其包含可以表达的TCR的可变抗原结合结构域(例如Va/Vα、Vb/Vβ、Vg/Vγ、Vd/Vδ等)。不仅在T细胞中，而且在任何其它细胞中，包括但不限于NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、内皮细胞和上皮细胞等。在一个实施方案中，表达uTCR的细胞对靶细胞作出反应通过增加细胞增殖、活化、细胞因子分泌和细胞毒性来表达其抗原。在一个实施方案中，靶抗原是作为MHC复合物的一部分呈现的肽。在一个实施方案中，靶抗原是脂质。如果uTCR的TCR结合域衍生自HLA独立的TCR，则uTCR也可能对非MHC限制性抗原作出反应。在一个实施方案中，本公开提供了非T细胞的细胞，其功能性地表达具有TCR样结合特性的双链受体，包括当由MHC复合体呈递时与胞内肽结合的特性。
本公开提供了包含一个或多个异源抗原结合结构域的单链uTCR-SAR，所述异源抗原结合结构域包含scTCR、svd-TCR或TCR模拟物scFv或其片段，其通过任选的接头可操作地连接至非TCR信号传导受体的整个或部分胞外结构域。在一些实施方案中，本公开提供包含scTCR、svd-TCR或TCR模拟物scFv的单链SAR获得TCR样结合能力(例如，结合肽/MHC复合物的能力)并且可以在任何细胞中表达，包括非T细胞或表达TCR链的细胞。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，其中所述uTCR-SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链和第一个膜相关模块(MAM)；b)包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)的第二多肽链，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域形成TCR样(例如TCR-Fv)特异性结合靶抗原的抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
在一个实施方案中，uTCR-SAR的第一和第二抗原结合结构域包含TCR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，uTCR-SAR的第一和第二抗原结合结构域包含特异性结合由MHC分子呈递的肽的TCR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含TCR的可变结构域。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含TCR的Vα、Vβ、Vγ和Vδ结构域。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域包含Vα结构域或其变体或片段，并且第二抗原结合结构域包含Vβ结构域或其变体或片段。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域包含Vγ结构域或其变体或片段，并且第二抗原结合结构域包含Vδ结构域或其变体或片段。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域包含preTCRα或其变体或片段的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域包含Vβ结构域或其变体或片段。在一个实施方案中，靶抗原是肽/MHC复合物。在一个实施方案中，被uTCR-SAR识别的肽是细胞内肽。在一个实施方案中，uTCR-SAR的靶抗原是MHC非依赖性抗原。在一个实施方案中，靶抗原是脂质。在一个实施方案中，uTCR-SAR包含HLA非依赖性TCR的可变结构域并且其靶抗原是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，uTCR-SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。
在一个实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域不衍生自抗体或抗体片段。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域不是抗体或其变体或片段的可变结构域。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域不是抗体的vL和vH结构域。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域不是TCR模拟抗体的vL和vH结构域。
在一个实施方案中，TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块特异性结合由MHC分子呈递的肽。在一个实施方案中，TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块特异性结合不由MHC分子呈递的抗原(例如HLA非依赖性抗原)。在一个实施方案中，TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块特异性结合脂质抗原。
在一个实施例中，uTCR-SAR的至少一个MAM包含信号传导适配器的跨膜结构域。在一个实施例中，uTCR-SAR的两个MAM均包含信号传导适配器的跨膜结构域。在一个实施方案中，uTCR-SAR的至少一个MAM包含能够募集信号传导适配器的信号传导受体的跨膜结构域/膜相关结构域。在一个实施方案中，uTCR-SAR的两个MAM均包含能够募集信号传导适配器的信号传导受体的跨膜结构域/膜相关结构域。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，其中所述uTCR-SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含Vα或Vγ结构域和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含Vβ或Vδ结构域，其中第一抗原结合结构域的Vα或Vγ结构域与互补的Vβ或Vδ结构域第二抗原结合结构域的结构域形成特异性结合靶抗原的TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施方案中，靶抗原是肽/MHC复合物。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，其中所述uTCR-SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含Vα结构域(衍生自TCRα链的可变结构域)和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含Vβ结构域(衍生自TCRβ链的可变结构域)和第二膜相关模块(MAM)，其中第一抗原结合结构域的Vα结构域和Vβ第二抗原结合结构域的一部分形成特异性结合靶抗原的TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施方案中，靶抗原是肽/MHC复合物。在一个实施方案中，靶抗原是MHC(HLA)非依赖性抗原。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，其中所述uTCR-SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含Vγ结构域(衍生自TCRγ链的可变结构域)和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含Vδ结构域(衍生自TCRδ链的可变结构域)和第二膜相关模块(MAM)，其中第一抗原结合结构域的Vγ结构域和Vδ第二抗原结合结构域的一部分形成特异性结合靶抗原的TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施方案中，靶抗原是肽/MHC复合物。在一个实施方案中，靶抗原是MHC(HLA)非依赖性抗原。在一个实施方案中，靶抗原是脂质。
在一些实施方案中，提供了特异性结合靶抗原的uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，其中所述uTCR-SAR包含：a)包含第一抗原结合结构域的第一多肽链，所述第一抗原结合结构域包含V-preTCRα结构域(衍生自preTCRα链的可变结构域)和第一膜相关模块(MAM)；b)第二多肽链，其包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含Vβ结构域(衍生自TCRβ链的可变结构域)和第二膜相关模块(MAM)，其中第一抗原结合结构域的Vα结构域和Vβ第二抗原结合结构域的一部分形成特异性结合靶抗原的TCR样(例如TCR-Fv)抗原结合模块，并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)。在一个实施方案中，NTCRM能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。在一个实施方案中，靶抗原是肽/MHC复合物。
在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTCRα的TCR链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM或第二MAM不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTCRα的TCR链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含选自CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3δ的CD3链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含TCR链和CD3链的跨膜结构域。在一个实施例中，第一MAM和第二MAM不包含CD3z的跨膜结构域。在一些实施方案中，uTCR-SAR的第一和第二MAM包含信号传导适配器的跨膜或膜相关结构域。在一个实施方案中，信号传导适配器选自但不限于CD3δ、FcRγ、DAP10和/或DAP12或其变体或片段中的一种或多种。在一些实施方案中，信号传导适配器是非CD3适配器(NCAM)。在一些实施方案中，信号传导适配器不是CD3ze。在一个实施方案中，uTCR-SAR的MAM包含非TCR受体。在一个实施方案中，非TCR选自但不限于以下的一种或多种：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KI R3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160和ILT2。包含与包含NKp46和CD16和NKp30铰链结构域的两个多肽连接的NY-ESO-1TCR可变结构域的示例性uTCR-SAR分别由SEQID NO:10467和10468表示。包含与包含NKp30胞外结构域的两个多肽连接的NY-ESO-1TCR的Va和Vb结构域的示例性uTCR-SAR由SEQ ID NO:10469表示。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链经由一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域和第一MAM之间的第一肽接头。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域和第二MAM之间的第二肽接头。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一肽接头和/或第二肽接头的长度分别为约5至约500个氨基酸。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域、或其变体或片段。在示例性实施方案中，第一和/或第二接头分别包含衍生自免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO：3536-3551)的类似Ig接头(例如，IgCL、IgCH1等)或TCR-类似Ig接头(例如TCRb-Ig3，SEQ ID NO：3560；TCRa-Ig3，SEQ IDNO：3562；TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566；或TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568等)或变体或其中的一个片段。在一些实施方案中，第一和/或第二肽接头包含增加其表达、亲和力和链配对的突变。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含互补链(例如，Vα和Vβ或Vγ和Vδ)。在一些实施方案中，第一和第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一多肽链的N末端或靠近第一多肽链的N末端(例如，vL、Vα或Vγ)并且/或第二(例如，vH、Vβ或Vδ)抗原结合结构域。在一些实施方案中，SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的复合物。在示例性实施方案中，肽/MHC复合物包含衍生自NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-中的一种或多种的肽。E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSA或gp100。在一些实施方案中，uTCR是可以靶向细胞表面抗原的HLA独立的TCR。在一个实施方案中，靶抗原是细胞表面抗原。在示例性实施方案中，靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原选自蛋白质、碳水化合物和脂质。在一些实施方案中，细胞表面抗原是CD2、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CD179b、CL L-1、FLT3、密蛋白18.2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7中的一种或多种，ROR1、ROR 2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16或Her2。在一个实施例中，uTCR-SAR是双特异性或多特异性的。在一个实施方案中，本公开提供了可以结合两种或更多种MHC限制性抗原的uTC R。在一个实施方案中，uTCR-SAR可以结合MHC限制性和/或MHC非限制性的两种或更多种抗原。在一个实施方案中，uTCR-SAR可通过其TCR-Fv结构域结合肽/MHC复合物，并通过连接至N末端或附近的一个或多个svd-TCR结合一个或多个肽/MHC复合物。其Vα和Vβ或Vγ和Vδ结构域的N末端。在一个实施方案中，uTCR-SAR可以通过其TCR-Fv结构域和svd-TCR结构域结合一种或多种肽/MHC复合物，并通过一种或多种AABD(例如，vHH、FHVH、centyrin)结合一种或多种表面抗原。等)连接至其Vα和Vβ或Vγ和Vδ结构域的N末端或N末端附近。
在一些实施方案中，根据上述任何uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，第一MAM进一步包含位于第一跨膜结构域N端的第一铰链结构域或其片段，和/或第二MAM进一步包含第二跨膜结构域N端的第二铰链结构域或其片段。在一些实施方案中，NTCRM包含第一铰链结构域中的残基和第二铰链结构域中的残基之间的二硫键。在一些实施方案中，根据上述任何uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，第一MAM还包含位于第一铰链结构域和/或第二MAM的N端的第一抗原结合结构域或其片段。还包含位于第二铰链结构域N端的第二抗原结合结构域或其片段。在一些实施方案中，第一MAM还包含第一跨膜结构域C端的第一胞质结构域。在一些实施方案中，第二MAM还包含第二跨膜结构域C端的第二胞质结构域。在一个实施例中，第一和/或第二胞质结构域是包含一个或多个ITAM的激活结构域。在一些实施方案中，uTCR-SAR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原。
在一些实施方案中，根据上述任何uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，第一多肽链进一步包含位于第一跨膜结构域C端的第一共刺激结构域。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二跨膜结构域C端的第二共刺激结构域。在一些实施方案中，根据上述任何uTCR-SAR(例如分离的uTCR-SAR)，第一多肽链包含多于一个位于第一跨膜结构域和/或第二多肽链C端的共刺激结构域第二跨膜结构域的C端包含多于一个共刺激结构域。在一些实施方案中，第一多肽链还包含第一抗原结合结构域的N-末端的第一信号肽。在一些实施方案中，第二多肽链还包含第二抗原结合结构域的N-末端的第二信号肽。
在一个实施例中，本发明提供了一种双链uTCR-SAR结构体(例如分离的结构体)，其特异性靶向抗原(例如，肽/MHC复合物)，该抗原包含TCR可变结构域(例如，Va/Vα、Vb/Vβ、Vg/Vγ、Vd/Vδ等)，这些结构域与包含非t细胞受体模块(NTCRM)的至少一种多肽融合。在一些实施例中，SAR包括一个或多个TCR可变结构域，其特异性结合靶抗原(例如，肽/MHC复合物或脂质抗原)和能够招募至少一个信号转接器的非t细胞受体模块(NTCRM)。在示例性的实施方案中，信号传导适配器是但不限于CD3δ、FcRγ、DAP10或DAP12中的一种或多种。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和MHC蛋白(例如MHC I类蛋白或MHC II类蛋白)的复合物。
在一个实施方案中，uTCR-SAR在细胞表面表达。在一个实施方案中，uTCR-SAR在非T细胞的细胞表面上表达。在一个实施方案中，uTCR-SAR在缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、前TCRα链或其变体或片段表达的细胞表面上表达。在一个实施方案中，uTCR-SAR在缺乏CD3ε、Cd3γ和CD3δ链或其变体或片段表达的细胞表面上表达。在一个实施方案中，具有TCR样特性的uTCR-SAR当在T细胞中表达时具有功能活性(即，能够诱导细胞增殖、细胞因子分泌或细胞毒性)。在一个实施方案中，当在非T细胞的细胞中表达时(即，当在NK细胞、巨噬细胞、粒细胞树突状细胞中表达时)，uTCR-SAR具有功能活性(即，能够诱导细胞增殖、细胞因子分泌或细胞毒性)。细胞等)。在一个实施方案中，SAR在缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和前TCRα链或其变体或片段的表达的细胞中表达并具有功能活性。在一个实施方案中，uTCR-SAR在缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和前TCRα链或其变体的表达和/或功能的细胞中表达并具有功能活性。在一个实施方案中，uTCR-SAR在缺乏CD3ε、Cd3γ和CD3δ链或其变体的表达和/或功能的细胞中表达并具有功能活性。
在一个实施方案中，uTCR-SAR向T细胞赋予TCR样抗原识别。在一个实施方案中，uTCR-SAR将TCR样抗原识别赋予T细胞以外的细胞(例如NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、CIK、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、上皮细胞、iPSC衍生的NK细胞等)。在一个实施方案中，uTCR-SAR能够以MHC(HLA)依赖性方式结合肽抗原。在示例性实施方案中，表达uTCR-SAR的细胞(例如NK细胞或巨噬细胞)可以以MHC(HLA)依赖性方式识别细胞内肽抗原。在示例性实施方案中，表达uTCR-SAR的免疫细胞(例如，NK细胞或巨噬细胞)可以以MHC(HLA)依赖性方式识别细胞内肽抗原并激活一种或多种细胞信号传导途径(例如，NFAT、PI3K、NF-κB通路等)。在示例性实施方案中，表达uTCR-SAR的免疫细胞(例如，NK细胞或巨噬细胞)可以以MHC(HLA)依赖性方式识别细胞内肽抗原并阻断一种或多种细胞信号传导途径(例如，NFAT、PI3K、NF-κB通路等)。在一个实施方案中，表达uTCR/SAR的免疫细胞(例如NK细胞、T细胞或巨噬细胞)具有诱导细胞活化、增殖、细胞因子分泌(例如IFNγ、TNFα和IL2的分泌)和/或细胞毒性的能力。结合其目标肽抗原后。在一个实施方案中，表达uTCR-SAR的免疫细胞(例如NK细胞、T细胞或巨噬细胞)具有阻断细胞活化、增殖、细胞因子分泌(例如IFNγ、TNFα和IL2的分泌)和/或细胞毒性的能力。结合其目标肽抗原后。在一个实施方案中，uTCR-SAR是激活受体。在一个实施方案中，uTCR-SAR是抑制性受体。
在一个实施方案中，uTCR-SAR包含衍生自TCR可变结构域的一个或多个抗原结合结构域(例如，Va/Vα、Vb/Vβ、Vg/Vγ、Vd/Vδ和preTCRα)并且具有两条链。在一个实施例中，uTCR-SAR包含Va/Vα和Vb/Vβ结构域。在一个实施例中，uTCR-SAR包含Vg/Vγ和Vd/Vδ结构域。在一个实施例中，uTCR-SAR包含preTCRα和Vb/Vβ结构域。在一个实施方案中，uTCR SAR的两个可变结构域存在于两条单独的多肽链上。在一个实施方案中，包含uTCR SAR的抗原结合结构域(例如，肽/MHC复合物结合结构域)的两个可变结构域不是单个多肽链的一部分。在一个实施方案中，uTCR-SAR的两个可变结构域不通过接头可操作地连接，即，uTCR不是单链TCR(scTCR)。
在一个实施方案中，uTCR的一条或两条链包含跨膜结构域或膜锚定结构域。在一个实施方案中，uTCR SAR的一条或两条链包含胞质结构域。在一个实施方案中，uTCR SAR的一条或两条链包含能够募集信号传导蛋白或信号传导适配器的跨膜和/或胞质结构域。在一个实施方案中，双链uTCR SAR的一条或两条链包含一个或多个胞质激活结构域。在一个实施方案中，双链uTCR SAR的一条或两条链在其胞质结构域中包含一个或多个ITAM。在示例性实施方案中，双链uTCR SAR的一条或两条链包含含有1、2或3个ITAM的胞质结构域。在示例性实施例中，uTCR SAR的一条链包含具有单个ITAM的胞质结构域，而第二条链具有具有3个ITAM的胞质结构域。在示例性实施方案中，一条链包含具有单个1个ITAM的胞质结构域，而第二条链包含具有2或3个ITAM的胞质结构域。在一个实施方案中，双uTCR SAR的一条或两条链包含一个或多个抑制基序，例如ITIM。在一个实施方案中，uTCR-SAR包含衍生自其中1个或多个ITAM突变的CD3δ链的胞质激活结构域。在示例性实施方案中，uTCR-SAR包含衍生自CD3δ链的胞质激活结构域，其中1个或多个ITAM的酪氨酸残基突变为苯丙氨酸。
在一个实施方案中，本公开内容还提供了uTCR-SAR，其包含TCR的可变结构域(例如Vα、Vβ、Vγ和Vδ等)作为其抗原结合结构域可操作地连接至信号链(适配器)和/或非信号链的胞外结构域。-TCR受体并包含共刺激结构域。
在一个实施例中，具有TCR样结合特性的双链uTCR SAR的一条或两条链任选地包含一个或多个共刺激结构域。在一个实施方案中，一个或多个共刺激结构域位于一条或两条链的近膜区域中。在示例性实施方案中，共刺激结构域衍生自4-1BB、CD28、CD27、CD81、OX40、2B4或CD2等的胞质结构域。包含CD28和4-1BB的共刺激结构域的示例性此类CD3ze信号链是分别呈现于SEQ ID NO：3493和3494中。由于SAR在格式上是模块化的，CD28和4-1BB的共刺激结构域可以被衍生自其它共刺激受体(例如OX40、2B4、CD2、CD81等)及其变体的共刺激结构域替换，以产生新的uTCR-SAR。类似地，一个或两个CD3ze信号链可以替代其它信号链以产生基于FcRγ、DAP10和DAP10及其变体的信号链并包含不同共刺激结构域的新型uTCR-SAR。示例性的此类uTCR-SAR靶向NY-ESO1肽/MHC复合物由SEQ ID NO：10481-10530表示。
在一个实施例中，具有TCR样结合特性的uTCR SAR是单特异性的。在一个实施例中，具有TCR样结合特性的uTCR SAR是双特异性的。在一个实施例中，具有TCR样结合特性的uTCR SAR是双互补位的。在一个实施例中，具有TCR样结合特性的uTCR SAR是多特异性的。在一个实施方案中，本公开提供了具有TCR样结合特性的uTCR SAR，当由MHC复合物呈递时，其能够结合两个或更多个不同的细胞内肽。在一个实施例中，本公开提供具有TCR样结合特性的uTCR SAR，其能够结合细胞内肽和细胞表面表达的(或细胞外)蛋白质(例如，CD19、CD20等)。靶向NY-ESO-1肽/MHC复合物和CD20的示例性此类uTCR-SAR由SEQ ID NO:10478表示。在此构建体中，靶向CD20的vHH结构域通过小接头连接至靶向NY-ESO-1肽的Vb结构域的N末端。CD20 vHH结构域可以被针对其它表面抗原或肽/MHC复合物的其它AABD替换。在示例性实施方案中，CD20vHH结构域被靶向MAGE-A3肽/HLA-A2复合物的单可变结构域TCR替代，以产生可靶向NY-ESO-1和MAGE-A3肽两者的双特异性uTCR-SAR。AABD还可以连接到uTCR的Va结构域以生成双特异性SAR，或者连接到Vb和Va结构域以生成多特异性uTCR-SAR。此外，多于一个AABD(例如，vHH、FHVH、centyrins、svd-TCR)可以连接至uTCR-SAR的每个可变结构域的N-末端。在一个实施例中，本公开提供了具有TCR样结合特性的uTCRSAR，其能够以MHC(或HLA)依赖性和MHC(HLA)非依赖性方式与其靶抗原结合。
在一个实施方案中，具有TCR结合特性的uTCR SAR包含两个可变结构域(例如，Vα和Vβ或Vγ和Vδ等)，其彼此缔合以形成结合肽/肽的可变TCR片段(TCR-Fv)。MHC复合体。在一个实施方案中，具有TCR结合特性的SAR还包含一个或多个自主抗原结合结构域(例如，vHH、FHVH、svd-TCR等)。在一个实施方案中，一个或多个自主抗原结合结构域(例如，vHH、FHVH、svd-TCR等)可操作地连接至一个或两个TCR可变结构域(例如，Vα和Vβ或Vγ和Vδ等)通过可选的接头。在示例性实施方案中，本公开提供了双链SAR，其通过其Vα/Vβ结构域识别与MHC复合的NY-ESO-1肽并共表达靶向NY-ESO-1或MAGE-A3或vHH或FHVH的svd-TCR靶向NY-ESO-1肽/MHC复合物、CD20和BCMA的示例性此类uTCR-SAR由SEQ ID NO:10479表示。
在一个实施方案中，本公开提供了双链uTCR SAR，其中TCR的Va(Vα)结构域通过任选的接头(例如，TCRa-Ig3，SEQ ID NO)可操作地连接至一条膜锚定多肽链的胞外结构域。：3562)并且Vb(Vβ)结构域通过任选的接头(例如TCR样接头，例如TCRb-Ig3；例如SEQ ID NO:3560)可操作地连接至第二膜锚定多肽链的胞外结构域。在一个实施方案中，构成双链SAR的一个或两个膜锚定多肽链是跨膜蛋白。
在示例性实施方案中，本公开提供了uTCR-SAR，其中衍生自TCR的Va(Vα)结构域可操作地连接至信号传导适配器的一条链的胞外铰链结构域(例如，CD3z、FcRγ、DAP10或DAP12等)或其变体通过任选的接头(例如，TCRa-Ig3，SEQ ID NO:3562)和Vb(Vβ)结构域可操作地连接至信号传导导适配器或其变体的第二链的胞外铰链结构域经由任选的接头(例如TCR样接头，例如TCRb-Ig3；例如SEQ ID NO：3560)。当在细胞(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞等)中表达时识别NY-ESO-1肽/HLA-A*02:01复合物的示例性此类uTCR-SAR如SEQ IDNO(DNA)：9355和SEQ ID NO：(PRT)：10447。由于SAR在格式上是模块化的，因此该SAR的一条或两条CD3ze信号链可以被其它信号链/适配器替换，包括FcRγ、DAP10和DAP10的信号链或其变体。此外，接头结构域可以被其它接头结构域替代。在一个示例性实施方案中，类似Ig接头TCRa-Ig3(SEQ ID NO:3562)被IgCL接头(SEQ ID NO:3536)替代，并且接头TCRb-Ig3(SE Q ID NO:3560)被IgG-CH1替代。(SEQ ID NO:3537)、IgG2-0C-CH1(SEQ ID NO:3543)、IgG2-IC-CHI1(SEQ ID NO:3544)、IgG3-CHI1(SEQ ID NO:3545)、IgG4-CHI1(SEQ ID NO:3545)、IgG4-CHI1(SEQ ID NO:3546)、IgAI-CHI1(SEQ ID NO:3547)、IgA2-CHI1、IgD-CHI1、IgE-CHI1或IgM-CHI1(SEQ ID NO:3551)。示例性的此类靶向NY-ESO-1肽/MHC复合物的uTCR-SAR构建体由SEQ ID NO：9357-9365表示。
在一些实施方案中，Vα结构域连接至IgCL接头并且Vβ结构域连接至IgCH1接头。在一些实施方案中，Vβ结构域附接到IgCH1接头并且Vα结构域附接到IgCL接头。在一些实施方案中，Vα结构域附着于Cα衍生的接头(例如TCRa-Ig3)并且Vβ结构域附着于Cβ衍生的接头(例如TCRb-Ig3)。在一些实施方案中，Vβ结构域附着至Cα衍生的接头(例如TCRa-Ig3)并且Vα结构域附着至Cβ衍生的接头(例如TCRb-Ig3)。示例性的此类构建体由SEQ ID NO:10448表示。在一些实施方案中，Vγ结构域连接至Cγ衍生的接头(例如，TCRg-Ig3)并且Vδ结构域连接至Cδ衍生的接头(例如，TCRd-免疫球蛋白3)。示例性的此类构建体是SEQ ID NO:10694。该构建体具有Vd2和Vg9可变结构域。在一些实施方案中，Vγ结构域连接至Cδ衍生的接头(例如，TCRd-Ig3)并且Vδ结构域连接至Cγ衍生的接头(例如，TCRg-Ig3)。示例性的诸如构建体由SEQ ID NO:10693表示。在一些实施方案中，设想了可变结构域和接头的其它构型。
在一些实施方案中，对于包含TCRγ和TCRδ的可变域的uTCR-SAR，Vγ片段通过衍生自TCRγ的类似Ig接头连接(例如，TCRg-Ig3，序列ID编号：3566)，连接到信号传导适配器的一条链(例如，CD3ζ、FcRγ、DAP10或DAP10等，并且Vδ片段通过衍生自TCRδ链的类似Ig接头(例如，TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568)连接至信号传导导适配器的第二链。TCRg-Ig3和TCRg-Ig3接头结构域可以被其它接头结构域替换。本公开提供了包含TCRγ和TCRδ可变结构域的SAR，其中衍生自Ig(例如，IgCL和IgG-CH 1)或TCRα/β(例如，TCRa-Ig3和TCRb-Ig3)的接头可以取代一个或两个接头衍生自TCRγ(例如，TCRg-Ig3，SEQ ID NO：3566)和TCRδ链(例如，TCRd-Ig3，SEQ ID NO：3568)。
本公开提供了包含TCR可变结构域作为其抗原结合结构域的异二聚双链uTCR-SAR，其中两条信号链具有不同类型(例如CD3 z和Fc y R、CD3 z和DAP10、CD3 z和DA P12、FcR y和DAP10等)。本公开提供了异二聚体双链uTCR-SAR，其中一条或两条信号链包含天然存在的信号传导受体(例如CD16A、NKp30、NKp44、NKp44等)的跨膜结构域和任选的胞质结构域。此类uTCR的一条或两条链-SAR还可包含一个或多个共刺激结构域。靶向NY-ESO-1肽/HLA-A*02:01和MAGE-A3肽/HLA-A*02:01复合物并包含不同结合结构域、接头、激活结构域和共刺激结构域的示例性uTCR-SAR构建体由下式SEQ ID NO(PRT)：分别为10447-10530和10531-10610表示。包含识别多种癌症类型的MC.7.G5(一种不依赖于HLA的TCR)的可变结构域的示例性uTCR-SAR构建体由SEQ ID NO(PR T):10620-10692和SEQ ID NO(DNA):9528-9600表示。
本公开提供了包含CD16(FcγRIII)的部分或全部区域的单链、双链和双链异二聚体SAR。本公开提供了包含CD16或其片段的SAR，其与任何CD16序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、98.5％、99％或99.9％同一性在此描述，同时保留生物活性。可用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性全长CD16核酸和氨基酸序列提供于SEQ ID NO(DNA):1415-1417和SEQ ID NO(PRT):3809-3811或来自非人类物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基(即同系物)。可用于构建本公开内容的CD16 SAR的CD16片段在临时申请的表25-30中提供。还可以使用表25-30中提供的序列的CD16片段的变体或来自非人类物种的等效残基来构建CD16 SAR。本公开的示例性单链、双链和双链异二聚体SAR在临时申请的表32、34和36-39中提供。
CD16有两种亚型，CD16a和CD16b，它们在细胞外和跨膜结构域中具有序列同源性。除非另有说明，CD16指CD16a(FcγRIIIa)和CD16b(FcγRIIIb)同种型以及来自人类或非人类物种的任何其它可变剪接变体。然而，由于CD16b同工型缺乏胞质结构域，因此有关CD16胞质结构域的任何描述仅适用于CD16a同工型和来自非人类物种的等效残基。在一些实施方案中，可用于构建本公开的CD16 SAR的CD16序列可包括增加CD16对免疫球蛋白Fc区的亲和力的突变体和变体(例如，CD16A-F158V；SE Q ID NO:1415)和此外，防止其从细胞表面裂解(例如CD16A-F158V-S197P；SEQ ID NO：1453)。
在某些实施例中，所述SAR分子的核酸序列包括如SEQ ID NO:1415-1417所示的人CD16的核酸序列。在某些实施方案中，SAR的核苷酸序列包含编码CD16的氨基酸序列的序列，其具有SEQ ID NO:3809-3811的氨基酸序列的至少一个、五个或十个修饰，但不超过20个修饰，或与SEQ ID NO：3809-3811的氨基酸序列具有70-99％同一性的序列。在某些实施方案中，SAR分子包含SEQ ID NO：3809-3811的氨基酸序列或来自非人类物种的等同残基。
在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16或其变体的部分或全部区域的单链CD16SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16胞外结构域的部分或整个区域的单链CD16SAR。可以用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16胞外结构域序列提供于SEQID NO(DNA):1496-1509和SEQ ID NO(PRT):3890-3903或等效残基(即，同源物)来自非人类物种。在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16铰链结构域的部分或整个区域的CD16SAR。可以用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16铰链结构域序列提供于SEQID NO(DNA):1545-1547和SEQ ID NO(PRT):3939-3941或等效残基(即，同源物)来自非人类物种。在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16跨膜结构域的部分或整个区域的CD16SAR。可以用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA):1528-1530和SEQ ID NO(PRT):3922-3924或等效残基(即，同源物)来自非人类物种。在一个实施方案中，本公开提供了包含CD16胞质结构域的部分或整个区域的CD16SAR。可以用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA):1556-1558和SEQ ID NO(PRT):3950-3952或等效残基(即，同源物)来自非人类物种。本公开内容还提供了包含CD16或其片段的变体的SAR，其保留与其具有同一性或同源性的野生型CD16的至少一种生物活性。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含CD16胞外结构域，其包含两个免疫球蛋白类似结构域(即，D1和D2)，其通过CD16铰链结构域连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域。示例性的此类CD16 SAR靶向BCMA由CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-Ec oR1-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SpeXba-PAC(SEQ ID NO(DNA))：1638和SEQ ID NO(PRT)：4032)代表。包含针对不同抗原的scFv、FHVH、vHH和非免疫球蛋白抗原结合支架的额外示例性此类SAR在SEQ ID NO(DNA)：4851-5121中提供。这种CD16 SAR还保留了与抗体、抗体片段或双特异性/三特异性接合物的Fc区结合并介导抗体依赖性细胞毒性的能力。因此，表达SARCD8SP-BCMA-FHVH-33-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:5062)的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞等)可以靶向通过BCMA FCVH区域表达BCMA靶细胞。此外，在赫赛汀存在的情况下，此类免疫细胞可以被重定向到表达Her2的靶细胞。或者，在利妥昔单抗存在的情况下，此类免疫细胞(例如，T或NK细胞)可以被重定向至表达CD20的靶细胞。
在一个实施方案中，CD16 SAR含有缺少CD16的第一免疫球蛋白类似结构域(即，D1)的部分CD16胞外结构域。这种CD16 SAR包含D1和D2结构域之间的接头区域以及第二免疫球蛋白类似结构域(即，D2)，其通过CD16铰链结构域连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域。示例性的此类靶向BCMA的CD16 SAR由CD8SP-Sph-BC MA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-D2TMCPv1-F-P2A-SpeXba-PAC(SEQ ID NO(DNA):1664和SEQ ID(PRT)：4058)。这种CD16-SAR缺乏与抗体结合的能力，因为它仅包含CD16的D2结构域并且缺乏D1结构域。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含通过CD16铰链结构域连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域的CD16 D2结构域。这种CD16-SAR缺乏与抗体结合的能力，因为它仅包含CD16的D2结构域并且缺乏D1结构域。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域的部分或全部CD16铰链结构域。示例性的这种靶向BCMA的CD16 SAR由CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-Hinge-TM-CP-v1-F-P2A-SpeXba-PA C(SEQ ID NO(DNA):1690和SEQ ID NO(PRT):4084)。这种CD16-SAR缺乏与抗体结合的能力，因为它缺乏D1和D2结构域。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含存在于抗原结合结构域(例如scFv或AABD)和CD16的铰链结构域之间的异源铰链(间隔区)结构域。示例性的此类靶向CD19的CD16 SAR由CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-CD8-Hinge-CD16A-Hinge-TM-CP-V158-F-P2A-PAC(SEQ IDNO(DNA):7693和SEQ ID NO(PRT)：8385)。该构建体包含靶向CD19的hu-mROO5-1 scFv，通过CD8铰链与编码CD16A铰链、跨膜和胞质结构域的片段可操作地连接。在一个替代实施方案中，CD8铰链区直接连接至CD16A跨膜结构域和胞质结构域。由于SAR在设计上是模块化的，所以上述构建体中的CD19-hu-mROO5-1-scFv可以被靶向另一种抗原的抗原结合结构域(例如，scFv、AABD等)替代。此外，CD8铰链结构域可以被不同的铰链结构域替换。包含代替CD8铰链的CD28铰链的示例性此类构建体由CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-CD28-Ig-113-137-CD16A-v158-Hinge-TM-CP-v2-F-F2A-PAC(SEQ ID NO(DNA):7683；SEQ ID NO(PRT):8375)(表46)。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含AABD(例如，vHH、FHVH、chVH、cent yrin、亲和体等)，其通过任选的介入接头(例如，Gly4-Ser接头)插入CD16的D2结构域和铰链结构域之间。在示例性实施方案中，此类CD16 SAR从氨基到羧基端的不同结构域包括N端信号肽、CD16-D1结构域、CD16-D2结构域、任选的接头、AABD(例如，vHH、FHVH、centyrin、亲和体等)，可选的接头，CD16-铰链结构域，CD16-跨膜结构域和CD16-胞质结构域。
应当理解，可用于构建SAR的不同CD16结构域(即，胞外、D1、D2、铰链、跨膜和胞质)可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要该域至少保留其功能特性之一。CD16结构域可包含其野生型序列或一种或多种高亲和力(例如，F158V)或高亲和力不可切割(例如，F158V/S197P或F158V/S197R)变体。
在一个实施方案中，CD16SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、Va、Vb、Vg、Vd、TCR-Fv、vHH、FHVH、单结构域抗体、单链TCR(scTCR)、单可变结构域TCR(svd-TCR)、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体(例如APRIL)或受体的胞外结构域(例如PD1、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等)。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链CD16SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
在一些实施例中，本公开内容的CD16 SAR包含通式的分子：
AABD(n)-任选的CD16D1结构域-任选的CD16接头结构域-任选的CD16D2结构域、CD16铰链结构域-CD16跨膜结构域-任选的细胞内共刺激结构域(n)-任选的CD16细胞内信号传导结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
在一个实施方案中，AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、ob ody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、an ticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；受体(例如NKG2D)、配体(例如APRIL、血小板生成素)等的胞外结构域。
在一些实施例中，本发明的CD16 SAR包括通式的分子:
scFv(n)-任选的CD16D1-任选的CD16接头结构域-任选的CD16D2结构域、CD16铰链结构域-CD16跨膜结构域-任选的细胞内共刺激结构域(n)-任选的CD16细胞内信号传导结构域，其中n是1或更大。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入CD16-SAR的CD16链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SEQ ID NO(DN A)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了当前一代CAR的一些设计限制，并为CAR提供了补充方法。
包含与靶向不同抗原的scFv片段融合的完整CD16A的SAR的核酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO(DNA)：4851-5039和SEQ ID NO(PRT)：5151-5339表示。scFv片段及其靶抗原的顺序与表3所示的scFv和靶抗原的顺序相同。这些基于CD16的SAR构建体的全名也在临时申请的表36中提供，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。包含连接至不同scFv、单域抗体、适配器或scTCR的CD16全长序列的额外SAR呈现于SEQ ID NO(PRT)：10043-10323中。包含CD16全长序列并包含连接至scFv靶向CD19的vHH片段或FHVH片段的示例性SAR由SEQID NO:10324-10326表示。还提供了包含CD16全长序列并包含适配器(SEQ ID NO：10331-32)或scTCR(SEQ ID NO：10329-10330)的示例性SAR。
包含与靶向不同抗原的vHH和FHVH片段融合的完整CD16A的示例性SAR的核酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO(DNA):5040-5108和SEQ ID NO(PRT):5340-5408表示。这些SAR的名称和靶抗原在临时申请的表37中提供。包含与靶向不同抗原的非免疫球蛋白抗原结合结构域融合的完整CD16A的示例性SAR的核酸和氨基酸序列由SEQ ID NO(DNA):5110-5121和SEQ ID NO(PRT):5410-5421表示。分别。这些SAR的名称和靶抗原在临时申请的表38中提供。包含与受体、适配器和细胞因子的胞外抗原结合结构域融合的完整CD16A的示例性SAR的核酸和氨基酸序列由SEQ ID NO(DNA):5123-5129和SEQ ID NO(PRT):5423表示。分别为-5429。这些SAR的名称和靶抗原在临时申请的表39中提供。
本公开的不同SAR在设计上是模块化的。因此，编码CD16A-F158V-FL-v1的序列(SEQ ID NO：1415)可以被编码不同信号传导模块的序列(例如，SEQ ID NO：9635-9740；9813-9851)替代。示例性的此类模块包括CD16-F158V-D2TMCPv1(SEQ ID NO:1450)、CD16-F158V-Hinge-TM-CP(SEQ ID NO:1451)、NKp30-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1369)、NKp30-Hinge-TMCP-opt1(SEQ ID NO:1370)、NKp44-ECDTM CP-opt1(SEQ ID NO:1382)、NKp44-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1383)、NK p46-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1395)、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1396)、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ IDNO:1397)和NKp46-Hi nge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1398)。其中一个或多个CD16A-F158V-FL-v1模块被不同的信号传导模块替换的示例性SAR由SEQ ID NO(PRT)：9860-10042和SEQID NO(DNA)：8768-8950表示。各种示例性构建体的名称和SEQ ID也呈现在临时申请的表33中，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
包含可用于构建SAR的不同天然存在受体的胞外、跨膜和胞质结构域的多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO(PRT)：9633-9668中。示例性SAR如SEQ ID NO：9860-9895所示。包含可用于构建SAR的不同天然存在受体的铰链、跨膜和胞质结构域的多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO(PRT)：9669-9704中。包含附着于这些多肽的CD19scFv和CD28的铰链结构域的示例性CD19 SAR呈现于SEQ ID NO:9896-9931中。包含可用于构建SAR的不同天然存在受体的跨膜结构域和胞质结构域的多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO(PRT)：9705-9740中。包含连接至这些多肽的CD19 scFv和CD28的铰链结构域的示例性CD19 SAR呈现于SEQID NO:9957-9992中。上述任何SAR中的CD19 scFV结构域可以被替换为不同的抗原结合结构域(例如，scFv、vHH、FHVH、非免疫球蛋白抗原结合结构域、scTCR、scv-TCR、受体的配体结合结构域、受体结合结构域)配体或适配器等的结构域)针对不同抗原的结构域以产生新的SAR。示例性抗原结合结构域呈现于临时申请的表3-10中。SAR还可以包含连接至天然存在的受体的两个异源抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CD16 SAR包含CD16的整个胞外结构域并具有下式：
AABD(n)-CD16D1-CD16接头结构域-CD16D2结构域-CD16铰链结构域-CD16跨膜结构域-CD16胞内结构域，其中n是1或更大并且其中AABD包含完全人vH结构域或人源化vHH结构域。CD16胞外结构域可能携带F158V和S197P突变。包含CD16的整个胞外结构域并靶向不同抗原的示例性CD16 SAR的核酸和氨基酸序列提供于SEQ ID NO(DNA):4851-5129和8951-9244以及SEQ ID NO(PRT):5151-5429中。和10043-10336以及临时申请的表36-39中。SEQID NO:5151-5429、8951-9244的SAR构建体的抗原结合结构域的组成和顺序与表3所示的SEQ ID NO:2924-3160的scFv的顺序相同。具有SEQ ID NO:9140-9153和9188-9215靶向BCMA的构建体，具有SEQ ID NO:9216-9222靶向PSMA的构建体，以及具有SEQ ID NO:9223-9231靶向间皮素的构建体。具有SEQ ID NO:9232和9234的构建体是靶向CD19和BCMA的双特异性CD16-SAR，而具有SEQ ID NO:9233的构建体是靶向CD20和CD19的双特异性CD16 SAR。具有SEQ ID NO:9237和9238的构建体包含scT CR靶向NY-ESO-1肽(SEQ ID NO:10880)和MAGE-A3肽(112-120)(SEQ ID NO:10879)作为其靶抗原，而SAR具有SEQ ID NO：9241的构建体包含靶向MAGE-A3肽-270-279(SEQ ID NO：10878)的单可变结构域TCR(svd-TCR)。构建体SEQ ID NO：9239和9240包含Rzip和EZip适配器作为抗原结合结构域。最后，具有SEQ IDNO：9242-9244的构建体包含其它适配器。
当表达单链CD16-SAR的T细胞暴露于表达同源靶抗原的细胞时，可以激活NFA T信号传导，诱导IL2产生，促进T细胞增殖，促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达单链CD16-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导IL2产生、促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化或发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达单链CD16-SAR的单核细胞/巨噬细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导靶细胞的吞噬作用。在另一个示例性实施方案中，表达单链CD16-SAR的粒细胞(例如，嗜中性粒细胞)当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导靶细胞的吞噬作用。
在某些实施方案中，本公开提供了合成抗原受体的新平台，指定为CD16-SA R，其包含两条链，其中每条链包含CD16或其变体的部分或全部序列。
在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16-SAR，其中每条链包含CD16胞外结构域的部分或全部区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16胞外结构域序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1496-1509和SEQ ID NO(PRT)：3890-3903中。在一个实施方案中，本公开提供双链CD16-SAR，其中每条链包含CD16铰链结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16铰链结构域序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1545-1547和SEQ ID NO(PRT)：3939-3941中。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16-SAR，其中每条链包含CD16跨膜结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1528-1530和SEQ ID NO(PRT)：3922-3924中。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16-SAR，其中每条链包含CD16胞质结构域的部分或全部区域。可用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1556-1558和SEQ ID NO(PRT)：3950-3952中。
本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条CD16链之一并且vH片段可以连接至另一条CD16链。当两条这样的链(例如，vL-CD16和vH-CD16)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递细胞信号。在示例性实施方案中，表达此类CD16-SAR的T细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达此类CD16-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导IL2产生、促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化或发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达此类CD16-SAR的单核细胞/巨噬细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导靶细胞的吞噬作用。在另一个示例性实施方案中，表达单链CD16-SAR的单核细胞/巨噬细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导靶细胞的吞噬作用。在另一个示例性实施方案中，表达单链CD16-SAR的粒细胞(例如，嗜中性粒细胞)当暴露于表达同源靶抗原的细胞时可以诱导靶细胞的吞噬作用。
通过在vL/vH和CD16片段之间掺入接头，可以进一步提高双链CD16-SAR的表达和活性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ IDNO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的片段可用作vL/vH和CD16片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DNA)：1168-1175和SEQ ID NO(PR T)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在一个实施方案中，双链CD16 SAR的每条链包含CD16胞外域，该CD16胞外域包含两个免疫球蛋白样域(即，D1和D2)，其通过CD16铰链域连接至CD16跨膜域和CD 16胞质域。示例性的这种靶向CD20和BCMA的双链CD16 SAR由SAR CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-Apa-BCMA917-vHH-E59D-Ml u-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-PAC(SEQ ID NO(DNA):1633和SEQ ID NO(PRT):4027)表示。在此SAR中，CD20 vHH结构域通过IgCL接头连接至一条CD16链，BCMA vHH通过IgG1-CH1接头连接至第二条CD16链。该双链CD16 SAR的两条链由带有P2A可裂解接头的单个载体表达。该SAR构建体还表达可选的嘌呤霉素抗性盒(PAC)。靶向CD19的另一个示例性双链CD16 SAR由CD8SP-hu-mR OO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgGl-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-K13-opt(SEQ ID NO(DNA):1628和SEQ ID NO(PRT):4022)表示。在此SAR中，hu-mROO5-1 vL结构域通过IgCL接头连接至一条CD16链，hu-mROO5-1 vH结构域通过IgG1-CH1接头连接至第二条CD16链。hu-mROO5-1 vL和vH片段连接形成可与人CD19结合的Fv。该双链CD16SAR的两条链由带有P2A可裂解接头的单个载体表达。该SAR构建体还表达一个辅助模块，该模块包含来自人疱疹病毒8的密码子优化的vFLIP K13模块，该模块是可选的。SEQ ID NO(DNA):1629和SEQ ID NO(PRT):4023表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1628和SEQ ID NO(PRT):4022表示的SAR构建体相似，其中例外的是K13模块被传染性软疣病毒的MC159模块取代。SEQ ID NO(DNA):1630和SEQ ID NO(PR T):4024表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1628和SEQ ID NO(PRT):4022表示的SAR构建体相似，其中例外的是K13模块被嘌呤霉素抗性基因取代。SEQ ID NO(DNA):1625和SEQ ID NO(PRT):4020表示的双链CD16 SAR与SEQ IDNO(DNA):1630和SEQ ID NO(PRT):4024表示的SAR构建体相似，其中例外的是IgCL和IgG1-CH1接头结构域缺失，并且hu-mROO5-1 vL和vH片段直接连接到两条CD16链。SEQ ID NO(DNA):1631和SEQ ID NO(PRT):4025表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DN A):1630和SEQID NO(PRT):4024表示的SAR构建体相似，其中例外的是，靶向人CD20的vHH结构域通过短Gly4Serx2接头(SEQ ID NO(DNA)：1024)连接至hu-mROO5-1 vL区的氨基末端。该构建体可以靶向CD19和CD20。SEQ ID NO(DNA):1632和SEQ ID NO(PRT):4026表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1631和SEQ ID NO(PR T):4025表示的SAR构建体相似，其中例外的是，靶向人BCMA的vHH结构域通过短G4Sx3接头(SEQ ID NO(DNA)：40)连接至hu-mROO5-1 vH区的氨基末端。该构建体可以靶向CD19、CD20和BCMA。SEQ ID NO(DNA):1634和SEQ ID NO(PRT):4028表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1630和SEQ ID NO(PRT):4024表示的SAR构建体相似，其中例外的是IgCL和IgG1-CH1接头结构域被TCRb-ECD(TCRb-wt-opt-8ECD；SEQ IDNO:1166)和TCRa-ECD(TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD；SEQ ID NO:1166)取代ID NO:1168)分别是接头结构域。SEQ ID NO(DNA):1635和SEQ ID NO(PRT):4029表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1631和SEQ ID NO(PRT):4025表示的SAR构建体相似，其中例外的是IgCL和IgG1-CH1接头结构域被TCRb-ECD(TCRb-wt-opt-8ECD；SEQ ID NO:1166)和TCRa-ECD(TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD；SEQ ID NO:1166)取代ID NO:1168)分别是接头结构域。由SEQ ID NO(DNA):1636和SEQ ID NO(PRT):4030表示的双链CD16 SAR与由SEQ ID NO(DNA):1632和SEQ ID NO(PR T):4026表示的SAR构建体相似，其中例外的是IgCL和IgG1-CH1接头结构域被TCR b-ECD(TCRb-wt-opt-8ECD；SEQ ID NO:1166)和TCRa-ECD(TCRa-Ig-Like-C1-Doma in-6MD；SEQ ID NO:1166)取代ID NO:1168)分别是接头结构域。SEQ ID NO(DN A):1637和SEQ ID NO(PRT):4031表示的双链CD16 SAR与SEQ ID NO(DNA):1633和SEQ ID NO(PRT):4027表示的SAR构建体相似，其中例外的是IgCL和IgG1-CH1接头结构域被TCRb-ECD(TCRb-wt-opt-8ECD；SEQ ID NO:1166)和TCRa-ECD(TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD；SEQ IDNO:1166)取代ID NO:1168)分别是接头结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16的部分或全部区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16胞外结构域的部分或全部区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16 D1结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16 D2结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16SAR，其中每条链包含CD16铰链结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16跨膜结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中每条链包含CD16胞质结构域的部分或整个区域。
在一个实施方案中，双链CD16 SAR的每条链包含CD16胞外结构域，其包含通过CD16铰链结构域连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域的免疫球蛋白类似结构域(即，D1和D2)。在一个实施方案中，双链CD16SAR的每条链还保留结合抗体、抗体片段或双特异性/三特异性接合物的Fc区并介导抗体依赖性细胞毒性的能力。在一个实施方案中，双链CD16 SAR的每条链包含部分CD16胞外结构域，该部分CD16胞外结构域包含通过CD16铰链结构域连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域的第二免疫球蛋白类似结构域(即，D2)。在一个实施方案中，此类双链CD16 SAR的每条链缺乏结合抗体或抗体片段的Fc部分的能力，因为其仅含有CD16的D2结构域并且缺乏D1结构域。在一个实施方案中，双链CD16 SAR的每条链包含连接至CD16跨膜结构域和CD16胞质结构域的部分或全部CD16铰链结构域。在一个实施方案中，这种双链CD16SAR的每条链缺乏结合抗体或抗体片段的Fc部分的能力，因为它缺乏D1和D2结构域。
在一个实施方案中，双链CD16 SAR的至少一条链包含插入在CD16的D2结构域和铰链结构域之间的AABD(例如，vHH、FHVH、chVH、centyrin、亲和体等)，并且任选插入接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)。在一个示例性实施方案中，这种包含从氨基到羧基端的双链CD16SAR的链的不同结构域包括N端信号肽、CD16-D1结构域、CD16-D2结构域、任选的接头、AABD(例如，vHH、FHVH、centyrin、affibody等)，可选接头、CD16-铰链结构域、CD16-跨膜结构域和CD16-胞质结构域。
应当理解，可用于构建双链CD16 SAR的不同CD16结构域(即，胞外、D1、D2、铰链、跨膜和胞质等)可包含其完整序列或缺失突变体或一个变体，只要它保留该域的功能特性。在一个实施方案中，双链CD16SAR的一条或两条链的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vHH、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体的胞外结构域。
在一个实施方案中，双链CD16SAR的两条链均包含抗原结合结构域。在一个实施方案中，双链CD16SAR的仅一条链包含抗原结合结构域。在一个实施方案中，双链CD16SAR的链之一包含非天然抗原结合结构域(例如，scFv、vL、vH、Fv、vHH、FHV H、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域)支架、配体或受体的胞外结构域)，第二条链通过CD16胞外结构域与抗体或抗体片段或双特异性/三特异性接合物的Fc部分结合。
在一个实施方案中，双链CD16SAR的一条链包含由vL结构域组成的抗原结合结构域，并且双链CD16SAR的第二条链包含由vH结构域组成的抗原结合结构域。在一个实施方案中，双链CD16SAR的两条链均包含相同类别的抗原结合结构域(即，scFv、vHH、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体等。)。在一个实施方案中，双链CD16SAR的每条链包含vHH结构域。在一个实施方案中，双链CD16SAR的每条链包含FHVH结构域。在一个实施方案中，双链CD16SAR的两条链均包含不同类别的抗原结合结构域(即，scFv、vHH、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体等)。在示例性实施方案中，双链CD16SAR的一条链包含衍生自vHH结构域的抗原结合结构域，而第二条链包含衍生自FHVH结构域的抗原结合结构域。
双链CD16 SAR的两条链可以靶向相同抗原(例如CD19)或不同抗原(例如CD 19和CD20)。双链CD16 SAR的两条链可以靶向单一抗原(例如CD19)或两种不同抗原(例如CD19和CD20)的两个不同表位。双链SAR的每条链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。双链CD16SAR的每条链还可包含适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也掺入双链CD16-SAR的一条或两条CD16链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SE Q ID NO(DNA)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了CAR的一些设计限制，并为SAR提供了补充方法。
本文所述的CD16A-SAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的CD16A-SAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的CD16A-SAR的两条链可以由单个载体编码。本文描述的CD16A-SAR的两条链可以由两个不同的载体编码。编码CD 16-SAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，CD16A-SAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导CD16A-SAR至细胞表面的前导序列，如下所示I型跨膜蛋白。在一个实施方案中，CD16-SAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ IDNO:31至34中任一个的核酸序列和SEQ ID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于CD16A-SAR的不同亚基之间，例如，信号序列与CD16-SAR的抗原结合结构域之间或抗原结合与CD16链之间。
本公开的不同SAR在设计上是模块化的。因此，编码CD16A-F158V-FL-v1(SE Q IDNO:1415)和CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3(SEQ ID NO:1417)的序列可以被编码不同信号模块(SEQ ID NO:1417)的序列替代(表25)。示例性的此类模块包括CD16-F158V-D2TMCPv1(SEQ ID NO:1450)、CD16-F158V-Hinge-TM-CP(SEQ ID NO:1451)、NKp30-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1369)、NKp30-Hinge-TMCP-opt1(SEQ ID NO:1370)、NKp44-ECDTMCP-opt1(SEQID NO:1382)、NKp44-Hinge-TM-CP-op t1(SEQ ID NO:1383)、NKp46-ECDTMCP-opt1(SEQ IDNO:1383)N0:1395)、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1396)、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1397)和NKp46-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO:1398)、41BB-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1573)、CD28-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1575)、OX40-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1577)、2B4-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1579)、CD32-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1581)和CD64-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1583)。表33中呈现了示例性SAR的SEQ ID NO，其中CD16A-F158V-FL-v1和CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3模块中的一个或多个被不同的信号传导模块替换的临时申请。
在某些实施方案中，本公开提供了合成抗原受体的新平台，指定为CD16-SA R，其包含两条链，其中一条并入CD16的部分或整个区域。
在替代实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中一条链包含CD16胞外结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16胞外结构域序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1496-1509和SEQ ID NO(PRT)：3890-3903中。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中一条链包含CD16铰链结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16铰链结构域序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1545-1547和SEQ ID NO(PRT)：3939-3941中。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16SAR，其中一条链包含CD16跨膜结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的双链CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1528-1530和SEQ ID NO(PRT)：3922-3924中。在一个实施方案中，本公开提供了双链CD16 SAR，其中一条链包含CD16胞质结构域的部分或整个区域。可用于构建本公开内容的CD16-SAR的示例性CD16跨膜序列提供于SEQ ID NO(DNA)：1556-1558和SEQ ID NO(PRT)：3950-3952中。
本公开提供了一种方法，即可以将抗体的vL片段与CD16链连接，而vH片段可以与另一信号链连接，例如CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46、TCRα常链、TCRβ常链、TCRγ常链或TCRδ常链等。另一种情况下，本公开提供了一种方法，即可以将抗体的vH片段与CD16链连接，而vL片段可以与另一信号链连接，例如CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46、TCRα常链、TCRβ常链、TCRγ常链或TCRδ常链等。当这两种链(例如，vL-CD16和vH-CD3z)在同一细胞中共同表达时，vL和vH片段可以与它们的相应抗原结合并传递T细胞信号。特别地，表达这种CD16-异二聚体SAR的T细胞，在暴露于表达相应目标抗原的细胞系时，可以激活NFAT信号传导，诱导IL2产生，促进T细胞增殖，促进T细胞激活并发挥细胞毒性作用。在另一个示范性实施方式中，当表达这种CD16-SAR的NK细胞暴露于表达相应目标抗原的细胞系时，可以诱导IL2产生，促进NK细胞增殖，促进NK细胞激活或发挥细胞毒性。通过在vL/vH与CD16以及其他信号链(例如CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46等)之间引入连接剂，可以进一步增加CD16-异二聚体SAR的表达和活性。特别地，衍生自抗体的IgCL(序列ID号(DNA)：1142和序列ID号(PRT)：3536)和IgCH结构域(序列ID号(DNA)：1143-1157和序列ID号(PRT)：3537-3551)可用作vL/vH与CD16片段之间的有用连接剂。艺术中还知道其他类似Ig结构域(例如，表13；序列ID号(DNA)：1168-1175和序列ID号(PRT)：3562-3569)，可以在本公开的另一实施方式中作为有用的连接剂。
本公开所述的不同SAR具有模块化设计。因此，编码CD16A-F158V-FL-v1(SEQ IDNO：1415)的序列可以被编码在临时申请表25中所示的不同信号模块的序列替代。示例性的此类模块包括CD16-F158V-D2TMCPv1(SEQ ID NO：1450)、CD16-F158V-Hinge-TM-CP(SEQ IDNO：1451)、NKp30-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1369)、NKp30-Hinge-TMCP-opt1(SEQ ID NO：1370)、NKp44-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1382)、NKp44-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO：1383)、NKp46-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1395)、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO：1396)、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO：1397)、NKp46-Hinge-TM-CP-opt1(SEQ ID NO：1398)、41BB-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1573)、CD28-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1575)、OX40-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1577)、2B4-ECDTMCP-opt1(SEQ IDNO：1579)、CD32-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1581)和CD64-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO：1583)。在其中一个或多个CD16A-F158V-FL-v1模块被不同信号模块替代的示例SAR的SEQID NO在表33中呈现。
本文还提供了经基因工程改造的克隆iPSC，其除本文设想和描述的其它编辑外还包含CD16 SAR。在一个实施例中，CD16 SAR是高亲和力CD16 SAR或高亲和力不可裂解CD16SAR(hnCD16-SAR)。基因工程iPSC能够分化成包含引入iPSC的CD16-SAR(例如，高亲和力CD16 SAR或hnCD16-SAR)的效应细胞。在一些实施方案中，包含CD16-SAR的衍生效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，包含CD16-SAR的衍生效应细胞是T细胞。在一个实施方案中，在iPSC或其衍生细胞中表达的CD16-SAR(例如，高亲和力CD16 SAR或hnCD16-SAR)不仅结合ADCC抗体或其片段，而且结合双、三或多特异性抗体。识别所述CD16 SAR的CD16或CD64胞外结合结构域的接合物或结合物。因此，本申请提供了衍生效应细胞或其细胞群，其通过与衍生效应细胞上表达的CD16-SAR的胞外结构域结合而预载有一种或多种预先选择的ADCC抗体，其量足以在治疗病症、疾病中的治疗用途，其中所述CD16-SAR包含具有FI76V和S197P的CD64或CD16的胞外结合域。在一个实施方案中，CD16-SAR的抗原结合结构域包含AABD、scFv、Fv、受体的胞外结构域、配体或另一种非免疫球蛋白抗原结合模块。在一个实施方案中，CD16-SAR包含附着于CD16或CD64的Fc结合结构域的N端或附近的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CD16-SAR还包含连接至Fc结合结构域的N端或附近的抗原结合结构域(例如，AABD，例如，FHVH、chVH、aVH、vHH、Darpin、centyrin、affibody等)。CD16或CD64。
例如，高亲和力CD16SAR或hnCD16-SAR)的天然CD16跨膜结构域和/或胞内结构域被进一步修饰或替换，使得嵌合Fc-SAR(CFc-SAR)产生的SAR)包含非天然跨膜结构域、非天然刺激结构域和/或非天然信号传导结构域。本文使用的术语“非天然的”或“非天然的”是指跨膜、刺激或信号传导结构域衍生自除提供胞外结构域的受体之外的不同受体。在此图中，基于CD16或其变体的CFc-SAR不具有衍生自CD16的跨膜、刺激或信号传导域。在一些实施方案中，外源性基于CD16的CFc-SAR包含衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3z、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、0X40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL-7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DSI、MKp30、MKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体多肽。在一些实施方案中，基于CD16的CFc-SAR包含衍生自CD27、CD28、4-1BB、0X40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP 12的非天然刺激/抑制结构域，CTLA-4或NKG2D多肽。在一些实施方案中，基于外源CD16的CFc-SAR包含衍生自CD3z、2B4、DAP 10、DAP 12、DNAM1、CD137(4IBB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44的非天然信号传导结构域，NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。在CD16-SAR的一个实施方案中，所提供的嵌合受体包含均衍生自IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C和NKG2D多肽之一的跨膜结构域和信号传导结构域。基于CD16的CFc-SAR的一个具体实施方案包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激结构域和CD3z的信号传导结构域；其中CD16的胞外结构域衍生自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的胞外结构域包含F176V(或158V)和S197P(或S197R)。
基于CD16的嵌合Fc-SAR的另一个实施方案包含CD3z的跨膜结构域和信号传导结构域；其中CD16的胞外结构域衍生自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的胞外结构域包含FI 76V和S197P。在一个实施方案中，CD16-嵌合Fc SAR的抗原结合结构域包含AABD(例如，FHVH、vHH等)、scFv、Fv、配体、受体的胞外结构域或另一种非免疫球蛋白抗原结合模块。在一个实施方案中，CD16-嵌合Fc SAR还包含附着于CD16或CD64的Fc结合结构域的N端或附近的抗原结合结构域。在一个实施方案中，hnCD16-嵌合Fc SAR还包含连接至Fc的N端或附近的抗原结合结构域(例如，AAB D，例如，FHVH、chVH、aVH、vHH、Darpin、centyrin、affibody等)。CD16或CD64的结合域。
如上所述的基于CD16的嵌合Fc SAR的各种实施方案能够结合抗体或其片段的Fc区；或连接至双、三或多特异性接合物或结合物的Fc区。另外，基于CD16的嵌合Fc SAR能够结合由其抗原结合结构域(即AABD、scFv、Fv等)指定的抗原。因此，具有基于BCMA-FHVH的抗原结合结构域的基于CD16的嵌合Fc SAR可以结合抗体的Fc区，同时还具有结合BCMA的能力。结合后，CD16-CFc SAR的刺激和/或信号传导结构域能够激活效应细胞并分泌细胞因子，并杀死抗体或其抗原结合结构域(例如，AABD、scFv、Fv等)，或具有肿瘤抗原结合组分以及Fc区的所述双、三或多特异性接合物或结合物。不受理论的限制，通过基于CD16的嵌合Fc受体的非天然跨膜、刺激和/或信号传导域，或通过与胞外域结合的接合物，CFc-SAR可有助于效应细胞的杀伤能力，同时增加效应细胞的增殖和/或扩张潜力。抗体和接合物可以使表达抗原的肿瘤细胞和表达CFc-SAR的效应细胞靠近，这也有助于增强对肿瘤细胞的杀伤。双、三、多特异性接合物或结合剂的示例性肿瘤抗原包括但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘蛋白和ROR1。适合于接合表达基于CD16的CFc-SAR的效应细胞攻击肿瘤细胞的一些非限制性示例性双、三、多特异性接合物或结合剂包括CD16(或CD64)-CD30、CD16(或CD64)-BCMA、CD16(或CD64)-IL15-EPCAM，和CD 16(或CD64)-IL15-CD33。
衍生NK中不可裂解的CD16-SAR(例如hnCD16-SAR)避免了CD16脱落并维持恒定表达。在衍生NK细胞中，不可裂解的CD16-SAR增加了TNFa和CD107a的表达，表明细胞功能得到改善。不可切割的CD16还增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及双、三或多特异性接合物的接合。ADCC是NK细胞通过CD16与抗体包被的靶细胞结合介导的裂解机制。在衍生的NK细胞中引入的hnCD16-SAR的额外高亲和力特性还使得能够在将细胞施用给需要细胞治疗的受试者之前通过CD16将ADCC抗体体外加载到NK细胞上。如所提供的，hnCD16-SAR可包含F176V(或158V)和S197P(或S197R)。如所公开的，本申请还提供了衍生NK细胞或其细胞群，其预载有一种或多种预选的ADCC抗体，其量足以用于治疗病症、疾病或感染。
在一种实施方式中，本发明的CD16-SAR包括在其n端或其附近附着于抗原结合结构域(例如，AABD、scFv、Fv等)的野生型CD16序列。因此，本公开内容的CD16-SAR可包含hnCD16或野生型CD16编码区。
在一个实施方案中，本公开内容的CD16-SAR包含框内融合至CD16或其变体的跨膜和胞内结构域的CD32或CD64的Fc结合区。在示例性实施例中，这样的CD16 SAR中的不同模块的顺序可以包括从NH2到C末端如下：
抗原结合结构域(n)-CD32-Fc结合结构域-CD16跨膜结构域-CD16-细胞内结构域；其中n＝1、2、3或更大。
在示例性实施例中，这种CD16 SAR中的不同模块的顺序可以包括从NH 2到C末端如下：其中n＝1、2、3或更多。
抗原结合结构域(n)-CD64-Fc结合结构域-CD16跨膜结构域-CD16-细胞内结构域
含有与CD64的胞外域和CD16的跨膜域和胞内域融合的CD20 vHH域的示例性CD 20靶向SAR构建体由SEQ ID NO(DNA):2328和SEQ ID NO(PRT):4722表示。另外的SAR构建体可以通过用靶向不同抗原的抗原结合结构域(例如，scFv、vHH、FHVH、Centyrin等)替换CD20vHH结构域来产生靶向其它抗原的结构域。
与原代NK细胞不同，来自主要来源(即自然/天然来源，例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟T细胞不表达CD16。出乎意料的是，表达外源CD16-SAR构建体的成熟T细胞显示出CD16 SAR的细胞表面表达，并且当暴露于靶抗原表达细胞时能够传递细胞信号(例如，NFAT信号传导)。
同样出乎意料的是，包含表达的外源CD16-SAR的iPSC不会损害T细胞发育生物学，并且能够分化为功能性衍生T细胞，其不仅表达外源CD16-SAR，而且能够通过以下方式执行功能：后天获得的ADCC机制。衍生T细胞中的这种获得性ADCC还可用作双重靶向和/或挽救CAR-T细胞治疗中经常发生的抗原逃逸的方法，其中肿瘤复发时CAR-T靶向抗原表达或表达减少或丢失突变抗原以避免被CAR(嵌合抗原受体)识别。当所述衍生T细胞包含通过外源CD16-SAR表达获得的ADCC，并且当抗体靶向与SAR所靶向的肿瘤抗原不同的肿瘤抗原时，该抗体可用于挽救SAR-T抗原逃逸并减少或预防复发或CAR-T治疗中常见的靶向肿瘤复发。这种减少和/或防止抗原逃逸同时实现双重靶向的策略同样适用于表达一种或多种SAR的NK细胞。
因此，本公开提供了包含外源CD16-SAR的衍生T细胞。在一些实施方案中，CD16-SAR包含CD16的野生型序列。在一些实施方案中，衍生T细胞中包含的hnCD16包含F176V(158V)和S197R(或S197P)。在一些其它实施方案中，衍生T细胞中包含的hnCD 16包含衍生自CD64的全部或部分胞外域，或者还可以包含非天然跨膜结构域、刺激结构域和信号传导结构域中的至少一种。正如所解释的，此类衍生T细胞具有通过ADCC介导的单克隆抗体靶向肿瘤的后天机制，以增强抗体的治疗效果。如所公开的，本申请还提供了衍生T细胞或其细胞群，其预载有一种或多种预选的ADCC抗体，其量足以用于治疗病症、疾病或感染。
除了原代NK和T细胞之外，本公开内容的CD16-SAR还可在永生化细胞系中表达。适合表达本公开内容的CD16-SAR的示例性永生化细胞系包括NK92和NK92MI细胞系。另外，本公开内容的CD16-SAR可在多能造血干细胞(例如，CD34+干细胞)中表达，其可分化以产生属于不同谱系的表达CD16 SAR的血细胞。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp30-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含NKp30链的完整或部分序列。
可用于构建NKp30 SAR的NKp30链的核酸序列提供于SEQ ID NO：1395至1414(临时申请的表25)中。相应的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO：3789至3808中。
在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp30的部分或全部区域的单链NKp30SAR。在替代实施方案中，本公开提供了包含NKp30胞外结构域的部分或整个区域的单链NKp30SAR。在一个实施方案中，本公开提供包含NKp30铰链结构域的部分或整个区域的NKp30SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp30跨膜结构域的部分或整个区域的NKp30SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp30胞质结构域的部分或整个区域的NKp30SAR。
在一个实施方案中，NKp30 SAR包含通过NKp30铰链结构域连接至NKp30跨膜结构域和NK p30胞质结构域的NKp30 Ig结构域。在一个实施方案中，NKp30 SAR包含连接至NKp30跨膜结构域和NKp30胞质结构域的NKp30铰链结构域。
应当理解，可用于构建SAR的不同NKp30结构域(即，胞外结构域、Ig结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域)可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要域至少保留其部分功能属性。
在一个实施方案中，NKp30SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vH H、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链NKp30SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
公开内容的NKp30 SAR包含通式的分子：
AABD(n)-任选的NKp30 Ig结构域、NKp30铰链结构域-NKp30跨膜结构域-任选的-细胞内共刺激结构域(n)-NKp30细胞内信号传导结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。
在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
在一个实施方案中，AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、ob ody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、an ticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；受体(例如NKp30、CD16-F158V、NKG2D)、配体(例如APRIL、血小板生成素)等。
公开内容的NKp30 SAR包含通式的分子：
scFv(n)-NKp30 Ig结构域-NKp30铰链结构域-NKp30跨膜结构域-任选的细胞内共刺激结构域(n)-任选的NKp30细胞内信号传导结构域，其中n为1或更大。在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp30-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含两条NKp30链的完整或部分序列。
本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条NKp30链之一并且vH片段可以连接至另一条NKp30链。当两条这样的链(例如vL-NKp30和vH-NKp30)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递T、NK细胞或巨噬细胞信号。具体地，表达此类NKp30-SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFA T信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个实施方案中，表达此类NKp30-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化并发挥细胞毒性。通过在vL/vH和NKP30片段之间掺入接头，可以进一步提高NKp30-SAR的表达和活性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp30”片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ IDNO(DN A)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入NKp30-SAR的NKp30链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SEQ ID NO(DN A)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了SAR的一些设计限制，并为SAR提供了补充方法。
本文描述的NKp30-SAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的NKp30-SAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的NKp30-SAR的两条链可以由单个载体编码。本文描述的NKp30-SAR的两条链可以由两个不同的载体编码。编码NK p30-SAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，NKp30-SAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导NKp30-SAR至细胞表面的前导序列，如下所示I型跨膜蛋白。在一种实施方式中，NKp30-SAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ IDNO:31至34中任一个的核酸序列和SEQ ID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于NKp30-SAR的不同亚基之间，例如，在信号序列与NKp30-SAR的抗原结合结构域之间或在抗原结合与NKp30链之间。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp30-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含两条链，其中一条并入NKp30的部分或整个区域。
在替代实施方案中，本公开提供了双链NKp30 SAR，其中一条链包含NKp30胞外结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp30 SAR，其中一条链包含NKp30铰链结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp30 SAR，其中一条链包含NKp30跨膜结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp30 SAR，其中一条链包含NKp30胞质结构域的部分或整个区域。
本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至NKp30链并且vH片段可以连接至另一信号链，例如CD3z、FcRγ、CD16、NKp44、NKp46、TCRα恒定链、TCRβ恒定链、TCRγ恒定链或TCRδ恒定链等。或者，本公开提供抗体的vH片段可以连接至NKp30链并且vL片段可以连接至NKp30链。当两条这样的链(例如，vL-NKp30和vH-CD3z)时，另一条信号链，例如CD3z、FcRγ、CD16、NKp44、NKp46、TCRα恒定链、TCRβ恒定链、TCRγ恒定链或TCRδ恒定链等由于vL和vH片段在同一细胞中共表达，因此它们可以结合其同源抗原并传递T细胞信号。具体地，表达此类NKp30-异二聚体SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达此类NKp30-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以诱导IL2产生、促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化或发挥细胞毒性。NKp30-异二聚SAR的表达和活性可以通过在vL/vH和NKp30以及其它信号链(例如，CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46等)之间掺入接头来进一步增加。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp30”片段之间的有用接头。
在某些实施方案中，本公开提供了合成抗原受体的新平台，指定为NKp44-SA R，其含有NKp44链的完整或部分序列。可用于构建NKp44 SAR的NKp44链的核酸序列是SEQ IDNO：1381至1394中提供。相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：3775至3788中提供。
在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp44的部分或全部区域的单链NKp44SAR。在替代实施方案中，本公开提供了包含NKp44胞外结构域的部分或整个区域的单链NKp44SAR。在一个实施方案中，本公开提供包含NKp44铰链结构域的部分或整个区域的NKp44SAR。在一个实施例中，本公开提供了包含NKp44跨膜结构域的部分或整个区域的NKp44SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp44胞质结构域的部分或整个区域的NKp44SAR。
在一个实施方案中，NKp44SAR包含通过NKp44铰链结构域连接至NKp44跨膜结构域和NKp44胞质结构域的NKp44Ig结构域。在一个实施方案中，NKp44SAR包含连接至NKp44跨膜结构域和NKp44胞质结构域的NKp44铰链结构域。
应当理解，可用于构建SAR的不同NKp44结构域(即，胞外结构域、Ig结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域)可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要域至少保留其部分功能属性。
在一个实施方案中，NKp44SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vH H、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链NKp44SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
公开内容的NKp44 SAR包含通式的分子：
AABD(n)-任选的NKp44 Ig结构域、NKp44铰链结构域-NKp44跨膜结构域-任选的-细胞内共刺激结构域(n)-NKp44细胞内信号传导结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。
在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
在一个实施方案中，AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、ob ody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、an ticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；受体(例如NKp44、NKG2D)、配体(例如APRIL、血小板生成素)等。
公开内容的NKp44 SAR包含通式的分子：
scFv(n)-NKp44 Ig结构域-NKp44铰链结构域-NKp44跨膜结构域-任选的细胞内共刺激结构域(n)-任选的NKp44细胞内信号传导结构域，其中n为1或更大。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp44-SAR的合成抗原受体的新平台，其含有两条NKp44链的完整或部分序列。本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条NKp44链之一并且vH片段可以连接至另一条NKp44链。当两条这样的链(例如vL-NKp44和vH-NKp44)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递T或NK细胞信号。具体地，表达此类NKp44-SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个实施方案中，表达此类NKp44-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化并发挥细胞毒性。通过在vL/vH和NKP30片段之间掺入接头，可以进一步提高NKp44-SAR的表达和活性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp44”片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DNA)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入NKp44-SAR的NKp44链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SEQ ID NO(DN A)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了一些设计限制，并为SAR提供了补充方法。
本文描述的NKp44-SAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的NKp44-SAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的NKp44-SAR的两条链可以由单个载体编码。本文描述的NKp44-SAR的两条链可以由两个不同的载体编码。编码NK p44-SAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，NKp44-SAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导NKp44-SAR至细胞表面的前导序列，如I型跨膜蛋白。在一种实施方式中，NKp44-SAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:31至34中任一个的核酸序列和SEQ ID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于NKp44-SAR的不同亚基之间，例如，在信号序列与NKp44-SAR的抗原结合结构域之间或在抗原结合与NKp44链之间。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp44-SAR的合成抗原受体的新平台，其含有两条链，其中一条并入NKp44的部分或整个区域。
在替代实施方案中，本公开提供了双链NKp44 SAR，其中一条链包含NKp44胞外结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp44 SAR，其中一条链包含NKp44铰链结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp44SAR，其中一条链包含NKp44跨膜结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp44SAR，其中一条链包含NKp44胞质结构域的部分或整个区域。
本公开提供了抗体的vL片段可以连接至NKp44链并且vH片段可以连接至另一信号链，例如CD3z、FcRγ、CD16、NKp30、NKp46、TCRα恒定链、TCRβ恒定链、TCRγ恒定链或TCRδ恒定链等。可选地，本公开提供抗体的vH片段可以连接至NKp44链并且vL片段可以连接至NKp44链。当两条这样的链(例如，vL-NKp44和vH-CD3z)由于vL和vH片段在同一细胞中共表达，因此它们可以结合其同源抗原并传递T细胞信号。具体地，表达此类NKp44-异二聚体SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达此类NKp44-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以诱导IL2产生、促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化或发挥细胞毒性。NKp44-异二聚SAR的表达和活性可以通过在vL/vH和NKp44以及其它信号链(例如，CD3z、FcRγ、NKp44、NKp44、NKp46等)之间掺入接头来进一步增加。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp44”片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DNA)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp46-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含NKp46链的完整或部分序列。
可用于构建NKp46 SAR的NKp46s链的核酸序列提供于SEQ ID NO：1381至1394(表25)中。相应的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO：3775至3788中(表25)。
在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp46的部分或整个区域的单链NKp46SAR。在替代实施方案中，本公开提供了包含NKp46胞外结构域的部分或整个区域的单链NKp46SAR。在一个实施例中，本公开提供了包含NKp46铰链结构域的部分或整个区域的NKp46SAR。在一个实施例中，本公开提供了包含NKp46跨膜结构域的部分或整个区域的NKp46SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含NKp46胞质结构域的部分或整个区域的NKp46SAR。
在一个实施方案中，NKp46 SAR包含通过NKp46铰链结构域连接至NKp46跨膜结构域和NKp46胞质结构域的NKp46 Ig结构域。在一个实施方案中，NKp46 SAR包含连接至NKp46跨膜结构域和NKp46胞质结构域的NKp46铰链结构域。
应当理解，可用于构建SAR的不同NKp46结构域(即，胞外结构域、Ig结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域)可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要域至少保留其部分功能属性。
在一个实施方案中，NKp46SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vH H、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链NKp46 SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
公开内容的NKp46 SAR包含通式的分子：
AABD(n)-任选的NKp46 Ig结构域、NKp46铰链结构域-NKp46跨膜结构域-任选的-细胞内共刺激结构域(n)-NKp46细胞内信号传导结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。
在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
在一个实施方案中，AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、ob ody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、an ticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；受体(例如NKp46、NKG2D)、配体(例如APRIL、血小板生成素)等。
公开内容的NKp46 SAR包含通式的分子：
scFv(n)-NKp46 Ig结构域-NKp46铰链结构域-NKp46跨膜结构域-任选的细胞内共刺激结构域(n)-任选的NKp46细胞内信号传导结构域，其中n为1或更大。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp46-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含两条NKp46链的完整或部分序列。本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条NKp46链之一并且vH片段可以连接至另一条NKp46链。当两条这样的链(例如vL-NKp46和vH-NKp46)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递T或NK细胞信号。具体地，表达此类NKp46-SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个实施方案中，表达此类NKp46-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化并发挥细胞毒性。通过在vL/vH和NKP30片段之间掺入接头，可以进一步提高NKp46-SAR的表达和活性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp46”片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DNA)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入NKp46-SAR的NKp46链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SEQ ID NO(DN A)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了一些设计限制，并为SAR提供了补充方法。
本文描述的NKp46-SAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的NKp46-SAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的NKp46-SAR的两条链可以由单个载体编码。本文描述的NKp46-SAR的两条链可以由两个不同的载体编码。编码NK p46-SAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，NKp46-SAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导NKp46-SAR至细胞表面的前导序列，如下所示I型跨膜蛋白。在一种实施方式中，NKp46-SAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ IDNO:31至34中任一个的核酸序列和SEQ ID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于NKp46-SAR的不同亚基之间，例如，在信号序列与NKp46-SAR的抗原结合结构域之间或在抗原结合与NKp46链之间。
在某些实施方案中，本公开提供了称为NKp46-SAR的合成抗原受体的新平台，其包含两条链，其中一条并入NKp46的部分或整个区域。
在替代实施方案中，本公开提供了双链NKp46-SAR，其中一条链包含NKp46胞外结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp46-SAR，其中一条链包含NKp46铰链结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp46 SAR，其中一条链包含NKp46跨膜结构域的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了双链NKp46 SAR，其中一条链包含NKp46胞质结构域的部分或整个区域。
本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至NKp46链并且vH片段可以连接至另一信号链，例如CD3z、FcRγ、CD16、NKp30、NKp44、TCRα恒定链、TCRβ恒定链、TCRγ恒定链或TCRδ恒定链等。或者，本公开内容提供了抗体的vH片段可以连接至NKp46链并且vL片段可以连接至NKp46链。当两条这样的链(例如，vL-NKp46和vH-CD3z)由于vL和vH片段在同一细胞中共表达，因此它们可以结合其同源抗原并传递T细胞信号。具体地，表达此类NKp46-异二聚体SAR的T细胞在暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFAT信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个示例性实施方案中，表达此类NKp46-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以诱导IL2产生、促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化或发挥细胞毒性。NKp46-异二聚SAR的表达和活性可以通过在vL/vH和NKp46以及其它信号链(例如，CD3z、FcRγ、NKp46、NKp46、NKp46等)之间掺入接头来进一步增加。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ IDNO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的“vL/vH”和“NKp46”片段之间的有用接头。
本公开还提供基于其它NK受体包括共刺激受体(SEQ ID NO：9860-9993)的胞外、跨膜和胞质结构域的SAR。由于SAR在格式上是模块化的，因此这些构建体中靶向CD19的hu-mROO5-scFv可以与表3-7中描述的其它抗原结合结构域交换，以生成新型单特异性和双特异性SAR。
NKG2D是一种II型蛋白，其N末端位于细胞内。尽管本领域已经描述了基于NK G2D片段的CAR，但它们缺乏NKG2D胞质和跨膜结构域的天然构型。本公开提供了一种SA R，其中包含一个或多个抗原结合结构域(例如，AABD、scFv)的多肽的N端与包含从N端到C端的细胞内、跨膜和结构域的多肽框内融合。通过可选的接头连接NKG2D或II型膜蛋白的胞外结构域。这种构建体的示意图提供于图12中。示例性的此类SAR提供于SEQ ID NO：7686-7687中。此外，具有ATG起始密码子的适配器(例如CD3z)的胞质结构域的N末端可以融合至NKG2D的N末端以向SAR提供激活结构域。本公开还提供了SAR，其中抗原结合结构域的N末端结构域与NKG2C、NKG2A、NKG2E和NKG2F受体的胞外结构域融合。该方案可用于产生任何I型蛋白(包括包含抗原结合结构域的I型蛋白)和II型蛋白之间的融合蛋白。该方案还可用于产生仅包含II型受体的铰链、跨膜和胞质结构域且缺乏其胞外结构域的融合体。
最后，本公开还提供了一种基于II型蛋白产生异二聚体SAR的方法，其中一个抗原结合结构域连接至一个受体链的C端，并且第二个抗原结合结构域连接至第二个受体链的C端。异二聚体链。包含NKG2E和CD94的示例性此类受体在SEQ ID NO:10341中提供。
在某些实施方案中，本公开提供了合成抗原受体的新平台，其包含衍生自两条CD3z链的部分或完整序列，可以在免疫细胞中功能性表达，所述免疫细胞例如NK细胞、NK92细胞系、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞，其缺乏内源性TCR链。在某些实施方案中，本公开提供了SAR的新平台，其包含衍生自两条CD3z链的部分或完整序列，其可以在iPSC细胞、胚胎干细胞或造血干细胞中表达，其可以分化以产生免疫细胞，例如如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞，表达zSAR。可用于构建zSA R的示例性CD3z链的核酸序列提供于SEQ ID NO:1090和1096中。相应的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO:3484和3490中。本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条CD3z链之一并且vH片段可以连接至另一条CD3z链。当两条这样的链(例如vL-CD3z和vH-CD 3z)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递T细胞信号。特别地，表达这种zSAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以表现出增加的增殖、活化并发挥细胞毒性。通过在vL/vH和CD3z片段之间掺入接头，可以进一步提高zSAR的表达和活性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PR T)：3537-3551)衍生自抗体的片段可用作vL/vH和CD3z片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DNA)：1168-1175和SE Q ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入zSAR的CD3z链中。示例性共刺激结构域包括41BB和CD28的共刺激结构域。含有41BB和CD28共刺激结构域的CD3z链分别呈现在SEQ ID NO：1100、1102以及1099和1101中。临时申请的表30中提供了可以替代41BB和CD28共刺激结构域的其它示例性共刺激结构域(例如OX40和2B4)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了CAR的一些设计限制，并为SIR提供了补充方法。
本文描述的zSAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的zSAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的zSAR的两条链可以由单个向量编码。本文描述的zSAR的两条链可以由两个不同的向量编码。编码zSAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，zSAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导序列，该前导序列将zSAR作为I型跨膜引导至细胞表面。蛋白质。在一种实施方式中，zSAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:31至34中任一个的核酸序列和SEQID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于zSAR的不同亚基之间，例如，信号序列与zSAR的抗原结合结构域之间或抗原结合与CD3z链之间。
一种可在免疫细胞(如NK细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、NK92细胞系等)或可产生免疫细胞的干细胞(如iPSC、造血干细胞等)中表达的靶向CD19的示例性zS AR是CD8SP-hu-mROO5-1-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP。在SEQ ID NO(DNA):2287-2291中提出了其他可在NK细胞中功能表达的靶向CD19的典型zSAR。
本公开还提供了zSAR，其中TCR的Va、b、g、d结构域用作抗原结合结构域。这样的SAR的作用类似于uTCR-SAR。
zSAR中的一个或两个CD3结构域可以被其它信号传导适配器替换，例如DAP10、DAP12或FcRγ或其片段或变体，以产生包含这些接头的新型SAR。
本公开提供了包含DAP10(SEQ ID NO(DNA)：1349-1350)的部分或整个区域的单链、双链和双链异二聚体SAR。本公开的示例性单链、双链和双链异二聚体DAP10SAR在临时申请的表32和33中提供。
在一个实施方案中，本公开提供了包含DAP10的部分或整个区域的单链DAP10SAR。在替代实施方案中，本公开提供了包含CD16胞外结构域的部分或整个区域的单链DAP10SAR。在一个实施例中，本公开提供了包含DAP10跨膜结构域的部分或整个区域的DAP10SAR。在一个实施例中，本公开提供了包含DAP10胞质结构域的部分或整个区域的DAP10SAR。包含DAP10的示例性SAR是CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-DAP10-opt1-F-P2A-SpeXba-PAC并且由SEQ ID NO(DNA):2002和SEQ ID NO(PRT)：4396代表。
在一个实施方案中，本公开提供了包含DAP10的部分或整个区域的单链DAP10SAR，其在其C末端框内融合至编码激活结构域的序列。在一个实施方案中，激活结构域衍生自CD3z的胞质结构域(SEQ ID NO(DNA)：1562-1564和SEQ ID NO(PRT)：3956-3958)。包含与CD3z激活结构域融合的DAP10的示例性SAR是CD8SP-Sph-BCM A-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-DAP10-opt1-Spe-CD3zCP-opt1-F-P2A-SpeXba-PAC(SE Q ID NO(DNA)：2037和SEQ IDNO(PRT)：4431)。
应当理解，可用于构建SAR的不同DAP10结构域可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要该结构域保留其至少一些功能特性即可。
在一个实施方案中，DAP10SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vH H、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链CD16SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
在一些实施例中，本公开的DAP10 SAR包含通式的分子：
AABD(n)-DAP10铰链结构域-DAP10跨膜结构域-DAP10-胞内信号传导结构域-任选的激活结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。
在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
在一个实施方案中，AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)、affilin、adnectin、affitin、ob ody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、an ticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；受体(例如CD16-F158V、NKG2D)、配体(例如APRIL、血小板生成素)等。
在某些实施方案中，本公开提供了合成抗原受体的新平台，指定为DAP10-SA R，其包含两条DAP10链。本公开内容提供了抗体的vL片段可以连接至两条DAP10链之一并且vH片段可以连接至另一条DAP10链。当两条这样的链(例如，vL-DAP10和vH-DAP10)在同一细胞中共表达时，vL和vH片段可以结合它们的同源抗原并传递T细胞信号。具体地，表达这种DAP10-SAR的T细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以激活NFA T信号传导、诱导IL2产生、促进T细胞增殖、促进T细胞活化并发挥细胞毒性。在另一个实施方案中，表达此类DAP10-SAR的NK细胞当暴露于表达同源靶抗原的细胞系时可以促进NK细胞增殖、促进NK细胞活化并发挥细胞毒性。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DN A)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PRT)：3537-3551)衍生自抗体的片段可用作vL/vH和DAP10片段之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如，表13；SEQ ID NO(DN A)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在另一个实施方案中，共刺激结构域也并入DAP10-SAR的DAP10链中。示例性共刺激结构域包括41BB、CD28、OX40和2B4等的共刺激结构域(表30；SEQ ID NO(DN A)：1565-1572和SEQ ID NO(PRT)：3959-3966)。总的来说，上述结果为过继细胞疗法提供了一个新的平台，克服了SAR的一些设计限制，并为SAR提供了补充方法。
本文描述的DAP10-SAR的两条链可以由单个多核苷酸链编码并翻译成单个多肽链，其随后被切割成不同的蛋白质。本文描述的DAP10-SAR的两条链可以使用两个不同的启动子表达并由两条单独的多核苷酸链编码。本文描述的DAP10-SAR的两条链可以由单个向量编码。本文描述的DAP10-SAR的两条链可以由两个不同的矢量编码。编码DA P10-SAR的核酸分子可以包含一个或多个前导序列(也称为信号肽)。在一个实施方案中，DAP10-SAR的每个功能单元(例如，连接至CD3z链加上Furine-SGSG-可裂解接头的抗原结合结构域)之前可以有引导DAP10-SAR至细胞表面的前导序列，如下所示I型跨膜蛋白。在一个实施方案中，DAP10-SAR的抗原结合结构域是面向细胞外的。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ IDNO:31至34中任一个的核酸序列和SEQ ID NO:2425至2428的氨基酸序列。在一些实施方案中，短核酸序列(3-9个核酸)包含限制性酶位点的序列位于DAP10-SAR的不同亚基之间，例如，信号序列与DAP10-SAR的抗原结合结构域之间或抗原结合与CD3z链之间。
本公开的不同SAR在设计上是模块化的。因此，编码DAP10模块的序列(SEQ ID NO：1349)可以被编码不同信令模块的序列(表25)替代。示例性的此类模块包括DAP12-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1362)、DAP12-C35S-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1366)、CD3z-ECDTM-opt1(SEQ ID NO:1351)、mutCD3z-ECDTM-opt1(SEQ IDNO:1353)、CD3z-ECDTM-OX40-opt1(SEQ ID NO:1357)、FcRy-C24S-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1423)、FcRy-ECDTMCP-opt1(SEQ ID NO:1419)、mutCD3z-ECDTM-2B4CP-opt1(SEQ ID NO:1426)、CD8-Hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt1(SEQ ID NO:1430)、mutCD8-Hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-1(SEQ ID NO:ID号：1438)。临时申请的表33中呈现了示例性SAR的SEQ ID NO，其中一个或多个DAP10模块被不同的信号模块替换。
在某些实施方案中，本公开提供了称为共刺激SAR的合成抗原受体的新平台，其含有共刺激受体的完整或部分序列，包括但不限于4-1BB、CD28、OX40和2B4。可用于构建共刺激SAR的共刺激受体链的核酸序列提供于SEQ ID NO：1573至1580(表25)中。相应的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO：3967至3974中。临时申请的表41和42中提供了包含示例性共刺激受体的完整或部分序列的示例性单链、双链和双链异二聚体SAR。
在一个实施方案中，本公开提供了包含附接到一个或多个抗原结合结构域的4-1BB的部分或整个区域的单链4-1BB SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含附着于一个或多个抗原结合结构域的CD28的部分或整个区域的单链CD28SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含连接至一个或多个抗原结合结构域的OX40的部分或整个区域的单链OX40SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含附接到一个或多个抗原结合结构域的2B4的部分或整个区域的单链2B4SAR。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链4-1BB SAR，其包含附接到一个或多个抗原结合结构域的4-1BB的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链CD28SAR，其包含附着于一个或多个抗原结合结构域的CD28的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链OX40 SAR，其包含附着于一个或多个抗原结合结构域的OX40的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链2B4 SAR，其包含附接到一个或多个抗原结合结构域的2B4的部分或整个区域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双链异二聚体4-1BB SAR，其包含附接到一个或多个抗原结合结构域的4-1BB的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链异二聚体CD28SAR，其包含附着于一个或多个抗原结合结构域的CD28的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链异二聚体OX40 SAR，其包含附着于一个或多个抗原结合结构域的OX40的部分或整个区域。在一个实施方案中，本公开提供了一种双链异二聚体2B4 SAR，其包含附接到一个或多个抗原结合结构域的2B4的部分或整个区域。
应当注意的是，在双链异二聚体SAR的情况下，其中一条链可以包含共刺激受体(例如，4-1BB、CD28、OX40、2B4等)，而另一条链可以包含能够传递激活信号的受体(例如CD16)。
应当理解，可用于构建SAR的不同共刺激受体结构域可包含其完整序列或缺失突变体或变体，只要该结构域保留其至少一些功能特性即可。
在一个实施方案中，共刺激SAR的抗原结合结构域包含scFv、vL、vH、Fv、vHH、FHVH、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架、配体或受体。单链SAR的链可以结合一种抗原或多于一种抗原(例如，两种、三种、四种等)。单链共刺激受体SAR的链还可包含一种或多种适配器(例如，RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FA等)。
在一些实施例中，本公开的共刺激SAR包含通式的分子：AABD(n)-共刺激受体铰链结构域-共刺激受体跨膜结构域-共刺激受体-胞内信号传导结构域-任选的激活结构域，其中n是1或更大。在一个实施方案中，n至少为2，例如2、3、4或5。AABD(自主抗原结合结构域)形成抗原结合结构域，并且当在细胞中表达时位于细胞外侧。
在一个实施方案中，AABD是完全人vH结构域或人源化vH结构域。在一个实施方案中，AABD是完全人单VH(SVH)结构域或人源化SVH结构域。SVH结构域，也称为自主vH结构域，可以在没有vL结构域的情况下与靶标结合。
在一个实施方案中，AABD是完全人vHH结构域或人源化vHH结构域。
编码SAR的向量通常具有有限的编码SAR的能力。例如，SAR多核苷酸的大小影响慢病毒或逆转录病毒载体的效价。因此，需要较小尺寸的SAR。一方面，本公开内容描述了包含两个信号肽和插入的2A接头的单特异性双链SAR，其少于1765个核苷酸、少于1770个核苷酸、少于1780个核苷酸、少于1790个核苷酸、少于1800个核苷酸、少于大小超过1820个核苷酸。一方面，本公开内容描述了单特异性双链SAR，其中不带信号序列的链之一不长于815个核苷酸、820个核苷酸、825个核苷酸或850个核苷酸，并且不带信号序列的第二条链不长于790个核苷酸。例如，800个核苷酸、810个核苷酸、815个核苷酸、820个核苷酸、825个核苷酸或850个核苷酸。一方面，SAR具有SI R、cTCR、Ab-TCR、AABD-TCR、εTFP、γTFP、δTFP、αβTFP、γδTFP或TCR的骨架。一方面，SAR具有SIR的支柱。一方面，SAR具有SIR、cTCR、Ab-TCR、AABD-TC R、αβTFP、γδTFP或具有TCRα和TCRβ恒定链的TCR的主链。一方面，SAR具有SI R、cTCR、Ab-TCR、AABD-TCR、αβTFP、γδTFP或具有TCRγ和TCRδ恒定链的TCR的主链。
本公开还提供了TCRα(SEQ ID NO(DNA)：7172-7271；SEQ ID NO(PR T)：7863-7963)、TCRβ(SEQ ID NO(DNA)：7273-7398；SEQ ID NO(DNA)：7273-7398；SEQ ID NO:(PRT):7965-8090)、TCRγ(SEQ ID NO(DNA):7400-7499；SEQ ID NO(PRT):8092-8191)和TCRδ(SEQID NO(DNA):7501-7600；SEQ ID NO(PRT)：8193-8292)(表45)，其可用于构建基于SIR和cTCR主链的SIR和cTCR和SA R。使用TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ恒定链的缺失突变体有助于减小SIR/SAR构建体的大小，改善其对病毒载体的包装，从而提高病毒载体滴度和转导效率。与由全长恒定链组成的SAR相比，本文描述的TCRα、TCRβ(β1或β2)、TCRγ和TCRδ链恒定链的缺失突变体可用于构建具有不同表达、结合亲和力和活性的SAR。例如，本文描述的TCRα、TCRβ(β1或β2)、TCRγ和TCRδ链恒定链的缺失突变体可用于构建与相比具有增加的表达、结合亲和力、信号传导活性、细胞因子产生和/或细胞毒性的SAR。到由全长恒定链组成的SAR。或者，本文描述的TCRα、TCRβ(β1或β2)、TCRγ和TCRδ链恒定链的缺失突变体可用于构建与SAR由全长恒定链组成。与由全长恒定链组成的SAR相比，具有增加的表达、结合亲和力、信号传导活性、细胞因子产生和/或细胞毒性的SAR构建体可用于靶向具有低水平靶表达的患病细胞(例如肿瘤细胞)抗原。与由全长恒定链组成的SAR相比，具有降低的表达、结合亲和力、信号传导活性、细胞因子产生和/或细胞毒性的SAR构建体可用于选择性靶向具有高水平表达靶抗原的肿瘤细胞，同时不伤害表达低水平靶抗原的正常健康细胞。
一方面，本公开内容描述了双链SAR，其中TCRα恒定链片段长度小于370、380、390、400、410或421个核苷酸，并且TCRβ恒定链片段小于490个核苷酸、小于500个核苷酸。长度小于510个核苷酸、小于520个核苷酸、小于530个核苷酸或小于540个核苷酸。一方面，SAR具有SIR、cTCR、Ab-TCR、AABD-TCR、αβTFP或TCR的骨架。一方面，SAR具有SIR的支柱。一方面，SAR具有带有TCRα和TCRβ恒定链或TCRγ和TC Rδ恒定链的SIR主链。一方面，SAR具有cTCR的主链，其具有TCRα和TCRβ恒定链或TC Rγ和TCRδ恒定链。一方面，TCRα和TCRβ恒定链片段携带增强其链配对并减少与内源TCRαβ链的链配对的突变。一方面，TCRα和TCRβ恒定链片段携带突变，导致两条链之间产生额外的半胱氨酸键(双键)。
一方面，本公开提供包含TCRα恒定链缺失突变体的SAR，所述TCRα恒定链缺失突变体选自SEQ ID NO：7864-7963所示的任何TCRα恒定链或具有至少70％、75％、80％、85％、90％的变体。与SEQ ID NO：7864-7963所示的氨基酸序列有95％、98％、99％、99.9％同源性。一方面，本公开提供包含TCRα恒定链片段的SAR，所述TCRα恒定链片段包含SEQ ID NO：7864-7963中的任一个或其保留与互补TCRβ恒定链配对的能力的缺失突变体或功能变体。一方面，本公开提供了包含TCRα恒定链片段的SA R，所述TCRα恒定链片段包含SEQ ID NO：7864-7963或其缺失突变体或功能变体中的任一个，其保留掺入TCR/CD3复合物、募集TCR信号传导模块和的能力。/或在与靶抗原结合时诱导T细胞信号传导。可用于构建SAR的其它TCRα恒定链缺失突变体和功能变体。
一方面，本公开提供了包含TCRβ恒定链缺失突变体的SAR，所述突变体选自SEQ IDNO:7965-8090所示的TCRβ恒定链中的任一个或具有至少70％、75％、80％、85％、90％的变体。与SEQ ID NO：7965-8090所示的氨基酸序列有95％、98％、99％、99.9％同源性。一方面，本公开提供包含TCRβ恒定链片段的SAR，所述TCRβ恒定链片段包含SEQ ID NO：7965-8090中的任一个或其保留与互补TCRα恒定链配对的能力的缺失突变体或功能变体。一方面，本公开提供了包含TCRβ恒定链片段的SAR，所述TCRβ恒定链片段包含SEQ ID NO：7965-8090中的任一个或其缺失突变体或功能变体，其保留掺入TCR/CD3复合物、募集TCR信号传导模块和/或在与靶抗原结合时诱导T细胞信号传导的能力。其它TCRβ恒定链缺失突变体和功能变体可用于构建SAR。
一方面，本公开提供了包含TCRγ恒定链缺失突变体的SAR，所述突变体选自SEQID NO：8092-8191所示的TCRγ恒定链中的任一个或具有至少70％、75％、80％、85％、90％的变体。与SEQ ID NO：8092-8191所示的氨基酸序列有95％、98％、99％、99.9％同源性。一方面，本公开提供包含TCRγ恒定链片段的SAR，所述TCRγ恒定链片段包含SEQ ID NO：8092-8191中的任一个或其保留与互补TCRδ恒定链配对的能力的缺失突变体或功能变体。一方面，本公开提供了包含TCRγ恒定链片段的SAR，所述TCRγ恒定链片段包含SEQ ID NO：8092-8191或其缺失突变体或功能变体中的任一个，其保留掺入TCR/CD3复合物、募集TCR信号传导模块和/或在与靶抗原结合时诱导T细胞信号传导的能力。可用于构建SAR的其它TCRγ恒定链缺失突变体和功能变体。
一方面，本公开提供了包含TCRδ恒定链缺失突变体的SAR，所述突变体选自SEQ IDNO:8193-8292所示的任何TCRδ恒定链或具有至少70％、75％、80％、85％、90％的变体。与SEQ ID NO：8193-8292所示的氨基酸序列有95％、98％、99％、99.9％同源性。一方面，本公开提供了包含TCRδ恒定链片段的SAR，所述TCRδ恒定链片段包含SE Q ID NO：8193-8292中的任一个或其保留与互补TCRγ恒定链配对的能力的缺失突变体或功能变体。一方面，本公开提供了包含TCRδ恒定链片段的SAR，所述TCRδ恒定链片段包含SEQ ID NO：8193-8292或其缺失突变体或功能变体中的任一个，其保留掺入TCR/CD3复合物、募集TCR信号传导模块和/或在与靶抗原结合时诱导T细胞信号传导。可用于构建SAR的其它TCRδ恒定链缺失突变体和功能变体。
在本文所述的任何SAR的一些实施方案中，异源抗原结合结构域选自：抗体、抗体片段(vL、vH、Fab等)scFv、(scFv)2、VHH结构域、FHVH(完全人vH结构域)、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合支架(例如Centyrin、亲和体、ZIP结构域、适配器等)、VNAR结构域、配体、TCR、可变TCR和受体的结构域(Va、Vb、Vg、Vd)。在本文所述的任何SAR的实施方案中，异源抗原结合结构域包含scFv。
本发明的SAR的抗原结合结构域可以是HLA非依赖性TCR、单结构域TCR、受体的配体结合结构域、配体的受体结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合支架、适配器或其片段。
一方面，本公开提供了合成抗原受体(SAR)的新组合物。在另一方面，本公开提供了SAR的新颖配置/架构。另一方面，本公开提供具有有用的生物学特性(例如，表达、结合亲和力、效应器功能等)的SAR。另一方面，本公开提供能够结合一种或多于一种抗原的SAR。另一方面，本公开提供能够结合抗原的一个或多于一个表位的SAR。
一方面，本公开提供了包含多于一个(即，2、3、4、5或更多个)抗原结合结构域的合成抗原受体(SAR)。另一方面，本公开提供能够结合和/或响应多于一种抗原或多于一个抗原表位的SAR。另一方面，本公开提供了能够结合和/或响应于多于一种抗原或多于一个抗原表位的双特异性和/或多特异性SAR。另一方面，本公开提供了用于构建双特异性和/或多特异性SAR的有用抗原结合结构域。另一方面，本公开提供了用于双特异性和/或多特异性SAR的有用配置(即不同域的位置)。当在免疫效应细胞(例如T细胞、NKT细胞或NK细胞等)中表达时，本公开的双特异性和多特异性SAR赋予其结合和/或响应多于一种抗原或多于一种的能力。与针对那些相同抗原或这些抗原的相同表位的两个或更多个单特异性SAR相比，具有几乎相同功效或更高功效的抗原表位。
双特异性或多特异性SAR中两个或更多个抗原结合结构域的存在可能导致空间阻碍、非特异性聚集、表达不良、蛋白质解折叠和/或干扰抗原结合。此外，需要优化抗原结合结构域相对于SAR跨膜结构域的位置，以优化所得受体的信号转导。本领域已经描述了掺入两个或更多个scFv的双特异性和多特异性CAR。然而，本公开内容确定SAR中多于一种scFv(即2、3、4或更多个)的存在常常导致空间阻碍、非特异性聚集、强直信号传导、不良表达、蛋白质解折叠和/或干扰抗原结合，导致信号传导和效应器功能不良(例如，细胞因子产生、细胞毒性等)。因此，产生包含两个或更多个抗原结合结构域的双特异性和多特异性SAR的主要挑战是确定有用的抗原结合结构域(例如，scFv、Fv、Fab、vHH、FHVH、Centyrin、affibody、细胞因子、受体、svd-TCR等)应纳入此类SAR中，以减少空间位阻、非特异性聚集、强直信号传导、表达不良、蛋白质解折叠和/或干扰抗原结合，从而导致信号传导不良和效应器功能(例如细胞因子的产生、细胞毒性等)。
第二个挑战是确定构成双特异性和多特异性SAR的各种抗原结合结构域的有用配置。例如，需要确定各种抗原结合结构域相对于彼此以及相对于SAR的其它成分(例如铰链结构域、跨膜结构域等)的最佳顺序，以减少非特异性聚集、强直信号传导。、表达不良、蛋白质解折叠和/或干扰抗原结合，导致信号传导和效应器功能不良(例如，细胞因子产生、细胞毒性等)。这对于所有SAR并且特别是对于多链SAR来说是一个重大挑战，例如本公开中描述的那些(例如，双链CD16 SAR、双链Dap10 SAR、双链NKp30 SAR等)，其抗原结合结构域由两种不同的组成。片段(例如，vL和vH、Va和Vb或Vg和Vd等)。例如，第二抗原结合结构域(例如，scFv或vHH结构域)与双链SAR的连接，所述双链SAR通过vL和vH片段与CD19结合，所述vL和vH片段可操作地连接至两条单独的CD16链但连接形成Fv与CD19结合的Fv可能会干扰vL和vH片段之间的相互作用，导致它们无法形成可以结合CD19的功能性Fv。
铰链结构域的长度决定了抗原结合结构域和细胞膜之间的距离，可能会影响通过嵌合抗原受体的信号传导。因此，该领域的另一个挑战是，目前尚不清楚多个抗原结合结构域的附着是否会通过增加靶抗原与细胞膜之间的距离，对有效免疫突触的形成和通过SAR的信号传导产生不利影响。
SAR中多个抗原结合域的融合可能会导致空间位阻和不正确的折叠。该领域的另一个挑战是，目前尚不清楚双特异性/多特异性SAR的不同抗原结合域之间是否需要接头域。接头结构域的长度和性质也是未知的。这对于双链SAR(例如双链CD16 SAR、双链NKp30SAR、双链NKp44 SAR、双链Dap10 SAR等)尤其重要，因为添加不正确的接头可能会干扰之间的相互作用。两条链或形成功能性Fv。此外，接头可能会增加靶抗原与细胞膜之间的距离，从而对有效免疫突触的形成和通过SAR的信号传导产生不利影响。
一方面，本公开提供了上述问题的解决方案。
一方面，本公开提供了具有一个或多个抗原结合结构域和一个或多个跨膜结构域的SAR。在一个实施方案中，本公开提供了用于构建双特异性和多特异性SAR的有用的抗原结合结构域。
本公开提供了若干示例性SAR，其包含不同的抗原结合结构域、铰链结构域、接头结构域、连接肽、跨膜结构域、激活结构域、共刺激结构域、辅助模块和治疗控制等。本公开提供于SEQ ID NO(DNA):1600-2328、4851-5129、5451-6282、7160-7170、7601-7747、8768-9602、10817-10830和SEQ ID NO(PRT)中：3994-4722、5151-5429、6283-7114、7852-7862、8293-8439、9860-10694。本公开的示例性SAR的名称和配置在临时申请的表32-34和36-42中提供，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。可用于构建SAR的示例性组分的SEQ ID(DNA)和SEQ ID(PRT)提供于SEQ ID NO(DNA):31-1243、1308-1572和8535至8767以及SEQID NO(PRT)：2425-3637、3702-3966和9627-9859、10832-10841和12304-12311。可用于构建本公开的SAR的不同SAR组分和辅助试剂的名称提供在临时申请的表1-31中，该临时申请通过引用以其整体并入本文。SAR的s靶抗原、构型和组成可以通过使用诸如BLAST的程序对其组件模块进行序列同源性搜索，从本公开中提供的它们的核酸序列和氨基酸序列推断出。或者，可以使用诸如ApE([https://]jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)的软件来确定不同SAR构建体的组成，其核酸序列在本公开中提供。最后，本领域技术人员可以从其名称推断出本公开的不同SAR的配置和组成。
在实施例中，本公开提供了一种新颖的SAR，其具有由本文提供的任何示例性SAR表示的架构和/或配置。在一个实施例中，本公开提供了一种新颖的SAR，其具有本文提供的任何示例性SAR或其功能变体的组合物。在一个实施方案中，本公开提供了与以下氨基酸序列具有至少70％同源性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性)的新颖SAR。本文提供的任何示例性SAR。在一个实施方案中，本公开提供了与以下氨基酸序列具有至少70％同源性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性)的新颖SAR。本文提供的任何示例性SAR，不包括可选的辅助模块。在一个实施方案中，本公开提供了与以下氨基酸序列具有至少70％同源性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性)的新颖SAR。本文提供的任何示例性SAR在包含其抗原结合结构域和信号链(例如CD16链)的区域中。
一方面，本公开涉及包括人VH结构域、通常多个人VH结构域的自主抗原结合结构域(AABD)作为构建块来制备具有有利的抗原结合结构域的SAR的用途。
本公开一方面涉及自主抗原结合结构域(AABD)、其生成方法以及此类结构域用于构建合成抗原受体和潜在抗体治疗剂的用途。在一个实施例中，AABD结构域具有改善的稳定性。在另一个实施方案中，AABD结构域具有改善的热稳定性。在另一个实施方案中，AABD结构域具有改善的溶解度。在另一个实施方案中，AABD结构域具有较小的自聚集倾向。在另一个实施方案中，当在具有N端信号肽的哺乳动物细胞中表达时，AABD结构域具有改善的在细胞外空间中分泌的能力。
一方面，AABD是单结构域抗体或抗体片段。一方面，AABD是单个可变重链(VH或vH)结构域(SVH结构域)或其片段，其能够在不存在可变轻链(VL或vL)结构域的情况下结合抗原。在另一个方面，AABD是其片段的单可变重链(VH)结构域(或SVH结构域)，其可以在不存在vL结构域的情况下表达为可溶性蛋白。在另一个方面，AABD是单可变重链(VH)结构域(或SVH结构域)或其片段，当与N端分泌信号连接时，其可以在不存在vL结构域的情况下表达为分泌蛋白。本公开的某些实施例涉及包含第一AABD的SAR，该第一AABD在不存在第二结构域的情况下特异性结合抗原。
一方面，AABD是单可变轻链(VL或vL)结构域或SVL结构域或其片段，其能够在不存在可变重链(VH或vH)结构域的情况下结合抗原。在另一个方面，AABD是单可变轻链(VL)结构域(或SVL结构域)或其片段，其可以在不存在vH结构域的情况下表达为可溶性蛋白。在另一个方面，AABD是单可变轻链(VL)结构域(或SVL结构域)或其片段，当与N端分泌信号连接时，其可以在不存在vH结构域的情况下表达为分泌蛋白。
在一些实施方案中，AABD是基于非scFv的抗原结合结构域、骆驼科动物vHH结构域、人源化vHH结构域、非免疫球蛋白抗原结合支架、细胞因子或配体的受体结合结构域、受体、单可变域T细胞受体(TCR)、自身抗原或其片段。
在一个实施方案中，AABD是适配器结构域、适配器结合结构域或其片段。示例性适配器和适配器结合结构域包括但不限于：RZIP、EZIP、E4、K4、NKG2D-YA、NKG2D-AF、D结构域等。
本文所用的术语“单结构域抗体、可变单结构域或免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”都是本领域众所周知的，并且描述了结合靶抗原的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。如下文所解释的，本公开的各个方面的实施方案涉及包含单重链可变结构域抗体/免疫球蛋白重链单可变结构域(称为SVH结构域)的SAR，其结合不同的抗原，例如CD19、CD20、CD22、BCMA、CD38、MPL、CD123、CD33、间皮素、Her2、CS1/SLAMF7、CD30、GD2、GD3、FLT3、ROR1、CD79b、Lym1、Lym2、PSCA、PSMA、ALK、CD138、CEA、FAP、TAJ、CD229、IL13Ra2、没有轻链时的CD32b、GPC3、Muc16和KIR3DL2。通常使用人重链单可变域抗体。
因此，在一些实施方案中，本公开的SAR包含结合结构域，该结合结构域包含单结构域抗体或由单结构域抗体组成，其中所述结构域是单个人重链可变结构域(SVH)。因此，在一些方面，本公开内容的SAR包含一个或多个缺乏VL结构域的结合结构域。
因此，在一些实施方案中，本公开的SAR包含结合结构域，该结合结构域包含单结构域抗体或由单结构域抗体组成，其中所述结构域是骆驼科动物vHH(或VH H)结构域或人源化vHH结构域。
如本文所用，VH结构域是人VH结构域或非人VH结构域。
SVH结构域是12-14kDa的小分子，可以组合成不同的形式以产生SAR的多价或多特异性抗原结合结构域。SVH结构域非常强大，其特点是在血清中具有高亲和力和稳定性。SVH结构域的另一个特点是在血清中溶解度高且不聚集。
每个单VH结构域(SVH)抗体包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，在本公开的一个实施方案中，该结构域是具有下式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的人可变重链(VH)结构域。
可以根据Kabat系统使用具有W103R取代的SVH结构域构建的单链和多链SAR(例如，CD16、NKp30、NKp44、NKp46、Dap10等)。具有W103R取代的示例性靶向CD19的SVH是CD19-FHVH-354，并且由SEQ ID NO(DNA):836和SEQ ID NO(PRT):3230表示。在另一个实施方案中，本公开内容提供了具有根据Kabat系统具有W103R取代的SVH结构域的双特异性、二价或双异位抗原结合片段的多链SAR。
在另一个实施方案中，本公开提供了具有多特异性、多价或多互补位抗原结合部分的多链SAR，其包含具有根据Kabat系统的W103R取代的SVH结构域。由于AABD本质上是模块化的，因此AABD可以被针对不同抗原的其它AABD替代，以开发针对这些抗原的SAR。
在另一个实施方案中，本公开提供了具有双特异性、二价或双互补位抗原结合部分的单链SAR，其包含具有根据Kabat系统的W103R取代的SVH。
在一个实施例中，本公开提供可以使用通过引入非规范半胱氨酸稳定的SVH来构建单链和多链SAR，所述SVH能够在合适的条件下形成二硫键和/或形成二硫桥。包含非规范半胱氨酸的示例性SVH是CEA-300-aVH，并在SEQ ID NO(DNA):954和SEQ ID NO(PRT):3348中提供。另外的示例性此类SVH在WO2019149715中提供，将其并入其在此全文引用。
在一个实施例中，本公开旨在通过提供包含SVH的单链SAR来减轻现有过继细胞疗法的缺点，其中SVH结构域根据Kabat在位置(i)52a和71或(ii)33和52中含有取代半胱氨酸编号，其中所述半胱氨酸能够形成二硫键和/或在合适的条件下形成二硫键。
在本公开的实施例中，用于制备SAR的SVH结构域包含选自根据Kabat编号的44E、45E、45R、(101-1)Y和101D的取代。具体地，SVH包含根据Kabat编号的取代44E、45E或45R、(101-1)Y和101D。在一个实施方案中，SVH结构域包含根据Kabat编号选自G44E、T45E、T45R、F(101-1)Y和A101D的取代。在一个实施方案中，SVH结构域包含根据Kabat编号的取代G44E、T45E、T45R、F(101-1)Y和A101D。
在本公开的实施例中，SAR包含根据Kabat编号具有选自44E、45E和(101-1)Y的取代的SVH。在一个实施例中，SAR包含具有根据Kabat编号的取代44E、45E和(101-1)Y的SVH结构域。在一个实施方案中，SVH结构域包含根据Kabat编号的选自G44E、T45E和F(101-1)Y的取代(如果存在于SVH结构域中)。在一个实施方案中，SAR包含SVH结构域，该SVH结构域包含根据Kabat编号的取代G44E、T45E和F(101-1)Y。
在一个实施方案中，SAR的SVH结构域包含vH构架，该vH构架包含分别与SEQ IDNO:21411、21412、21413和21414的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个实施方案中，SAR的SVH结构域包含vH框架，该vH框架包含分别与SEQ IDNO:4819-4822的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个实施方案中，SAR的SVH结构域包含vH框架，该vH框架包含分别与SEQ IDNO:4823-4826的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4。
在本公开的实施例中，SAR的SVH结构域包含vH框架，该vH框架包含分别与SEQ IDNO:4827-4830的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR 4。
在本公开的一个实施方案中，SVH结构域包含vH构架，所述vH构架包含分别与SEQID NO:4831-4834的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR 4。
在本公开的一个实施方案中，SVH结构域包含vH构架，所述vH构架包含分别与SEQID NO:4835-4838的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR 4。
在一个实施方案中，SVH结构域包含vH构架，所述vH构架包含分别与SEQ ID NO:4839-4842的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个实施方案中，SVH结构域包含vH框架，所述vH框架包含分别与SEQ ID NO:4843-4846的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4。
SVH结构域对于构建SAR特别有用，因为根据SEQ ID NO 4819-4650的FR1-4在人类中不具有免疫原性。
在一些实施方案中，所述的SAR载体包括一个人类SVL结构域(通常是多个人类SVL结构域)，该结构域能够识别感兴趣的目标蛋白质，例如在肿瘤细胞上表达的蛋白，比如一种抗原。本文使用的术语SVL结构域是指单个人VL结构域抗体(VL sdA b)。因此，这些术语可以互换使用。术语SVL也可与独立vL结构域或自主vL结构域互换使用。SVL是AABD的一种。
一方面，SAR的AABD是骆驼科动物vHH结构域。本公开还涉及包含多个vHH结构域的SAR。本公开还涉及包含人源化vHH结构域的SAR。可用于构建本公开内容的SA R的示例性vHH结构域及其靶抗原呈现于表5中。
一方面，SAR的AABD是非免疫球蛋白抗原结合支架，例如DARPIN、affibody、affilin、adnectin、affitin、obodys、repebody、fynomer、alphabody、avime r、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白、D结构域或其片段。本公开还涉及包含多个非免疫球蛋白抗原结合支架的SAR。可用于构建本公开内容的SAR的示例性非免疫球蛋白抗原结合支架及其靶抗原呈现于表7-9中。
一方面，SAR的AABD是适配器结合结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、K4、NKG2D-AF、NKG2D-YA或D结构域等)。本公开还包括与多个适配器结合的SAR。在一个实施方案中，适配器结合结构域是亮氨酸拉链结构域。一方面，SAR的AABD结合适配器(例如，RZIP、EZIP、E4、K4、D结构域、Streptag、FITC、生物素、ULBP2R、ULBP2-S3等)。本领域技术人员应当理解，适配器和适配器结合蛋白可以彼此替换。因此，SAR可以包括RZIP模块，该RZIP模块绑定到包括EZIP模块的SAR适配器。或者，SAR可以包括EZIP模块，而SAR适配器可以包括RZIP模块。本公开还包括与多个适配器结合的SA R。
一方面，SAR的AABD是受体或其片段的胞外配体结合结构域。本公开内容还包括包含受体的多个胞外配体结合结构域的SAR。
一方面，SAR的AABD是配体或细胞因子或其片段的胞外受体结合结构域。本公开内容还包括包含配体或细胞因子的多个细胞外受体结合结构域的SAR。
一方面，SAR的AABD是自身抗原。本公开还包括包含多种自身抗原的SA R。可用于构建SAR的示例性的自身抗原是Dsg3或其片段。
一方面，SAR的AABD是T细胞受体(svd-TCR)的单可变结构域。本公开内容还包括包含T细胞受体的多个单可变结构域的SAR。包含svd-TCR结构域的示例性多核苷酸提供于PCT/US2021/022641的SEQ ID NO(DNA):21563-21564和WO2021030182中，其通过引用以其整体并入本文。
一方面，SAR的AABD是可以与细胞表面表达的抗原结合的任何单结构域蛋白。
SAR中的多个AABD可以以不同的组合存在(例如，两个Centyrin、一个Ce ntyrin和一个vHH结构域、vHH结构域和一个SVH结构域和一个Centyrin等)
一方面，SAR的AABD是Centyrin。本公开还涉及包含多个Centyrin的SA R。一方面，SAR的AABD是DARPINS。本公开还涉及包括多个DARPIN的SAR。类似地，本公开涉及包含多个非免疫球蛋白抗原结合结构域的SAR，例如affibodies、affilins、adnectin、affitin、obodies、repebodies、fynomer、alphabodies、avimer、atrim ers、pronectin、anticalins、kunitz结构域、犰狳重复蛋白。
在一些实施例中，SAR包含多个AABD。在一个实施方案中，第一AABD连接至第二AABD，其中第一和第二AABD特异性结合抗原。在一个实施方案中，SAR识别的抗原是与MHC复合体结合的肽抗原。在一些实施方案中，SAR的两个或更多个AABD识别相同的抗原。在其它实施方案中，SAR的两个或更多个AABD识别不同的抗原。
虽然通常用于SAR(例如第二代CAR)的scFv可能会出现不需要的聚集、簇形成和免疫原性，但自主抗原结合域(AABD)的使用提供了一种稳定的形式，大大降低了免疫原性、非特异性的可能性。聚合或展开。这在设计具有双特异性、二价或双互补位抗原结合部分的SAR时特别有用。如本文发明人所证明的，多个AA BD结构域可以容易地以这种多聚体形式使用，从而促进多特异性SAR的产生，所述多特异性SAR能够同时靶向多于一种靶抗原或多于一种抗原表位。
在一个实施例中，本公开提供了可以靶向一种或多于一种抗原(例如，1、2、3、4、5、6或更多种抗原)的SAR。在一个实施例中，本公开提供了可以靶向一个或多于1个表位(例如，1、2、3、4、5、6或更多个表位)的SAR。在一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多于1个抗原结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6或更多个抗原结合结构域)的SAR。
在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一条或多于一条链，每条链包含零、一个或多个可操作地连接至跨膜结构域、任选的激活结构域和任选的共刺激结构域的抗原结合结构域。在一个实施例中，激活结构域编码一个或多个ITAM基序。
在一个实施方案中，本公开提供了一种合成抗原受体，其包含(a)一个或多个抗原特异性靶向区，(b)至少一个胞外接头结构域，(c)至少一个跨膜结构域，(d)任选的共刺激结构域和(e)任选的胞内信号传导结构域，其中一个抗原特异性靶向区域包含抗原特异性单链Fv(scFv)片段，并且第二抗原特异性靶向结构域包含AABD。在示例性实施方案中，AABD是非scFv抗原结合模块(例如，SVH、vHH、FHV H、SVL、svd-TCR、Centyrin、DARPIN、CD16A、CD64、CD32、NKG2D、NKG2D-AF、NKG2D-YA、RZIP、EZIP、E4、K4、D域等)。
在一个实施方案中，本公开提供了一种双特异性或多特异性合成抗原受体，其包含(a)至少两个抗原特异性靶向区，(b)至少一个胞外接头结构域，(c)至少一个跨膜结构域，(d)任选的共刺激结构域和(e)任选的胞内信号传导结构域，其中一个抗原特异性靶向区域包含抗原特异性单链Fv(scFv)片段，并且第二抗原特异性靶向结构域包含AABD。在示例性实施方案中，AABD是非scFv抗原结合模块(例如，SVH、vHH、FHVH、SVL、svd-TCR、Centyrin、DARPIN、CD16A、CD64、CD32、NKG2D、NKG2D-AF、NKG2D-YA、RZIP、EZIP、E4、K4、D域等)。包含两个AABD并靶向CD38和BCMA的示例性双特异性SAR是CD8SP-CD38-717-vHH-Ecoil-BCMA-346-vHH-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO(DNA):5100；SEQ ID NO NO(PRT):5400)在一个实施方案中，本公开提供了具有通式的双特异性或多特异性合成抗原受体：(AABD)n-任选的接头结构域-scFv-Hinge结构域-跨膜结构域-任选的一个或多个共刺激结构域-激活域；其中n＝0、1、2、3、4、5或更多并且其中激活结构域可以包含一个或多个ITAM基序。示例性的此类SAR由IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-scFv-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3(SEQ ID NO(DNA):7160和SEQ ID NO(PRT)：7853)。该SAR具有一个以人源化hu-mROO5-1 scFv为代表、靶向CD19的抗原结合结构域，以及第二个以CD20-vHH-2HCD26为代表、以CD20为目标的抗原结合结构域。两个抗原结合结构域通过Gly-Ser(G4Sx3v2)柔性接头连接。该SAR构建体还包含CD16胞外结构域(包括CD16 D1和D2结构域)、CD16铰链和跨膜结构域以及CD16胞质结构域。其它示例性双特异性SAR由SEQ IDNO：7161-7170表示。
另一个示例性双特异性SAR由IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-scFv-CD28-Hinge-CD16-F158V-S197P-Hinge-TM-CP-v3(SEQ ID NO：7164)。该构建体与上述具有SEQ ID NO:7160的构建体相似，不同之处在于它缺少CD16 D1和D2结构域并且包含CD28铰链结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种SAR，其包含一条或多于一条链，每条链包含零、一个、两个或更多个可操作地连接至跨膜结构域但缺乏激活结构域的抗原结合结构域。尽管这样的SAR缺乏其自身的激活结构域，但它能够通过招募包含编码激活结构域的蛋白质的信号转导模块来进行信号转导。此类SAR可以招募信号蛋白的例子包括CD3z、DAP10或DAP12。示例性的此类SAR基于CD16 SAR、NKp30 SAR、NK p44 SAR或NKp46 SAR的主干。在示例性实施例中，本公开提供了一种SAR，其中一个或多个AABD连接至双链SAR的一条或两条链的N端或N端附近。在示例性实施例中，本公开提供了一种SAR，其中一个或多个AABD连接至包含SAR的一条或两条链的vL或vH片段的N端或N端附近。在示例性实施例中，本公开提供了一种SAR，其中一个或多个AABD连接至包含TCR的一条或两条链的Va、Vb、Vg或Vd片段的N端或N端附近。在示例性实施方案中，AABD是非scFv抗原结合模块(例如：SVH、vHH、FHVH、SVL、svd-TCR、Centyri n、DARPIN、CD16A、CD64、CD32、NKG2D、NKG2D-AF、NKG2D-YA、RZIP、EZIP、E4、K4、D域等)。
在一个实施方案中，本公开提供了一种半链SAR或双链SAR，其包含具有通式的一条链：(AABD)n-任选的接头结构域-scFv-任选的接头-TCR恒定链；以及具有通式(AABD)n的第二条链-任选的接头结构域-CD16/NKp30/NKp44/Nkp46恒定链，其中n＝0、1、2、3、4、5或更多。CD16/NKp30/NKp44/Nkp46恒定链包含全长CD16/NKp30/NKp44/Nkp46多肽或其片段或突变体或变体，其能够直接将信号传递至免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞等)或能够募集一种或多种能够将信号传递至免疫细胞的信号蛋白。传输的信号可以包括刺激细胞增殖、活化、细胞因子分泌和/或细胞毒性的信号。
在一个实施方案中，本公开提供了一种包含两条链的双链双特异性合成抗原受体，每条链包含(a)一个或多个异源抗原特异性靶向区，(b)至少一个胞外接头结构域，(c)至少一个跨膜结构域，(d)任选的共刺激结构域和(e)任选的细胞内信号传导结构域，其中一个抗原特异性靶向区域包含能够与vH和/或vL结合的vL和/或vH片段存在于第二链上的片段以产生片段变量(Fv)，并且第二抗原特异性靶向结构域包含AABD(例如，vHH、SVH、Centyrin、affibody等)。在一个实施方案中，Fv结合抗原。在另一个实施方案中，Fv不结合抗原。在一个实施方案中，Fv充当用于附着包含AABD的第二抗原特异性靶向结构域的支架。在一个实施方案中，AABD是非scFv抗原结合结构域。
包含两条链的示例性双链双特异性SAR是CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-Kpn-G4S-EcoR1-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-NKp30-ECDTMCP-opt1-F-P2A-SP-hu-mROO 5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC并且由SEQ ID NO(DNA):1605和SEQ ID NO(PRT):3999表示。SAR构建体的一条链包含通过IgCL接头与NKp30胞外、跨膜和胞质结构域融合的人源化hu-mROO5-1 vL片段，并且SAR的另一条链包含与第二条链包含NKp30胞外、跨膜和胞质结构域。通过IgG1-CH1连接器。SAR的hu-mROO5-1 vL和hu-mROO5-1vH片段一起形成靶向CD19的Fv。靶向CD20的vHH片段(CD20-USC1-vHH-2HCD26；SEQ ID NO：841)通过甘氨酸-丝氨酸接头融合至hu-mROO5-1vH片段的N末端。因此，SAR通过hu-mROO5-1Fv靶向CD19，并通过CD20-USC1-vHH-2HCD26靶向CD20。值得注意的是，SAR的格式是模块化的。因此，可以用SAR的一个模块替换另一模块。例如，hu-mROO5-1 vL和hu-mROO5-1 vH片段可以用针对不同抗原的vL/vH片段替换。类似地，CD20-USC1-vHH-2HCD26模块可以被另一个针对不同抗原的AABD替换。IgCL和IgG1-CH1接头可以被SEQ ID NO：1142-1175(表13)中提供的其它合适的类似Ig接头替代。最后，两个NKp30片段之一可以被衍生自NKp44、NKp46、CD16、CD3z或DAP10的一种或两种多肽替换。
其中NKp30 ECDTMCP链之一被CD16-F158V-S197P-FL-TMCP链取代的示例性构建体由CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-Kpn-G4S-EcoR1-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Ba m-NKp30-ECDTMCP-opt1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-PAC(SEQ ID NO(DNA):1618和SEQ ID NO(PRT):4012)表示。临时申请的表32中提供了其它示例性单特异性、双特异性和三特异性SAR构建体。
靶向CD19、CD20和BCMA的示例性三特异性双链构建体由SEQ ID NO(DN A):1714和SEQ ID NO(PRT):4108表示。靶向CD19、CD20和BCMA的另一个示例性三特异性双链构建体由SEQ ID NO:1714表示。SEQ ID NO(DNA):1619和SEQ ID NO(PRT):4013。
公开内容的SAR包含一个、通常多于一个vH(V H)结构域，即一种或多种vH单结构域抗体，并且缺乏轻链。在一个实施例中，SAR包括至少两个vH单域(SV H)抗体。
公开内容的SAR包含一个、通常多于一个VHH结构域，即一种或多种VHH单结构域抗体，并且缺乏轻链。在一个实施例中，SAR包括至少两个VHH单域。
公开内容的SAR包含一种、通常多于一种非免疫球蛋白抗原结合支架，即选自DARPIN、亲和体、ZIP结构域(例如，RZIP、EZIP、E4、R4等)的一种或多种结构域)、affilin、adnectin、affitin、obodies、repebody、fynomer、alphabody、av imer、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或片段其中。在一个实施例中，SAR包括两个AABD。在一个实施方案中，SAR包含Fv(即，组合形成Fv的vL/vH片段)和至少一个AABD。
公开内容的SAR包含靶向一种或多种抗原的至少两个AABD(例如，两个SVH结构域或两个VHH结构域或一个SVH和一个VHH结构域等)。
公开内容的SAR包含至少两个靶向一种或多种抗原的抗原结合结构域。
公开内容的SAR的抗原结合结构域包含对相同抗原具有特异性的两个或至少两个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，从而提供二价结合分子。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含两个或至少两个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其对相同抗原具有特异性，但与所述抗原上的不同表位结合。换句话说，抗原结合结构域包含结合第一表位的第一AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)和结合第二表位的第二AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)。表位可以重叠。因此，抗原结合结构域是双互补位的并且本公开的范围包括双互补位SAR。在又一个实施方案中，抗原结合结构域包含两个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其对相同抗原具有特异性并结合所述抗原上的相同表位。
公开内容的SAR的抗原结合结构域包含Fv(例如，连接至不同信号链且不以单链片段可变形式或scFv形式存在的vL片段和vH片段)和至少一种对与Fv结合的相同抗原具有特异性的AABD(例如SVH、VHH、Centyrin等)，从而提供二价结合分子。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含Fv和至少一种AABD(例如，SVH、VHH、Centyri n等)，其对与Fv相同的抗原具有特异性，但与所述抗原上的不同表位结合。换句话说，抗原结合结构域包含结合第一表位的Fv和结合第二表位的第二AABD(例如SVH、VH H、Centyrin等)。表位可以重叠。因此，抗原结合结构域是双互补位的并且本公开的范围包括双互补位SAR。在又一个实施方案中，抗原结合结构域包含Fv和至少一个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其对相同抗原具有特异性并结合所述抗原上的相同表位。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含Fv和至少一个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其中Fv片段不以显著的亲和力结合任何特定抗原或以不显著的亲和力结合并且仅仅用作作为连接一个或多个AABD的支架。
公开内容的SAR的抗原结合结构域包含TCR-Fv(例如，连接至不同信号链且不以单链TCR形式存在的Vα/Vβ片段或Vγ/Vδ片段，或scTCR形式)和至少一种对与TCR-Fv结合的相同抗原具有特异性的AABD(例如SVH、VHH、Centyrin等)，从而提供二价结合分子。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含TCR-Fv(例如，Va/Vb或Vg/Vd)和至少一种AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其对与TCR相同的抗原具有特异性，但与所述抗原上的不同表位结合。换句话说，抗原结合结构域包含结合第一表位的TCR-Fv和结合第二表位的第二AABD(例如SVH、VHH、Centyrin等)。表位可以重叠。因此，抗原结合结构域是双互补位的并且本公开的范围包括双互补位SAR。在又一个实施方案中，抗原结合结构域包含TCR-Fv和至少一个AABD(例如，SVH、VHH、Centy rin等)，其对相同抗原具有特异性并结合所述抗原上的相同表位。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含TCR-Fv和至少一个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，其中TCR-Fv片段不以显著亲和力结合任何特定抗原或以不显著亲和力结合。亲和力并且仅仅充当一个或多个AABD附着的支架。
在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含对两种不同抗原特异性的两个AA BD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)，从而提供双特异性抗原结合结构域。换句话说，抗原结合结构域包含结合第一靶标的第一AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)和结合第二靶标的第二AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)。因此，在某些实施例中，本公开涉及双特异性SAR。
因此，本文所用的术语“双特异性SAR”或“双特异性抗原结合结构域”是指包含本文所述的结合分子和第二多肽结构域的多肽，所述结合分子具有对第一靶抗原具有结合特异性的结合位点。其具有对第二抗原靶标具有结合特异性的结合位点，即双特异性结合分子对两个靶标具有特异性。第一靶标和第二靶标不相同，即是不同的靶标，例如蛋白质；两者都可以存在于细胞表面上。因此，本文所述的双特异性结合分子可以选择性地且特异性地结合表达(或在其细胞表面上展示)第一靶标和第二靶标的细胞。在另一个实施方案中，结合分子包含两个以上的抗原结合结构域，提供多特异性结合分子。本文所述的多特异性抗原结合结构域除了结合第一靶标之外还可以结合一个或多个另外的靶标，即多特异性多肽可以结合至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、或多个靶，其中多特异性多肽试剂分别具有至少两个、至少、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或更多个靶结合位点。
包含三个或更多个AABD(例如SVH、VHH、Centyrin等)的抗原结合结构域也在本公开的范围内。
一方面，本公开内容描述了用于靶向两种或更多种抗原的本公开内容的SAR的最佳配置。一方面，本公开内容描述了用于靶向一种或多种抗原的两个或更多个表位的本公开内容的SAR的最佳配置。
本公开的单链和双链SAR可在T细胞中表达，其中内源TCRα、TCRβ、TCR和/或TCRδ基因的表达已使用本领域已知的方法减少或消除。其中内源功能性TRAC、TRB C、TRGC和/或TRDC链的表达已被减少或消除的此类T细胞可用于同种异体细胞治疗的目的。
在一个实施例中，使用PCT/US2018/053247中描述的方法，本公开的单链和双链SAR可以靶向T细胞中的TRAC、TRBC、TRGC和/或TRDC基因座，该PCT/US2018/053247通过引用以其整体并入在此处。其中内源TRAC、TRBC、TRGC和/或TRDC基因座通过插入SAR而被破坏的此类T细胞可用于同种异体细胞治疗的目的。
本公开还提供了用于将双特异性和多特异性SAR靶向TRAC和/或TRBC基因座以产生同种异体SAR-T细胞的组合物和方法。
在一个实施方案中，本公开内容的单链和双链SAR可靶向编码在免疫细胞例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞和/或中表达的一种或多种基因的内源基因座。或中性粒细胞等。
在一个实施例中，本公开的单链和双链SAR可靶向编码在NK细胞中表达的一种或多种基因的内源基因座。
在一个实施方案中，本公开内容的单链和双链SAR可靶向编码一种或多种选自CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、NK G2D、NKG2A和DNAM1。
在一个实施例中，本公开内容的单链和双链SAR靶向编码CD16A、CD16B NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、NKG2D、NKG2C和DNAM1中的一个或多个的内源基因座。基因，以便SAR的抗原结合结构域与CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12、FcRγ的部分或全部胞外结构域、铰链结构域和/或跨膜结构域框内表达、CD3z、NKG2D、NKG2C和DNAM1基因。
在一个实施例中，本公开内容的单链和双链SAR靶向编码CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z和DNAM1基因中的一个或多个的内源基因座，以便SAR的抗原结合结构域插入编码CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z和DNAM1基因的信号肽下游并与信号肽符合读码框。
通过基因组工程iPSC的定向分化产生免疫细胞(包括T和NK细胞)的方法是本领域已知的，包括在WO2020117526、WO2020210398、WO2019126748、WO2019112899、WO2019018603和US10370452中，将其通过引用整体并入本文。
一方面，SAR的新抗原结合结构域结合优先或排他性在造血谱系细胞上表达的抗原。在造血谱系细胞上优先或专门表达的示例性抗原是CD19、CD20、CD22、BCM A、CS1、CD33、MPL、CD138、CD38和CD123。一方面，SAR的新抗原结合结构域结合优先或专门在非造血谱系细胞上表达的抗原。在非造血谱系细胞上优先或专门表达的示例性抗原是间皮素(MSLN)、Her2、EGFR、PSMA、PSCA、GPC3等。一方面，SAR表达两个或更多个新抗原结合结构域，其中至少一种新抗原结合结构域与优先或排他性地在造血谱系细胞上表达的抗原结合，并且至少一种新抗原结合结构域与在造血谱系细胞上表达的抗原结合。非造血谱系细胞。
本公开提供了SAR的两个或更多个AABD(例如，SVH、VHH、Centyrin等)可以通过接头例如肽接头连接。连接体还可以存在于包含Fv或TCR-Fv的vL和/或vH结构域与AABD之间。合适的接头，例如包含接头，包括GS残基，例如(Gly 4Ser)n，其中n＝1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。示例性的接头在SEQ ID NO(DN A)：1024-1028和SEQ ID NO(PRT)：3418-3422中提供。
接头还可以存在于包含SAR的Fv或TCR-Fv的vL和vH结构域与vL和vH结构域所附着的TCR恒定链连接肽之间。具体地，IgCL(SEQ ID NO(DNA)：1142和SEQ ID NO(PRT)：3536)和IgCH结构域(SEQ ID NO(DNA)：1143-1157和SEQ ID NO(PR T)：3537-3551)衍生自抗体，可作为vL/vH和信号链之间的有用接头。另外的类似Ig结构域是本领域已知的(例如SEQ IDNO(DNA)：1168-1175和SEQ ID NO(PRT)：3562-3569)并且可以充当本公开的替代实施例中的有用接头。
在一些实施方案中，包含SAR的抗原结合结构域的一个或多个AABD连接至信号链，而没有居间的vL/vH片段。在此类构建体中，接头也可以存在于SAR的AABD和AAB D所附着的信号链之间。在一个实施方案中，双链SAR的一个AABD连接至接头IgCL(SEQ ID NO：1142)并且另一个AABD连接至接头IgG1-CH1(SEQ ID NO：1143)。在一个实施方案中，双链SAR的一个AABD连接至接头IgCL(SEQ ID NO：1142)并且另一个AABD连接至接头IgG4-CHI1(SEQ IDNO：1152)。在一个实施方案中，双链SAR的一个AABD连接至接头TCRa-wt-opt-6ECD(SEQ IDNO：1158)，并且另一个AABD连接至接头TCRb-wt-opt-6ECD(SEQ ID NO：1160)。
例如，CD16A)的NH2末端或NH2末端附近(如本文所述的NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12等或其突变体或变体)共同构成结合特定抗原的可变片段(Fv)。
例如，CD16A)的NH2末端或NH2末端附近(如本文所述的NKp30、NKp44、NKp46、CD3z、DAP10、DAP12等或其突变体或变体)共同构成片段可变-TCR(TCR-Fv)，其结合与MHC分子相关的特定肽抗原。
例如，CD16A)的NH 2-末端或靠近NH 2-末端(如本文所述的NKp30、NK p44、NKp46、CD3z、DAP10、DAP12等或其突变体或变体)共同构成结合特定肽抗原/MH C或脂质抗原的可变片段-TCR(TCR-Fv)。
在一些实施方案中，SAR多肽具有表达为单链可变片段(scFv)的抗原结合结构域并且可操作地连接至信号链(例如，CD16A、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12等或其突变体或变体，如本文所述)。
在某些实施方案中，双链SAR的两条多肽链的AABD在结构上相似(例如，两条AABD都是SVH或骆驼科动物VHH结构域或affibodies或Centyrins)。在一个实施方案中，双链SAR的两条多肽链的AABD在结构上不相似(例如，第一抗原结合结构域是SV H，第二抗原结合结构域是骆驼科动物VHH)。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的抗原结合结构域由相应野生型序列或非野生型序列的密码子优化的核苷酸序列编码抗体、单结构域抗体(SDAB)、VH结构域、VL结构域、骆驼科动物VHH结构域或非免疫球蛋白支架，例如DARPIN、Aff ibodies、Affilins、Adnectin、Affitins、Obodies、repebodies、fynomer、alphab odies、avimer、atrimers、centyrins、pronectin、anticalins、kunitz结构域、犰狳重复蛋白、自身抗原，受体或配体。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO 2440至2676的轻链可变结构域(vL或VL)氨基酸序列中的任何一个或多个，其中多达20个氨基酸残基，但没有多于21个氨基酸被任何其它氨基酸残基、或与SEQ ID NO 2440至2676的氨基酸序列具有70-99.9％同一性的序列、或与互补决定区(CD R)具有70-100％同一性的序列替代SEQ ID NO:2440至2676的序列，或在10736至10972的三个互补性决定区中的每一个中具有最多3个氨基酸取代的序列。表3显示了靶抗原、名称、SEQ ID NO(DNA)、SEQID NO(PRT)，本公开中使用的示例性vL结构域的scFv的SEQ ID NO(PRT)。
在某些实施方案中，SAR多肽编码的一个或多个抗原结合结构域包括序列号为SEQID NO：2682-2918的任何一种或多种重链可变结构域(vH或VH)的氨基酸序列，其中最多20个氨基酸残基，但是不超过21个氨基酸被任何其它氨基酸残基或与SEQ ID NO 2682-2918的氨基酸序列具有70-99.9％同一性的序列替代。在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ ID NO:2682-2918的任何一种或多种重链可变结构域(vH或VH)氨基酸序列，其中最多20个氨基酸残基，但是不超过21个氨基酸被任何其它氨基酸残基、或与SEQ ID NO:2682-2918的氨基酸序列具有70-99.9％同一性的序列、或与互补决定区具有70-100％同一性的序列替代。SEQ ID NO：2682-2918的CDR)，或在SEQ ID NO：2682-2918的三个互补决定区的任一个中具有最多3个氨基酸取代的序列。表3显示了本公开中使用的示例性vH结构域的scFv的靶抗原、名称、SEQ ID NO(DNA)、SEQ ID NO(PRT)、SEQID NO(PRT)。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO:3253-3296的骆驼科单域抗体(vHH或VHH)氨基酸序列中的任何一种或多种，其中最多20个氨基酸残基，但是不超过21个氨基酸被任何其它氨基酸残基、或与SEQ ID NO 3253-3296的氨基酸序列具有70-99.9％同一性的序列、或在三个互补性中的任一个中具有最多3个氨基酸取代的序列替代SEQ 3253-3296的决定区(CDR)。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO:3366-3377的任何一种或多种非免疫球蛋白抗原结合支架氨基酸序列，其中多达20个氨基酸残基，但不超过21个氨基酸被任何其它氨基酸残基或与SEQ ID NO:3366-3377的氨基酸序列具有70-99％同一性的序列替代。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO 3378-3395的任何一种或多种受体氨基酸序列，其中多达20个氨基酸残基但不超过21个氨基酸被替换为任何其它氨基酸残基，或与SEQ ID NO:3378-3395的氨基酸序列具有70-99.9％同一性的序列。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO:3391的自身抗原氨基酸序列，其中多达19个氨基酸残基但不超过20个氨基酸被任何其它氨基酸残基替代。或与SEQ ID NO 3391的氨基酸序列具有70-100％同一性的序列。
在一些实施方案中，所编码的SAR分子的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO:3396-3406的任何一种或多种配体氨基酸序列，其中多达20个氨基酸残基但不超过21个氨基酸被取代由与SEQ ID NO:3396-3406的氨基酸序列具有70-100％同一性的任何其它氨基酸残基或序列构成。
在一些实施方案中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合结构域包含SEQ IDNO:2924-3160的scFv氨基酸序列中的任何一个或多个，其中多达40个氨基酸残基但不超过41个氨基酸被替换由任何其它氨基酸残基或与SEQ ID NO 2924-3160的氨基酸序列具有70-100％同一性的序列或在每个SEQ ID NO 2924的六个互补决定区(CDR)中具有70-100％同一性的序列构成-3160或在每个SEQ ID NO：2924-3160中的六个互补决定区(CDR)中具有最多3个取代的序列。
在一些实施方案中，SAR多肽所编码的的一个或多个抗原结合结构域包含靶向该抗原的vL和vH片段的任何一个或多个抗原结合部分，例如CDR，或者具有表3中列出的vL和vH片段的任何CDR中最多3个氨基酸替代的结构域。表3中列出的vL和vH片段的CDR1-3的序列可以通过本领域已知的方法确定。
在一些实施例中，所编码的SAR多肽的一个或多个抗原结合域包含靶向该抗原的vHH片段的任何一个或多个抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，SAR的抗原结合结构域是已知结合该靶抗原的受体的抗原结合部分。
在另一个实施例中，本公开提供了与本公开的任何SAR结合不同靶标上的相同表位的SAR(即，具有与本公开的任何SAR交叉竞争结合不同靶标的能力的SAR)。披露)。在一些实施方案中，这些SAR的抗原特异性结构域可以从用作SAR的组分的抗体的vL片段、vH片段和/或scFv片段来确定。在一些实施方案中，用于交叉竞争研究以确定被本公开的SAR识别的靶表位的参考抗体是本文描述的vL、vH、scFv、SVH、vHH、非免疫球蛋白抗原结合结构域。在示例性实施方案中，由SEQ ID NO:3027表示的参考scFv hu-mROO5-1可以用于交叉竞争研究以确定由本公开内容的基于hu-mROO5-1的SAR识别的靶表位。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定由所描述的本公开内容的SAR识别的靶标表位的参考AABD片段是本文描述的AABD片段。在一些实施方案中，用于交叉竞争研究以确定由本公开内容的SAR识别的靶表位的交叉竞争研究的参考非免疫球蛋白抗原结合支架是基于非免疫球蛋白抗原结合支架的AABD。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定由本公开的SAR识别的靶表位的参考配体是配体。
在本文所述的其它实施例中，本公开内容的双特异性SAR显示出大于30％(例如，大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％、99％等)的亲和力。对于每个靶抗原，与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达并在相似条件下进行比较时的亲和力进行比较。可以使用本领域已知的测定例如Topanga测定来测量结合亲和力。
在本文描述的其它实施例中，本公开内容的双特异性SAR显示超过30％
(例如，超过40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)信号传导。当在效应细胞中表达并在相似条件下进行比较时，将针对每个靶抗原表达细胞的活性与每个相应的单特异性SAR的信号传导活性进行比较。信号传导活性可以使用本领域已知的方法来测量，例如Jurkat-NFAT-GFP细胞测定。
在本文所述的其它实施方案中，本公开内容的双特异性SAR显示多于30％(例如，多于40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)的细胞因子与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达时的细胞因子产生相比，针对每个靶抗原表达细胞的细胞因子产生(例如，TNFα、IFNγ、IL-2等)并在相似条件下进行比较。细胞因子的产生(例如TNFα、IFNγ、IL-2等)可以使用本领域已知的方法例如ELISA来测量。
在本文描述的其它实施方案中，本公开内容的双特异性SAR表现出超过30％(例如，40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)的细胞毒性。当在效应细胞中表达并在相似条件下比较时，与每个相应的单特异性SAR的细胞毒活性相比，针对每个靶抗原表达细胞的活性。细胞毒性活性可以使用本领域已知的方法来测量，例如Matador或放射性铬释放测定法。
在本文所述的其他实施方案中，与在类似条件下在效应细胞中表达的相应单特异性SAR相比，本公开的双特异性SAR对于每个表达目标抗原的细胞显示出超过30％(例如40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％等)的体内活性。在一个实施方案中，使用免疫缺陷小鼠中的异种移植模型测量体内活性。
在本文描述的其它实施例中，本公开的多特异性SAR表现出大于30％(例如，大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％、99％等)与在效应细胞中表达并在相似条件下比较时每个相应单特异性SAR的亲和力相比，对每个靶抗原的亲和力。可以使用本领域已知的测定例如Topanga测定来测量结合亲和力。
在本文描述的其它实施例中，本公开的多特异性SAR表现出大于30％(例如，大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％、99％等)针对每个靶抗原表达细胞的信号传导活性与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达时的信号传导活性并在相似条件下进行比较。信号传导活性可以使用本领域已知的方法来测量，例如Jurkat-NF AT-GFP细胞测定。
在本文描述的其它实施例中，本公开的多特异性SAR显示出多于30％(例如，40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)，与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达时的细胞毒活性相比，并在相似条件下进行比较时，针对每个靶抗原表达细胞的细胞毒活性。细胞毒性活性可以使用本领域已知的方法来测量，例如Matador或放射性铬释放测定法。
在本文所述的其它实施方案中，本公开内容的多特异性SAR显示多于30％(例如，多于40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)的细胞因子与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达时的细胞因子产生相比，针对每个靶抗原表达细胞的细胞因子产生(例如，TNFα、IFNγ、IL-2等)并在相似条件下进行比较。细胞因子的产生(例如TNFα、IFNγ、IL-2等)可以使用本领域已知的方法例如ELISA来测量。
在本文描述的其它实施例中，本公开的多特异性SAR显示出多于30％(例如，40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、99％等)，与每个相应的单特异性SAR在效应细胞中表达时的体内活性相比，并在相似条件下进行比较，针对每个靶抗原表达细胞的体内活性。在一个实施方案中，使用免疫缺陷小鼠中的异种移植模型测量体内活性。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，双特异性SAR的Fv或TCR-Fv(即vL/vH、Vα/Vβ或Vγ/Vδ片段)包含的抗原结合结构域对其的结合亲和力同源抗原基本上不被连接至所述SAR的vL、vH、Vα、Vβ、Vγ或Vδ片段的N末端区域的一种或多种AABD减少。在一些实施方案中，SAR是单链SAR。在一些实施方案中，SAR是双链SAR。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，双特异性SAR的Fv或TCR-Fv(即，vL/vH、Vα/Vβ或Vγ/Vδ片段)包含的抗原结合结构域的抗原结合亲和力其关联抗原包含连接至所述SAR的vL、vH、Vα、Vβ、Vγ和/或Vδ片段的N末端区域或N末端附近的一个或多个AABD的至少70％，相应单特异性SAR的抗原结合结构域的抗原结合亲和力的80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中一个或多个AABD未附接至N-vL、vH、Vα、Vβ、Vγ或Vδ的末端区域或靠近N末端区域碎片。
在一些实施方案中，在所述第二条SAR链存在下，所述第一条SAR链的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％在不存在所述第二条SAR链与其同源抗原的情况下，所述第一条SAR链的抗原结合结构域与其同源抗原的98％或99％结合。
在一些实施方案中，在存在所述第二条SAR链(或CAR)的情况下，所述第一条SAR链的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是70％、80％、85％、90％、95％。在不存在所述SAR第二链(或CAR)与其同源抗原的情况下，所述第一条SAR链的抗原结合结构域与其同源抗原的96％、97％、98％或99％结合。
在一个实施方案中，VH结构域选自SEQ ID NO:3210-3252，与SEQ ID NO:3210-3252相比，其具有一处或多处氨基酸取代、缺失、插入或其它修饰，并且其保留了该结构域的生物学功能。单域抗体。
在另一个实施方案中，VH结构域选自SEQ ID NO.3210-3252之一，但包含一或多个氨基酸取代，例如1至20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一种实施方式中，一处或多处氨基酸取代位于一处或多处框架区域中。在另一实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代位于框架和CDR序列中。
本公开内容还包括本文所述的单域抗体的序列优化变体。
公开内容的SAR的结合结构域提供针对BCMA的双互补位靶向。因此，结合结构域包含结合BCMA的第一表位的第一AABD(例如，VH单域抗体)和结合BCMA的第二表位的AABD(例如，VH单域抗体)。第一和第二表位可以重叠。
公开内容的SAR的结合结构域提供针对CD22的双互补位靶向。因此，结合结构域包含结合CD22的第一表位的第一VH单结构域抗体和结合CD22的第二表位的第二VH单结构域抗体。第一和第二表位可以重叠。
公开内容的SAR的结合结构域提供针对CD38的双互补位靶向。因此，结合结构域包含结合CD38的第一表位的第一VH单结构域抗体和结合CD38的第二表位的第二VH单结构域抗体。第一和第二表位可以重叠。
公开内容的SAR的结合结构域提供针对CEA的双互补位靶向。因此，结合结构域包含结合CEA第一表位的第一VH单结构域抗体和结合CEA第二表位的第二VH单结构域抗体。第一和第二表位可以重叠。
公开内容的SAR的结合结构域提供针对PSMA的双互补位靶向。因此，结合结构域包含结合PSMA第一表位的第一VH单结构域抗体和结合PSMA第二表位的第二VH单结构域抗体。第一和第二表位可以重叠。
公开内容的SAR的结合结构域提供双特异性靶向。因此，结合结构域包含结合BCMA的VH单结构域抗体和靶向第二靶标的第二结合部分。第二结合部分可以是抗体片段，通常是VH单结构域抗体、centyrin、亲和体或vHH结构域。第二靶标可以选自CD19、CD20、CD22、BCMA、PSCA、CS1、GPC3、CSPG4、EGFR、5T4、L1 CAM、MUC16、ROR1、cKit、ROR1、间皮素、IL3Ra、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR或MAGE A3TCR、HER2、维尔姆氏肿瘤基因1(WT1)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16、MUC1、免疫检查点靶标或其组合。然而，技术人员将理解，其它肿瘤抗原也是本公开范围内的潜在组合靶标。在单链SAR的情况下，两个结合域可以以任一顺序存在。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合BCMA的AABD(例如，VH单结构域抗体或SVH、vHH或Centyrin等)和靶向CD38的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。表3中提供了示例性vL/vH片段及其靶抗原。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。表4中提供了示例性Va/Vb或Vg/Vd片段及其靶抗原。
在一个实施方案中，SAR的一个结合结构域包含结合BCMA的AABD(例如，VH单结构域抗体或SVH、vHH或Centyrin等)和靶向CD19的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。表3中提供了示例性vL/vH片段及其靶抗原。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。表4中提供了示例性Va/Vb或Vg/Vd片段及其靶抗原。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合BCMA的AABD(例如，VH单结构域抗体或SVH、vHH或Centyrin等)和靶向CD22的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。表3中提供了示例性vL/vH片段及其靶抗原。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv(或TCR-Fv)的Va/Vb或Vg/Vd片段。表4中提供了示例性Va/Vb或Vg/Vd片段及其靶抗原。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合BCMA的AABD(例如，VH单结构域抗体或SVH、vHH或Centyrin等)和靶向CD20的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合CD22的AABD和靶向CD20的第二结合部分。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合CD22的AABD和靶向CD19的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合CD19的AABD和靶向CD20的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。
CD19的AABD和靶向CD38的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合CD19的AABD和靶向CD123的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。
在一个实施方案中，SAR的第一结合结构域包含结合CD19的AABD和靶向BAFF-R的第二结合部分。在一个实施方案中，SAR进一步包含vL/vH片段，其结合形成靶向特定抗原的Fv。在一个实施方案中，SAR还包含组合形成靶向不同抗原的TCR-Fv的Va/Vb或Vg/Vd片段。
除了如上文详细描述的结合结构域之外，本公开内容的SAR还可包含一条或多条信号链或其片段和变体。示例性信号链和片段提供于SEQ ID NO(DNA):1349-1584和8541至8767(新链)以及SEQ ID NO(PRT):3743-3966、3385、3394、7818-7822、9633-9859中。本公开还提供了信号链的示例性组分，例如胞外结构域、胞外和跨膜结构域、跨膜结构域、铰链结构域(SEQ ID NO(DNA):1535-1549和SEQ ID NO(PRT):3929-3943)、胞质结构域(SEQ ID NO(DNA):1550-1564和SEQ ID NO(PRT):3944-3958)和共刺激结构域(SEQ ID NO(DNA):1565-1572和SEQ ID NO(PRT):3959-3966)。在示例性实施方案中，用于构建SAR的信号链和片段包含SEQ ID NO:3743-3966、3385、3394、7818-7822、9633-9859表示的多肽或具有至少60％、70％、与其具有80％或90％同源性或其功能变体或来自非人类物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基(即同源物)。应当理解，来自其它哺乳动物物种的信号链和片段可以用于本公开的方法中以制备本公开的SAR。此外，作为衍生自人和其它哺乳动物物种的信号链和片段的杂合体的信号链和片段可以在本公开的方法中使用以制备本公开的SAR。最后，本文中描述的信号链和片段的选择性剪接同种型可用于本公开的方法中以制备SAR。
本公开的SAR包含一个或多个跨膜结构域。本文使用的“跨膜结构域”
(TMD)是指SAR的区域，其穿过质膜并连接至内质信号传导结构域和抗原结合结构域，在后一种情况下任选地经由铰链结构域或连接肽。在一个实施例中，本公开内容的SAR的跨膜结构域是I型或II型跨膜蛋白的跨膜区，或人工疏水序列或其组合。在一种实施方式中，跨膜结构域包含衍生自CD16、CD64、CD32、KIR2DS4、CD3z、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DAP10、DAP12、CD28和CD8的跨膜结构域。其它跨膜结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施例结合使用。具体地，SEQ ID NO：3914-3928中所示的TMD序列在本公开的范围内。
公开的SAR进一步包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”、“细胞质结构域”或“胞内结构域”是将激活信号传递至T细胞并指导细胞执行其专门功能的结构域。具体地，在本公开的范围内的是SEQ ID NO：3944-3958中所示的细胞内信号传导结构域序列。
公开内容的SAR还包含一个或多个共刺激结构域以增强抗原特异性接合后的SAR-T细胞活性。单个SAR中可以包含多个共刺激结构域，以招募多个信号通路。具体地，在本公开的范围内的是具有SEQ ID NO：3959-3966的共刺激结构域序列。
发明的SAR还包含连接胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区或间隔区。该铰链或间隔区域可用于实现所得SAR的不同长度和灵活性。根据本公开可以使用的铰链区或间隔区的实例包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH 2区抗体的CH 3区、CD8A铰链结构域、CD28铰链结构域、CD16铰链结构域、NKp30铰链结构域、NKp44铰链结构域、NKp46铰链结构域和人工间隔序列，例如肽序列，或其组合。其它铰链或间隔区域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本公开的替代实施例结合使用。具体地，在本公开的范围内的是SEQ ID NO：3592-3598和3929-3943中所示的铰链序列。TCR连接肽(SEQ ID NO：3571-3579)也可以充当铰链结构域。
公开的SAR进一步包含连接SAR的不同结构域的“接头结构域”或“接头区域”。该结构域包括长度为约1至500个氨基酸的寡聚或多肽区域。合适的接头对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以与本公开的替代实施例结合使用。
公开的SAR进一步包含“前导序列”。在一个实施方案中，前导序列是CD8A结构域。具体地，具有SEQ ID NO：2425-2430的前导序列在本公开的范围内。
公开内容的SAR包括传递抑制信号的抗原结合结构域。
公开内容的SAR包括允许其结合可溶性多肽适配器或标签的适配器结合结构域。示例性适配器和适配器结合结构域提供于SEQ ID NO：3407-3435中。在示例性实施方案中，编码RZIP的SAR可以与含有靶向CD19的抗原结合结构域的编码EZIP多肽(SEQ ID NO：3409)联合使用以靶向表达CD19的细胞。类似地，编码SAR(例如，SEQ ID NO:5481)的NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF可以与编码ULBP2R的多肽(例如，CD8SP-BC MA-FHVH93-GS-ULBP2R，SEQ IDNO:5481)组合使用。在一个替代实施方案中，编码SA R(例如，SEQ ID NO:5482)的NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA可以与编码ULBP2-S3的多肽(例如，CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2R，SEQ ID NO：5132)组合使用以靶向BCMA。类似地，编码靶向Strepttag(SEQ ID NO:4970)或FITC(例如SEQ ID NO:4963-4964)的抗原结合结构域的SAR可以与Streptag标记的或FITC标记的抗体/抗体片段组合使用，以靶向后者结合的抗原。其它适配器是本领域已知的(例如，WO2019099440和Dia na Darowski等人，MABS，2019，VOL.11，NO.4，621-631)并且可以在本公开的替代实施例中使用。
SAR还可以包括标记，例如促进成像的标记，例如荧光标记或其它标记。例如，这可以用于对肿瘤结合进行成像的方法中。标记可以缀合至抗原结合结构域。
本文描述的SAR可以合成为单多肽链。在该实施方案中，抗原特异性靶向区域位于N末端，串联排列并由连接肽分隔。
另一方面，本公开提供了分离的SAR多肽分子，其包含一个或多个抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、配体或受体)，其结合本文所述的抗原，并且连接至一个或多个信号链。
在一些实施方案中，SAR可包含单个多肽或由其组成，所述单个多肽含有连接至单个信号链(1类)的NH 2末端的单个抗原结合结构域。
在一些实施方案中，SAR包含组装以产生功能性SAR(2类)的两个多肽或由其组成。这种双链2类SAR的每个多肽含有信号链并含有(如在2A类中)或不含有(如在2B类中)一个或多个抗原结合结构域。在2A类SAR中，每个抗原结合结构域都连接到单独信号链的N末端。例如，抗原结合结构域1(例如抗体的vL片段)连接到一条DAP10链以构成功能性多肽单元1，并且抗原结合结构域2(抗体的vH片段)连接到第二条DAP10链以构成功能性多肽单元1。多肽单元2。这种SAR的两个功能性多肽单元在同一细胞中共表达并相互配对而具有功能活性。应当注意的是，每个抗原结合结构域又可以是双特异性或多特异性的，从而允许2类SAR靶向超过2种抗原。
在一些实施方案中，2类SAR的两个功能性多肽单元使用不同的载体在细胞中共表达。在一些实施方案中，使用单个载体在细胞中共表达2类SAR的两个功能性多肽单元，该载体采用两个单独的调控元件(例如启动子)来编码编码2类SAR的两个功能性多肽单元的两个多核苷酸。本公开提供可用于表达第二多肽单元或第三附加模块的小启动子是EFS启动子、EFS2启动子或RSV启动子。在一些实施方案中，使用单个载体在细胞中共表达2类SAR的两个功能性多肽单元，所述单个载体采用单个启动子来表达含有IRES序列的多核苷酸，所述IRES序列将编码SAR的两个多肽的核苷酸片段分开。在一些实施方案中，使用单个载体在细胞中共表达2类SAR的两个功能性多肽单元，所述单个载体采用单个启动子来表达编码含有可裂解接头(例如，F2A、T2A、E2A、P2A等)。由此产生的mRNA编码单个多肽，随后生成SAR的两个功能性多肽单元。在一些实施例中，2类SAR的两个功能性多肽单元使用编码两个功能性多肽单元的单个mRNA序列的转染来共表达，而在其它实施例中，通过两个不同的mRNA序列的转染来共表达两个功能性多肽单元。每个编码一个功能性多肽单元。在一些实施方案中，编码SAR的载体或mRNA可以编码额外的基因/蛋白质(治疗对照、抑制分子、辅助模块等)，其可以通过IRES或使用单独的启动子表达的可裂解接头与SAR编码序列分开。例如，EFS、EFS2或RSV启动子)或其组合。在另一个实施方案中，治疗对照或辅助模块或两者可以在使用单独的载体或mRNA表达SAR的细胞中表达。应当理解，治疗控制器或辅助模块对于SAR的功能来说不是必需的，并且可以在没有治疗控制器或辅助模块的情况下使用实施例的任何SAR。例如，抗生素抗性盒，例如PAC(嘌呤霉素抗性基因)，可以从本公开的SAR编码载体中去除，而不损害SAR的功能。
还提供了本文所述的SAR的功能变体，其与亲本SAR具有实质性或显著的序列同一性或相似性，该功能变体保留了其作为变体的SAR的生物活性。功能变体涵盖例如本文所述的SAR(亲本SAR)的那些变体，其保留了与亲本SAR相似程度、相同程度或更高程度识别靶细胞的能力。就亲本SAR而言，功能变体可以是例如至少约30％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、氨基酸序列与亲本SAR具有约9
3％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多同一性。
功能变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本SAR的氨基酸序列。另外，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本SAR的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸取代通常不会干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本CAR相比增加。
SAR(包括功能部分和功能变体)可以具有任何长度，即，可以包含任何数量的氨基酸，条件是SAR(或其功能部分或功能变体)保留其生物活性，例如特异性地例如，SAR可以是约300至约5000个氨基酸长，例如300、400、500、600、700、长度为800、900、1000或更多个氨基酸。
另一方面，本公开内容涉及分离的核酸构建体，其包含至少一种编码如上定义的SAR的核酸。在一个实施方案中，核酸编码靶向表B中列出的靶标之一的蛋白质。
与本文所述的任何SAR多肽具有至少60％、70％、80％或90％同源性的序列也在本公开的范围内。由于SAR在设计上是模块化的，因此可以通过用不同的模块替换本文描述的SAR的一个或多个模块来生成额外的SAR。例如，SAR的抗原结合结构域(即，vL、vH、scFv、vHH、FHVH、centyrin等)可以被靶向其它抗原的抗原结合结构域替代。
本文所用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、或DNA或RNA的组合。RNA包括体外转录的RNA或合成的RNA；编码如本文所述的SAR多肽的mRNA序列)。核酸还可包含自杀基因。构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式。
在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如转录本文所述的核酸分子的RNA的载体。表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且在(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约，2013年)中描述。已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，使用逆转录病毒，例如腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。这在示例中得到了证明。本公开还涉及包含上述SAR的病毒。
本公开内容还包括可直接转染至细胞中的RNA构建体。产生用于转染的mR NA的方法涉及用专门设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)的构建体(例如，此处描述的3'和/或5'UT R)、5'帽(例如，本文中描述的5'帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文中描述的IRES)、核酸被表达，并且多聚A尾，通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO：13-16)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施例中，模板包括SAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA SAR载体转导至细胞，例如T细胞、NK细胞或iPSC中。在另一个实施方案中，通过使用微流体装置在细胞膜中引起瞬时扰动，将RNA SAR载体转导至细胞，例如T细胞或NK细胞中。还可以使用一种或多于一种载体、不同载体或技术的组合将SAR的不同链(或功能性多肽单元)引入细胞中。
在另一个实施方案中，可以使用逆转录病毒载体引入SAR的一个链或功能性多肽单元，而使用慢病毒载体引入另一个功能性多肽单元。在另一个方面，使用慢病毒载体引入一个功能性多肽单元，而使用睡美人转座子引入另一个功能性多肽单元。在又一个方面，使用慢病毒载体引入一个功能性多肽单元，而使用RNA转染引入另一个功能性多肽单元。在又一个方面，通过使用本领域已知的基因靶向技术在内源TCR链基因座处进行遗传重组来在细胞中产生一个功能性多肽单元，同时使用慢病毒或逆转录病毒载体引入其它功能性多肽单元。
可以使用多种不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞中，例如商业上可获得的方法，包括但不限于电穿孔、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装、肽介导的转染或基因枪颗粒递送系统例如“基因枪”(参见，例如，Nishikaw a，et al.Hum GeneTher.，12(8):861-70(2001))或通过使用微流体装置在细胞膜中引起瞬时扰动(参见专利申请WO 2013/059343 A1和PCT/US2012/060646)。
在一些实施方案中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。
在一些实施方案中，通过使用使用SBTS的基因插入和使用核酸酶的基因编辑的组合来产生表达本文所述的SAR的细胞，例如T、NK、NKT、干细胞或iPSC或合成T细胞(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程大范围核酸酶重新设计的归巢核酸内切酶。
在一些实施方案中，使用非病毒递送方法允许对细胞例如T、NK、NKT、干细胞或iPSC或合成T细胞进行重新编程，并且将这些细胞直接输注至受试者中。
另一方面，本公开内容还涉及包含一种或多种如上所述的核酸构建体的分离的细胞或细胞群。因此，细胞已被遗传修饰以表达本公开内容的SAR核酸构建体。因此，本公开提供了包含并稳定表达本公开的SAR核酸构建体的基因工程细胞。在一个实施方案中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、造血干细胞和/或或多能胚胎/诱导干细胞。可以从患者分离T细胞用于用本公开内容的SAR核酸构建体转染。
公开内容的核酸转染细胞离体。多种方法产生表达本公开内容的SAR的稳定转染子。在一个实施方案中，稳定转染和重新定向细胞的方法是通过使用裸DNA进行电穿孔。使用本公开的编码SAR的裸露DNA对细胞进行基因工程改造的其它方法包括但不限于化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(例如，电穿孔)、光学转化、基因电转移和/或流体动力递送)和/或基于粒子的方法(例如，刺穿、使用基因枪和/或磁转染)。证明存在整合的未重排载体和SAR表达的转染细胞可以离体扩增。病毒转导方法还可用于产生表达本公开内容的SAR的重定向细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的载体还可包含启动子。启动子的非限制性实例包括例如EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、MNDU3启动子、泛素C启动子、核心启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，启动子是EF-1启动子。在进一步的实施方案中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，载体是RNA核酸。在一些实施方案中，载体包含聚(A)尾。
另一方面，本公开提供了制备细胞(例如，免疫效应细胞或其群体)的方法，包括引入(例如，转导)细胞，例如T、NK、NK细胞系、巨噬细胞、NKT、干细胞。细胞、iPSC或本文所述的合成T细胞，以及包含编码SAR(例如本文所述的SAR)的核酸的载体；或编码SAR分子例如本文描述的SAR的核酸。
细胞可以是免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞或NKT细胞，或其组合)或可以产生免疫效应细胞或合成T细胞的干/祖细胞。在一些实施方案中，细胞是永生化细胞系，例如NK92、NK92MI或其衍生物。在一些实施方案中，方法中的细胞缺乏内源T细胞受体α、β1、β2、前TCRα、γ或δ或其组合的恒定链。在一些实施方案中，该方法中的细胞缺乏HLA抗原。在一些实施方案中，方法中的细胞缺乏β2微球蛋白。在一些实施方案中，方法中的细胞缺乏SAR靶抗原的表达。例如，如果SAR针对CD5，则表达SAR的T细胞缺乏内源性CD5，或者如果SAR针对TCR-β1恒定链，则表达T细胞缺乏TCR-β1恒定链，或者缺乏TCR-β2恒定链如果SAR是针对TC R-beta2的，或者如果SAR是针对CS1的，则CS1存在缺陷。
在一些实施方案中，引入编码SAR的核酸分子包括转导包含编码SAR的核酸分子的载体，或转染编码SAR的核酸分子，其中所述核酸分子是体外转录的RN A。在一些实施方案中，编码SAR的两种或更多种组分的核酸分子通过用多于一种载体转导细胞或用编码SAR的不同亚基的两种或更多种核酸分子转染来引入。例如，可以用两个单独的载体转导细胞，每个载体编码SAR的两个功能性多肽单元之一。类似地，可以用两个单独的体外转录的RNA转导细胞，每个RNA编码SAR的两个功能性多肽单元之一。除了SAR的功能性多肽单元之外，每个RNA可以携带不同的选择标记或报道分子(例如，tEGFR、tBCMA、或CD34或CNB30或突变体DHFR)，其可用于选择用两种RNA转导的细胞。RNA从而表达SAR的两个功能性多肽单元。
在一个实施方案中，可以使用内源基因的调控元件来表达本公开内容的SAR。在一个实施方案中，编码SAR的一个或多个异源抗原结合结构域的表达盒靶向天然存在的信号传导受体或信号传导适配器的遗传位点。在一个实施方案中，SAR的一个或多个异源抗原结合结构域与编码天然受体或信号传导适配器的全部或部分胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域的mRNA融合转录。在一个实施方案中，SAR的一个或多个异源抗原结合结构域与编码天然受体或信号传导适配器的铰链结构域和胞质结构域的mRNA融合转录。在一个实施方案中，SAR的一个或多个异源抗原结合结构域与编码天然受体或信号传导适配器的跨膜结构域和胞质结构域的mRNA融合转录。在一个实施方案中，SAR在天然存在的受体或信号传导适配器的启动子和转录调控元件下表达。在一个实施方案中，SAR靶向内源性基因座导致天然存在的受体或信号传导适配器表达的破坏。
将基因靶向任何特定遗传位点的方法是本领域已知的。在一个实施例中，该方法涉及使用CRISP/Cas9或Zn指核酸酶或TAL EN。在一个实施方案中，SAR表达盒靶向选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG 2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1和CD161的天然受体的遗传位点。在一个实施方案中，SAR表达盒靶向CD3、FcRγ、DAP10或DAP12的遗传位点。在一个实施方案中，SAR表达盒靶向TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT的遗传位点或染色体6p21区域中的任何基因。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：a)提供免疫效应细胞群(例如，T细胞或NK细胞)；b)从群体中去除调节性T细胞，从而提供调节性T细胞耗尽的群体；其中步骤a)和b)在将编码SAR的核酸引入群体之前进行。
在一个实施方案中，细胞是人T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，细胞是狗细胞。
在一个实施方案中，细胞是T细胞并且T细胞缺乏一种或多种内源T细胞受体链。根据本公开内容，稳定缺乏功能性TCR表达的T细胞可以使用多种方法来产生，例如使用Zn指核酸酶(ZFN)、CRISP/Cas9和靶向内源T细胞受体链的shRNA。
缺乏功能性内源TCR的AT细胞可以被工程化，使得其在其表面上不表达任何功能性内源TCR，被工程化使得其不表达一个或多个亚基(例如，内源TCRα、TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδ或pre-TCRα的恒定链)，其包含功能性内源TCR或经过改造，使其在其表面产生非常少的功能性内源TCR。或者，T细胞可表达显著受损的内源TCR，例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。本文所用的术语“显著受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引起不良免疫反应。
本公开提供了基于新链(例如NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、CD3z、NKG 2D和CD16等)的SAR，其不仅在NK细胞中表达并显示信号传导活性，而且还可以在T细胞中表达并显示信号传导活性。细胞和其它免疫谱系，包括单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。本公开内容提供了非T细胞TCR样结合特性(即结合肽/MHC复合物的能力)的通用方法。因此，本公开提供了具有TCR样结合特性的非T细胞。在该实施例中，本公开提供了通过表达本公开的SAR，非T细胞的细胞可以被赋予TCR样结合特性，其中SAR是包含TCR可变结构域但缺少TCR模块的uTCR-SAR。在该实施例中，本公开提供了一种简单的一步方法，其赋予任何细胞TCR样结合特性，而不需要多次遗传操作。在一个实施方案中，该方法涉及细胞中uTCR-SAR的异位表达，并且不需要多个CD3亚基的异位表达和高表达克隆的选择所需的额外步骤和时间消耗。因此，该方法适合于向任何细胞赋予类T细胞结合和信号传导，包括原代细胞，例如原代NK细胞、造血干细胞或iPSC。该方法还可以用于赋予永生化细胞系例如NK细胞系(例如NK92、NK92MI、NKG和YTS细胞系)。
由于本公开的SAR(例如，uTCR-SAR、CD16-SAR等)可以在任何细胞中表达，包括非T细胞，因此本公开的方法相对于其它下一代CAR平台具有明显的优势，例如如SIR、AbTCR等，它们依赖于通过生理T细胞受体复合物发出的信号。本公开提供了在多个组织和谱系中有活性的启动子(例如，EF1α、MNDU3、泛素等)下表达的SAR。本公开提供了本公开的SAR可以在干细胞(例如，造血干细胞或iPSC)中表达，并且干细胞的分化将导致SAR在多个谱系中的功能性表达，包括NK、T、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、B细胞、粒细胞和树突状细胞，从而对SAR靶向的抗原产生强烈的免疫反应。在一个实施方案中，SAR在体内的造血干细胞中表达，并且在体内分化成不同的血系。在本公开的替代实施例中，SAR在体外在干细胞(例如iPSC)中表达并且分化成不同的血统在体外发生。然后将体外分化和扩增的多个谱系的血细胞施用于受试者。
在某些实施方案中，本公开提供了来自以下群体中的非T细胞，包括原始细胞(例如，原代NK细胞、g-NK细胞、CIK、记忆样NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、B细胞、粒细胞等)、细胞系、造血干细胞、iPSC细胞、HLA缺陷型iPSC细胞、HLA缺陷型NK细胞、HLA缺陷型NK细胞系等，具有类TCR的结合性质和/或信号传导活性。
鉴于上述，本申请提供了包含至少一种SAR的iPSC、iPS细胞系细胞、或来自其的衍生细胞，其中衍生细胞是从包含SAR的iPSC的分化获得的功能性效应细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是造血细胞，包括但不限于具有永久造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中，功能性衍生造血细胞包括效应细胞例如T、NK和调节细胞。
在另一实施方案中，iPSC或其衍生细胞包括SAR，还包括外源性细胞因子和/或细胞因子受体，包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的至少一种。
另外提供的是至少包含SAR表达的iPSC、iPS细胞系细胞、或来自其的衍生细胞，还可以包含编码至少一种外源细胞因子和/或其受体(IL)的多核苷酸，以使得细胞因子信号传导能够促进细胞活化、存活、持久性和/或扩增，其中iPSC系能够定向分化以产生具有改善的活化、存活、持久性、扩增和效应细胞功能的功能性衍生造血细胞。外源引入的细胞因子信号传导包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的任一种、或两种或多种的信号传导。在一些实施方案中，细胞因子信号转导被组成型激活。在一些实施方案中，细胞因子信号转导的激活是可诱导的。在一些实施方案中，细胞因子信号转导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施方案中，细胞表面细胞因子/细胞因子受体的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、附加体、小环或包括mRNA的RNA。在一些实施方案中，SAR过表达的iPSC或其衍生细胞中包含的外源细胞表面细胞因子和/或受体能够实现IL7、IL10、IL15、IL18或IL21信号传导。在一些实施方案中，细胞因子是膜锚定形式的IL2、IL15、IL7等。编码膜锚定形式的hIL2的示例性构建体由SEQ ID NO:1330表示。在一些实施方案中，细胞因子是多用途开关的一部分。
还提供了iPSC、修饰的HLA缺陷型iPCS、iPS细胞系细胞、或来自其的衍生细胞，其包含SAR和过表达的NKG2C、CD94、DAP12、DAP10、BiKE、TriKE、hnCD16、CAR、IL、B2M敲除和/或CITA敲除；和任选地，编码HLA-G的多核苷酸，其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。在iPSC及其衍生NK或T细胞的一个实施方案中，细胞除其它基因组编辑外还包含B2M-/-CIITA-/-，并且HLA-I和HLA-II均缺陷，其中iPSC及其衍生效应子细胞具有改善的持久性和/或存活率。在一些实施方案中，效应细胞具有增加的体内持久性和/或存活率。
因此，本文提供的包括包含SAR、外源细胞因子/受体、B2M敲除和CIITA敲除的iPSC；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G的多核苷酸，并且其中iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。本申请还包括功能性iPSC衍生造血细胞，其包含过表达的SAR、外源细胞因子/受体、B2M敲除和CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G的多核苷酸，并且其中衍生造血细胞包括但不限于具有永久造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。
在包含所述一种或多种包含SAR的外源多核苷酸的细胞或细胞群的一个实施方案中，所述细胞进一步包含以下的一种或多种：(i)BiKE或TriKE；(ii)B2M无效或较低；(iii)CIITA为零或较低；(iv)引入HLA-G或不可切割的HLA-G的表达；(v)嵌合抗原受体(CAR)；(vi)细胞表面表达的外源细胞因子或其受体的部分或全部肽；(vii)编码多用途开关的辅助模块；(viii)至少在以下基因之一中删除或降低表达，B2M、TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIIT A、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT或染色体6p21区域中的任何基因；(ix)在HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、DA P10、DAP12、CD4、CD8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、接合器或用于与双特异性或多特异性或通用接合器偶联的表面触发受体中的至少一种中引入或增加表达。
在uTCR-SAR的替代方法中，本公开还提供了在SIR、AbTCR、cTCR和其它类似平台上表达SAR的方法，这些平台依赖于在非T细胞中表达的内源TCR信号传导，例如NK细胞或NK细胞系。在一个实施方案中，细胞是免疫细胞(例如NK、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、NK92细胞系等)或干细胞(例如iPSC)，并且免疫细胞或干细胞被工程化以异位表达一种CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ中的一个或多个或其变体。在一个实施方案中，细胞是免疫细胞或干细胞(例如，iPSC)，并且免疫细胞(例如，NK、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等)或干细胞(例如，iPSC)被工程化以异位表达一种或多种CD3ε、CD3γ和CD3δ或其变体。在一个实施方案中，被工程改造以异位表达CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ的细胞也表达本公开的一种或多种SA R。在一个实施方案中，本公开内容的SAR包含一个或多个TCR恒定链或其片段(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ等的恒定链)。包含一个或多个TCR恒定链或片段的示例性SAR包括SIR(SEQ ID NO:2305)、cTCR、Ab-TCR(SEQ ID NO:2309和2310)、STAR、HIT、TFP以及TFPαβ和TFPγδ。在一个实施方案中，细胞中CD3ε、CD3γ、CD3δ和/或CD3δ的表达促进包含一个或多个TCR恒定链或片段的SAR的功能性表达。
在一个实施方案中，细胞是干细胞并且干细胞缺乏一种或多种内源T细胞受体链。在另一个实施方案中，细胞是干细胞，其中SAR的一种或多种靶抗原(例如，MPL、CD33、CD123、CD19等)已被删除或突变成不再被SAR识别的形式。例如，靶向CD19的SAR在使用CRISP/Cas9或锌指核酸酶使其缺乏CD19的干细胞中表达，因此由此类干细胞产生的B细胞不会被表达CD19靶向的T细胞消除特别行政区。或者，可以使用CRISP/Cas9或锌指核酸酶将内源性CD19突变成不被SAR靶向的形式，然后在干细胞中表达针对CD19的SAR，以使由这些干细胞产生的B细胞不会被表达CD19靶向SAR的T细胞消除。在另一实施方案中，SAR被表达在免疫效应细胞中，并且来自自体或同种异体供体的干细胞经基因工程处理，要么缺乏SAR靶向抗原的表达，要么表达一个不被SAR识别的突变形式的SAR。例如，靶向CD19的SAR在T细胞中表达，这些T细胞与自体或同种异体造血干细胞一起输注到患者体内，这些干细胞使用CRISP/Cas9或锌指核酸酶使其缺乏CD19，以便由此类干细胞产生的B细胞表达CD19靶向SAR的T细胞不会消除细胞。或者，靶向CD19的SAR在T细胞中表达，这些T细胞与自体或同种异体造血干细胞一起输注到患者体内，其中内源性CD19已使用CRISP/Cas9或Zn指核酸酶突变为SAR不靶向的形式这样，由此类干细胞产生的B细胞就不会被表达CD19靶向SAR的T细胞消除。类似的方法可用于在接受靶向这些抗原的SAR-T细胞进行治疗的受试者中使用shRNA、CRISP/Cas9或Zn指核酸酶来突变或消除干细胞中的其它内源抗原(例如MPL、CD33、CD123等)这些抗原在疾病相关或致病细胞上表达的特定疾病。
免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞等)或干细胞可以从受试者获得。本文所用的术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞等)可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自人体的组织感染部位、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一个实施方案中，免疫细胞获自已施用动员剂例如CXCR4拮抗剂(例如Plerixaf or)的受试者。免疫细胞可以是组织驻留的γ-δT细胞，可以在表达SAR之前在体外培养和扩增。
免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞等)可以通过干细胞的体外分化获得。在一个实施方案中，免疫细胞通过iPSC的体外分化获得。
用于表达SAR的免疫细胞可以是自体或同种异体免疫细胞。
公开内容的SAR(包括uTCR-SAR)的细胞用于治疗疾病。
本公开涉及用于预防和/或治疗疾病例如癌症的方法，包括向受试者施用包含本文所述的SAR的细胞或细胞群，所述方法包括向有需要的受试者施用、本公开内容的细胞和/或药物组合物的药学活性量。
本公开还涉及用于治疗的SAR、包含如本文所述的SAR的细胞或细胞群。本公开还涉及用于治疗癌症的本文所述的SAR或包含SAR的细胞。本公开还涉及本文所述的SAR或包含SAR的细胞在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
另一方面，本公开涉及用于刺激受试者中针对靶细胞群体或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的表达SAR的细胞或细胞群体本公开的内容，其中选择抗原结合结构域以特异性识别靶细胞群体或组织。
另一方面，本公开涉及在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，该方法包括向哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达本公开的SAR的细胞或细胞群，从而提供受试者的抗肿瘤免疫力。
另一方面，本公开涉及用于产生遗传修饰的细胞或细胞群的方法，包括在所述细胞或细胞群中表达本公开的SAR核酸构建体。该方法可以包括将本文所述的核酸(例如，体外转录的RNA或合成RNA；编码本文所述的SAR多肽的mRNA序列)引入细胞中。在实施方案中，RNA瞬时表达SAR多肽。在一个实施方案中，细胞是本文所述的细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞，或细胞群)。通过此类方法产生的细胞也在本公开的范围内。
另一方面，本公开涉及用于产生用于适应性免疫疗法的细胞群的离体方法，包括用本公开的SAR转化所述细胞。
在本公开的某些方面，可以使用本领域技术人员已知的多种技术，例如Ficoll TM分离，从从受试者收集的血液单位中获得免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。一方面，从受试者收集细胞，其中T和/或NK细胞已通过施用试剂而动员。在一些实施方案中，从已施用CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福)、细胞因子(例如G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim)、β2激动剂(例如在收集免疫细胞之前，单独或组合使用肾上腺素、酪氨酸激酶抑制剂(例如达沙替尼)、化疗药物(例如环磷酰胺、阿霉素等)。在一些实施方案中，供体是自体供体，而在其它实施方案中，供体是同种异体供体。
单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。一方面，可洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆部分，并且任选地将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一种实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可以缺乏镁或者可以缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。
在另一个实施方案中，本文所述的表达SAR的效应细胞还可表达增强表达SAR的细胞的活性的试剂。在一些实施方案中，该试剂是一种抑制抑制分子的试剂。抑制分子的非限制性实例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制分子的试剂包含结合抑制分子的第一多肽，例如scFv或VHH或受体或配体片段，其与向细胞提供阳性信号的第二多肽结合，例如细胞内信号传导结构域，例如41BB、CD27、0X40、CD28、Dap10、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合和/或主要信号传导结构域(例如，CD3zeta信号传导结构域)。在一个实施方案中，抑制抑制分子的试剂包含与本文所述的信号链(例如CD16、NKp30、NKp44、NKp46等)。
在另一个实施方案中，本文所述的SAR表达细胞还可以表达辅助模块，例如调节SAR表达细胞活性的试剂。SEQ ID NO：3702-3725中提供了一些包含可以增强或调节SAR表达细胞活性试剂的附属模块的例子。例如，在一个实施方案中，所述试剂可以是增加CD3δ、CD3δ、CD3ε、CD3γ或其组合的表达和/或活性的试剂。在另一个实施方案中，试剂可以是向SAR表达细胞提供共刺激信号的试剂(例如，vFLIP K13、vFLIP MC159、cFLIP-L、cFLIP-p22、HTLV1 Tax、HTLV2 Tax、41BB或CD28)。在另一个实施方案中，所述试剂可以是以诱导方式向SAR表达细胞提供共刺激信号的试剂(例如，FKBPx2-K13、Myr-MYD88-CD40-Fv'-Fv等)。在另一个实施方案中，所述试剂可以是促进SAR表达细胞的增殖或持续存在的细胞因子或趋化因子(例如CD40L、IL2、IL-7、IL-15、IL12f或IL-21)。在示例性实施方案中，试剂是膜锚定形式的人IL2(SEQ ID NO(DNA)：1330和SEQ ID NO(PRT)：3724)。
本公开还提供了一种用作“多用途开关”的治疗控制/辅助模块。在示例性实施方案中，当在细胞中异位表达时，多用途开关充当用于过继细胞治疗目的的生死开关。在一个实施方案中，多用途开关包括包含受体结合结构域的第一模块与用作终止开关的第二模块和用作膜锚定模块的第三模块的框内融合。在一个实施方案中，第一模块与细胞表面表达的受体结合，即，其与受体的胞外结构域结合。在一个实施方案中，第一模块与受体结合，该受体在结合时将促存活和/或增殖信号传递至细胞。在一个实施方案中，第一模块以顺式结合受体(即，结合在与表达分子开关的细胞相同的细胞上表达的受体)。在一个实施方案中，第一模块反式结合受体(即，结合在除表达分子开关的细胞之外的细胞上表达的受体)。在一个实施方案中，第一模块以顺式和反式结合受体。在一个实施方案中，第二和第三模块衍生自相同的内源蛋白质。在一个实施例中，第二和第三模块衍生自不同的内源蛋白质。在一个实施方案中，第二模块包含内源蛋白质或其片段的胞外结构域。在一个实施方案中，第二模块可用于诱导表达分子开关的细胞死亡。在一个实施方案中，第二模块可用于在与试剂结合时诱导表达分子开关的细胞死亡。在示例性实施方案中，当与第二模块结合时诱导表达分子开关的细胞死亡的试剂是抗体、单域抗体、非免疫球蛋白抗原结合域、抗体药物缀合物、双特异性抗体或片段其中。在一个实施方案中，第二模块可用于选择性富集或耗尽表达分子开关的细胞。在一个实施例中，第二模块可用于选择性地检测、富集和/或耗尽当被试剂结合时表达分子开关的细胞。在示例性实施方案中，当与第二模块结合时，可用于选择性检测、富集和/或消除表达分子开关的细胞的试剂是抗体、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域或其片段。在一个实施方案中，分子开关用于选择性地离体检测、富集和/或耗尽细胞。在一个实施方案中，分子开关用于选择性地消耗体内细胞。在一个实施方案中，用于检测、消除或富集表达分子开关的细胞的试剂(即，抗体、抗体药物缀合物、双特异性抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域或其片段)已被批准用于人类。由FDA管理。已被FDA批准用于人类施用的示例性药剂是本领域已知的，并且包括但不限于利妥昔单抗、赫赛汀、Erbitrux、adcet ris、Enbrel等。在一个实施方案中，用于检测、消耗或表达分子开关的富集细胞已获得FDA批准用于体外临床使用。示例性的此类试剂是针对CD34的抗体，其已被FDA批准与临床批准的CliniMACS CD34系统(Miltenyi)结合使用。示例性多用途开关是Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter(SEQ ID NO(DNA):7152和SEQ ID NO(PRT):7843)并且包含框内融合至胞外域的IL2的IL2受体结合域和BCMA的跨膜结构域。当这种多用途开关在免疫细胞(例如T细胞或NK细胞等)中表达时，通过包含IL2的N端模块与IL 2受体结合，为免疫细胞提供生存信号。该多用途开关的第二个模块包含BCMA的胞外结构域，其被BCMA结合剂(例如BCMA抗体)识别并且可用于检测、选择性去除和/或富集转基因(例如SAR)表达细胞。包含第二模块的BCMA的胞外结构域还可用于通过使用BC MA靶向剂(例如靶向BCMA的抗体或抗体药物缀合物)选择性自杀表达转基因(例如SA R)的细胞。该分子开关中的第三个模块由BCMA的铰链和/或跨膜结构域组成，用于将开关锚定到细胞膜上。在一个实施方案中，第二模块是包含表位或模拟表位的一个或多个拷贝的合成模块。在一个实施方案中，表位存在于内源蛋白质的胞外结构域中。在一个实施方案中，模拟表位模拟存在于内源蛋白质的胞外结构域中的表位。包含一个或多个拷贝的表位或模拟表位的示例性合成模块是RQR8，该模块含有CD34表位和两个CD20模拟表位。RQR8模块允许选择经过临床批准的CliniMACSCD34系统(Miltenyi)。此外，该构建体结合广泛使用的药物抗体利妥昔单抗，导致转基因表达细胞的选择性删除。另外的示例性多用途分子开关包括包含IL2或其变体和tBCMA(SEQID NO(DNA):7151-7155)、IL15或其变体和tBCMA(SEQ ID NO(DNA):7156-7157)、IL2的融合蛋白。及其变体和tHer2、IL2及其变体和tEGFR、IL2及其RQR8等。由于多用途开关在格式上是模块化的，所以可以用不同的模块替换一个模块。因此，IL2模块可以被不同的细胞因子(例如，IL15、IL18、IL21等)替代。这些多用途蛋白通过其细胞因子部分(例如，IL2、IL15、IL18、IL21等)提供促生存信号，但是可以通过使用与第二模块(例如，RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19等)结合的试剂(例如，抗体)来杀死细胞，从而充当自杀基因，允许在面对毒性时选择性删除所施用的T细胞。第二模块(例如，RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19等)也可以用作测量转导的标记并允许选择转导的细胞。
在另一个实施方案中，药剂可以是抑制抑制分子的药剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如PD1可以降低SAR表达细胞发起免疫效应反应的能力。在另一个实施方案中，该试剂可以是靶向PD1或CTLA4的scFV。在一个实施方案中，所述试剂包含第一多肽，例如抑制性分子的第一多肽，例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR 1、CD160、2B4或TGFRβ，或任何这些的片段(例如，任何这些的胞外结构域的至少一部分)，以及作为所述胞内信号传导结构域的第二多肽。本文所述的试剂(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3zeta信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述试剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)，以及本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或CD3zeta信号传导结构域)。
在一个实施方案中，本文所述的表达SAR的效应细胞还可包含第二SAR，其可包含针对相同或不同靶标的不同抗原结合结构域。在一些实施例中，第二SAR可以针对与第一SAR相同或不同的细胞类型。
在一个实施方案中，本文所述的表达SAR的效应细胞还可包含具有相同或不同抗原结合结构域、任选地相同或不同靶标的第二SAR。在一些实施例中，第二SAR可以针对与第一SAR相同或不同的细胞类型。两个SAR可以具有相同的主干或不同的主干。在示例性实施例中，两个SAR可以具有CD16 SAR的主干。在另一示例性实施例中，一个SAR可以具有SIR的主干，而第二SAR可以具有CD16SAR的主干。在另一示例性实施例中，一个SAR可具有Ab-TCR的主干，而第二SAR可具有CD16SAR的主干。不同主链上的几个示例性SAR的核酸和氨基酸序列呈现在临时申请的表32和34中。在一个实施方案中，SAR包括针对在与疾病相关抗原相同的疾病细胞类型(例如癌症)上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达SAR的细胞包含靶向第一抗原的第一SAR和靶向第二不同抗原并包含不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二S AR(或第二代CAR)。而是共刺激信号传导域。尽管不希望受理论束缚，将共刺激信号传导结构域例如4-1BB、CD28、CD27、2B4或OX40置于SAR(例如第二代CAR)上可以调节对细胞的SAR活性，其中两个目标均已表达。在一个实施方案中，SAR表达细胞包含i)第一疾病相关抗原SAR(例如CD16SAR)，其包括结合本文所述的靶抗原的一个或多个抗原结合结构域，以及一个或两个信号传导链，和ii)靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的疾病相关(例如，癌症细胞类型上表达的抗原)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和主要信号传导域和共刺激域。在另一个实施方案中，SAR表达细胞包含ai)第一SAR(例如，CD16SAR)，其包括结合本文所述的靶抗原的抗原结合结构域和一个或两个信号链，以及ii)靶向抗原的CAR“第一靶抗原”不同于第一靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)，并且包括对该抗原特异性的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。该CAR构建体缺少CD3z结构域。在另一个实施方案中，SAR表达细胞包含i)第一疾病相关抗原SAR(例如CD16SAR)，其包括结合本文所述的靶抗原的一个或多个抗原结合结构域，以及一个或两个信号传导链，和ii)一种CAR，它靶向不同的目标抗原(例如，一种与第一个目标抗原相同疾病相关的抗原，例如癌细胞)，并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，但不包括共刺激域。
在另一个示例性实施方案中，免疫细胞可以表达两种SAR，其中一个提供共刺激信号，而另一个提供初级激活信号。在一个实施例中，一个SAR可以具有基于4-1BB的SAR的主干，而第二SAR可以具有基于CD16的SAR的主干。在另一示例性实施例中，一个SAR可以具有基于CD28的SAR的主干，而第二SAR可以具有基于CD16的SAR的主干。在另一示例性实施例中，一个SAR可以具有基于OX40的SAR的主干，而第二SAR可以具有基于CD16的SAR的主干。在另一示例性实施例中，一个SAR可以具有2B4SAR的主干，而第二SAR可以具有基于CD16的SAR的主干。
应当理解，可以将激活信号传递至免疫效应细胞但可能不具有包含激活结构域的ITAM的SAR。此类SAR可能会募集具有包含激活结构域的ITAM的蛋白质。缺少包含激活域的ITAM的示例性SAR包括但不限于具有CD16主链的SAR。
在一个实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如但不限于来自41BB、CD27、2B4、0X40、CD28、Dap10、CD2、CD5的一种或多种细胞内信号传导结构域，ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合)和/或初级信号传导结构域(例如但不限于CD3zeta信号传导结构域)。
在一个实施例中，表达SAR的效应细胞包含本文所述的SAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合正常细胞而非癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ)中任一种的胞内结构域。
在某些实施方案中，第一SAR分子(例如，CD16 SAR、NKp30 SAR、NKp44SAR、NKp46SAR或DAP10 SAR等)的抗原结合结构域包含scFv，并且第二SAR分子(例如，CD16 SAR、NKp30SAR、NKp44 SAR、NKp46 SAR或DAP10 SAR等)不包含scF v。例如，第一SAR分子的抗原结合结构域包含scFv并且第二SAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一个实施方案中，本公开提供了表达SAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)和CAR，所述SAR包含结合至本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域，所述CAR包含PD1胞外结构域或片段其中。在一些实施方案中，所述细胞还包含抑制分子，所述抑制分子包含inhKIR胞质结构域；跨膜结构域，例如KIR跨膜结构域；和抑制剂细胞质结构域，例如ITIM结构域和inhKIR ITIM结构域。
本公开还提供了一种方法，包括向受试者施用SAR分子、表达SAR分子的细胞或包含编码SAR分子的核酸的细胞。在一个实施方案中，受试者患有本文所述的病症，例如，受试者患有癌症、传染病、过敏性疾病、退行性疾病或自身免疫性疾病，其表达本文所述的靶抗原。在又一个实施方案中，受试者具有增加的患本文所述病症的风险，例如，受试者具有增加的患癌症、传染病、过敏性疾病、退行性疾病或自身免疫病的风险，其表达本文所述的靶抗原。在一个实施方案中，受试者是人类。在另一个实施方案中，受试者是动物。在又一个实施方案中，受试者是伴侣动物，例如狗。
在一个实施方案中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。靶向X-SIR，其中X代表本文所述的疾病相关抗原，并且其中引起疾病或疾病相关的细胞表达所述X抗原。表49提供了不同抗原和可以使用表达靶向这些抗原的SAR的免疫效应细胞来预防、抑制或治疗的示例性疾病的列表。
被工程改造以表达所述X靶向SAR(或X靶向SAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)来治疗或预防癌症的方法。在本文中，其中癌细胞表达抗原靶标“X”。在一种实施方式中，X在正常细胞和癌细胞上均表达，但在正常细胞上以较低水平表达。在一个实施方案中，该方法还包括选择以允许X靶向的SAR结合并杀死表达X但低于30％、25％、20％、15％、10％的癌细胞的亲和力结合X的SAR。例如，如通过本文描述的测定所确定的，5％或更少的表达X的正常细胞被杀死。例如，本文描述的Gluc释放细胞毒性测定可用于鉴定靶向例如癌细胞的X靶向SAR。在一个实施方案中，选择的SAR具有抗原结合结构域，其结合亲和力KD为约10-4M至10-8M，更常见为约10-5M至10-7M，并且通常为约10-6M或10-7M，对于靶抗原。在一个实施方案中，所选择的抗原结合结构域的结合亲和力比抗原结合结构域低至少两倍、五倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1，000倍。参考抗体，例如本文描述的并且SAR的结合结构域衍生自其的抗体。
在另一个实施例中，本公开提供了通过向需要的受试者提供免疫效应细胞(例如T细胞)来治疗或预防癌症的方法，该免疫效应细胞被设计为表达本文所述的双特异性SAR(或AxB靶向的SAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞)来治疗或预防癌症的方法，其中A B代表SAR所针对的两种不同抗原。在一个实施方案中，抗原A是CD19并且抗原B是CD22并且疾病是B细胞淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，抗原A是CD19并且抗原B是CD20并且疾病是B细胞淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，抗原A是CD19并且抗原B是BCMA并且疾病是B细胞淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，抗原A是CD19并且抗原B是CD38并且疾病是B细胞淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，抗原A是BCMA并且抗原B是CD38并且疾病是浆细胞病症或原发性渗出性淋巴瘤(PEL)。在一个实施方案中，抗原A是BCMA并且抗原B是CS1/SLAMF7并且疾病是浆细胞病症或原发性渗出性淋巴瘤(PEL)。在一个实施方案中，抗原A是CD123并且抗原B是MPL并且疾病是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增殖性疾病或骨髓纤维化。在一个实施方案中，抗原A是CD123并且抗原B是CD33并且疾病是急性髓性白血病、慢性髓性白血病或骨髓增殖性疾病。在一个实施方案中，抗原A和B均在血细胞上表达。在一个实施方案中，一种抗原优先或排他地在血谱系细胞(例如，正常B细胞或淋巴瘤细胞)上表达，而另一种抗原优先或排他地在非血细胞(例如，前列腺癌细胞)上表达。在示例性实施方案中，抗原A是PSMA并且抗原B是CD19并且疾病是前列腺癌。在这样的构建体中，靶向CD19通过靶向正常B细胞上表达的CD19向SAR细胞提供增殖信号，同时靶向PSMA诱导杀伤前列腺癌细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。CD19xC20双特异性SAR，其中引起疾病或疾病相关的细胞表达CD19和CD20。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是急性B细胞白血病、慢性B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。CD19xC22双特异性SAR，其中引起疾病或疾病相关的细胞表达CD19和CD22。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是急性B细胞白血病、慢性B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。CD19xC22xCD20三特异性SAR，其中引起疾病或疾病相关的细胞表达CD19、CD22和CD20。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是急性B细胞白血病、慢性B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。BCMAxCD38双特异性SAR，其中致病细胞或疾病相关细胞表达BCMA和CD38。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一个实施方案中，待治疗或预防的癌症是浆细胞病症(例如，浆细胞白血病、骨髓瘤。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以产生被改造以表达CD5-SAR的免疫效应细胞，其中致病细胞或疾病相关细胞表达CD5。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。在一种实施方式中，待治疗或预防的免疫病症是多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病、糖尿病、移植物抗宿主病或自身免疫性甲状腺炎。
在另一个实施方案中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以产生被工程化以表达TCRB1的免疫效应细胞。-SAR，其中致病细胞或疾病相关细胞表达TCRB 1(T细胞受体Beta1链)。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫疾病。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。在一种实施方式中，待治疗或预防的免疫病症是多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病、糖尿病、移植物抗宿主病或自身免疫性甲状腺炎。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以产生被工程化以表达TCRB2的免疫效应细胞-SIR，其中致病细胞或疾病相关细胞表达TC RB2(T细胞受体Beta2 SAR)。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫病症。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。在一种实施方式中，待治疗或预防的免疫病症是多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病、糖尿病、移植物抗宿主病或自身免疫性甲状腺炎。
在另一个实施方案中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以产生被工程化以表达T的免疫效应细胞。细胞受体γ-δ-SIR，其中引起疾病或疾病相关的细胞表达T细胞受体γ-δ。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是癌症或免疫病症。在一种实施方式中，待治疗或预防的癌症是T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。在一种实施方式中，待治疗或预防的免疫病症是多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病、糖尿病、移植物抗宿主病或自身免疫性甲状腺炎。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞或干细胞可以产生被工程化以表达免疫效应细胞。SAR编码CD4-DC-SIGN。在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病是HIV1/AIDS。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防自身免疫性疾病的方法，所述干细胞可以产生经工程改造以表达的免疫效应细胞。编码自身抗原或其片段的SAR。在一种实施方式中，自身免疫性疾病是糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、寻常型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、肾小球肾炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病。一方面，该疾病是寻常型天疱疮，并且SAR的抗原结合结构域包含桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的胞外结构域。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)或能够产生工程化免疫效应细胞的干细胞，这些工程化细胞表达SAR编码天然存在的受体的细胞外结构域(例如，CD16、CD64、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D等)或其片段，以及一种或多种试剂(例如，抗体、抗体片段、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、双特异性T细胞接合物或BiTE、双特异性杀伤剂接合物或BiKE、三特异性接合物、三特异性T细胞接合器(或三特异性杀伤接合器或TriKE等)，这些试剂结合到包含SAR的天然存在的受体并且还结合在疾病相关细胞上表达的抗原。在一个实施方案中，SAR包含Fc受体的胞外结构域(例如，CD16或CD69等)并向表达SAR的细胞施用一种或多种结合Fc受体的试剂(例如抗体、抗体片段或非免疫球蛋白抗原结合结构域)。在示例性实施方案中，SAR包含天然存在的受体(例如，NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D或NKG2C)的胞外结构域，并且表达SAR的细胞与一种或多种试剂(例如，BiKE、TRiKE、BiTE)一起施用与天然存在的受体的细胞外结构域结合。在示例性实施方案中，SAR包含NKp46的胞外结构域并且与结合NKp46和CD19的双特异性杀伤接合物(BiKE)或三特异性杀伤接合物(TRiKE)一起施用以靶向表达CD19的细胞。在示例性实施方案中，SAR包含NKp46的胞外结构域并且与结合NKp4 6和间皮素的双特异性杀伤接合物(BiKE)一起施用，以便靶向表达间皮素的细胞。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
一方面，在向受试者施用SAR细胞之前，将试剂(例如抗体、BiKE、TRiK E或其片段)离体结合至SAR表达细胞。一方面，药剂(例如抗体、BiKE、TRiKE或其片段)在体内施用。一方面，在输注表达SAR的细胞之前、同时或之后施用药剂(例如抗体、BiKE、TRiKE或其片段)。一方面，施用单剂量的试剂，而在其它方面，施用多剂量的试剂(例如抗体、BiKE、TRiKE或其片段)。一方面，施用多种类型的药剂。一方面，试剂(例如抗体、BiKE、TRiKE或其片段)靶向单一抗原。一方面，一种或多种试剂(例如抗体、BiKE、TRiKE或其片段)靶向多种抗原。在一个示例性实施方案中，SA R包含NKp44的胞外结构域，并且将SAR表达细胞与结合NKp46和CD19的双特异性杀伤接合物(BiKE)或三特异性杀伤接合物(TRiKE)一起施用，以便靶向表达CD19的细胞。在一个示例性实施方案中，SAR包含NKp44的胞外结构域，并且向SAR表达细胞施用结合NKp46的三特异性杀伤接合物(TRiKE)和SAR上的共刺激受体(例如CD28或4-1BB)。在肿瘤细胞上表达效应细胞和CD19，从而靶向并杀死表达CD19的肿瘤细胞。在示例性实施方案中，SAR包含NKp46和CD16两者的胞外结构域，并且将SAR表达细胞与结合NKp46、CD16和间皮素的三特异性杀伤接合物(TRiKE)一起施用，以便以增加的功效靶向表达间皮素的细胞。示例性的BiKE和TRiKE在(Gauthier L等人的CELL，(2019)，117，1701)中进行了描述。其它BiKE和TRiKE在本领域中是已知的并且可以在本公开的替代实施例中使用。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一实施方案中，本公开提供了一种通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或可以产生免疫效应细胞的干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方，这些被工程化改造的细胞表达编码CD16或其缺失或点突变片段的通用SAR，以及与SAR的CD16结构域结合的抗体或抗体片段以及疾病相关细胞上表达的抗原。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述干细胞可以产生具有以下作用的免疫效应细胞：被工程化以表达编码免疫球蛋白结合受体(例如CD16、CD64等)或其缺失或点突变片段的通用SAR。将表达SAR的免疫效应细胞与一种或多种抗体或抗体片段一起施用于患者，所述抗体或抗体片段结合SAR受体的免疫球蛋白结合结构域以及疾病相关细胞上表达的一种或多种抗原。一方面，在将SAR细胞施用于受试者之前，将抗体离体结合至SAR表达细胞。一方面，抗体在体内施用。一方面，在输注表达SAR的细胞之前、同时或之后施用抗体或抗体片段。一方面，施用多剂量的抗体或抗体片段。一方面，施用多种类型的抗体或抗体片段。一方面，抗体或抗体片段靶向单一抗原。一方面，抗体或抗体片段靶向多种抗原。示例性抗体是利妥昔单抗、赫赛汀、Erbitrux等。在一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述干细胞可以产生具有以下作用的免疫效应细胞：被工程化以表达编码免疫球蛋白结合受体或其缺失或点突变片段的通用SAR，所述片段连接至本文所述的信号链(例如，SEQ ID NO：3914-3958)和抗原结合结构域(例如，scFv、vHH、vL、vH或非免疫球蛋白抗原结合结构域、BiTE、BiKE、TRiKE)。将表达SAR的免疫效应细胞与与SAR受体的免疫球蛋白结合结构域结合的一种或多种抗原结合结构域以及疾病相关细胞上表达的一种或多种抗原一起施用给患者。一方面，在将SAR细胞施用于受试者之前，将抗原结合结构域离体结合至SAR表达细胞。一方面，抗原结合结构域在体内施用。一方面，在输注表达SAR的细胞之前、同时或之后施用抗体或抗体片段。一方面，施用多剂量的抗原结合结构域。一方面，施用多种类型的抗原结合结构域。一方面，抗原结合结构域靶向单一抗原。一方面，抗原结合结构域靶向多种抗原。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一实施方案中，本公开提供了一种通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞和/或巨噬细胞等)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，其可以产生免疫效应细胞，所述免疫效应细胞被工程化以表达编码免疫球蛋白受体或其缺失或点突变片段的通用SAR以及与上述受体结合的一种或多种抗体或抗体片段以及一种或多种在疾病相关细胞上表达的抗原。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T、NK细胞和/或巨噬细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述免疫效应细胞可以产生产生免疫效应细胞，所述免疫效应细胞被工程化以表达编码CD16或其缺失或点突变(例如F158V突变体)片段的通用SAR，所述片段连接至T细胞受体恒定链，以及编码抗原结合结构域(例如、scF v、vHH、vL、vH或非免疫球蛋白抗原结合结构域)连接至T细胞受体恒定链。将表达SAR的免疫效应细胞与一种或多种结合SAR的CD16结构域的抗体或抗体片段以及疾病相关细胞上表达的一种或多种抗原一起施用于患者。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。在一个实施方案中，抗体在体内施用。在一个实施方案中，抗体离体结合至CD16-SAR细胞。在一个实施方案中，施用抗体的多次输注。
在另一个实施例中，本公开提供了治疗或预防癌症、感染、自身免疫性或过敏性疾病的方法，方法是向需要这些方法的受试者提供免疫效应细胞(例如，NK细胞或T细胞)或干细胞，这些细胞可以产生免疫效应细胞，这些免疫效应细胞被工程化表达编码CD16的通用SAR或缺失或点突变片段(例如，F158V突变体)以及与SAR的CD16结构域结合的一个或多个抗体或抗体片段以及在疾病相关细胞上表达的一个或多个抗原。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一个实施例中，本公开提供了通过向需要这些免疫效应细胞的受试者提供治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，这些免疫效应细胞(例如，NK或T细胞)被工程化表达编码NKG2D受体的SAR或其缺失或点突变片段(例如，SEQ ID NO:3407和3435)。在一个实施方案中，NKG2D突变体是NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF(SEQ ID NO：3407)。在一个实施方案中，NKG2D突变体是NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA(SEQ ID NO：3435)。在一个实施方案中，向受试者施用表达SAR的免疫效应细胞，所述SAR表达NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF(SEQ ID NO:3407)以及包含抗原结合结构域(例如，scFv、vHH、FHVH等)的蛋白质。与ULBP2R融合。包含与ULBP2R融合的BCMA-93-FHVH的示例性蛋白质如SEQ ID NO:5431所示。在另一个实施方案中，向受试者施用表达SAR的免疫效应细胞，所述SAR表达NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA(SE Q ID NO:：3435)以及包含与ULBP2-S3融合的抗原结合结构域的蛋白质(例如scFv、vHH、FHVH等)。包含与ULBPP2-S3融合的BCMA-93-FHVH的示例性蛋白质如SEQID NO:5432所示。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞或浆细胞或B细胞或T细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以被工程化产生表达靶向CD19的SAR的免疫效应细胞。一方面，该疾病是免疫性疾病或过敏性疾病。
在另一个实施方案中，本公开提供了通过向需要免疫效应细胞的受试者提供被改造为表达CD20-TARGETED-SAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)来治疗或预防疾病的方法。一方面，这种疾病是一种免疫或过敏性疾病。
在另一个实施例中，本公开提供了通过向需要免疫效应细胞的受试者提供被设计为表达CD22-TARGETED-SAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)来治疗或预防疾病的方法。一方面，这种疾病是一种免疫或过敏性疾病。
在另一实施方案中，本公开提供了一种通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或可以产生免疫效应细胞的干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，其可以产生免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可被工程化以表达FITC-SAR以及与疾病相关细胞上表达的抗原结合的FITC标记的抗体或抗体片段或抗体片段或受体或配体或能够结合到疾病相关细胞表面表达抗原的非免疫球蛋白支架。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞、或浆细胞、或B细胞或T细胞。
在另一实施方案中，本公开提供了一种通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或可以产生免疫效应细胞的干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，其可以产生免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可被工程化以表达抗生物素蛋白-SAR以及生物素标记的抗体或抗体片段或抗体片段或受体或配体或与疾病相关细胞上表达的抗原结合的非免疫球蛋白支架。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞或浆细胞。
在另一实施方案中，本公开提供了一种通过向需要的患者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)或可以产生免疫效应细胞的干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，其可以产生免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可被工程化以表达Streptag-SAR以及含有Streptag的抗体或抗体片段或受体或配体或与疾病相关细胞上表达的抗原结合的非免疫球蛋白支架。一方面，疾病相关细胞是癌细胞、感染细胞或浆细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T或NK细胞)来治疗或预防疾病的方法，所述免疫效应细胞被工程化以表达IgE-SAR，所述IgE-SAR的抗原结合结构域包含抗体或与IgE结合的抗体片段。一方面，该疾病是免疫性疾病或过敏性疾病。
方案中，本公开内容涉及使用PD1-SAR(即，含有PD1的胞外结构域作为其抗原结合结构域的SAR)对受试者进行体内治疗，从而抑制癌性肿瘤的生长。PD1-SAR可单独使用来抑制癌性肿瘤的生长。或者，PD1-SAR可以与其它SAR、CAR、免疫原性试剂、标准癌症治疗或其它抗体结合使用。在一个实施方案中，用本文描述的PD1-SAR和X-SAR治疗受试者。在另一个实施方案中，PD1-SAR与另一种SAR或CAR(例如本文所述的SAR或CAR)和激酶抑制剂(例如本文所述的激酶抑制剂)联合使用。
体内治疗受试者，使得癌性肿瘤的生长被抑制。在一个实施方案中，用本文所述的PD 1-CAR或CTLA4-CAR和X-SAR治疗受试者。
免疫系统的某些细胞表现出针对特定靶细胞的细胞毒活性。细胞毒性T淋巴细胞表达T细胞受体(TcR)，能够特异性识别与MHC I类分子结合的抗原衍生肽。相比之下，自然杀伤(NK)细胞不受MHC限制，不需要MHC分子呈递抗原即可发挥杀伤作用。它们能够在缺乏肽负载MHC的情况下识别应激细胞，并杀死缺乏MHC的细胞。因此，NK细胞在先天免疫中发挥着重要作用，否则这些“非MHC”细胞将不会被其它免疫细胞检测到和破坏。
NK细胞(也定义为“大颗粒淋巴细胞”)代表从常见淋巴祖细胞(也产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。与T细胞不同，NK细胞的质膜天然不包含CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR，通常也缺乏其它抗原特异性细胞表面受体(以及TCR和CD3)，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，而是通常表达CD 16和CD56。因此，NK细胞根据其CD3-、CD56+表型进行区分。NK细胞的细胞毒活性不需要致敏，但可通过多种细胞因子(包括IL-2)的激活来增强。通常认为NK细胞缺乏抗原-所需的适当或完整的信号传导途径。受体介导的信号传导，因此不被认为能够进行抗原受体依赖性信号传导、激活和扩展。
已经开发出许多基于T细胞的癌症疗法。基于TCR的细胞治疗方法在一些研究中显示出前景，但存在MHC限制的缺点，即所使用的TCR必须与患者的免疫类型相匹配。与TCR不同，CAR不需要与受体进行MHC匹配。然而，迄今为止，很少有癌症特异性表面抗原能够作为CAR的合适靶标，因此目前CAR在癌症治疗中的应用受到限制。所有涉及用TCR或CAR修饰T细胞的过继细胞治疗方法都需要从患者或组织类型匹配的供体中分离和修饰T细胞，这增加了制造所需的时间和成本的程序。寻求克服ACT的上述限制的替代方法利用细胞毒性NK细胞，例如WO 98/49268中所述。然而，NK细胞缺乏CD3ε、γ、δ链的表达，并且在天然状态下不表达TCR。NK92细胞系被设计为异位表达CD3ε、γ、δ和δ链，已被证明支持TCR表达。然而，这种方法很麻烦。
本公开提供了一种新颖的TCR，称为通用TCR(或uTCR-SAR)。在一个实施方案中，uTCR-SAR的表达不依赖于CD3链并且可以在任何细胞中表达。在一个实施例中，uTCR-SAR在拥有两条链方面类似于生理TCR。在一个实施方案中，uTCR的抗原结合结构域包含衍生自TCR的可变结构域(Va/Vα和Vb/Vβ或Vg/Vγ和Vd/Vδ)。在一个实施方案中，uTCR缺乏完整的TCR恒定链。在一个实施方案中，uTCR的一条或两条链缺乏TCR恒定链的跨膜和/或胞质结构域。在一个实施方案中，uTCR的一条或两条链缺乏TCR恒定链的铰链、跨膜和/或胞质结构域。
本公开旨在提供基于NK细胞的癌症特异性杀伤细胞，以供普遍使用，这意味着这些细胞不必与待治疗受试者的免疫类型相匹配，而目前T细胞所需的基础疗法，但它们仍然可以根据需要针对受试者的特定免疫和癌症类型进行定制。因此，通用杀伤细胞可用于个性化医疗。
在一个实施方案中，向受试者施用表达本公开的SAR的不同细胞。在一个实施方案中，SAR在干细胞(例如，造血干细胞或iPSC)中表达，所述干细胞分化成SA R的多种不同谱系(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞等)。表达细胞。天然T细胞受体和几个下一代CAR平台(例如SIR、Ab-TCR、HIT或TFP等)可以仅在T细胞中功能性表达。本公开的uTCR-SAR的优点是它可以在任何细胞类型中表达。在一个实施方案中，SAR(例如，uTCR-SAR)在干细胞(例如，造血干细胞或iPSC)中表达，所述干细胞在体外分化成多种不同谱系(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等)表达uTCR-SAR的细胞。然后向受试者施用表达SAR(例如uTCR-SA R)的细胞群。在替代实施方案中，SAR(例如uTCR-SAR)在造血干细胞中表达，然后将其施用于受试者。表达SAR的造血干细胞在体内分化成多个谱系的表达SAR的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞等)。
本公开还提供了下一代嵌合受体例如SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβ和TFPγδ在NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞中表现出较差或可忽略的表达。本公开提供了在NK细胞、NK细胞系(例如NK92及其衍生物)、单核细胞/巨噬细胞、单核细胞细胞系和嗜中性粒细胞中表达SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβ和TFPγδ的方法。该方法涉及NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞中CD3复合物的一条或多条链的异位表达。在一个替代实施方案中，该方法涉及干细胞(例如，iPSC、胚胎干细胞、多能干细胞等)中CD3复合物的一条或多条链的异位表达，所述干细胞可以分化产生NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。在一个实施方案中，可以在NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和干细胞中异位表达的CD3复合物的链包括CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ。示例性CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ链的SEQ ID NO，其可以在NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和干细胞中异位表达以促进SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβ的功能性表达临时申请的表18中提供了TFPγδ。在一个实施方案中，CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3δ链在NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和干细胞中异位表达，以促进SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβ和TFPγδ的功能性表达。在一个替代实施方案中，CD 3ε、CD3γ和CD3δ链在NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞中异位表达，以促进SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβ和TFPγδ的功能性表达。在一个实施方案中，使用单个载体表达CD3复合物的一条或多条链。示例性载体由SEQ ID NO：1331和1332表示。在一个替代实施方案中，使用多于一种载体表达CD3复合物的多条链中的一条。
在一些方面，可以使用本领域已知的用于生成不同CAR修饰的细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、g-NK、CIK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、干细胞、iPSC等)。除非另有说明，本领域已知的用于制造和施用过继细胞治疗产品的技术可用于生成SAR编码载体，用于收获、分离和培养不同细胞类型以通过SAR编码载体进行遗传修饰，用于SAR表达细胞的扩增、储存、运输、解冻、效力测试、无菌测试和管理。
SAR可以在体外和/或体内引入进靶细胞(例如，T细胞、NK细胞、造血细胞等)。表达SAR的效应细胞可以在施用于受试者之前离体扩增。在一个实施方案中，表达SAR的效应细胞可以在施用于受试者之前离体扩增2-30天的时间。本公开内容提供了可以使用无扩增方案来制造表达SAR的细胞。在一个实施方案中，表达SAR的细胞在1天或2天的时间内制造。在一个实施方案中，表达SAR的细胞在小于3天、4天、5天、6天、7天、10天、15天、21或30天的时间内制造。表达SAR的效应细胞可以冷冻保存，然后在给药前解冻。
在本公开的另一个方面，提供了包含根据本公开的SAR或包含SAR和任选的药学上可接受的载体的分离的细胞或细胞群的药物组合物。
本公开内容的基因修饰细胞或药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括肠胃外施用。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式。
可以将表达SAR的免疫细胞按绝对细胞数施用于个体，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞/注射至高达约100亿个细胞/注射，例如约、至少约、或每次注射最多大约lxl08、lxl07、5xl07、lxl06、5xl06、lxl05、5xl05、lxl04、(依此类推)SAR细胞，或任意两个数字之间的任何范围(包括端点)。在其它实施方案中，SAR表达细胞可以按相对数量的细胞施用给这样的个体，例如，可以向所述个体施用每公斤个体约1000个细胞至高达约100亿个细胞，例如约、至少大约或至多大约每千克lxl08、lxl07、5xl07、lxl06、5xl06、lxl05、5xl05、lxl04等个细胞个体或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。还可以根据SAR细胞的数量与所述患者中的肿瘤大小之间的近似比率将SAR细胞施用给这样的患者。肿瘤的大小可以通过常规成像方法确定或估计，例如X射线、超声成像等。在其它实施例中，总剂量可以通过m2体表面积来计算，包括每m21xl08、lxl07、5xl07、lxl06。平均人为1.6-1.8m2。
可以在施用之前照射表达SAR的免疫细胞(例如NK92细胞系)。可以用试剂(例如丝裂霉素-C)处理表达SAR的免疫细胞，使其在施用于受试者之前丧失复制能力。
SAR表达细胞和任选的其它抗肿瘤剂可以向患者施用一次或可以多次施用，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每治疗期间1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长时间，或任何两个数字之间的任何范围，包括终点。
表达SAR的细胞可以通过本领域已知的不同途径施用，例如静脉内、腹膜内、胸膜内、鞘内、心室内、真皮内、皮下、肿瘤内、病灶内、肝内途径等。
在一些实施方案中，表达SAR的细胞与其它治疗组合施用，包括常规治疗，例如化学疗法、放射疗法、生物疗法、抗体疗法或激素治疗。在一个实施方案中，在受试者接受淋巴细胞清除化疗后将SAR表达细胞施用于受试者。在一个实施方案中，在受试者接受了淋巴细胞清除和骨髓清除化疗两者之后，将SAR表达细胞施用于受试者。在一个实施方案中，在受试者接受包含依托泊苷的化疗后，将SAR表达细胞施用于受试者。在一个实施方案中，向表达SAR的细胞施用选自以下一种或多种的药剂：蛋白磷酸酶抑制剂；激酶抑制剂(例如，src激酶抑制剂)；Lck激酶抑制剂(例如，达沙替尼)；与表达SAR的效应细胞上表达的一种或多种抗原和靶细胞上表达的一种或多种抗原结合的试剂(例如，抗体、抗体片段、BiTE、BiKE、TRiKE等)；细胞因子(例如IL2、IL15等)；免疫抑制分子的抑制剂(例如PD1或PDL1抑制剂)；降低TREG细胞水平或活性的药剂(例如雷帕霉素)；增加SAR修饰细胞的增殖和/或持久性的试剂(例如IL2、IL15、IL18、IL21等)；趋化因子；增加SAR表达的试剂；允许调节SAR表达或活动的试剂；允许控制SAR修饰细胞的存活和/或持久性的试剂；控制SAR修饰细胞副作用的药物(例如托珠单抗、阿那白滞素、类固醇、达沙替尼、依鲁替尼等)；Brd4抑制剂；将治疗剂或预防剂递送至疾病部位的药剂；增加SAR所针对的靶抗原表达的试剂(例如，当与BCMA靶向SAR一起使用时，γ分泌酶抑制剂)；与SAR共表达的多用途开关结合的试剂(例如，利妥昔单抗、赫赛汀或)；保护同种异体SAR细胞免受免疫攻击的试剂(例如CD52抗体)和腺苷A2a受体拮抗剂。
在一种实施方案中，该方法包括将本文所述的表达SAR分子的细胞与增强表达SAR的细胞活性的试剂联合使用，其中该试剂是细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其组合。细胞因子可以与SAR表达的细胞的施用同时进行，或者在SAR表达的细胞的之后不久进行。另外，细胞因子也可在施用SAR表达细胞后较长时间后递送，例如在评估受试者对SAR表达细胞的反应后。在一个实施方案中，细胞因子与施用同时(例如，在同一天施用)或施用后不久(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用)施用于受试者。在其它实施方案中，在延长的时间段(例如，至少2周、3周、4周、6周)后向受试者施用细胞因子。施用细胞或细胞群后，或在评估受试者对细胞的反应后(1周、8周、10周或更长时间)。
本公开内容提供了Src抑制剂(例如，Lck抑制剂，例如达沙替尼、普纳替尼等)可以控制本公开内容的SAR的活性。在一个实施方案中，达沙替尼可以控制包含CD3z、CD16、NKp30、NKp44、NKp46或NKG2D等的跨膜和/或胞质结构域的SAR的活性。在一个实施方案中，本公开提供了一种可以施用至治疗本公开的新型SAR表达细胞的副作用的是Src抑制剂(例如，Lck抑制剂，例如达沙替尼)。在一种实施方式中，在施用SAR表达细胞之后向患者施用达沙替尼以控制或终止SAR表达细胞的活性。在一个实施方案中，向受试者施用达沙替尼以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的细胞因子释放综合征(CRS)。在一个实施方案中，将达沙替尼施用于受试者以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的神经系统并发症。在一个实施方案中，达沙替尼与其它药剂(例如类固醇、托珠单抗、阿那白滞素等)组合使用以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的CRS和神经并发症。
在一个实施方案中，达沙替尼(Dasatinib)以至少10mg/天、20mg/天、40mg/天、60mg/天、70mg/天、90mg/天、100mg/天、140mg/天、180mg/天/天、210毫克/天、250毫克/天或280毫克/天的剂量口服施用。在一个实施方案中，本公开提供了可施用以治疗本公开的新型SAR表达细胞的副作用的药剂是帕纳替尼。在一个实施方案中，在施用CAR表达细胞之后向患者施用帕纳替尼以控制或终止CAR表达细胞的活性。在一个实施方案中，帕纳替尼以至少15mg/天、30mg/天、45mg/天、60mg/天的剂量口服施用。在一个实施方案中，将帕纳替尼施用于受试者以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的细胞因子释放综合征(CRS)。在一个实施方案中，将帕纳替尼施用于受试者以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的神经系统并发症。在一个实施方案中，帕纳替尼与其它药剂(例如类固醇、托珠单抗、阿那白滞素等)组合使用以预防和/或治疗由SAR表达细胞引起的CRS和神经并发症。
在一个实施方案中，本公开内容提供了酪氨酸激酶抑制剂可用于延长具有新的信号传导结构域的本公开内容的SAR表达细胞的持续性。在一个实施方案中，本公开内容提供了酪氨酸激酶抑制剂可用于延长具有新颖信号传导结构域的本公开内容的SAR表达细胞的持续性，其中SAR包含CD3z、CD16A、CD16B、NKp30的跨膜和/或胞质结构域、NKp44、NKp46和/或NKG2D等。在一个实施方案中，本公开内容提供了酪氨酸激酶抑制剂可用于延迟/逆转具有新颖信号传导结构域的本公开内容的SAR表达细胞的耗竭，其中SAR包含CD3z、CD16、NKp30的跨膜和/或胞质结构域，NKp44、NKp46和/或NKG2D等。在一个实施例中，酪氨酸激酶抑制剂是Src激酶抑制剂。在一个实施方案中，Src激酶抑制剂是Lck抑制剂。在一个实施方案中，Lck抑制剂是达沙替尼或帕纳替尼。在一个实施例中，达沙替尼可用于防止/延迟本公开内容的SAR表达细胞的耗竭。在一个实施方案中，SAR包含CD3z、CD16、NKp30、NKp44、NKp46和/或NKG2D等的跨膜和/或胞质结构域。在一个实施方案中，达沙替尼可用于逆转表达SAR的细胞的耗竭。在一个实施方案中，SAR包含CD3z、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46和/或NKG2D等的跨膜结构域和/或胞质结构域。在一个实施方案中，将达沙替尼施用于间歇性地接受SAR表达细胞的受试者。在一个实施方案中，受试者接受多个周期的酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)。在一个实施方案中，用酪氨酸激酶抑制剂(例如达沙替尼或帕纳替尼)治疗防止本公开内容的SAR表达细胞的凋亡。在一个实施方案中，用酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼或帕纳替尼)降低选自PD1、TIM-3和LAG-3的至少一种T或NK细胞耗竭标志物的表达。在一个实施方案中，用酪氨酸激酶抑制剂(例如达沙替尼或帕纳替尼)治疗增加SAR表达细胞上CD62L或CCR7的表达。在一个实施方案中，治疗持续足以恢复SAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)的至少部分功能的时间。在一个实施方案中，将酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼或帕纳替尼)施用于已连续接受SAR表达细胞的受试者。在实施方案中，达沙替尼以约10mg/天至240mg/天的剂量施用(例如，10mg/天、20mg/天、40mg/天、50mg/天、70mg/天、80mg/天、100mg/天、110mg/天、120mg/天、140mg/天、180mg/天、210mg/天、240mg/天或300mg/天)。
在一个实施方案中，帕纳替尼可用于延长本公开内容的SAR表达细胞的持续性。在一个实施方案中，帕纳替尼可用于延迟本公开内容的SAR表达细胞的耗竭。在一个实施方案中，将帕纳替尼施用于间歇性接受SAR表达细胞的受试者。在一个实施方案中，将帕纳替尼施用于已连续接受SAR表达细胞的受试者。
公开的组合物可以是液体的形式，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可用于通过注射、输注(例如，IV输注)或皮下递送。本公开的液体组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其它类似形式，还可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如水、盐水溶液，通常是生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油例如合成的单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；以及张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。组合物可以封装在由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
在治疗特定病症或病症中有效/有活性的本公开内容的药物组合物的量将取决于病症或病症的性质并且可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。
公开的组合物包含有效量的本公开的结合分子，以便获得合适的剂量。化合物的正确剂量将根据具体制剂、施用方式及其具体部位、宿主和所治疗的疾病而变化。应考虑其它因素，如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度。给药可在最大耐受剂量内连续或定期进行。
通常，该量为本公开内容的结合分子按组合物的重量计至少约0.01％。
制备本公开内容的典型组合物，使得肠胃外剂量单位含有按重量计约0.01％至约2％的本公开内容的结合分子。
对于静脉内施用，组合物可包含约0.1mg/kg至约250mg/kg动物体重，通常约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重，以及更多。通常为约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。
本发明的组合物可以采用合适的载体的形式，例如气雾剂、喷雾剂、悬浮液或任何其它适合使用的形式。合适的药物载体的其它实例描述于EW Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。
药物组合物可以使用制药领域熟知的方法来制备。例如，旨在通过注射施用的组合物可以通过将本公开内容的结合分子与水混合以形成溶液来制备。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。
公开的药物组合物可以与其它治疗剂共同施用，例如抗癌剂、化疗药物、手术或放射。
在一个实施方案中，癌症选自血液癌症或恶性肿瘤或实体瘤。在一种实施方式中，癌症是转移性的。
在一个实施方案中，癌症是任何器官或组织的任何癌症。表49中呈现了示例性疾病和本公开的SAR靶向的抗原。在示例性实施方案中，SAR用于靶向BCMA和CD38，并用于治疗浆细胞和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和系统性红斑狼疮(SLE)。这样的SAR包括如本文所述的BCMA和CD38特异性的抗原结合结构域。在另一个示例性实施方案中，SAR用于靶向BCMA和CD22并用于治疗淋巴疾病和浆细胞疾病，例如淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和系统性红斑狼疮(SLE)。这样的SAR包括如本文所述的BCMA和CD22特异性的抗原结合结构域。在一个实施方案中，SAR用于靶向CD19、CD22、BCMA和CD20并用于治疗浆细胞、淋巴和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括如本文所述的CD19、CD22、BCMA和CD20特异性的抗原结合结构域。在一种实施方式中，SAR用于靶向PSMA和CD19并治疗前列腺癌。此类SAR包括如本文所述的对PSMA和CD19特异性的抗原结合结构域。CD19特异性抗原结合结构域主要用于刺激SAR的激活、增殖和扩张。
在一个实施例中，本公开内容的SAR用于治疗任何疾病(例如，感染、过敏、自身免疫、退行性疾病等)。
在一个实施方案中，SAR用于靶向BCMA和CD19并用于治疗淋巴疾病和浆细胞疾病，例如淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括如本文所述的BCMA和CD19特异性的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，SAR用于靶向BCMA、CD38和CD22并用于治疗淋巴、浆细胞和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。这样的SAR包括对本文所述的BCMA、CD38和CD22具有特异性的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，SAR用于靶向BCMA、CD38和CD19并用于治疗淋巴、浆细胞和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括对本文所述的BCMA、CD38和CD19具有特异性的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，SAR用于靶向BCMA、CD38、CD22和CD19并用于治疗淋巴、浆细胞和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SL E)。此类SAR包括如本文所述的BCMA、CD38、CD22和CD19特异性的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，SAR用于靶向BCMA、CD38、CD22、CD20和CD19并且用于治疗淋巴、浆细胞和自身免疫性疾病，例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括对本文所述的BCMA、CD38、CD22、CD20和CD19具有特异性的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，SAR用于靶向CD19和CD22并用于治疗淋巴和自身免疫性疾病，例如淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括如本文所述的CD19和CD22特异性的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，SAR用于靶向CD19和CD20并用于治疗淋巴和自身免疫性疾病，例如淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括如本文所述的CD19和CD22特异性的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，SAR用于靶向CD19、CD22和CD20并用于治疗淋巴和自身免疫性疾病，例如淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和系统性红斑狼疮(SLE)。此类SAR包括如本文所述的CD19、CD20和CD22特异性的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，SAR用于靶向PSMA并治疗前列腺癌。此类SAR包括如本文所述的对PSMA特异性的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，SAR用于靶向PSMA和CD22并治疗前列腺癌。这样的SA R包括如本文所述的对PSMA和CD22特异性的抗原结合结构域。CD22特异性抗原结合结构域主要用于刺激SAR的激活、增殖和扩张。
在一种实施方式中，SAR用于靶向PSMA和CD20并治疗前列腺癌。这样的SA R包括如本文所述的对PSMA和CD20特异性的抗原结合结构域。CD20特异性抗原结合结构域主要用于刺激SAR的激活、增殖和扩张。
在一种实施方式中，SAR用于靶向PSMA和BCMA并治疗前列腺癌。这样的SA R包括如本文所述的对PSMA和BCMA特异性的抗原结合结构域。BCMA特异性抗原结合结构域主要用于刺激SAR的激活、增殖和扩张。
在一种实施方式中，本公开内容的SAR或包含SAR的细胞与现有疗法或治疗剂例如抗癌疗法组合使用。因此，在另一方面，本公开内容还涉及组合疗法，其包括施用本公开内容的SAR-T或SAR-NK和/或SAR-巨噬细胞或药物组合物和抗癌疗法。抗癌疗法可包括治疗剂或放射疗法，并且包括基因疗法、病毒疗法、RNA疗法、骨髓移植、纳米疗法、靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其它治疗剂的实例包括其它检查点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性剂、减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)、靶向小分子和生物分子(例如信号转导途径的组分，例如酪氨酸激酶调节剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的试剂，包括EGFR拮抗剂)，抗炎剂、细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂和用编码免疫刺激细胞因子(例如GM-CSF)的基因转染的细胞、化疗。在一种实施方式中，本公开内容的SAR-T或SAR-NK和/或SAR-T和/或SAR-巨噬细胞药物组合物与手术组合使用。本公开内容的SAR-T或SAR-NK药物组合物可以与其它疗法同时或不同时间施用，例如同时、单独或顺序施用。
免疫细胞(例如NK、T细胞等)的存活以及细胞毒性需要细胞因子的支持。已知白细胞介素15(IL-15)和IL-2以非分泌、膜结合形式的表达维持NK和T细胞生长并改善细胞毒性。
本公开提供了产生表达IL-2和/或IL-15的低亲和力变体的全部或功能部分的免疫细胞的方法。IL-2和/或IL-15的全部或部分可以表达为膜结合多肽、分泌多肽或其组合。该方法包括将编码IL-2或IL-15低亲和力变体的全部或功能部分的核酸引入一种或多种免疫细胞(例如NK细胞)中。一方面，编码IL-2或IL-15的低亲和力变体的全部或功能部分的核酸连接(例如，融合)至跨膜蛋白的全部或部分。或者或另外，将编码IL-2或IL-15变体的全部或功能部分的核酸引入免疫细胞(例如NK细胞)中。如本领域技术人员显而易见的，编码IL-2或IL-15变体的全部或功能部分的核酸以及IL-2或IL-15变体的全部或功能部分与全部融合的方面或将跨膜蛋白的一部分引入免疫细胞(例如，NK细胞，可以使用单个核酸或多个(例如，单独的；两个)核酸来完成。NK或T细胞维持在一定条件下)其中IL-15或IL-2的全部或功能部分表达为膜结合多肽和/或分泌多肽，从而产生表达IL-15或IL-2的全部或功能部分的NK或T细胞IL-2作为膜结合多肽和/或作为分泌多肽。在一个具体方面，编码IL-15或IL-2的全部或功能部分的核酸与CD8a的信号肽和全部或功能部分融合。CD8a跨膜结构域的一部分被引入NK细胞。
又一方面，本公开涉及增强NK细胞的扩增和/或存活的方法(例如，体外、离体和/或体内)。该方法包括引入编码IL-15或IL-2的全部或功能部分的核酸。编码IL-15的全部或部分(例如野生型IL-15)和/或编码与跨膜蛋白的全部或部分融合的IL-15的全部或功能部分的核酸可被引入NK中细胞。因此，NK细胞可以将IL-15的全部或功能部分表达为膜结合多肽、分泌多肽或其组合。将NK细胞维持在全部或部分IL-15表达为膜结合多肽、分泌多肽或其组合并且NK细胞增殖的条件下。在一个具体方面，编码IL-15的全部或功能部分的核酸与CD8a的信号肽融合，并且CD8a的跨膜结构域的全部或部分被引入NK细胞中。在一些方面，该方法还可包括使包含膜结合的IL-15和/或分泌的IL-15的NK细胞与IL-2接触。在一些方面，IL-2的浓度为约10IU/ml至约1000IU/ml。在其它方面，IL-2的浓度为约20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720 740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980IU/ml。
如本领域技术人员显而易见的，可以使用多种引入核酸的方法。
对于本领域技术人员来说还显而易见的是，将免疫细胞(例如NK细胞)维持在以下条件下的多种方法：(i)IL-15的全部或功能部分表达为膜结合多肽，并且/或作为分泌的多肽和/或(ii)可以使用包含膜结合的IL-15和/或分泌的IL-15增殖的NK细胞。该方法还可以包括分离或分离通过本文提供的方法产生的一种或多种NK细胞。此外，该方法还可以包括培养该一种或多种NK细胞。在一些方面，产生NK细胞系。
本公开内容还涵盖通过本文描述的方法产生的(一种或多种)自然杀伤(NK)细胞或细胞系，以及包含本文提供的NK细胞的组合物。在一个具体方面，该组合物是包含一种或多种本文提供的NK细胞或细胞系的药物组合物。药物组合物还可包含IL-2的全部或功能部分(例如，(一种或多种)IL-2蛋白的全部或功能部分；编码IL-2的全部或功能部分的核酸)。
本公开提供了IL2和IL15的膜锚定形式及其低亲和力变体(表43)，其可用于向免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、NK-T细胞)提供IL2和/或IL15信号传导，包括表达本公开的SAR(例如SEQ ID NO：8428)的免疫细胞。代表性低亲和力IL2变体的SEQ ID NO：在SEQ IDNO：7834-7837中提供。代表性低亲和力IL15变体的SEQ ID NO：在SEQ ID NO：7839-7841中提供。膜锚定的IL2和/或IL15的低亲和力变体具有选择性地向表达变体的细胞提供生存信号而不刺激邻近细胞中的IL2和/或IL15信号传导的优点。因此，膜锚定的IL2和/或IL15的低亲和力变体具有改善治疗指数的优点。下一代SAR结构的技术挑战是缺乏简单的方法来检测、分离、纯化或消除它们。已经描述了在SAR构建体上添加表位标签，但遇到了干扰SAR与其靶抗原结合和/或脱靶信号传导的问题。申请人发现表位标签可以添加至膜锚定形式的细胞因子(例如IL2和1L15)，而不干扰它们的结合和信号传导活性。本公开提供了膜锚定形式的IL2和IL15及其低亲和力变体，其还包含可用于检测、分离的一种或多种表位标签(例如西妥昔单抗模拟表位、利妥昔单抗标签、赫赛汀模拟表位、MYC标签、StreptagII等)、表达它们的细胞的纯化和/或耗竭，包括SAR表达细胞。示例性表位标签在文献中是已知的，包括PCT/US2021/022641的表37，其通过引用以其整体并入本文。这些表位标签可用于使用PCT/US2021/022641中描述的方法检测、分离、纯化和/或消除免疫细胞(例如，表达SAR的NK或T细胞)。
过继免疫疗法疗效的提高与严重的短期和长期不良事件的报告有关，例如CRS、神经毒性、移植物抗宿主病(GvHD)、淋巴细胞增殖和插入突变。由于工程化T细胞在给药后可以扩增并持续数年，因此需要一种安全机制，允许在面临毒性时选择性删除过继输注的T细胞。自杀基因能够在体内选择性删除转导细胞。两种自杀基因正在临床测试中：HSV-TK和iCasp9。
为了最大限度地提高过继细胞治疗的效率，需要有一种监测转导效率和选择转导细胞的机制。然后可以将纯化的转导细胞群体给予患者。
一些T细胞工程策略，包括下一代CAR构建体(例如，SIR、zSIR、Ab-TCR等)的表达，可能不会导致易于检测的表面蛋白的转基因表达。在这些情况下，测量外周血中细胞的转导和追踪是很困难的。此外，在某些情况下，必须仅施用转导的T细胞，例如在GvHD基因治疗方案中。这里，需要一种允许临床等级分类的标记物。
一些标记基因已被描述，例如嘌呤霉素抗性基因(PAC)、tEGFR、CD20和低亲和力神经生长因子受体。最近，截短的CD34和RQR8已被用作标记。这些的优点是CD34 MiltenyiCliniMACS选择系统可随时用于临床分级分选。
标记基因和自杀基因(例如HSV-TK、iCaspase 9、tEGFR等)具有长编码序列，并且将这些蛋白质作为标记基因包含在内可能会加重载体包装能力和转录效率。最后，上述自杀和/或标记基因均不能向免疫细胞提供生存信号。尽管可以通过包含两个或多个基因来提供自杀、标记和生存功能，但这可能会进一步加重载体包装能力和转录效率的负担。因此需要一种能够提供自杀、生存和标记功能的多用途基因开关。
本公开提供了用于自杀、生存和标记功能的多用途基因开关。在示例性实施方案中，当在细胞中异位表达时，多用途开关充当生-死(或生存-自杀)开关，用于过继细胞治疗的目的。在一个实施例中，多用途开关具有以下公式：SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4；其中SP是任选的信号肽，其允许多用途开关的细胞表面转运并被切割以产生成熟肽，D1是受体结合结构域，其与促进细胞存活的受体结合，D2是标记/自杀结构域，D3是铰链结构域/茎结构域允许D1和D2结构域远离靶细胞表面投射，D4是膜关联结构域(例如，跨膜结构域或膜锚定结构域)，其将分子开关锚定到细胞膜和L1、L2和L3是可选的接头结构域。
在一个实施方案中，多用途开关包含包含受体结合结构域的第一模块(D1)与用作标记/自杀开关的第二模块(D2)和第三模块(D3)的框内融合。充当铰链/茎结构域和第四个模块(D4)充当膜关联结构域。在一个实施方案中，D2、D3和D4模块衍生自相同的内源蛋白质。在一个实施方案中，D2、D3和D4模块衍生自不同的内源蛋白质。在一个实施方案中，D3和D4衍生自相同的内源蛋白质。在一个实施方案中，D3和D4衍生自不同的内源蛋白质。
在一个实施方案中，第一模块(D1)与细胞表面表达的受体结合，即，其与受体的胞外结构域结合。在一个实施方案中，第一模块(D1)与受体结合，该受体在结合时向细胞传递促存活和/或增殖信号。在一个实施方案中，第一模块以顺式结合受体(即，结合在与表达分子开关的细胞相同的细胞上表达的受体)。在一个实施方案中，第一模块反式结合受体(即，结合在除表达分子开关的细胞之外的细胞上表达的受体)。在一个实施方案中，第一模块以顺式和反式结合受体。在一个实施方案中，第一模块(D1)包含细胞因子、趋化因子、配体或其变体或片段的受体结合结构域。示例性细胞因子、趋化因子和配体包括但不限于以下之一：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL18、IL-19、IL20、IL-21、IL-22、IL-23、IL27、IL-28、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、APRIL、BAFF、Rantes、MIP、促红细胞生成素、血小板生成素、SCF(干细胞因子)、G-CSF、在一个实施方案中，第一模块是抗体、抗体片段(例如scFv、vL、vH、Fab等)、单域抗体(例如vHH、FHVH等)。或可以与受体结合的非免疫球蛋白抗原结合模块。在示例性实施方案中，受体选自以下之一:IL-1R、IL2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-18R、IL-19R、IL-20R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-27R、IL-28R、CCR1、CCR3、CCR5、MIP-1R、PF4受体、促红细胞生成素受体(Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit和M-CSF受体。
在一个实施方案中，第二模块(D2)包含内源蛋白质或其片段的胞外结构域。在一个示例性实施方案中，D2包含一种或多种以下内源蛋白或其片段的胞外结构域：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD38、CD52、CD171；CS1(SLAMF7、CD319)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体II I(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；BCMA；Tn抗原(Tn Ag)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms类似酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；套件(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCA M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD 2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类组5，成员D(GPRC5D)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；GloboH甘油酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；潘联蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；雄激素受体；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有粘蛋白样激素受体样2(EMR2)的EGF样模块；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLLl)、MPL、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸路易斯抗原)；岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRgamma-delta、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、黄体生成素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FS HR)、促性腺激素受体(CGHR或GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、组织因子1(TF1)、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、Nectin-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯通道(LCCC)、TAJ/TROY、MPL(TPO-R)、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、PD-L1、PD-L2、TN FR1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、CTLA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺基质淋巴细胞生成素、组织因子、IFNAR1、IL5、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-13、血管生成素样3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD 8、CD7、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7整合素、α4整合素、VEG F、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys和BAFF-R。
在一个实施方案中，第二模块(D2)可用于诱导表达分子开关的细胞死亡。在一个实施方案中，当与试剂结合时，第二模块(D2)可用于诱导表达分子开关的细胞死亡。在示例性实施方案中，当与第二模块结合时诱导表达分子开关的细胞死亡的试剂是抗体、抗体片段、scFv、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域、抗体药物缀合物、双特异性抗体或其片段或细胞(例如，CAR-T、SAR-T、SAR-NK细胞等)。在一个实施方案中，第二模块可用于选择性富集或耗尽表达分子开关的细胞。在一个实施例中，第二模块可用于选择性地检测、富集和/或耗尽当被试剂结合时表达分子开关的细胞。在一个示例性实施方案中，当与第二模块结合时，可用于选择性检测、富集和/或消除表达分子开关的细胞的试剂是抗体、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域或其片段。在一个实施方案中，分子开关用于选择性地检测、富集和/或消耗离体细胞。在一个实施方案中，分子开关用于选择性地消耗体内细胞。在一个实施方案中，用于检测、消除或富集表达分子开关的细胞的试剂(即，抗体、抗体药物缀合物、双特异性抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域或其片段)已被批准用于人类。已被FDA批准或正在等待FDA批准用于人类施用的示例性药剂是本领域已知的，并且包括但不限于利妥昔单抗、赫赛汀、Erbitrux、Adcetris、Enbrel、曲美木单抗，莫苏奈珠单抗，泰克他单抗，多纳单抗，斯培索利单抗、法瑞昔单抗、替雷利珠单抗、belantamab mafodotin、Pembrolizumab、纳武单抗和Qbend等。使用抗体选择性地消耗和/或富集细胞的方法是本领域已知的(例如，WO 2018/178378)。在一个实施方案中，用于检测、消除或富集表达分子开关的细胞的试剂被FDA批准用于离体临床使用。示例性的此类试剂是抗CD34的抗体，其已被FDA批准与临床批准的CliniM ACS CD34系统(Miltenyi)结合使用。
本公开的分子开关包含铰链/茎序列(D3)，当多肽在靶细胞表面表达时，其导致D1和D2结构域远离靶细胞表面投射。
茎序列(D3)导致D1和D2与细胞表面的距离足够远，以促进例如D1与受体和/或抗体与D2结构域的结合。
茎序列(D3)将D1-D2结构域从细胞表面提升。
茎序列可以是基本上线性的氨基酸序列。茎序列可以足够长以使D1和D2结构域与靶细胞表面相距一定距离，但又不能长到其编码序列损害载体包装和转导效率。茎序列的长度可以是例如20至100个氨基酸。茎序列的长度可以是大约40-50个氨基酸。
茎序列可以是高度糖基化的。
茎序列可包含由SEQ ID NO(DNA):7132和SEQ ID NO(PRT):7824表示的序列或在长度上大致相等。
茎/铰链序列可操作地连接至跨膜结构域(D4)，任选地与细胞内锚定序列一起。跨膜结构域和胞内锚定序列可以衍生自与茎序列的胞外部分相同的蛋白质，或者它/它们可以衍生自不同的蛋白质。茎/铰链和跨膜结构域以及胞内锚定序列可以衍生自CD8。示例性CD8铰链和跨膜序列提供于SEQ ID NO(PRT):3603中。
分子开关可以包含L1、L2和L3，它们是任选的接头(或间隔子)结构域，它们可以相同或不同。示例性接头提供于SEQ ID NO：3418-3434中。分子开关还可以在氨基末端包含信号肽。示例性信号肽提供于SEQ ID NO：2425-2428中。一旦多肽被靶细胞表达，信号肽就会被切割，产生成熟的肽产物。
示例性多用途开关是Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter(SEQ ID NO(DN A):7152和SEQ ID NO(PRT):7843)并且包含框内融合至胞外域的IL2的IL2受体结合域和BCMA的跨膜结构域。当在免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞等)中表达时，这种多用途开关通过包含IL2的IL-2R结合结构域的N端D1模块与IL2受体结合，为免疫细胞提供生存信号。该多用途开关的第二模块(D2)包含BCMA的胞外结构域，其被BCMA结合剂(例如BCMA抗体)识别并且可用于检测、选择性去除和/或富集转基因(例如SA R)表达细胞。包含第二(D2)模块的BCMA胞外结构域还可用于通过使用BCMA靶向剂(例如靶向BCMA的抗体或抗体药物缀合物)来选择性自杀转基因(例如SAR)表达细胞。例如，belantamab mafodotin)。该分子开关中的第三个(D3)和第四个(D4)模块由BCMA的铰链/茎和跨膜结构域组成，用于将开关锚定到细胞膜上。
由于分子开关在形式上是模块化的，所以不同的模块可以被其它模块替代，只要所得的开关保留其至少一种生物活性(例如，用作生存开关或自杀开关的能力等)。因此，IL2模块可以被不同的细胞因子(例如，IL15、IL18、IL21等)替代。这些多用途蛋白通过其细胞因子部分(例如，IL2、IL15、IL18、IL21等)提供促生存信号，但是可以通过使用与第二模块(例如，RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19、tCD30等)结合的试剂(例如，抗体)来杀死细胞，从而起到自杀的作用。允许在面对毒性时选择性删除施用的T细胞的基因。第二模块(例如，RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19、tCD30等)也可以用作测量转导的标记并允许选择转导的细胞。
在示例性实施方案中，IL2模块可以被低亲和力IL2变体、IL15或IL15变体替代。包含与tBCMA融合的低亲和力IL2变体的示例性多用途开关提供于SEQ ID NO(DNA)：7152-7155和SEQ ID NO(PRT)：7844-7847中。包含IL-15及其与tBCMA融合的低亲和力变体的示例性多用途开关提供于SEQ ID NO(DNA)：7156-7157和SEQ ID NO(PRT)：7848-7849中。在另一示例性实施例中，tBCMA模块可以被其它模块替换。包含与tCD30融合的IL2的示例性多用途开关提供于SEQ ID NO(DNA):7158和SEQ ID NO(PRT):7850中。包含与tEGFR和其它表面蛋白(例如，Her3、CD19、PD1)融合的细胞因子的示例性多用途开关、PDL1、CD40等)可以类似地构造并用在本公开的替代实施例中。
多用途开关表达盒尺寸紧凑，可以轻松包装在病毒载体中。它们的大小比编码单个标记、自杀和生存基因的表达盒更容易管理，后者需要单独的启动子。它们具有额外的优势，包括生存、自杀和标记基因元件，其敏感性至少等于单个基因所表现出的敏感性。
在一个实施方案中，第二模块(D2)是包含表位或模拟表位的一个或多个拷贝的合成模块。在一个实施方案中，表位存在于内源蛋白质的胞外结构域中。在一个实施方案中，模拟表位模拟存在于内源蛋白质的胞外结构域中的表位。示例性内源蛋白在前面的部分中介绍。包含表位或模拟表位的一个或多个拷贝的示例性合成模块是RQR8(SEQ ID NO:9619)，其是含有CD34表位和两个CD20模拟表位的模块并且已描述于WO/2013/153391中，其是其全部内容通过引用并入本文。RQR8模块允许选择经过临床批准的CliniMACS CD34系统(Miltenyi)。此外，该构建体结合广泛使用的药物抗体利妥昔单抗，导致转基因表达细胞的选择性删除。附加示例性多用途分子开关且包括包含IL2或其变体和tBCMA(SEQ ID NO(DNA):7151-7155)、IL15或其变体和tBCMA(SEQ ID NO(DNA):7156-7157)、IL2及其变体和tHer2的融合蛋白，IL2及其变体和tEGFR、IL2及其RQR8、IL2及其变体和CD30(SEQ ID NO：7850)等。由于多用途开关在形式上是模块化的，所以可以用不同的模块替换一个模块。
发明的多用途开关的多肽可以包含SEQ ID No.7843-7850和9621-9625所示序列的变体或由其组成，其与所示序列具有至少70％、80％或90％同一性如SEQ ID No.7843-7850和9621-9625，只要其保留SEQ ID No.7843-7850和9621-9625多肽的功能活性即可。例如，序列7843-7847的变体应当(i)结合IL-2R；(ii)结合BCMA抗体(例如J6M0或belantamabmafodotin)(iii)当在细胞表面表达时，在J6M0或belantamab mafodotin存在的情况下诱导细胞杀伤。US9273141B2中已经描述了J6M0。
同源性比较可以通过肉眼进行或借助现成的序列比较程序(例如GCG Wi sconsinBestfit软件包)进行。本公开的多用途分子开关可以是融合蛋白的形式，其中多肽与目的蛋白(POI)融合。融合蛋白可包含位于编码多用途开关的多肽和目的蛋白之间的自切割肽(例如，P2A或F2A)。
感兴趣的蛋白质是在靶细胞表面表达的分子。当靶细胞在体内时，POI可以发挥治疗或预防作用。POI可以是SAR(例如，CAR、SIR、zSIR、HIT、STAR、cTC R、Ab-TCR、TFP、TAC、重组TCR等)或内源TCR。
公开内容的多肽或融合蛋白的多用途转换的核酸序列。
当由靶细胞表达时，核酸导致编码的多用途转换多肽在靶细胞的细胞表面表达。当核酸编码多用途转换多肽和POI两者(例如作为融合蛋白)时，其应当导致本公开内容的多肽和POI两者在靶细胞的表面表达。
核酸序列可以是RNA或DNA，例如cDNA。
本公开还提供了包含多用途分子开关的核酸序列的载体。载体还可以包含感兴趣的转基因，即编码POI(例如SAR)的基因。
载体应当能够转染或转导靶细胞，使得它们表达编码多用途开关的多肽和任选的感兴趣的蛋白质。
载体可以是非病毒载体，例如质粒。载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体。载体可包含编码多肽的核酸和包含POI的核酸作为单独的实体或作为单核苷酸序列。如果它们作为单核苷酸序列存在，则它们可以在两个编码部分之间包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)序列以使下游序列能够被翻译。在一个实施方案中，多用途分子开关和POI可以使用单独的启动子从单一载体表达。在另一个实施例中，多用途开关和POI可以由单独的向量表达。
公开内容的多用途转换多肽的细胞。细胞可以在细胞表面共表达多用途开关多肽和POI(例如SAR)。本公开内容还提供了包含能够编码本公开内容的多用途转换多肽的核酸序列的细胞。细胞可以已经用根据本公开内容的载体转导或转染。该细胞可能适合过继细胞疗法。细胞可以是T细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。T细胞可能具有现有的特异性。例如，它可能是Epstein-Barr病毒(EBV)特异性T细胞。细胞可以是NK细胞、NKT细胞、iPSC衍生的T细胞或合成的T细胞。细胞可以衍生自患者。例如，细胞可以从患者体内取出，然后用根据本公开内容的载体离体转导。适合ACT的T细胞群包括：大量外周血单核细胞(PBMC)、CD8+细胞(例如CD4耗尽的PBMC)；选择性去除T调节细胞(Treg)的PBMC；分离的中央记忆(Tcm)细胞；EBV特异性CTL；和三病毒特异性CTL。
本公开内容还包括包含根据本公开内容的细胞的细胞群。细胞群可以已经用根据本公开内容的载体转导。细胞群的一部分细胞可以在细胞表面表达根据本公开内容的多用途转换多肽。细胞群的一部分细胞可以在细胞表面共表达多用途开关多肽和POI(例如SAR)。细胞群可以是来自患者的离体细胞群。
本公开提供了用于测量用感兴趣的转基因(其编码感兴趣的蛋白质POI，例如SAR)的转导的方法，其包括用共表达本公开的多用途转换多肽的载体转导细胞群体的步骤和感兴趣的蛋白质(例如，SAR)并检测细胞表面上的多用途开关(例如，BCMA、QBEnd10结合表位等)的表达，其中表达本发明的多用途开关多肽的细胞的比例对应于转导目的转基因的细胞比例。
本发明还提供了一种选择表达POI(例如SAR)的细胞的方法，包括以下步骤：
(i)检测用本公开内容的载体转染或转导的细胞表面上的多用途开关(例如BCMA-、Her2-或QBEnd10-结合表位)的表达，所述载体包含编码POI(例如，特
区)；和
(ii)选择被鉴定为表达多用途开关(例如BCMA-、Her2-或QBEnd10-结合表
位)的细胞。
可以通过本领域已知的方法例如FACS或Miltenyi cliniMACS系统来鉴定和/或分选细胞。
本公开内容还提供了用于制备富集表达POI(例如，SAR)的细胞的纯化细胞群的方法，其包括使用以下步骤从细胞群中选择表达POI(例如，SAR)的细胞。本公开内容还提供了通过这种方法制备的表达POI的细胞的纯化群体。在纯化的细胞群体中，至少80％、85％、90％或95％的细胞可以表达POI(和根据本公开的多用途转换多肽)。
本公开内容还提供了用于体内追踪转导细胞的方法，其包括检测本公开的多肽在细胞表面的表达的步骤。可以通过本领域已知的方法例如生物发光成像在体内追踪细胞。对于这样的应用，本公开的多肽可以被工程化以与可检测的蛋白质例如荧光素酶共表达。
本公开还提供了用于删除由根据本公开的载体转导的细胞的方法，其包括将细胞暴露于与多用途转换多肽结合的试剂的步骤。在一个实施方案中，试剂结合多用途转换多肽的D2结构域。在一个实施方案中，试剂是抗体(例如，利妥昔单抗、ertibtrux或J6M0)并且细胞在补体存在下暴露于抗体。在一个实施方案中，试剂是抗体药物缀合物(例如belantamab mafodotin、T-DM1或Enhertu等)。在一个实施例中，多用途开关包含tBCMA或其变体或片段并且药剂是J6M0或belantamab mafodotin。在一个实施例中，多用途开关包含tHer2或其变体或片段并且药剂是赫赛汀、T-DM1或Enhertu。在一个实施例中，多用途开关包含RQR8或其变体或片段并且药剂是利妥昔单抗。在一个实施例中，多用途开关包含tEGFR或其变体或片段并且药剂是Erbitrux。
本公开内容的多用途转换多肽在细胞表面表达时，试剂(例如利妥昔单抗)与多肽的D2结构域的结合导致细胞裂解。每个在细胞表面表达的多用途转换多肽可以结合多于一个分子的试剂(例如，利妥昔单抗)。
细胞的缺失可以在体内发生，例如通过向患者施用药剂(例如，利妥昔单抗、赫赛汀、Erbitrux、J6M0、belantamab mafodotin、T-DM1或Enhertu等)。去除转移的细胞的决定可能是由于在患者中检测到可归因于转移的细胞的不良影响而产生的。例如，可能检测到不可接受的毒性水平。不同药剂的施用剂量、途径和频率是本领域已知的，并且将根据药剂和受试者的临床状况而变化。在一个实施方案中，施用多于一个剂量的药剂。
转基因T细胞的过继转移是产生所需免疫反应(例如抗肿瘤免疫反应)的一种有吸引力的方法。
公开的细胞的步骤。该方法可以包括向受试者施用细胞群的步骤。可以使用上述方法富集细胞群中表达目的转基因的细胞。
该方法可以包括以下步骤：
о(i)采集细胞样本，例如来自患者的血液样本，
о(ii)提取T细胞，
о(iii)用本公开的载体转导或转染T细胞，所述载体包含编码多用途开关的核酸序列和感兴趣的转基因(例如，SAR)，
о(iv)离体扩增转导细胞
о(v)将细胞返回给患者。
转导的细胞可以具有所需的治疗特性，例如增强的肿瘤特异性靶向和杀伤。
下一代SAR构建体(例如，SIR、zSIR、Ab-TCR、HIT、STAR等)的技术挑战是缺乏对其检测、分离、纯化或消除的简单方法。已经描述了在CAR构建体上添加终止开关，但会遇到干扰SAR与其靶抗原结合和/或脱靶信号传导的问题。申请人已发现细胞因子(例如IL2和1L15等)可以框内融合至膜锚定形式的分子(例如BCMA、CD30等)，而不干扰它们的结合和信号传导活性。本公开提供了与膜锚定分子(例如BCMA或CD30)融合的细胞因子(例如IL2和IL15等)及其低亲和力变体。由于存在FDA批准的针对BCMA和CD30的抗体和抗体药物缀合物(例如Adcetris)，因此这些分子可以用作杀死开关以在出现毒性时根除表达它们的细胞(例如SAR细胞)。
融合构建体还可以包含一种或多种表位标签(例如，西妥昔单抗模拟表位、利妥昔单抗标签、赫赛汀模拟表位、MYC标签、StreptagII等)，其可以用于检测、分离、纯化和/或消除表达它们的细胞，包括SAR表达细胞。示例性表位标签在文献中是已知的(例如，SEQ IDNO：3423-3434。这些表位标签可用于使用以下方法检测、分离、纯化和/或消除免疫细胞(例如，表达SAR的NK或T细胞)：PCT/US2021/022641中描述的方法。
制品可包括容器和位于容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料形成，例如玻璃或塑料。一般而言，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症的组合物，并且可以具有无菌进入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是在其表面上呈递本公开的SAR的效应细胞。标签或包装插页表明该组合物用于治疗特定病症。标签或包装插页将进一步包含向患者施用SAR效应细胞组合物的说明。还涵盖包含本文描述的组合疗法的制品和试剂盒。
包装说明书是指治疗产品的商业包装中通常包含的说明书，其中包含有关此类治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。在一些实施方案中，包装插页表明该组合物用于治疗靶抗原阳性癌症(例如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或甲状腺癌)。在其它实施方案中，包装插页表明该组合物用于治疗靶抗原阳性病毒感染(例如CMV、EBV、HCV等感染)。
另外，制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度来看所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
还提供了可用于多种目的的试剂盒，例如用于治疗本文所述的靶抗原阳性疾病或病症，任选地与制品组合。本公开的试剂盒包括一个或多个包含SAR效应细胞组合物(或单位剂型和/或制品)的容器，并且在一些实施方案中，进一步包含另一种药剂(例如本文描述的药剂)和/或说明书根据本文描述的任何方法使用。该试剂盒还可以包括对适合治疗的个体的选择的描述。
试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书(例如，试剂盒中包含的纸张)，但机器可读的说明书(例如，磁或光存储盘上携带的说明书)也可以是机器可读的说明书。可以接受。
例如，在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，该组合物包含在其表面上呈递SAR的效应细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含在其表面上呈递SAR的效应细胞的组合物，和b)有效量的至少一种其它试剂，其中所述其它试剂增加MHC蛋白的表达和/或增强MHC蛋白的表达。MHC蛋白(例如IFNγ、IFNP、IFNa或Hsp90抑制剂)对肽的表面呈递。在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含在其表面上呈递SAR的效应细胞的组合物，和b)用于向个体施用SAR效应细胞组合物以治疗靶抗原阳性疾病(例如癌症或病毒感染)的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含在其表面上呈递SAR的效应细胞的组合物，b)有效量的至少一种其它试剂，其中所述其它试剂增加MHC蛋白的表达和/或增强表面由MHC蛋白呈递肽，以及c)关于向个体施用SAR效应细胞组合物和其它药剂以治疗靶抗原阳性疾病(例如癌症或病毒感染)的说明。SAR效应细胞组合物和其它试剂可以存在于单独的容器中或单个容器中。例如，试剂盒可包含一种不同的组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包含SAR效应细胞，而另一种组合物包含其它药剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含SAR的组合物，和b)将SAR与效应细胞(例如衍生自个体的效应细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞)组合以形成组合物的说明书包含在其表面上呈递SAR的效应细胞，并将SAR效应细胞组合物施用于个体以治疗靶抗原阳性疾病(例如癌症或病毒感染)。在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含SAR的组合物，和b)效应细胞(例如细胞毒性细胞)。
在一些实施方案中，试剂盒包含a)包含SAR的组合物，b)效应细胞(例如细胞毒性细胞)，和c)用于将SAR与效应细胞组合以形成包含呈递于其上的效应细胞的组合物的说明书。其表面具有SAR并向个体施用SAR效应细胞组合物以治疗靶抗原阳性疾病(例如癌症或病毒感染)。
在一些实施方案中，试剂盒包含编码SAR的核酸(或核酸组)。在一些实施方案中，试剂盒包含a)编码SAR的核酸(或核酸组)，和b)用于表达核酸(或核酸组)的宿主细胞(例如效应细胞)。在一些实施方案中，试剂盒包含a)编码SAR的核酸(或核酸组)，和b)用于i)在宿主细胞(诸如效应细胞，例如T细胞)中表达SAR的说明书，ii)制备包含表达SAR的宿主细胞的组合物，和iii)向个体施用包含表达SAR的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原阳性疾病(例如癌症或病毒感染)。在一些实施方案中，宿主细胞衍生自个体。在一些实施方案中，试剂盒包含a)编码SAR的核酸(或核酸组)，b)用于表达核酸(或核酸组)的宿主细胞(例如效应细胞)，和c)关于i)在宿主细胞中表达SAR，ii)制备包含表达SAR的宿主细胞的组合物，以及iii)向个体施用包含表达SAR的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原的说明-阳性疾病(例如癌症或病毒感染)。
公开的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以选择提供额外的组件，例如缓冲液和解释信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
与SAR效应细胞组合物的使用相关的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可以提供包含足够剂量的如本文所公开的SAR效应细胞组合物的试剂盒，以在延长的时间内(例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月的任一个或更长时间)为个体提供有效治疗。试剂盒还可以包括多个单位剂量的SAR和药物组合物以及使用说明书，并且以足以在药房(例如医院药房和复合药房)中储存和使用的量进行包装。
本公开提供了靶向热休克蛋白70(Hsp70)的膜暴露表位的vL、vH和scFv(表47)。本公开还提供基于这些靶向Hsp70的vL、vH和scFv多肽的靶向Hsp70的SAR。靶向Hsp70的示例性SAR的SEQ ID提供于(SEQ ID NO(DNA)：7754-7808和SEQ ID NO(PRT)：8446-8500)。使用慢病毒介导的基因转移在免疫细胞(例如，T细胞和NK细胞等)中表达SAR，并使用本公开中描述的体外和体内测定法测试针对表达Hps70的Dau di细胞的细胞毒性。
在急性淋巴细胞白血病患者体内测试了具有多种不同骨架的SAR体内递送。人们尝试了多种递送方法，包括慢病毒介导的基因转移和病毒样颗粒的基因转移。据观察，与具有第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPδ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR或NKG2D SAR骨架的SAR相比，具有SIR、cTCR和Ab-TCR骨架的SAR对于体内基因递送来说更安全。据观察，与编码具有SIR、acTCR和Ab-TCR主干的SAR的慢病毒载体相比，编码具有SIR、acTCR和Ab-TCR主干的SAR的慢病毒载体在表达CD19的循环B-ALL细胞中插入的频率较低。第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR一代CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPδ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR或NKG2D SAR。进一步观察到，即使插入后，具有SIR、acTCR和Ab-TCR骨架的SAR也不在表达CD19的循环B-ALL细胞中表达，而具有第一代CAR骨架的SAR良好表达，a在循环B-ALL中观察到第二代CAR、第三代CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPζ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR或NKG2D SAR细胞。进一步注意到，与具有第一代骨架的SAR相比，具有SIR、cTCR和Ab-TCR骨架的SAR因SAR意外插入而导致B-ALL复发的风险较低。CAR、第二代CAR、第三代CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPζ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR或NKG2D SAR。
已经观察到，针对实体瘤上表达的抗原(例如，间皮素、PSMA等)的CAR-T细胞在输注到患者体内时表现出较差的扩增。本公开通过提供可以靶向血细胞上表达的抗原(例如，CD19、BCMA、CD20等)的SAR来提供该问题的解决方案。这种SAR可以与靶向实体瘤的SAR一起在免疫细胞中共表达，从而为靶向实体瘤的SAR-T细胞提供增殖优势。例如，靶向CD19(SEQID NO：7660)的SAR可以与靶向PSMA(SEQ ID NO：7617)的SAR或靶向Her2的SAR在免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)中共表达。据观察，与单独表达PSMA SAR的免疫细胞相比，表达PSMASAR并且还共表达CD19 SAR的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)显示出更大的增殖和体内持久性。本公开的SAR用于产生双特异性或多特异性免疫细胞(例如，双特异性或多特异性CAR-T或CAR-NK细胞)的独特优势是基于它们与第一代或第二代CAR相比相对较小的尺寸。因此，它们可以很容易地包装在病毒载体(例如慢病毒或逆转录病毒载体)中。另外，本公开的SAR包含许多不同的信号传导链(例如CD16、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、NKG2D、CD3z等)。具有不同信号链(即主链)的SAR可以组合以产生多种双特异性和多特异性SAR，这些SAR彼此不竞争信号蛋白。因此，本公开的SAR可用于产生多样化的免疫应答。
如前所述，慢病毒插入片段的大小存在包装限制。本公开内容描述了来自人疱疹病毒8(卡波西肉瘤相关疱疹病毒或KSHV)的内部核糖体进入序列(IRES)用于细胞治疗和其它基因工程应用的基因表达的用途。与其它已知的IRES相比，KSHV IRES(SEQ ID NO：7116)尺寸相对较小，因此可以容易地包装在病毒载体中。我们生成了编码双链SIR的慢病毒载体，其中使用插入的KSHV IRES序列在SIR盒之后表达tBCMA。我们观察到慢病毒载体感染的T细胞中tBCMA的有效表达。我们还观察到，当使用标准包装混合物包装在293FT细胞中时，所得慢病毒载体具有良好的效价。我们还观察到T细胞中SIR的高水平表达，表明KSVH IRES的存在不会影响上游SIR的表达。感染上述构建体的T细胞中SIR和tBCMA的表达均优于其在慢病毒载体感染的T细胞中的表达，其中使用F2A核糖体跳跃序列表达tBCMA。
本公开考虑了以下示例性发明方面：
方面1.一种特异性结合靶抗原的合成抗原受体(SAR)，所述SAR包含：(i)第一模块，其包含选自以下的一个或多个异源抗原结合结构域：a)抗体；b)抗体片段；c)抗体的重链可变区(vH结构域)或其片段；d)抗体的轻链可变区(vL结构域)或其片段；e)单链可变片段(scFv)或其片段；f)单结构域抗体(SDAB)或其片段；g)vHH结构域或其片段；h)抗体的单体可变区；i)单个vH结构域(SVH)或其片段；j)单个vL结构域(SVL)或其片段；k)非免疫球蛋白抗原结合支架，选自DARPIN、affibody、affilis、adnectin、affitin、obody、repebody、fyno mer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronecti、anticalins、kunitz结构域、犰狳重复蛋白、D结构域、以及前述任意的片段；l)受体或其片段的配体结合结构域；m)配体的受体结合结构域；n)双特异性抗体、-抗体片段、-scFV、-vHH、-SDAB、-非免疫球蛋白抗原结合支架、-受体或-配体；o)自身抗原或其片段；p)适配器结合结构域或其片段；q)Fc结合结构域或其片段；r)TCR或HLA非依赖性TCR或其片段；s)TCR的Va、Vb、Vg或Vd片段或其片段，(ii)包含至少一个膜相关结构域的第二模块，其中膜相关结构域可以是跨膜结构域或膜锚定结构域；(iii)包含一个或多个胞质结构域的任选的第三模块，其中第一、第二和任选的第三模块通过一个或多个任选的接头可操作地连接。
方面2.根据方面1所述的单链SAR，其中包含一个或多个异源抗原结合结构域的第一模块经由任选的接头可操作地连接至多肽，所述多肽包含：(1)完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、天然存在的受体或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；(2)天然存在的受体或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；(3)天然存在的受体或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；(4)天然存在的受体或其片段或变体的胞质结构域；(5)信号传导适配器或其变体或片段的全部或部分胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
方面3.根据方面2所述的SAR，其中a)所述天然存在的受体不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和preTCRα的T细胞受体；和/或b)天然存在的受体不包含T细胞受体模块(TCRM)；和/或c)信号传导适配器不是选自CD3δ、CD3γ、CD3ε和CD3δ的组的CD3适配器；和/或)信号传导适配器不是FcRγ。
方面4.根据方面2或3所述的SAR，其中所述天然存在的受体是具有N端胞外结构域的I型膜蛋白，并且包含一个或多个异源抗原结合结构域的多肽的N端通过任选的可的接头操作地连接至包含以下的多肽的N端或N端附近，a)天然存在的受体多肽链的完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域或a)其片段或其变体；b)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；c)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或d)天然存在的受体多肽链的胞质结构域或其片段或变体。
方面5.方面4的SAR，其中所述天然存在的I型受体膜蛋白选自CD16A、CD 16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KI R2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、LAIR1、其变体和片段。
方面6.根据方面2或3所述的SAR、其中所述天然存在的受体是具有C末端胞外结构域的II型膜蛋白，并且编码一个或多个异源抗原结合结构域的多肽的N末端通过任选接头的可操作地连接至多肽C端或靠近C端，包含：a)天然存在的受体多肽链的完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域，或其片段或其变体；b)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；c)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或d)天然存在的受体多肽链的胞质结构域或其片段或变体。
方面7.根据方面6所述的SAR，进一步包含多肽的N末端，所述多肽包含可操作地连接至II型膜蛋白的N末端的信号传导适配器的胞质结构域。
方面8.根据方面7所述的SAR，其中所述信号传导适配器选自CD3z、FcRγ、DAP10或DAP10。
方面9.根据方面8所述的SAR，进一步包含多肽的N末端，所述多肽包含可操作地连接至信号传导适配器的胞质结构域的N末端的一个或多个共刺激结构域。
方面10.方面9的SAR，其中所述一个或多个共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM和ICOS。
方面11.根据方面10所述的SAR，其与包括DAP10的辅助模块共同表达。
方面12.根据方面6-10中任一项所述的SAR，其中所述天然存在的II型受体膜蛋白选自NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、KLRG1、CD94、CD161、其变体及其片段。
方面13.根据方面3所述的SAR，其中所述完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域全部衍生自单一天然存在的受体并且存在于一条连续多肽链中。
方面14.根据方面2所述的SAR，其中所述完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域衍生自两种或更多种不同的天然存在的受体。
方面15.根据方面14所述的SAR，其中a)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同天然存在的任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域。受体；b)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域和任选的铰链结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同的天然存在的受体的跨膜结构域和任选的胞质结构域；或c)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链和跨膜结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同的天然存在的受体的胞质结构域。
方面16.根据方面2所述的SAR，其中所述胞质结构域包括含有ITAM的激活结构域。
方面17.根据方面2所述的SAR，其中所述胞质结构域缺乏包含ITAM的激活结构域。
方面18.根据方面2所述的SAR，其中所述胞质结构域募集一种或多种选自CD3δ、FcRγ、DAP10和/或DAP10的信号传导适配器。
方面19.根据方面2所述的SAR，其中所述胞质结构域包含一个或多个共刺激结构域。
方面20.根据方面2所述的SAR，其中所述一个或多个共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM、ICOS、其变体及其片段。
方面21.根据方面2所述的SAR，其中胞质结构域缺乏共刺激结构域。
方面22.根据方面2所述的SAR，其中所述胞质结构域包含位于所述跨膜结构域和所述激活结构域之间的一个或多个共刺激结构域。
方面23.方面2的SAR，其中天然存在的受体选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、其变体及其片段。
方面24.方面2和3的SAR，其中所述SAR部分或完全保留天然存在的受体的胞外抗原结合结构域的抗原结合特性，并且获得位于第一个模块中的一个或多个异源抗原结合结构域的抗原结合特异性。
方面25.根据方面1所述的SAR，其当在细胞表面上表达时能够赋予所述细胞MHC(或HLA)依赖性和/或MHC(或HLA)非依赖性抗原识别，并且其中a)SAR的抗原结合结构域不由单个连续的多肽链组成；和/或b)SAR的抗原结合结构域不是衍生自抗体或抗体片段；和/或c)SAR不包含T细胞受体模块。
方面26.根据方面25所述的SAR，其中所述SAR的抗原识别结构域衍生自TCR的至少两个可变结构域。
方面27.根据方面26所述的SAR，其中所述两个可变结构域包含选自Vα、Vβ、Vγ、Vδ和preTCRα的至少两个可变结构域的异二聚体。
方面28.根据方面27所述的SAR，其中所述两个可变结构域是Vα和Vβ或Vγ和Vδ。
方面29.根据方面28所述的SAR，其中所述两个可变结构域不通过柔性肽接头连接。
方面30.根据方面29所述的SAR，其不是单链TCR(sc-TCR)。
方面31.根据方面25所述的SAR，其具有两条链并且至少一条链是膜缔合的。
方面32.根据方面31所述的SAR，其中两条链都是膜相关的。
方面33.根据方面25所述的SAR，其可以结合与MHC(HLA)分子形成复合物的肽。
方面34.根据方面25所述的SAR，其当在细胞表面上表达时赋予其在与肽/MHC复合物结合时募集至少一种信号传导适配器的能力。
方面35.根据方面25所述的SAR，其当在细胞表面上表达时赋予其在与肽/MHC复合物结合时启动至少一种信号传导途径的能力。
方面36.根据方面25所述的SAR，其可以在非T细胞中功能性表达。
方面37.根据方面36所述的SAR，其可以在缺乏功能性CD3复合物表达的细胞中功能性地表达。
方面38.根据方面37所述的SAR，其可以在缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的细胞中功能性地表达。
方面39.根据方面36所述的SAR，其可以将类T细胞抗原识别赋予非T细胞。
方面40.根据方面36所述的SAR，其可以将类T细胞抗原识别赋予缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的T细胞。
方面41.根据方面36所述的SAR，其可在抗原识别后赋予非T细胞类T细胞的信号传导。
方面42.根据方面36所述的SAR，其可以向缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的T细胞赋予类T细胞信号传导。
方面43.根据方面222所述的SAR，其可以赋予任何细胞类T细胞抗原识别。
方面44.根据方面1所述的SAR，其包含至少两条链，其中a)第一多肽链包含第一抗原结合结构域和第一膜相关模块(MAM)，所述第一抗原结合结构域包含vL、Vα或Vγ结构域；b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含vH、Vβ或Vδ结构域；其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶标的Fv-或TCR-Fv样抗原结合模块抗原；并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)，其能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
方面45.根据方面44所述的SAR，其中所述第一多肽链进一步包含在所述第一抗原结合结构域与所述第一MAM之间的第一肽接头，并且所述第二多肽链进一步包含在所述第二抗原结合结构域之间与所述第二个MAM的第二肽接头。
方面46.根据方面45所述的SAR，其中所述第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。
方面47.根据方面46所述的SAR，其中所述第一和/或第二肽接头分别包含CH1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。
方面48.根据方面46所述的SAR，其中所述第一和/或第二肽接头分别包含Cα、Cβ、Cγ或CδTCR结构域或其片段。
方面49.根据方面44或45所述的SAR，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链经由一个或多个二硫键连接。
方面50.根据方面45所述的SAR，其中第一和/或第二肽接头包含增加两条多肽链的表达、亲和力和/或配对的突变。
方面51.根据方面45所述的SAR，其中所述第一肽接头和/或第二肽接头包含如SEQ ID NO:3536-3569和9627-9631、10832-10841和12304-12311中任一个所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列。
方面52.根据方面44所述的SAR，其中所述第一多肽进一步包含位于所述第一MAM的N端的第一铰链结构域或其片段；和/或其中第二多肽还包含第二MAM的N端的第二铰链结构域或其片段。
方面53.根据方面44所述的SAR，包含所述第一MAM中的残基与所述第二MAM中的残基和/或所述第一铰链域中的残基与所述第二铰链域中的残基之间的二硫键。
方面54.根据方面44所述的SAR，其中所述第一多肽还包含位于所述第一铰链结构域的N端的第一同源抗原结合结构域或其片段，和/或所述第二多肽还包含位于所述第二铰链结构域的N端的第二同源抗原结合结构域或其片段，其中两个同源抗原结合结构域衍生自与相应铰链结构域相同的天然存在的非T细胞受体。
方面55.根据方面44所述的SAR，其中所述第一多肽进一步包含第一胞质结构域，所述第一胞质结构域包含位于包含所述第一MAM的所述第一跨膜/膜锚定结构域的C端的任选的激活结构域；和/或其中第二多肽还包含第二胞质，所述第二胞质含有位于包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域C端的任选激活结构域。
方面56.根据方面44所述的SAR，其中所述第一多肽链还包含第一附加胞内结构域，所述第一附加胞内结构域包含所述第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列；和/或其中第二多肽链还包含第二附加胞内结构域，其包含包含第二MA M的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列。
方面57.根据方面56所述的SAR，其中所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS，或变体或其片段。
方面58.根据方面44所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由非T细胞和/或信号传导适配器的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成受体。
方面59.根据方面58所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由全部衍生自单一非T细胞受体和/或信号传导适配器或其变体。
方面60.根据方面58所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由衍生自不同非-T细胞受体和/或信号传导适配器或其变体。
方面61.根据方面58所述的SAR，其中所述两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上是相同的并且衍生自相同的蛋白质。
方面62.根据方面58所述的SAR，其中所述两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上不同和/或衍生自不同的蛋白质。
方面63.根据方面58所述的SAR，其中a)所述非T细胞受体是天然存在的受体并且选自：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KI R2DL3，KIR2DL5A，KIR2DL5B，KIR3DL1，KIR3DL2，KIR3DL4，KIR2DL4，KIR2DS 1，KIR2DS2，KIR2DS3，KIR2DS4，KIR2DS5，KIR3DS1，NKG2D，NKG2C，NKG2A，NKG2E，NKG2F，DNAM-1，2B4，OX40，CD 28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD 5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD 100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、任何以下的变体上述内容及其片段；b)信号传导适配器选自：CD3z、FcRγ、DAP10、任何前述的变体及其片段。
方面64.根据方面44所述的SAR，其中a)所述第一MAM和所述第二MAM不包含选自CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3δ的CD3链的跨膜结构域和任选的胞质结构域；和/或b)第一MAM和第二MAM不包含TCR链和CD3链的跨膜结构域；和/或c)第一MAM和第二MAM不包含CD3ze的跨膜结构域。
方面65.根据方面44所述的SAR，其中所述MAM中的仅一种衍生自选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和preTCRα的T细胞受体。
方面66.根据方面1所述的SAR，其包含至少两条链，其中a)第一多肽链包含包含vL结构域的第一抗原结合结构域和选自TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的第一TCR恒定链或变体其中；b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含vH结构域和选自TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的第二TCR恒定链或其变体；其中第一TCR恒定链是TCRα的恒定链并且第二TCR恒定链是TCRβ的恒定链，或者其中第一TCR恒定链是TCRβ的恒定链并且第二TCR恒定链是TCRα的恒定链，或者其中第一TCR恒定链是TCRγ恒定链并且第二TCR恒定链是TCRδ恒定链，或者其中第一TCR恒定链是TCRδ恒定链并且第二TCR恒定链是TCRγ恒定链，或者其中第一TCR恒定链是TCRγ恒定链，或者其中第一TCR恒定链是TCRδ恒定链并且第二TCR恒定链是TCRγ恒定链恒定链和/或第二TCR恒定链在其N端区域缺乏氨基酸残基，其中vL和vH结构域形成特异性结合靶抗原的Fv样抗原结合模块；并且其中第一TCR恒定链和第二TCR恒定链形成T细胞受体模块(TCRM)，其能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
方面67.根据方面66所述的SAR，其中a)TCRα恒定链由具有SED ID NO(PRT):7863-7963的氨基酸序列或与其具有80-99％同源性的序列表示；b)TCRβ恒定链由SE D ID NO(PRT):7964-8089的氨基酸序列或与其具有80-99％同源性的序列表示；c)TCRγ恒定链由SED ID NO(PRT)：8091-8191的氨基酸序列或与其具有80-99％同源性的序列表示；d)TCRδ恒定链由具有SED ID NO(PRT)：8192-8292的氨基酸序列或与其具有80-99％同源性的序列表示。
方面68.根据方面44或66所述的SAR，其中所述第一和/或第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其附接至第一多肽链的N端或靠近第一多肽链的N端。和/或第二抗原结合结构域。
方面69.根据方面68所述的SAR，其中所述AABD选自单vH结构域(SVH)、单vL结构域(SVL)、vHH结构域、单结构域抗体、单可变结构域TCR(svd-TCR)、非免疫球蛋白抗原结合支架、受体的配体结合结构域、配体的受体结合结构域、自身抗原、适配器结合结构域、Fc结合结构域、其片段和/或其变体。
方面70.根据方面1所述的SAR，其中包含一个或多个异源抗原结合结构域的模块特异性结合选自以下的一种或多种靶抗原：a)细胞表面蛋白抗原，b)肽/MHC复合物，和c)脂质抗原。
方面71.根据方面1所述的SAR，其中所述靶抗原选自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvi ii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCM A)；Tn抗原((Tn Ag)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；FmsLike酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)；白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-llR a)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；丝氨酸蛋白酶21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺素；前列腺酸性磷酸酶(PA P)；延伸因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome、Ma cropain)亚基，Beta型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成的癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基-GM1；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类组5，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；GloboH甘油酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；潘联蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ES0-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、PRAME、PSA、ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；幸存下来；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-1或Galectin 8)，T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节器的兄弟)，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART 3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；顶体素原结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾无处不在1(RUl)；肾无处不在2(RU2)；豆豆；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有粘蛋白样激素受体样2(EMR2)的EGF样模块；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLLl)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸路易斯抗原)岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRgamma-delta、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFbetaR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、黄体生成素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、鸟苷酸环化酶C(GCC)、桥粒芯糖蛋白3自身抗体(Dsg3)、桥粒芯糖蛋白1自身抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、NECTIN-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道和SAR-CoV2刺突蛋白。
方面72.根据方面1所述的SAR，其中所编码的SAR多肽包含一个或多个选自以下的异源抗原结合结构域：(i)重链可变区(vH)，其包含如SEQ ID NO:1中任一个所示的SEQ IDNOS:2682-2918或与其具有至少80％同一性的序列或在三个互补决定区(CDR)中与SEQ IDNOS:2682-2918中任一项或多项中列出的序列具有至少80％同一性的序列2918或SEQ IDNO:2682-2918中任何一个或多个所示序列的三个CDR中具有少于3个取代的序列，或属于属于一个的CDR1、CDR2和CDR3中具有少于3个取代的序列。属于vH且呈现于SEQ ID NO：分别为11593-11829、11830-12066、12067-12303中的CDR2和CDR3，或与SEQ ID NOS:2682-2918中任一项或多项所示序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位的序列。编码与其抗原结合的多肽；(ii)轻链可变区(vL)，其包含SE Q ID NO:2440-2676中任一项所示的序列或与SEQID NO:2440-2676中任一项或多项中所示的序列具有至少80％同一性的序列，或在三个互补决定区(CDR)中与SEQ ID NO S:2440-2676中任何一个或多个所示序列具有至少80％同一性的序列或在三个互补决定区中具有少于3个取代的序列SEQ ID NO:12440-2676中任一个或多个所示序列的CDR或属于vL且在SEQ ID NO:12440-2676中呈现的CDRl、CDR2和CDR3中具有少于三个取代的序列的CDR分别为10882-11118、11119-11355和11356-11592，或与SEQ ID NOS:2440-2676中任一项或多项中列出的序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位的序列。编码结合其抗原的多肽；(iii)单链可变片段(scFv)，其包含在任一个SEQ IDNO:2924-3160中所示的序列或与这些序列至少80％相似性的序列，或者，该scFv具有至少与SEQ ID NO:2924-3160中的序列在六个互补决定区(CDRs)中的序列至少有70％的相似性，或还可以具有与SEQ ID NO:2924-3160中的序列相比，六个CDRs中不超过6个替代物的序列，CDR1、CDR2和CDR3中替换量少于3个的序列，分别属于一个包含scFV的vH，在SEQ IDNOS中表示为11593-11829、11830-12066、12067-12303；轻链CDR1、CDR2和CDR3中替换量少于3个的序列，属于一个包含scFV的vL，SEQ ID NOS:10882-11118、11119-11355和11356-1159，或与相同的目标抗原或目标抗原上相同的表位结合的序列，如SEQ ID NOS:2924-3160中的任何一个或多个序列所述，并且编码与其抗原结合的多肽；(iv)单域抗体、vHH域、SVH和/或FHVH域，其包含SEQ ID NO:3210-3353、10695-10713中任一个所示的序列或具有至少70％同一性的序列SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中任一项或多项中所示的序列和/或与任一项中所示的序列在三个互补性决定区(CDR)中具有至少70％同一性的序列，或SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中的更多个或在SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中的任何一个或多个中列出的序列的三个CDR中具有少于3个取代的序列与SEQ IDNOS:3210-3353、10695-10713中任一项或多项中所示的序列结合相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位，并且其编码与其抗原结合的多肽；(v)由SEQ ID NOS:3366-3377中任一项的多核苷酸或与SEQ ID NOS:3366-3377中任一项或多项中列出的序列具有至少70％同一性的序列编码的非免疫球蛋白支架与SEQ ID NOS:3366-3377中任一个或多个所示序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位；(vi)包含如所示序列的受体的配体结合结构域SEQ ID NO:3378-3395、3880、3882、3886、3893、3896、3897或与其具有至少70％同一性的序列中的任一个，并且其编码与其同源物结合的多肽；(vii)配体的受体结合结构域，其包含SEQ ID NO:3396-3406、10786-10787中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其同源物结合的多肽；(viii)适配器结合结构域，其包含SEQ ID NO:3407-3435、10771-10780中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其适配器结合的多肽；(ix)自身抗原，其包含SEQ ID NO 10788-10791中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其自身抗体或产生自身抗体的细胞结合的多肽；(x)TCR可变区(Va、Vb、Vg或Vd)，其包括以下所述的序列之一(SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782)，或者具有至少70％相似性的序列，或者在三个互补决定区(CDRs)中与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有至少70％相似性的序列，或者在三个CDRs中与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有不到3个替代物的序列，或者与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位的序列，并编码与其抗原结合的多肽。(xi)单可变结构域TCR(svd-TCR)，其包含如SEQ ID NO:9613-9614中任一个所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列或在这三个结构域中具有70-99％同一性的序列互补决定区(CDR)与SEQ ID NOS:9613-9614中任一项或多项所列序列或SEQ ID NOS:9613-9614中任一项或多项所列序列的三个CDR中具有少于3个取代的序列具有互补决定区(CDR)。9613-9614或与SEQ ID NO：9613-9614中任一个或多个所示序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位的序列，并且编码与其抗原结合的多肽。
方面73.方面2或58的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器或其片段包含选自SEQ ID NO:3743-3966、3385、3394、7818-7822、9633-9859的序列或者与其序列具有70％同源性的序列。
方面74.方面2或58的SAR，其中包含天然存在的受体的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域和/或信号传导适配器的多肽包含选自SEQ ID NO:9669-9704、3813、8721的序列、8733和8746或与其序列具有70％同源性的序列。
方面75.方面1、2或58的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的膜相关结构域包含选自SEQ ID NO:3914-3928、9741-9776、9852-9855的序列或者与其序列具有70％同源性的序列。
方面76.方面1、2或58的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的胞质结构域包含选自SEQ ID NO:3944-3958、9777-9812、9856-9859或与其序列具有70％同源性的序列。
方面77.方面16或55的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的激活结构域包含选自SEQ ID NO:9856-9859和9777的序列或与序列具有70％同源性的序列至此。
方面78.根据方面9、48和56所述的SAR，其中所述共刺激结构域包含选自SEQ IDNO：9807-9810的序列或与其序列具有70％同源性的序列。
方面79.根据方面1所述的SAR，进一步包含前导序列或信号肽，其存在于每条链的N端并且任选地包含选自SEQ ID NO:2425-2430的序列。
方面80.方面1的分离的SAR多肽，其中所述SAR包含SAR异二聚体。
方面81.方面1或80的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述多肽包含通过可裂解接头连接的两条SAR链。
方面82.方面81的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是自切割可裂解接头。
方面83.方面82的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是2A接头、类似2A接头或其功能等同物中的任何一种或多种。
方面84.方面83的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是T2A接头、P2A、F2A、E2A接头或其功能等同物中的任何一种或多种。
方面85.方面84的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头包含SEQ ID No:3627-3632中的任何一个或多个的序列。
方面86.方面84的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头任选地在弗林切割位点或弗林样切割位点或其功能等同物之前。
方面87.方面86的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中可裂解接头之前的呋喃裂解位点包含SEQ ID No:3635-3636中的任何一个或多个的序列。
方面88.方面86-87中任一项的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头之前有柔性接头。
方面89.方面88的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中可裂解接头之前的柔性接头编码一种或多种Ser-Gly接头或其功能等同物。
方面90.方面89的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中可裂解接头之前的柔性接头包含SEQ ID No:3633-3634的序列。
方面91.方面88-90中任一项的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中弗林氨酸切割位点之后是柔性接头，其之后是可裂解接头，使得顺序是弗林氨酸切割位点-灵活的可裂解接头。
方面92.根据方面1或80所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述SAR被设计为对所选抗原具有所需的结合亲和力。
方面93.根据方面1所述的SAR，进一步表达包含选自下组的多肽的附加模块，该组由以下各项组成：a)细胞因子或其变体；b)膜锚定细胞因子；c)带有表位标签的膜锚定细胞因子；d)具有自杀、生存和标记功能的多用途开关；e)信号传导适配器分子；f)终止开关。
方面94.根据方面93所述的辅助模块，其中a)所述细胞因子包含具有SEQ ID NO:7833-7842的序列或与其具有高达70％序列同源性的变体，并且b)所述膜锚定细胞因子包含具有以下的序列：SEQ ID NO:7825-7832或与其具有高达70％序列同源性的变体，c)多用途开关包含具有SEQ ID NO:7843-7850的序列或与其具有70％序列同源性的变体，以及d)适配器选自CD3δ、FcRγ、DAP10和DAP12的组。
方面95.一种多肽，其包含方面94的多用途开关，其具有下式：SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4；其中SP是任选的信号肽，其允许多用途开关的细胞表面转运并且被切割以产生成熟肽，D1是与促进细胞存活的受体结合的受体结合结构域，
D2是标记/自杀结构域，D3是铰链结构域/茎结构域，允许D1和D2结构域投射远离靶细胞表面，D4是膜关联结构域，将多用途开关锚定到细胞膜，L1、L2和L3是可选的接头。
方面96.根据方面95所述的多肽，其中所述多用途转换多肽包含第一模块(D1)、(D2)、(D3)和(D4)的框内融合。
方面97.根据方面96所述的多肽，其中a)D3和D4模块衍生自相同的内源蛋白质；b)D2、D3和D4模块衍生自不同的内源蛋白；c)D3和D4衍生自相同的内源蛋白质；或d)D3和D4衍生自不同的内源蛋白质。
方面98.根据方面95所述的多肽，其中所述第一模块(D1)结合在细胞表面上表达的受体。
方面99.根据方面98所述的多肽，其中所述受体在结合时将促存活和/或增殖信号传递至所述细胞。
方面100.根据方面98所述的多肽，其中所述第一模块以顺式结合所述受体和/或所述第一模块以反式结合所述受体。
方面101.方面95的多肽，其中所述第一模块(D1)包含细胞因子、趋化因子、配体或其变体或片段的受体结合结构域。
方面102.方面101的多用途开关，其中D1包含选自IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15的细胞因子、趋化因子或配体的受体结合结构域、IL18、IL21、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、APRIL、BAFF、Rantes、MIP、促红细胞生成素、血小板生成素、SCF(干细胞因子)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、前述任何一项的变体以及前述任何一项的片段。
方面103.方面101的多肽，其中D1包含具有由SEQ ID NO:7833至7842表示的序列的多肽或与其具有至少70％同一性的变体。
方面104.方面95的多肽，其中D1包含可以结合受体的抗体、抗体片段、单域抗体、单链抗体、scFv或非免疫球蛋白抗原结合模块。
方面105.方面95和104的多肽，其中Dl结合选自以下的受体：IL2R、IL6R、IL7R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL15R、IL18、IL21CCR1、CCR3、CCR 5，MIP-1R、PF4受体、促红细胞生成素受体(Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit和M-CSF受体。
方面106.根据方面95所述的多肽，其中所述D2包含非内源多肽。
方面107.根据方面95所述的多肽，其中所述D2包含内源蛋白质或其变体或片段的胞外结构域。
方面108.根据方面95所述的多肽，其中所述D2包含一种或多种以下内源蛋白质或其变体或片段的胞外结构域：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD38、CD52、CD171；CS1(SLAMF7、CD319)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD 3；BCMA；Tn抗原(Tn Ag)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms类似酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；套件(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD 24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类组5，成员D(GPRC5D)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；GloboH甘油酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；潘联蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；雄激素受体；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有粘蛋白样激素受体样2(EMR2)的EGF样模块；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLLl)、MPL、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸路易斯抗原)；岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRgamma-delta、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、黄体生成素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、促性腺激素受体(CGHR或GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、组织因子1(TF1)、GPRC5D、Claudin18.2(CL D18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、Nectin-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯通道(LCCC)、TAJ/TROY、MPL(TPO-R)、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、PD-L1、PD-L2、TNFR1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、CT LA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺基质淋巴细胞生成素、组织因子、IFNAR1、IL5、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-13、血管生成素样3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD8、CD7、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7整合素、α4整合素、VEGF、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys和BAFF-R。
方面109.根据方面95所述的多肽，其中所述D2可以由可用于检测、富集和/或杀死表达所述多用途开关的细胞的试剂结合。
方面110.方面109的多肽，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗体、抗体片段、scFv、单结构域抗体、非免疫球蛋白抗原结合结构域、抗体药物缀合物、双特异性抗体抗体或其片段或细胞。
方面111.方面110的多肽，其中结合D2的试剂被批准用于体内或离体人类临床用途。
方面112.方面111的多肽，其中所述药剂选自：利妥昔单抗、赫赛汀、Enhert u、Erbitrux、Adcetris、Enbrel、曲美木单抗、莫苏奈珠单抗、特克他单抗、多南单抗、斯培索利单抗、Faricimab、belantamab mafodotin、替雷利珠单抗、loncastuxi mab tesirine、Tafasitamab、Pembrolizumab、nivolumab和Qbend10。
方面113.根据方面95所述的多肽，其中所述D3包含长度在5-100个氨基酸之间的茎(铰链结构域)序列。
方面114.根据方面95所述的多肽，其包含由SEQ ID NO(PRT):7843-7850、SE Q IDNO(PRT):9625和SEQ ID NO:9620-9624表示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的变体。
方面115.根据方面95的多肽，其包含SEQ ID No.7843-7849所示的序列，或其与SEQ ID No.7843-7849所示的序列具有至少80％同一性的变体，并且(i)结合J6M0；(ii)结合belantamab mafodotin，并且(iii)当在T细胞或NK细胞表面表达时，促进存活；(v)当在T细胞或NK细胞表面表达时，在belantamab mafod otin存在的情况下诱导细胞死亡。
方面116.根据方面95的多肽，其包含如SEQ ID No.9620-9624所示的序列，或其与如SEQ ID No.9620-9624所示的序列具有至少80％同一性的变体，并且(i)结合QBEND10；(ii)结合利妥昔单抗，并且(iii)当在T细胞或NK细胞表面表达时，促进存活；(v)当在T细胞或NK细胞表面表达时，在利妥昔单抗存在的情况下诱导补体介导的细胞杀伤。
方面117.根据方面95的多肽，其包含如SEQ ID No.9625所示的序列，或其与如SEQID No.9625所示的序列具有至少80％同一性的变体，并且其(i)结合赫赛汀；(ii)与Enhertu结合，(iii)当在T细胞或NK细胞表面表达时，促进存活；(v)当在T细胞或NK细胞表面表达时，在赫赛汀或Enehertu存在的情况下诱导细胞死亡。
方面118.一种重组核酸，其编码方面1的SAR的第一和/或第二多肽链和/或方面93的一个或多个附加模块。
方面119.一种重组表达系统，其包含方面118的重组多核苷酸，其与辅助模块共表达，其中所述辅助模块选自截短的表皮生长因子受体(tEGFR)、截短的表皮生长因子受体viii(tEGFRviii)、截短的CD30(tCD30)、截短的BCMA(tBCMA)、截短的CD19(tCD19)、CD34、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、人caspase 8、人caspase 9、诱导型caspase 9(icaspase9)、嘌呤核苷磷酸化酶、亚麻苦苷酶/亚麻苦苷/葡萄糖氧化酶、脱氧核糖核苷激酶、辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚-3-乙酸(IAA)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、CD20/αCD20、CD34/胸苷激酶嵌合体、dox-依赖性caspase-2、突变型胸苷激酶(HSV-TKS R39)、AP1903/Fas系统、嵌合细胞因子受体(CCR)、选择标记、多用途开关、vFLIP-K13、vFLIP-MC159、4-1BBL-CD40L、DAP10、DAP12、NKG2C、CD94、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、二羟基叶酸受体(DHFR)、突变型DHFR、甲基化DNA蛋白半胱氨酸甲基转移酶、肌苷单磷酸脱氢酶II(IMDHP2)、嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)、杀稻瘟菌素抗性基因、突变型钙调神经磷酸酶a/b(Can/b)、CNa12、CNb30及其组合。
方面120.如方面119所述的重组表达系统，其中编码SAR的一条或两条链和一个或多个辅助模块的重组多核苷酸通过编码任选的柔性接头、任选的弗林裂解位点或弗林样裂解的核苷酸序列连接位点和可切割的接头。
方面121.如方面120所述的重组表达系统，其中编码SAR的一条或两条链和一个或多个辅助模块的重组多核苷酸使用i)一种或多种启动子表达；ii)一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)；iii)一个或多个可裂解接头；iv)i、ii和iii的任意组合。
方面122.方面121的重组表达系统，其中a)启动子是MNDU3启动子、EF1a启动子、EFS启动子(SEQ ID NO:8505)、EFS2启动子(SEQ ID NO:8506)、RSV启动子(SEQ ID NO:8506)：8507)，或mutRSV启动子(SEQ ID NO：8508)或与其具有70％同一性的序列；b)IRES是K-IRES(SEQ ID NO:8504)或与其具有70％同一性的序列。
方面123.至少一种载体，其包含方面118的重组多核苷酸和方面119的重组表达系统，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、睡美人转座子载体和piggybac转座子载体。
方面124.方面123的载体，包含一个或多个组成型启动子或可调节启动子。
方面125.方面104的载体，其中启动子选自MNDU3启动子、EF1a启动子、EFS启动子(SEQ ID NO:8505)、EFS2启动子(SEQ ID NO:8506)、RSV启动子(SEQ ID NO:8507)、或mutRSV启动子(SEQ ID NO:8508)、CMV IE基因启动子、EF-1a启动子、泛素C启动子、MSCVLTR启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或合成Notch(SynNotch)启动子。
方面126.根据方面123所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体，或者所述载体进一步包含poly(A)尾或3'UTR。
方面127.一种效应细胞或干细胞，其包含方面1的至少一种SAR多肽或异二聚体、方面118的核酸、任选的附属模块、方面119的重组表达系统和方面123的载体。
方面128.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述细胞包含多个单链或双链SAR多肽。
方面129.如方面128所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种单链或双链SAR多肽靶向与至少一种其它SAR多肽不同的抗原。
方面130.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽靶向相同抗原。
方面131.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽包含与至少一种其它SAR多肽不同的对抗原的结合亲和力。
方面132.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽包含与至少一种其它SAR多肽不同的天然存在的受体或信号传导适配器。
方面133.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽具有与至少一种其它SAR多肽不同的胞外结构域、跨膜结构域、胞质结构域。
方面134.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽是激活受体并且至少一种其它SAR多肽是抑制性受体。
方面135.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽是激活性受体，或者多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽是抑制性受体。
方面136.如方面127所述的效应细胞或干细胞，其中多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽募集不同的信号传导适配器和/或激活不同的信号转导途径。
方面137.方面127-136中任一项的效应细胞或干细胞，其中所述效应细胞是α/βT细胞、γ/δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、T干细胞、Treg细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、iNKT(先天自然杀伤细胞)、NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、iPSC衍生的T细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、树突状细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞或其衍生物。
方面138.方面127-137中任一项的效应细胞群体，其中所述细胞群体包含多个不同的SAR多肽。
方面139.如方面138所述的免疫细胞或效应细胞群体，其中所述多个不同的SAR多肽包含不同的序列但结合相同的靶抗原或不同的抗原。
方面140.一种制备方面127的表达SAR的效应细胞的方法，其包括将方面123的至少一种载体或方面118的至少一种重组多核苷酸引入效应细胞、细胞系、造血干细胞、在表达SAR多肽和任选的辅助模块的条件下，可以产生效应细胞的祖细胞或IPSC。
方面141.如方面127所述的效应细胞，其中所述效应细胞缺乏表达或具有低表达功能性TCR、功能性HLA、β2巨球蛋白、TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXAN K、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT或染色体6p21区域中的任何基因的特征；和/或在HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、DAP10、DAP12、CD4、CD8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80，PDL1、A2AR、Fc受体、结合蛋白或与双特异性、多特异性或通用结合蛋白耦合的表面诱导受体中中引入或增加至少一种表达。
方面142.方面127的效应细胞，其中效应细胞被修饰以阻断或降低第一内源TCR亚基和/或第二内源TCR亚基的表达。
方面143.方面127的效应细胞，其不表达T细胞受体(TCR)和/或CD3ε、CD3γ或CD3δ并且通过重组表达进行修饰以表达包含非TCR抗原识别结构域的重组双链SAR T细胞受体模块(TCRM)，其中所述细胞表达CD3链CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3δ，并且CD3链和SAR形成位于细胞表面的功能性CD3-SAR复合物。
方面144.方面127的效应细胞，其不表达T细胞受体(TCR)和/或不表达CD3ε、CD3γ或CD3δ并且通过重组表达进行修饰以表达细胞外源的重组双链TCR，其中所述重组双链TCR是包含TCR抗原识别结构域的SAR，所述TCR抗原识别结构域包含a)Vα和Vβ结构域或b)Vγ和Vδ结构域以及非T细胞受体模块(NTCRM)。
方面145.如方面144所述的效应细胞，包含TCR抗原识别基序，其经由任选的接头可操作地连接至非T细胞受体模块(NTCRM)，所述非T细胞受体模块包含衍生自非T细胞受体的第一MAM和第二MAM，并且/或信号传导适配器并且进一步包含任选的胞质共刺激结构域。
方面146.方面143-145的效应细胞，其选自NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、B细胞、粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、树突状细胞、缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3δ链中的一种或多种的T细胞、永生化细胞细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞或其衍生物。
方面147.一种产生方面127的效应细胞的方法，包括将体外转录的一种或多种RNA或合成的一种或多种RNA引入细胞或细胞群体中，其中所述一种或多种RNA包含方面118的重组多核苷酸。
方面148.一种在受试者中提供抗疾病免疫力的方法，包括向受试者施用有效量的免疫效应细胞或能够产生方面127-146中任一项的免疫效应细胞的干细胞，其中所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，或自体NK细胞或同种异体NK细胞，或自体巨噬细胞或同种异体巨噬细胞，或自体粒细胞或同种异体粒细胞，或自体树突细胞或同种异体树突细胞树突细胞，或自体造血干细胞或同种异体造血干细胞，或可产生效应细胞的自体或同种异体iPSC。
方面149.如方面148所述的方法，其中所述同种异体T、NK、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞、造血干细胞或iPSC缺乏或具有低表达功能性TCR、功能性HLA、β2巨球蛋白、TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT或染色体6p21区域中的任何基因；和/或在HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、DAP10、DAP12、CD4、CD 8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80，PDL1、A2AR、Fc受体、结合蛋白或与双特异性、多特异性或通用结合蛋白耦合的表面诱导受体中的至少一种中引入或增加表达。
方面150.一种杀死呈递靶抗原的靶细胞的方法，其包括使靶细胞与方面127的效应细胞接触，其中SAR特异性结合靶抗原。
方面151.方面150的方法，进一步包括使靶细胞与一种或多种结合于表达SAR的效应细胞上表达的一种或多种抗原和靶细胞上表达的一种或多种抗原的试剂接触。
方面152.根据方面151所述的方法，其中所述试剂可以将表达SAR的效应细胞重定向至表达由所述试剂靶向的抗原的靶细胞。
方面153.方面151的方法，其中所述试剂是抗体、抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤剂接合物(BiKE)、三特异性杀伤剂接合物、三特异性T细胞接合物或三特异性杀伤剂接合物(TRiKE)或其组合。
方面154.方面151的方法，其中所述效应细胞表达包含一种或多种天然存在的受体的胞外结构域的SAR。
方面155.方面154的方法，其中所述SAR包含选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A的组的一种或多种天然存在的受体的胞外结构域，KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG 2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNF R-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1和CD161。
方面156.方面151的方法，其中所述试剂是抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤接合物(BiKE)、三特异性杀伤接合物、三特异性T细胞接合物或三特异性杀伤接合物(TriKE)，其包含至少一个可特异性结合天然存在的受体或变体的一个或多个胞外结构域的结构域，或其片段构成SAR。
方面157.方面151或156的方法，其中所述试剂特异性结合：a)包含SAR的一种或多种天然存在的受体或其变体或片段的胞外结构域；和/或b)不属于SAR一部分的一种或多种天然存在的受体的胞外结构域。
方面158.方面151或157的方法，其中所述试剂可以特异性结合一种或多种天然存在的共刺激受体的胞外结构域。
方面159.方面151或157的方法，其中所述试剂可以特异性结合一种或多种天然存在的活化受体的胞外结构域。
方面160.方面151或157的方法，其中所述试剂可以特异性结合至包含共刺激结构域的SAR的胞外结构域。
方面161.根据方面151或157所述的方法，其中所述试剂可以特异性结合至包含激活结构域和共刺激结构域的SAR的胞外结构域。
方面162.方面154或155的方法，其中所述SAR表达Fc受体的胞外结构域并且所述试剂是抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域，包含Fc结构域的双特异性接合物、双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤剂接合物(BiKE)、三特异性接合物、三特异性T细胞接合物或三特异性杀伤剂接合物(TRiKE)。
方面163.方面162的方法，其中所述Fc受体是CD16A、CD16B、CD64、CD32或其变体或片段中的一种或多种。
方面164.根据方面151所述的方法，其中所述靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。
方面165.方面148或149的方法，其中向受试者施用有效量的方面123-146中任一项的免疫效应细胞，其包含合成抗原受体(SAR)分子与调节存活的药剂的组合，免疫细胞的增殖、分化和/或功效，其中所述试剂选自以下的一种或多种：a)蛋白磷酸酶抑制剂；b)激酶抑制剂；c)Lck激酶抑制剂；d)与表达SAR的效应细胞上表达的一种或多种抗原以及靶细胞上表达的一种或多种抗原结合的试剂；e)细胞因子；f)免疫抑制分子的抑制剂；g)降低TREG细胞水平或活性的药剂；h)增加SAR修饰细胞的增殖和/或持久性的试剂；i)趋化因子；j)增加SAR表达的试剂；k)允许调节SAR表达或活性的试剂；l)允许控制SAR修饰细胞的存活和/或持久性的试剂；m)控制SAR修饰细胞副作用的试剂；n)Brd4抑制剂；o)将治疗剂或预防剂递送至疾病部位的药剂；p)增加SAR所针对的靶抗原表达的试剂；q)与与SAR共表达的多用途开关结合的试剂；r)腺苷A2a受体拮抗剂。
方面166.一种药物组合物，其包含方面1的SAR多肽分子、方面118的多核苷酸、方面119的载体、方面127-146中任一项的细胞、和/或方面151和165的试剂以及药学上可接受的载体。
方面167.一种在有需要的个体中预防或治疗靶抗原相关疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的方面166的药物组合物。
方面168.如方面167所述的方法，其中所述靶抗原相关疾病选自增殖性疾病、癌前病症、癌症、免疫疾病、过敏性疾病、退行性疾病、传染病、和非癌症相关的适应症。
方面169.方面168的用途或方法，其中所述癌症是选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-AL L)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛状淋巴瘤细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤(PEL)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症或白血病前期。
方面170.方面168的用途或方法，其中所述癌症选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌，食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、癌症甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、肿瘤中枢神经系统(CNS)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、默克尔细胞癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合，以及所述癌症的转移性病变。
方面171.方面168的用途或方法，其中所述疾病与以下病毒感染有关，所诉病毒选自冠状病毒、SAR-CoV2及其变体、HIV1、HIV2、HTLV1、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6型、人类疱疹病毒8型流感病毒、副流感病毒、禽流感病毒、MERS和SAR冠状病毒、克里米亚刚果出血热病毒、鼻病毒、肠道病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒、RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、水痘病毒、单纯疱疹病毒1和2、水痘带状疱疹病毒、HIV-1、HTLV1、肝炎病毒、肠道病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、尼帕病毒和裂谷热病毒、日本脑炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒，或与结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、耶氏肺孢子菌、弓形体病、立克次体、诺卡氏菌、曲霉、毛霉感染有关，或念珠菌。
方面172.方面168的用途或方法，其中所述疾病是选自糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、寻常型天疱疮、强直性脊柱炎、星本氏甲状腺炎、SLE、结节病、硬皮病、混合结缔组织病、移植物抗宿主病或阿尔茨海默病。
方面173.一种用于研究编码SAR的载体和方面93的多用途开关的转导效率的方法，其包括检测用所述载体转染或转导的细胞表面上的多用途开关的表达的步骤。
方面174.一种用于选择表达方面95的SAR的细胞的方法，其包括以下步骤：i)检测用根据方面140的载体转染或转导的细胞表面上的多用途开关的表达；(ii)选择被鉴定为表达多用途开关的细胞。
方面175.一种制备富集表达SAR的细胞的纯化细胞群体的方法，其包括使用根据方面174的方法从细胞群体中选择表达SAR的细胞的步骤。
方面176.方面175的方法，其包括以下步骤：(i)用根据方面140的载体转导或转染离体自患者分离的细胞群；(ii)通过根据方面174的方法从转导/转染的细胞群中选择表达SAR的细胞。
方面177.一种细胞群体，其富集表达方面94-117的多用途转换多肽的细胞，并因此富集表达SAR的细胞。
方面178.一种用于体内追踪转导细胞的方法，其包括检测根据方面173中任一项的多用途转换多肽在细胞表面的表达的步骤。
方面179.根据方面127所述的用于删除单元的方法，其包括将所述单元暴露于结合到包括所述多用途开关的辅助模块的试剂的步骤。
方面180.根据方面179所述的方法，其中a)所述多用途开关包含具有SEQ ID NO:7843-7850的序列或与其具有80％同源性的变体，并且所述药剂是belantamab mafodotin；b)多用途开关包含具有SEQ ID NO:9620-9624的序列或与其具有80％同源性的变体，并且药剂是利妥昔单抗或CD20抗体；c)多用途开关包含具有SEQ ID NO:9625的序列或与其具有80％同源性的变体，并且药剂是赫赛汀、Enhertu或Her2靶向抗体；d)多用途开关包含具有SEQ ID NO:7850的序列或与其具有80％同源性的变体，并且药剂是Adcetris或CD30靶向抗体。
方面181.一种试剂盒，其包含方面1的至少一种SAR多肽分子、方面93的附加模块、方面94的多用途开关、方面118的重组多核苷酸、方面119的重组表达系统、方面119的载体方面123或方面127的细胞、方面151和/或165的试剂以及方面166的组合物。
方面182.方面140的方法，其在a)离体；b)体内；或c)离体和体内进行。
方面183.根据方面1所述的SAR，其包含至少两条链，其中a)第一多肽链包含第一抗原结合结构域和第一膜相关模块(MAM)，所述第一抗原结合结构域包含Vα或Vγ结构域；b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含Vβ或Vδ结构域；其中第一抗原结合结构域的Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的TCR-Fv样抗原结合模块；并且其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)，其能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
方面184.如方面183所述的SAR，其中所述第一多肽链进一步包含在所述第一抗原结合结构域与所述第一MAM之间的第一肽接头，并且所述第二多肽链进一步包含在所述第二抗原结合结构域之间的第二肽接头和第二个MAM。
方面185.根据方面184所述的SAR，其中所述第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。
方面186.根据方面183所述的SAR，其中所述第一多肽还包含位于包含第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的第一胞质结构域；和/或其中第二多肽还包含位于包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的第二胞质结构域。
方面187.如方面183所述的SAR，其中所述第一多肽链进一步包含第一附加胞内结构域，其包含第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列；和/或其中第二多肽链还包含第二附加胞内结构域，其包含包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列。
方面188.根据方面187所述的SAR，其中所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS，或变体或其片段。
方面189.根据方面183所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由非T细胞的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成受体和/或信号传导适配器。
方面190.方面189的SAR，其中a)所述非T细胞受体选自：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TI GIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、任何上述的变体及其片段；和/或b)信号传导适配器选自：CD3δ、FcRγ、DAP10、前述任一项的变体及其片段。
方面191.方面183的SAR，其当在非T细胞中表达时赋予其T细胞受体样靶结合识别和/或至少一种信号传导适配器的募集和/或至少一种信号传导途径的激活。
方面192.方面167的方法，其中向受试者进一步施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂以a)预防或逆转由于施用包含表达SAR的效应细胞的药物组合物而导致的毒性；和/或b)防止或逆转表达SAR的效应细胞的耗竭。
方面193.方面192的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是Lck抑制剂。
方面194.方面192的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼或普纳替尼。
方面195.方面192的方法，其中治疗增加受试者中T细胞的IL-2分泌。
方面196.方面192的方法，其中治疗减少受试者中T细胞的凋亡。
方面197.如方面192所述的方法，其中治疗降低选自PD-1、TIM-3和LAG-3的至少一种T细胞耗竭标志物的表达。
方面198.方面192的方法，其中治疗增加CD62L或CCR7的表达。
方面199.方面192的方法，其中向受试者施用多个治疗周期。
方面200.方面192的方法，其中间歇地施用所述酪氨酸激酶抑制剂。
方面201.方面192的方法，其中施用所述酪氨酸激酶抑制剂足以恢复至少部分T细胞功能的一段时间，然后中断。
方面202.方面192的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂口服施用。
方面203.方面192的方法，其中与施用于受试者的基因工程化T细胞相关的毒性是细胞因子释放综合征。
方面204.方面192的方法，其中与施用给受试者的基因工程化T细胞相关的毒性是中靶脱肿瘤毒性或脱靶脱肿瘤毒性。
方面205.如方面192所述的方法，其中所述受试者是人。
方面206.一种不具有T细胞的靶识别特性和功能的T细胞，其中所述细胞a)缺乏选自TCRα、TCRβ一条或全部TCR恒定链或其片段的表达，TCRγ、TCRδ或preTC R；b)缺乏选自CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的组中的一条或多条CD3链的表达；和/或c)缺乏形成功能性TCR模块(TCRM)的能力。
方面207.方面206的细胞，其表达包含TCRM的双链受体并赋予T细胞的细胞靶识别特性。
方面208.方面207的细胞，其能够在细胞表面表达受体，所述受体可形成特异性结合靶抗原的TCR-Fv抗原结合模块。
方面209.方面208的受体，其中包含TCR-Fv的两个可变结构域不是单个多肽链的一部分。
方面210.方面206的细胞，其中包含TCR-Fv的两个可变结构域是a)Vα和Vβ，或b)Vγ和Vδ。
方面211.一种杀死呈递靶抗原的靶细胞的方法，包括使靶细胞与方面206的效应细胞接触，其中所述细胞特异性识别靶抗原。
方面212.方面210的细胞，其可以杀死表达其靶肽抗原的靶细胞。
方面213.一种药物组合物，其包含方面206的细胞和药学上可接受的载体。
方面214.一种在有需要的个体中预防或治疗靶抗原相关疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的方面206的细胞或方面213的药物组合物。
方面215.一种制备方面206的具有T细胞受体样抗原识别的非T细胞的方法。
方面216.方面215的方法，其中具有TCR样抗原识别的非T细胞不表达a)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和前TCRα链，或b)TCRα和TCRβ链的二聚体，或c)TCRγ和TCRδ链的二聚体，或d)preTCRα和TCRβ链的二聚体。
方面217.方面215的方法，其中所述方法不涉及a)TCR链的外源表达，或b)选自CD3ε、CD3γ和CD3δ的CD3链的外源表达。
方面218.方面215的方法，其中所述方法涉及单一遗传修饰。
方面219.方面215的方法，其中所述方法涉及引入编码双链受体的一种或两种重组多核苷酸。
方面220.方面210的细胞，其是NK细胞、iNKT(先天性自然杀伤细胞)、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPS C、iPSC衍生的NK细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、树突细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞、NKG细胞系或其衍生物。
方面221.II型跨膜蛋白与I型跨膜蛋白或具有N-末端信号肽的分泌蛋白之间的分离的融合蛋白。
方面222.方面221的分离的融合蛋白，其包含与I型跨膜蛋白或具有N端信号肽的分泌蛋白的胞外结构域融合的II型蛋白的胞质、跨膜和部分或全部胞外结构域。
方面223.方面221的分离的融合蛋白，其中编码I型膜蛋白或具有N端信号肽的分泌蛋白的全部或部分胞外结构域的多肽的N端可操作地连接至C-II型蛋白的末端从N端到C端方向。
方面224.一种制备方面221的融合蛋白的方法，包括步骤a)将编码I型膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸的5'端与N端信号肽框内融合至3'端。编码II型蛋白的部分或全部胞外结构域的核苷酸的末端；b)将重组多核苷酸引入合适的细胞中以允许融合蛋白的表达。
方面225.方面221的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白编码靶向特定抗原的嵌合抗原受体或合成抗原受体。
方面226.一种药物组合物，其包含通过方面224制备的表达方面221的融合蛋白的细胞和药学上可接受的载体。
方面227.一种使用方面226的组合物的治疗方法。
方面228.一种编码合成免疫受体的重组多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1600-2328、4851-5129、5451-6282、7160-7170、7601-7747、8768-9602、10817-组成的组的序列。10830或与编码上述任一合成免疫受体的核苷酸序列具有至少75％同一性的序列。
方面229.编码合成免疫受体多肽的氨基酸序列，所述合成免疫受体多肽选自SEQID NO:3994-4722、5151-5429、6283-7114、7852-7862、8293-8439、9860-10694或具有以下特征的序列：与编码上述任一项中列出的合成免疫受体的氨基酸序列具有至少75％的同一性。
例子
表A中提供了被工程化以表达荧光素酶(例如，GLuc或NLuc)以测量针对不同细胞表面和细胞内抗原的不同构建体的细胞毒性的细胞系。这些实验中使用的细胞系、细胞系上的靶抗原及其生长培养基如下表A所示。细胞在37℃、5％CO2湿润培养箱中培养。细胞系从ATCC、NIH AIDS试剂项目获得或在实验室获得。
表A：
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Jurkat细胞系(克隆E6-1)采用NFAT依赖性EGFP(或GFP)报告基因进行工程改造，命名为JNG，是加州大学旧金山分校Arthur Weiss博士的礼物，被描述用于研究CAR信号传导(Wu，CY et al.，Science 350:293-302，2015).Jurkat细胞维持在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中。NK92MI细胞从ATCC获得，并按照提供的说明进行维持。NK92细胞是也从ATCC获得并维持在含有20％FBS和200 U/mL hIL2的RPMI培养基中。T2细胞来自ATCC。
编码SAR的慢病毒载体的生成
SAR构建体被克隆到慢病毒、逆转录病毒或睡美人转座子载体中。示例性载体在SEQ ID NO：1-6中提供。可用于生成本公开的SAR的其它矢量是本领域已知的。psPAX2载体是Didier Trono的礼物(Addgene质粒#12260)。pLP/VSVG包膜质粒和293FT细胞获自Invitrogen(ThermoFisher Scientific)。逆转录病毒转移载体MSCVneo、MSCVhygro和MSCVpac以及包装载体pKAT先前已有描述(PCT/US2018/53247)。SAR的产生方法(如第二代CAR、SIR、Ab-TCR和TFP等)、GGS-NLuc融合蛋白的产生和使用、以及荧光素酶(如GLuc和Luc146-1H2)的产生和使用，已描述了使用Matador测定法测量细胞毒性的报告细胞系(PCT/US2017/024843、PCT/US2017/025602、PCT/US2017/052344、PCT/US2017/064379和PCT/US2018/53247)，其中其全部内容通过引用并入本文。
包含SAR的抗原结合结构域的序列经过密码子优化并使用公开软件(例如ThermoFisher或IDT)和商业供应商(例如IDT)人工合成。使用标准分子生物学技术对所得片段进行PCR扩增并克隆到包含不同SIR主链的不同载体中。一般来说，SAR构建体通常克隆在慢病毒载体中。使用自动测序确认SIR构建体的序列。
示例性SAR构建体编码载体是pCCLc-MNDU3-Nhe-CD8SP-R1-NY-ESO-IG4-Vb-Xh o-TCRβECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-NY-ESO-IG4-Va-Mlu-TCRαECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-Xba-PAC-Sal-ΔWPRE(SEQ ID NO：9366)。该构建体被克隆到pCCLc-MNDU3-delta-WPRE慢病毒载体主链(SEQ ID NO：6)中。该载体包含驱动SAR构建体表达的MNDU3启动子，所述SAR构建体包含核苷酸，所述核苷酸包含CD 8信号肽(SEQ ID NO：31)、EcoR I位点、靶向NY-ESO的TCR(IG4)的Vβ/Vb结构域-1(SEQ ID NO:966)、Xho I位点、TCRβ-Ig3接头(或TCRβ-Ig3；SEQ ID NO:1166)、BamH I限制性位点、CD3zECDTMCP-opt信号链(SEQ ID NO:1089)，其包含人CD 3z的胞外、跨膜和胞质结构域、Furine切割位点、P2A可裂解接头、Spe I限制位点、信号肽、Bst I限制位点、靶向NY-ESO的TCR(IG4)的Vα/Va结构域-1肽/HLA-A2(SEQ ID NO:966)、Mlu I位点、TCRαECD接头(或TCRa-Ig3；SEQ ID NO:1168)、Kpn I限制性位点、第二CD3zECDTMCP-opt2信号传导模块(SEQ ID NO:10816)，其包含人CD3z的胞外、跨膜和胞质结构域、Furine切割位点、F2A可裂解接头、Xba I限制性位点、嘌呤霉素抗性(PAC)盒和Sal I限制性位点。表达盒具有许多便利的限制性位点，使得不同的模块包含抗原结合结构域片段(例如Vb、Va、vL和vH结构域)、接头(例如TCRβECD、TCRαECD、IgCL或IgG-CHI)或信号链(例如，CD3zECDT MCP-opt和opt2)可以被剪掉并用不同的模块替换。因此，本领域普通技术人员可以使用该载体和抗原结合结构域(例如抗体的vL和vH结构域)的序列来产生靶向任何其它新抗原并包含不同接头和信号链的SAR。
慢病毒和逆转录病毒载体
基本上如前所述(Natarajan等人，科学报告，10：2318)和PCT/US2018/53247。293FT细胞在含有10％ FCS的DMEM(以下称为DMEM-10)中生长。转染后大约48-72小时，收集、合并所有培养基并以1000rpm离心1分钟，以去除任何细胞碎片和非贴壁细胞。将无细胞上清液通过0.45μm注射器过滤器过滤。在某些情况下，通过在4℃下以18500rpm离心2小时来进一步浓缩上清液。将病毒沉淀重新悬浮在XVIVO培养基中初始体积的1/10中。病毒可以新鲜使用来感染靶细胞，也可以分装冷冻保存在-80℃。
T细胞、NK细胞和PBMC的感染
血沉棕黄层细胞取自洛杉矶儿童医院血库的健康、未识别身份的成年捐献者，并用于通过聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。PBMC可以直接使用，也可以使用磁性微珠(Miltenyi Biotech)并按照制造商的说明来分离T细胞或NK细胞。将PBMC或分离的T细胞重悬于替换有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。细胞在37℃、5％ CO2湿润培养箱中培养。在用慢病毒载体感染之前，将细胞在上述培养基中激活1天。一般来说，在早上使用旋转感染(1800rpm，37℃，90分钟)感染原代细胞(例如，T细胞)，使用300μl浓缩病毒，该病毒已重悬于存在8μg的XVIVO培养基中/ml(Sigm a，目录号H9268)。晚上更换培养基，再重复感染两天，共感染3次。第3次感染后，将细胞沉淀并重悬于新鲜的培养基中。除非另有说明，否则XVIVO培养基含有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2，并补充相应的抗生素(如果注明)，并置于细胞培养瓶中进行选择。细胞在上述中培养如果不使用药物选择，则培养基培养10-15天；如果使用药物选择，则培养20-30天。对于JNG和癌细胞系的感染，大约500，000个细胞被2ml未浓缩的病毒感染总体积为3ml的上清液与/>(Sigma，目录号：H9268)。然后第二天早上，将细胞沉淀并重新悬浮在含有相应抗生素的培养基中(如果合适)，并放入细胞培养瓶中进行选择。原代NK细胞用NK激活珠(Miltenyi Biotech)刺激24-96小时，然后用不含/>的浓缩慢病毒载体感染。分析前将细胞在包含IL-2的NK培养基中扩增。
使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi)从健康供体的血液中分离NK细胞。NK92细胞获自ATCC。NK原代细胞和NK92细胞在不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的最低必需培养基(MEM)Alpha中培养，并补充有20％胎牛血清、0.2mM肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、0.02mM叶酸。对于NK92细胞，培养基进一步补充有200IU/ml IL2。感染前用500IL/ml IL2培养和激活NK原代细胞7天。通过在6孔板中旋转感染，用浓缩慢病毒上清液进行慢病毒感染。对于原代NK细胞，大约1.5ml培养基中含有400万NK细胞，补充有500IU/ml IL2，并用500μl不含聚凝胺的浓缩病毒感染。对于NK92细胞，使用6ug/ml聚凝胺。将板在32℃下以2，800rpm离心90分钟，持续5小时。5小时后更换培养基，次日重复感染。
本质上，使用与上述慢病毒载体生产类似的程序来产生逆转录病毒载体，不同之处在于，293FT细胞通常在10cm组织培养板中的10ml DMEM-10培养基中使用10μg逆转录病毒构建体、4μg pKAT和2μg VSVG质粒。病毒收集和靶细胞感染基本上按照上述慢病毒载体进行。
抗体、多肽和药物
NY-ESO1(SEQ ID NO：10880)、MAGE-A3-270-270(SEQ ID NO：10878)和MAGE-A3-112-120(SEQ ID NO：10879)肽由Genscript合成。洋地黄皂苷购自Sigma(货号D141)，并在DMSO中制成100mg/ml的储备液。在PBS中制备1mg/ml的稀释储备液。除非另有说明，用于细胞裂解的洋地黄皂苷的最终浓度为30μg/ml。
酶联免疫吸附试验
使用市售ELISA测量表达CAR的Jurkat-NFAT-GFP效应细胞或T细胞的细胞培养上清液中的人IL2、IFNγ、IL6和TNFα，这些细胞已与特定靶细胞系共培养24至96小时试剂盒来自研发系统(明尼苏达州明尼阿波利斯)和BD Bioscienc es，并遵循制造商的建议。
FACS分析检测SAR表达
小鼠抗人c-Myc APC缀合单克隆抗体(目录号IC3696A)来自R&D System s(明尼苏达州明尼阿波利斯)。生物素化蛋白L购自GeneScript(新泽西州皮斯卡塔韦)，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1mg/ml复溶并储存于4℃。链霉亲和素-APC(SA1005)购自ThermoFisherScientific。APC标记的NY-ESO-1/HLA-A2和MAGE-A3(270-279)-HLA-A2四聚体获自埃默里大学NIH四聚体设施。它们靶向NY-ESO1(SEQ ID NO:10880)和MAGE-A3-270-279(SEQ IDNO:10878)肽。
为了使用四聚体检测SAR，收获1×106个细胞并用3ml含有4％牛血清白蛋白(BSA)洗涤缓冲液的冰冷1×PBS洗涤三次。洗涤后，将细胞重悬于0.1ml含有10μl APC缀合四聚体的冰冷洗涤缓冲液中，并在黑暗中孵育1小时，随后用冰冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后进行FACS分析。
为了使用蛋白L染色检测SAR，收获1×106个细胞并用3ml含有4％牛血清白蛋白(BSA)洗涤缓冲液的冰冷的1×PBS洗涤3次。洗涤后，将细胞重悬于0.1ml含有1μg ProteinL的冰冷洗涤缓冲液中，4℃ 1小时。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞3次，然后与10μl APC缀合的链霉亲和素在0.1ml洗涤缓冲液中的溶液一起孵育(在黑暗中)30分钟，然后用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次。FACS使用BD Biosciences的FACSVerse分析仪进行。
细胞死亡测定
为了测量细胞死亡，使用基于Gluc、NLuc或热稳定甲虫荧光素酶(LucPPe或Luc146-1H2)异位胞质表达的Matador测定，如PCT/US2017/052344“非放射性细胞毒性测定”中所述。除非另有说明，否则将稳定表达不同荧光素酶的靶细胞一式三份地铺在384孔板中，并置于用于生长靶细胞的培养基中。在悬浮液中生长的靶细胞通常以每孔2-3x 10 4的浓度铺板，而作为贴壁单层生长的靶细胞以每孔1-2x 10 4的浓度铺板。除非另有说明，靶细胞与基因修饰的(即表达SAR)效应细胞(例如T和NK细胞或细胞系(NK92、NK92MI或THP细胞)以效应物：靶标(E:T)比例共培养比例从1:1到10:1，持续4小时到96小时。如果靶细胞以贴壁细胞形式生长(例如HeLa细胞)，则在添加T细胞之前，在表达GLuc的靶细胞的情况下，允许它们附着在孔底部过夜，效应细胞介导的靶细胞裂解诱导通过直接注射含有天然腔静脉曲嗪(Nana olight)的0.5x CTZ测定缓冲液，通过BioTek协同读板器测量荧光素酶活性的增加来测定。荧光素用作表达Luc146-1H2的靶细胞的底物。只含有培养基的孔(Med)和靶细胞与未感染任何SAR构建体的效应细胞(UI)一起孵育的孔中的荧光素酶活性用作对照(如所示)。
检测靶细胞上抗原表达并确定SAR构建中使用的各种抗原结合部分的抗原结合活性的测定
靶细胞上抗原的表达通过生物信息学结合抗体免疫染色或高灵敏度抗原检测测定来确定，如PCT/US2017/025602中所述，并且其通过引用整体并入本文。
在以下测定中测试表达SAR的免疫效应细胞，以鉴定功能性SAR。
(A)Topanga测定(NLuc结合测定)：用目标CD19-Nluc融合蛋白对表达对照载体和SAR的Jurkat-NFAT-GFP、T细胞或NK细胞进行染色，并通过测量来测定它们与目标抗原结合的能力使用Topanga测定的Nluc活性。如下图所示，表达新型下一代SAR(SEQ ID NO：2275)的NK92MI细胞，其中CD19单克隆hu-mROO5-1的vL和vH片段附着至DAP10的铰链、跨膜和胞质结构域与对照亲本细胞相比，通过IgCL和IgG-CH1连接体显示与CD19-Nluc Topanga试剂的结合增加。第二代CAR(SEQ IDNO：5141)作为阳性对照。
表50
使用表达不同下一代SAR的NK92MI细胞重复该实验。如下图所示，表达SAR(SEQ IDNO：2277)的NK92MI细胞在Topanga测定中显示出与CD19-Nluc融合蛋白非常高的结合。表达DAP10-SAR(SEQ ID NO:2275)的NK92MI细胞也显示出适度的CD19结合。
表51 平均的 标准差
父母 108 7
序列号：2275 648 189
序列号：2278 145 2.8284
序列号：2277 49100 5081
序列号：5141 f1274 349
体外细胞毒活性测定。将未感染的NK92或T细胞或表达对照载体或SAR的细胞与表达非分泌形式荧光素酶(如GLuc、NLuc、Turboluc 16等)的靶细胞系共培养4-96小时，并诱导如PCT/US17/52344中所述，通过测量荧光素酶活性来检查细胞裂解。如通过Matador测定所测量的，如下表所示，表达SAR(SEQ ID NO：2277)的NK92MI细胞显示出最高的细胞毒性。表达DAP10-SAR(SEQ ID NO：2275)的NK92MI细胞也显示出适度的细胞毒性。
表52
Raji-MATADOR测定 平均的 标准差
中等的 9308 634
父母 39075 3842
序列号：2278 39424 366
序列号：2275 53450 2739
序列号：2277 89496 2318
序列号：5141 37447 981
NF-κB激活测定
Jurkat细胞被设计为在NF-κB响应启动子下表达萤火虫荧光素酶cDNA(Luc)。随后用编码以下SAR构建体的慢病毒载体感染细胞，以产生稳定表达不同SAR的细胞。将表达不同SAR的Jurkat-NF-κB细胞与RAJI-wt(CD19+ve)或RAJI-CD19-KO(CD19-null)细胞共培养24小时，并测量荧光素酶活性。
表53
附表53显示表达具有SEQ ID NO:2275和2277的SAR的Jurkat细胞诱导对NF-κB活性的。具有SEQ ID NO:1860的NKp46 SAR没有诱导NF-κB活性。
诱导NFAT启动子驱动GFP表达。Jurkat-NFAT-GFP(JNG)细胞用编码不同SAR构建体的慢病毒载体感染，并用嘌呤霉素进行选择。将对照JNG细胞和表达SAR的JNG细胞与表达其同源抗原的不同靶细胞系共培养约24小时。因此，表达靶向CD19的SAR的JNG细胞与表达CD19抗原的细胞系RAJI共培养，并通过使用流式细胞术测量GFP表达的诱导来测定它们结合靶抗原并诱导细胞信号传导的能力。缺乏CD19的RAJI细胞(RAJI-CD19-KO)用作阴性对照。GFP表达的诱导被量化为1+、2+、3+等，具体取决于诱导GFP的SAR表达细胞相对于对照细胞的百分比。因此，1.6+意味着大约16％的表达SAR的JNG细胞在与靶细胞共培养时表现出高于对照JNG亲本细胞所观察到的水平的GFP诱导。下表中的结果证明在大多数单链和双链SAR构建体表达时NFAT诱导GFP表达的激活。结果还显示双链异二聚体SAR构建体(例如由SEQ ID NO:2276、2280、2314-2316、2319-2326表示的SAR)诱导NFAT。结果进一步表明，表达至少一条具有CD16A完整胞外结构域的链的SAR构建体不仅对表达其抗原结合结构域(例如BCMA-FHVH)靶向的抗原的细胞作出反应，而且保留结合到针对不同抗原的抗体的Fc区能力。因此，在示例性实施方案中，JNG细胞表达SAR构建体CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-CD16A-F158V-FL-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD16A-F158V-FL-v2-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:2283)当与RAJI(CD19+和BCMA+)和L363(CD19-ve)共培养时诱导NFAT驱动的GFP/BCMA+)细胞系分别通过其抗原结合域BCMA-FHVH93和CD20-VHH-USC1-2HC2D6。更重要的是，当与表达Her2的SKO V3细胞共培养时，表达该SAR(SEQ ID NO：2283)构建体的JNG细胞不能诱导GFP。然而，当表达该SAR的JNG细胞与SKOV3细胞在赫赛汀(1μg/ml)存在下共培养时，观察到GFP的强烈诱导，赫赛汀可以与构成该SAR构建体的两条CD16A-F158V-FL链中的任意一条结合。当用表达SAR构建体CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-Ec oR1-CD16A-V158A-FL-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH的JNG细胞重复实验时，获得了基本相似的结果-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO：2314)。该构建体是双链异二聚体SAR，其中一条信号链包含CD16A-V158A-FL，另一条信号链包含[hTCRa-T48C-opt]。与此相反，由SEQ ID NO:2315和2316所代表的SAR构建体，包括缺乏第一个Ig类似结构域的CD16A链(CD16-V158A-D2TMCP-v1)，在与Herceptin一起与SKOV3细胞共培养时未能诱导GFP表达。然而，这些SAR构建体在与RAJI细胞共培养时仍然可以激活GFP表达，这表明CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa-T48C-opt]链存在于该构建体中。另一方面，表达该SAR的JNG细胞在与L363细胞共培养时未能诱导GFP表达，表明BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP链不表达或不具有功能活性。类似地，JNG细胞表达构建体CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197P当与RAJI或L363细胞共培养时，-D2TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:2322)无法诱导GFP表达。此外，当这些细胞与SKOV3细胞在赫赛汀存在下共培养时，无法诱导GFP表达。这些结果表明BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1和CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197P-D2TMCP-v3链均未功能表达。
结果进一步证明，表达多个包含连接至两条单独链的vL和vH片段的双链构建体的JNG细胞能够在与它们的同源抗原表达细胞共培养时诱导GFP表达。示例性的此类构建体由2275-2278、2280-2282、2319、2321、2300、2323-2326代表。这些结果表明，vL和vH片段可以组装形成功能性Fv，即使它们连接到两条单独的链上，也能够与同源抗原结合并传递信号。当两条链结构不同并且不知道异二聚或同二聚时，就会观察到这种情况。示例性的此类双链异二聚构建体由SEQ ID NO:2276、2280、2323-2326表示。
结果进一步证明，与编码CD16的完整胞外、跨膜和胞质结构域(例如SEQ ID NO：3843、3853和3863)的SAR构建体相比，包含一条或两条链的SAR构建体显示出对NFAT驱动的GFP的强烈诱导表达。缺少CD16的第一Ig结构域(例如SEQ ID NO：3844、3854和3864)的CD16链。此外，包含编码CD16的整个胞外、跨膜和胞质结构域(例如SEQ ID NO：3843、3853和3863)的CD16一条或两条链的SAR构建体通常显示出更强的NFAT驱动的GFP诱导表达。类似地，表达包含由SEQ ID NO:3763或3769表示的NKp30的完整胞外、跨膜和胞质结构域(例如，NKp30-ECDTMCP-opt1或opt2)的SAR构建体(例如，SEQ ID NO:2297)的JNG细胞显示出强的当与其同源抗原表达细胞系共培养时，诱导NFAT驱动的GFP表达。
表54
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构建了多个删除TCRα、β、γ和δ链的双链SIR，并在JNG细胞中表达。如下表所示，令人惊讶的是，具有缺失TCRα、β、γ或δ链(SEQ ID NO：7619-7625)的SIR在JNG细胞中表达时表现出强NFAT-GFP活性。因此，缺失TCRα、β、γ或δ链的SIR在JNG细胞中表达时表现出强NFAT-GFP活性。δ链可用于生成具有不同表达和信号活性的多样化SIR组，以产生多样化的免疫反应。表55
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诱导NFAT启动子驱动GFP表达。Jurkat-NFAT-GFP(JNG)细胞用编码不同CD16-SAR构建体的慢病毒载体感染，其中包含scFv或vHH结构域作为抗原结合结构域，CD16A-F158V-S197P-FL-v3作为信号链。细胞扩增4天，无需药物选择。将对照JNG细胞和表达SAR的JNG细胞与表达其同源抗原的不同靶细胞系共培养约24小时。因此，表达靶向CD19的SAR的JNG细胞与表达CD19抗原的细胞系RAJI共培养，并通过使用流式细胞术测量GFP表达的诱导来测定它们结合靶抗原并诱导细胞信号传导的能力。结果表明，当与表达靶抗原的细胞系共培养时，表达不同SAR的JNG细胞会诱导NFAT驱动的GFP表达。当用临时申请的表36-38中列出的其它CD16 SAR构建体重复实验时，获得基本上相似的结果。
表56
生成表达不同SAR构建体的JNG和NK92细胞，并使用表达其靶抗原的细胞系进行NFAG-GFP测定和细胞毒性测定(MATADOR测定)测试，如前面部分所述。下面提供了用其SEQID NO和靶抗原表示的不同SAR构建体的结果的总结。Matador测定中的倍数诱导计算为与与对照NK92细胞共培养时观察到的荧光素酶活性相比，靶细胞与表达SAR的NK92细胞共培养时荧光素酶活性的增加。以0.3:1至1:1之间的E:T比例进行共培养测定2小时。
表57
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表达CD19靶向SAR的NK92细胞对表达CD19的NALM6和RAJI细胞具有细胞毒性
NK92细胞用编码所示CD19靶向SAR构建体的慢病毒载体感染。在嘌呤霉素中选择细胞。将亲本NK92细胞或表达SAR的NK92细胞与稳定表达Gluc的指定靶细胞系以0.25:1的效应器:靶标(E:T)比例共培养4小时，一式两份。在共培养期结束时，添加CTZ测定缓冲液后通过Matador测定测量Gluc活性。结果显示，与表达不同CD19靶向SAR的NK92细胞共培养后，含有Nalm6-Gluc和RAJI-Gluc细胞的培养物中的Gluc活性出现特异性增加。相反，在含有缺乏CD19表达的RAJI-CD19-KO、U927和THP-1细胞的培养物中，GLuc活性没有显著增加。这证明了该测定的特异性。表达常规二代CAR(SEQ ID NO：5441)的NK92细胞对Nalm6和RAJI细胞显示出最高的细胞毒性，但也对RAJI-CD19-KO、U937和THP-1细胞显示出非特异性细胞毒性。
表58 MATADOR测定法
MATADOR检测
NK92亲代细胞和表达指定SAR和RS4；11-Gluc靶细胞的NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果如图6所示，并显示SEQ ID NO：7695、7692和7607的SAR有效诱导细胞死亡。
MATADOR检测
NK92亲代细胞和表达指定SAR和RS4；11-Gluc靶细胞的NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果显示在图7中并且显示具有SEQ ID NO:7679的SAR有效诱导细胞死亡。
MATADOR检测
将表达指定SAR和L363-Gluc靶细胞的NK92亲代细胞和NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果显示在图8中并且显示具有SEQ ID NO:7679的SAR有效诱导细胞死亡。
MATADOR检测
NK92亲代细胞和表达指定SAR和RS4；11-Gluc靶细胞的NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。如图所示，包含hu-mROO5-1-scFv、CD28铰链区和NKp44-Hinge-TMCP或NKp46-Hinge-TMCP的两种SAR构建体均诱导有效的细胞死亡。结果如图9所示。
MATADOR检测
NK92亲代细胞和表达指定SAR和RS4；11-Gluc靶细胞的NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果如图10所示
MATADOR检测
将表达指定SAR和L363-Gluc靶细胞的NK92亲代细胞和NK92细胞以0.3:1和1:1的E:T比例共孵育，每种情况下分别为5，000:15，000个细胞和15，000:15，000个细胞。NK92和NK92-SAR细胞还共表达膜锚定形式的IL2(SEQ ID NO：7133)。孵育2小时后，使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果如图11所示。
MATADOR检测
NK92细胞被工程化以表达SAR构建体NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her2-47D5-vHH-Mlu-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:7696)和NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her3-21F06-vHH-Mlu-F-F2A-Xba-PAC(SEQ ID NO:7697)。将NK92亲代细胞和表达SAR的NK92细胞与SKOV3-Gluc靶细胞以1:1的E:T比例共培养。使用Matador测定法通过添加coeleterazine来测量细胞死亡。结果显示，与表达具有SEQ ID NO：7696和7697的SAR构建体的NK92细胞共培养后，Gluc活性增加，反映了细胞死亡的诱导。
SAR-NK细胞
靶向NY-ESO1(157-165)肽(SEQ ID NO:10880)的NY-ESO1-四聚体-APC(HLA-A*02:01人NY-ESO1 157-165C165V APC标记四聚体)获自NIH四聚体设施。用嘌呤霉素选择感染NY-ESO1-SIR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO：9366)的JNG细胞。将稳定细胞用NY-ESO1-四聚体-APC(HLA-A*02:01人NY-ESO1 157-165C165V APC标记四聚体)在室温、黑暗中染色30分钟，并通过流式细胞术进行分析。与JNG-UI细胞(1.42％)相比，表达NY-ESO1 SAR的JNG细胞呈APC阳性(10％)。类似地，与293FT未转染细胞(0.97％)相比，用NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)瞬时转染并用NY-ESO1-四聚体-APC染色的293FT细胞为52.3％APC阳性。使用其中SAR的Va结构域被不同的Va结构域(SEQ ID NO：8514)替换的构建体重复该实验。用该SAR构建体转染的293FT细胞显示出NY-ESO1-四聚体-APC染色率超过70％，表明该平台可用于构建具有TCR样结合能力并包含不同可变域的不同SA R。接下来，NY-ESO1-SIR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO：9366)构建体的接头结构域(即TCRa-Ig3和TCRb-Ig3)和信号模块(例如CD3zECDTMCP-opt和CD3zECDTMCP opt2)被替换由不同的接头(例如，IgCL、IgG-CHI等)和包含不同信号传导适配器及其变体和片段的信号传导模块组成。所得SAR构建体由SEQ ID NO：9427-9434表示。当转染293FT细胞时，该构建体显示出NY-ESO1-四聚体-APC的染色增强。靶向NY-ESO1并包含不同主链的其它示例性构建体由SEQ ID NO：9356-9426表示并进行类似测试。uTCR-SAR构建体靶向MAGE-A3(112-120)/HLA-A2(SEQ ID NO:9439-9506,9517-9518)，同样使用从NIH四聚体设施获得的MAGE-A3(112-120)-四聚体-APC进行测试。
THP-1细胞用编码uTCR-SAR NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO：9366)的慢病毒载体稳定转导。细胞显示NY-ESO1-四聚体-APC染色增加，表面NY-ES O1/HLA-A2复合物表达的靶细胞吞噬作用增加。
使用编码NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO：9366)的浓缩慢病毒载体感染NK92细胞系、原代T细胞和原代NK细胞。感染后，细胞用如上所述的NY-ES O1-四聚体-APC染色。NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)的表达导致NK92细胞系中的APC+ve细胞从4.93％增加至84.06％，在原代NK细胞中从3.3％增加至10.98％，并且在原代T细胞从29％增加到59.3％。这些结果表明NY-ESO1-SAR可以在多种细胞系中功能性表达，包括T细胞和非T细胞，并且可以赋予这些细胞类似TCR的结合能力。
将表达NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)的NK92、原代NK和原代T细胞在补充有50IU/ml IL2的XVIVO培养基中生长1天。在存在和不存在NYESO肽(10μM)、CD28激动剂抗体(1μg/ml)、NY-ESO-1肽+CD28抗体的情况下与表达GLuc的T2-细胞进行共培养。T2细胞在37℃下负载NY-ESO1肽30分钟。此外，用慢病毒载体(020122-BBjV1)感染的T2细胞作为对照，所述慢病毒载体表达外源HLA-A2编码序列以及NY-ESO-1编码序列。此外，表达Gluc的L363(NY-ESO1+/HLA-A2+)和U266(NY-ESO1+/HLA-A2+)细胞。包括用020122-BBjV1载体转导的L363和U266细胞。所有靶细胞和效应细胞均以E:T比例1:1铺在白色384孔板中，在不含任何补充剂的XVIVO培养基中培养4小时。靶细胞以10，000个细胞/孔在30μl培养基中使用。使用自动分配器在井模式下注射15μl 1:100CTZ测定缓冲液(溶于PBS)后进行Matador测定。读取发光5秒。结果显示，与NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)感染的U266-Gluc细胞培养中，NK92、初级NK和初级T细胞的Gluc活性显著增加，反映出细胞死亡。Gluc活性从NK92培养物中的23356增加到表达NY-ESO1-SAR的NK92中的334646。Gluc活性从原代NK细胞培养物中的17788增加到表达NY-ESO1-SAR的原代NK细胞中的162764。Gluc活性从原代T细胞培养物中的2183增加到表达NY-ESO1-SAR的原代T细胞中的491493。同样，与未感染的对照细胞相比，在NK92、原代NK和原代T细胞中的表达NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)显示出对L363细胞和稳定转导020122-BBjV1载体的L363细胞增加的细胞毒性。最后，相对于已经加载肽的T2细胞，在NK92和原代NK细胞中表达NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)表现出对已加载NY-ESO1肽的T2细胞相比，对已负载NY-ESO1肽的T2细胞的细胞毒性增加。
将对照T2细胞或已负载NY-ESO1肽的T2细胞以50K细胞/孔铺在96孔U底板中的100μl培养基中。以1:1的E:T比例添加对照效应细胞(NK92和原代T细胞)或已用NY-ESO1-SAR编码慢病毒载体(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)感染的效应细胞。24小时后，收集上清液用于ELISA。结果显示，当与NK92细胞和表达NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7；SEQ ID NO:9366)的原代T细胞共培养时，负载NY-ESO1肽的T2细胞中IFNγ和TNFα的产生增加。与未感染的对照细胞相比(图13)。这种效应是加载了NY-ESO1肽的T2细胞所特有的，并且在未加载NY-ESO1肽的T2细胞中未观察到相同程度的效应。
NK92、原代NK和原代T细胞被表达uTCR-SAR CD8SP-MAGE-A3-112-120-Vb-TCRb-S57C-ECD-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-MAGE-A3-112-120-Va-TCRa-T48C-ECD-CD3zECDTMCP-opt2(SEQ ID NO:9450)的慢病毒构建体感染，靶向MAGE-A3肽(112-120)与HLA-A2复合物。使用已负载MAGE-A3肽(SEQ ID NO：10879)的T2细胞如上所述重复该实验。与与未转导细胞共培养相比，与uTCR-SAR表达细胞共培养可导致细胞毒性和细胞因子(IFNγ和TNFα)产量增加。未负载肽的T2细胞作为阴性对照。
基本上与上述类似的方法可用于生成表达uTCR-SAR的初级巨噬细胞，其靶向NY-ESO1、MAGE-A3和其它细胞内肽抗原。
本质上，可以使用与上述类似的方法来生成和测试针对其它肽抗原的uTC R-SAR。提供了几个另外的示例性单特异性和双特异性uTCR-SAR构建体的SEQ ID，所述uTCR-SAR构建体包含靶向NY-ESO1、MAGE-A3、MC7.G5(不依赖于HLA的TC R)和Vd2/Vg9(γδTCR)的TCR的可变结构域SEQ ID NO：9355-9602。这些构建体可以在原代NK细胞、原代T细胞、NK细胞系、iPSC细胞、造血细胞和其它效应细胞(例如CIK、记忆性NK、g-NK树突细胞等)中表达，并使用技术测试其活性。本领域已知。
THP-1细胞上CD19靶向SAR的表达
从ATCC获得的THP-1(单核细胞)细胞用编码针对CD19的所示SAR构建体的慢病毒载体感染。在嘌呤霉素中选择细胞。如前所述使用FLAG-CD19-ECD-GG SG-NLuc-AcV5(SEQID NO:3675)通过Topanga法检测了表达CD19的SAR的THP-1细胞结合CD19胞外结构域的能力(Gopalakrishnan,R等，Sci。报告，9:1957,2019)。结果显示与亲代THP-1细胞相比，CD19Topanga试剂与表达由SEQ ID NO:2312、2291、5138、2313表示的SAR的THP-1细胞的结合增加。这些结果表明，这些SAR可以在单核细胞谱系的THP-1细胞表面功能性表达，并显示出与CD19靶抗原的结合增加。
表59
表达CD19靶向SAR的THP-1细胞表现出CD19+RAJI细胞的吞噬作用增强
7.5 x 104THP-1细胞分化为单核细胞/巨噬细胞谱系。48小时，一式三份，分两组。细胞贴壁并洗涤两次。然后将7.5 x 1104RAJI-Nluc和RAJI-CD19-KO-Nluc细胞靶细胞添加至适当的孔中3-4小时。除去悬浮细胞并将板洗涤两次。加入500μL EDTA的PBS溶液，在37℃下孵育5分钟。刮下细胞，放入试管中，在4℃下以1000rpm旋转5分钟。除去PBS，并用100μL1x Renilla Luciferase Assay裂解。将缓冲液(Promega)添加到管中并在冰上孵育10分钟。样品在4℃下以12，000转旋转10分钟。一式三份收集25μL上清液，加入25μL CTZ(腔肠素)测定缓冲液，并使用读板器测量发光。如下表60所示，与RAJI细胞共培养后，与THP-1亲本细胞相比，表达具有SEQ ID NO：2291和5138的SAR的THP-1细胞显示出更高的NLuc活性。这些结果表明表达CD19-TARGETED-SAR的THP-1细胞对表达CD19的RAJI细胞的吞噬作用增加。相反，在与缺乏CD19表达的RAJI-CD19-KO细胞共培养后，与THP-1亲本细胞相比，表达具有SEQ ID NO:2291和5138的SAR的THP-1细胞显示出NLuc活性没有增加。
表60
多用途开关的表达
NK92细胞用编码SAR的慢病毒载体和共表达包含不同膜锚定细胞因子或多用途开关的辅助模块稳定转导。表达Synth-IL2-tBCMA-L24多用途开关的示例性构建体由SEQ IDNO:8509-8512表示。感染后将NK92细胞从IL2中取出。当在缺乏IL2的培养基中生长时，由SEQ ID NO:7133-7137、7151-7157和8529-8534为代表的辅助模块的共表达导致NK92细胞生长时存活，而未转导的对照NK92细胞死亡。通过Matador测定测量，表达不同SAR构建体的NK92细胞显示出强大的SAR表达和活性。将表达代表IL2-tHer2(SEQ ID NO:8533)、IL2-RQR8(SEQ ID NO:8529)和IL2-tBCMA(SEQ ID NO:7151)的多用途开关的NK92细胞用赫赛汀、利妥昔单抗和J6MO抗体染色，分别与Her2、RQR8和BCAM结合，并发现显示阳性染色。此外，表达IL2-RQR8(SEQ ID NO：8529)的NK92细胞也显示出用结合CD34的QBEND-10抗体染色。当使用上述抗体检测时，表达上述多用途开关的JNG细胞也显示出多用途开关的细胞表面表达。这些结果表明，可以通过用与多用途开关结合的抗体染色然后进行细胞分选(例如流式分选或磁力分选)来检测、分离和纯化SAR表达细胞。这些结果进一步表明，可以通过用与多用途开关结合的抗体染色、随后使用细胞分选(例如流式分选或磁力分选)进行阴性选择来消除SAR表达细胞。此外，表达多用途开关的细胞可通过与开关结合的抗体(例如赫赛汀、利妥昔单抗、J6M0或BCMA-ADC)处理而被杀死。
还观察到，对于那些使用短内部启动子(例如EFS、EFS2、RSV等)表达辅助模块的构建，SAR和辅助模块的优异表达。这在具有两条链的SAR构建中特别明显。这在具有两条链的SAR构造的情况下尤其明显。
使用针对多种抗原的自体SAR-T细胞进行过继细胞治疗。患者患有多种不同的疾病，包括传染病(如HIV1、EBV、CMV、HTLV1等)、退行性疾病(如阿尔茨海默病)、自身免疫性疾病(如寻常型天疱疮)、过敏性疾病(如慢性特发性荨麻疹)多种癌症被纳入IRB批准的I期免疫治疗临床试验，该试验采用过继转移的自体SAR-T细胞针对不同的致病或疾病相关抗原。不同疾病的SAR是根据其靶抗原在致病细胞或疾病相关细胞中的已知表达来选择的。在可能的情况下，通过与ABD-GGS-NLuc融合蛋白结合来确认SAR靶标在致病细胞或疾病相关细胞上的表达，其中SAR的抗原结合结构域通过柔性接头与NLuc蛋白的非分泌形式融合。或者，使用市售抗体的免疫组织化学或流式细胞术可用于确认SAR靶标在致病细胞或疾病相关细胞上的表达。使用白细胞分离术从受试者收集T细胞，用适当的SAR编码慢病毒载体转导，并使用CD3/CD28珠子进行离体扩增。所得细胞产品经过质量控制测试(包括无菌和肿瘤特异性细胞毒性测试)后，将其冷冻保存。同时，研究参与者开始进行淋巴细胞清除化疗(30mg/m 2/天氟达拉滨加500mg/m 2/天环磷酰胺×3天)。完成淋巴细胞清除方案一天后，研究参与者接受静脉注射转导淋巴细胞，然后每8小时注射一次高剂量(720，000IU/kg)IL-2(Aldesleukin；Prometheus，San Diego，CA)直至耐受。先前储存的SAR-T细胞产品在患者床边进行运输、解冻和输注。根据研究方案，SAR-T产品的剂量从1x 10 4SAR+ve CD3细胞/kg到5x 10 9SAR+ve CD3细胞/kg不等。SAR-T产品可以单次输注或分次输注形式施用。研究参与者可以在T细胞输注前至少30分钟预先注射15mg/kg对乙酰氨基酚PO(最大剂量650mg)和苯海拉明0.5-1mg/kg IV(最大剂量50mg)。研究参与者可以选择每天注射人IL-2。然后可以根据医生的判断进行临床和实验室相关的随访研究。
使用同种异体SAR-T细胞进行过继细胞治疗。接受同种异体骨髓移植的复发性急性淋巴细胞白血病或高危中级B细胞淋巴瘤患者可以接受过继转移的同种异体SAR-T细胞的免疫治疗。使用Miltenyi Biotec的CliniMACS系统并遵循制造商的建议，从供体(与用于同种异体移植的供体相同的供体)收集的白细胞去除术产品经历CD3阳性T淋巴细胞的选择。使用本领域已知的技术通过CRISP9介导的敲除消除TRAC和β2M的表达，并且选择缺乏TCR/CD3复合物和HLA的细胞表面表达的T细胞。使用基于CD3和CD28磁珠的人工抗原呈递细胞激活细胞并用临床级CD20靶向SAR病毒(例如，CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:5047))。细胞在封闭系统中扩增9-12天。所得细胞产品经过质量控制测试(包括无菌和肿瘤特异性细胞毒性测试)后，进行冷冻保存。同时，研究参与者开始进行淋巴细胞清除化疗(30mg/m2/天氟达拉滨加500mg/m2/天环磷酰胺x3天)。完成淋巴细胞清除方案一天后，研究参与者接受静脉输注转导淋巴细胞，然后接受高剂量(720，000IU/kg)IL-2(Aldesleukin；Prometheus，San Diego，CA)每8小时一次，直至耐受。SAR-T细胞产品在患者床边运输、解冻和输注。根据研究方案，SAR-T产品的剂量可能在1x104SAR+ve CD3细胞/kg至5x109SAR+ve CD3细胞/kg。SAR产品可以单次输注或分次输注形式施用。研究参与者可以在SAR-T细胞输注前至少30分钟预先注射15mg/kg对乙酰氨基酚PO(最大剂量650mg)和苯海拉明0.5-1mg/kg IV(最大剂量50mg)。然后可以根据医生的判断进行临床和实验室相关的后续研究，并且可能包括针对表达CD20的ALL/淋巴瘤细胞和/或过继转移的T细胞的存在进行定量RT-PCR研究；FDG-PET和/或CT扫描；骨髓检查以进行疾病特异性病理评估；淋巴结活检；和/或根据FDA生物反应调节剂咨询委员会制定的适用于基因转移研究的指南进行长期随访。免疫抑制药物的使用也由医生决定。基本上类似的方法可用于使用表达本公开内容的SAR的同种异体免疫细胞(例如，T细胞)来治疗其它疾病，其中SAR靶向在引起疾病的细胞或疾病相关细胞上表达的一个或多个抗原。本质上，类似的协议用于测试表36-38中列出的其它SAR构造。
使用表达SAR的自体或同种异体NK细胞
从供体(与用于异基因移植的相同供体)采集的白细胞分离产品在遵循MiltenyiBiotec的CliniMACS系统制造商建议的步骤下，通过ClIniMACS/> 系统进行NK细胞选择。NK细胞用hIL2激活3-5天，然后用编码CD20靶向的SAR(例如，CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:5047)的慢病毒载体转导。慢病毒还编码膜锚定形式的IL2(SEQ ID NO:1330)。NK细胞在表达人CD20的人工抗原呈递K562细胞(aAPC)的存在下离体扩增15天，其中50单位/mL的hIL-2。所得细胞产品经过质量控制测试(包括无菌和肿瘤特异性细胞毒性测试)后，进行冷冻保存。同时，研究参与者开始进行淋巴细胞清除化疗(30mg/m2/天氟达拉滨加500mg/m2/天环磷酰胺x3天)。完成淋巴细胞清除方案一天后，研究参与者接受静脉注射转导的NK细胞，然后每8小时接受高剂量(720,000IU/kg)IL-2直至耐受。NK细胞产品在患者床边运输、解冻和输注。根据研究方案，SAR-NK产品的剂量可能从1x 10 4SAR+ve NK细胞/kg到5x 10 9SAR+ve NK细胞/kg不等。SAR-NK产品可以单次输注或分次输注形式施用。
表达SAR的iPSC衍生NK细胞的生成
CD19-靶向的SAR构建体CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQID NO:5042)将在两种不同的脐带干细胞来源的iPSC细胞系(606A1、NCRM-1)和外周血来源的iPSC细胞系(648A1)中表达。通过与Topanga试剂结合和使用抗FLAG-FITC的FACS确定的表达SAR的单细胞克隆将被分离、扩增并进行QC分析(例如，染色体完整性、多能性、身份确认、支原体和无菌性)。从每个iPSC细胞系中提取的几个独立克隆将被冷冻在液氮中，作为主细胞库。
从iPSC和SAR转染的iPSC衍生NK细胞将使用本领域已知的方案进行。简而言之，将3，000个TrypLE适应的iPSC接种到96孔圆底板中，其中含有APEL培养物，其中含有40ng/ml人干细胞因子(SCF)、20ng/ml人血管内皮生长因子(VEGF)和20ng/ml重组人骨形态发生蛋白4(BMP-4)。造血分化第11天后，将通过流式细胞术评估细胞的CD34+/CD43+和CD34+/CD45+的造血祖细胞。
然后在NK细胞培养条件下将旋转胚状体(EB)直接转移到未包被的24孔板的每个孔中。然后，使用5ng/mL IL-3(仅限第一周)、10ng/mL IL-15、20ng/mL IL-7、20ng/mL SCF和10ng/mL flt3，细胞进一步分化为NK细胞配体28-32天。每周进行一次半介质更换。将收获NK细胞用于在50单位/mL hIL-2存在下使用表达人CD19的表达人工抗原呈递K562细胞(aAPC)的经辐照的mbIL-21进行扩增。使用Matador测定进行体外效力测试后，这些细胞将用于在NSG小鼠中使用NALM6异种移植模型进行体内研究。经过额外的无菌和效力测定后，这些细胞将用于治疗表达CD19的B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的人体临床试验。
基本上类似的程序将用于使用本领域已知的用于将iPSC分化成T细胞的方案来生成表达本公开内容的SAR的iPSC衍生的T细胞。
表达SAR的NK92细胞的生成和使用
cGMP级NK92细胞将用编码CD20靶向的SAR的慢病毒载体(例如CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO：5047))转导。慢病毒还编码膜锚定形式的IL2(SEQ ID NO：1330)。NK92细胞在表达人CD20的人工抗原呈递K562细胞(aAPC)和50单位/mLhIL-2的存在下离体扩增15天。细胞将接受γ射线照射。所得细胞产品经过质量控制测试(包括无菌和肿瘤特异性体外和体内细胞毒性测试)后，细胞将被冷冻保存。同时，研究参与者开始进行淋巴清除化疗(30mg/m2/天氟达拉滨加500mg/m2/天环磷酰胺x 3天)。完成淋巴细胞清除方案一天后，研究参与者接受静脉注射转导的NK92细胞。SAR-NK产品的剂量可能根据研究方案从1x 10 4SAR+ve NK92细胞/kg至5x 10 9SAR+ve NK92细胞/kg。SAR-NK92产品可以单次输注或分次输注形式施用。
生成表达SAR的造血干细胞
从G-CSF动员的白细胞去除术产物中纯化CD34阳性造血干细胞，并用编码由CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:5042)使用US10660919中描述的技术任选地消除造血干细胞中内源CD19的表达。受试者接受清髓性化疗，然后输注基因修饰干细胞。基本上类似的方法用于表达CD33靶向的SAR(例如SEQ ID NO：4871)并结合消除造血干细胞中的内源CD33。基本上类似的方法用于表达MPL靶向的SAR(例如SEQ IDNO：4919)并结合消除造血干细胞中的内源MPL。
表达SAR的巨噬细胞/单核细胞的产生和使用由CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(SEQ ID NO:5042)代表的CD19靶向SAR在巨噬细胞/单核细胞中表达，并使用所述方法用于治疗表达CD19的淋巴瘤在WO2019152781中。
SAR-T/NK细胞肝动脉输注。除了静脉输注外，SAR-T和SAR-NK细胞还可以动脉内输注，以便在与疾病有关的局部区域或器官中提供高浓度的SAR表达细胞。
SAR-T/NK细胞腹膜内给药。SAR-T/NK细胞也可以腹膜内施用，基本上如(Koneru M等人；Journal of Translational Medicine；2015；13:102)中所述。
使用SAR-T/NK细胞进行瘤内注射。SAR-T/NK细胞也可以在肿瘤内施用，基本上如(Brown CE等人，Clin Cancer Res.2015年9月15日；21(18)：4062-4072)中所述。
不同SAR表达细胞的组合
患者可以接受靶向一种或多于一种抗原的不同SAR表达细胞的组合。例如，患者可以接受靶向CD19的SAR-T和靶向CD20的SAR-NK以及靶向CD22的SAR-巨噬细胞。或者，受试者可以接受靶向CD19的SAR-T、靶向CD19的SAR-NK细胞和靶向CD19的SA R-巨噬细胞。
SAR的组合可用于微调免疫反应，以便仅在达到阈值效应时才触发信号传导。因此，当暴露于表达BCMA和CD19两者的细胞时，表达具有SEQ ID NO:7601的靶向BCMA的SAR和具有SEQ ID NO:7607的靶向CD19的SAR的NK细胞可以显示相加或协同效应。附加/协同效应可以通过靶向不同抗原(例如BCMA和CD19)来实现。另一种实现相加/协同效应的方法是通过包含不同信号链的不同SAR受体靶向相同抗原。例如，表达具有SEQ ID NO:7607(CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)的CD19-SAR的NK细胞也可以共表达另一种CD19-SAR具有SEQ ID NO:7676(CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC)。在替代实施例中，两个SAR可以靶向相同抗原的不同表位。例如，表达具有SEQ ID NO:7607(CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)的CD19-SAR的NK细胞也可以共表达另一种CD19-SAR具有SEQ ID NO:7660(FMC64-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PA C)或具有SEQ ID NO:7668(hCD19-Bu12-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC)的CD19-SAR。
在另一个实施方案中，包含CD16信号传导链的SAR可以与包含NKp30、NKp44、NKp44、NKG2D、Dap10和/或CD3z信号传导链的SAR组合以具有相加/协同效应。在另一个实施方案中，包含NKp30信号链的SAR可以与包含CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、Dap10和/或CD3z信号链的SAR组合以具有相加/协同效应。类似地，包含NKp44信号链的SAR可以与包含CD16、NKp30、NKp46、NKG2D、Dap10和/或CD3z信号链的SAR组合以具有相加/协同效应。类似地，包含NKp46信号链的SAR可以与包含CD16、NKp30、NKp44、NK G2D、Dap10和/或CD3z信号链的SAR组合以具有相加/协同效应。类似地，包含DAP10信号链的SAR可以与包含CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和/或CD3z信号链的SAR组合以具有相加/协同效应。类似地，包含CD3z信号链的SAR可以与包含CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和/或DAP10信号链的SAR组合以具有相加/协同效应。类似地，包含NK G2D信号链的SAR可以与包含CD16、NKp30、NKp44、NKp46、CD3z和/或DAP10信号链的SA R组合以具有相加/协同效应。

Claims (245)

1.一种与目标抗原特异性结合的合成抗原受体(SAR)，该SAR包含：
(i)选自以下的异源抗原结合结构域的第一模块：
a)抗体；
b)抗体片段；
c)抗体的重链可变区(vH结构域)或其片段；
d)抗体的轻链可变区(vL结构域)或其片段；
e)单链可变片段(scFv)或其片段；
f)单结构域抗体(SDAB)或其片段；
g)vHH结构域或其片段；
h)抗体的单体可变区；
i)单个vH结构域(SVH)或其片段；
j)单个vL结构域(SVL)或其片段；
k)非免疫球蛋白抗原结合支架，选自DARPIN、affibody、affilis、adnectin、affitin、obody、repebody、fynomer、alphabody、avimer、atrimer、centyrin、pronecti、anticalins、kunitz结构域、犰狳重复蛋
白、D结构域、以及任何上述的片段；
l)受体或其片段的配体结合结构域；
m)配体的受体结合结构域；
n)双特异性抗体、-抗体片段、-scFV、-vHH、-SDAB、-非免疫球蛋白抗原结合支架、-受体或-配体；
o)自身抗原或其片段；
p)适配器结合结构域或其片段；
q)Fc结合结构域或其片段；
r)TCR或HLA非依赖性TCR或其片段；和
s)TCR的Va、Vb、Vg或Vd片段或其片段，
(ii)第二模块，其包含至少一个膜相关结构域，其中所述膜相关结构域可以是跨膜结构域或膜锚定结构域；和
(iii)任选的第三模块，其包含一个或多个胞质结构域，其中第一、第二和可选的第三模块通过一个或多个可选的接头可操作地连接。
2.根据权利要求1所述的单链SAR，其中包含一个或多个异源抗原结合结构域的所述第一模块经由任选的接头可操作地连接至包含以下的多肽：
(1)天然存在的受体或其片段或变体的完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
(2)天然存在的受体或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
(3)天然存在的受体或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
(4)天然存在的受体或其片段或变体的胞质结构域；或者
(5)信号传导适配器或其变体或片段的整个或部分胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
3.根据权利要求2所述的SAR，其中
a)所述天然存在的受体不包含选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和preTCRα的T细胞受体；和/或
b)天然存在的受体不包含T细胞受体模块(TCRM)；和/或
c)信号传导适配器不是选自CD3δ、CD3γ、CD3ε和CD3δ的组的CD3适配器；
和/或
d)信号传导适配器不是FcRγ。
4.根据权利要求2或3所述的SAR，其中所述天然存在的受体是具有N端胞外结构域的I型膜蛋白，并且包含一个或多个异源抗原结合结构域的多肽的N端通过任选的接头可操作地连接至包含以下的多肽的N端或N端附近
a)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
b)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
c)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
d)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的胞质结构域。
5.根据权利要求4所述的SAR，其中所述天然存在的I型受体膜蛋白选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、LAIR1、及其变体和片段。
6.根据权利要求2或3所述的SAR，其中所述天然存在的受体是具有C端胞外结构域的II型膜蛋白，并且编码一个或多个异源抗原结合结构域的多肽的N端通过任选的接头可操作地连接至多肽的C端或C端附近的，包含：
a)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的完整或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
b)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的铰链结构域、跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
c)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的跨膜/膜相关结构域和任选的胞质结构域；或者
d)天然存在的受体多肽链或其片段或变体的胞质结构域。
7.根据权利要求6所述的SAR，进一步包含多肽的N末端，所述多肽包含可操作地连接至所述II型膜蛋白的N末端的信号传导适配器的胞质结构域。
8.根据权利要求7所述的SAR，其中所述信号传导适配器选自CD3δ、FcRγ、DAP10或DAP10的组。
9.根据权利要求8所述的SAR，其进一步包含多肽的N末端，所述多肽包含可操作地连接至所述信号传导适配器的胞质结构域的N末端的一个或多个共刺激结构域。
10.根据权利要求9所述的SAR，其中所述一个或多个共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM和ICOS。
11.根据权利要求10所述的SAR，其与包括DAP10的辅助模块共同表达。
12.根据权利要求6-10中任一项所述的SAR，其中所述天然存在的II型受体膜蛋白选自NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、KLRG1、CD94、CD161、其变体及其片段。
13.根据权利要求3所述的SAR，其中所述全部或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域全部衍生自单一天然存在的受体并且存在于一条连续的多肽链中。
14.根据权利要求2所述的SAR，其中所述全部或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域衍生自两种或更多种不同的天然存在的受体。
15.根据权利要求14所述的SAR，其中
a)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同天然存在的受体的任选的铰链结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域；或者
b)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域和任选的铰链结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同的天然存在的受体的跨膜结构域和任选的胞质结构域；或者
c)天然存在的受体的全部或部分胞外抗原结合结构域、任选的铰链和跨膜结构域可操作地连接至衍生自一种或多种不同的天然存在的受体的胞质结构域。
16.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域包括含有ITAM的激活结构域。
17.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域缺少包含ITAM的激活结构域。
18.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域募集选自CD3z、FcRγ、DAP10和/或DAP10中的一种或多种信号传导适配器。
19.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域包含一个或多个共刺激结构域。
20.根据权利要求2所述的SAR，其中所述一个或多个共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM、ICOS、其变体及其片段。
21.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域缺乏共刺激结构域。
22.根据权利要求2所述的SAR，其中所述胞质结构域包含位于所述跨膜结构域和所述激活结构域之间的一个或多个共刺激结构域。
23.根据权利要求2所述的SAR，其中所述天然存在的受体选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、其变体及其片段。
24.根据权利要求2和3所述的SAR，其中所述SAR部分或完全保留天然存在的受体的胞外抗原结合结构域的抗原结合特性，并获得位于第一模块中的一个或多个异源抗原结合结构域的抗原结合特异性。
25.根据权利要求1所述的SAR，其当在细胞表面上表达时能够赋予所述细胞MHC(或HLA)依赖性和/或MHC(或HLA)非依赖性抗原识别，并且其中
a)SAR的抗原结合结构域不由单个连续的多肽链组成；和/或
b)SAR的抗原结合结构域不是衍生自抗体或抗体片段；和/或
c)SAR不包含T细胞受体模块。
26.根据权利要求25所述的SAR，其中所述SAR的抗原识别结构域衍生自TCR的至少两个可变结构域。
27.根据权利要求26所述的SAR，其中所述两个可变结构域包含选自Vα、Vβ、Vγ、Vδ和preTCRα的至少两个可变结构域的异二聚体。
28.根据权利要求27所述的SAR，其中所述两个可变结构域是Vα和Vβ或Vγ和Vδ。
29.根据权利要求28所述的SAR，其中所述两个可变结构域不通过柔性肽接头连接。
30.根据权利要求29所述的SAR，其不是单链TCR(sc-TCR)。
31.根据权利要求25所述的SAR，其具有两条链并且至少一条链是膜缔合的。
32.根据权利要求31所述的SAR，其中两条链都是膜相关的。
33.根据权利要求25所述的SAR，其能够结合与MHC(HLA)分子复合的肽。
34.根据权利要求25所述的SAR，当其在细胞表面表达时，赋予其在与肽/MHC复合物结合时募集至少一种信号传导适配器的能力。
35.根据权利要求25所述的SAR，当其在细胞表面上表达时，赋予其在与肽/MHC复合物结合时启动至少一种信号传导途径的能力。
36.根据权利要求25所述的SAR，其可以在非T细胞中功能性表达。
37.根据权利要求36所述的SAR，其可以在缺乏功能性CD3复合物表达的细胞中功能性地表达。
38.根据权利要求37所述的SAR，其可以在缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的细胞中功能性表达。
39.根据权利要求36所述的SAR，其能够将类T细胞抗原识别赋予非T细胞。
40.根据权利要求36所述的SAR，其能够将类T细胞抗原识别赋予缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的T细胞。
41.根据权利要求36所述的SAR，其可在抗原识别后赋予非T细胞类T细胞的信号传导。
42.根据权利要求36所述的SAR，其能够向缺乏CD3γ和CD3δ以及CD3ε链的功能性表达的T细胞赋予类T细胞信号传导。
43.根据权利要求222所述的SAR，其可以赋予任何细胞类T细胞抗原识别。
44.根据权利要求1所述的SAR，包括至少两条链，其中
a)第一多肽链包含第一抗原结合结构域和第一膜相关模块(MAM)，所述第一抗原结合结构域包含vL、Vα或Vγ结构域；和
b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块(MAM)，所述第二抗原结合结构域包含vH、Vβ或Vδ结构域；
其中第一抗原结合结构域的vL、Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补vH、Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶标的Fv-或TCR-Fv样抗原结合模块抗原；和
其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)，其能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
45.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一多肽链还包含所述第一抗原结合结构域与所述第一MAM之间的第一肽接头，且所述第二多肽链还包含所述第二抗原结合结构域与所述第二MAM之间的的第二肽接头。
46.根据权利要求45所述的SAR，其中所述第一肽接头和/或第二肽接头单独地包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。
47.根据权利要求46所述的SAR，其中所述第一肽接头和/或第二肽接头单独地包含CH
1、CH2、CH3、CH4或CL抗体结构域或其片段。
48.根据权利要求46所述的SAR，其中所述第一肽接头和/或第二肽接头单独地包含C
α、Cβ、Cγ或CδTCR结构域或其片段。
49.根据权利要求44或45所述的SAR，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链经由一个或多个二硫键连接。
50.根据权利要求45所述的SAR，其中第一和/或第二肽接头包含增加两条多肽链的表达、亲和力和/或配对的突变。
51.根据权利要求45所述的SAR，其中所述第一肽接头和/或第二肽接头包含SEQ IDNO:3536-3569和9627-9631中任一个所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列。
52.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一多肽还包含位于所述第一MAM N端的第一铰链结构域或其片段；和/或其中第二多肽还包含第二MAM N端的第二铰链结构域或其片段。
53.根据权利要求44所述的SAR，其包含所述第一MAM中的残基与所述第二MAM中的残基和/或所述第一铰链域中的残基与所述第二铰链域中的残基之间的二硫键。
54.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一多肽还包含位于所述第一铰链结构域的N端的第一同源抗原结合结构域或其片段，和/或所述第二多肽还包含位于所述第二铰链结构域的N端的第二同源抗原结合结构域或其片段，其中两个同源抗原结合结构域衍生自与相应铰链结构域相同的天然存在的非T细胞受体。
55.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一多肽还包含第一胞质结构域，所述第一胞质结构域包含位于包含所述第一MAM的所述第一跨膜/膜锚定结构域的C端的任选的激活结构域；和/或其中第二多肽还包含第二胞质，所述第二胞质含有位于包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域C端的任选激活结构域。
56.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一多肽链还包含第一附加胞内结构域，所述第一附加胞内结构域包含所述第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列；和/或其中第二多肽链还包含第二附加胞内结构域，其包含包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列。
57.根据权利要求56所述的SAR，其中所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B
4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS，或其变体或其片段。
58.根据权利要求44所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由非T细胞受体和/或信号传导适配器的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成。
59.根据权利要求58所述的SAR，其中所述第一和/或所述第二MAM和所述NTCRM由跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成，所述结构域全部衍生自单个非T细胞受体和/或信号传导适配器或其变体。
60.根据权利要求58所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由衍生自不同非T细胞的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成受体和/或信号传导适配器或其变体。
61.根据权利要求58所述的SAR，其中所述两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上是相同的并且衍生自相同的蛋白质。
62.根据权利要求58所述的SAR，其中所述两个跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的共刺激结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域在序列上不同和/或衍生自不同的蛋白质。
63.根据权利要求58所述的SAR，其中
a)非T细胞受体是天然存在的受体并且选自：CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-
1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD16
0、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、任何上述的变体及其片段；和
b)所述信号传导适配器选自：CD3δ、FcRγ、DAP10、任何前述的变体及其片段。
64.根据权利要求44所述的SAR，其中
a)第一MAM和第二MAM不包含选自CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3δ的CD3链的跨膜结构域和任选的胞质结构域；和/或
b)第一MAM和第二MAM不包含TCR链和CD3链的跨膜结构域；和/或
c)第一MAM和第二MAM不包含CD3z的跨膜结构域。
65.根据权利要求44所述的SAR，其中仅一种MAM衍生自选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和preTCRα的T细胞受体。
66.根据权利要求1所述的SAR，包括至少两条链，其中
a)第一多肽链包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含vL结构域和选自TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ或其变体的第一TCR恒定链；和
b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含vH结构域和选自TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的第二TCR恒定链或其变体；
其中第一TCR恒定链是TCRα恒定链，第二TCR恒定链是TCRβ恒定链，或
其中第一TCR恒定链是TCRβ恒定链，第二TCR恒定链是TCRα恒定链，或
其中第一TCR恒定链是TCRγ恒定链，第二TCR恒定链是TCRδ恒定链，或
其中第一TCR恒定链是TCRδ恒定链，第二TCR恒定链是TCRγ恒定链，或
其中第一TCR恒定链和/或第二TCR恒定链在其N端区域缺乏氨基酸残基
其中vL和vH结构域形成特异性结合靶抗原的Fv样抗原结合模块；和
其中第一TCR恒定链和第二TCR恒定链形成能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器的T细胞受体模块(TCRM)。
67.根据权利要求66所述的SAR，其中
a)TCRα恒定链由SED ID NO(PRT):7863-7963的氨基酸序列或其具有80-99％同源性的序列表示；和
b)由SED ID NO(PRT):7964-8089的氨基酸序列或其具有80-99％同源性的序列表示；和
c)TCRγ恒定链由SED ID NO(PRT)：8091-8191的氨基酸序列或其具有80-99％同源性的序列表示；和
d)TCRδ恒定链由SED ID NO(PRT)：8192-8292的氨基酸序列或其具有80-99％同源性的序列表示。
68.根据权利要求44或66所述的SAR，其中所述第一和/或第二多肽链还包含一个或多个自主抗原结合结构域(AABD)，其连接至第一和/或第二多肽链的N末端或附近第二抗原结合结构域。
69.根据权利要求68所述的SAR，其中所述AABD选自单vH结构域(SVH)、单vL结构域(SVL)、vHH结构域、单结构域抗体、单可变结构域TCR(svd-TCR)、非免疫球蛋白抗原结合支架、受体的配体结合结构域、配体的受体结合结构域、自身抗原、适配器结合结构域、Fc结合结构域、其片段和/或其变体。
70.根据权利要求1所述的SAR，其中所述包含一个或多个异源抗原结合结构域的模块特异性结合选自以下的一种或多种靶抗原：a)细胞表面蛋白抗原，b)肽/MHC复合物，和c)脂质抗原。
71.根据权利要求1所述的SAR，其中所述靶抗原选自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；FmsLike酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)；白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；丝氨酸蛋白酶21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺素；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚基，Beta型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成的癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基-GM1；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类组5，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；GloboH甘油酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；潘联蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ES0-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、PRAME、PSA、ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；幸存下来；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-1或Galectin 8)，T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节器的兄弟)，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；顶体素原结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾无处不在1(RUl)；肾无处不在2(RU2)；豆豆；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有粘蛋白样激素受体样2(EMR2)的EGF样模块；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLLl)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸路易斯抗原)岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRgamma-delta、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFbetaR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、黄体生成素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、鸟苷酸环化酶C(GCC)、桥粒芯糖蛋白3自身抗体(Dsg3)、桥粒芯糖蛋白1自身抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、NECTIN-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道和SAR-CoV2刺突蛋白。
72.根据权利要求1所述的SAR，其中所述编码的SAR多肽包含选自以下的一个或多个异源抗原结合结构域：
(i)重链可变区(vH)，其包含如SEQ ID NO:1中任一个所示的SEQ ID NOS:2682-2918或与其具有至少80％同一性的序列或在三个互补决定区(CDR)中与SEQ ID NOS:2682-2918中任一项或多项中列出的序列具有至少80％同一性的序列2918或SEQ ID NO:2682-2918中任何一个或多个所示序列的三个CDR中具有少于3个取代的序列，或属于属于一个的CDR1、CDR2和CDR3中具有少于3个取代的序列，属于vH且呈现于SEQ ID NO：分别为11593-11829、11830-12066、12067-12303中的CDR2和CDR3，或与SEQ ID NOS:2682-2918中任一项或多项所示序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位的序列，编码与其抗原结合的多肽；
(ii)轻链可变区(vL)，其包含SEQ ID NO:2440-2676中任一项所示的序列或与SEQ IDNO:2440-2676中任一项或多项中所示的序列具有至少80％同一性的序列，或在三个互补决定区(CDR)中与SEQ ID NOS:2440-2676中任何一个或多个所示序列具有至少80％同一性的序列或在三个互补决定区中具有少于3个取代的序列SEQ ID NO:12440-2676中任一个或多个所示序列的CDR或属于vL且在SEQ ID NO:10882-11118中呈现的CDR1、CDR2和CDR3中具有少于三个取代的序列分别为11119-11355和11356-11592，或与SEQ ID NOS:2440-2676中任一个或多个所示序列结合相同靶抗原或靶抗原上相同表位的序列，并且其编码与其抗原结合的多肽；
(iii)单链可变片段(scFv)，其包含在任一个SEQ ID NO:2924-3160中所示的序列或与这些序列至少80％相似性的序列，或者，该scFv具有至少与SEQ ID NO:2924-3160中的序列在六个互补决定区(CDRs)中的序列至少有70％的相似性，或还可以具有与SEQ ID NO:2924-3160中的序列相比，六个CDRs中不超过6个替代物的序列，CDR1、CDR2和CDR3中替换量少于3个的序列，分别属于一个包含scFV的vH，在SEQ ID NOS中表示为11593-11829、11830-12066、12067-12303；轻链CDR1、CDR2和CDR3中替换量少于3个的序列，属于一个包含scFV的vL，SEQ ID NOS:10882-11118、11119-11355和11356-1159，或与相同的目标抗原或目标抗原上相同的表位结合的序列，如SEQ ID NOS:2924-3160中的任何一个或多个序列所述，并且编码与其抗原结合的多肽；
(iv)单域抗体、vHH域、SVH和/或FHVH域，其包含SEQ ID NO:3210-3353、10695-10713中任一个所示的序列或具有至少70％同一性的序列SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中任一项或多项中所示的序列和/或与任一项中所示的序列在三个互补性决定区(CDR)中具有至少70％同一性的序列，或SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中的更多个或在SEQ IDNOS:3210-3353、10695-10713中的任何一个或多个中列出的序列的三个CDR中具有少于3个取代的序列与SEQ ID NOS:3210-3353、10695-10713中任一项或多项中所示的序列结合相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位，并且其编码与其抗原结合的多肽；
(v)由SEQ ID NOS:3366-3377中任一项的多核苷酸或与SEQ ID NOS:3366-3377中任一项或多项中列出的序列具有至少70％同一性的序列编码的非免疫球蛋白支架与SEQ IDNO：3366-3377中任一项或多项所示序列结合相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位；
(vi)受体的配体结合结构域，其包含SEQ ID NO:3378-3395、3880、3882、3886、3893、3896、3897中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且编码与其同源物结合的多肽；
(vii)配体的受体结合结构域，其包含SEQ ID NO:3396-3406、10786-10787中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其同源物结合的多肽；
(viii)适配器结合结构域，其包含SEQ ID NO:3407-3435、10771-10780中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其适配器结合的多肽；
(ix)自身抗原，其包含SEQ ID NO 10788-10791中任一项所示的序列或与其具有至少70％同一性的序列，并且其编码与其自身抗体或产生自身抗体的细胞结合的多肽；
(x)TCR可变区(Va、Vb、Vg或Vd)，其包括以下所述的序列之一(SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782)，或者具有至少70％相似性的序列，或者在三个互补决定区(CDRs)中与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有至少70％相似性的序列，或者在三个CDRs中与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有不到3个替代物的序列，或者与SEQ ID NOs:3357-3364、9606-9614、10781-10782中的序列具有相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位的序列，并编码与其抗原结合的多肽；和
(xi)单可变结构域TCR(svd-TCR)，其包括以下所述的序列之一(SEQ ID NOs:9613-9614)，或者具有至少70％相似性的序列，或者在三个互补决定区(CDRs)中与SEQ ID NOs:9613-9614中的序列具有70-99％相似性的序列，或者在三个CDRs中与SEQ ID NOs:9613-9614中的序列具有不到3个替代物的序列，或者与SEQ ID NOs:9613-9614中的序列具有相同的靶抗原或靶抗原上的相同表位的序列，并编码与其抗原结合的多肽。
73.根据权利要求2或58所述的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器或其片段包含选自SEQ ID NO:3743-3966、3385、3394、7818-7822、9633-9859的序列或与其序列具有70％的同源性的序列。
74.根据权利要求2或58所述的SAR，其中包含天然存在的受体的铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域和/或信号传导导适配器的多肽包含选自SEQ ID NO:9669-9704、3813、8721、8733的序列，和8746或与其序列具有70％同源性的序列。
75.根据权利要求1、2或58所述的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的膜相关结构域包含选自SEQ ID NO:3914-3928、9741-9776、9852-9855的序列或与其序列具有70％的同源性的序列。
76.根据权利要求1、2或58所述的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的胞质结构域包含选自SEQ ID NO:3944-3958、9777-9812、9856-9859或与其序列具有70％同源性的序列。
77.根据权利要求16或55所述的SAR，其中天然存在的受体和/或信号传导适配器的激活结构域包含选自SEQ ID NO：9856-9859和9777的序列或与其具有70％同源性的序列。
78.根据权利要求9、48和56所述的SAR，其中所述共刺激结构域包含选自SEQ ID NO:9807-9810的序列或与其具有70％同源性的序列。
79.根据权利要求1所述的SAR，其进一步包含存在于每条链的N端且任选地包含选自SEQ ID NO:2425-2430的序列的前导序列或信号肽。
80.根据权利要求1所述的分离的SAR多肽，其中所述SAR包含SAR异二聚体。
81.根据权利要求1或80所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述多肽包含通过可裂解接头连接的两条SAR链。
82.根据权利要求81所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是自切割可裂解接头。
83.根据权利要求82所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是2A接头、类似2A接头或其功能等同物中的任何一种或多种。
84.根据权利要求83所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头是T2A接头、P2A、F2A、E2A接头或其功能等同物中的任何一种或多种。
85.根据权利要求84所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头包含SEQ ID No:3627-3632中的任何一个或多个的序列。
86.根据权利要求84所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头任选地在弗林切割位点或弗林样切割位点或其功能等同物之前。
87.根据权利要求86所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头之前的弗林裂解位点包含SEQ ID No:3635-3636中的任何一个或多个的序列。
88.根据权利要求86-87中任一项所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头之前是柔性接头。
89.根据权利要求88所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头之前的柔性接头编码一种或多种Ser-Gly接头或其功能等同物。
90.根据权利要求89所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述可裂解接头之前的柔性接头包含SEQ ID No:3633-3634的序列。
91.权利要求88-90中任一项的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述弗林裂解位点之后是柔性接头，之后是可裂解接头，使得顺序是弗林裂解位点-柔性接头-可切割的接头。
92.根据权利要求1或80所述的分离的合成抗原受体(SAR)多肽或多肽异二聚体，其中所述SAR被设计为对所选抗原具有所需的结合亲和力。
93.根据权利要求1所述的SAR，其进一步表达包含选自下组的多肽的附加模块：
a)细胞因子或其变体；
b)膜锚定细胞因子；
c)带有表位标签的膜锚定细胞因子；
d)具有自杀、生存和标记功能的多用途开关；
e)信号传导适配器分子；和
f)终止开关。
94.根据权利要求93所述的辅助模块，其中
a)所述细胞因子包含具有SEQ ID NO:7833-7842的序列或与其具有高达70％序列同源性的变体，并且
b)所述膜锚定细胞因子包含具有SEQ ID NO:7825-7832的序列或与其具有高达70％序列同源性的变体，
c)所述多用途开关包含具有SEQ ID NO:7843-7850的序列或与其具有70％序列同源性的变体，并且
d)所述适配器选自CD3δ、FcRγ、DAP10和DAP12的组。
95.包含权利要求94的多用途开关的多肽，其具有下式：
SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4；其中
SP是一种可选的信号肽，允许多用途开关在细胞表面转运，并被裂解产生成熟肽，
D1是受体结合域，与促进细胞存活的受体结合，
D2是一个标记/自杀结构域，
D3是铰链结构域/茎结构域，允许D1和D2结构域投射远离靶细胞表面，
D4是一个膜关联结构域，将多用途开关锚定到细胞膜上，
L1、L2和L3是可选的接头。
96.根据权利要求95所述的多肽，其中所述多用途转换多肽包含第一模块(D1)、(D2)、(D3)和(D4)的框内融合。
97.根据权利要求96所述的多肽，其中
a)D3和D4模块衍生自相同的内源蛋白；或者
b)D2、D3、D4模块来源于不同的内源蛋白；或者
c)D3和D4衍生自相同的内源蛋白；或者
d)D3和D4衍生自不同的内源蛋白质。
98.根据权利要求95所述的多肽，其中所述第一模块(D1)结合在细胞表面上表达的受体。
99.根据权利要求98所述的多肽，其中所述受体在结合时将促存活和/或增殖信号传递至所述细胞。
100.根据权利要求98所述的多肽，其中所述第一模块以顺式结合所述受体和/或所述第一模块以反式结合所述受体。
101.根据权利要求95所述的多肽，其中所述第一模块(D1)包含细胞因子、趋化因子、配体或其变体或片段的受体结合结构域。
102.根据权利要求101所述的多用途开关，其中所述D1包含选自IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18的细胞因子、趋化因子或配体的受体结合结构域，IL21、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、APRIL、BAFF、Rante
s、MIP、促红细胞生成素、血小板生成素、SCF(干细胞因子)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、上述任何一项以及上述任何一项的片段。
103.根据权利要求101所述的多肽，其中所述D1包含具有由SEQ ID NO:7833至7842表示的序列的多肽或与其具有至少70％同一性的变体。
104.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D1包含能够结合受体的抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、scFv或非免疫球蛋白抗原结合模块。
105.根据权利要求95和104所述的多肽，其中所述D1结合选自以下的受体：IL2R、IL6R、IL7R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL15R、IL18、IL21 CCR1、CCR3、CCR5、MIP-1R、PF4受体、促红细胞生成素受体(Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit和M-CSF受体。
106.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D2包含非内源多肽。
107.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D2包含内源蛋白质或其变体或片段的胞外结构域。
108.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D2包含一种或多种以下内源蛋白或其变体或片段的胞外结构域：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD38、CD52、CD171；CS1(SLAMF7、CD319)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；BCMA；Tn抗原(Tn Ag)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms类似酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；套件(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类组5，成员D(GPRC5D)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；GloboH甘油酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；潘联蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；雄激素受体；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有粘蛋白样激素受体样2(EMR2)的EGF样模块；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLLl)、MPL、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸路易斯抗原)；岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRgamma-delta、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、黄体生成素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、促性腺激素受体(CGHR或GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、组织因子1(TF1)、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、Nectin-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯通道(LCCC)、TAJ/TROY、MPL(TPO-R)、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、PD-L1、PD-L2、TNFR1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、CTLA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺基质淋巴细胞生成素、组织因子、IFNAR1、IL5、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-13、血管生成素样3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD8、CD7、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7整合素、α4整合素、VEGF、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys和BAFF-R。
109.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D2可被可用于检测、富集和/或杀死表达所述多用途开关的细胞的试剂结合。
110.根据权利要求109所述的多肽，其中所述试剂选自以下的一种或多种：抗体、抗体片段、scFv、单域抗体、非免疫球蛋白抗原结合域、抗体药物缀合物、双特异性抗体或其片段或细胞。
111.根据权利要求110所述的多肽，其中所述结合D2的试剂被批准用于体内或离体人类临床用途。
112.根据权利要求111所述的多肽，其中所述药剂选自利妥昔单抗、赫赛汀、Enhertu、Erbitrux、Adcetris、Enbrel、曲美木单抗、莫苏奈珠单抗、特克司他单抗、多南单抗、斯培索利单抗、法里昔单抗、贝兰他马福汀、替雷利珠单抗、龙卡妥昔单抗、他法西他单抗、派姆单抗、纳武单抗和Qbend10。
113.根据权利要求95所述的多肽，其中所述D3包含长度在5-100个氨基酸之间的茎(铰链结构域)序列。
114.根据权利要求95所述的多肽，其包含由SEQ ID NO(PRT):7843-7850、SEQ ID NO(PRT):9625和SEQ ID NO:9620-9624表示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的变体。
115.根据权利要求95所述的多肽，其包含SEQ ID No.7843-7849所示的序列，或其与SEQ ID No.7843-7849所示的序列具有至少80％同一性的变体，并且(i)结合J6M0；(ii)结合belantamab mafodotin，并且(iii)当在T细胞或NK细胞表面表达时，促进存活；(v)当在T细胞或NK细胞表面表达时，在belantamab mafodotin存在的情况下诱导细胞死亡。
116.根据权利要求95所述多肽，包括如SEQ ID No.9620-9624所示的序列，或者具有与SEQ ID No.9620-9624所示序列至少80％相同性的变体，该变体(i)结合QBEND10；(ii)结合Rituximab；并且(iii)当表达在T细胞或NK细胞的表面上时，促进细胞的存活；(v)当表达在T细胞或NK细胞的表面上时，在利妥昔单抗存在的情况下诱导补体介导的细胞杀伤。
117.根据权利要求95所述的多肽，其包含如SEQ ID No.9625所示的序列，或其与如SEQID No.9625所示的序列具有至少80％同一性的变体，并且其(i)结合赫赛汀；(ii)与Enhertu结合，(iii)当在T细胞或NK细胞表面表达时，促进存活；(v)当在T细胞或NK细胞表面表达时，在赫赛汀或Enehertu存在的情况下诱导细胞死亡。
118.一种重组核酸，其编码权利要求1所述的SAR的第一和/或第二多肽链和/或权利要求93所述的一个或多个附加模块。
119.一种重组表达系统，其包含权利要求118所述的重组多核苷酸，其与辅助模块共表达，其中所述辅助模块选自：截短的表皮生长因子受体(tEGFR)、截短的表皮生长因子受体viii(tEGFRviii)、截短的CD30(tCD30)、截短的BCMA(tBCMA)、截短的CD19(tCD19)、CD34、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、人caspase 8、人caspase 9、诱导型caspase 9(icaspase9)、嘌呤核苷磷酸化酶、亚麻苦苷酶/亚麻苦苷/葡萄糖氧化酶、脱氧核糖核苷激酶、辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚-3-乙酸(IAA)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、CD20/αCD20、CD34/胸苷激酶嵌合体、dox依赖性caspase-2、突变型胸苷激酶(HSV-TKSR39)、AP1903/Fas系统、嵌合细胞因子受体(CCR)、选择标记、多用途开关、vFLIP-K13、vFLIP-MC159、4-1BBL-CD40L、DAP10、DAP12、NKG2C、CD94、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、二羟基叶酸受体(DHFR)、突变型DHFR、甲基化DNA蛋白半胱氨酸甲基转移酶、肌苷单磷酸脱氢酶II(IMDHP2)、嘌呤霉素乙酰基转移酶(PAC)、杀稻瘟菌素-抗性基因、突变型钙调神经磷酸酶a/b(Can/b)、CNa12、CNb30及其组合。
120.根据权利要求119所述的重组表达系统，其中编码SAR的一条或两条链和一个或多个辅助模块的重组多核苷酸通过编码任选的柔性接头、可选的弗林裂裂解位点或类似弗林裂裂解位点以及可切割的接头的核苷酸序列相连。
121.根据权利要求120所述的重组表达系统，其中编码SAR的一条或两条链和一个或多个辅助模块的重组多核苷酸使用
i)一名或多名启动子；
ii)一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)；
iii)一个或多个可裂解接头；
iv)i、ii和iii的任意组合。
122.根据权利要求121所述的重组表达系统，其中
a)所述启动子是MNDU3启动子、EF1α启动子、EFS启动子(SEQ ID NO:850
5)、EFS2启动子(SEQ ID NO:8506)、RSV启动子(SEQ ID NO:8507)或mutRSV启动子(SEQID NO:8508)或与其具有70％同一性的序列；和
b)IRES是K-IRES(SEQ ID NO：8504)或与其具有70％同一性的序列。
123.根据权利要求118所述的重组多核苷酸和权利要求119所述的重组表达系统的至少一种载体，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、睡美人转座子载体和piggybac转座子载体。
124.根据权利要求123所述的载体，包含一个或多个组成型启动子或可调节启动子。
125.根据权利要求104所述的载体，其中所述启动子选自MNDU3启动子、EF1α启动子、EFS启动子(SEQ ID NO:8505)、EFS2启动子(SEQ ID NO:8506)、RSV启动子(SEQID NO:8507)、或mutRSV启动子(SEQ ID NO：8508)、CMV IE基因启动子、EF-1a启动子、泛素C启动子、MSCV LTR启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或合成Notch(SynNotch)启动子。
126.根据权利要求123所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体，或者所述载体进一步包含poly(A)尾或3'UTR。
127.一种效应细胞或干细胞，其包含至少一种根据权利要求1所述的SAR多肽或异二聚体、根据权利要求118所述的核酸、任选的附属模块、根据权利要求119所述的重组表达系统和根据权利要求123所述的载体。
128.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述细胞包含多个单链或双链SAR多肽。
129.根据权利要求128所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种单链或双链SAR多肽靶向与至少一种其它SAR多肽不同的抗原。
130.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽靶向相同抗原。
131.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽包含与至少一种其它SAR多肽不同的对所述抗原的结合亲和力。
132.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽包含与至少一种其它SAR多肽不同的天然存在的受体或信号传导适配器。
133.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽具有与至少一种其它SAR多肽不同的胞外结构域、跨膜结构域、胞质结构域。
134.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多种SAR多肽中的至少一种SAR多肽是激活性受体并且至少一种其它SAR多肽是抑制性受体。
135.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽是激活性受体，或者所述多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽是抑制性受体。
136.根据权利要求127所述的效应细胞或干细胞，其中所述多个SAR多肽中的两个或更多个SAR多肽募集不同的信号传导适配器和/或激活不同的信号转导途径。
137.权利要求127-136中任一项的效应细胞或干细胞，其中所述效应细胞是α/βT细胞、γ/δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、T细胞、T干细胞、Treg细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、iNKT(先天自然杀伤细胞)、NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、iPSC衍生的T细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、树突状细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞或其衍生物。
138.根据权利要求127-137中任一项所述的效应细胞群，其中所述细胞群包含多个不同的SAR多肽。
139.根据权利要求138所述的免疫细胞或效应细胞群体，其中所述多个不同的SAR多肽包含不同的序列但结合相同的靶抗原或不同的抗原。
140.制备权利要求127的表达SAR的效应细胞的方法，包括将权利要求123的至少一种载体或权利要求118的至少一种重组多核苷酸引入效应细胞、细胞系、造血干细胞、祖细胞或IPSC，在SAR多肽和任选的辅助模块表达的条件下，可以产生效应细胞。
141.根据权利要求127所述的效应细胞，其中所述效应细胞缺乏表达或具有低表达以下：功能性TCR、功能性HLA、β2巨球蛋白、TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD
5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、或染色体6p21区域中的任何基因；和/或在HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3δ、FcRγ、DAP10、DAP12、CD4、CD8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、接合器或用于与双特异性或多特异性或通用接合器偶联的表面触发受体中的中引入或增加至少一种表达。
142.根据权利要求127所述的效应细胞，其中效应细胞被修饰以阻断或降低第一内源TCR亚基和/或第二内源TCR亚基的表达。
143.根据权利要求127所述的效应细胞，其不表达T细胞受体(TCR)和/或CD3ε、CD3γ或CD3δ，并且其通过重组表达进行修饰以表达包含非TCR抗原识别结构域和T的重组双链SAR。细胞受体模块(TCRM)，其中所述细胞表达CD3链CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3δ，并且CD3链和SAR形成位于细胞表面的功能性CD3-SAR复合物。
144.根据权利要求127所述的效应细胞，其不表达T细胞受体(TCR)和/或不表达CD3ε、CD3γ或CD3δ，并且其通过重组表达进行修饰以表达细胞外源的重组双链TCR，其中所述重组体双链TCR是包含TCR抗原识别结构域和非T细胞受体模块(NTCRM)的SAR，所述TCR抗原识别结构域包括a)Vα和Vβ结构域或b)Vγ和Vδ结构域。
145.根据权利要求144所述的效应细胞，包含TCR抗原识别基序，其通过任选的接头可操作地连接至非T细胞受体模块(NTCRM)，所述非T细胞受体模块包含衍生自非T细胞受体和/或信号传导的第一MAM和第二MAM适配器并且还包含任选的胞质共刺激结构域。
146.根据权利要求143-145所述的效应细胞，其选自NK细胞、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、B细胞、粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、树突细胞、缺乏TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3δ链中的一种或多种的T细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞或其衍生物。
147.根据权利要求127的产生的所述效应细胞的方法，包括将体外转录的RNA或多种RNA或合成的RNA或多种RNA引入细胞或细胞群中，其中所述RNA或多种RNA包含权利要求118的重组多核苷酸。
148.一种在受试者中提供抗疾病免疫力的方法，包括向受试者施用有效量的免疫效应细胞或能够产生权利要求127-146中任一项所述的免疫效应细胞的干细胞，其中所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，或自体NK细胞或同种异体NK细胞，或自体巨噬细胞或同种异体巨噬细胞，或自体粒细胞或同种异体粒细胞，或自体树突细胞或同种异体树突细胞，或可产生效应细胞的自体造血干细胞或同种异体造血干细胞或自体或同种异体iPSC。
149.根据权利要求148所述的方法，其中异基因T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、造血干细胞或iPSC缺乏表达或具有低表达以下功能性蛋白或基因之一或多个：功能性TCR、功能性HLA、β2巨球蛋白、TAPI、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β常量区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT，或者染色体6p21区域中的任何基因；以及/或者在HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、FcRγ、DAP10、DAP12、CD4、CD8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、接合物或与双特异性或多重特异性或通用接合物耦合的表面触发受体之一中引入或增强表达。
150.一种杀死呈递靶抗原的靶细胞的方法，包括使所述靶细胞与权利要求127所述的效应细胞接触，其中所述SAR特异性结合所述靶抗原。
151.根据权利要求150所述的方法，进一步包括使所述靶细胞与一种或多种试剂接触，所述试剂结合所述表达SAR的效应细胞上表达的一种或多种抗原以及靶细胞上表达的一种或多种抗原。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述试剂可以将表达SAR的效应细胞重定向至表达由所述试剂靶向的抗原的靶细胞。
153.根据权利要求151所述的方法，其中所述试剂是抗体、抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤剂接合物(BiKE)、三特异性杀伤剂接合物、三特异性T细胞接合物或三特异性杀伤剂接合物(TRiKE)或其组合。
154.根据权利要求151所述的方法，其中所述效应细胞表达包含一种或多种天然存在的受体的胞外结构域的SAR。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述SAR包含选自CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1和CD161中一个或多个自然存在的受体的细胞外域。
156.根据权利要求151所述的方法，其中所述试剂是抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、双特异性T
细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤物接合物(BiKE)、三特异性接合物、三特异性T细胞接合物或三特异性杀伤接合物(TRiKE)，其包含至少一个结构域，所述结构域能够特异性结合包含SAR的天然存在的受体或其变体或片段的一个或多个胞外结构域。
157.根据权利要求151或156所述的方法，其中所述试剂特异性结合：
a)包含SAR的一种或多种天然存在的受体或其变体或片段的胞外结构域；和/或
b)不属于SAR的天然存在的受体的细胞外结构域。
158.根据权利要求151或157所述的方法，其中所述试剂可以特异性结合一种或多种天然存在的共刺激受体的胞外结构域。
159.根据权利要求151或157所述的方法，其中所述试剂可以特异性结合至一种或多种天然存在的激活受体的胞外结构域。
160.根据权利要求151或157所述的方法，其中所述试剂可以特异性结合至包含共刺激结构域的SAR的胞外结构域。
161.根据权利要求151或157所述的方法，其中所述试剂可以特异性结合至包含激活结构域和共刺激结构域的SAR的胞外结构域。
162.根据权利要求154或155所述的方法，其中所述SAR表达Fc受体的胞外结构域，所述试剂是抗体、抗体、抗原结合结构域、非免疫球蛋白抗原结合结构域片段、自主抗原结合结构域、双特异性接合物、包含Fc结构域的双特异性T细胞接合物(BiTE)、双特异性杀伤剂接合物(BiKE)、三特异性接合物、三特异性T细胞接合物或包括一个Fc区域的三特异性杀伤剂接合物(TRiKE)。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述Fc受体是CD16A、CD16B、CD64、CD32或其变体或片段中的一种或多种。
164.根据权利要求151所述的方法，其中所述靶抗原是表B中列出的一种或多种抗原。
165.根据权利要求148或149所述的方法，其中向所述受试者施用有效量的根据权利要求123-146中任一项所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含合成抗原受体(SAR)分子与调节存活、增殖、分化的试剂的组合和/或免疫细胞的功效，其中所述试剂选自以下的一种或多种：
a)蛋白磷酸酶抑制剂；
b)激酶抑制剂；
c)Lck激酶抑制剂；
d)结合于表达SAR的效应细胞上表达的一种或多种抗原以及靶细胞上表达的一种或多种抗原的试剂；
e)细胞因子；
f)免疫抑制分子的抑制剂；
g)降低TREG细胞水平或活性的药剂；
h)增加SAR修饰细胞的增殖和/或持久性的试剂；
i)趋化因子；
j)增加SAR表达的试剂；
k)允许调节SAR表达或活动的试剂；
l)允许控制SAR修饰细胞的存活和/或持久性的试剂；
m)控制SAR修饰细胞副作用的药剂；
n)Brd4抑制剂；
o)将治疗剂或预防剂递送至疾病部位的药剂；
p)增加SAR所针对的靶抗原表达的试剂；
q)与与SAR共表达的多用途开关结合的试剂；和
r)腺苷A2a受体拮抗剂。
166.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的SAR多肽分子、权利要求118所述的多核苷酸、权利要求119所述的载体、权利要求127-146中任一项所述的细胞、和/或权利要求151和165所述的试剂以及药学上可接受的载体。
167.一种在有需要的个体中预防或治疗靶抗原相关疾病的方法，包括向所述个体施用有效量的权利要求166所述的药物组合物。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述靶抗原相关疾病选自增殖性疾病、癌前病症、癌症、免疫疾病、过敏性疾病、退行性疾病、感染性疾病和非癌症相关适应症。
169.如权利要求168所述的用途或方法，其中所述癌症是选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中的一种或多种的血液癌症，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性疾病、MALT
淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤(PEL)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症或白血病前期。
170.如权利要求168所述的用途或方法，其中所述癌症选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、结肠癌、食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌腺体、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中央肿瘤神经系统(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、默克尔细胞癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述的组合癌症，以及所述癌症的转移性病变。
171.如权利要求168所述的用途或方法，其中所述疾病与选自冠状病毒、SAR-CoV2及其变种、HIV1、HIV2、HTLV1、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6型、人类疱疹病毒8型流感病毒、副流感病毒、禽流感病毒、MERS和SAR冠状病毒、克里米亚刚果出血热病毒、鼻病毒、肠道病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒、RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、水痘病毒、单纯疱疹病毒1和2、水痘带状疱疹病毒、HIV-1、HTLV1、肝炎病毒、肠道病毒、肝炎B病毒、丙型肝炎病毒、尼帕病毒和裂谷热病毒、日本脑炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒，或与结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、耶氏肺孢子菌、弓形体病、立克次体、诺卡氏菌、曲霉、毛霉或念珠菌感染相关。
172.如权利要求168所述的用途或方法，其中所述疾病是选自糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、寻常型天疱疮、强直性脊柱炎、星本氏甲状腺炎、SLE、结节病、硬皮病、混合结缔组织的免疫或退行性疾病病、移植物抗宿主病或阿尔茨海默病。
173.一种研究编码SAR的载体和权利要求93的多用途开关的转导效率的方法，其包括检测用所述载体转染或转导的细胞表面上的多用途开关的表达的步骤。
174.一种选择表达权利要求95所述的SAR的细胞的方法，其包括以下步骤：i)检测用权利要求140所述的载体转染或转导的细胞表面上的多用途开关的表达；和
(ii)选择被鉴定为表达多用途开关的细胞。
175.一种制备富集表达SAR的细胞的纯化细胞群的方法，其包括使用根据权利要求174所述的方法从细胞群中选择表达SAR的细胞的步骤。
176.根据权利要求175所述的方法，其包括以下步骤：
(i)用根据权利要求140所述的载体转导或转染离体从患者分离的细胞群；和
(ii)通过根据权利要求174的方法从转导/转染的细胞群中选择表达SAR的细胞。
177.一种细胞群，其富集表达权利要求94-117的多用途转换多肽的细胞，并因此富集表达SAR的细胞。
178.体内追踪转导细胞的方法，其包括检测细胞表面根据权利要求173中任一项所述的多用途转换多肽的表达的步骤。
179.根据权利要求127所述的用于删除单元的方法，其包括将所述单元暴露于与包括所述多用途开关的辅助模块结合的试剂的步骤。
180.根据权利要求179所述的方法，其中
a)所述多用途开关包含具有SEQ ID NO:7843-7850的序列或与其具有80％同源性的变体，并且所述药剂是belantamab mafodotin；
b)9620-9624的序列或与其具有80％同源性的变体，并且药剂是利妥昔单抗或CD20抗体；
c)所述多用途开关包含具有SEQ ID NO:9625的序列或与其具有80％同源性的变体，并且所述药剂是Herceptin、Enhertu或Her2靶向抗体；和
d)多用途开关包含具有SEQ ID NO:7850的序列或与其具有80％同源性的变体，并且所述试剂是Adcetris或CD30靶向抗体。
181.一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1所述的SAR多肽分子、根据权利要求93所述的附加模块、根据权利要求94所述的多用途开关、根据权利要求118所述的重组多核苷酸、根据权利要求119所述的重组表达系统、根据权利要求123所述的载体，或权利要求127的细胞、权利要求151和/或165的试剂以及权利要求166的组合物。
182.根据权利要求140所述的方法，其是在a)离体；b)体内；或c)离体和体内的条件下进行的。
183.根据权利要求1所述的SAR，包括至少两条链，其中
a)第一多肽链包含第一抗原结合结构域和第一膜相关模块(MAM)，所述第一抗原结合结构域包含Vα或Vγ结构域；和
b)第二多肽链包含第二抗原结合结构域和第二膜相关模块()，所述第二抗原结合结构域包含Vβ或Vδ结构域；
其中第一抗原结合结构域的Vα或Vγ结构域和第二抗原结合结构域的互补Vβ或Vδ结构域形成特异性结合靶抗原的TCR-Fv样抗原结合模块；和
其中第一MAM和第二MAM形成非T细胞受体模块(NTCRM)，其能够激活至少一种信号传导途径和/或募集至少一种信号传导适配器。
184.根据权利要求183所述的SAR，其中所述第一多肽链进一步包含在所述第一抗原结合结构域和所述第一MAM之间的第一肽接头，并且所述第二多肽链进一步包含在所述第二抗原结合结构域和所述第二MAM之间的第二肽接头。
185.权利要求184的SAR，其中所述第一和/或第二肽接头分别包含来自免疫球蛋白或T细胞受体亚基的恒定结构域或其片段。
186.根据权利要求183所述的SAR，其中所述第一多肽还包含位于包含所述第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的第一胞质结构域；和/或其中第二多肽还包含位于包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的第二胞质结构域。
187.根据权利要求183所述的SAR，其中所述第一多肽链还包含第一附加胞内结构域，所述第一附加胞内结构域包含所述第一MAM的第一跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列；和/或其中第二多肽链还包含第二附加胞内结构域，其包含包含第二MAM的第二跨膜/膜锚定结构域的C端的共刺激结构域序列。
188.根据权利要求187所述的SAR，其中所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、0X40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEM或ICOS，或者变体或变体其片段。
189.根据权利要求183所述的SAR，其中所述第一和/或第二MAM和NTCRM由非T细胞受体的跨膜/膜锚定结构域、任选的胞质结构域、任选的铰链结构域和/或任选的胞外结构域组成，和/或或信号传导适配器。
190.根据权利要求189所述的SAR，其中
a)非T细胞受体可从以下选择:CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT
2、KLRG1、LAIR1、CD161、任何上述的变体及其片段；和/或
b)所述信号传导适配器选自以下：CD3δ、FcRγ、DAP10、任何前述的变体及其片段。
191.根据权利要求183所述的SAR，当其在非T细胞中表达时，赋予其T细胞受体样靶结合识别和/或至少一种信号传导适配器的募集和/或至少一种信号传导途径的激活。
192.根据权利要求167所述的方法，其中向所述受试者进一步施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂以
a)预防或逆转由于施用包含表达SAR的效应细胞的药物组合物而导致的毒
性；和/或
b)防止或逆转SAR表达效应细胞的耗竭。
193.根据权利要求192所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是Lck抑制剂。
194.根据权利要求192所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼或普纳替尼。
195.根据权利要求192所述的方法，其中治疗增加受试者中T细胞的IL-2分泌。
196.根据权利要求192所述的方法，其中治疗减少受试者中的T细胞的凋亡。
197.根据权利要求192所述的方法，其中治疗降低选自PD-1、TIM-3和LAG-3的至少一种T细胞耗竭标志物的表达。
198.根据权利要求192所述的方法，其中治疗增加CD62L或CCR7的表达。
199.根据权利要求192所述的方法，其中对所述受试者施用多个治疗周期。
200.根据权利要求192所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是间歇施用的。
201.根据权利要求192所述的方法，其中施用所述酪氨酸激酶抑制剂足以恢复至少部分T细胞功能的一段时间，然后停止。
202.根据权利要求192所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂口服施用。
203.根据权利要求192所述的方法，其中与给予受试者的基因工程T细胞相关的毒性是细胞因子释放综合征。
204.根据权利要求192所述的方法，其中与给予受试者的基因工程T细胞相关的毒性是中靶脱肿瘤毒性或脱靶脱肿瘤毒性。
205.根据权利要求192所述的方法，其中所述受试者是人。
206.一种非T细胞的细胞，具有T细胞的靶标识别特性和功能，其中该细胞
a)缺乏选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或preTCR的一条或全部TCR恒定链或其片段的表达；和/或
b)缺乏选自CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的组中的一条或多条CD3链的表达；和/或
c)缺乏形成功能性TCR模块(TCRM)的能力。
207.根据权利要求206所述的细胞，其表达包含TCRM的双链受体并赋予T细胞的细胞靶标识别特性。
208.据权利要求207所述的细胞，其能够在细胞表面表达受体，所述受体可形成特异性结合靶抗原的TCR-Fv抗原结合模块。
209.根据权利要求208所述的受体，其中包含TCR-Fv的两个可变结构域不是单个多肽链的一部分。
210.根据权利要求206所述的细胞，其中包含TCR-Fv的两个可变结构域是
a)Vα和Vβ，或
b)Vγ和Vδ。
211.一种杀死呈递靶抗原的靶细胞的方法，包括使所述靶细胞与权利要求206所述的效应细胞接触，其中所述细胞特异性识别所述靶抗原。
212.根据权利要求210所述的细胞，其能够杀死表达其靶肽抗原的靶细胞。
213.一种药物组合物，其包含权利要求206的细胞和药学上可接受的载体。
214.一种在有需要的个体中预防或治疗靶抗原相关疾病的方法，包括向所述个体施用有效量的权利要求206的细胞或权利要求213的药物组合物。
215.一种制备权利要求206所述的具有T细胞受体样抗原识别功能的非T细胞的方法。
216.根据权利要求215所述的方法，其中具有TCR样抗原识别的非T细胞不表达
a)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ和preTCRα链，或
b)TCRα和TCRβ链的二聚体，或
c)TCRγ和TCRδ链的二聚体，或
d)preTCRα和TCRβ链的二聚体。
217.根据权利要求215所述的方法，其中所述方法不涉及
a)TCR链的外源表达，或
b)选自CD3ε、CD3γ和CD3δ的CD3链的外源表达。
218.根据权利要求215所述的方法，其中所述方法涉及单一遗传修饰。
219.根据权利要求215所述的方法，其中所述方法涉及引入一种或两种编码双链受体的重组多核苷酸。
220.根据权利要求210所述的细胞，其是NK细胞、iNKT(先天性自然杀伤细胞)、g-NK细胞、记忆样NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、iPSC、修饰的HLA缺陷型iPSC、iPSC衍生的NK细胞、B细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、树突细胞、永生化细胞系、永生化NK细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系、YTS细胞、NKG细胞系或其衍生物。
221.一种分离的融合蛋白，其中包括一个II型跨膜蛋白和一个I型跨膜蛋白或具有N端信号肽的分泌蛋白。
222.根据权利要求221所述的分离的融合蛋白，其包含与I型跨膜蛋白或具有N端信号肽的分泌蛋白的胞外结构域融合的II型蛋白的胞质、跨膜和部分或全部胞外结构域。
223.根据权利要求221所述的分离的融合蛋白，其中编码I型膜蛋白或具有N端信号肽的分泌蛋白的全部或部分胞外结构域的多肽的N端端可操作地连接至C-II型蛋白的末端从N端到C端方向。
224.一种制备权利要求221的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
a)将编码I型膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸的5'端与N端信号肽框内融合到编码II型蛋白的部分或全部胞外结构域的核苷酸的3'端；和
b)将重组多核苷酸引入合适的细胞中以允许融合蛋白的表达。
225.根据权利要求221所述的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白编码靶向特定抗原的嵌合抗原受体或合成抗原受体。
226.一种药物组合物，其包含由权利要求224制备的表达权利要求221的融合蛋白的细胞和药学上可接受的载体。
227.一种使用权利要求226的组合物的治疗方法。
228.一种编码合成免疫受体的重组多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1600-2328、4851-5129、5451-6282、7160-7170、7601-7747、8768-9602和10817-10830的序列，或与编码上述任一合成免疫受体的核苷酸序列具有至少75％同一性的序列。
229.一种编码选自下组的合成免疫受体多肽的氨基酸序列：SEQ ID NO：3994-4722、5151-5429、6283-7114、7852-7862、8293-8439、9860-10694、10832-10841、12304-12311或与编码上述任一合成免疫受体的氨基酸序列具有至少75％同一性的序列。
230.一种用于产生非天然蛋白质(即合成蛋白质)的方法，所述非天然蛋白质包含两条或多条从氨基(N)到羧基(C)末端具有以下通式的链：
链1：SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
链2：SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
其中SP1和SP2是从成熟多肽链上切割下来的任选的信号肽；A1和A2是两个可以相互作用的蛋白质结构域，L1和L2是可选的接头，H1和H2是可选的铰链或间隔结构域，M1和M2是膜锚定或跨膜结构域，C1和C2是可选的胞质结构域。
231.根据权利要求230所述的方法，其中所述A1和A2结构域并非衍生自抗体且不是抗体片段。
232.根据权利要求230所述的方法，其中A1和A2结构域与所述M1和M2结构域是异源的。
233.根据权利要求230所述的方法，其中所述A1和A2域不是自治域。
234.根据权利要求230所述的方法，其中所述A1和A2结构域对彼此的亲和力大于它们对不相关蛋白质的亲和力。
235.根据权利要求230所述的方法，其中所述A1和A2结构域可以彼此缔合以产生抗原结合结构域。
236.根据权利要求230所述的方法，其中所述L1和L2接头是a)长接头；b)类似Ig接头；或c)衍生自免疫球蛋白的接头；d)衍生自TCR恒定链的接头。
237.根据权利要求230所述的方法，其中所述L1和L2接头通过一个或多个二硫键连接。
238.根据权利要求230所述的方法，其中所述M1和M2结构域是跨膜结构域。
239.根据权利要求238所述的方法，其中所述Ml和M2结构域衍生自a)相同的蛋白质；b)不同的蛋白质；或c)序列相同和/或具有大于70％的氨基酸序列同源性。
240.根据权利要求230所述的方法，其中所述M1和M2域彼此关联。
241.根据权利要求230所述的方法，其中所述M1和M2结构域通过二硫键连接。
242.根据权利要求230所述的方法，其中所述M1和/或M2结构域可以募集一个或多个信号传导适配器。
243.根据权利要求230所述的方法，其中所述C1和C2结构域能够募集至少一种信号传导适配器和/或启动至少一种信号转导途径。
244.根据权利要求230所述的方法，其中所述两条链均在细胞表面表达。
245.根据权利要求230所述的方法，其中所述A1-L1-H1和A2-L2-H2区段位于细胞外侧。
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