JP2023145589A - 共刺激のための新規のプラットフォーム、新規のcar設計、および養子細胞療法のための他の増強 - Google Patents
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
【課題】養子細胞療法を促進する組成物及び方法を提供する。【解決手段】本開示は、NFkB活性の特異的活性化因子と組み合わせて、キメラ抗原受容体(CAR)および合成免疫受容体(SIR)等を含むポリヌクレオチド、ベクター、系、および細胞を提供し、それ故に、細胞増殖、発現、および減少したアポトーシスが改善され、それにより、養子細胞療法における細胞持続性が改善される。【選択図】図2
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条の下で、2017年9月27日に出願された米国仮出願第62/564,249号に対する優先権を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第119条の下で、2017年9月27日に出願された米国仮出願第62/564,249号に対する優先権を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
がん、感染症、アレルギー性障害、変性障害、および免疫障害の養子細胞療法のための新規の共刺激モジュールおよび新規のキメラ抗原受容体が本明細書に提供される。
配列表の参照による組み込み
IBM-PCのMS-Windowsオペレーティングシステムで機械的にフォーマットされた、2018年9月27日に作成され、60,347,260バイトのデータを有する「Sequence_ST25.txt」というファイル名の配列表が本出願に添付されている。本配列表は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
IBM-PCのMS-Windowsオペレーティングシステムで機械的にフォーマットされた、2018年9月27日に作成され、60,347,260バイトのデータを有する「Sequence_ST25.txt」というファイル名の配列表が本出願に添付されている。本配列表は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
養子T細胞免疫療法は、がん治療法の最前線に位置している。T細胞は、腫瘍関連抗原を認識するキメラ抗原受容体(CAR)の遺伝子を発現するように操作され得る。CARは、操作された免疫受容体であり、腫瘍細胞を選択的に死滅させるようにT細胞に再指向することができる。がん免疫療法におけるそれらの使用の一般前提は、腫瘍標的T細胞を迅速に生成することであり、能動免疫化の障壁および漸進的動態を迂回し、それにより、「生きた薬物」の役割を果たす。HLA-ペプチド複合体を結合する生理学的T細胞受容体(TCR)とは異なり、CARは、ペプチドプロセシングまたはHLA発現の認識を必要としない分子を結合する。したがって、CARは、TCRとは対照的に、患者のハプロタイプに一致しなければならない任意のHLAバックグラウンドの抗原を認識する。さらに、CARは、TCR媒介免疫からの腫瘍回避に寄与する2つの機構である下方調節されたHLA発現またはプロテアソームによる抗原プロセシングを有する腫瘍細胞を標的とすることができる。CARの広範な適用性の別の特徴は、タンパク質のみならず炭水化物および糖脂質構造にも結合するそれらの能力であり、これらも同様に、潜在的標的の範囲を拡大する。
本開示は、(i)少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および(ii)NF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化する少なくとも1つの天然に存在しない薬剤を発現する免疫細胞またはその免疫細胞集団を提供する。一実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体は、少なくとも1つの抗原結合ドメインおよび少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体は、少なくとも1つのTCR関連シグナル伝達モジュールを動員することができる。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)または組換えTCRである。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される抗原に結合する。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、vFLIP K13、K13-opt、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、NF-κBを選択的に活性化することができる任意の遺伝子編集系、それらの任意の相同体またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、非ウイルス起源のものである。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、遺伝子編集系である。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、NEMO/IKKγのオリゴマー化を誘導する。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、IKK複合体の活性化を誘導する。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、AKT経路を活性化しない。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、構成的または誘導的様式で発現される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、過渡的に発現される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、安定的に発現される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤の活性は、細胞を化合物と接触させることによって翻訳後に制御される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤は、スイッチドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される。別のまたはさらなる実施形態では、NF-κB経路を選択的に活性化す
ることができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤の活性は、スイッチドメインの二量体化を誘導する化合物の治療有効量を投与することによって翻訳後レベルで制御される。別のまたはさらなる実施形態では、スイッチドメインは、FKBP12ドメインの1つ以上のコピーを含む。別のまたはさらなる実施形態では、化合物は、AP20187またはRimiducidまたはそれらの相同体である。別のまたはさらなる実施形態では、免疫細胞は、Tリンパ球(T細胞)、CAR-T細胞、TCR発現T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、組織常在性リンパ球、幹細胞、誘導多能性幹細胞、またはナチュラルキラー(NK)細胞である。別のまたはさらなる実施形態では、免疫細胞は、機能的天然T細胞受容体(TCR)シグナル伝達複合体および/またはβ2マイクログロブリンを欠くように操作されている。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの薬剤は、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの薬剤の発現が、TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる。本開示は、がん、感染性疾患、免疫疾患、およびアレルギー性疾患の群から選択される疾患の予防および治療のために使用される本明細書に記載の免疫細胞または免疫細胞集団の使用も提供する。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードし、単一のプロモーターから発現される。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドは、2つ以上の別個のプロモーターを使用して発現される。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、NF-κBを選択的に活性化することができる天然に存在しない薬剤をコードする第2の核酸配列とは別個の少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体をコードする第1の核酸コード配列を含み、それにより、第1の核酸コード配列および第2の核酸コード配列の発現時に、天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBを選択的に活性化することができる天然に存在しない薬剤が物理的または化学的に結合しないようになる。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードするポリヌクレオチドは、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる。別のまたはさらなる実施形態では、TCR遺伝子の1つ以上の定常鎖は、機能的に再発現される。
ることができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤の活性は、スイッチドメインの二量体化を誘導する化合物の治療有効量を投与することによって翻訳後レベルで制御される。別のまたはさらなる実施形態では、スイッチドメインは、FKBP12ドメインの1つ以上のコピーを含む。別のまたはさらなる実施形態では、化合物は、AP20187またはRimiducidまたはそれらの相同体である。別のまたはさらなる実施形態では、免疫細胞は、Tリンパ球(T細胞)、CAR-T細胞、TCR発現T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、組織常在性リンパ球、幹細胞、誘導多能性幹細胞、またはナチュラルキラー(NK)細胞である。別のまたはさらなる実施形態では、免疫細胞は、機能的天然T細胞受容体(TCR)シグナル伝達複合体および/またはβ2マイクログロブリンを欠くように操作されている。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの薬剤は、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの薬剤の発現が、TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる。本開示は、がん、感染性疾患、免疫疾患、およびアレルギー性疾患の群から選択される疾患の予防および治療のために使用される本明細書に記載の免疫細胞または免疫細胞集団の使用も提供する。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードし、単一のプロモーターから発現される。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドは、2つ以上の別個のプロモーターを使用して発現される。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、NF-κBを選択的に活性化することができる天然に存在しない薬剤をコードする第2の核酸配列とは別個の少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体をコードする第1の核酸コード配列を含み、それにより、第1の核酸コード配列および第2の核酸コード配列の発現時に、天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBを選択的に活性化することができる天然に存在しない薬剤が物理的または化学的に結合しないようになる。別のまたはさらなる実施形態では、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードするポリヌクレオチドは、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる。別のまたはさらなる実施形態では、TCR遺伝子の1つ以上の定常鎖は、機能的に再発現される。
本開示は、少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体をコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドであって、(a)内在性タンパク質の一部または全ての膜貫通および/または細胞質ドメインならびに任意選択的に細胞外ドメインをコードする第1の核酸ドメインであって、内在性タンパク質がリンパ球の表面に発現され、リンパ球の活性化および/または増殖を誘発する、第1の核酸ドメインと、(b)任意選択的にポリヌクレオチドaリンカーと、(c)第1の核酸ドメインに作動可能に連結された第2の核酸ドメインであって、1つ以上の非天然TCR抗原結合ドメインをコードする、第2の核酸ドメインと、(d)共刺激ドメインをコードする任意選択的な第3の核酸ドメインと、(e)アクセサリーモジュールをコードする任意選択的な追加の核酸ドメインとを含む、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドも提供する。
本開示は、天然に存在しない免疫受容体をコードする第1の核酸と、選択的NF-κB活性化因子を含むアクセサリーモジュールをコードする第2の核酸とを含む、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドも提供する。一実施形態では、第1の核酸および第2の核酸は、切断可能なペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドリンカーによって分離されている。別の実施形態では、少なくとも1つは、第1の核酸および第2の核酸が別個のベクターから発現されるように2つの組換えポリヌクレオチドを含む。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、天然に存在しない選択的NF-κB活性化因子である。別のまたはさらなる実施形態では、天然に存在しない免疫受容体は、CAR、Ab-TCR、TFP、cTCR、SIR、および組換えTCRからなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、天然に存在しない免疫受容体は、(i)細胞外抗原特異的ドメイン、(ii)膜貫通ドメイン、および(iii)免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含む任意選択的な細胞内シグナル伝達ドメインを含み、(iii)は、天然に存在しない免疫受容体のC末端に位置する。別のまたはさらなる実施形態では、第1の核酸配列および第2の核酸配列の発現時に、天然に存在しない免疫受容体および選択的NF-κB活性化因子ポリペプチドは、物理的または化学的に結合しない。別のまたはさらなる実施形態では、細胞外抗原特異的ドメインは、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);AFP/MHC複合体;上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);WT1/MHC I複合体;癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);NY-ESO-1/MHC I複合体、癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);HPV E6/MHC I複合体;ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);HPV E7/MHC I複合体;AFP/MHC I複合体;Ras/MHC I複合体;腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原のうちのいずれか1つ以上に結合する。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、vFLIP K13、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、FKBPx2-RIP-ID、IKK1、FKBPx2-IKKa、IKK2、FKBPx2-IKK2、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、NF-κBを選択的に活性化することができる遺伝子編集系、NF-κBを選択的に活性化するRNA干渉系、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、FKBPドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される。別のまたはさらなる実施形態では、細胞外抗原特異的ドメインは、所定の標的抗原に特異的な抗体またはその断片の重鎖(vH)の可変領域;所定の標的抗原に特異的な抗体またはその断片の軽鎖(vL)の可変領域;所定の標的抗原に特異的な一本鎖可変断片(scFv)またはその断片;所定の標的抗原に特異的な抗体断片(例えば、Fv、Fab、a(Fab’)2);所定の標的抗原に特異的な単一ドメイン抗体(SDAB)断片;所定の標的抗原に特異的なラクダ類vHHドメイン;所定の標的抗原に特異的な非免疫グロブリン抗原結合足場;所定の標的抗原に特異的な受容体またはその断片;所定の標的抗原に特異的なリガンドまたはその断片;1つ以上の所定の標的抗原に特異的な二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、二重特異性scFV、二重特異性vHH、二重特異性SDAB、二重特異性非
免疫グロブリン抗原結合足場、二重特異性受容体、または二重特異性リガンド;および自己抗原またはその断片からなる群から選択される。
免疫グロブリン抗原結合足場、二重特異性受容体、または二重特異性リガンド;および自己抗原またはその断片からなる群から選択される。
本開示は、本明細書の上に記載の前述のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのベクターも提供する。一実施形態では、ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Sleeping Beautyトランスポゾンベクター、およびPiggyBacトランスポゾンベクターからなる群から選択される。
本開示は、本明細書の上に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド構築物またはベクターを含む免疫エフェクター細胞または幹細胞も提供する。一実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞である。別のまたはさらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、ヒトT細胞、ヒトNKT細胞もしくは合成T細胞、NK細胞、または幹細胞であり、任意選択的に、T細胞は、ジアグリセロールキナーゼ(DGK)および/またはIkaros欠損性および/またはBrd4欠損性である。
本開示は、(i)発現している免疫細胞の寿命を延長させ、(ii)免疫細胞の増殖を刺激し、(iii)免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激し、(iv)免疫細胞による抗原提示を増強し、(v)免疫細胞をアポトーシスから保護するための方法であって、免疫細胞を、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質転換することを含む、方法も提供する。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドは、vFLIP K13、K13-opt、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、それらの任意の相同体またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドは、構成的または誘導的様式で発現される。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドは、T細胞を化合物と接触させることによって翻訳後に制御される。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドは、FKBPドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される。別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドの活性は、FKBPドメインの二量体化を誘導する化合物の治療有効量を投与することによって翻訳後レベルで制御される。別のまたはさらなる実施形態では、化合物は、AP20187またはRimiducidである。
本開示は、天然に存在しない免疫受容体を発現する免疫エフェクター細胞を作製する方法であって、本開示の少なくとも1つのベクターまたは少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド構築物を、天然に存在しない免疫受容体が発現されるような条件下で、免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる造血幹細胞もしくは前駆細胞に導入することを含み、免疫エフェクター細胞が、NFkB特異的刺激ポリペプチドを欠くCAR-T細胞と比較して、(i)延長された寿命、(ii)改善されたT細胞増殖、および/または(iii)減少したアポトーシスを含む、方法も提供する。別のまたはさらなる実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団を提供することと、その集団から調節性T細胞を除去し、それにより、調節性T細胞枯渇集団を提供することとをさらに含み、これらのステップは、CARおよび/またはNFkB特異的刺激ポリペプチドをコードするベクターまたは組換えポリヌクレオチドをその集団に導入する前に行われる。別のまたはさらなる実施形態では、調節性T細胞は、抗CD25抗体または抗GITR抗体を使用して細胞集団から除去される。別のまたはさらなる実施形態では、本方法は、a)免疫エフェクター細胞の集団を提供することと、b)その集団からP-糖タンパク質(P-gpまたはPgp;MDR1、ABCB1、CD243)陽性細胞を富化し、それにより、P-糖タンパク質(P-gpまたはPgp;MDR1、ABCB1、CD243)富化細胞集団を提供することとをさらに含み、ステップa)およびステップb)は、CARおよび/またはNFkB特異的刺激ポリペプチドをコードするベクターまたは組換えポリヌクレオチドを導入する前または導入した後に行われる。別のまたはさらなる実施形態では、P-糖タンパク質陽性細胞は、i)P-糖タンパク質特異的抗体のうちの1つまたはそのカクテルを使用した免疫選択、ii)P-糖タンパク質がポンプとして活性である条件下での、P-糖タンパク質の基質である蛍光色素、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、アドリアマイシン、およびアクチノマイシン-D)のうちの1つ以上での染色、およびその色素でわずかに染色される細胞の富化、iii)P-糖タンパク質の基質である光毒性化合物、例えば、TH9402、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸メチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸エチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸オクチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸n-ブチルエステル塩酸塩、2-(6-エチルアミノ-3-エチルイミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸n-ブチルエステル塩酸塩、またはそれらの誘導体もしくはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上に耐性を示す細胞の選択、およびiv)P-糖タンパク質の基質である細胞毒性化合物、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、パクリタキセル、ミトキサントロン、エトポシド、アドリアマイシン、ダウノルビシン、およびアクチノマイシン-Dに耐性を示す細胞の選択からなる群から選択される方法のうちのいずれか1つ以上を使用して富化される。
本開示は、RNA操作細胞の集団を生成する方法であって、インビトロ転写RNA(複数可)または合成RNA(複数可)を細胞または細胞集団に導入することを含み、RNA(複数可)が、本開示の組換えポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、方法も提供する。
本開示は、対象に抗疾患免疫を提供する方法であって、対象に、本開示の免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞の有効量を投与することを含み、その細胞が、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、自己T細胞もしくは同種T細胞、または自己NKT細胞もしくは同種NKT細胞、または自己もしくは同種造血幹細胞、または自己もしくは同種iPSCである、方法も提供する。別のまたはさらなる実施形態では、同種T細胞または同種NKT細胞または造血幹細胞またはiPSCは、機能的TCRまたは機能的HLAの発現を欠くか、またはその低発現を有する。
本開示は、天然に存在しない免疫受容体および選択的NFkB活性化因子を含む免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生成することができる幹細胞を含む組成物であって、天然に存在しない免疫受容体が、疾患関連抗原関連に結合する抗原結合ドメインを含み、その疾患関連抗原が、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビンg;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原)フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、KSHV-K8.1タンパク質、KSHV-gH タンパク質、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2 OR CLDN18A.2))、P-糖タンパク質、STEAP1、LIV1、NECTIN-4、クリプト、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される、組成物も提供する。
本開示は、対象における疾患関連抗原の発現に関連する疾患を治療または予防する方法であって、対象に、天然に存在しない免疫受容体および選択的NFkB活性化因子を含む免疫エフェクター細胞の有効量を投与することであって、天然に存在しない免疫受容体が、疾患関連抗原関連に結合する抗原結合ドメインを含み、疾患関連抗原が、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビンg;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原)フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、KSHV-K8.1タンパク質、KSHV-gH タンパク質、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2 OR CLDN18A.2))、P-糖タンパク質、STEAP1、LIV1、NECTIN-4、クリプト、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される、投与することを含み、それにより、対象を治療するか、または対象における疾患を予防する、方法も提供する。別のまたはさらなる実施形態では、疾患関連抗原の発現に関連する疾患は、疾患関連抗原の発現に関連する、増殖性疾患、前癌状態、がん、および非がん関連適応症からなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、または前白血病のうちの1つ以上から選択される血液学的癌である。別のまたはさらなる実施形態では、がんは、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、環境誘発癌、これらのがんの組み合わせ、およびこれらのがんの転移病巣からなる群から選択される。別のまたはさらなる実施形態では、疾患は、HIV1、HIV2、HTLV1、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス8インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスによる感染に関連するか
、またはmycobacterium tuberculosis、非定型マイコバクテリア種、Pneumocystis jirovecii、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ケカビ、またはカンジダによる感染に関連する。別のまたはさらなる実施形態では、疾患は、真性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、SLE、サルコイドーシス、強皮症、混合結合組織病、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない免疫疾患または変性疾患である。
、またはmycobacterium tuberculosis、非定型マイコバクテリア種、Pneumocystis jirovecii、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ケカビ、またはカンジダによる感染に関連する。別のまたはさらなる実施形態では、疾患は、真性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、SLE、サルコイドーシス、強皮症、混合結合組織病、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない免疫疾患または変性疾患である。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の発明を実施するための形態に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
初期の第一世代CARは、scFv(一本鎖断片可変)に基づく抗原結合ドメインの、CD3-ζ鎖またはFc受容体γ鎖に由来する細胞質シグナル伝達ドメインに連結された不活性CD8膜貫通ドメインへの融合により構築された(図1)。
CD3-ζ鎖凝集は、T細胞の溶解活性を可能にするのに十分であるが、それらは、インターロイキン-2(IL-2)を含むサイトカインのロバスト応答を誘発することができず、抗原に繰り返し曝露した場合にT細胞の拡大を支援することができなかった。最適な活性化および増殖のために、T細胞は、T細胞受容体結合およびシグナル伝達の両方、ならびに標的とされた腫瘍細胞または抗原提示細胞のいずれかによって発現された同族リガンド(すなわち、CD80/86、4-1BBL、OX-40L)に結合するT細胞上の共刺激受容体(すなわち、CD28、4-1BB、OX-40)を介した共刺激シグナル伝達を必要とする。T細胞共刺激の欠如を打開するために、第一世代CARは、T細胞共刺激受容体の細胞質シグナル伝達ドメインを組み込むことによってさらに修飾された。これらの第二世代CARは、修飾されたT細胞のシグナル伝達の強度および持続性を増強し、優れた抗腫瘍活性につながった。第二世代CAR構築物に存在する共刺激ドメインを介したシグナル伝達により、NF-κB、AKT、およびERK等のいくつかのシグナル伝達経路の活性化がもたらされる。具体的には、AKT活性化は、T細胞活性化を促進するが、末端分化、疲弊、および持続性の欠如をもたらすことも示されている。
図2は、各々に関連する生物学的活性を示す、第一世代CARの次の上述の第二世代CARおよび特異的NF-κB刺激分子の模式図を示す。
現在の臨床使用におけるCAR構築物は、それらがいくつかの異なるタンパク質の融合を表すため、設計が人工的である。具体的には、第二世代CAR構築物への共刺激ドメインの包含により、その受容体を介した非生理学的シグナル伝達がもたらされ、これは、次いで、それらの毒性に寄与し得る。いくつかのCARは、持続性抗原非依存性シグナル伝達を示し、これは、無制限の細胞活性化につながり、最終的には、アポトーシス、同族抗原とは無関係の過度のサイトカイン放出、および免疫学的疲弊をもたらす。共刺激ドメイン(例えば、41BBおよびCD28ドメイン)を介した持続性シグナル伝達がT細胞生存を妨げることが示されている。したがって、サイトカイン放出症候群(CRS)等の過度の毒性の危険性を伴うことなくCAR修飾T細胞の長期持続性を達成するためにCAR設計を改善する必要がある。
従来の第二世代CAR設計上の制限のうちのいくつかを打開するために、Ab-TCR(参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1)、TCR受容体融合タンパク質またはTFP(参照により本明細書に組み込まれるWO2016/187349 A1)、合成免疫受容体(SIR)(参照により本明細書に組み込まれるWO2018/102795 A1を参照のこと)、三官能性T細胞抗原カップラー(Tri-TAC)(参照により本明細書に組み込まれるWO2015/117229 A1を参照のこと)を含む、集合的に次世代CARと称されるいくつかの代替の設計について説明されている。これらの代替のCAR設計は、一般に、共刺激ドメインを欠く。
AKT活性化および持続性シグナル伝達の制限を打開するために、本開示は、選択的NF-κB活性化因子、例えば、NEMO-突然変異体(例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、マウスNEMO-K270A)、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180Eの使用を実証し、共刺激機能を提供する。多数のシグナル伝達経路を活性化する41BB-およびCD28由来の共刺激ドメイン(図1における第二および第三世代CARを参照のこと)とは対照的に、選択的NF-κB活性化因子、例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E等は、I-カッパBキナーゼ(IKK)複合体を活性化することによってNF-κB経路を選択的に活性化する。本開示は、代替の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)の設計についてさらに記載し、この設計では、共刺激が天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)と共発現される選択的NF-κB活性化因子を含むアクセサリーモジュールによって提供される。しかしながら、共刺激ドメインが成熟CARポリペプチドの成分である第二世代CAR構築物とは対照的に、選択的NF-κB活性化因子を含むアクセサリーモジュールは、必ずしも成熟免疫受容体(例えば、CAR)ポリペプチドの不可欠な部分ではない。かかる設計は、持続性シグナル伝達、過度のサイトカイン産生、ならびに共刺激ドメインを介した凝集および非生理学的シグナル伝達によって引き起こされるT細胞の早期疲弊といった問題を打開するため、有利である。本開示は、スイッチドメインと融合した、例えば、FKBP12v36ドメインのタンデムコピーと融合したNF-κB活性化因子を発現させることによってその活性を調節するための方法をさらに提供する。
本開示は、選択的NF-κB活性化因子、例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176-S180EおよびK13-opt等のT細胞における発現が、老化を経ることなく培養下で長期間増殖するそれらの能力を高めることを実証し、それにより、単一経路(すなわち、NF-κB)の活性化がT細胞の老化を遅らせるのに十分であることを初めて実証する。例えば、hNEMO-K277AまたはhNEMO-K277A-DeltaV249-K255を共発現するが、いずれの共刺激ドメインも欠くCD19-CAR構築物は、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR構築物と比較して優れたインビボ有効性を示す。本開示は、NF-κBの選択的活性化が、T細胞の増殖を促進し、老化を遅らせ、かつCAR-T細胞療法を含む養子細胞療法のためにT細胞の性能を改善するのに十分であることをさらに実証する。したがって、本開示は、免疫細胞におけるNF-κB経路の選択的または優先的(すなわち、AKT活性化なし)活性化により、免疫細胞、例えば、T細胞、例えば、CAR-TもしくはTCR-TもしくはSIR-T細胞、および/または天然に存在しない免疫受容体を発現する免疫細胞の生存、増殖、サイトカイン分泌を増強し、その疲弊および老化を遅らせ、そのインビボ拡大、持続性、および抗腫瘍活性を改善するための組成物および方法を提供する。さらに、本開示は、選択的NF-κB活性化因子、例えば、hNEMO-K277AまたはhNEMO-K277A-DeltaV249-K255等が、内在性TCR(例えば、腫瘍浸潤リンパ球)、外因性TCR、SIR等を発現するT細胞を含む養子細胞療法のためのいずれのT細胞でも使用され得るため、それらの使用がCAR-T細胞での使用に限定されないことを実証する。
本開示は、選択的NF-κB活性化因子、例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E等が、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞によるサイトカイン分泌および抗原提示を促進することによってワクチンの性能を改善するために使用され得ることをさらに実証する。例えば、選択的NF-κB活性化因子、例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180Eを発現する骨髄由来の樹状細胞(DC)は、対照DCと比較して優れたサイトカイン産生、抗原提示、および免疫応答(例えば、抗腫瘍応答または抗感染薬応答)を示す。
本開示は、ヒト起源のものであり、それ故に、免疫原性が低い選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB活性化因子をさらに提供する。
本開示は、サイトゾルに発現され得る選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB活性化因子をさらに提供する。本開示は、NF-κBを活性化する能力のため、構成的に活性であり、刺激、例えば、リガンドでの治療を必要としない選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB活性化因子をさらに提供する。
本開示は、養子細胞療法での適用のための、従来のCAR(例えば、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR)、ならびに次世代CAR、例えば、SIR、zSIR、Ab-TCR、およびTFPの生成に使用され得るいくつかの抗原結合ドメインをさらに提供する。いくつかの実施形態では、これらの抗原結合ドメインは、血液学的悪性腫瘍および固形腫瘍の両方に発現される抗体および標的抗原に由来する。これらの抗原結合ドメインのvL、vH、およびscFv断片の配列番号は、表6A~Cに示される。軽鎖(vL)および重鎖(vH)の相補性決定領域(CDR)の配列番号は、表6A~Bに示される。41BB共刺激ドメインを含む例示的な第二世代CARおよびこれらの抗原結合ドメインに基づく次世代CAR(例えば、zCAR-K13、zCAR-NEMO-K277A、SIR、Ab-TCR、およびTFP)の核酸およびアミノ酸の配列番号は、表10~14に提供される。これらの抗原結合ドメインを含むCARは、多様なインビトロおよびインビボ特性、例えば、標的抗原に対する結合親和性、サイトカイン分泌、増殖、細胞毒性、疲弊、および長期持続性を示す。したがって、これらの標的抗原を含む天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARを使用して、多様な免疫応答を引き起こすことができる。本開示の抗原結合ドメインを含むCARを発現するポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現構築物、組換え操作された細胞、ならびにかかるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および細胞を作製および使用する方法は、当該技術分野で既知の方法、ならびに参照により全体が本明細書に組み込まれる、PCT/US2017/024843、WO2014/160030 A2、WO2016/187349 A1、WO2017/070608 A1、およびWO2018/102795 A1に記載の方法に記載されている。これらの抗原結合ドメインを含むCARを発現する免疫細胞は、当該技術分野で既知の方法、ならびに参照により全体が本明細書に組み込まれる、WO2017/070608 A1、WO2016/187349 A1、WO2018/102795 A1、WO2015/117229 A1に記載の方法を使用して、がん、感染性障害、および免疫障害の養子細胞療法のために生成および使用され得る。
本開示は、既製の養子細胞療法の目的のために、TCRおよびCAR、例えば、次世代CAR(例えば、TFP、SIR、Ab-TCR、cTCR)を発現する同種T細胞を生成するための新規の方法をさらに提供する。
本開示は、TCRおよびCAR、例えば、次世代CAR(例えば、TFP、SIR、Ab-TCR、およびcTCRを発現する自己および同種T細胞を使用する併用療法の新規の方法をさらに提供する。本開示は、TFPを発現する細胞に、定常鎖TCRα、TCRβ、TCRγ、またはTCRδを共発現させることによって、天然TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRγ鎖、またはTCRδ鎖の発現を欠くT細胞におけるCD3ε鎖、CD3γ鎖、およびCDδ鎖に基づくTFPの発現および/または活性を回復させる方法を提供する。本開示は、TFPを発現する細胞に、定常鎖TCRα、TCRβ、TCRγ、またはTCRδの全長または断片をコードするSIRまたはAb-TCRのいずれかを共発現させることによって、天然TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRγ鎖、またはTCRδ鎖の発現を欠くT細胞におけるCD3ε鎖、CD3γ鎖、およびCDδ鎖に基づくTFPの発現および/または活性を回復させる方法をさらに提供する。本開示は、同種および既製の療法の目的のために、CD3ε鎖、CD3γ鎖、およびCDδ鎖に基づくTFPが、天然TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRγ鎖、またはTCRδ鎖を欠くT細胞において、定常鎖TCRα、TCRβ、TCRγ、またはTCRδ定常鎖をコードするSIRまたはAb-TCRと組み合わせられ得ることを提供する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある細胞(a cell)」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「そのポリヌクレオチド(the polynucleotide)」への言及は、1つ以上のポリヌクレオチドへの言及を含むといった具合である。
また、「または」の使用は、別途明記されない限り、「および/または」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含むこと(including)」は同義であり、限定するようには意図されていない。
様々な実施形態の記述が「含む(comprising)」という用語を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例では、実施形態が、「から本質的になる」または「からなる」という言葉を使用してその代わりに記述され得ると理解するであろうことをさらに理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。Allen et al.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed.,Pharmaceutical Press(September 15,2012)、Hornyak et al.,Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)、Singleton and Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,revised ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)、Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 7th ed.,J.Wiley & Sons(New York,NY 2013)、Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed.,Wiley-Blackwell(November 28,2012)、およびGreen and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)は、当業者に本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を提供する。抗体の調製法に関する参考文献については、Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)、Kohler and Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976 Jul,6(7):511-9、Queen and Selick,Humanized immunoglobulins,米国特許第5,585,089号(1996 Dec)、およびRiechmann et al.,Reshaping human antibodies for therapy,Nature 1988 Mar 24,332(6162):323-7を参照されたい。本明細書に提供される全ての表題および副題は、単に読み易くするためのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料が本発明の実践または試験で使用され得るが、好適な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。加えて、材料、方法、および具体的な例は、例証のためのみであり、限定するようには意図されていない。
本明細書における全ての刊行物は、個々の刊行物または特許出願が各々参照により組み込まれると明確かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。引用されるいずれの参考文献も、それらの参考文献に提供される情報のうちのいずれかが先行技術であるか、または現在特許請求されている本発明に関連することも、具体的または黙示的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であることも認めるものではない。
「約」という用語は、測定可能な値、例えば、量、時間的持続時間等を指す場合、規定値から±20%、またはある場合には±10%、またはある場合には±5%、またはある場合には±1%、またはある場合には±0.1%の変動を包含するよう意図されており、したがって、変動は、開示される方法の実行または本明細書における組成物の記載に適切である。さらに、任意の値または範囲(例えば、20未満または同様の専門用語)は、かかる値間またはかかる値までの任意の整数を明示的に含む。したがって、例えば、「1~5つの突然変異」は、1、2、3、4、および/または5つの突然変異を明示的に含む。
「Ab-TCR」または「AbTCR」という用語は、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1に記載の次世代CARプラットフォームを指す。ある実施形態では、Ab-TCRは、少なくとも1つのTCRシグナル伝達モジュールを動員することができるTCRモジュールに融合した標的抗原に特異的に結合する抗体部分を含む。Ab-TCRの構築に使用され得る例示的なTCRモジュールは、配列番号959~964(表6D)および参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1に提供される。TCRモジュールTCRb-IAH-6MDでは、ヒトTCRb鎖(配列番号15053)に見られる3つのアミノ酸残基(F133、E136、およびQ139)(表4、5、および6Dを参照のこと)は、それぞれ、マウスTCRb鎖に見られる残基イソロイシン、アラニン、およびヒスチジンに突然変異して、このモジュールの発現を増強するようになる。同様に、TCRモジュールIgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MDでは、ヒトTCRa鎖(配列番号15041)に見られる4つのアミノ酸残基(P91、E92、S93、S94)は、マウスTCRa鎖に見られる残基S、D、V、Pに突然変異して、このモジュールの発現を増強するようになる(表3および表6Dを参照のこと)。NEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールを共発現する例示的なAb-TCRは、配列番号3124~3523提供される(表14)。しかしながら、このNEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールは、任意である。本開示に記載の抗原結合ドメイン(すなわち、vLおよびvH断片、リガンド、および受容体等)を有するAb-TCRは、NEMO-K277Aなしで構築され得る。したがって、このアクセサリーモジュールは、上流フーリン-SGSG-F2A配列とともに、Ab-TCRから欠失し得る。あるいは、NEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールは、他のタンパク質、例えば、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E、およびMyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2等をコードするアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。さらに、Ab-TCRに存在するTCRモジュールは、WO2017/070608 A1に記載の他のTCRモジュールに置換される。例えば、配列番号3124~3323によって表されるAb-TCRは、それぞれ、TCRモジュールIgCL-TCRb-wt2-opt-6MD(配列番号961)およびIgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD(配列番号964)に置換され得る、TCRモジュールIgCL-TCRb-IAH-6MD(配列番号960)およびIgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD(配列番号963)を含む。NEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールを共発現し、かつTCRモジュールIgCL-TCRg-6MD(配列番号959)およびIgG1-CH1-TCRd-6MD(配列番号962)を含む例示的なAb-TCRは、配列番号3324~3523に提供される。これらの構築物における抗原結合ドメインの順序は、表14に示される構築物の順序と同じであり、それ故に、特定の抗原を標的とし、かつ特異的抗原結合ドメインを含むIgCL-TCRg-6MD(配列番号959)およびIgG1-CH1-TCRd-6MD(配列番号962)に基づくAb-TCRは、表14を参照することによって特定され得る。
「アクセサリーモジュール」という用語は、免疫細胞(例えば、T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞)に発現して、免疫細胞の活性を低減、調節、または修飾する、hNEMO-K277A(またはNEMO-K277A)、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E(またはIKK2-SS/EE)、IKK1-S176E-S180E(またはIKK1-SS/EE)、MyD88-L265P、TCL-1a、MTCP-1、CMV-141、41BBL、CD40L、vFLIP-K13、MC159、cFLIP-L/MRITα、cFLIP-p22、HTLV1 Tax、HTLV2 Tax、HTLV2 Tax-RS突然変異体、FKBPx2-K13、FKBPx2-HTLV2-Tax、FKBPx2-HTLV2-Tax-RS、IL6R-304-vHH-Alb8-vHH、IL12f、PD1-4H1 scFV、PD1-5C4 scFV、PD1-4H1-Alb8-vHH、PD1-5C4-Alb8-vHH、CTLA4-イピリムマブ-scFv、CTLA4-イピリムマブ-Alb8-vHH、IL6-19A-scFV、IL6-19A-scFV-Alb8-vHH、sHVEM、sHVEM-Alb8-vHH、hTERT、Fx06、Brd4を標的とするshRNA、IgSP-[hTRAC-opt2]、IgSP-[hTRBC-opt2]、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上を指す。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュールは、CARまたはTCR等の免疫受容体と共発現して、CARまたはTCRまたはCAR発現細胞またはTCR発現細胞の発現または活性を増加、低減、調節、または修飾する。アクセサリーモジュールは、単一のベクターを使用して、または2つ以上の異なるベクターを使用して、CARまたはTCRと共発現され得る。さらなる実施形態では、アクセサリーモジュールは、FKBPx2-NEMO等のFKBP(FK506結合タンパク質)融合タンパク質を含み、その活性は、二量体化因子分子の投与によって制御され得る。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュールは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞に発現される。
本明細書で使用される場合、「親和性」は、結合強度の尺度を説明するよう意図されている。親和性は、ある場合には、結合剤とその標的との間(例えば、抗体と抗原(結合ドメインに特異的なエピトープを含む)との間)の立体化学的適合の近似性、それらの間の接触面積のサイズ、および荷電基および疎水基の分布に依存する。親和性は、一般に、結合剤がその標的に結合する「能力」を指す。「親和性」を測定するための多数の方法が当該技術分野に存在する。例えば、親和性を計算するための結合実験の使用を含む、抗体の抗原に対する親和性を計算するための方法が、当該技術分野で既知である。結合親和性は、当該技術分野で既知の様々な技法、例えば、表面プラズモン共鳴、生体層干渉法、二重偏波干渉法、静的光散乱、動的光散乱、等温滴定熱量測定、ELISA、分析超遠心、およびフローサイトメトリーを使用して決定され得る。結合親和性を決定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴は、例えば、BIAcore system(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象である。本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、少なくとも10-6Mの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約10-7M、好ましくは、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、または10-12Mの親和性で結合する。
本明細書で使用される「AKT経路」または「PI3K-AKT経路」は、細胞外シグナルに応答して生存および成長を促進するシグナル伝達経路である。関与する主要なタンパク質は、PI3K(ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ)およびAkt(タンパク質キナーゼB)である。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するタンパク質、または免疫グロブリン分子に由来するポリペプチド配列を指す。抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル、複数鎖もしくは一本鎖、またはインタクトな免疫グロブリンであり得、天然源または組換え源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。抗体は、「ヒト化」、「キメラ」、または非ヒトであり得る。
「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって)特異的に相互作用する能力を保持する抗体少なくとも一部分を指す。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’h、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VHおよびCHlドメインからなるFd断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体(sdAb)、例えば、vLまたはvHのいずれか、ラクダ類vHHドメイン、抗体断片から形成された多重特異性抗体、例えば、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片、ならびに抗体の単離されたCDRまたは他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NAR、およびビス-scFvに組み込まれる場合もある(例えば、Hollinger and Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005を参照のこと)。抗原結合断片は、フィブロネクチンIII型(Fn3)等のポリペプチドに基づいて足場にグラフトされる場合もある(フィブロネクチンポリペプチドミニホディについて記載している米国特許第6,703,199号を参照のこと)。
「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、その抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ(κ)軽鎖およびラムダ(λ)軽鎖とは、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「抗がん剤」とは、異常な細胞分裂および成長を抑制するか、新生細胞の移動を抑制するか、侵襲性を抑制するか、またはがんの増殖および転移を予防する薬剤を指す。この用語には、化学療法剤、生物学的薬剤(例えば、細胞毒性遺伝子を送達するsiRNA、ウイルスベクター、例えば、操作されたMLV、アデノウイルス、ヘルペスウイルス)、抗体等が含まれる。
「抗がん効果」という用語は、腫瘍体積の減少、がん細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の延長、がん細胞増殖の低減、がん細胞生存の低減、または癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗がん効果」は、最初の段階でのがんの発症の予防におけるCARの能力によっても現れ得る。
「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、またはそれらの両方を伴い得る。当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むいずれの巨大分子も抗原としての機能を果たすことができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含むいずれのDNAも、それ故に、「抗原」という用語が本明細書で使用される場合に「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことを理解するであろう。本開示は、1つより多くの遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されない。さらに、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原が、生物学的試料から生成されるか、それから合成されるか、またはそれに由来し得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかである。かかる生物学的試料には、他の生物学的成分を有する組織試料、腫瘍試料、細胞、または体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
標的抗原の非限定的な例としては、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原が挙げられる。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、主要組織適合性複合体(MHC)と複合体形成した外来抗原をその表面に呈する免疫系細胞、例えば、アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞等)を指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用してこれらの複合体を認識し得る。APCは抗原をプロセシングし、それらをT細胞に提示する。
「抗感染効果」という用語は、例えば、感染病原体の力価の減少、感染病原体のコロニー計数の減少、感染性状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗感染効果」は、最初の段階での感染の発症の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても現れ得る。
「抗腫瘍効果」または「抗がん効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減、または腫瘍細胞生存の低減を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合モジュール」または「抗原結合セグメント」または「抗原特異的ドメイン(ASD)」とは、一次、二次、または三次配列、翻訳後修飾、および/または電荷のため、高度の特異性で抗原に結合するポリペプチドまたはペプチドを指す。抗原結合ドメインは、異なる源、例えば、抗体(全長重鎖、Fab断片、一本鎖Fv(scFv)断片、二価一本鎖抗体、もしくはダイアボディ)、非免疫グロブリン結合タンパク質、リガンド、または受容体に由来し得る。しかしながら、各々本発明の様々な実施形態で使用され得る、連結されたサイトカイン(サイトカイン受容体を持つ細胞の認識につながる)、アフィボディ、天然に存在する受容体由来のリガンド結合ドメイン、受容体に対する可溶性タンパク質/ペプチドリガンド(例えば、腫瘍細胞上の)、ペプチド、および免疫応答を引き起こすためのワクチン等の多数の代替物が存在する。いくつかの実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、高親和性で所与の抗原に結合するほぼいずれの分子もASDとして使用され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、T細胞受容体(TCR)またはその一部分を含む。例示的な実施形態では、scFVを含む抗原結合ドメインをコードする核酸は、本明細書の配列番号642~902および表6Cに記載される。例示的な実施形態では、scFVを含む抗原結合ドメインをコードするアミノ酸は、本明細書の表6Cの配列番号4555~4815に記載される。
「会合定数(Ka)」という用語は、受容体とリガンドとの会合の平衡定数と定義される。
「自己抗体」とは、自己抗原に特異的なB細胞によって産生される抗体を指す。
「自己抗原」という用語は、自己抗体の産生等の自己免疫応答の産生を刺激する内在性抗原を指す。自己抗原(autoantigen)は、自己免疫疾患の発症をもたらし得る細胞媒介または抗体媒介免疫応答の標的である自己抗原(self-antigen)または正常組織由来の抗原も含む。自己抗原の例としては、デスモグレイン1、デスモグレイン3、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
「結合力」とは、結合剤とその標的との間の相互作用の強度(例えば、抗体とその抗原標的との間、受容体とその同族物との間等の相互作用の強度)を指す。結合力は、弱い場合も強い場合もある。親和性を計算するための結合実験の使用を含む、抗体の抗原に対する親和性を計算するための方法が、当該技術分野で既知である。機能的アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)における抗体活性は、抗体親和性の反映でもある。抗体および親和性は、機能的アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)を使用して、表現型的に特徴付けられ、比較され得る。
本明細書で使用される場合、「骨格」という用語は、CAR(表1)と表2に記載のアクセサリーモジュールとの特定の組み合わせを指す。例示的な実施形態では、様々な骨格を含むCARとアクセサリーモジュールとの特定の組み合わせが表2に記載される。一実施形態では、CARおよびアクセサリーモジュールは、単一の核酸分子によってコードされる。別の実施形態では、CARは、第1の核酸分子によってコードされ、アクセサリーモジュールは、第2の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュールは、アクセサリーモジュール内の成分の数に応じて、1つより多くの核酸分子によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「有益な結果」には、疾患状態の重症度の軽減または緩和、疾患状態の悪化の阻止、疾患状態の治癒、疾患状態の発症の阻止、患者が疾患状態を発症する可能性の低下、および患者の寿命または平均寿命の延長が含まれ得るが、決してこれらに限定されない。非限定的な例として、「有益な結果」または「所望の結果」は、1つ以上の症状の緩和、欠陥の程度の減退、がんの進行の安定した(すなわち、悪化していない)状態、転移または侵襲性の遅延または緩徐化、およびがんに関連する症状の改善または緩和であり得る。
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」または「抗体分子」という用語は、非特異的ドメインよりも高い親和性で標的に結合することができる少なくとも1つのドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片、リガンドドメインまたはその断片(場合によって)を指す。この用語は、抗体および抗体断片、またはリガンドおよびリガンド断片を包含する。別の実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、その複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第1のエピトープに対する結合特異性を有し、その複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第2のエピトープに対する結合特異性を有する。別の実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、2つの抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第2のエピトープに対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。二重特異性分子は、第1の抗原結合ドメインがT細胞に発現する抗原(例えば、CD3ε)に結合し、第2の抗原結合ドメインが病原細胞または疾患関連細胞(例えば、がん細胞)に発現する抗原に結合する、二重特異性T細胞結合抗体であり得る。二重特異性抗体は、それらの第2の抗原結合ドメインによって認識される標的抗原を発現する細胞に対するT細胞媒介細胞毒性を誘導するために使用され得る。本開示に記載の抗原結合ドメインを使用して、二重特異性T細胞エンゲージャーを構築することができる。本開示に記載の抗原結合ドメイン(例えば、scFv)を含む例示的な二重特異性T細胞エンゲージャーの核酸配列は、配列番号3545~3830(表13)に提示される。対応するアミノ酸配列は、配列番号7458~7721に提示される。
「同じエピトープに結合する」とは、例示される抗体、scFv、または他の抗原結合ドメインと同じエピトープを有する、標的抗原に結合する抗体、scFv、または他の抗原結合ドメインの能力を意味する。一例として、例示される抗体、scFv、または他の結合剤および他の抗体のエピトープは、標準のエピトープマッピング技法を使用して決定され得る。当該技術分野で周知のエピトープマッピング技法には、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,New Jerseyが含まれる。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、多数のペプチド(これらのペプチドはタンパク質分子の一部分に相当する)を固体支持体上で同時に合成し、それらのペプチドを依然としてその支持体に結合させながらそれらのペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。かかる技法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第4,708,871号、Geysen et al,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002、Geysen et al,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182、Geysen et al,(1986)Mol.lmmunol.23:709-715に記載されている。CARの抗原結合ドメインによって結合されたエピトープは、エピトープビニングアッセイによっても決定され得る。エピトープビニングは、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体を特徴付けた後にそのライブラリを選別するために使用される競合的免疫アッセイである。抗体が抗原のエピトープへの互いの結合を遮断するかを確認するために、同様の標的に対する抗体がそのライブラリ内の全ての他の抗体に対して対様式で試験される。各抗体がそのライブラリ内の他の抗体の全てに対して作成されたプロファイルを有した後、競合的遮断プロファイルが、そのライブラリ内の他の抗体に対して各抗体に作成される。密接に関連するビニングプロファイルは、これらの抗体が同じまたは密接に関連するエピトープを有し、一緒に「ビニング」される。同様に、立体構造エピトープは、アミノ酸の空間立体構造を決定することによって、例えば、水素/重水素交換、X線結晶学、および二次元核磁気共鳴等によって容易に特定される。例えば、Epitope Mapping Protocols(上記参照)を参照されたい。タンパク質の抗原性領域は、標準の抗原性およびヒドロパシープロット、例えば、Oxford Molecular Groupから入手可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算されたもの等を使用することによって特定される場合もある。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのHopp/Woods法(Hopp et al,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828)、およびヒドロパシープロットのためのKyte-Doolittle技法(Kyte et al,(1982)J.Mol.Bioi.157:1 05-132)を用いる。標的(例えば、CD19)に対する選択されたモノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するかを決定するために、各抗体が市販の試薬(Pierce,Rockford,Ill.)を使用してビオチン化され得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用した競合研究が、CD19-細胞外ドメインコーティングELISAプレートを使用して行われ得る。ビオチン化mAb結合が、ストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼプローブを用いて検出され得る。scFvおよび本出願のCARによって結合されたヒトCD20抗原の例示的なエピトープは、配列番号15149~15154に提供される。scFvおよび本出願のCARによって結合されたヒトBCMAの例示的なエピトープは、配列番号15155~15159に提供される。scFvおよび本出願のCARによって結合されたヒトMPL抗原の例示的なエピトープは、配列番号15160に提供される。
本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体もしくはその断片、ポリペプチド、または核酸について言及する場合、「その等価物」と同義であるよう意図されており、所望の構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意図している。別途本明細書に明確に列挙されない限り、上記のうちのいずれもそれらの等価物を含むことが企図される。例えば、等価物は、参照タンパク質、ポリペプチド、抗体もしくはその断片、または核酸と少なくとも約70%の相同性もしくは同一性、または少なくとも80%の相同性もしくは同一性、またはあるいは少なくとも約85%、またはあるいは少なくとも約90%、またはあるいは少なくとも約95%、またはあるいは少なくとも98%の相同性もしくは同一性を意図し、それと実質的に同等の生物学的活性を呈する。あるいは、ポリヌクレオチドについて言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。あるいは、ポリペプチドまたはタンパク質について言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドまたはタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「CDR」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を意味するよう意図されている。これらの特定の領域は、Kabat et al.,J.Bioi.Chern.252:6609-6616(1977)、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,”Sequences of proteins of immunological interest”(1991)、Chothia et al.,J.Mol.Bioi.196:901-917(1987)、およびMacCallum et al.,J.Mol.Bioi.25 262:732-745(1996)によって説明されており、これらの定義は、互いに比較したときにアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはそのグラフト抗体もしくはバリアントのCDRを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあるよう意図されている。本明細書で使用される場合、抗体の異なるCDRは、それらの異なる定義の組み合わせによっても定義され得る。例えば、vHCDR1は、Kabatに基づいて定義され得、VHCDR2は、Chothiaに基づいて定義され得る。上記の参考文献の各々によって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基は、以下の通りである。
CDR定義
(残基番号は、それらの特定された参照に相当する)。
CDR定義
(残基番号は、それらの特定された参照に相当する)。
本開示のCARの抗原結合ドメインを構成し得る異なるvLセグメントおよびvHセグメントのCDRの配列番号は、それぞれ、配列番号13204~14121および配列番号14122~15039(表6A、B)、および参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2017/064379の表5~6に提供される。
いくつかの実施形態では、標的抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール(Fab様またはFv様抗原結合モジュール等)への言及は、抗原結合モジュールが、(a)他の分子に対する結合親和性の少なくとも約10倍(例えば、約10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000倍、もしくはそれ以上)の親和性で、または(b)他の分子への結合に対するKdの約1/10倍以下(例えば、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1175、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000倍、もしくはそれ未満)のKdで、標的抗原に結合することを意味する。結合親和性は、ELISA、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析、または放射性免疫沈降アッセイ(RIA)等の当該技術分野で既知の方法によって決定され得る。Kdは、例えばBiacore機器を利用する表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ、または例えばSapidyne機器を利用する結合平衡除外アッセイ(KinExA)等の当該技術分野で既知の方法によって決定され得る。
「がん」および「癌性」とは、典型的には未調節細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを説明する。がんの例としては、B細胞リンパ腫(ホジキンリンパ腫および/または非ホジキンリンパ腫)、T細胞リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、皮膚癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、肛門癌、原発部位不明のがん、内分泌癌、精巣癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、生殖器癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌(例えば、多形性膠芽腫)、前立腺癌(アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むが、これらに限定されない)、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。他のがんおよび細胞増殖障害は、当該技術分野で容易に認識されるであろう。「腫瘍」および「がん」という用語は、本明細書で同義に使用され、例えば、これらの両方の用語は、固体および液体、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性がんおよび腫瘍、ならびに悪性がんおよび腫瘍を含む。「がん」という用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性ステージにかかわらず、全てのタイプの癌性成長もしくは発癌性過程、転移性組織もしくは悪性形質転換細胞、組織、または臓器を含むよう意図されている。例示的な固形腫瘍には、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、腺癌、肉腫、および癌腫、例えば、乳房、肝臓、肺、脳、リンパ、胃腸(例えば、結腸)、尿生殖路(例えば、腎細胞、尿路上皮細胞)、前立腺、および咽頭を侵すものが含まれる。腺癌には、大半の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、および食道癌等のがんが含まれる。一実施形態では、がんは、黒色腫、例えば、末期黒色腫である。前述のがんの転移病巣は、本開示の方法および組成物を使用して治療または予防される場合もある。治療または予防され得る他のがんの例としては、膵臓癌、骨癌、皮膚癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、頭部または頸部癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性または急性白血病(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む)、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、環境誘発癌(アスベストによって誘発されるものを含む)、およびそれらのがんの組み合わせが挙げられる。転移性がん、例えば、PD-L1を発現する転移性がん(Iwai et al.(2005)Int.Immunol.17:133-144)の治療は、本明細書に記載の抗体分子を使用して達成され得る。成長が抑制され得る例示的ながんには、典型的には免疫療法に応答するがんが含まれる。加えて、再発性または難治性悪性腫瘍は、本明細書に記載の分子を使用して治療され得る。
「化学療法剤」とは、がんの化学療法に使用されることで知られている化合物である。化学療法剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド;スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ;エチレンイミンおよびメチラメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミン;アセトゲニン(特に、ブラタシンおよびブラタシノン);カンプトセシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む);クリプトフィジン(特に、クリプトフィジン1およびクリプトフィジン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンギスタチン;ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ1IおよびカリケアマイシンオメガI1(例えば、Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)を参照のこと);ジネマイシン、例えば、ジネマイシンA;ビスホスホネート、例えば、クロドロネート;エスペラマイシン;ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシン(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;抗代謝物、例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルチン;ジアジクオン;エルホルミチン;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン(lonidainine);メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラキュリンA、ロリジンA、およびアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、タキソール(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE(登録商標)パクリタキセルのクレモフォール不含アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)、およびTAXOTERE(登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France);クロラムブシル;GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金類似体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE;ビノレルビン;ノバトロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(Camptosar、CPT-11)(5-FUおよびロイコボリンでのイリノテカンの治療レジメンを含む);トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;カペシタビン;コンブレタスタチン;ロイコボリン(LV);オキサリプラチン、例えば、オキサリプラチン治療レジメン(FOLFOX);ラパチニブ(Tykerb);細胞増殖を低減するPKC-アルファ、Raf、H-Ras、EGFR(例えば、エルロチニブ(Tarceva(登録商標)))、およびVEGF-A阻害剤;ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。
「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、養子細胞移入と呼ばれる技法を使用したがん療法としての使用に企図された人工的(天然に存在しない)免疫細胞(例えば、T細胞)受容体である。CARは、人工的T細胞受容体、キメラT細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても既知である。この複合体の抗原結合、シグナル伝達、および刺激機能は、遺伝子組換え法によって一般にキメラ抗原受容体(CAR)と称される単一のポリペプチド鎖に操作されている。例えば、Eshhar(米国特許第7,741,465号)、Eshhar(米国特許出願公開第2012/0093842号)を参照されたい。CARは、CARが結合する特異的抗原に応答してT細胞活性化および増殖を刺激するように特異的に構築されている。一般に、CARは、免疫エフェクター細胞に発現されると、免疫エフェクター細胞に、標的細胞、典型的には、がん細胞に対する特異性、および細胞内シグナル生成を提供する一組のポリペプチド、最も単純な実施形態では、典型的には2つのポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、CARは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに刺激分子および/または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書で「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)を含む。いくつかの態様では、この一組のポリペプチドは、互いに隣接している。一態様では、刺激分子は、ゼータ鎖T細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下で定義される少なくとも1つの共刺激分子に由来する1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施形態では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、4-lBB(すなわち、CD137)、CD27、および/またはCD28から選択される。一実施形態では、CARは、CAR融合タンパク質のアミノ末端(N末端)に任意選択的なリーダー配列を含む。一実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメインのN末端にリーダー配列をさらに含み、このリーダー配列は、細胞プロセシングおよびCARの細胞膜への局在化中に、抗原結合ドメイン(例えば、scFv)から任意選択的に切断される。様々な実施形態では、CARは、抗原特異的ドメイン(ASD)、ヒンジ領域(HR)、膜貫通ドメイン(TMD)、任意選択的な共刺激ドメイン(CSD)、および細胞内シグナル伝達ドメイン(ISD)を含む組換えポリペプチドである。任意選択的な共刺激ドメインは、一般に、第一世代CAR構築物には不在である。本開示に記載の異なる抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を含み、かつNEMO-K277AおよびPACをコードするアクセサリーモジュールを共発現するいくつかの例示的な第一世代CARの標的抗原、抗原結合ドメイン名、および核酸配列は、配列番号1594~1899(表12)に提示される。これらのCAR構築物は、ヒトCD8シグナルペプチド、CD8ヒンジおよび膜貫通領域、ならびにヒトCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有する。これらの構築物は、抗原結合ドメインとCD8ヒンジ領域との間にMYCリンカーも任意選択的に有する。本開示に記載の異なる抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を含み、かつvFLIP K13およびPACをコードするアクセサリーモジュールを共発現するいくつかの例示的な第一世代CARの核酸配列は、配列番号1016-1317(表13)に提示される。本開示に記載の異なる抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を含み、かつ41BB共刺激ドメインを組み込むいくつかの例示的な第二世代CARの核酸配列は、配列番号1318-1593(表13)に提示される。これらのCAR構築物は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとフーリン-SGSG-T2A配列によってCARカセットから分離されたピューロマイシン耐性遺伝子(PAC)をコードするアクセサリーモジュールとの間にMYCリンカーも有する。vFLIP-K13、NEMO-K277A、およびPACをコードするアクセサリーモジュールは、上記の第一および第二世代CARにおいて任意選択的である。したがって、本開示に記載の抗原結合ドメイン(すなわち、vLおよびvH断片、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を含むCARは、vFLIP-K13、NEMO-K277A、および/またはPACなしで構築されていてもよい。したがって、これらのアクセサリーモジュールは、上流切断リンカー配列(例えば、F2A、P2A、またはT2A)とともに、配列番号1016~1899によって表されるCARから欠失し得る。あるいは、vFLIP-K13、NEMO-K277A、および/またはPACをコードするアクセサリーモジュールは、他のタンパク質、例えば、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E、およびMyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2、TCL-1A、MTCP-1、およびCMV-141等をコードするアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。本明細書で使用される場合、「CAR」または「CARs」という用語は、抗原特異性を、細胞、例えば、抗体-TCRキメラ分子またはAb-TCRまたはAb-TCR(参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1)、TCR受容体融合タンパク質またはTFP(参照により本明細書に組み込まれるWO2016/187349 A1)、合成免疫受容体(SIR)(参照により本明細書に組み込まれるWO2018/102795 A1を参照のこと)、三官能性T細胞抗原カップラー(Tri-TAC)(参照により本明細書に組み込まれるWO2015/117229 A1を参照のこと)に付与するためのより新たなアプローチも包含む。本開示に記載されており、かつCD3ε鎖、CD3δ鎖、CD3γ鎖、およびCD3ζ鎖に基づく異なる抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を含み、かつ任意選択的なアクセサリーモジュールNEMO-K277Aを共発現するいくつかの例示的なTFPの核酸配列は、それぞれ、配列番号1900~2205、2206~2511、2512~2817、2818~3123(表13)に提示される。異なるCARアーキテクチャおよびBiTE構築物に含まれる抗原結合ドメインの順序は、表13に列記されるは、表12に提示されるzCAR-K277Aアーキテクチャ上の構築物の順序と同じである。したがって、所与のアーキテクチャ(例えば、zCAR-K13)に属し、かつ特異的抗原結合ドメインを含むCARのアミノ酸および核酸配列番号は、表12および表13の試験によって決定され得る。したがって、表12は、zCAR-NEMO-K277Aアーキテクチャ上にあり、かつhuFMC63-11-(vL-vH)抗原結合ドメインを含むCARが、表12の第2の構築物であり、それぞれ、核酸およびアミノ酸配列番号1595および5508によって表されることを示す。zCAR-K13アーキテクチャ上の対応するCARの核酸およびアミノ酸配列番号は、このアーキテクチャ上の第2の構築物が、それぞれ、核酸およびアミノ酸配列番号1017および4930を有することを示す表13の試験によって決定され得る。同様のアプローチを使用して、異なるアーキテクチャおよびBiTEに属する他のCAR構築物の核酸およびアミノ酸配列番号を決定することができる。表10は、異なる骨格に属し、かつHIV1-N49P6 vLおよびvH抗原結合ドメインに基づくHIV-1エンベロープ糖タンパク質を標的とするいくつかの例示的なCARの核酸およびアミノ酸配列番号を提供する。表11は、表10に示される骨格に属するが、異なる抗原結合ドメインを含むいくつかの例示的なCARの核酸およびアミノ酸配列番号を提供する。したがって、表11に示される抗原結合ドメインを含む特定の骨格上のCARの核酸およびアミノ酸配列番号は、表10におけるその順位を最初に決定することによって決定され得る。したがって、vFLIP-K13骨格を有する第一世代CARは、表10のリストにおける第3のCARであり、vFLIP-K13を共発現し、かつHIV1-N49P7抗原結合ドメインを含む第一世代CARの核酸配列番号が配列番号8740であると表11から容易に決定され得る(すなわち、8738から始まるシリーズの第3の構築物)。同様のアプローチを使用して、このCAR構築物のアミノ酸配列番号が配列番号11438であると決定される。CARが設計においてモジュラーであるため、異なる抗原結合ドメインまたはアクセサリーモジュールを含むCAR/BiTEの核酸およびアミノ酸配列は、異なるモジュールならびに本開示に開示される例示的なCARおよびBiTE構築物の配列を使用して、当業者によって容易に決定され得る。典型的には、キメラ抗原受容体を発現するように操作されたT細胞を指す「CAR-T細胞」が使用される。したがって、かかるCARを持つTリンパ球は、一般に、CAR-Tリンパ球と称される。CARは、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞(iPSC)、NK細胞、およびマクロファージ等のT細胞以外の細胞に発現される場合もある。
「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」とは、特定の宿主細胞の好ましいコドン使用を指す。当業者に理解されるであろうように、特定の宿主におけるその発現を増強するようにコード配列を修飾することが有利であり得る。遺伝暗号は64個の可能なコドンで重複しているが、大半の生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も頻繁に利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、めったに利用されないコドンは、稀なコドンまたは使用頻度の低いコドンに分類される。
特定の原核または真核宿主に好まれるコドンを含む最適化コード配列(Murray et al.(1989)Nucl.Acids Res.17:477-508も参照のこと)は、例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較してより長い半減期等の望ましい特性を有する組換えRNA転写物の翻訳速度を上昇させるか、またはそれを産生するように調製され得る。翻訳終止コドンは、宿主選好を反映するように修飾される場合もある。当業者であれば、遺伝暗号の縮重性質のため、ヌクレオチド配列が異なる様々なDNA化合物を使用して、本開示の所与のポリペプチドをコードすることができることを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「共発現」とは、2つ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を指す。遺伝子は、例えば、単一のポリペプチド鎖として単一のタンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸であり得る。本明細書に記載のCARまたはTCRは、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖として発現され得、これは、その後、各々はっきりと異なる機能単位を表す異なるポリペプチドに切断される。いくつかの実施形態では、CARまたはTCRが2つ以上の機能的ポリペプチド単位からなる場合、異なる機能単位は、1つ以上のポリヌクレオチド鎖を使用して共発現される。一実施形態では、共刺激は、CARまたはTCRと共発現されるが、CARまたはTCRポリペプチドの不可欠な部分ではないアクセサリーモジュールによって提供される。CARもしくはTCR発現細胞または任意の細胞に共刺激を提供するが、CARまたはTCRポリペプチドの不可欠な部分ではないアクセサリーモジュールは、CAR非依存的共刺激モジュールまたはCICMと称される。別の実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、切断可能なリンカー(例えば、T2A、F2A、P2A、E2A等)をコードする核酸配列によって連結される(表6D)。別の実施形態では、Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG)モチーフ(配列番号4844)も、切断の効率を増強するために、切断可能なリンカー配列の上流に付加される。CARまたはTCRの異なる単位をコードするポリヌクレオチドは、IRES(内部リボソーム侵入部位)配列によって連結され得る。あるいは、CARまたはTCRの異なる機能単位は、リンカーによって連結されないが、代わりに、例えば、2つの異なるベクターによってコードされる2つの異なるポリヌクレオチドによってコードされる。例示的な切断可能なリンカーおよびフーリン切断部位の核酸およびアミノ酸配列は、表6Dに提供される。
「保存的置換」または「保存的配列修飾」とは、コードされたタンパク質の結合特性または機能に著しく影響を及ぼさないまたはそれを改変しないアミノ酸修飾を指す。例えば、「保存的配列修飾」とは、本開示のCAR構築物の結合特性または機能に著しく影響を及ぼさないまたはそれを改変しないアミノ酸修飾(例えば、定常鎖、抗体、抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインの保存的変化)を指す。かかる保存的修飾には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発等の当該技術分野で既知の標準の技法によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐状側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本開示のCAR内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換され得、改変されたCARは、本明細書に記載の結合アッセイおよび/または機能的アッセイを使用して試験され得る。
「T細胞受容体-アルファの定常領域」または「T細胞受容体-アルファの定常鎖」または「TCRα」または「Cα」という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15041または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。本開示は、SIRおよびAb-TCRの構築に使用され得るTCRαポリペプチドにある特定の突然変異も提供する(表3および表6D)。例えば、増加した発現および減少した誤対合を示すCαにおける突然変異部位は、配列番号15041の91位、92位、93位、および94位に位置する。CαにThr 48 Cys(T48C)突然変異を有し、かつCβ1鎖またはCβ2鎖にSer-57-Cys(S57C)突然変異を有するTCRポリペプチド(本明細書の他の箇所でより完全に記載される)により、2つのTCR定常鎖(αおよびβ)間に追加のジスルフィド結合がもたらされる。これは、次いで、免疫細胞における内在性TCR鎖との減少した誤対合および増強された機能性をもたらす。同様に、Cα(配列番号15048)にSer 61 Arg(S61R)突然変異およびCβ1鎖またはCβ2鎖にArg 79 Gly(R79G)突然変異を有するCAR(本明細書の他の箇所でより完全に記載される)により、内在性TCR鎖との減少した誤対合および増強された機能性がもたらされ、これは、対合の「ノブアンドホール」設計のためである。本開示は、SIRおよびAb-TCRの構築に使用され得る以下の表3による突然変異のうちの1つ以上または全てを有するCαポリペプチドを提供する。
ヒトゲノムは、2つの高度に相同性のTCRベータ定常鎖、TCRベータ1(TCRβ1またはTCRb1またはcβ1)およびTCRベータ2(TCRβ2またはTCRb2またはcβ2)をコードする。本開示のCARは、これらの2つの鎖のいずれかを含み得る。同様に、他の哺乳類種のTCRベータ1鎖またはTCRベータ2鎖のいずれかが本開示の方法に使用され得る。
「T細胞受容体-ベータ1定常鎖」または「T細胞受容体-ベータ1の定常領域」(TCR-ベータ1またはTCRβ1またはTCRb1またはhTCR-ベータ1またはCβ1)という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15051または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。
「T細胞受容体-ベータ2の定常鎖」または「T細胞受容体-ベータ2の定常領域」(TCR-ベータ2またはTCRβ2またはTCRb2またはCβ2)という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15052または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。
「T細胞受容体-ベータの定常鎖」または「T細胞受容体-ベータの定常領域」(TCR-ベータまたはTCRβまたはTCRbまたはCβ)という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15051-15053または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。
Cβ2(配列番号15052)およびCβ1(配列番号15051)の両方のタンパク質配列が既知である(表6D)。Cβ2配列とβ1配列との間の相違は、当該技術分野で典型的な通常の技能を使用して、これらの配列を整列させることによって容易に特定される。本開示は、SIRおよびAb-TCRの構築に使用され得るTCRβにある特定の突然変異も提供する。例えば、増加した発現および内在性TCRα鎖との減少した誤対合を示すCβにおける突然変異部位が本明細書に提供される。Cβ1およびCβ2におけるこれらの突然変異部位は、配列番号15051および15052の18位、22位、57位、79位、133位、136位、および139位に位置し、以下の表4および表5に要約される。Cβ1およびCβ2における突然変異部位は、それらの位置で同一である。2つの配列間の唯一の相違点は、136位の突然変異である。この位置で、グルタミン酸(E)がCβ2に存在する一方で、バリンはCβ1に存在する。
「TCR-ガンマの定常鎖」または「TCR-ガンマの定常領域」(TCR-ガンマまたはTCRγまたはTCRgまたはTCR-ガンマ1またはTCRγ1またはTCRg1またはCγ)という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15068または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。
「TCR-デルタの定常鎖」または「TCR-デルタの定常領域」(TCR-デルタまたはTCRδまたはTCRdまたはCδ)という用語は、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来の配列番号15069または等価残基(すなわち、相同体)として提供されるタンパク質と定義される。
タンパク質が互いに同一性または相同性を有し、同様または同一の機能を保持し得ることが認識されるであろう。本開示は、生物学的活性を保持しながら、本明細書に記載の配列のうちのいずれかに85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%、または99.9%の同一性を有するTCR定常領域を含む。
したがって、本開示は、(a)配列番号15041と少なくとも98%同一であり、61位、91位、92位、93位、および/または94位に1つ以上の突然変異を有し得るアミノ酸配列、(b)配列番号15051と少なくとも98%同一であり、18位、22位、57位、79位、133位、136位、および/または139位に1つ以上の突然変異を有し得るアミノ酸配列、(c)配列番号15052と少なくとも98%同一であり、18位、22位、57位、79位、133位、136位、および/または139位に1つ以上の突然変異を有し得るアミノ酸配列、(d)配列番号15068と少なくとも98%同一のアミノ酸配列、および(e)配列番号15069と少なくとも98%同一のアミノ酸配列からなる群から選択される配列を有するT細胞受容体定常鎖を提供する。(a)~(e)のうちのいずれかのT細胞受容体定常鎖は、それが同一性または相同性を有する野生型T細胞受容体定常鎖の少なくとも1つの生物学的活性を保持する。
「構成的に活性な」という用語は、刺激を必要とすることなくシグナル伝達活性を有する分子、例えば、タンパク質を指す。例示的な構成的に活性なタンパク質は、NEMO-K277AおよびvFLIP K13であり、これらは、さらなる刺激を必要とすることなく好適な細胞に発現されるとNF-κBシグナル伝達を活性化することができる。
「共刺激分子」または「共刺激受容体」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、増殖等であるが、これに限定されない、T細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激細胞外分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、Dap10、CD27、CD28、CD2、CD5、CD8、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、および4-1BB(CD137)が含まれるが、これらに限定されない。かかる共刺激分子のさらなる例としては、CD8、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDlOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IP0-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、およびCD83に特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激受容体は、細胞、他のT細胞、例えば、NK細胞またはマクロファージに発現される。
「共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン(CSD)」とは、共刺激受容体の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球性活性化分子(SLAMタンパク質)、および活性化NK細胞受容体で表され得る。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD8、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、その分子が由来する、その分子の全細胞内部分、または全天然細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその機能的断片もしくは誘導体を含み得る。本開示のCARは、1つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
「cTCR」という用語は、抗原結合ドメインに連結される野生型TCR核酸コード配列および対応する野生型TCRタンパク質を指す。cTCRは、いくつかの実施形態で使用され、参照対照である。例えば、CD19結合ドメインを有するcTCRおよびCD19-CAR(突然変異体TCR鎖およびCD19結合ドメインを含む)は、標的抗原と異なる発現および/または異なる結合親和性を有するであろう。
「サイトゾル」または「細胞質」という用語は、細胞の細胞質にその成熟形態で位置する薬剤、例えば、タンパク質を指す。サイトゾルタンパク質は、核内に移動することができるが、膜貫通タンパク質ではなく、細胞外で分泌されない。例示的なサイトゾルタンパク質は、vFLIP K13である。
「変性障害」という用語は、通常の身体の衰えによるか、運動または食習慣等の生活様式の選択によるかにかかわらず、経時的に次第に悪化するであろう組織または臓器に影響を及ぼす変性細胞変化に基づく連続過程の結果である疾患を指す。例示的な変性疾患としては、アルツハイマー病、シャルコー・マリー・ツース病、クロイツフェルト・ヤコブ病、フリードライヒ失調症、真性糖尿病(II型)、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
本明細書で使用される「に由来する」という用語は、第1の分子と第2の分子との間の関係を示す。これは、概して、第1の分子と第2の分子との間の構造的類似性を指し、第2の分子に由来する第1の分子に対する過程または源の限定を暗示するものでも含むものでもない。例えば、抗体分子に由来する抗原結合ドメインの場合、抗原結合ドメインは、それが必要な機能、すなわち、抗原に結合する能力を有するように、十分な抗体構造を保持する。これは、その抗体を産生する特定の過程に対する制限を暗示するものでも含むものでもなく、例えば、これは、抗原結合ドメインを提供するために、抗体配列から開始し、抗原結合ドメインに到達するように望ましくない配列を欠失させるか、または突然変異を課さなければならないことを意味しない。
本明細書で使用される「二量体化分子」という用語は、第1のスイッチドメインの第2のスイッチドメインとの会合を促進する分子を指す。実施形態では、二量体化分子は、対象に天然に存在しないか、または著しい二量体化をもたらすであろう濃度で存在しない。実施形態では、二量体化分子は、小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、RAD001、Rimiducid、またはAP20187である。Rimiducid(AP1903)は、ホモ二量体化活性を有する脂質透過性タクロリムス類似体である。Rimiducidは、単一の酸置換(Phe36Val)を含むヒトタンパク質の類似体FKBP12(Fv)をホモ二量体化する。Rimiducidは、天然に存在しない免疫受容体のFv含有薬物結合ドメインをホモ二量体化するために使用され、細胞療法中に下流シグナル伝達活性化をもたらす。Rimiducidは、約0.01~1mg/kgであり得、細胞培養下で約0.1nMのEC50を有する。AP20187は、約2~10mg/kg/日で、単回投与または複数回投与で投与され得る。
「標的抗原の発現に関連する疾患」または「本明細書に記載の疾患関連抗原」という語句には、本明細書に記載の標的抗原の発現に関連する疾患または本明細書に記載の標的抗原を発現する細胞に関連する状態、例えば、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪性腫瘍もしくは前癌状態、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、または本明細書に記載の標的抗原を発現する細胞に関連する非癌関連適応症が含まれるが、これらに限定されない。一態様では、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連するがんは、血液癌である。一態様では、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連するがんは、固形がんである。本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連するさらなる疾患には、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非定型および/もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前癌状態、または増殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の標的抗原の発現に関連する非がん関連適応症には、例えば、自己免疫疾患(例えば、ループス)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)、ならびに移植が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的抗原発現細胞は、標的抗原をコードするmRNAを発現するか、または任意の時点で発現される。別の実施形態では、標的抗原発現細胞は、標的抗原タンパク質(例えば、野生型または突然変異体)を産生し、標的抗原タンパク質は、正常なレベルまたは低下したレベルで存在し得る。別の実施形態では、標的抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの標的抗原タンパク質を産生し、その後、実質的に検出不能な標的抗原タンパク質を産生した。
本明細書で使用される「遺伝子修飾された細胞によって標的とされる疾患」は、治療的に有益な結果をもたらすために遺伝子修飾された細胞が罹患細胞を標的とするか健常細胞を標的とするかにかかわらず、本発明の遺伝子修飾された細胞によるいずれかの様式で任意の疾患に関与する任意の細胞の標的を包含する。遺伝子修飾された細胞には、遺伝子修飾されたT細胞、NK細胞、造血幹細胞、多能性胚幹細胞、または胚幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子修飾された細胞は、従来のCARおよび本発明のアクセサリーモジュールを有する従来のCARを含む新規の骨格を発現し、これらのCARは、標的細胞の表面に発現される抗原のうちのいずれかを標的とし得る。標的とされ得る抗原の例としては、B細胞に発現する抗原;癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽細胞腫に発現する抗原;様々な免疫細胞に発現する抗原;ならびに様々な血液疾患、自己免疫疾患、および/または炎症性疾患に関連する細胞に発現する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的とされ得る他の抗原は当業者には明らかであり、その代替実施形態に関連して本発明のCARによって標的とされ得る。
「解離定数(Kd)」という用語は、受容体-リガンド相互作用の解離の平衡定数と定義される。
本明細書で使用される場合、「多様な組の天然に存在しない免疫受容体」または「多様な組のSIR」または「多様な組のCAR」とは、同じ結合ドメインが多様な組のT細胞受容体定常鎖または「骨格」に連結された複数の天然に存在しない免疫受容体を指し、結合ドメインおよび異なるT細胞定常鎖または骨格を含む各構築物は、標的抗原に多様な範囲の結合および/または様々な発現レベルを提供する。例えば、定常ドメインの突然変異組成(例えば、突然変異体TCRa+TCRb)に応じて、結合ドメインのその標的に対する結合親和性は変化する。いくつかの実施形態では、本開示のSIR(一本鎖またはヘテロ二量体)は、同じ結合ドメインを有する野生型TCR(例えば、cTCR)を超える結合親和性を含む。一実施形態では、SIRは、cTCRよりも高い(少なくとも1.25倍~約10,000倍(およびそれらの間のいずれの数)の)発現レベルを有し、SIRおよびcTCRは、TCRドメインにおける突然変異のみが異なる。別の実施形態では、SIRは、同じ抗原への結合ドメインを有するcTCRよりも少なくとも1.5倍~約10,000倍高い標的に対する結合親和性を有する。さらに別の実施形態では、SIRは、同じ抗原に対してcTCRよりも高いが、同じ結合ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR)よりも低い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、SIR発現エフェクター細胞の標的抗原への結合は、対応するcTCR発現エフェクター細胞の結合よりも少なくとも1.25倍高いが、対応するcTCRよりも100,000倍未満高い。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約10-4M~10-8Mの解離定数(KD、その結合親和性を反映するもの)を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、上に列挙される抗原のうちの1つ以上に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約10-4M~10-8M、例えば、約10-5M~10-7M、例えば、約10-5M~10-6Mの標的抗原に対するKDを有する。一実施形態では、抗原結合ドメインの結合親和性は、参照抗体よりも少なくとも5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、または1,000倍低い。一実施形態では、コードされた抗原結合ドメインは、参照抗体よりも少なくとも5倍低い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、参照抗体は、抗原結合ドメインが由来する抗体である。例えば、本開示は、TCR鎖における核酸配列コドン最適化および/または突然変異に基づいて設計およびスクリーニングされて、結合ドメインおよびTCRドメインの対合もしくは発現および/またはそれらの間のリンカーの使用を促進し得る特定の抗原標的に対するSIRの多様な集団を企図する。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる抗原の一部分、または抗体もしくは抗体断片に結合する抗原の一部分であると定義される。エピトープは、タンパク質配列または部分配列であり得る。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドプラスミドまたはリポソーム内に含有されるプラスミド)、およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)を含む、当該技術分野で既知のもの全てが含まれる。
「機能的部分」という用語は、CARに関して使用される場合、CARの任意の部分または断片を指し、この部分または断片は、その一部であるCAR(親CAR)の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親CARと同様の程度、同じ程度、またはそれを超える程度に、標的細胞を認識するか、または疾患を検出、治療、または予防する能力を保持するCARの一部を包含する。親CARに関して、機能的部分は、例えば、親CARの約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%、またはそれ以上を含み得る。
本明細書で使用される「遺伝子修飾された細胞」、「再指向された細胞」、「遺伝子操作された細胞」または「修飾された細胞」とは、本開示のCARを発現する細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、CARをコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、同じベクター内のCARおよび1つ以上のアクセサリー分子をコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、CARをコードする第1のベクターおよびアクセサリー分子をコードする第2のベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、CARをコードする第1のベクターおよび1つより多くのアクセサリー分子をコードする第2のベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、CARをコードする第1のベクターおよび第1のアクセサリー分子をコードする第2のベクターおよび第2のアクセサリー分子をコードする第3のベクターを含む。
本明細書で使用される「ヒンジ領域(HR)」とは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域を指す。ヒンジ領域には、抗体またはその断片もしくは誘導体のFc断片、抗体またはその断片もしくは誘導体のヒンジ領域、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工的スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ヒンジ領域の例としては、CD8aヒンジ、および例えばGly3と同程度に小さくあり得るポリペプチドから作製された人工的スペーサー、またはIgG(ヒトIgG4等)のCH1およびCH3ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、(i)IgG4のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、(ii)IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ領域およびCH2領域、(iv)CD8aのヒンジ領域、(v)IgG1のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、(vi)IgG1のヒンジ領域または(vi)IgG1のヒンジ領域およびCH2領域のうちのいずれか1つ以上である。他のヒンジ領域は当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態に関連して使用され得る。
「免疫障害」という用語は、免疫系の機能不全を特徴とする疾患を指す。自己免疫疾患は、正常な身体部分に異常な免疫応答に起因する状態である。自己免疫疾患には少なくとも80種がある。
本明細書で使用される「免疫細胞」とは、抗原提示細胞、B細胞、好塩基球、細胞毒性T細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーT細胞、白血球、リンパ球、マクロファー、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、プラズマ細胞、およびT細胞を含むが、これらに限定されない哺乳類免疫系の細胞を指す。
本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、T細胞、例えば、アルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、マスト細胞、ならびに骨髄球由来の食細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター応答」、「エフェクター機能」とは、分化細胞の特殊化機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害を促進するT細胞またはNK細胞の特性を指す。T細胞の場合、一次刺激および共刺激が、免疫エフェクター機能または応答の例である。抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)の場合、抗原提示およびサイトカイン分泌がエフェクター機能の例である。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、先天性免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症性応答、後天性(適応的)免疫、自己免疫、および/または過剰活性免疫を含むが、これらに限定されない免疫を指す。
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン(ISD)」または「細胞質ドメイン」という用語は、分子の細胞内シグナル伝達部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能の例としては、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性が挙げられる。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例としては、T細胞受容体複合体のz鎖またはその相同体のうちのいずれか(例えば、h鎖、FceR1gおよびb鎖、MB1(Iga)鎖、B29(Igb)鎖等)、ヒトCD3ゼータ鎖、CD3ポリペプチド(D、d、およびe)、sykファミリーチロシンキナーゼ(Syk、ZAP 70等)、srcファミリーチロシンキナーゼ(Lck、Fyn、Lyn等)、ならびにT細胞形質導入に関与する他の分子、例えば、CD2、CD5、およびCD28が挙げられるが、これらに限定されない。他の細胞内シグナル伝達ドメインは当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態に関連して使用され得る。
別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3zの細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28または41BB等の共受容体または共刺激分子由来の細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして既知のシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD3ゼータ、一般的なFeRガンマ(FCER1G)、FeガンマRIIa、FeRベータ(FeイプシロンR1b)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAPlO、およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の物質を実質的に含まない分子または生物学的薬剤または細胞物質を指す。一態様では、「単離された」という用語は、核酸、例えば、それぞれ、天然源に存在する他のDNAもしくはRNA、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官とは別個の、DNAもしくはRNA、またはタンパク質もしくはポリペプチド(例えば、抗体もしくはその誘導体)、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。「単離された」という用語は、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地(組換えDNA技法によって産生された場合)、または化学的前駆体もしくは他の化学物質(化学的に合成された場合)を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、かつ天然状態で見られないであろう核酸断片を含むよう意図されている。「単離された」という用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すためにも本明細書で使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含するよう意図されている。「単離された」という用語は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すためにも本明細書で使用され、培養された細胞または組織および操作された細胞または組織の両方を包含するよう意図されている。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語(別名、「リンカードメイン」または「リンカー領域」)は、それぞれ、本明細書に開示されるCARポリヌクレオチドまたはポリペプチドの2つ以上のドメインまたは領域を一緒に連結するオリゴまたはポリペプチド(またはポリペプチドをコードするオリゴ)を指す。リンカーは、1~500アミノ酸長または3~1500ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、「リンカー」は、切断可能または切断不能である。別途特定されない限り、本明細書で使用される「リンカー」という用語は、切断不能なリンカーを意味する。この切断不能なリンカーは、互いに対する隣接するタンパク質ドメインの運動の自由度を可能にする可動性残基で構成され得る。かかる残基の非限定的な例としては、グリシンおよびセリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、非可動性残基を含み得る。切断可能なリンカーの例としては、2Aリンカー(例えば、T2A)、2A様リンカー、またはそれらの機能的等価物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーには、ピコルナウイルス2A様リンカー、ブタテッショウウイルス(P2A)のCHYSEL配列、ゾセアアシグナウイルス(T2A)のCHYSEL配列、またはそれらの組み合わせ、バリアント、および機能的等価物が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、2Aグリシンと2Bプロリンとの間の切断をもたらすモチーフを含み得る(例えば、T2A配列、配列番号4839および4840、C末端Gly-Proを参照のこと)。いくつかの例示的な切断可能なリンカーの核配列は、配列番号925~配列番号930に提供され、いくつかの例示的なリンカーのアミノ酸配列は、配列番号4838~配列番号4843に提供される。本明細書で使用され得る他の切断可能なリンカーは、当業者によって容易に理解される。
ある実施形態では、Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG)モチーフ(配列番号931-32)も、切断の効率を増強するために、切断可能なリンカー配列の上流に付加される。切断可能なリンカーの潜在的な欠点は、N末端タンパク質の終端に残存する小さい2Aタグがタンパク質機能に影響を及ぼし得るか、またはタンパク質の抗原性に寄与し得る可能性である。この制限を打開するために、いくつかの実施形態では、フーリン切断部位(RAKR)(配列番号933~935)がSGSGモチーフの上流に付加されて、翻訳後の残留2Aペプチドの切断を容易にする。
本明細書で使用される「可動性ポリペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖を一緒に(例えば、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に)連結するための、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシン残基および/またはセリン残基等のアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)n、(配列番号4191~4192)を含み、ここで、nは、1以上の正の整数である。例えば、n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9、およびn=10である。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーには、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3(配列番号4193または4194)が含まれるが、これらに限定されない。参照により本明細書に組み込まれるW02012/138475に記載のリンカーも本開示の範囲に含まれる。
「レンチウイルス」という用語は、Retroviridaeファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中で特有であり、これらは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNAに送達することができ、それ故に、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法のうちの1つである。HIV、SIV、およびFIVは全て、レンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)に提供される特に自己不活性化レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術およびLentigenのLENTIMAX(商標)ベクター系等が挙げられるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも入手可能であり、当業者に既知であろう。レンチウイルスベクターの他の例は、pLENTI-EF1α(配列番号3837)、pLENTI-EF1α-DWPRE(配列番号3838)、pCCLc-MNDU3-WPRE(配列番号7779)、およびpCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE(配列番号7780)である。pLenti-EF1a-DWPREは、WPRE配列の欠失によってpLENTI-EF1αベクターから得られたものである。内部Sac II断片は、EF1アルファ(EF1a)-D-SACII-プロモーター(配列番号3842)を生成するためにEF1αプロモーターから欠失させたものである。例示的な実施形態では、CAR、CARおよびアクセサリーモジュール(複数可)、またはアクセサリーモジュール(複数可)をコードする核酸断片は、当該技術分野で既知の方法を使用してpLENTI-EF1αおよびpCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPREベクターに存在するNhe I部位とSal I部位との間にクローン化され得る。
本明細書で使用される「哺乳動物」とは、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種;家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ;家畜哺乳動物、例えば、イヌおよびネコ;齧歯類を含む実験動物、例えば、マウス、ラット、およびテンジクネズミ等を含むが、これらに限定されない、哺乳類クラスの任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、成人および新生児対象、ならびに胎児は、男性(雄)であるか女性(雌)であるかにかかわらず、この用語の範囲に含まれるよう意図されている。
本明細書で使用される「ネイキッドDNA」とは、発現に適切な配向で好適な発現ベクター内にクローン化されたCARをコードするDNAを指す。使用され得るウイルスベクターには、SINレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ハイブリッドベクター、および/またはプラスミドトランスポゾン(例えば、Sleeping Beautyトランスポゾン系)もしくはインテグラーゼベースのベクター系が含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替実施形態に関連して使用され得る他のベクターは、当業者に明らかであろう。
本明細書で使用される「天然」または「天然に存在する」または「内在性」とは、細胞に天然に存在するか、または細胞に自然に発現する遺伝子、タンパク質、核酸(例えば、DNA、RNA等)、またはそれらの断片を指す。したがって、T細胞の天然または内在性TCRα鎖ポリペプチドは、TCRα定常鎖に連結された可変ドメイン(Vα)からなる。天然または内在性TCRα鎖前駆体ポリペプチドは、成熟ポリペプチドから切断されたアミノ末端シグナルペプチドからなるものでもある。
NF-カッパ-B必須モジュレーター(NEMO)とは、NF-κB活性化に必要なIκBキナーゼ複合体の足場タンパク質成分を指す。NF-κBは、炎症、細胞増殖、およびアポトーシスを制御する転写因子である。
「NF-κB経路」または「NF-κBシグナル伝達経路」とは、NF-κBサブユニットの核転座およびNF-κBサブユニット応答性遺伝子の転写活性化をもたらすシグナル伝達経路を指す。NF-κBは、炎症および免疫応答に関与するいくつかの遺伝子の発現の調節に関与する転写因子のファミリーを指す。現在に至るまでにこのファミリーの5つの既知のメンバーが特徴付けられており、c-Rel、NF-κB1(p50およびその前駆体p105)、NF-κB2(p52およびその前駆体p105)、p65(RelA)、ならびにRelBを含む。NF-κBの多くの二量体形態が説明されているが、古典的なNF-κB複合体は、p65/RelAおよびp50サブユニットのヘテロ二量体であり、IκB(これらのうちで最も一般的なものはIκBαである)と呼ばれる阻害タンパク質のファミリーに関連して大半の細胞に見られる。古典的なNF-κB経路では、TNFαおよびIL-1等のサイトカインのメンバーによる刺激により、マルチサブユニットIκBキナーゼ(IKK)複合体の活性化がもたらされ、これは、2つの触媒サブユニットIKK1/IKKαおよびIKK2/IKKβ、ならびに調節サブユニットNEMO/IKKγを含む。活性化されたIKK複合体は、IκBタンパク質の誘導的リン酸化およびそれらのその後の分解をもたらし、それにより、NF-κBをそれらの阻害影響から解放する。解放されると、NF-κBは、核に自由に移動し、同族結合部位を有する特異的遺伝子のプロモーターに結合する。核内でのNF-κB二量体の転写活性は、それらのリン酸化によってさらに修飾される。p100/NF-κB2のp52サブユニットへのプロテアソーム媒介プロセシングを伴うNF-κB活性化の代替(または非標準)経路、が説明されている。
「NF-κB刺激分子」または「NF-κB刺激因子」または「NF-κB活性化因子」とは、NF-κBシグナル伝達経路の活性またはNF-κBシグナル伝達経路の下流標的遺伝子の活性/発現を促進するアクセサリー分子のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、NF-κB活性化因子は、天然に存在しないNF-κB活性化剤である。例示的な天然に存在しないNF-κB活性化剤は、hNEMO-K277Aである。一実施形態では、NF-κB刺激分子またはNF-κB刺激因子は、選択的NF-κB刺激因子または選択的NF-κB活性化因子である。本明細書に記載の「選択的NF-κB活性化因子」または「選択的NF-κB刺激因子」とは、NF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化し、他のシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない薬剤を指す。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、AKTシグナル伝達経路、PI3Kシグナル伝達経路、JNKシグナル伝達経路、p38キナーゼシグナル伝達経路、ERKシグナル伝達経路、JAK/STATシグナル伝達経路、およびインターフェロンシグナル伝達経路の群から選択されるシグナル伝達経路のうちの1つ以上を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、AKTシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、AKTシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、PI3Kシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、ERKシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、JNKシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、p38キナーゼシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、JAK/STATシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、インターフェロンシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。リン酸化IκBα、リン酸化p65/RelA、全IκBαの測定、p65核転座、NF-κB応答性遺伝子の上方調節、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、およびNF-κBベースのレポーターアッセイ等を含むが、これらに限定されない、NF-κBシグナル伝達経路の活性化を測定するためのいくつかの方法が当該技術分野で既知である。これらのアッセイを本開示の方法で単独でまたは組み合わせて使用して、NF-κB経路の選択的活性化因子特定することができる。異なる経路に属する異なるキナーゼおよび下流基質のリン酸化の測定、下流転写因子の核転座、下流応答性遺伝子の上方調節、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、およびルシフェラーゼベースのレポーターアッセイ等を含むが、これらに限定されない、シグナル伝達経路(例えば、AKTシグナル伝達経路、PI3Kシグナル伝達経路、JNKシグナル伝達経路、p38キナーゼシグナル伝達経路、ERKシグナル伝達経路、JAK/STATシグナル伝達経路、およびインターフェロンシグナル伝達経路)の活性化を測定するためのいくつかの方法が当該技術分野で既知である。これらのアッセイを本開示の方法で単独でまたは組み合わせて使用して、NF-κBシグナル伝達経路の選択的活性化因子を選択することができる。選択的NF-κB刺激因子は、41BB等の他のアクセサリー分子と比較してNF-κBを特異的に活性化する。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、以下の効果のうちの1つ以上を有する:(i)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の寿命を延長させる、(ii)T細胞増殖を刺激する、(iii)T細胞、例えば、CAR-T細胞をアポトーシスから保護する、(iv)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の老化を遅延させる、(v)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の疲弊を遅延させる、(vi)T細胞の末端分化を遅延させる、(vii)T細胞によるIL2等のサイトカインの産生を促進する、(viii)CAR-T細胞およびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ拡大を促進する、(ix)CAR-T細胞およびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ持続性を促進する、(x)CAR-TおよびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ活性(例えば、抗腫瘍活性)を改善する。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞等のT細胞以外の細胞に発現し得る。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子を使用して、抗原提示細胞によってもたらされる抗原提示、サイトカイン産生、および免疫応答を増強することができる。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、ウイルスまたは非ウイルス(例えば、ヒト)起源のものであり得る。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、細胞に過渡的または安定的に発現し得る。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、細胞に構成的または誘導的様式で発現し得る。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、スイッチドメイン、例えば、FKBP12v36ドメインのタンデムコピーと融合した細胞に発現し得る。NF-κB刺激分子を含む例示的なスイッチドメインは、配列番号973~977、1006~1009、7763~7767、および7781~7782(表7)に提供される。選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB刺激分子は、CAR/TCRのコード配列を含むベクターから発現し得るか、または異なるベクターに存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、CAR/TCRをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、(i)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の寿命を延長させる、(ii)T細胞増殖を刺激する、(iii)T細胞、例えば、CAR-T細胞をアポトーシスから保護する、(iv)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の老化を遅延させる、(v)T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞の疲弊を遅延させる、(vi)T細胞の末端分化を遅延させる、(vii)T細胞によるIL2等のサイトカインの産生を促進する、(viii)CAR-T細胞およびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ拡大を促進する、(ix)CAR-T細胞およびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ持続性を促進する、および/または(x)CAR-TおよびTCR-T細胞を含むT細胞のインビボ活性(例えば、抗腫瘍活性)を改善するNF-κB刺激分子または選択的NF-κB活性化因子であるウイルスおよび細胞シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子のコード配列は、切断可能なリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによってCAR骨格コード配列に連結される。例示的な実施形態では、かかるNF-κB刺激分子には、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス由来のvFLIP-K13、コドン最適化K13(K13-opt)、NEMO突然変異体((例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277L、hNEMO-K277A-deltaV249-K255、mNEMO-K270A等)、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、MTCP-1、IKKα、およびIKKβ(表7)が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、CARをコードするベクターは、vFLIP-K13をさらにコードする。別の実施形態では、CARをコードするベクターは、hNEMO-K277Aをさらにコードする。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子は、本明細書に記載のCARをコードするベクターとははっきりと異なるベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、CARをコードするベクターを含むエフェクター細胞は、NF-κB刺激分子をコードするベクターも含む。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子は、対応する内在性タンパク質をコードするゲノム遺伝子座を修飾することによってコードされる。例えば、hNEMO遺伝子の1つ以上のコピーは、相同組換えによって修飾されて、それをK277A突然変異体形態に突然変異させることができる。内在性ヒトNEMO遺伝子にK277A突然変異をもたらすために使用され得る例示的な標的構築物は、配列番号7771によって提示される。内在性ヒトNEMO遺伝子にK277A-デルタ-V249-K255突然変異をもたらすために使用され得る例示的な標的構築物は、配列番号7772によって提示される。これらの標的構築物は、当該技術分野で既知の技法を使用して、NEMOを標的とする遺伝子編集系、例えば、CRISP/Cas9またはTALONとともにヒトT細胞に導入され得る。Streptococcus Pyogenes Cas9の例示的なNEMO gRNA標的配列は、配列番号7759~7762に提供される。一実施形態では、CARおよびNF-κB刺激分子は、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、CARは、第1の核酸分子によってコードされ、NF-κB刺激分子は、第2の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子は、NF-κB刺激分子の数に応じて、1つより多くの核酸分子によってコードされる。本開示のある特定の部分では、「CAR/NFκB」という略語は、例えば、本開示のCARおよびNF-κB刺激分子(例えば、NF-κB特異的刺激分子)の両方を発現する細胞を示すために使用される。例えば、「CAR/NFκB発現T細胞」という用語は、例えば、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス由来のvFLIP-K13、コドン最適化K13(K13-opt)、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、MTCP-1、IKK1/IKKα、およびIKK2/IKKβ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるNF-κB特異的刺激分子も発現する、任意の数の可能な異なる抗原結合ドメインを有するCAR-T細胞を指す。NF-κB刺激分子は、CARの細胞質ドメインに直接連結され得るか、または独立して細胞に発現し得る。NF-κB刺激分子は、NF-κBシグナル伝達経路の発現および/またはその阻害剤の活性を遮断する分子であり得る。例えば、NF-κBシグナル伝達経路の発現および/またはその阻害剤の活性を遮断するNF-κB刺激分子は、遺伝的(例えば、siRNA、shRNA、gRNA、TALON、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ)、化学的、または生物学的A20阻害剤である。他の実施形態は、NF-κB刺激分子としてNEMO融合構築物を含む(例えば、hNEMO-FKBPx2、FKBPx2-hNEMO-L600等)。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない薬剤」または「非天然」または「外因性」とは、細胞に天然に発現しない薬剤を指す。換言すれば、天然に存在しない薬剤は、細胞に発現されるように「操作される」。天然に存在しない薬剤は、天然に存在する薬剤のクローン化バージョンであり得る。例示的な天然に存在しない薬剤としては、CAR、SIR、Ab-TCR、TFP、組換えTCR、NEMO-K277A、vFLIP-K13、およびK13-optが挙げられる。天然に存在しない薬剤は、レンチウイルスまたはレトロウイルス媒介遺伝子導入等の当該技術分野で既知の遺伝子導入技法を使用して細胞に発現され得る。天然に存在しない薬剤は、外因性プロモーター(例えば、EF1αプロモーター)または内在性プロモーター(例えば、TCRαプロモーター)を使用して免疫細胞に発現され得る。内在性遺伝子(例えば、IKK1、IKK2、IKKγ/NEMO)がクローン化され、細胞に異所的に発現されると、これは、天然に存在しない薬剤の別の例を表す。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない免疫受容体」または「外因性免疫受容体」とは、免疫細胞に天然に発現しない免疫受容体を指す。換言すれば、天然に存在しない免疫受容体は、免疫細胞に発現されるように「操作される」。天然に存在しない免疫受容体は、天然に存在する免疫受容体のクローン化バージョンであり得る。あるいは、天然に存在しない免疫受容体は、組換え分子生物学技法を使用して産生されるキメラ受容体であり得る。例示的な天然に存在しない免疫受容体としては、CAR、SIR、Ab-TCR、TFP、および組換えTCRが挙げられる。天然に存在しない免疫受容体は、レンチウイルスまたはレトロウイルス媒介遺伝子導入等の当該技術分野で既知の遺伝子導入技法を使用して免疫細胞に導入され得る。天然に存在しない免疫受容体は、外因性プロモーター(例えば、EF1αプロモーター)または内在性プロモーター(例えば、TCRαプロモーター)を使用して免疫細胞に発現され得る。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しないTCR抗原結合ドメイン」または「外因性TCR抗原結合ドメイン」とは、自然界に存在するTCRに対してキメラであり天然に存在しないTCR定常領域に作動可能に連結された結合ドメインを指す。換言すれば、天然に存在しないTCR抗原結合ドメインは、組換え分子生物学技法を使用してTCRに作動可能に連結されるように「操作され」、さらに、抗原結合ドメインは、自然界で見られるTCRとははっきりと異なる分子から得られるか、またはそれに由来する。自然界のTCRとははっきりと異なる抗原結合ドメインには、抗体vHおよびvL断片、ヒト化抗体断片、キメラ抗体断片、受容体リガンド等が含まれる。
本明細書で使用される場合、「非ウイルス起源」とは、ウイルスによって完全にまたは部分的にコードされていないか、またはウイルスでコードされたタンパク質と80%超(例えば、85%超、90%超、95%超、または99%超)の配列相同性を有する10個より多くのアミノ酸(例えば、15個より多くのアミノ酸、20個より多くのアミノ酸、25個より多くのアミノ酸、または50個より多くのアミノ酸)の任意のドメインまたは領域を有する薬剤(例えば、タンパク質)を指す。ある実施形態では、非ウイルス起源の薬剤は、ヒト起源のものである。ある実施形態では、非ウイルス起源の薬剤は、選択的NF-κB活性化因子である。選択的NF-κB活性化因子である例示的な非ウイルス起源の薬剤は、ヒトNEMO-K277A(配列番号4892)である。
「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」という用語は、各成分が機能的になるような第1の成分と第2の成分との間の機能的連結または会合を指す。例えば、「作動可能に連結された」には、異種核酸配列の発現をもたらす調節配列と異種核酸配列との間の会合が含まれる。例えば、第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に、第2の核酸配列に作動可能に連結される。作動可能に連結された2つのポリペプチドとの関連で、第1のポリペプチドは、それがいずれの連結とも無関係であろう様式で機能し、第2のポリペプチドは、それがそれらの2つの間の連結を欠くであろうように機能する。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で「パーセント同一性」とは、同じである2つ以上の配列を指す。2つの配列は、これらの2つの配列が、最大一致について比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって比較して整列させたときに、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手動アライメントおよび目視検査によって測定される、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定されたパーセンテージ(例えば、特定された領域にわたって、または特定されていない場合、全配列にわたって、60%の同一性、任意選択的に、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性)を有する場合、「実質的に同一」である。任意選択的に、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長(または10アミノ酸長)である領域、またはより好ましくは、100~500または1000またはそれ以上のヌクレオチド長(または20、50、200、またはそれ以上のアミノ酸長)である領域にわたって存在する。
配列比較のために、一般に、1つの配列が参照配列の役割を果たし、試験配列がこの参照配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用して、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが指定され得る。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アライメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482cの局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Bioi.48:443の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI))、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biologyを参照のこと)によって行われ得る。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために使用され得るアルゴリズムの2つの例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402、およびAltschul et al.,(1990)J.Mol.Bioi.215:403-410に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを介して公的に入手可能である。
2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE.Meyers and W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)のアルゴリズムを使用して、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用して決定することもできる。加えて、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comから入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(1970)J.Mol.Bioi.48:444-453)アルゴリズムを使用して、Blossom 62行列またはP AM250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重み、および1、2、3、4、5、または6の長さ重みを使用して決定され得る。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「組換え核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマー、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)を指し、適切な場合、リボ核酸(RNA)も指す。
本明細書で同義に使用される「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に連結されたアミノ酸と呼ばれる化学的構成要素の1つ以上の鎖を含む。
「レトロウイルスベクター」という用語は、レトロウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。レトロウイルスベクターの例としては、MSCVneo、MSCV-pac(またはMSCV-puro)、MSCV-hygro(AddgeneまたはClontechから入手可能)が挙げられる。
「Sleeping Beautyトランスポゾン」または「Sleeping Beautyトランスポゾンベクター」という用語は、Sleeping Beautyトランスポゾンゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。
「一本鎖可変領域」または「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片および重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、scFvは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。特定されない限り、本明細書で使用される場合、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端およびC末端に対して、vL可変領域およびvH可変領域をいずれかの順序で有し得、scFvは、vL-リンカー-vHを含み得るか、またはvH-リンカー-vLを含み得る。本発明では、scFvは、vL-Gly-Ser-リンカー-vHとも称される。あるいは、scFvは、(vL+vH)または(vH+vL)とも称される。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内に情報を伝達して、第2のメッセンジャーを生成することによって、またはかかるメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するタンパク質の機能的領域を指す。
「合成免疫受容体」またはあるいは「SIR」という用語は、エフェクター細胞に発現されると、細胞に、標的細胞、典型的にはがん細胞に対する特異性と、細胞内シグナル発生とを提供する一組のポリペプチド、いくつかの実施形態では、典型的には2つの組のポリペプチドを指す。SIRは、参照により本明細書に組み込まれるWO2018/102795 A1に記載の次世代CARプラットフォームを表す。典型的な実施形態では、SIRは、本明細書に記載の抗原に結合する1つ以上の抗原結合ドメイン(例えば、抗体もしくは抗体断片、リガンド、または受容体)を含み、任意選択的なリンカーを介して1つ以上のT細胞受容体定常鎖または領域に連結される。いくつかの実施形態では、この一組のポリペプチドは、互いに隣接している。いくつかの実施形態では、SIRは、2つ以上の組の2つ以上のポリペプチドを含む。各組のSIRのポリペプチドは、互い(機能的ポリペプチド単位1)に隣接しているが、他方の組のポリペプチド(機能的ポリペプチド単位2)とは隣接していない。いくつかの態様では、SIRのT細胞受容体定常鎖(または領域)は、ヒトT細胞受容体-アルファ(TCR-アルファまたはTCRαまたはTCRaまたはhTCR-アルファまたはhTCRαまたはhTCRaまたはCα)、ヒトT細胞受容体-ベータ1(TCR-ベータ1またはTCRβ1またはTCRb1またはhTCR-ベータ1またはhTCRβ1またはhTCRb1またはCβ1)、ヒトT細胞受容体-ベータ2(TCR-ベータ2またはTCRβ2またはTCRb2またはhTCR-ベータ2またはhTCRβ2またはhTCRb2またはCβ2、TCR-ベータ、TCRβまたはTCRbまたはCβとも指定される)、ヒトプレT細胞受容体アルファ((プレTCR-アルファまたはプレTCRαまたはプレTCRaまたはプレCα)、ヒトT細胞受容体-ガンマ(TCR-ガンマまたはTCRγまたはTCRgまたはhTCR-ガンマまたはhTCRγまたはhTCRgまたはhTCRγ1またはhTCRガンマ1、またはCγ)、またはヒトT細胞受容体-デルタ(TCR-デルタまたはTCRdまたはTCRδまたはhTCR-デルタまたはhTCRdまたはhTCRδまたはCδ)の定常鎖から選択される。いくつかの実施形態では、SIRのTCR定常鎖は、それらの野生型ヌクレオチド配列によってコードされ、他の態様では、SIRのTCR定常鎖は、野生型ではないヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、SIRのTCR定常鎖は、それらのコドン最適化配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、SIRのTCR定常鎖は、野生型ポリペプチド配列をコードし、他の実施形態では、SIRのTCR定常鎖は、1つ以上の突然変異を持つポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、SIRのTCR定常鎖は、1つ以上の突然変異を持つそれらのコドン最適化配列によってコードされる。本明細書に記載のもの等の特異的腫瘍マーカー「X」を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、scFvまたはvHH)を含むSIRは、X-SIRまたはXSIRとも称される。例えば、CD19を標的とする抗原結合ドメインを含むSIRは、CD19-SIRまたはCD19SIRと称される。SIRのTCR定常鎖/ドメインは、SIRが最終的に使用されるであろう同じ種に由来し得る。例えば、ヒトに使用する場合、SIRのTCR定常鎖がヒトTCR定常鎖に由来するか、またはそれから成ることが有益であり得る。しかしながら、ある場合には、TCR定常鎖が、SIRが最終的に使用されるであろう同じ種に由来するが、TCR定常鎖の発現を増強するアミノ酸置換を持つように修飾されることが有益である。例えば、ヒトに使用する場合、SIRのTCR定常鎖がヒトTCR定常鎖に由来するか、またはそれから成るが、そこである特定のアミノ酸がマウスTCR定常鎖由来の対応するアミノ酸に置き換えられることが有益であり得る。かかるマウス化TCR定常鎖は、SIRの増加した発現を提供する。SIRまたはその機能的部分は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端に、または両方の末端に追加のアミノ酸を含み得、この追加のアミノ酸は、SIRを構成するTCRまたは抗原結合ドメインのアミノ酸配列には見られない。望ましくは、この追加のアミノ酸は、SIRまたは機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの治療または予防等を妨害しない。より望ましくは、この追加のアミノ酸は、親SIRの生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。例示的なSIRの核酸およびアミノ酸配列は、配列番号3878~3879および表10~11に提供される。
「刺激」という用語は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)のその同族リガンド(または標的抗原)への結合によって誘導され、それにより、TCR/CD3を介したシグナル伝達等であるが、これに限定されないシグナル伝達事象を媒介する一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の改変された発現を媒介し得る。
「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について免疫細胞の活性化を刺激的に調節する細胞質シグナル伝達配列(複数可)を提供する免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、B細胞)によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体のペプチドを装填したMHC分子への結合によって開始され、増殖、活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答の媒介をもたらす一次シグナルである。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして既知のシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMを含む細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD3ゼータ、一般的なFeRガンマ(FCERIG)、FeガンマRIIa、FeRベータ(FeイプシロンRib)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAPIO、およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生きた生物(例えば、いずれの家畜哺乳動物またはヒト)を含むよう意図されている。
本明細書で使用される「スイッチドメイン」または「二量体化ドメイン」とは、典型的には、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと会合するポリペプチドベースの実体を指す。この会合により、第1のスイッチドメインに連結された、例えば、融合した第1の実体と、第2のスイッチドメインに連結された、例えば、融合した第2の実体との機能的カップリングがもたらされる。第1のスイッチドメインおよび第2のスイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと称される。実施形態では、第1のスイッチドメインおよび第2のスイッチドメインは、互いに同じであり、例えば、それらは、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと称される。実施形態では、このスイッチは、細胞内にある。実施形態では、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えば、FKBP(FK506結合タンパク質)であり、二量体化分子は、小分子、例えば、AP20187である。
「T細胞」および「Tリンパ球」という用語は同義であり、本明細書で同義に使用される。例としては、ナイーブT細胞(「リンパ球前駆体」)、中心メモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、幹メモリーT細胞(Tscm)、iPSC由来のT細胞、合成T細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
「TCR関連シグナル伝達モジュール」という用語は、TCR-CD3複合体の一部である細胞質免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を有する分子を指す。TCR関連シグナル伝達モジュールには、CDγε、CDδε、およびCD3ζζが含まれる。
本明細書で使用される「治療薬」とは、例えば、疾患を治療する、抑制する、予防する、その影響を軽減する、その重症度を低下させる、その発症の可能性を低減する、その進行を緩徐化する、および/または治癒するために使用される薬剤を指す。治療薬によって標的とされる疾患には、感染性疾患、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、様々な免疫細胞に発現する抗原、ならびに様々な血液疾患および/または炎症性疾患に関連する細胞に発現する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「治療制御体(therapeutic control)」とは、CAR発現細胞の活性を制御するために使用される要素を指す。いくつかの実施形態では、本発明のCAR発現細胞の活性を制御するための治療制御体は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)、切断型上皮成長因子受容体viii(tEGFRviii)、切断型CD30(tCD30)、切断型BCMA(tBCMA)、切断型CD19(tCD19)、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、誘導的カスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ/リナマリン/グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)/インドール-3-酢酸(IAA)、ガンマ-グルタミルシステインシンテターゼ、CD20/アルファCD20、CD34/チミジンキナーゼキメラ、dox-依存性カスパーゼ-2、突然変異体チミジンキナーゼ(HSV-TKSR39)、AP1903/Fas系、キメラサイトカイン受容体(CCR)、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上を含む。
「治療効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、がん細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の延長、がん細胞増殖の低減、がん細胞生存の低減、感染病原体の力価の減少、感染病原体のコロニー計数の減少、疾患状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「治療効果」は、最初の段階での疾患の発症の予防または疾患の再発の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても現れ得る。
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つ以上の症状を軽減するための本明細書に開示される1つ以上のペプチド、またはその突然変異体、バリアント、類似体、もしくは誘導体を含む薬学的組成物の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な薬理学的組成物の量に関連する。本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、いずれの医学的治療にも適用される合理的なリスク対効果比での障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。
症状の治療的または予防的に有意な軽減は、対照もしくは未処理対象または本明細書に記載のオリゴペプチドの投与前の対象の状態と比較して、例えば、測定されたパラメータの少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約125%、少なくとも約150%、またはそれ以上である。測定されたパラメータまたは測定可能なパラメータには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、生物学的マーカーの上昇または低下したレベル、ならびに糖尿病の臨床的に許容される規模の症状またはマーカーに関連したパラメータが含まれる。しかしながら、本明細書に開示される組成物および製剤の1日当たりの総使用量が正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろうことが理解されよう。必要とされる正確な量は、対象の治療される疾患の種類、性別、年齢、および体重等の要因に応じて変化するであろう。
「TCR受容体融合タンパク質またはTFP」という用語は、参照により本明細書に組み込まれるWO2016/187349 A1に記載の次世代CARプラットフォームを指す。ある実施形態では、TFPは、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、またはTCRβ等のTCR鎖に融合した標的抗原に特異的に結合する抗体部分を含む。TFPの構築に使用され得る例示的なTCR鎖は、配列番号944~945、948、949~950、および958によって表され、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1に提供されている。CD3ε鎖を組み込むTFPは、CD3ε TFPと称される。CD3γ鎖を組み込むTFPは、CD3γ TFPと称される。CD3δ鎖を組み込むTFPは、CD3δ TFPと称される。CD3ε鎖、CD3γ鎖、またはCD3δ鎖を組み込むTFPは、集合的にCD3ε/γ/δ TFPと称される。本開示に記載の異なる抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、リガンド、受容体等)を組み込み、NEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールを共発現する例示的なTFPは、配列番号1900~3123(表13)に提供される。これらのTFPの配列番号、抗原結合ドメイン、および標的抗原は、これらのTFP構築物が、表12に示されるNEMO-K277Aを共発現する第一世代CAR構築物と同一の抗原結合ドメインを有し、同一の順序で番号付けされているため、表12を参照することによって決定され得る。しかしながら、このNEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールは、任意である。本開示に記載の抗原結合ドメイン(すなわち、vLおよびvH断片、リガンド、および受容体等)を有するTFPは、NEMO-K277Aなしで構築され得る。したがって、このアクセサリーモジュールは、上流フーリン-SGSG-F2A配列とともに、配列番号1900~3123によって表されるTFPから欠失し得る。あるいは、NEMO-K277Aをコードするアクセサリーモジュールは、他のシグナル伝達タンパク質、例えば、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E、ならびにMyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2、およびCMV-141等をコードするアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。
「導入ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物を指す。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当該技術分野で既知である。したがって、「導入ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物およびリポソーム等の核酸の細胞への導入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン(TMD)」とは、形質膜を横断するCARの領域を指す。本発明のCARの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質(例えば、I型膜貫通タンパク質)、人工的疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。他の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態に関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の骨格のうちのいずれかを含むTMDをコードするCARは、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、および/またはNKG2Cの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「三官能性T細胞抗原カップラーまたはTri-TAC」とは、参照により本明細書に組み込まれるWO2015/117229 A1に記載の次世代CARプラットフォームを指す。異なる抗原を標的とするTri-TACは、当該技術分野で既知の技法を使用して、本開示に記載の抗原結合ドメイン(例えば、vLおよびvH断片、scFv、vHH、リガンド、ならびに受容体等)を使用して構築され得る。さらに、本開示に記載の異なるアクセサリーモジュール(例えば、NEMO-K277A、mNEMO-K270A等)は、Tri-TACを発現する免疫細胞、例えば、T細胞、例えば、CAR-T細胞に発現され得る。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「改善」という用語は、治療的治療を指し、疾患または障害を逆転させる、緩和する、改善する、抑制する、それに関連する状態の進行または重症度を緩徐化または停止させることが目的である。「治療すること」という用語は、状態、疾患、または障害、例えば、がんの少なくとも1つの有害作用または症状を軽減または緩和することを含む。治療は、一般に、1つ以上の症状または臨床的マーカーが軽減/低減された場合に「有効」である。あるいは、治療は、疾患の進行が軽減または停止された場合に「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善のみならず、治療の不在下で予想されるであろう症状の進行または悪化の停止または少なくとも緩徐化も含む。有益または所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、1つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減退、疾患の安定した(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解(部分的であるか全体であるかにかかわらず)が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語は、疾患の症状または副作用の緩和を提供することも含む(姑息的治療を含む)。いくつかの実施形態では、がんの治療は、腫瘍体積の減少、がん細胞数の減少、がん転移の抑制、平均寿命の延長、がん細胞増殖の低減、がん細胞生存の低減、または癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含む。
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるかにかかわらず全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」とは、ポリヌクレオチド配列(例えば、外来遺伝子)が宿主細胞に導入されて、それにより、宿主を形質転換し、導入された配列の発現(例えば、転写および翻訳)を促進するようになり得るビヒクルを指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
「ゼータ」またはあるいは「ゼータ鎖」、「CD3-ゼータ」または「TCR-ゼータ」という用語は、GenBan Aceとして提供されるタンパク質と定義される。非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来のBAG36664.1または等価残基、および「ゼータ刺激ドメイン」またはあるいは「CD3-ゼータ刺激ドメイン」または「TCR-ゼータ刺激ドメイン」は、T細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基またはその機能的誘導体と定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Aceの残基52~164を含む。非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等由来のBAG36664.1または等価残基は、その機能的オルソログである。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」または「CD3-ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号4853として提供される配列である(表6D)。
CARの結合ドメインは、所望のエピトープに結合するように選択される。例えば、CARによって認識されるエピトープは、CARを含むscFvによって認識されるエピトープからも決定され得る。例えば、MPLを標的とするCAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(配列番号1509および配列番号5422)の抗原特異的ドメインが、scFv MPL-161-(vL-vH)(配列番号808および配列番号4721)から成るため、CARがscFvおよびscFvが由来する親抗体と同じエピトープを標的とするであろうことが予想される。scFv MPL-161-(vL-vH)(配列番号808および配列番号4721)によって認識されるエピトープは、配列番号15160に提供される。本開示のCARおよび骨格の構築に使用されるいくつかのscFvおよび/またはそれらの親抗体によって認識されるエピトープは、当該技術分野で既知である。あるいは、CAR(骨格の一部として存在するCARを含む)によって標的とされるエピトープは、その標的抗原の一連の突然変異体を生成し、CAR発現細胞に結合するそれらの突然変異体の能力を試験することによって決定され得る。一例として、MPLを標的とするCAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PACによって認識されるエピトープは、MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5融合構築物(DNA配列番号1015およびPRT配列番号4928)の突然変異体のパネルを生成することによって決定され得る。突然変異体構築物は、好適な細胞株(例えば、293FT細胞)にトランスフェクトされ、融合タンパク質を含む上清が収集され、NLuc活性についてアッセイされて、異なる突然変異体MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5融合タンパク質が上清中に分泌されていることを確実にするであろう。その後、融合タンパク質は、CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR構築物を発現する細胞(例えば、Jurkat細胞またはT細胞)に結合するそれらの能力について試験されるであろう。CAR発現細胞に結合することができない突然変異体は、MPL特異的CARによって標的とされるエピトープを含む候補である。特定のCARによって認識されるエピトープを決定するための代替アプローチには、異なる試験抗体を用いた機能的競合アッセイが含まれ得る。例えば、CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CARを発現するT細胞は、異なる試験MPL抗体の増加濃度の不在下および存在下でMPLを発現する細胞株(例えば、HEL細胞)と共培養され得る。試験MPL抗体によって認識されるエピトープがCD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CARによって認識されるエピトープと重複する場合、この試験抗体が、用量依存的様式で、CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CARを発現するT細胞によって誘導される標的細胞死滅およびサイトカイン産生を阻止することが予想されるであろう。試験抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体は、対照として含まれ、CARを発現するT細胞によって誘導される標的細胞死滅およびサイトカイン産生に影響を及ぼさないことが予想されるであろう。同様に、特異的CARがJurkat-NFAT-EGFP細胞に発現され得、標的細胞株との共培養時にCARを発現するJurkat-NFAT-GFP細胞によるEGFP誘導を阻止する試験抗体の能力を使用して、試験抗体によって認識されるエピトープがそのCARによって認識されるエピトープと重複するかを決定することができる。
天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARと、アクセサリーモジュール(NF-κB刺激分子および選択的NF-κB活性化因子を含む)とを含む組成物、およびがんを含む疾患を治療するためのその組成物の使用法も本明細書に提供される。本明細書に記載されるように、従来のCAR(表1)および表2に記載のアクセサリーモジュールの特定の組み合わせが提供される。
表1:従来のCARアーキテクチャ第一世代の従来のCAR(従来のCAR I)は、細胞内シグナル伝達(ISD)ドメイン(例えば、CD3z)を有し、共刺激ドメインを有しない。TCR融合タンパク質(TFP)は、従来のCAR 1の別の例である。第二世代の従来のCAR(従来のCAR 2またはCAR II)は、1つの共刺激ドメイン(例えば、41BBまたはCD28)および細胞内シグナル伝達(ISD)ドメイン(例えば、CD3z)を有する。第三世代の従来のCAR(従来のCAR 3またはCAR III)は、2つの共刺激ドメイン(例えば、41BBおよびCD28)および細胞内シグナル伝達(ISD)ドメイン(例えば、CD3z)を有する。Ab-TCRは、二本鎖受容体であり、PCT/US2016/058305に記載されている。cTCRは、1つ以上のTCR定常鎖に融合しており、かつT細胞シグナル伝達の活性化をもたらす、vLおよびvH断片に由来する抗原結合ドメインからなる一本鎖、一本半鎖(one-and-half)、または二本鎖受容体である。合成免疫受容体は、次世代CARであり、US62/429,597およびWO2018/102795 A1に記載されている。
略語、1st Gen CAR:第一世代CAR、2nd Gen CAR:第二世代CAR、DC SIR:二本鎖SIR、OHC SIR:一本半鎖SIR。
上記の表10の例示的な構築物中のアクセサリーモジュールは任意選択的であり、欠失していても他のアクセサリーモジュールに置き換えられてもよい。
いくつかの実施形態では、本組成物は、従来のCAR1~6(表1)をコードする核酸を含み、CARの抗原特異的ドメインは、表6A~Cまたは参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上の特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格1~72(表2)のうちのいずれか1つ以上をコードする核酸を含み、コードされたCARの抗原特異的ドメインは、表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上の特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-1におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-2におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-37におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-38におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-49におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、骨格-1をコードする核酸を含み、骨格-50におけるCARの抗原特異的ドメインは、本明細書の表6A~CまたはPCT/US2017/064379の表5~6に記載の1つ以上のがん特異的抗原を標的とする。
様々な実施形態では、本明細書に記載の骨格の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)の成分をコードする単離された核酸分子は、1、2、3つ、またはそれ以上の抗原特異的ドメインをコードする。例えば、本明細書に記載のがん関連抗原に特異的に結合する1つ以上のASDが使用され得る。ASDの配列は、CARの1つ以上の鎖の残りをコードする核酸配列と隣接しており、それと同じリーディングフレーム内にある。
一実施形態では、VHドメインが単独で抗原特異性を付与するのに十分である場合(「単一ドメイン抗体」)、抗原特異的領域は各々、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジドメイン、ならびにCH2およびCH3(Fc)Igドメインを有する全長IgG重鎖(標的抗原に特異的)を含む。全長IgG重鎖は、適切な膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび任意選択的な細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。VHドメインおよびVLドメインの両方が完全に活性な抗原特異的標的領域を生成するのに必要である場合、VHを含む天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)も全長ラムダ軽鎖(IgL)もいずれも細胞に導入されて、活性な抗原特異的標的領域を生成する。
いくつかの実施形態では、コードされた天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)の分子の抗原特異的ドメインは、抗体、抗体断片、scFv、Fv、Fab、a(Fab’)2、単一ドメイン抗体(SDAB)、vHもしくはvLドメイン、またはラクダ類vHHドメインを含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)の抗原結合ドメインは、由来するscFvのマウス配列と比較してヒト化されているscFv抗体断片である。
ある場合には、scFvは、当該技術分野で既知の方法に従って調製され得る(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423-426およびHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。ScFv分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してVH領域とVL領域を一緒に連結することによって産生され得る。scFv分子は、最適化された長さおよび/またはアミノ酸組成(例えば、折り畳みを最適化するため等)を有するリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。scFvは、そのVL領域とVH領域との間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個、またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリン反復セットを含む。リンカーの長さの変化により、活性が保持または増強され得、活性研究において優れた有効性をもたらす。いくつかの実施形態では、抗原特異的scFv抗体断片は、由来するIgG抗体と同じまたは同等の親和性で同じ抗原に結合するという点で機能的である。他の実施形態では、抗体断片は、それが由来する抗体と比較してより低い抗原に対する結合親和性を有するが、本明細書に記載の生物学的応答を提供するという点で機能的である。一実施形態では、CAR分子は、10-4M~10-8M、10-5M~10-7M、10-6M、または10-8Mの標的抗原に対する結合親和性KDを有する抗体断片を含む。
一実施形態では、抗原特異的ドメインは、本明細書に列記される抗体またはscFvの1つ、2つ、または3つ全ての重鎖(hc)CDR、hcCDR1、hcCDR2、およびhcCDR3(表6B、配列番号14122~15039)、および/または本明細書に列記される抗体またはscFvの1つ、2つ、または3つ全ての軽鎖(lc)CDR、lcCDR1、lcCDR2、およびlcCDR3(表6A、配列番号13204~14121)を含む(PCT/US2017/064379の表5~6も参照のこと)。いくつかの実施形態では、ASDは、特異的scFvに属する3つ全ての軽鎖CDRを含むVL(またはvL)断片(表6A、配列番号13204~14121)、または特異的scFvに属する3つ全ての重鎖CDRを含むVH(またはvH)断片(表6B、配列番号14122~15039)を含む(PCT/US2017/064379の表5~6も参照のこと)。表6Cは、異なるscFvの名称、標的抗原、および配列番号を提供し、そのvL断片およびvL断片ならびにCDRが表6Aおよび表6Bに列記される。vL断片およびvH断片ならびに対応するscFvを本開示の様々な実施形態で使用して、本明細書に記載のCARを構築することができる。
別の実施形態では、抗原特異的ドメインは、ヒト化抗体または抗体断片を含む。いくつかの態様では、非ヒト抗体は、ヒト化されており、その抗体の特定の配列または領域が、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはその断片との類似性を高めるように修飾されている。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化されている。ヒト化抗体は、CDRグラフティング、ベニアリングまたはリサーフェシング、および鎖シャッフリングを含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。
さらなる実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは各々、二価(divalent)(または二価(bivalent))一本鎖可変断片(di-scFv、bi-scFv)を含み得る。例えば、di-scFVを含むCARでは、各抗原に特異的な2つのscFvは、2つのVH領域および2つのVL領域を有する単一のペプチド鎖を産生することによって一緒に連結され、タンデムscFvをもたらす。(Xiong,Cheng-Yi;Natarajan,A;Shi,XB;Denardo,GL;Denardo,SJ(2006).“Development of tumor targeting anti-MUC-1 multimer:effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding”.Protein Engineering Design and Selection 19(8):359-367、Kufer,Peter;Lutterbuse,Ralf;Baeuerle,Patrick A.(2004).“A revival of bispecific antibodies”.Trends in Biotechnology 22(5):238-244)。少なくとも2つの抗原特異的標的領域を含むCARは、2つの抗原の各々に特異的な2つのscFvを発現するであろう。結果として生じたASDは、ヒンジ領域および膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。あるいは、2つの抗原特異的標的領域を含む天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARは、2つの抗原または同じ抗原の2つのエピトープの各々に特異的な2つのvHHを発現するであろう。2つの抗原を標的とする例示的なCARは、配列番号1307および1310によって表される。
別の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARのASDは各々、ダイアボディを含む。ダイアボディでは、scFvは、2つの可変領域が一緒に折り畳むには短すぎるリンカーペプチドを用いて作製され、scFvを二量体化させる。さらに短いリンカー(1つまたは2つのアミノ酸)は、三量体、いわゆるトリアボディまたはトリボディの形成をもたらす。テトラボディも使用され得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARのASDは、本明細書に記載のVHH断片(ナノボディ)を含む(PCT/US2017/064379の表5~6を参照のこと)。いくつかの実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARのASDは、本明細書に記載のアフィボディを含む(PCT/US2017/064379の表5~6を参照のこと)。
別の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、標的細胞に発現される同族のリガンドを含む。
一実施形態では、標的抗原に対する天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは、この抗原を標的とするvHH断片の抗原結合部分、例えば、CDRである(PCT/US2017/064379の表5~6を参照のこと)。
一実施形態では、標的抗原に対する天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは、この抗原を標的とする非免疫グロブリン足場の抗原結合部分である(PCT/US2017/064379の表5~6を参照のこと)。
一実施形態では、標的抗原に対する天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは、この標的抗原に結合することで知られている受容体の抗原結合部分である(PCT/US2017/064379の表5~6を参照のこと)。
別の態様では、抗原結合ドメインは、T細胞受容体(「TCR」)、またはその断片、例えば、一本鎖TCR(scTCR)である。かかるTCRを作製するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Willemsen RA et al,Gene Therapy 7:1369-1377(2000)、Zhang T et al,Cancer Gene Ther 11:487-496(2004)、Aggen et al,Gene Ther.19(4):365-74(2012)(これらの参考文献は、全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。例えば、リンカー(例えば、可動性ペプチド)によって連結されたT細胞クローン由来のVα遺伝子およびνβ遺伝子を含むscTCRが操作され得る。このアプローチは、細胞内にあるがん関連標的に非常に有用であるが、かかる抗原の断片(ペプチド)は、MHCによってがん細胞の表面に提示される。
いくつかの実施形態では、抗原特異的ドメインは、標的抗原に特異的なT細胞受容体またはT細胞受容体の断片であり、この断片は、標的抗原に対する特異性を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは、MHC提示ペプチドに結合する。通常、内在性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子のポケットを満たし、CD8+Tリンパ球上のT細胞受容体(TCR)によって認識される。MHCクラスI複合体は、全ての有核細胞によって構成的に発現される。がんにおいて、ウイルス特異的および/または腫瘍特異的ペプチド/MHC複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の特有のクラスを表す。ヒト白血球抗原(HLA)-A1またはHLA-A2との関連でウイルス抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドを標的とするTCR様抗体について説明されている(例えば、Sastry et al.,J Viral.2011 85(5):1935-1942、Sergeeva et al.,Blood,2011117(16):4262-4272、Verma et al.,Jlmmunol2010 184(4):2156-2165、Willemsen et al.,Gene Ther20018(21):1601-1608、Dao et al.,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33、Tassev et al.,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照のこと)。例えば、TCR様抗体は、ヒトscFvファージディスプレイライブラリ等のライブラリをスクリーニングすることによって特定され得る。HLA-A2と関連してWT1を標的とするTCR様抗体に基づく例示的なCARは、配列番号1266~配列番号1268によって表される。本発明では、CARは、いくつかのHLA-A2制限細胞内ペプチドに対するTCR様抗体に由来する抗原結合ドメインを使用して生成された。ペプチドの標的タンパク質抗原、ペプチド断片、および配列は、表8に示される。
いくつかの実施形態では、単独でまたは本明細書に記載のアクセサリーモジュールと発現された場合、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARによって標的とされ得る疾患に特異的な抗原には、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、単独でまたは本明細書に記載のアクセサリーモジュールと発現された場合、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARによって標的とされ得る疾患に特異的な抗原には、4-1BB、5T4、腺癌抗原、アルファ-フェトプロテイン、BAFF、B-リンパ腫細胞、C242抗原、CA-125、炭酸脱水酵素9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受容体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、フィブロネクチン細胞外ドメイン-B、葉酸受容体1、GD2、GD3ガングリオシド、糖タンパク質75、GPNMB、HER2/neu、HGF、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、IGF-1受容体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、インスリン様成長因子I受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαvβ3、LAMP1、MORAb-009、MS4A1、MUC1、ムチンCanAg、N-グリコリルノイラミン酸、NPC-1C、PDGF-R α、PDL192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、テネイシンC、TGFベータ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘍抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、ビメンチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。がんに特異的な他の抗原は当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態に関連して使用され得る。
CARは、単独でまたは本明細書に記載のアクセサリーモジュールと使用される場合、疾患支持抗原(例えば、本明細書に記載の疾患支持抗原)に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体断片)を含み得る。いくつかの実施形態では、疾患支持抗原は、病原細胞の生存および増殖を支持する細胞に存在する抗原である。いくつかの実施形態では、疾患支持抗原は、間質細胞または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)に存在する抗原である。間質細胞は、成長因子およびサイトカインを分泌して、微環境下で細胞増殖を促進することができる。MDSC細胞は、T細胞増殖および活性化を阻止することができる。理論によって束縛されることを望むことなく、いくつかの実施形態では、CAR発現細胞は、疾患支持細胞を破壊し、それにより、病原細胞の成長または生存を間接的に阻止する。
ある特定の実施形態では、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原2(BST2)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、およびテネイシンのうちの1つ以上から選択される。ある実施形態では、FAP特異的抗体は、シブロツヅマブであるか、それと結合について競合するか、またはそれと同じCDRを有する。実施形態では、MDSC抗原は、CD33、CDllb、C14、CD15、およびCD66bのうちの1つ以上から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、疾患支持抗原は、骨髄間質細胞抗原2(BST2)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)またはテネイシン、CD33、CDllb、C14、CD15、およびCD66bのうちの1つ以上から選択される。
別の実施形態では、本開示は、本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、本開示のCARのうちのいずれかと異なる標的への結合について交差競合する能力を有するCAR)のうちのいずれかとして、表6A~Cに記載の異なる標的上の同じエピトープに結合する天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARを提供する。いくつかの実施形態では、これらの天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原特異的ドメインは、抗体のvL断片、vH断片、またはscFv断片に由来し得る。いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照抗体は、配列番号4555~4815、11165~11401、15070~15132(表6C)に示される配列を有する本明細書の表6Cに記載のscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。例示的な実施形態では、配列番号4555によって表される参照scFv FMC63(vL-vH)を交差競合研究で使用して、本開示のFMC63ベースの従来のCARおよび骨格によって認識される標的エピトープを決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照vHH断片は、配列番号4474~4514に示される配列を有するvHH断片である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究のための交差競合研究用の参照非免疫グロブリン抗原結合足場は、配列番号4515~4519に示される配列を有する非免疫グロブリン抗原結合足場である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のCARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照リガンドは、配列番号4544~4554の配列を有するリガンドである。いくつかの実施形態では、異なる標的に対する交差競合研究用の参照CARは、配列番号が表10~14に示されるCARである。
別の実施形態では、本開示のMPL標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照抗体は、特許出願第US2012/0269814 A1号に記載の抗体mAb-1.6、mAb-1.111、mAb-1.75、mAb-1.78、mAb-1.169、およびmAb-1.36である。
別の実施形態では、本開示のMPL標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照scFvは、表6Cの配列番号4720~4727に示される配列を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。
別の実施形態では、本開示のMPL標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照リガンドは、配列番号4544~4545に列記される配列を有するTPOリガンドおよびmTPOリガンドである。
別の実施形態では、本開示のMPL標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照CARは、配列番号5120~5126に示される配列を有するCARである。
好ましい実施形態では、本開示のMPL標的CARは、配列番号15160に示される配列に対応するエピトープに結合する。
一実施形態では、本発明のCD19標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照scFvは、配列番号4555~4568および表6Cに示される配列を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のCD19標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照CARは、配列番号4929~4943に示される配列を有するCARである。
一実施形態では、本発明のCD20標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照scFvは、CD20を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のCD20標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照CARは、CD20を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
好ましい実施形態では、本開示のCD20標的CARは、配列番号15149~15154に示される配列のうちの1つ以上に対応するエピトープに結合する。
一実施形態では、本発明のBCMA標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照scFvは、CD20を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のBCMA標的CARによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究用の参照CARは、BCMAを標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
好ましい実施形態では、本開示のBCMA標的CARは、配列番号15155~15159に示される配列のうちの1つ以上に対応するエピトープに結合する。
一実施形態では、本発明のDLL3標的CARに対する交差競合研究用の参照scFvは、DLL3を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のDLL3標的CARに対する交差競合研究用の参照CARは、DLL3を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
一実施形態では、本発明のLAMP1標的CARに対する交差競合研究用の参照scFvは、LAMP1を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のLAMP1標的CARに対する交差競合研究用の参照CARは、LAMP1を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
一実施形態では、本発明のTROP2標的CARに対する交差競合研究用の参照scFvは、TROP2を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のTROP2標的CARに対する交差競合研究用の参照CARは、TROP2を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
一実施形態では、本発明のPTK7標的CARに対する交差競合研究用の参照scFvは、PTK7を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のPTK7標的CARに対する交差競合研究用の参照CARは、PTK7を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
一実施形態では、本発明のCD22、CD123、CD33、CD37、CD70、CD138、CS1、IL13Ra2、葉酸受容体α、葉酸受容体β、TCRB1、TCRB2、TCRγδ、CD30、メソテリン、Her2、EGFRviii、およびHIV1標的CARに対する交差競合研究用の参照scFvは、これらの抗原を標的とし、かつ表6Cに列記される配列番号を有するscFv、またはPCT/US2017/064379の表5~6に記載のscFvである。別の実施形態では、本発明のCD22、CD123、CD33、CD37、CD70、CD138、CS1、IL13Ra2、葉酸受容体α、葉酸受容体β、TCRB1、TCRB2、TCRγδ、CD30、メソテリン、Her2、EGFRviii、およびHIV1標的CARに対する交差競合研究用の参照CARは、これらの抗原を標的とし、かつ表12に列記される配列番号を有するCARである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCARは、抗原特異的ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域またはリンカー領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗体、またはその機能的等価物、断片、もしくは誘導体のヒトCD8αまたはFc断片、ヒトCD8αまたは抗体、またはその機能的等価物、断片、もしくは誘導体のヒンジ領域、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工的スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上を含む。例示的な実施形態では、ヒンジ領域は、(i)IgG4のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、(ii)IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ領域およびCH2領域、(iv)CD8αのヒンジ領域、(v)IgG1のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、(vi)IgG1のヒンジ領域、(vi)IgG1のヒンジ領域およびCH2領域、または(vii)それらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの2つ以上の機能的ドメインは、1つ以上のリンカーによって分離されている。リンカーは、本開示の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARのドメイン/領域のうちのいずれかを一緒に連結する、約1~100アミノ酸長のオリゴペプチドまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、5~12アミノ酸長、5~15アミノ酸長、または5~20アミノ酸長であり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に動くことができるように、グリシンおよびセリン等の可動性残基で構成され得る。より長いリンカー、例えば、100アミノ酸長を超えるものが本開示の代替実施形態に関連して使用され得、例えば、2つの隣接するドメインが互いに立体的に妨害しないことを確実にするように選択され得る。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載のCARは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、I型、II型、またはIII型膜貫通タンパク質のうちのいずれかを含む、膜貫通ドメインを有するいずれかのタンパク質由来の膜貫通配列を含み得る。本開示のCARの膜貫通ドメインは、人工的疎水性配列も含み得る。本明細書に記載のCARの膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが二量体化しないように選択され得る。いくつかの実施形態では、CARは、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、CD3ε、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、および/またはNKG2Cの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを有する本明細書に記載の骨格のうちのいずれかを含む。
膜貫通ドメインは、膜貫通領域に対して膜貫通領域(例えば、1つ以上のアミノ酸が細胞外に伸長し、かつ/または1つ以上のアミノ酸が細胞内に伸長する)のいずれかの末端に1つ以上の追加のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、最大15個のアミノ酸)を含み得る。一態様では、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインのうちの1つと隣接している。一実施形態では、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはヒンジドメインが由来する同じタンパク質由来であり得る。別の態様では、膜貫通ドメインは、CARの任意の他のドメインが由来する同じタンパク質に由来しない。
様々な実施形態では、本明細書に記載の骨格の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)成分をコードする単離された核酸分子は、0、1、2、3個、またはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARは、任意選択的に、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。このドメインは、細胞質であり得、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を果たすように指示し得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、T細胞受容体のζ鎖またはその相同体のうちのいずれか(例えば、η鎖、CD3ε、CD3γ、CD3δ、FcεR1γ、およびβ鎖、MB1(Igα)鎖、B29(Igβ)鎖等)、CD3ポリペプチド(Δ、δ、およびε)、sykファミリーチロシンキナーゼ(Syk、ZAP 70等)、srcファミリーチロシンキナーゼ(Lck、Fyn、Lyn等)、ならびにT細胞形質導入に関与する他の分子、例えば、CD2、CD5、およびCD28が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。追加の細胞内シグナル伝達ドメインは当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態に関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖、FcgRIII、FceRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
様々な実施形態では、本明細書に記載の骨格の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)成分をコードする単離された核酸分子は、0、1、2、3個、またはそれ以上の共刺激ドメインをコードする。例示的な実施形態では、共刺激ドメインは、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上由来のシグナル伝達ドメインを含む。本開示の天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの様々な成分は、本明細書の上および他の箇所に提供される。この場合もやはり、本開示が、例えば、リンカーの「ヒンジ」を介して膜貫通ドメインに結合し、次いで、これが1つ以上の刺激ドメインおよび任意選択的に1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインに連結される抗原特異的結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むCARを提供することを認識されたい。
本明細書に記載の従来のCAR 1~6(表1)または骨格1~72のうちのいずれか1つ以上(表2)をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドが本明細書に提供される。
従来のCAR 1~6をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされた1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、CARの抗原特異的ドメインは、がん細胞等の標的細胞上の1、2、3つ、またはそれ以上の抗原に特異的である。本明細書に記載されるように、CARの各成分は、CARの他の各成分と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。いくつかの実施形態では、CARを含む骨格は、1つより多くの抗原特異的ドメインを含み、これらの抗原特異的ドメインは各々、同じCARにおける他の抗原特異的ドメインと隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。
本明細書に記載の従来のCAR IとNF-κB刺激分子(例えば、vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、またはそれらのバリアント)をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格1~10をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。骨格1~10におけるアクセサリーモジュールは、異なるNF-κB活性化因子(例えば、K13-opt、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K255、またはhNEMO-K277L等)を含む異なる分子をコードする他のアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。従来のCAR IとIgSP-[hTRAC-opt2]およびIgSP-[hTRBC-opt2]をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格11~12をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、CARを含む骨格1~12の抗原特異的ドメインは、がん細胞等の標的細胞上の1、2、3つ、またはそれ以上の抗原に特異的である。本明細書に記載されるように、CARの各成分は、CARを含む骨格1~12の他の各成分と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。いくつかの実施形態では、CARを含む骨格1-12は、1つより多くの抗原特異的ドメインを含み、これらの抗原特異的ドメインは各々、同じCARにおける他の抗原特異的ドメインと隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。
本明細書に記載の従来のCAR IIとNF-κB刺激分子(例えば、vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、またはそれらのバリアント)をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格13~22をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。骨格13~22におけるアクセサリーモジュールは、異なるNF-κB活性化因子(例えば、K13-opt、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K255、またはhNEMO-K277L等)を含む異なる分子をコードする他のアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、CARを含む骨格13~22の抗原特異的ドメインは、がん細胞等の標的細胞上の1、2、3つ、またはそれ以上の抗原に特異的である。本明細書に記載されるように、CARの各成分は、CARを含む骨格13~24の他の各成分と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。いくつかの実施形態では、CARを含む骨格13~24は、1つより多くの抗原特異的ドメインを含み、これらの抗原特異的ドメインは各々、同じCARにおける他の抗原特異的ドメインと隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。
本明細書に記載のAb-TCRとNF-κB刺激分子(例えば、vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、またはそれらのバリアント)をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格37~46をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。骨格37~46におけるアクセサリーモジュールは、異なるNF-κB活性化因子(例えば、K13-opt、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K255、またはhNEMO-K277L等)を含む異なる分子をコードする他のアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。
本明細書に記載の二本鎖cTCR/SIRとNF-κB刺激分子(例えば、vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、またはそれらのバリアント)をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格49~58をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。骨格49~58におけるアクセサリーモジュールは、異なるNF-κB活性化因子(例えば、K13-opt、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K255、またはhNEMO-K277L等)を含む異なる分子をコードする他のアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。
本明細書に記載の一本半鎖(OHC)cTCR/SIRとNF-κB刺激分子(例えば、vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、またはそれらのバリアント)をコードするアクセサリーモジュールとを含む骨格61~70をコードする1つ以上の核酸分子によってコードされる1つ以上のポリペプチドも本明細書に提供される。骨格61~70におけるアクセサリーモジュールは、異なる選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-opt、hNEMO-K277A-デルタ-V249-K255またはhNEMO-K277L等)を含む異なる分子をコードする他のアクセサリーモジュールに置き換えられ得る。
様々な実施形態では、本明細書に記載の骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドは、1、2、3つ、またはそれ以上のNF-κB刺激分子(例えば、K13-vFLIP、K13opt、NEMO、NEMO K277A、ヒトNEMO-K277L、ヒトNEMO-K277A-DeltaV249-K255、もしくはマウスNEMO K270A、またはそれらのバリアント)を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、トロンボポエチン受容体であるMPLに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD19に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD20に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD22に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD23に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD30に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD32に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD33に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD123に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD138に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD200Rに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD276に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD324に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、BCMAに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CS1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、ALK1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、ROR1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CDH6に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CDH16に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CDH17に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CDH19に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、EGFRviiiに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Her2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Her3に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、メソテリンに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、葉酸受容体アルファに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、葉酸受容体ベータに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CLL-1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等
)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CLEC5Aに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、NY-ESO/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、WT1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、WT1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、AFP/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HPV16-E7/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、gp100/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、hTERT/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、MART1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HTLV1-Tax/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、PR1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HIV1-gag/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HIV1-エンベロープgp120に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、DLL3に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、PTK7に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TROP2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、LAMP1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Tim1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRガンマ-デルタに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRベータ1定常鎖に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRベータ2定常鎖に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GCCに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、B7H4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、LHRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TSHRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Tn-Muc1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TSLPRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、組織因子に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37
、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、SSEA-4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-32、または骨格-33等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、SLeaに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Muc1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Muc16に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、NYBR-1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、IL13Ra2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、IL11Raに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、L1CAMに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、EpCAM1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、gpNMBに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GRP78に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GPC3に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GRPC5Dに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GFRa4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、FITCに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD79bに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Lym1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Lym2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CLD18A2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、白血病細胞に発現したCD43エピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD179aに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、抗体のFc部分(すなわち、Ig Fc)に特異的である。Ig Fcに特異的な抗原特異的ドメインを有する例示的なCARは、配列番号1629によって表され、抗原特異的ドメインとしてCD16-V158の細胞外ドメインを含む。前述のうちのいずれかでは、CAR構築物をコードする核酸分子は、NF-κB活性化因子コード配列をさらに含むか、またはあるいは、NF-κB活性化因子コード配列は、第2の核酸分子上に存在し得る。
)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CLEC5Aに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、NY-ESO/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、WT1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、WT1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、AFP/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HPV16-E7/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、gp100/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、hTERT/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、MART1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HTLV1-Tax/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、PR1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HIV1-gag/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、HIV1-エンベロープgp120に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、DLL3に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、PTK7に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TROP2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、LAMP1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Tim1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRガンマ-デルタに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRベータ1定常鎖に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TCRベータ2定常鎖に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GCCに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、B7H4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、LHRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TSHRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Tn-Muc1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、TSLPRに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、組織因子に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37
、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、SSEA-4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-32、または骨格-33等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、SLeaに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Muc1/MHCクラスI複合体に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Muc16に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、NYBR-1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、IL13Ra2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、IL11Raに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、L1CAMに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、EpCAM1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、gpNMBに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GRP78に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GPC3に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GRPC5Dに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、GFRa4に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、FITCに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD79bに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Lym1に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、Lym2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CLD18A2に特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、白血病細胞に発現したCD43エピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~4の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、CD179aに特異的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の従来のCAR 1~6の一部または骨格(骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61等)の一部であるCARをコードする核酸分子によってコードされたポリペプチドが本明細書に提供され、これらのCARの抗原特異的ドメインは、抗体のFc部分(すなわち、Ig Fc)に特異的である。Ig Fcに特異的な抗原特異的ドメインを有する例示的なCARは、配列番号1629によって表され、抗原特異的ドメインとしてCD16-V158の細胞外ドメインを含む。前述のうちのいずれかでは、CAR構築物をコードする核酸分子は、NF-κB活性化因子コード配列をさらに含むか、またはあるいは、NF-κB活性化因子コード配列は、第2の核酸分子上に存在し得る。
本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/または選択的NF-κB活性化因子コード配列の所望の成分をコードする核酸配列は、当該技術分野で既知の組換え方法を使用して、例えば、標準の技法を使用して、核酸分子を発現する細胞由来のライブラリをスクリーニングすること、核酸分子を含むことで知られているベクターから核酸分子を得ること、または細胞およびその細胞を含む組織から直接単離すること等によって得られ得る。あるいは、目的とする核酸は、クローン化されるのではなく、合成的に産生され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはアクセサリー分子(例えば、NF-κB活性化因子配列)をコードする核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)転写物として提供される。別の実施形態では、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはアクセサリー分子(例えば、選択的NF-κB活性化因子コード配列)をコードする核酸分子は、DNA構築物として提供される。
クローン化法および発現法は当業者には明らかであり、各々の内容が本明細書に記載されているかのように参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、WO2015/142675、Sambrook et al.,2012、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY、June et al.2009 Nature Reviews Immunology 9.10:704-716、WO01/96584、WO01/29058、米国特許第6,326,193号に記載のものであり得る。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション等は、当該技術分野で周知であり、当業者には明らかであろう。例示的な実施形態では、かかる方法は、各々の内容が本明細書に記載されているかのように参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)、米国特許第5,350,674号、および同第5,585,362号に記載されている。別の実施形態では、CARベクターは、各々の内容が本明細書に記載されているかのように参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、特許出願第WO2013/059343 A1号(PCT/US2012/060646)およびDing X et al,Nat.Biomed.Eng.1,0039(2017)に記載されるように、マイクロ流体デバイスを使用して細胞膜に過渡動揺を引き起こすことによって、細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に形質導入される。
本開示は、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を提供し、この核酸分子は、1つ以上の抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、抗原結合ドメインの各々をコードするヌクレオチド配列は、(i)任意選択的なヒンジ/リンカー、(ii)膜貫通ドメイン、および(iii)任意選択的な細胞内ドメイン、または(a)T細胞受容体定常鎖をコードする核酸配列と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。SIRの構築に使用され得る例示的なT細胞受容体定常鎖としては、TCRα、TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδ、プレTCRαの定常鎖、ならびにそれらのバリアントおよび突然変異体が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、NF-κB活性化因子(例えば、選択的NF-κB活性化因子)コード配列は、同じ組換え核酸構築物上にあるが、発現時には、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARに連結されておらず、むしろ、切断されている(例えば、ペプチド切断可能なリンカーを介して)か、またはポリヌクレオチドにおけるそれ自体の発現カセットの一部である。
本開示は、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)およびアクセサリーモジュールをコードする核酸配列(複数可)を含むベクター(複数可)も提供する。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュールは、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子をコードする。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、天然に存在しないNF-κB活性化因子である。一実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)およびアクセサリーモジュール(例えば、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュール)は、単一のベクターによってコードされる。別の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)およびアクセサリーモジュール(例えば、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュール)は、1つより多くのベクターによってコードされる。さらに別の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)およびアクセサリーモジュール(例えば、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュール)は各々、別個のベクターまたは別個の核酸によってコードされる。一実施形態では、2つの機能的ポリペプチド単位(例えば、CARおよびアクセサリーモジュール)は、単一のベクターまたは単一の核酸によってコードされる。一実施形態では、ベクター(複数可)は、DNAベクター(複数可)、RNAベクター(複数可)、プラスミド(複数可)、レンチウイルスベクター(複数可)、アデノウイルスベクター(複数可)、レトロウイルスベクター(複数可)、バキュロウイルスベクター(複数可)、Sleeping Beautyトランスポゾンベクター(複数可)、またはPiggyBackトランスポゾン(複数可)から選択される。一実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Sleeping Beautyトランスポゾンベクターである。例示的なベクターの核酸配列は、配列番号3840~3841に提供される。ベクターであるpLenti-EF1α(配列番号3840)とpLenti-EF1α-DWPRE(配列番号3841)は、pLenti-EF1α-DWPREがWPRE領域を欠くという事実だけが異なる空レンチウイルスベクターである。pCCL3-MNDU3-WPREベクターの核酸配列は、配列番号7779に提供される。本開示の天然に存在しない免疫受容体コード配列は、これらのベクターのNhe I部位とSal I部位との間にクローン化され得る。
レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(PBS)、1つ以上の(例えば、2つの)長い末端反復(LTR)、および目的とする導入遺伝子、例えば、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、gag、pol、およびenv等のウイルス構造遺伝子を欠き得る。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス(MLV)、脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)、および骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)、ならびにそれらに由来するベクターが挙げられ得る。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al.,”Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application” Viruses.2011 Jun;3(6):677-713に記載されている。別の実施形態では、本開示の所望の天然に存在しない免疫受容体をコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、プロモーターをさらに含み得る。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、MNDU3プロモーター、CMV IE遺伝子プロモーター、EF-lαプロモーター、ユビキチンCプロモーター、コアプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、EF-1プロモーターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリ(A)尾部を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、3’UTRを含む。
本開示は、細胞に直接トランスフェクトされ得るRNA構築物も含む。トランスフェクションに使用するためのmRNAを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のインビトロ転写(IVT)、続いて、3’および5’非翻訳配列(「UTR」)(例えば、本明細書に記載の3’および/または5’UTR)、5’キャップ(例えば、本明細書に記載の5’キャップ)および/または内部リボソーム侵入部位(IRES)(例えば、本明細書に記載のIRES)、発現される核酸、ならびにポリA尾部、典型的には50~2000塩基長(配列番号3855)を含む構築物を産生するためのポリA付加を含む。そのように産生されたRNAは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態では、鋳型は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB刺激分子の配列を含む。一実施形態では、RNA CAR-NFκBベクターは、電気穿孔によって、細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に形質導入される。別の実施形態では、RNA CARベクターおよび/またはNF-κB活性化因子ベクターは、マイクロ流体デバイスを使用して細胞膜に過渡動揺を引き起こすことによって、細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に形質導入される。異なる鎖(または機能的ポリペプチド単位)も、1つまたは1つより多くのベクター、異なるベクターまたは技法の組み合わせを使用して細胞に導入され得る。別の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARが、レトロウイルスベクターを使用して導入され得る一方で、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールは、レンチウイルスベクターを使用して導入される。別の態様では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARが、レンチウイルスベクターを使用して導入される一方で、アクセサリーモジュール(例えば、NF-κB活性化因子)は、Sleeping Beautyトランスポゾンを使用して導入される。さらに別の態様では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARが、レンチウイルスベクターを使用して導入される一方で、アクセサリーモジュール(例えば、NF-κB活性化因子)は、RNAトランスフェクションを使用して導入される。さらに別の態様では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARが、当該技術分野で既知の遺伝子標的技法を使用して内在性TCR鎖遺伝子座における遺伝子組換えによって細胞中に産生される一方で、アクセサリーモジュールは、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して導入される。
RNAは、いくつかの異なる方法、例えば、電気穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)もしくはGene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg,Germany)を含むが、これらに限定されない商業的に利用可能な方法、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、もしくは「遺伝子銃」等の微粒子銃送達系(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)を参照のこと)を使用した、またはマイクロ流体デバイスを使用して細胞膜に過渡動揺を引き起こすことによる(例えば、特許出願第WO2013/059343 A1号およびPCT/US2012/060646を参照のこと)カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションのうちのいずれかを使用して標的細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、非ウイルス法は、トランスポゾン(別名、転位因子)の使用を含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、ゲノム内のある位置に自己挿入することができる一片のDNA、例えば、自己複製してそのコピーをゲノムに挿入することができる一片のDNA、またはより長い核酸からスプライスされてゲノム内の別の位置に挿入され得る一片のDNAである。例えば、トランスポゾンは、転位のために遺伝子を隣接する逆方向反復で構成されたDNA配列を含む。
トランスポゾンを使用した核酸送達の例示的な方法は、Sleeping Beautyトランスポゾン系(SBTS)およびpiggyBac(PB)トランスポゾン系を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Aronovich et al.Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20、Singh et al.Cancer Res.15(2008):2961-2971、Huang et al.Mol.Ther.16(2008):580-589、Grabundzija et al.Mol.Ther.18(2010):1200-1209、Kebriaei et al.Blood.122.21(2013):166、Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16、Bell et al.Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65、およびDing et al.Cell.122.3(2005):473-83を参照されたい。
SBTSは、2つの成分、1)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび2)トランスポザーゼ酵素源を含む。トランスポザーゼは、トランスポゾンを担体プラスミド(または他のドナーDNA)から宿主細胞染色体/ゲノム等の標的DNAに転位することができる。例えば、トランスポザーゼは、担体プラスミド/ドナーDNAに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子(複数可)を含む)をプラスミドから切断し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al(上記参照)を参照されたい。
例示的なトランスポゾンとしては、pT2ベースのトランスポゾンが挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Grabundzija et al.Nucleic Acids Res.41.3(2013):1829-47、およびSingh et al.Cancer Res.68.8(2008):2961-2971を参照されたい。例示的なトランスポザーゼとしては、Tc1/マリナー型トランスポザーゼ、例えば、SB10トランスポザーゼまたはSB11トランスポザーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る高活性トランスポザーゼ)が挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Aronovich et al.、Kebriaei et al.、およびGrabundzija et al.を参照されたい。
SBTSの使用により、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載のCARおよび/またはNF-κB活性化因子をコードする核酸の効率的な組み込みおよび発現が可能になる。例えば、SBTS等のトランスポゾン系を使用して、本明細書に記載のCARおよび/またはNF-κB活性化因子を安定的に発現する細胞、例えば、T細胞またはNKT細胞または幹細胞またはiPSCまたは合成T細胞を生成する方法が本明細書に提供される。
本明細書に記載の方法によれば、いくつかの実施形態では、SBTS成分を含む1つ以上の核酸、例えば、プラスミドは、細胞(例えば、T細胞またはNKT細胞または幹細胞またはiPSCまたは合成T細胞)に送達される。例えば、核酸(複数可)は、標準の核酸(例えば、プラスミドDNA)送達法、例えば、本明細書に記載の方法、例えば、電気穿孔、トランスフェクション、またはリポフェクションによって送達される。いくつかの実施形態では、核酸は、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB活性化因子をコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、導入遺伝子(例えば、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB活性化因子をコードする核酸)を含むトランスポゾン、ならびにトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施形態では、例えば、第1のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第2のプラスミドがトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、2つの核酸を有する系、例えば、二重プラスミド系が提供される。例えば、第1の核酸および第2の核酸は、宿主細胞に共送達される。
本明細書の上および他の箇所に記載されるように、本開示は、本開示の免疫受容体(例えば、CAR、内在性TCR、または組換えTCR)の、NF-κB刺激分子(例えば、選択的NF-κB活性化因子、例えば、天然に存在しないNF-κB活性化剤、例えば、hNEMO-K277A)との共発現により、生存、拡大、増殖、活性化、持続性、サイトカイン産生、およびインビボ活性等の免疫細胞の機能が改善されることを実証する。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然に存在する免疫受容体(例えば、天然TCR)である。一実施形態では、NF-κB刺激分子は、第一世代、第二世代、第三世代CAR、TFP、AbTCR、またはSIRと共発現される。上述のように、NF-κB刺激分子は、CAR、TCR、またはSIR骨格に連結され得るが、好ましくは連結されない。さらに、ある特定の実施形態では、本開示のCARは、CD28または41BBドメインを含まず、任意選択的にCD3ドメインを含む。
一実施形態では、本開示は、選択的NF-κB活性化因子の発現により、生存、拡大、増殖、活性化、持続性、サイトカイン産生およびインビボ活性等の免疫細胞(例えば、T細胞、樹状細胞、CAR-T細胞またはTCR-T細胞等)の機能が改善されることを実証する。本明細書に記載の選択的NF-κB活性化因子とは、NF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化し、他のシグナル伝達経路を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない薬剤を指す。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、NF-κBシグナル伝達経路を活性化し、AKTシグナル伝達経路、PI3Kシグナル伝達経路、JNKシグナル伝達経路、p38キナーゼシグナル伝達経路、ERKシグナル伝達経路、JAK/STATシグナル伝達経路、およびインターフェロンシグナル伝達経路の群から選択されるシグナル伝達経路のうちの1つ以上を活性化しないか、または最小限にしか活性化しない。NF-κB、AKT、PI3K、JNK、p38キナーゼ、ERK、JAK/STAT、およびインターフェロンシグナル伝達経路の活性化を測定するためのいくつかの方法が当該技術分野で既知である。これらのアッセイを本開示の方法で単独でまたは組み合わせて使用して、NF-κB経路の選択的活性化因子特定することができる。
一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、AKT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗体(例えば、クローンG9、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、JNK経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体(例えば、クローンD3F9、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、p38キナーゼ経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat1(Tyr701)抗体(例えば、クローンD4A7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat2(Tyr690)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat3(Tyr705)抗体(例えば、クローンD3A7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat5(Tyr694)抗体(例えば、クローンD47E7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(例えば、クローンD13.14.4E、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、ERK経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。
一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)サブユニットによって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、AKT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗体(例えば、クローンG9;Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、JNK経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体(例えば、クローンD3F9、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、p38キナーゼ経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat1(Tyr701)抗体(例えば、クローンD4A7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat2(Tyr690)抗体(Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat3(Tyr705)抗体(例えば、クローンD3A7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-Stat5(Tyr694)抗体(例えば、クローンD47E7、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、STAT経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、対照ヒトT細胞と比較して、試験ヒトT細胞に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例えば、14D4、Clone Cell Signaling Technology;Danvers,MA)によって測定される、NF-κB活性の20%超(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%超)の増加を誘導するが、Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(例えば、クローンD13.14.4E、Cell Signaling Technology;Danvers,MA)を使用して測定される、ERK経路の活性の20%未満の増加しか誘導しない。
NF-κB、AKT、JNK、p38、ERK、JAK/STAT、およびインターフェロンシグナル伝達経路の活性化を測定する代替方法が当該技術分野で既知であり、これらを使用して、NF-κBシグナル伝達経路の選択的活性化因子を特定することができる。例えば、選択的NF-κB活性化因子は、c-Jun、c-Fos、JunD、ATF2、STAT3、NFAT1c、ELK-1、CREB、IRF3、またはIRF7 DNA結合活性の増加と比較して、標的細胞(例えば、T細胞または293FT細胞)に曝露されるか、またはそれに発現されたときに、NF-κB DNA結合活性のより高い増加を誘導する。異なるシグナル伝達経路に属する異なる転写因子のDNA結合活性を測定するためのキットが市販されており(例えば、TransAM(登録商標)転写因子アッセイ;Active Motif)、これらを使用して、NF-κBシグナル伝達経路の選択的活性化因子を特定することができる。
ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、CD28と比較して、IκBαおよびAKTの両方がヒトT細胞に発現されたときに、またはこれらの両方を介したシグナル伝達が同等の条件下でヒトT細胞において活性化されたときに、IκBαリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、41BBと比較して、IκBαおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現されたときに、またはこれらの両方を介したシグナル伝達が同等の条件下でヒトT細胞において活性化されたときに、IκBαリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い倍増を誘導する。ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CARと共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、CD28共刺激ドメインを含む第二世代CARと比較して、IκBαおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現され、かつ標的抗原を含む細胞に曝露されたときに、IκBαリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CAR(例えば、配列番号1016によって表されるCAR)と共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR(例えば、配列番号1318によって表されるCAR)と比較して、IκBαおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現され、かつ標的抗原を含む細胞(例えば、RAJI)に曝露されたときに、IκBαリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。例えば、K13を共発現するCD19指向性第一世代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC、配列番号1016)を発現するT細胞は、41BB共刺激ドメインを有するCD19指向性第二世代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC、配列番号1318)を発現するT細胞と比較して、両方のCAR-T細胞がRAJI細胞に1:5のE:T比で1~24時間曝露されたときに、IκBαリン酸化のAKTリン酸化に対する比率のより高い増加を示す。IκBαおよびAKTのリン酸化は、それらのリン酸化形態に特異的な抗体を使用した当該技術分野で既知の方法(例えば、免疫ブロット法またはフローサイトメトリー)を使用することによって計算される。IκBαリン酸化の増加は、CARの発現を欠く対照T細胞におけるIκBαリン酸化を、RAJI細胞への曝露後のCAR-T細胞におけるIκBαリン酸化から差し引くことによって計算される。AKTリン酸化の増加は、CARの発現を欠く対照T細胞におけるAKTリン酸化を、RAJI細胞への曝露後のCAR-T細胞におけるAKTリン酸化から差し引くことによって計算される。IκBαリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率は、IκBαリン酸化の増加をAKTリン酸化の増加で割ることによって計算される。
ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、CD28と比較して、p65/RelAおよびAKTの両方がヒトT細胞に発現されたときに、またはこれらの両方を介したシグナル伝達が同等の条件下でヒトT細胞において活性化されたときに、p65/RelAリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、41BBと比較して、p65/RelAおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現されたときに、またはこれらの両方を介したシグナル伝達が同等の条件下でヒトT細胞において活性化されたときに、p65/RelAリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い倍増を誘導する。ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CARと共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、CD28共刺激ドメインを含む第二世代CARと比較して、p65/RelAおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現され、かつ標的抗原を含む細胞に曝露されたときに、p65/RelAリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CAR(例えば、配列番号1016によって表されるCAR)と共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR(例えば、配列番号1318によって表されるCAR)と比較して、p65/RelAおよびAKTの両方が同等の条件下でヒトT細胞に発現され、かつ標的抗原を含む細胞(例えば、RAJI)に曝露されたときに、p65/RelAリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。例えば、K13を共発現するCD19指向性第一世代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC、配列番号1016)を発現するT細胞は、41BB共刺激ドメインを有するCD19指向性第二世代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC、配列番号1318)を発現するT細胞と比較して、両方のCAR-T細胞がRAJI細胞に1:5のエフェクター:標的(E:T)で1~24時間(例えば、1時間、2時間、4時間、12時間、または24時間)曝露されたときに、p65/RelAリン酸化のAKTリン酸化に対する比率のより高い増加を示す。p65/RelAおよびAKTのリン酸化は、それらのリン酸化形態に特異的な抗体を使用した当該技術分野で既知の方法(例えば、免疫ブロット法またはフローサイトメトリー)を使用することによって計算される。p65/RelAリン酸化の増加は、CARの発現を欠く対照T細胞におけるp65/RelAリン酸化を、両方のRAJI細胞への曝露後のCAR-T細胞におけるp65/RelAリン酸化から差し引くことによって計算される。AKTリン酸化の増加は、CARの発現を欠く対照T細胞におけるAKTリン酸化を、両方のRAJI細胞への曝露のCAR-T細胞におけるAKTリン酸化から差し引くことによって計算される。p65/RelAリン酸化の増加のAKTリン酸化の増加に対する比率は、p65/RelAリン酸化の増加をAKTリン酸化の増加で割ることによって計算される。
ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CAR(例えば、配列番号1016によって表されるCAR)と共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR(例えば、配列番号1318によって表されるCAR)と比較して、IκBαリンおよびJNK、ERK、またはp38キナーゼの両方がヒトT細胞に同等の条件下で発現され、かつ標的抗原を含む細胞(例えば、RAJI)に適切な期間(例えば、1~24時間)曝露されたときに、IκBαリン酸化の増加の、JNK、ERK、またはp38キナーゼリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。ある実施形態では、共刺激ドメインを欠く第一世代CAR(例えば、配列番号1016によって表されるCAR)と共発現されたときに、選択的NF-κB活性化因子は、41BB共刺激ドメインを含む第二世代CAR(例えば、配列番号1318によって表されるCAR)と比較して、p65/RelAおよびJNK、ERK、またはp38キナーゼの両方がヒトT細胞に同等の条件下で発現され、かつ標的抗原を含む細胞(例えば、RAJI)に適切な期間(例えば、1~-24時間)曝露されたときに、p65/RelAリン酸化の増加の、JNK、ERK、またはp38キナーゼリン酸化の増加に対する比率のより高い増加を誘導する。
一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB活性化因子は、天然に存在しない薬剤であり、細胞に外因的に発現される。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、ウイルス起源のものであり、すなわち、これは、ウイルスによってコードされるか、またはウイルスによってコードされたタンパク質に由来するか、または1つ以上のウイルスタンパク質と80%超(例えば、85%、90%、95%、または99%超)の同一性を有する10個より多くのアミノ酸残基(例えば、15個より多くのアミノ酸残基、20個より多くのアミノ酸残基、30個より多くのアミノ酸残基、または50個より多くのアミノ酸残基)のドメインを有する。ウイルス起源の例示的な選択的NF-κB活性化因子は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに由来するvFLIP K13(配列番号)である。別の実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、哺乳類または細胞起源のものである。哺乳類起源の例示的な選択的NF-κB活性化因子は、ヒトNEMO-K277A突然変異体、ヒトNEMO-K277-deltaV249-K255突然変異体、マウスNEMO-K270A突然変異体、IKK2-S177E-S181E、およびIKK1-S176E-S180Eである。別の実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、ヒト起源のものであり、すなわち、これは、1つ以上のヒトタンパク質と80%超(例えば、85%、90%、95%、または99%超)の同一性を有する10個より多くのアミノ酸残基(例えば、15個より多くのアミノ酸残基、20個より多くのアミノ酸残基、30個より多くのアミノ酸残基、または50個より多くのアミノ酸残基)のドメインを有する。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、2つ以上の融合タンパク質(例えば、FKBPx2-NEMO)で構成されている。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子の2つ以上の融合パートナーは各々、ヒトタンパク質に由来するか、またはヒトタンパク質と80%超の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子が野生型核酸配列によってコードされる一方で、他の実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、コドン最適化核酸配列または突然変異体配列によってコードされる。例示的な実施形態では、vFLIP K13は、ヒトコドン最適化核酸配列、例えば、K13-opt(配列番号7768)によってコードされる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞が単一の選択的NF-κB活性化因子を発現する一方で、他の実施形態では、免疫細胞発現は、1つより多くの選択的NF-κB活性化因子(例えば、NEMO-K277AおよびK13-optまたはIKK2-S177E-S181EおよびIKK1-S176E-S180E)を発現する。
いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、構成的様式で免疫細胞に発現される。他の実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、誘導的様式で免疫細胞に発現される。例示的な実施形態では、選択的NF-κB活性化因子の誘導的発現は、誘導性プロモーターの使用によって達成され得る。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネイン誘導性プロモーター、グルココルチコイド誘導性プロモーター、プロゲステロン誘導性プロモーター、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。RheoSwitch(登録商標)系は、タンパク質の発現を制御するための別の転写調節因子プラットフォームに相当する。
タンパク質の活性を制御するための方法は当該技術分野で既知であり、選択的NF-κB活性化因子を含むNF-κB活性化因子の活性を制御するために使用され得る。例示的な実施形態では、これは、二量体化ドメインまたはスイッチドメインに融合したNEMOまたはNEMO突然変異体のT細胞またはNK細胞等の標的細胞における発現を伴う。例示的な実施形態では、スイッチドメインは、FKBP12ドメインまたはFKBP12v36ドメインの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、スイッチドメインがNF-κB活性化因子(例えば、NEMO)のカルボキシ末端に結合している一方で、他の実施形態では、スイッチドメインは、NF-κB活性化因子(例えば、NEMO)のアミノ末端に結合している。かかる融合タンパク質を発現する標的細胞の好適な二量体化因子(例えば、Rimiducid)への曝露により、NEMOのオリゴマー化がもたらされ、次いで、NF-κB活性化につながる。代替実施形態では、選択的NF-κB活性化因子の活性は、説明されているように(Matta H et al.,Journal of Biological Chemistry,282,34,2007)、それらを突然変異したエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに融合させることによっても制御され得る。突然変異したエストロゲン受容体は、生理学的リガンドエストロゲンに結合しないが、binds with 非常に高い親和性で合成リガンド4-OHT(4-ヒドロキシタモキシフェン)に結合し、4-OHT依存性様式で融合パートナー(例えば、NF-κB活性化因子、例えば、vFLIP K13またはNEMO)の活性を調節する。
いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技法を使用して、そのゲノムコピーの改変によって免疫細胞に発現される。例示的な実施形態では、遺伝子編集系(例えば、TALON、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはCRISP/Cas9)は、ヒトNEMOの一方または両方の対立遺伝子をヒトNEMO-K277A突然変異体形態に変換するために使用される。別の例示的な実施形態では、遺伝子編集系は、ヒトNEMOの一方または両方の対立遺伝子をヒトNEMO-K277A-デルタ-V249-K255突然変異体形態に変換するために使用される。K277AおよびK277A-デルタ-V249-K255突然変異を誘導するために使用され得るヒトNEMO遺伝子標的構築物の配列は、それぞれ、配列番号7771および7772に提供される。これらの配列は、好適なベクター(例えば、組み込み欠損レンチウイルスベクター、AAVベクター、またはアデノウイルスベクター)にクローン化され得る。相補的標的配列を含むCRISP/Cas9 gRNAが生成され得るヒトNEMOのゲノム標的配列の例は、配列番号7759~7762に提供される。gRNA配列は、pX330-U6-キメラ_BB-CBh-hSpCas9ベクター(Addgene)にクローン化される。あるいは、gRNA配列は、Addgeneによって提供される指示に従ってAddgeneから入手可能なpLenti-CRISPR-v2ベクター(プラスミド番号52961)にクローン化され得る。NEMO標的構築物およびgRNAをコードする構築物のT細胞への導入は、本質的に以前に説明されているように(Knipping F et al,Molecular Therapy:Methods & Clinical Development,Vol 4,2017)行われる。
本明細書に記載の前述の実施形態のうちのいずれかの別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子(例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、またはIKK1-S176E-S180E)をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞は、アクセサリーモジュールを欠く対応する免疫エフェクター細胞と比較して、同様の条件下で比較されたときに、標的抗原発現細胞に対する改善されたインビトロ活性(例えば、標的抗原誘導性IL2産生、増殖、拡大、および末端分化の遅延、老化の遅延等)を示す。免疫エフェクター細胞におけるNF-κB活性化は、リン酸化IκBα、リン酸化p65、全IκBαの測定、p65核転座、NF-κB応答性遺伝子の上方調節、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、およびNF-κBベースのレポーターアッセイ等を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の技法を使用することによって測定される。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化は、AKT経路の活性化の倍増に対する免疫エフェクター細胞におけるNF-κBの活性化の倍増を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-opt(ヒトコドン最適化 K13)またはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞は、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-optまたはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールの発現を欠く対応する免疫エフェクター細胞と比較して、これらの両方が同様の実験条件下で試験されたときに、標的抗原発現細胞に対するより高いインビトロ活性(例えば、標的抗原誘導性IL2産生、増殖、拡大、ならびに末端分化の遅延、および老化の遅延)を示す。例示的な実施形態では、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-opt(ヒトコドン最適化 K13)またはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールを発現するCD19-CAR発現免疫エフェクター細胞は、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-optまたはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールを発現しない対応するCD19-CAR発現エフェクター細胞と比較して、これらの両方が同様の実験条件下で試験されたときに、Nalm6細胞に対するより高いインビトロ活性(例えば、標的抗原誘導性IL2産生、増殖、拡大、ならびに末端分化の遅延、および老化の遅延)を示す。いくつかの実施形態では、標的抗原発現細胞(すなわち、標的細胞)に対する選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞のインビトロ活性(例えば、標的抗原誘導性IL2産生、増殖、拡大、ならびに末端分化の遅延、および老化の遅延)は、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現しない対応する免疫エフェクター細胞のインビトロ活性よりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%高い。いくつかの実施形態では、標的抗原発現細胞(すなわち、標的細胞)に対する選択的NF-κB活性化因子(例えば、hNEMO-K277A)を発現する免疫エフェクター細胞のインビトロ活性(例えば、標的抗原誘導性IL2産生、増殖、拡大、ならびに末端分化の遅延、および老化の遅延)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対応する免疫エフェクター細胞のインビトロ活性よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、2倍、5倍、または10倍高い。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を発現する免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対照免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)と比較して、標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6細胞)に曝露されたときに、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%高いIL2を産生する。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を発現する免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対照免疫エフェクターT細胞(例えば、CAR-T細胞)と比較して、標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6細胞)に曝露されたときに、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%高い増殖を示す。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を発現する免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対照免疫エフェクターT細胞(例えば、CAR-T細胞)と比較して、標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6細胞)に曝露されたときに、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%低い疲弊マーカーを示す。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を発現する免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対照免疫エフェクターT細胞(例えば、CAR-T細胞)と比較して、標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6細胞)に曝露されたときに、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%低い末端分化マーカーを示す。ある実施形態では、選択的NF-κB活性化因子を発現する免疫エフェクターT細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)は、選択的NF-κB活性化因子の発現を欠く対照免疫エフェクターT細胞(例えば、CAR-T細胞)と比較して、標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6細胞)に3~4週間にわたって連続して曝露されたときに、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、または100%高い細胞毒性を示す。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、T細胞(例えば、CD8 T細胞、CD4 T細胞、CAR-T細胞、TIL、TREG細胞、NKT細胞)、NK細胞(例えば、CAR-NK細胞)、マクロファージ(例えば、CAR発現マクロファージ)、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)、幹細胞、誘導多能性幹細胞(iPSC)、または幹細胞である。
本明細書に記載の前述の実施形態のうちのいずれかの別のまたはさらなる実施形態では、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞は、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現しない対照免疫エフェクター細胞と比較して、これらの両方が同様の条件下で試験されたときに、標的抗原発現細胞に対するより高いインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、ルシフェラーゼ発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)を示す。免疫エフェクター細胞におけるNF-κB活性化は、リン酸化IκBα、全IκBαの測定、p65核転座、F-κB応答性遺伝子の上方調節、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、およびNF-κBベースのレポーターアッセイ等を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の技法を使用することによって測定される。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化は、AKT経路の活性化の倍増に対する免疫エフェクター細胞におけるNF-κBの活性化の倍増を測定することによって決定される。例えば、いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-opt(ヒトコドン最適化 K13)またはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールを発現するCD19-CAR発現免疫エフェクター細胞は、選択的NF-κB活性化因子(例えば、K13-opt(ヒトコドン最適化K13)またはhNEMO-K277A)をコードするアクセサリーモジュールを欠く対応するCD19-CAR発現エフェクター細胞と比較して、同様の実験条件下で試験されたときに、NSGマウス異種移植モデルにおけるNalm6-FLuc細胞に対するより高いインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)を示す。いくつかの実施形態では、NSGマウス異種移植モデルにおける標的抗原発現細胞(例えば、Nalm-6)に対する選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)のインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)は、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを欠く対応する免疫エフェクター細胞のインビボ活性よりも少なくとも5、10、20、30、40、50%、または100%高い。いくつかの実施形態では、NSGマウス異種移植モデルにおける標的抗原発現細胞(例えば、Nalm6)に対する選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールをコードする免疫エフェクター細胞(例えば、CD19-CAR-T細胞)のインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)は、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールの発現を欠く対応する免疫エフェクター細胞のインビボ活性よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、2倍、5倍、または10倍高い。いくつかの実施形態では、選択的NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを発現する免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、T細胞(例えば、CD8 T細胞、CD4 T細胞、CAR-T細胞、TIL、TREG細胞、NKT細胞)、NK細胞(例えば、CAR-NK細胞)、マクロファージ(例えば、CAR発現マクロファージ)、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)、幹細胞、誘導多能性幹細胞(iPSC)、または幹細胞である。
本明細書に記載の前述の実施形態のうちのいずれかの別のまたはさらなる実施形態では、アクセサリーモジュール、例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、またはMYD88-L265Pを発現する免疫エフェクター細胞は、アクセサリーモジュールを欠く対応する免疫エフェクター細胞と比較して、同様の条件下で比較されたときに、標的抗原発現細胞に対するより高いインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)を示す。例えば、いくつかの実施形態では、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、またはMYD88-L265Pも共発現するCD19-CAR発現免疫エフェクター細胞は、hNEMO-K277A発現を欠く対応するCD19-CAR発現エフェクター細胞と比較して、同様の実験条件下で試験されたときに、NSGマウス異種移植モデルにおけるNalm6-FLuc細胞に対するより高いインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)を示す。いくつかの実施形態では、NSGマウス異種移植モデルにおける標的抗原発現細胞(すなわち、標的細胞)に対する本明細書に記載のアクセサリーモジュール(例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、またはMYD88-L265P)を発現する免疫エフェクター細胞のインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)は、アクセサリーモジュールの発現を欠く対応する免疫エフェクター細胞のインビボ活性よりも少なくとも5、10、20、30、40、50%、または100%高い。いくつかの実施形態では、NSGマウス異種移植モデルにおける標的抗原発現細胞(すなわち、標的細胞)に対する本明細書に記載のアクセサリーモジュール(例えば、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-deltaV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、またはMYD88-L265P)を発現する免疫エフェクター細胞のインビボ活性(例えば、インビボ拡大、インビボ持続性、腫瘍低減、FLuc発現腫瘍から得られた生物発光値の低下、または動物生存)は、アクセサリーモジュールの発現を欠く対応する免疫エフェクター細胞のインビボ活性よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、2倍、5倍、または10倍高い。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュール発現エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、T細胞(例えば、CD8 T細胞、CD4 T細胞、CAR-T細胞、TIL、TREG細胞、NKT細胞)、NK細胞(例えば、CAR-NK細胞)、マクロファージ(例えば、CAR発現マクロファージ)、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)、誘導多能性幹細胞(iPSC)、または幹細胞である。
本開示は、選択的NF-κB活性化因子の発現を使用して、樹状細胞を含む抗原提示細胞によってもたらされるサイトカイン分泌、抗原提示、および免疫応答を改善することができることをさらに提供する。本開示は、エクスビボまたはインビボでの抗原提示細胞における選択的NF-κB活性化因子の発現によってがんワクチンを含むワクチンの有効性を改善する方法をさらに提供する。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子の使用により、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)によるサイトカイン産生(例えば、TNFα)が少なくとも15%超増加する。
本開示は、CMV-141(配列番号7770)をコードするアクセサリーモジュールが、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、例えば、CAR-T細胞またはTCR-T細胞に発現されて、それらの疲弊を遅延させ、それらの長期持続性を改善することができることをさらに提供する。CMV-141は、誘導的または構成的様式で免疫エフェクター細胞に発現され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB刺激分子を発現する細胞、例えば、T細胞またはNKT細胞または幹細胞またはiPSC細胞または合成T細胞は、SBTSを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas系、または操作メガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用した遺伝子編集との組み合わせを使用することによって生成される。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の細胞、例えば、T細胞、NKT細胞または幹細胞またはiPSC細胞または合成T細胞に、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB刺激分子をコードする核酸を含むベクターを導入(例えば、形質導入)することを含む、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団)を作製する方法を提供する。
様々な実施形態では、本明細書に記載の非天然免疫受容体および/またはNF-κB刺激分子での修飾のためのT細胞またはNK細胞を含む細胞は、療法を所望する対象から得られ得る。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むいくつかの源から得られ得る。T細胞は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはNF-κB刺激分子の発現前にインビトロで培養および拡大され得る組織常在性ガンマ-デルタT細胞であり得る。
一実施形態では、本開示は、疾患関連抗原、例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原に特異的に結合するように操作された抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体断片、TCRまたはTCR断片)を含むいくつかのキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。一実施形態では、本開示は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を提供し、この操作された免疫エフェクター細胞は、治療特性を呈する。一実施形態では、本開示は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を提供し、この操作された免疫エフェクター細胞は、抗がんまたは抗感染(例えば、抗HIV-1)特性を呈する。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子は、T細胞(例えば、腫瘍浸潤リンパ球またはTIL)にその内在性TCRとともに発現され得、この操作された免疫エフェクター細胞は、抗がんまたは抗感染(例えば、抗HIV-1)特性を呈する。一実施形態では、細胞は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)およびNF-κB刺激分子で形質転換され、天然に存在しない免疫受容体は、細胞表面に発現される。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのかかる実施形態では、細胞は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子を安定的に発現し得る。別の実施形態では、細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードする核酸、例えば、mRNA、cDNA、DNAでトランスフェクトされる。いくつかのかかる実施形態では、細胞は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARまたは組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子を過渡的に発現し得る。いくつかの実施形態では、NF-κB刺激分子は、T細胞(例えば、腫瘍浸潤リンパ球またはTIL)にその内在性TCRとともに発現され得る。
本開示は、免疫エフェクター細胞をがん細胞等の罹患細胞または疾患関連細胞に指向する1つ以上の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR/TCR)および/またはNF-κB刺激分子を含むように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を提供する。これは、がん関連抗原に特異的な免疫受容体上の抗原結合ドメインを介して達成される。本開示のCARによって標的とされ得るがん関連抗原(腫瘍抗原)には、(1)がん細胞の表面に発現されるがん関連抗原、および(2)細胞内にあるがん関連抗原の2つのクラスが存在するが、かかる抗原の断片(ペプチド)は、MHC(主要組織適合性複合体)によってがん細胞の表面に提示される。本開示は、内在性TCRを含み、かつ/または免疫エフェクター細胞をがん細胞等の罹患細胞または疾患関連細胞に指向する1つ以上のNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)も提供する。
さらに、本開示は、NF-κB刺激分子も発現するCAR、TCR、およびCAR/TCR発現細胞、および薬剤におけるそれらの使用、または数ある疾患の中でもとりわけ、本明細書に記載の腫瘍抗原または疾患関連抗原を発現する細胞または組織を伴うがんまたはいずれかの悪性腫瘍または自己免疫疾患または感染性疾患または変性疾患またはアレルギー性疾患を治療するための方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CAR)および/またはTCR、およびNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を提供し、この操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性等の抗疾患特性を呈する。抗原のタイプの1つは、本明細書に記載のがん関連抗原(すなわち、腫瘍抗原)である。一態様では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗体断片を含む。一実施形態では、天然に存在しない免疫受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化されたscFvを含む。したがって、本開示は、ヒト化抗原結合ドメインを含み、NF-κB刺激分子も発現する細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に操作された天然に存在しない免疫受容体、例えば、CAR、および養子療法のためのそれらの使用法を提供する。
一実施形態では、本開示は、NF-κB刺激分子を発現するように操作された内在性免疫受容体(例えば、TCR)を含む免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を提供し、この操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性または抗HIV-1特性等の抗疾患特性を呈する。
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび/または天然に存在しない免疫受容体を含む遺伝子操作された細胞が本明細書にさらに提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、Tリンパ球(T細胞)である。いくつかの実施形態では、細胞は、ナイーブT細胞、中心メモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、調節性T細胞(Treg)、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、造血幹細胞(HSC)、胚幹細胞、または多能性幹細胞である。NF-κB刺激分子と組み合わせて本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)を含み得、かつそれを発現し得る遺伝子操作された細胞には、治療的に関連する子孫を生み出すことができる、Tリンパ球(T細胞)、ナイーブT細胞(TN)、メモリーT細胞(例えば、中心メモリーT細胞(TCM)、エフェクターメモリー細胞(TEM))、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および/または多能性胚/誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、遺伝子操作された細胞は、自己細胞である。ある実施形態では、遺伝子操作された細胞は、同種細胞である。一例として、本発明の個々のT細胞は、CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4-/CD8-、またはCD4+/CD8+であり得る。T細胞は、CD4+/CD8-細胞およびCD4-/CD8+細胞の混合集団、または単一クローンの集団であり得る。本発明のCD4+T細胞は、標的抗原を発現する細胞(例えば、CD20+および/またはCD19+腫瘍細胞)とインビトロで共培養されると、IL-2、IFNγ、TNFα、および他のT細胞エフェクターサイトカインを産生し得る。本発明のCD8+T細胞は、標的細胞とインビトロで共培養されると、抗原特異的標的細胞を溶解し得る。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD45RA+CD62L+ナイーブ細胞、CD45RO+CD62L+中心メモリー細胞、CD62L-エフェクターメモリー細胞、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上であり得る(Berger et al.,Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity.Curr Opin Immunol 2009 21(2)224-232)。遺伝子修飾された細胞は、細胞を本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードするDNAで安定的にトランスフェクトすることによって産生され得る。単一の組み込まれた再編成されていないベクターの存在ならびに天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子の発現を示すトランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡大され得る。一実施形態では、エクスビボ拡大のために選択された細胞は、CD8+であり、抗原特異的標的細胞を特異的に認識および溶解する能力を示す。
適切な条件下での抗原によるT細胞の刺激により、細胞の増殖(拡大)および/またはIL-2の産生がもたらされる。本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を含む細胞の数は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)の抗原特異的標的領域への1つ以上の抗原の結合に応答して拡大するであろう。本開示は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)を発現する細胞を作製および拡大する方法も提供する。この方法は、細胞を、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するベクター(複数可)でトランスフェクトまたは形質導入することと、細胞を、受容体に対する標的抗原、組換え標的抗原、または抗体を発現する細胞で刺激して、細胞を増殖させて、T細胞を作製および拡大することとを含む。ある実施形態では、細胞は、治療的に関連する子孫を生み出すことができる、Tリンパ球(T細胞)、ナチュラルキラー(NK)細胞、造血幹細胞(HSC)、または多能性胚/誘導性幹細胞のうちのいずれか1つ以上であり得る。ある実施形態では、NF-κB刺激分子は、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)を導入することなく、細胞(例えば、免疫細胞を生み出すことができる、T細胞、NK細胞、または幹細胞)に発現され得る。
本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を含むT細胞およびNK細胞等の免疫エフェクター細胞は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を使用して活性化および拡大され得る。
一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、従来のCAR 1~6、または本明細書に記載の骨格、例えば、骨格-1、骨格-2、骨格-13、骨格-14、骨格-37、骨格-38、骨格-49、骨格-50、骨格-60、または骨格-61の一部である従来のCAR 1~6、およびNF-κB刺激分子をコードする核酸分子を含み、CARの抗原特異的ドメインは、MPL、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CLL1、TCR-ベータ1定常鎖、TCR-ベータ2定常鎖、TCRガンマ/デルタ、メソテリン、IL13Ra2、ALK、PTK7、DLL3、TROP2、Tim1、LAMP1、CS1、Lym1、Lym2、TSHR、NY-ESO-1/MHCクラス1複合体、WT1/MHCクラスI複合体、Ras/MHCクラスI複合体、AFP/MHCクラスI複合体、HPV-E6/MHCクラスI複合体、HPV-E7/MHCクラスI複合体、CD179a、CLD18A2、CD43エピトープ、またはHIV1エンベロープタンパク質gp120に特異的である。
一実施形態では、細胞は、T細胞であり、T細胞は、内在性T細胞受容体鎖のうちの1つ以上を欠損している。本開示による機能的TCRの発現を安定的に欠くT細胞は、内在性T細胞受容体鎖を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISP/Cas9、およびshRNAの使用等の様々なアプローチを使用して産生され得る。shRNAに関する非限定的な例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれるUS2012/0321667A1に記載されている。TCRのα鎖およびβ鎖の定常領域を標的とするZFNを使用した内在性TCR発現の排除に関する別の非限定的な例示的な方法は、Torikai H et al.(Blood,119(24),June,14 2012)に記載されている。
機能的内在性TCRを欠くT細胞は、例えば、それがいずれの機能的内在性TCRもその表面に発現しないように操作され得るか、それが機能的内在性TCRを含む1つ以上のサブユニット(例えば、内在性TCRα、TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδ、またはプレTCRαの定常鎖)を発現しないように操作され得るか、またはそれが非常に少数の機能的内在性TCRしかその表面に産生しないように操作され得る。あるいは、T細胞は、例えば、TCRのサブユニットのうちの1つ以上の突然変異型または切断型の発現によって、実質的に障害された内在性TCRを発現し得る。「実質的に障害されたTCR」という用語は、このTCRが宿主に有害な免疫反応を誘発しないであろうことを意味する。なおさらに代替の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子は、T細胞ゲノムにおけるTCR遺伝子座にクローン化され得、それ故に、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子は、内在性T細胞発現系の制御下に置かれるであろう。
本開示は、第一世代または第二世代CAR構築物での状態とは対照的に、CD3ε鎖、CD3γ鎖、およびCD3δ鎖に基づくTFP(CD3ε/γ/δ TFPと指定される)が、機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞に発現されたときに、不良な発現および活性を有することを実証する。例えば、CD3ε/γ/δ TFPは、内在性TRACゲノム遺伝子座がTFP発現カセットによって破壊されたαβ T細胞において発現および活性(例えば、T細胞活性化、増殖、サイトカイン産生、および細胞毒性等)障害を有することが観察される。本開示は、天然全長TCRα鎖ポリペプチドの発現が低減または排除されたT細胞にTCRα定常鎖(TRAC鎖)ポリペプチドまたはその断片を再発現することによってこの問題への解決策を提供する。ある実施形態では、再発現されたTCRα定常鎖ポリペプチドまたはTCRα定常鎖断片により、天然TCRα定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるαβ T細胞における機能的CD3ε/γ/δ TFP-TCR-CD3シグナル伝達複合体の再構成が可能になる。ある実施形態では、再発現されたTCRα定常鎖またはTCRα定常鎖断片により、天然TCRα定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるCD3ε/γ/δ TFP発現αβ T細胞の標的抗原誘導性サイトカイン(例えば、IL2、TNFα、IFNγ)産生、増殖、および/または細胞毒性活性を15%超(例えば、20%超、50%超、75%超、または100%超等)改善する。ある実施形態では、再発現されたTCRα定常鎖またはTCRα定常鎖断片により、天然TCRα定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるαβ T細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの増強された発現が可能になる。ある実施形態では、再発現されたTCRα定常鎖またはTCRα定常鎖断片により、天然TCRα定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるαβ T細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現の15%超(例えば、20%超、50%超、75%超、または100%超等)の増加が可能になる。例示的な実施形態では、CD3ε/γ/δ TFPの発現およびシグナル伝達活性は、かかるT細胞に外因性TCRα定常鎖(TRAC鎖)(例えば、配列番号1010)をコードする核酸構築物を導入することによって、天然TCRα鎖の発現が低減または排除されるαβ T細胞において回復し得る。好ましい実施形態では、外因性TRAC鎖をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化され、そのヌクレオチド配列内の内在性または天然TCRα定常鎖とは異なる。代替実施形態では、外因性TRAC鎖をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化され、ヒトTCRα定常鎖の発現を増強することで知られている1つ以上のアミノ酸置換を有する(表3を参照のこと)。例示的な実施形態では、内在性TCRα遺伝子の発現が下方調節または排除されたαβ T細胞におけるTFP-TCR-CD3複合体の再発現および/または活性を可能にするために使用され得る外因性TRAC鎖は、配列番号3886~3894に示される配列を有するか、または配列番号3886~3894に示される配列によってコードされたポリペプチドと80%超の相同性を有するポリペプチドをコードする配列を有する。その細胞表面発現を可能にするために、外因性TCRα定常鎖(TRAC)をコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作的に連結される。ある実施形態では、追加の天然に存在しない配列(例えば、リンカーまたは抗原結合ドメイン)は、TCR-CD3シグナル伝達複合体および/またはCD3ε/γ/δ TFPの他の成分を動員する能力を妨害しない限り、TRAC鎖をコードする配列に任意選択的に付加され得る。ある実施形態では、外因性TCRα定常鎖ポリペプチドは、発現されるT細胞に存在する天然Vα配列(すなわち、抗原結合ドメイン)に操作的に連結されない。ある実施形態では、外因性TCRα定常鎖ポリペプチドの発現は、αβ T細胞がその天然抗原認識特異性および/または親和性を取り戻すこと、例えば、内在性TCRα鎖を有するT細胞によって認識されたMHC-ペプチド抗原複合体を認識することを可能にしない。例示的な実施形態では、外因性TCRα定常鎖をコードするアクセサリーモジュールは、αβ T細胞に、適切な方法(例えば、レンチウイルス媒介遺伝子導入)を使用して単独で発現され得る(配列番号1010)か、または単一のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を使用してTFP発現カセットと共発現され得るかのいずれかである。2つ以上の遺伝子またはRNAの送達および発現の代替方法は当該技術分野で既知であり、本開示に記載されており、本発明の代替実施形態で使用され得る。TCRα定常鎖を、MPLを標的とするCD3ε/γ/δ TFP構築物と共発現する例示的な構築物のヌクレオチド配列は、配列番号3538、3540、および3542に示される。例示的な構築物CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRAC-opt2](配列番号3538)において、第1のカセットは、CD8シグナルペプチドを含むCD3ε-TFPをコードし、続いて、ヒトMPLタンパク質を標的とするヒト化scFV、ならびにCD3εの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインをコードする。このTFPをコードするカセットの後に、インフレームで、フーリン-SGSG-P2Aをコードするリンカーおよびシグナルペプチド(IgSP)をコードするカセットおよびTRACをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列が続く。例示的な実施形態では、全カセットがレンチウイルスベクターを使用して内在性TCRα鎖を欠くαβ T細胞に発現され得る。
代替実施形態では、TCRα定常鎖ポリペプチドの発現は、内在性TCRα定常鎖遺伝子を使用することによって、機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞において回復し得る。例示的な実施形態では、TCRα定常鎖ポリペプチドの発現は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技法を使用してシグナルペプチドをコードする核酸配列を内在性TCRα定常鎖遺伝子の少なくとも1つのコピーにインフレームで機能的に連結することによって、機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞において回復し得る。例示的な実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、TCRα定常鎖ポリペプチドのT細胞表面における発現を可能にするように、内在性TCRα定常鎖遺伝子のうちの少なくとも1つの第1のエクソンにインフレームで操作的に連結される。ある実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRα定常鎖遺伝子をコードする発現カセットは、内在性TCRαプロモーターの転写調節制御下にある。ある実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRα定常鎖遺伝子をコードする発現カセットは、内在性TCRα遺伝子の3’非翻訳配列および調節制御を共有する。代替実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRα定常鎖遺伝子をコードする発現カセットは、外因性プロモーター(例えば、EF1αまたはCMVプロモーター)下にある。
例示的な実施形態では、TCRα定常鎖ポリペプチドの発現は、TFPカセットの後に、インフレームで、2A切断可能なリンカー、シグナルペプチド(例えば、CD8シグナルペプチドまたはIgHシグナルペプチド)、およびTCRα定常鎖(TRAC)の第1のエクソンが続く(図5C)ように標的カセットを設計することによって、内在性または天然TCRα鎖遺伝子がTFPをコードするカセットの標的組み込みによって破壊されたαβ T細胞において回復し得る。例示的なかかる標的構築物は、配列番号3860によって表される。この実施形態では、TCRα定常鎖は、細胞表面発現が標的カセットに存在するシグナルペプチドによって促進される内在性TCRα定常鎖(TRAC)遺伝子から発現される。この実施形態では、TCRα定常鎖は、TCRα遺伝子プロモーターおよびTCRα 3’非翻訳領域の調節制御下で発現される。例示的な代替標的構築物は、配列番号3859によって表され、TFPをコードするカセットの標的組み込みによって内在性TCRα鎖を破壊すると同時に、シグナルペプチド、続いて、コドン最適化TCRα定常鎖cDNAおよびポリA配列をコードする発現カセット(図5B)からのTCRα定常鎖の再発現を同時に可能にする本開示の代替実施形態で使用され得る。
本開示は、第一世代または第二世代CAR構築物での状態とは対照的に、CD3ε/γ/δ TFPは、機能的内在性または天然TCRβ1およびTCRβ2鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRβ1およびTCRβ2鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞(すなわち、TCRα鎖およびTCRβ鎖を発現するT細胞)に発現されたときに、それらの活性を失うことも実証する。例えば、本開示は、CD3ε/γ/δ TFPが内在性TCRβ1およびTCRβ2ゲノム遺伝子座が破壊されたαβ T細胞において発現および活性(例えば、T細胞活性化、増殖、サイトカイン産生、および細胞毒性等)障害を有することを提供する。本開示は、天然全長TCRβ1およびTCRβ2鎖ポリペプチドの発現が低減または排除されたT細胞にTCRβ1もしくはTCRβ2定常鎖ポリペプチドまたはその断片を再発現することによってこの問題への解決策を提供する。ある実施形態では、再発現されたTCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドまたはTCRβ1/β2定常鎖断片により、天然TCRβ1および/またはβ2定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるT細胞、例えば、αβ T細胞における機能的TFP-TCR-CD3シグナル伝達複合体の再構成が可能になる。ある実施形態では、再発現されたTCRβ1/β2定常鎖またはTCRβ1/β2定常鎖断片により、天然TCRβ1および/またはβ2定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるTFP発現αβ T細胞の標的抗原誘導性サイトカイン(例えば、IL2、TNFα、IFNγ)産生、増殖、および/または細胞毒性活性が15%超(例えば、20%超、50%超、75%超、または100%超等)改善する。ある実施形態では、再発現されたTCRβ1/β2定常鎖またはTCRβ1/β2定常鎖断片により、天然TCRβ1および/またはTCRβ2定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるαβ T細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの増強された発現が可能になる。ある実施形態では、再発現されたTCRβ1/β2定常鎖またはTCRβ1/β2定常鎖断片により、天然TCRβ1および/またはTCRβ2定常鎖の発現が障害されるか、低減されるか、または排除されるαβ T細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現の15%超(例えば、20%超、50%超、75%超、または100%超等)の増加が可能になる。例示的な実施形態では、CD3ε/γ/δ TFPの発現およびシグナル伝達活性は、かかるT細胞に外因性TCRβ1/β2定常鎖(TRBC鎖)(例えば、配列番号1011)をコードする核酸構築物に導入することによって天然TCRβ1および/またはTCRβ2鎖の発現が低減または排除されるT細胞において回復し得る。好ましい実施形態では、外因性TCRβ1/β2定常鎖をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化され、そのヌクレオチド配列内の内在性または天然TCRβ1およびTCRβ2定常鎖とは異なる。代替実施形態では、外因性TCRβ1/β2定常鎖をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化され、ヒトTCRβ1/β2定常鎖の発現を増強することで知られている1つ以上のアミノ酸置換を有する(表4a、表4bを参照のこと)。例示的な実施形態では、内在性TCRβ1およびβ2鎖の発現が下方調節または排除されたT細胞におけるTFP-TCR-CD3複合体の再発現および/または活性を可能にするために使用され得る外因性TCRβ1/β2鎖は、配列番号3895~3900に示される配列を有するか、または配列番号3895~3900に示される配列によってコードされたポリペプチドと80%超の相同性を有するポリペプチドをコードする配列を有する。その細胞表面発現を可能にするために、外因性TCRβ1/β2定常鎖(TRBC)をコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作的に連結される。ある実施形態では、追加の天然に存在しない配列(例えば、リンカーまたは抗原結合ドメイン)は、TCR-CD3シグナル伝達複合体および/またはTFPの他の成分を動員する能力を妨害しない限り、TCRβ1/β2定常鎖(TRBC)をコードする配列に任意選択的に付加され得る。ある実施形態では、外因性TCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドは、発現されるT細胞に存在する天然Vβ配列(すなわち、抗原結合ドメイン)に操作的に連結されない。ある実施形態では、外因性TCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドの発現は、T細胞がその天然抗原認識特異性および/または親和性を取り戻すこと、例えば、内在性TCRβ1/β2鎖を有するT細胞によって認識されたMHC-ペプチド抗原複合体を認識することを可能にしない。例示的な実施形態では、外因性TCRβ1/β2定常鎖をコードするアクセサリーモジュールは、T細胞に、適切な方法(例えば、レンチウイルス媒介遺伝子導入)を使用して単独で(例えば、配列番号1011)発現され得るか、または単一のベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を使用してCD3ε/γ/δ TFP発現カセットと共発現され得るかのいずれかである。2つ以上の遺伝子またはRNAの送達および発現の代替方法は当該技術分野で既知であり、本開示に記載されており、本開示の代替実施形態で使用され得る。TCRβ定常鎖を、MPLを標的とするTFP構築物と共発現する例示的な構築物のヌクレオチド配列を、配列番号3537、3539、および3541に示す。例示的な構築物CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRBC-opt2](配列番号3537)において、第1のカセットは、CD8シグナルペプチドを含むTFPをコードし、続いて、ヒトMPLタンパク質を標的とするヒト化scFV、ならびにCD3εの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインをコードする。このTFPをコードするカセットの後に、インフレームで、フーリン-SGSG-P2Aをコードするリンカーおよびシグナルペプチド(IgSP)をコードするカセットおよびTCRβ定常鎖(TRBC)をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列が続く。例示的な実施形態では、全カセットがレンチウイルスベクターを使用して内在性TCRβ鎖を欠くT細胞に発現され得る。
代替実施形態では、TCRβ1またはβ2定常鎖ポリペプチドの発現は、内在性TCRβ1またはβ2定常鎖遺伝子を使用することによって、機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRα鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞において回復し得る。例示的な実施形態では、TCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドおよび共発現されたTFPの発現は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技法を使用してシグナルペプチドをコードする核酸配列を内在性TCRβ1またはTCRβ2定常鎖遺伝子の少なくとも1つのコピーにンフレームで操作的に連結することによって、機能的内在性または天然TCRβ鎖ポリペプチドを欠くか、または障害された機能的内在性または天然TCRβ鎖ポリペプチドを表面に有するαβ T細胞において回復し得る。例示的な実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、TCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドおよび共発現されたTFPのT細胞表面における発現を可能にするように、内在性TCRβ1またはTCRβ2定常鎖遺伝子のうちの少なくとも1つの第1のエクソンにインフレームで操作的に連結される。ある実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRβ1/β2定常鎖をコードする発現カセットは、内在性TCRβ1/β2 プロモーターの転写調節制御下にある。ある実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRβ1/β2定常鎖をコードする発現カセットは、内在性TCRβ1/β2遺伝子の3’非翻訳配列および調節制御下にある。代替実施形態では、シグナルペプチドおよびTCRβ1/β2定常鎖をコードする発現カセットは、外因性プロモーター(例えば、EF1αまたはCMVプロモーター)下にある。
例示的な実施形態では、TCRβ1/β2定常鎖ポリペプチドの発現は、TFPカセットの後に、インフレームで、2A切断可能なリンカー、シグナルペプチド(例えば、CD8シグナルペプチドまたはIgHシグナルペプチド)、およびTCRβ1/β2定常鎖(TRBC)の第1のエクソンが続くように標的カセットを設計することによって、内在性または天然TCRβ1およびTCRβ2鎖遺伝子がTFPをコードするカセットの標的組み込みによって破壊されたαβ T細胞において回復し得る。
CARカセットのTRAC遺伝子座への指向により、およそ95%のT細胞がTCR陰性になることが観察されている。かかるTCR陰性T細胞は、移植片対宿主病(GVHD)を引き起こす可能性が低いため、同種環境下で使用され得る。しかしながら、TRAC遺伝子座がTFPカセットによって標的とされたT細胞におけるTRAC鎖の再発現が、Vβ領域を含む全長TCRβ鎖の発現につながる可能性がある。かかるT細胞は、Vα領域によって提供されるMHC認識を欠くが、TCRβ鎖を介してMHC複合体によって提示されるアロ抗原を認識することができる可能性があり、それ故に、GVHDを引き起こす可能性がある。本開示の代替実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ1鎖またはβ2鎖の両方が、内在性TCRα鎖ならびにTCRβ1鎖およびTCRβ2鎖の発現が下方調節または排除されたCD3ε/γ/δ TFP発現αβ T細胞に再発現される。
上記の例では、外因性TRACまたはTRBCは、TFP発現構築物と共発現されて、内在性TCRα鎖および/またはTCRβ鎖の発現が、例えば、それらのゲノム遺伝子座とすることによって下方調節または排除されたα/β T細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現および/または活性を回復させる。本発明の代替実施形態では、外因性TCRα定常鎖および/またはTCRβ1/β2定常鎖の発現は、キメラ抗原受容体、キメラT細胞受容体(cTCR)、AbTCR、または合成免疫受容体を発現する野生型α/β T細胞またはα/β T細胞を含む任意のα/β T細胞におけるTCR/CD3複合体発現を回復させるために使用される。最後に、同様のアプローチを使用して、内在性TCRγ鎖および/またはTCRδ鎖の発現が下方調節または排除されたγ/δ T細胞におけるCAR/TFPおよび/またはTCR/CD3発現を回復させることができる。内在性TCRγ鎖および/またはTCRδ鎖の発現が下方調節または排除されたγ/δ T細胞に発現され得るTCRγ(TRGC)およびTCRδ(TRDC)の例示的な定常鎖は、配列番号3912および3913によって表される。
本開示は、障害された天然TCRα/β/γまたはδ鎖を有するか、または天然TCRα/β/γまたはδ鎖の発現を欠くT細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現および活性が、TCRα/β/γまたはδの定常鎖の断片またはバリアントを再発現することによって回復し得ることも提供する。天然TCRα/β/γまたはδ鎖を欠く細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現を回復させるために使用され得るTCRα/β/γおよびδの定常鎖の断片/バリアントは、配列番号15141~15144に提供される(表6D)。IgHシグナルペプチドを有するこれらの鎖をコードする発現カセットは、配列番号15145~15148に列記される(表7)。
本開示は、障害されたTCRα/β/γまたはδ鎖を有するか、または天然TCRα/β/γまたはδ鎖の発現を欠くT細胞におけるCD3ε/γ/δ TFPの発現および活性が、欠損しているTCRα/β/γまたはδ定常鎖を含むSIRまたはAb-TCRの共発現によって回復し得ることをさらに提供する。したがって、障害された天然TCRα鎖を有するか、または天然TCRα鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFPの発現および活性は、TCRα定常鎖を含むSIRの発現によってレスキューされ得る。例示的な実施形態では、障害された天然TCRα鎖を有するか、または天然TCRα鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRα定常鎖を含むSIR(例えば、配列番号9668、9669、または9684等によって表されるSIR)の発現によってレスキューされ得る。別の例示的な実施形態では、障害された天然TCRα鎖を有するか、または天然TCRα鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRα定常鎖の一部分を含むAb-TCR(例えば、配列番号9677または9678等によって表されるAb-TCR)の発現によってレスキューされ得る。本開示は、2つのCARを含む同種T細胞での併用療法のために、CD3α/γ/δ TFPが、好ましくは、同種T細胞における発現が低減されるか、または欠損しているTCR定常鎖またはTCR定常鎖断片を組み込むSIRおよび/またはAb-TCRと組み合わせられることを提供する。
本開示は、障害された天然TCRβ鎖を有するか、または天然TCRβ鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFPの発現および活性が、TCRβ定常鎖を含むSIRの発現によってレスキューされ得ることをさらに提供する。例示的な実施形態では、障害された天然TCRβ1/β2鎖を有するか、または天然TCRβ1/β2鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRβ定常鎖を含むSIR(例えば、配列番号9668、9669、または9684等によって表されるSIR)の発現によってレスキューされ得る。別の例示的な実施形態では、障害された天然TCRα鎖を有するか、または天然TCRα鎖の発現を欠くαβ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRβ定常鎖の一部分を含むAb-TCR(例えば、配列番号9677または9678等によって表されるAb-TCR)の発現によってレスキューされ得る。
本開示は、障害された天然TCRγ鎖を有するか、または天然TCRγ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFPの発現および活性が、TCRγ定常鎖を含むSIRの発現によってレスキューされ得ることをさらに提供する。例示的な実施形態では、障害された天然TCRγ鎖を有するか、または天然TCRγ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRγ定常鎖を含むSIR(例えば、配列番号9689によって表されるSIR)の発現によってレスキューされ得る。別の例示的な実施形態では、障害された天然TCRγ鎖を有するか、または天然TCRγ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRγ定常鎖の一部分を含むAb-TCR(例えば、配列番号9676によって表されるAb-TCR)の発現によってレスキューされ得る。
本開示は、障害された天然TCRδ鎖を有するか、または天然TCRδ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFPの発現および活性が、TCRδ定常鎖を含むSIRの発現によってレスキューされ得ることをさらに提供する。例示的な実施形態では、障害された天然TCRδ鎖を有するか、または天然TCRδ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRδ定常鎖を含むSIR(例えば、配列番号9689によって表されるSIR)の発現によってレスキューされ得る。別の例示的な実施形態では、障害された天然TCRδ鎖を有するか、または天然TCRδ鎖の発現を欠くγδ T細胞において、CD3ε/γ/δ TFP(例えば、配列番号8708~8714によってコードされたTFP)の発現および活性は、TCRδ定常鎖の一部分を含むAb-TCR(例えば、配列番号9676によって表されるAb-TCR)の発現によってレスキューされ得る。
本開示は、次世代CAR(例えば、SIRおよびAbTCR)、cTCR、およびTCRが内在性TCR遺伝子によって提供される生理学的調節機構下で発現されることを可能にする方法および構築物も提供する。本開示は、次世代CAR(例えば、SIRおよびAbTCR)、cTCR、およびTCRが内在性TCR遺伝子によって提供されるプロモーターおよび3’非翻訳調節機構下で発現されることを可能にする方法および構築物も提供する。一実施形態では、本開示は、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRをコードする発現カセットが内在性TCRα、TCRβ1/β2、TCRγ、またはTCRδ遺伝子座を標的とするような方法を提供する。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRα定常鎖が内在性天然TCRα定常鎖遺伝子から完全にまたは部分的に発現されるように、内在性TCRα遺伝子座(TRAC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRα定常鎖が内在性TCRα定常鎖遺伝子のエクソンのうちの少なくとも1つによって完全にまたは部分的にコードされるように、内在性TCRα遺伝子座(TRAC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRα定常鎖が天然/内在性TCRα定常鎖遺伝子の3’非翻訳領域およびポリアデニル化配列を完全にまたは部分的に共有するように、内在性TCRα遺伝子座(TRAC)を標的とする。
ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRβ定常鎖が内在性天然TCRβ1またはTCRβ2定常鎖遺伝子から完全にまたは部分的に発現されるように、内在性TCRβ遺伝子座(TRBC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRβ定常鎖が内在性TCRβ定常鎖遺伝子のエクソンのうちの少なくとも1つによって完全にまたは部分的にコードされるように、内在性TCRβ1/β2遺伝子座(TRBC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRβ定常鎖が天然/内在性TCRβ定常鎖遺伝子の3’非翻訳領域およびポリアデニル化配列を完全にまたは部分的に共有するように、内在性TCRβ1/β2遺伝子座(TRBC)を標的とする。
ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRγ定常鎖が内在性天然TCRγ定常鎖遺伝子から完全にまたは部分的に発現されるように、内在性TCRγ遺伝子座(TRGC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRγ定常鎖が内在性TCRγ定常鎖遺伝子のエクソンのうちの少なくとも1つによって完全にまたは部分的にコードされるように、内在性TCRγ遺伝子座(TRGC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRγ定常鎖が天然/内在性TCRγ定常鎖遺伝子の3’非翻訳領域およびポリアデニル化配列を完全にまたは部分的に共有するように、内在性TCRγ遺伝子座(TRGC)を標的とする。
ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRδ定常鎖が内在性天然TCRδ定常鎖遺伝子から完全にまたは部分的に発現されるように、内在性TCRδ遺伝子座(TRDC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRδ定常鎖が内在性TCRδ定常鎖遺伝子のエクソンのうちの少なくとも1つによって完全にまたは部分的にコードされるように、内在性TCRδ遺伝子座(TRGC)を標的とする。ある実施形態では、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRは、SIR/cTCR/Ab-TCR/TCRのTCRδ定常鎖が天然/内在性TCRδ定常鎖遺伝子の3’非翻訳領域およびポリアデニル化配列を完全にまたは部分的に共有するように、内在性TCRδ遺伝子座(TRDC)を標的とする。
T細胞またはナチュラルキラー(NK)または幹細胞は、対象から得られ得る。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生きた生物(例えば、哺乳動物)を含むよう意図されている。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むいくつかの源から得られ得る。T細胞は、CAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子の発現前にインビトロで培養および拡大され得る組織常在性ガンマ-デルタT細胞であり得る。
本開示のある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞は、Ficoll(商標)分離等の当業者に既知のいくつかの技法を使用して対象から収集された血液単位から得られ得る。好ましい一態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、通常、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞が洗浄されて血漿画分が除去され、任意選択的に、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に置くことができる。一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠くか、マグネシウムを欠き得るか、または全てではないが多くの二価カチオンを欠き得る。
カルシウムの不在下での初期活性化ステップにより、活性化の拡大がもたらされ得る。当業者であれば容易に理解するであろうように、洗浄ステップは、当業者に既知の方法によって、例えば、製造業者の指示に従って半自動「貫流」遠心分離機(例えば、Cobe 2991細胞処理装置、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5)を使用することによって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca不含、Mg不含PBS、PlasmaLyte A、または緩衝液を含むか含まない他の生理食塩水溶液等中に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され、細胞が培養培地中に直接再懸濁され得る。
本出願の方法が、5%以下、例えば、2%のヒトAB血清を含む培養培地条件を利用し、既知の培養培地条件および組成物、例えば、Smith et al.,”Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”Clinical & Translational Immunology(2015)4,e31;doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることが認識される。
一態様では、T細胞は、赤血球を溶解し、例えば、PERCOLL(商標)勾配による向流遠心水簸または遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。
一実施形態では、本開示は、疾患の治療または予防を必要とする対象に、X-CARまたはX-TCRおよびNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞を提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供し、ここで、Xは、本明細書に記載の疾患関連抗原を表し、病原細胞または疾患関連細胞がそのX抗原を発現する。表9は、異なる抗原およびこれらの抗原を標的とするCARを発現する免疫エフェクター細胞を使用して予防、抑制、または治療され得る例示的な疾患のリストを提供する。
別の実施形態では、本開示は、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患の治療または予防を必要とする対象に、本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞を提供することによって、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患を治療または予防する方法を提供する。一実施形態では、NF-κB刺激分子は、選択的NF-κB活性化因子である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、非ウイルスNF-κB活性化因子である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、膜貫通タンパク質ではなく、サイトゾルに発現されるか、またはサイトゾルに優先的に存在する。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、構成的に活性である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、構成的に活性ではない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、誘導剤(例えば、二量体化因子)の投与によって活性化される。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、vFLIP K13、NEMO-K277A、またはその誘導体である。CAR/NF-κB刺激分子発現免疫エフェクター細胞は、患者に投与される。一態様では、疾患関連細胞は、がん細胞、感染細胞(例えば、HIV-1感染細胞)、またはプラズマ細胞もしくはB細胞もしくはT細胞である。
別の実施形態では、本開示は、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患の治療または予防を必要とする対象に、天然に存在する免疫受容体(例えば、天然TCR)およびNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞を提供することによって、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患を治療または予防する方法を提供する。一実施形態では、NF-κB刺激分子は、選択的NF-κB活性化因子である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、非ウイルスNF-κB活性化因子である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、膜貫通タンパク質ではなく、サイトゾルに発現されるか、またはサイトゾルに優先的に存在する。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、構成的に活性である。一実施形態では、NF-κB活性化因子、例えば、選択的NF-κB活性化因子は、構成的に活性ではない。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、誘導剤(例えば、二量体化因子)の投与によって活性化される。一実施形態では、選択的NF-κB活性化因子は、vFLIP K13、NEMO-K277A、またはその誘導体である。天然TCRおよびNF-κB刺激分子発現免疫エフェクター細胞は、患者に投与される。一態様では、疾患関連細胞は、がん細胞、感染細胞(例えば、HIV-1感染細胞)、またはプラズマ細胞もしくはB細胞もしくはT細胞である。
別の実施形態では、本開示は、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患の治療または予防を必要とする対象に、天然に存在する(例えば、天然TCR)または本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/または組換えTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞を提供することによって、がん、感染症、自己免疫疾患、またはアレルギー性疾患を治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、CAR-TまたはTCR-T細胞の活性は、水溶性ダサチニブ塩を使用して制御され得る。
別の態様では、対象を治療する方法、例えば、対象における過剰増殖性障害または状態(例えば、がん)、例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液癌、または転移病巣を軽減または改善する方法が提供される。
さらに別の実施形態では、本開示は、対象における疾患を治療する方法に関する。この方法は、対象における疾患が治療されるように、対象に、天然に存在するおよび/または本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/または組換えTCR)および/または本開示のNF-κB刺激分子を発現する細胞を投与することを含む。一態様では、この方法は、対象における疾患が治療されるように、対象に、内在性(または天然)TCRおよび本開示のNF-κB刺激分子を発現する細胞を投与することを含む。一態様では、本明細書に記載の疾患関連抗原の発現に関連する疾患は、感染性疾患である。一態様では、感染性疾患は、HIV1、HIV2、HTLV1、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス8、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルスパラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、mycobacterium tuberculosis、非定型マイコバクテリア種、Pneumocystis jirovecii、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ケカビ、またはカンジダによる感染に関連する疾患である。
いくつかの実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)は、HIV抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、HIV-1抗原である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、HIVエンベロープタンパク質またはその一部分である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gpl20またはその一部分である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gpl20上のCD4結合部位である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gpl20上のCD4誘導性結合部位である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gpl20上のN-グリカンである。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gpl20のV2である。いくつかの実施形態では、HIV抗原は、gp41上の膜近位領域である。
本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞を生み出す幹細胞)が本開示のCARまたはTCRおよび/またはNF-κB刺激分子を発現するように遺伝子修飾され、CAR発現T細胞または幹細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞を生み出す幹細胞)がNF-κB刺激分子を発現するように遺伝子修飾され、かかる細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントにおける疾患関連細胞(例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞)を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、NF-κB活性化因子で修飾された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、幹細胞)は、インビボで複製することができ、長期持続性をもたらし、持続的な腫瘍制御につながり得る。様々な態様では、患者に投与されるNF-κB活性化因子で修飾された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞を生み出すことができる幹細胞)、またはそれらの子孫は、患者へのT細胞または幹細胞の投与後、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、または5年間にわたって患者に存続する。
本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を生み出すことができる幹細胞(例えば、造血幹細胞またはリンパ幹細胞または胚幹細胞、または誘導多能性幹細胞)が本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように修飾され、それを必要とするレシピエントに投与される、ある種の細胞療法も含む。投与された幹細胞は、レシピエントへの移植後に免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を生み出し、この細胞(すなわち、免疫エフェクター細胞)は、レシピエントにおける疾患関連細胞を死滅させることができる。したがって、様々な態様では、CAR/NFκB-活性化因子発現幹細胞の投与後に患者に産生される免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、患者へのT細胞または幹細胞の投与後、少なくとも1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、5年、10年、または20年間にわたって患者に存続する。本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を生み出すことができる幹細胞が本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現するように修飾され、インビトロで分化して、それを必要とするレシピエントに注入される免疫エフェクター細胞を生成する、ある種の細胞療法も含む。レシピエントに注入された後、注入された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、レシピエントにおける疾患関連細胞を死滅させることができる。したがって、様々な態様では、患者に投与される免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、5年、10年、または20年間にわたって患者に存続する。
本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞を生み出す幹細胞)が同じ細胞における2つ以上の異なる抗原を標的とするCARを発現するように遺伝子修飾され、かかるT細胞または幹細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、造血細胞に発現される抗原を標的とする。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、CD19、CD20、CD22、BCMA、CS1、CD138、Lym1、Lym2、CD33、およびCD123の群から選択される抗原を標的とする。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、造血細胞に発現される抗原を標的とし、少なくとも1つの他のCARが、固形腫瘍に発現される抗原を標的とする。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、CD19、CD20、CD22、BCMA、CS1、CD138、Lym1、Lym2、CD33、またはCD123の群から選択される抗原を標的とし、少なくとも1つの他のCARが、メソテリン、Her2、葉酸受容体1、ROR1、IL13Ra2、AFP、WT1、Ras、NY-ESO-1、DLL3、CD70、およびPTK7の群から選択される抗原を標的とする。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、SIRである。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、Ab-TCRである。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、SIRであり、他のCARが、CD3ε/γ/δ TFPである。ある実施形態では、CARのうちの少なくとも1つが、Ab-TCRであり、他のCARが、CD3ε/γ/δ TFPである。ある実施形態では、細胞は、天然TCR鎖のうちの少なくとも1つの発現障害を有する。本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞を生み出す幹細胞)が2つの異なる抗原を標的とするCARおよびNF-κB刺激分子を発現するように遺伝子修飾され、かかる細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法も含む。実施形態では、これらの細胞が自己である一方で、他の実施形態では、これらの細胞は、同種である。注入された細胞は、レシピエントにおける疾患関連細胞(例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞)を死滅させることができる。
エクスビボ免疫化に関して、i)細胞の拡大、ii)本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードする核酸の細胞への導入、またはiii)細胞の凍結保存のうちの少なくとも1つが、哺乳動物への細胞の投与前にインビトロで生じる。
エクスビボ手順が当該技術分野で周知であり、以下でより完全に論じられる。簡潔には、細胞が哺乳動物(例えば、ヒト)から単離され、本開示の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/または本明細書に開示されるNF-κB刺激分子を発現する1つ以上のベクターで遺伝子修飾(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクト)される。天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)およびNF-κB活性化因子で修飾された細胞が哺乳類レシピエントに投与されて、治療利益を提供し得る。哺乳類レシピエントは、ヒトであり得、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)およびNF-κB活性化因子で修飾された細胞は、レシピエントに対して自己であり得る。あるいは、これらの細胞は、レシピエントに対して同種、同系、または異種であり得る。
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ拡大が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,199,942号に記載されており、本発明の細胞に適用され得る。他の好適な方法が当該技術分野で既知であり、それ故に、本発明は、細胞のエクスビボ拡大のいずれの特定の方法にも限定されない。簡潔には、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)のエクスビボ培養および拡大は、(1)CD34+造血幹細胞および前駆細胞を哺乳動物由来の末梢血採取物または骨髄外植片から収集することと、(2)かかる細胞をエクスビボで拡大することとを含む。米国特許第5,199,942号に記載の細胞成長因子に加えて、flt3-L、IL-l、IL-3、およびc-kitリガンド等の他の因子が、細胞の培養および拡大に使用され得る。
一般に、本明細書に記載されるように活性化および拡大された細胞は、免疫不全の個体に発症する疾患の治療および予防に利用され得る。ある特定の態様では、本開示の細胞は、本明細書に記載の疾患関連抗原の発現に関連する疾患、障害、および状態を発症する危険性のある患者の治療に使用される。したがって、本開示は、本明細書に記載の疾患関連抗原の発現に関連する疾患、障害、および状態を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、CAR/TCR/NF-κB刺激分子で修飾された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)または本開示の免疫エフェクター細胞を生成することができる幹細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
一態様では、本開示のCAR/TCR/NF-κB刺激分子発現細胞を使用して、がんもしくは悪性腫瘍等の増殖性疾患、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病等の前癌状態を治療することができる。さらに、本明細書に記載のがん関連抗原の発現に関連する疾患には、例えば、本明細書に記載のがん関連抗原を発現する非定型および/もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前癌状態、または増殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の疾患関連抗原の発現に関連する非癌性関連適応症には、例えば、自己免疫疾患(例えば、ループス)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)、感染性状態(例えば、HIV1、CMV、EBV、インフルエンザ)、ならびに移植が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のCAR/TCR/NF-κB刺激分子で修飾された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、単独で、または薬学的組成物として、希釈剤および/または他の成分、例えば、IL-2もしくは他のサイトカインまたは細胞集団と組み合わせてのいずれかで投与され得る。
血液癌または血液癌状態は、血液、骨髄、およびリンパ系を侵す白血病、リンパ腫、および悪性リンパ増殖性状態等のがんの種類である。
白血病は、急性白血病および慢性白血病に分類される。急性白血病は、急性骨髄性白血病(AML)および急性リンパ性白血病(ALL)にさらに分類され得る。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病(CML)および慢性リンパ白血病(CLL)を含む。他の関連状態には、骨髄血液細胞の産生不良(または異形成)およびAMLへの形質転換の危険性によってまとめられる多様な血液学的状態の群である骨髄異形成症候群(MDS、以前の「前白血病」)が含まれる。
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫が挙げられる。
本開示は、がんを治療および予防するための組成物および方法を提供する。一態様では、がんは、血液学的癌であるか、または血液学的癌を含むが、これに限定されない血液癌は、白血病またはリンパ腫である。一態様では、本開示のCAR/TCR/NFκB発現細胞を使用して、例えば、急性白血病(例えば、B細胞急性リンパ性白血病(「BALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「TALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)を含むが、これらに限定されない)、1つ以上の慢性白血病(例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されない)、さらなる血液学的癌または血液学的状態(例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および骨髄血液細胞の産生不良(または異形成)等によってまとめられる多様な血液学的状態の群である「前白血病」を含むが、これらに限定されない)等であるが、これらに限定されない、がんおよび悪性腫瘍を治療することができる。さらに、本明細書に記載のがん関連抗原の発現に関連する疾患には、例えば、本明細書に記載のがん関連抗原を発現する非定型および/もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前癌状態、または増殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本開示は、対象に、各々が天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、またはその集団の有効量を、任意選択的に免疫細胞の有効性および/または安全性を高める薬剤と組み合わせて投与する方法を提供する。様々な実施形態では、免疫細胞の有効性および/または安全性を高める薬剤は、(i)タンパク質ホスファターゼ阻害剤、(ii)キナーゼ阻害剤、(iii)サイトカイン、(iv)免疫抑制分子阻害剤、(v)TREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤、(vi)CAR/NF-κB刺激分子で修飾された細胞の増殖および/または持続性を高める薬剤、(vii)ケモカイン、(viii)CAR/TCRの発現を増加させる薬剤、(ix)CARの発現または活性の調節を可能にする薬剤、(x)修飾された細胞の生存および/または持続性の制御を可能にする薬剤、(xi)修飾された細胞の副作用を制御する薬剤、(xii)Brd4阻害剤、(xiii)治療薬(例えば、sHVEM)または予防薬を疾患部位に送達する薬剤、(xiv)CARが指向される標的抗原の発現を増加させる薬剤、(xv)アデノシンA2a受容体アンタゴニスト、および(xvi)(i)~(xv)の任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、治療または予防される疾患は、血液学的癌である。さらなる実施形態では、血液学的癌は、白血病である。急性白血病の非限定的な例としては、B細胞急性リンパ性白血病(「BALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「TALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)、1つ以上の慢性白血病(慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されない)、さらなる血液学的癌または血液学的状態(B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および骨髄血液細胞の産生不良(または異形成)によってまとめられる多様な血液学的状態の群である「前白血病」を含むが、これらに限定されない)が挙げられ、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患には、本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する非定型および/もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前癌状態、または増殖性疾患、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍である。
いくつかの実施形態では、疾患に関連する腫瘍抗原は、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビンg;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原)フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、KSHV-K8.1タンパク質、KSHV-gH タンパク質、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2 OR CLDN18A.2))、P-糖タンパク質、STEAP1、LIV1、ネクチン-4、クリプト、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原から選択される。
いくつかの実施形態では、治療される疾患は、HIV1、HIV2、HTLV1、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス8インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、mycobacterium tuberculosis、非定型マイコバクテリア種、Pneumocystis jirovecii、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ケカビ、またはカンジダによる感染を含むが、これらに限定されない感染性疾患である。かかる疾患において、疾患に関連する標的抗原は、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HIV1-gag、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、およびGADから選択される。
本開示の方法および組成物によって治療または予防される疾患は、免疫疾患または変性疾患、例えば、真性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、SLE、サルコイドーシス、強皮症、混合結合組織病、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病であり得る。かかる実施形態では、疾患に関連する標的抗原は、自己抗体である。
標的抗原の発現に関連する疾患のさらなる非限定的な例としては、以下のがんまたは関連状態:結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、環境誘発癌、これらのがんの組み合わせ、およびこれらのがんの転移病巣のうちのいずれか1つが挙げられる。
本明細書に記載の方法または使用のある特定の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子分子を含むCAR/TCR発現細胞は、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤、例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、scFV断片、二重特異性抗体、免疫抑制分子阻害剤、細胞シグナル伝達タンパク質、ウイルスシグナル伝達タンパク質、またはTREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤のうちの1つ以上と組み合わせて投与される。タンパク質ホスファターゼ阻害剤の非限定的な例としては、SHP-1阻害剤および/またはSHP-2阻害剤が挙げられる。キナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、CDK4阻害剤、CDK4/6阻害剤(例えば、パルボシクリブ)、BTK阻害剤(例えば、イブルチニブまたはRN-486)、mTOR阻害剤(例えば、ラパマイシンまたはエベロリムス(RAD001))、MNK阻害剤、または二重P13K/mTOR阻害剤が挙げられる。一実施形態では、BTK阻害剤は、インターロイキン-2-誘導性キナーゼ(ITK)のキナーゼ活性を低下させることも阻害することもない。A2a受容体アンタゴニストの非限定的な例としては、Vipadenantが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫抑制分子を阻害する薬剤は、抑制分子の発現を阻害する、抗体または抗体断片、阻害性核酸、クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)のうちの1つ以上であり得る。本明細書に記載の方法または使用の他の実施形態では、TREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤は、シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇、またはそれらの組み合わせから選択される。本明細書に記載の方法または使用のある特定の実施形態では、免疫抑制分子は、PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRベータ、CEACAM-1、CEACAM-3、およびCEACAM-5からなる群から選択される。他の実施形態では、サイトカインは、IL2、IL-7、IL-15、もしくはIL-21、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。他の実施形態では、CAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子、ならびに第2のもの、例えば、本明細書に開示される併用療法のうちのいずれか(例えば、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤)を含む免疫エフェクター細胞は、実質的に同時にまたは順次投与される。一実施形態では、サイトカインは、対象に、CAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子を含む細胞または細胞集団と同時に投与される(例えば、同じ日に投与される)か、またはその投与後間もなく投与される(例えば、投与の1日、2日、3日、4日、5日、6日、または7日後に投与される)。他の実施形態では、サイトカインは、対象に、細胞または細胞集団の投与から長期間後に(例えば、少なくとも2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、またはそれ以上の期間後に)投与されるか、または対象の細胞への応答の評価後に投与される。
他の実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現する細胞は、CAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子を発現する細胞の投与に関連する1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。CAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子)発現細胞に関連する副作用は、サイトカイン放出症候群(CRS)、血球貪食性リンパ組織球増多症(HLH)、または神経学的合併症から選択され得る。かかる薬剤の例としては、ステロイド(例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン)、IL6Rアンタゴニスト(例えば、トシリズマブ)、IL1Rアンタゴニスト(例えば、アナキンラ)、srcキナーゼ阻害剤(例えば、ダサチニブまたは水溶性ダサチニブ塩)、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブ)、カルシニューリン阻害剤(例えば、タクロリムスまたはシクロスポリンA)、または化学療法薬(例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、またはビンクリスチン)が挙げられる。
一実施形態では、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現する細胞は、免疫増強低用量のmTOR阻害剤と組み合わせて投与される。理論によって束縛されることを望むことなく、免疫増強低用量(例えば、免疫系を完全に抑制しないが、免疫機能を改善するには十分である用量)での治療が、PD-1陽性T細胞の減少またはPD-1陰性細胞の増加を伴うと考えられている。PD-1陽性T細胞は、PD-1リガンド、例えば、PD-L1またはPD-L2を発現する細胞との結合によって疲弊し得るが、PD-1陰性T細胞は疲弊し得ない。
本開示の薬学的組成物は、本明細書に記載の天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子発現細胞、例えば、複数のCAR/TCRおよび/またはNF-κB刺激分子発現細胞を、1つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、緩衝液(例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール)、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸(例えば、グリシン)、抗酸化剤、キレート剤(例えば、EDTAまたはグルタチオン)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化され得る。本組成物は、二次活性薬剤(例えば、抗がん剤、抗ウイルス剤、または抗生物質剤)をさらに含み得る。
本開示の薬学的組成物は、治療(または予防)される疾患に適切な様式で投与され得る。投与量および投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度等の要因によって決定されるであろう。「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療量」もしくは「抗感染」が示されるとき、投与される本開示の組成物の量は、場合によって、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者(対象)の状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。概して、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を含む薬学的組成物が104~109細胞/kg体重、ある場合には105~106細胞/kg体重(これらの範囲内の全ての整数値を含む)の投薬量で投与され得ると述べられ得る。T細胞組成物もこれらの投薬量で複数回投与され得る。これらの細胞は、免疫療法で一般に知られている注入技法を使用することによって投与され得る(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988を参照のこと)。
ある特定の態様では、対象に活性化された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を投与し、その後、再採血し(またはアフェレーシスを行い)、本開示によるそれ由来の免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を活性化し、患者にこれらの活性化および拡大された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を再注入することが所望され得る。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、10cc~400ccの採血から活性化され得る。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採血から活性化される。
いくつかの実施形態では、対象は、白血球がエクスビボで収集されるか、富化されるか、または枯渇して、目的とする細胞、例えば、T細胞を選択および/または単離する白血球除去療法を受け得る。これらのT細胞単離物は、当該技術分野で既知の方法によって拡大され、本開示の1つ以上の構築物が導入され得るように処理および/または形質転換され、それにより、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを共発現する本開示のCAR-TまたはTCR-T細胞を作製することができる。その後、それを必要とする対象は、高用量化学療法での標準の治療を受け、その後に末梢血幹細胞移植が続く。ある特定の態様では、移植後または移植と同時に、対象は、NF-κB活性化因子をコードするアクセサリーモジュールを任意選択的に共発現する本開示の拡大されたCAR-T細胞またはTCR-T細胞の注入を受ける。さらなる態様では、拡大された細胞は、手術前または手術後に投与される。
本開示を実施するためにキットも提供される。例えば、対象におけるがんを治療するためのキット、または本明細書に開示される天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現する細胞を作製するためのキット。本キットは、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードする少なくとも1つの核酸分子またはベクターを、その核酸を免疫エフェクター細胞に導入するための方法とともに含み得る。本キットは、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子をコードする核酸を含むウイルス、ならびにウイルス形質導入を増強するためのポリブレン等の化学物質を含み得る。本キットは、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)を発現するT細胞を単離するための成分を含み得る。あるいは、本キットは、天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)または幹細胞を含み得る。開示される天然に存在しない免疫受容体(例えば、CARおよび/またはTCR)および/またはNF-κB刺激分子のうちの2つ以上が本キットに含まれ得る。本キットは、容器および容器上のラベルまたは容器に関連する添付文書を含み得る。
好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、典型的には、核酸分子、ウイルス、ベクター、T細胞等のうちの1つ以上を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る)。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を治療もしくは予防する方法またはCAR-T細胞を作製する方法における開示される成分の使用に関する指示をさらに含むであろう。添付文書は、典型的には、治療用製品の市販のパッケージに習慣的に含まれる、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、および/またはかかる治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む指示を含む。教材は、電子的形態(コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク等)で書かれ得るか、または視覚的なもの(ビデオファイル等)であり得る。本キットは、本キットが設計された特定の用途を促進するための追加の成分も含み得る。したがって、例えば、本キットは、T細胞上でのまたはT細胞におけるCARおよび/またはNF-κB刺激分子の発現を測定するための手段、またはCARおよび/またはNF-κB刺激分子を発現するT細胞の数またはパーセンテージを決定する手段、または細胞の機能性を決定する手段をさらに含み得る。本キットは、特定の方法の実施に日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
本開示は、以下の実験実施例を参照することによってさらに説明される。これらの実施例は、例証目的のためのみに提供され、別途特定されない限り、限定するようには意図されていない。したがって、本開示は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
異なる細胞表面および細胞内抗原を標的とする異なる構築物の細胞毒性を測定するためにルシフェラーゼ(例えば、GLucまたはNLuc)を発現するように操作された細胞株を表Aに提供する。この実験に使用した細胞株、細胞株上の標的抗原、およびそれらの成長培地を以下の表Aに示す。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養した。細胞株をATCC、NIH AIDS試薬プログラムから入手するか、または実験室で入手可能であった。
NFAT依存性EGFP(またはGFP)レポーター遺伝子で操作されたJurkat細胞株(クローンE6-1)は、Dr.Arthur Weiss(University of California San Francisco)から寄贈されたものであり、CARシグナル伝達の研究のために説明されている((Wu,CY et al.,Science 350:293-302,2015)。Jurkat細胞を、10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地中で維持した。
MPLに対するキメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターの生成
pLENTI-Blastベクターは、LacZ遺伝子の除去によってpLenti6v5gw_laczベクター(Invitrogen、ThermoFisher Scientific)から得られたものである。pLenti-MP2は、Pantelis Tsoulfas(Addgeneプラスミド番号36097)から寄贈されたものであり、これを使用して、標準の分子生物学技法を使用してCMVプロモーターをヒトEF1αプロモーターに置き換えることによって、pLenti-EF1aまたはpLenti-EF1α[配列番号3837]レンチウイルスベクターを生成した。pLenti-EF1a-DWPRE[配列番号3838]は、WPRE配列の欠失によってpLENTI-EF1αベクターから得られたものである。内部Sac II断片をEF1αプロモーターから欠失させて、EF1アルファ(EF1a)-D-SACII-プロモーター(配列番号3842)を生成した。psPAX2ベクターは、Didier Trono(Addgeneプラスミド番号12260)から寄贈されたものである。pLP/VSVGエンベローププラスミドおよび293FT細胞をInvitrogen(ThermoFisher Scientific)から入手した。レトロウイルス導入ベクターMSCVneo、MSCVhygro、およびMSCVpac、ならびにパッケージングベクターpKATを、Dr.Robert Illariaの実験室から入手した。phRGTK Renillaルシフェラーゼ プラスミドは、Promegaのものであった。
pLENTI-Blastベクターは、LacZ遺伝子の除去によってpLenti6v5gw_laczベクター(Invitrogen、ThermoFisher Scientific)から得られたものである。pLenti-MP2は、Pantelis Tsoulfas(Addgeneプラスミド番号36097)から寄贈されたものであり、これを使用して、標準の分子生物学技法を使用してCMVプロモーターをヒトEF1αプロモーターに置き換えることによって、pLenti-EF1aまたはpLenti-EF1α[配列番号3837]レンチウイルスベクターを生成した。pLenti-EF1a-DWPRE[配列番号3838]は、WPRE配列の欠失によってpLENTI-EF1αベクターから得られたものである。内部Sac II断片をEF1αプロモーターから欠失させて、EF1アルファ(EF1a)-D-SACII-プロモーター(配列番号3842)を生成した。psPAX2ベクターは、Didier Trono(Addgeneプラスミド番号12260)から寄贈されたものである。pLP/VSVGエンベローププラスミドおよび293FT細胞をInvitrogen(ThermoFisher Scientific)から入手した。レトロウイルス導入ベクターMSCVneo、MSCVhygro、およびMSCVpac、ならびにパッケージングベクターpKATを、Dr.Robert Illariaの実験室から入手した。phRGTK Renillaルシフェラーゼ プラスミドは、Promegaのものであった。
BBz、CD28z、およびz-K13骨格を有するベクターを含むキメラ抗原受容体の生成、GGS-NLuc融合タンパク質の生成および使用、ならびにMatadorアッセイを使用して細胞毒性を測定するためのルシフェラーゼ(例えば、GLuc)レポーター細胞株の生成および使用が記載されている(PCT/US2017/024843、PCT/US2017/025602、およびPCT/US2017/052344)。
レンチウイルスおよびレトロウイルスベクター
レンチウイルスを、本質的に以前に説明されているように(Matta H et al,Cancer biology and therapy.2(2):206-10.2003)、293FT細胞におけるリン酸カルシウムベースのトランスフェクションによって生成した。293FT細胞を、10%FCS、4mM L-グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、および1mM MEMピルビン酸ナトリウムを有するDMEM(本明細書によってDMEM-10と称される)中で成長させた。レンチウイルスを生成するために、トランスフェクション当日におよそ80%コンフルエントになるように、293FT細胞を10cmの組織培養プレート内の抗生物質なしの10mLのDMEM-10培地中にプレーティングした。翌日、これらの細胞を、異なる遺伝子をコードする10μgのレンチウイルス発現プラスミド、7.5μgのPSPAX2プラスミド、および2μgのPLP/VSVGプラスミドを使用して、リン酸カルシウムトランスフェクション法によってトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ15~16時間後、9mLの培地を除去し、5mLの新鮮な培地と交換した。トランスフェクションのおよそ48時間後、5mLの上清を収集し(第1の収集)、5mLの新鮮な培地と交換した。トランスフェクションのおよそ72時間後、全ての培地を収集した(第2の収集、通常約6mL)。収集した上清をプールし、1000rpmで1分間遠心分離して、いずれの細胞残屑も非付着性細胞も除去した。無細胞上清を、0.45μmのシリンジフィルターを通して濾過した。ある場合には、上清を4℃で2時間にわたる18500rpmでの超遠心分離によってさらに濃縮した。ウイルスペレットをXVIVO培地中の初期体積の10分の1の体積中に再懸濁した。ウイルスを新鮮なうちに使用して標的細胞を感染させるか、または-80℃で一定分量を凍結保存した。
レンチウイルスを、本質的に以前に説明されているように(Matta H et al,Cancer biology and therapy.2(2):206-10.2003)、293FT細胞におけるリン酸カルシウムベースのトランスフェクションによって生成した。293FT細胞を、10%FCS、4mM L-グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、および1mM MEMピルビン酸ナトリウムを有するDMEM(本明細書によってDMEM-10と称される)中で成長させた。レンチウイルスを生成するために、トランスフェクション当日におよそ80%コンフルエントになるように、293FT細胞を10cmの組織培養プレート内の抗生物質なしの10mLのDMEM-10培地中にプレーティングした。翌日、これらの細胞を、異なる遺伝子をコードする10μgのレンチウイルス発現プラスミド、7.5μgのPSPAX2プラスミド、および2μgのPLP/VSVGプラスミドを使用して、リン酸カルシウムトランスフェクション法によってトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ15~16時間後、9mLの培地を除去し、5mLの新鮮な培地と交換した。トランスフェクションのおよそ48時間後、5mLの上清を収集し(第1の収集)、5mLの新鮮な培地と交換した。トランスフェクションのおよそ72時間後、全ての培地を収集した(第2の収集、通常約6mL)。収集した上清をプールし、1000rpmで1分間遠心分離して、いずれの細胞残屑も非付着性細胞も除去した。無細胞上清を、0.45μmのシリンジフィルターを通して濾過した。ある場合には、上清を4℃で2時間にわたる18500rpmでの超遠心分離によってさらに濃縮した。ウイルスペレットをXVIVO培地中の初期体積の10分の1の体積中に再懸濁した。ウイルスを新鮮なうちに使用して標的細胞を感染させるか、または-80℃で一定分量を凍結保存した。
T細胞およびPBMCの感染
バフィーコート細胞をBlood Bank at Children Hospital of Los Angelesの健常な匿名成人ドナーから入手し、それらを使用して末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll-Hypaque勾配遠心分離によって単離した。PBMCをそのままの状態で使用するか、またはそれを使用して、T細胞を製造業者の指示に従ってCD3電磁マイクロビーズ(Miltenyi Biotech)を使用して単離した。PBMCまたは単離されたT細胞を、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中に再懸濁した。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養した。細胞をレンチウイルスベクターに感染させる前に上記の培地中で1日間活性化した。概して、初代細胞(例えば、T細胞)を、午前中に、スピン感染(1800rpm、37℃で90分間)を使用して8μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma、カタログ番号H9268)の存在下でXVIVO培地中に再懸濁された300μLの濃縮ウイルスに感染させた。培地を夕方に交換し、感染をさらに2日間続けて、合計3回感染させた。3回目の感染後、細胞をペレット化し、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2を含有し、かつ(必要に応じて)それぞれの抗生物質を補充した新鮮なXVIVO培地中に再懸濁し、別途指示されない限り、選択のために細胞培養フラスコ内に置いた。薬物選択を使用しなかった場合、細胞を上記の培地中で10~15日間培養し、薬物選択を使用した場合、20~30日間培養した。細胞を、EGFPを発現するレンチウイルスに感染させた場合、これらの細胞を薬物選択なしで拡大させるか、または流動選別して、EGFP発現細胞を富化した。がん細胞株の感染のために、およそ500,000個の細胞を、総体積3mLのPolybrene(登録商標)(Sigma、カタログ番号H9268)中2mLの未濃縮ウイルス上清に感染させた。翌朝、細胞をペレット化し、それぞれの抗生物質を有する培地中に再懸濁し、選択のために細胞培養フラスコ内に置いた。
バフィーコート細胞をBlood Bank at Children Hospital of Los Angelesの健常な匿名成人ドナーから入手し、それらを使用して末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll-Hypaque勾配遠心分離によって単離した。PBMCをそのままの状態で使用するか、またはそれを使用して、T細胞を製造業者の指示に従ってCD3電磁マイクロビーズ(Miltenyi Biotech)を使用して単離した。PBMCまたは単離されたT細胞を、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中に再懸濁した。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養した。細胞をレンチウイルスベクターに感染させる前に上記の培地中で1日間活性化した。概して、初代細胞(例えば、T細胞)を、午前中に、スピン感染(1800rpm、37℃で90分間)を使用して8μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma、カタログ番号H9268)の存在下でXVIVO培地中に再懸濁された300μLの濃縮ウイルスに感染させた。培地を夕方に交換し、感染をさらに2日間続けて、合計3回感染させた。3回目の感染後、細胞をペレット化し、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2を含有し、かつ(必要に応じて)それぞれの抗生物質を補充した新鮮なXVIVO培地中に再懸濁し、別途指示されない限り、選択のために細胞培養フラスコ内に置いた。薬物選択を使用しなかった場合、細胞を上記の培地中で10~15日間培養し、薬物選択を使用した場合、20~30日間培養した。細胞を、EGFPを発現するレンチウイルスに感染させた場合、これらの細胞を薬物選択なしで拡大させるか、または流動選別して、EGFP発現細胞を富化した。がん細胞株の感染のために、およそ500,000個の細胞を、総体積3mLのPolybrene(登録商標)(Sigma、カタログ番号H9268)中2mLの未濃縮ウイルス上清に感染させた。翌朝、細胞をペレット化し、それぞれの抗生物質を有する培地中に再懸濁し、選択のために細胞培養フラスコ内に置いた。
293FT細胞を、10μgのレトロウイルス構築物、4μgのpKAT、および2μgのVSVGプラスミドを使用して、10mLのDMEM-10培地中の10cmの組織培養プレート内で概ねトランスフェクトしたことを除いて、レンチウイルスベクター産生について上に記載される手順と本質的に同様の手順をレトロウイルスベクターの生成に使用した。ウイルス収集および標的細胞感染を、レンチウイルスベクターについて本質的に上に記載されるように行った。
抗体および薬物
ブリナツモマブをAmgenから入手した。ジギトニンをSigmaから購入し(カタログ番号D141)、100mg/mLの原液をDMSO中で作製した。1mg/mLの希釈原液をPBS中で作製した。細胞溶解に使用したジギトニンの最終濃度は、別途指示されない限り、30μg/mLであった。
ブリナツモマブをAmgenから入手した。ジギトニンをSigmaから購入し(カタログ番号D141)、100mg/mLの原液をDMSO中で作製した。1mg/mLの希釈原液をPBS中で作製した。細胞溶解に使用したジギトニンの最終濃度は、別途指示されない限り、30μg/mLであった。
ELISA
ヒトIL2、IFNγ、IL6、およびTNFαを、R&D systems(Minneapolis,MN)およびBD Biosciencesから市販されているELISAキットを使用し、かつ製造業者の推奨に従って、特異的標的細胞株と24~96時間共培養したCAR発現Jurkat-NFAT-GFPエフェクター細胞またはT細胞の細胞培養上清中で測定した。
ヒトIL2、IFNγ、IL6、およびTNFαを、R&D systems(Minneapolis,MN)およびBD Biosciencesから市販されているELISAキットを使用し、かつ製造業者の推奨に従って、特異的標的細胞株と24~96時間共培養したCAR発現Jurkat-NFAT-GFPエフェクター細胞またはT細胞の細胞培養上清中で測定した。
CARの発現を検出するためのFACS分析
マウス抗ヒトc-Myc APCコンジュゲートモノクローナル抗体(カタログ番号IC3696A)は、R&D Systems(Minneapolis,MN)製のものであった。ビオチン化タンパク質LをGeneScript(Piscataway,NJ)から購入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で1mg/mLで再構成し、4℃で保管した。ストレプトアビジン-APC(SA1005)をThermoFisher Scientificから購入した。
マウス抗ヒトc-Myc APCコンジュゲートモノクローナル抗体(カタログ番号IC3696A)は、R&D Systems(Minneapolis,MN)製のものであった。ビオチン化タンパク質LをGeneScript(Piscataway,NJ)から購入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で1mg/mLで再構成し、4℃で保管した。ストレプトアビジン-APC(SA1005)をThermoFisher Scientificから購入した。
Myc染色を使用してCARを検出するために、1×106細胞を採取し、4%ウシ血清アルブミン(BSA)洗浄緩衝液を含有する3mLの氷冷1×PBSで3回洗浄した。洗浄後、細胞を、10μLのAPCコンジュゲートMyc抗体を含有する0.1mLの氷冷洗浄緩衝液中に再懸濁し、暗所で1時間インキュベートし、その後、氷冷洗浄緩衝液で2回洗浄した。
タンパク質L染色を使用してCARを検出するために、1×106細胞を採取し、4%ウシ血清アルブミン(BSA)洗浄緩衝液を含有する3mLの氷冷1×PBSで3回洗浄した。洗浄後、細胞を、1μgのタンパク質Lを含有する0.1mLの氷冷洗浄緩衝液中に4℃で1時間再懸濁した。細胞を氷冷洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後、0.1mLの洗浄緩衝液中10μLのAPCコンジュゲートストレプトアビジンと30分間インキュベートし(暗所で)、その後、氷冷洗浄緩衝液で2回洗浄した。FACSを、BD Biosciences製のFACSVerse分析器を使用して行った。
細胞死アッセイ
細胞死を測定するために、Gluc、NLuc、および他のルシフェラーゼの異所性サイトゾル発現に基づく新規のアッセイを、PCT/US2017/052344“A Non-Radioactive Cytotoxicity Assay”に記載されるように利用した。この方法は、健常な細胞内に優先的に保持されるが、死細胞および瀕死細胞から放出されるか、または活性が死細胞および瀕死細胞において優先的に測定され得るかのいずれかの様式での標的細胞におけるレポーターの発現を含む。このアッセイに好ましいレポーターは、1)Gaussia princeps等のカイアシ類由来のルシフェラーゼの非分泌形態、2)NanoLuc等の深海エビ由来の操作されたルシフェラーゼレポーターである。いくつかのかかる例示的なレポーターベクターの配列を、配列番号3845~配列番号3851に提供する。上記のベクターを使用してレトロウイルスおよびレンチウイルスを生成し、次いで、これらを使用して、適切な抗生物質での選択後にGLuc、NLuc、またはTurboLucを安定的に発現するいくつかの標的細胞株のポリクローナル集団を生成した。別途指示されない限り、異なるルシフェラーゼを安定的に発現する標的細胞を培地中の384ウェルプレート内に三連でプレーティングし、標的細胞を成長させるために使用した。懸濁液中で成長する標的細胞を2~3×104/ウェルの濃度で概ねプレーティングし、付着性単層として成長する標的細胞を1~2×104/ウェルの濃度でプレーティングした。別途指示されない限り、標的細胞を遺伝子修飾されたT細胞(すなわち、CARを発現するもの)と1:1~10:1のエフェクター:標的(E:T)比で4時間~96時間共培養した。標的細胞が付着細胞(例えば、HeLa細胞)として成長する場合、それらをウェルの底部に一晩付着させた後にT細胞を添加した。標的細胞の溶解のT細胞媒介誘導を、以下に記載されるように天然セレンテラジン(Nanaolight)を含有する0.5×CTZアッセイ緩衝液を直接注入することによってBioTek synergyプレートリーダーによって測定されるルシフェラーゼ活性の増加によってアッセイした。
細胞死を測定するために、Gluc、NLuc、および他のルシフェラーゼの異所性サイトゾル発現に基づく新規のアッセイを、PCT/US2017/052344“A Non-Radioactive Cytotoxicity Assay”に記載されるように利用した。この方法は、健常な細胞内に優先的に保持されるが、死細胞および瀕死細胞から放出されるか、または活性が死細胞および瀕死細胞において優先的に測定され得るかのいずれかの様式での標的細胞におけるレポーターの発現を含む。このアッセイに好ましいレポーターは、1)Gaussia princeps等のカイアシ類由来のルシフェラーゼの非分泌形態、2)NanoLuc等の深海エビ由来の操作されたルシフェラーゼレポーターである。いくつかのかかる例示的なレポーターベクターの配列を、配列番号3845~配列番号3851に提供する。上記のベクターを使用してレトロウイルスおよびレンチウイルスを生成し、次いで、これらを使用して、適切な抗生物質での選択後にGLuc、NLuc、またはTurboLucを安定的に発現するいくつかの標的細胞株のポリクローナル集団を生成した。別途指示されない限り、異なるルシフェラーゼを安定的に発現する標的細胞を培地中の384ウェルプレート内に三連でプレーティングし、標的細胞を成長させるために使用した。懸濁液中で成長する標的細胞を2~3×104/ウェルの濃度で概ねプレーティングし、付着性単層として成長する標的細胞を1~2×104/ウェルの濃度でプレーティングした。別途指示されない限り、標的細胞を遺伝子修飾されたT細胞(すなわち、CARを発現するもの)と1:1~10:1のエフェクター:標的(E:T)比で4時間~96時間共培養した。標的細胞が付着細胞(例えば、HeLa細胞)として成長する場合、それらをウェルの底部に一晩付着させた後にT細胞を添加した。標的細胞の溶解のT細胞媒介誘導を、以下に記載されるように天然セレンテラジン(Nanaolight)を含有する0.5×CTZアッセイ緩衝液を直接注入することによってBioTek synergyプレートリーダーによって測定されるルシフェラーゼ活性の増加によってアッセイした。
CTZアッセイ
天然セレンテラジンの100倍原液(CTZ、Nanolight、カタログ番号303)を、CTZの経時的な酸化を避けるために1mgの凍結乾燥CTZ粉末を30μLの6N HClを補充した1.1mLの100%メタノール中に溶解することによって作製した。CTZアッセイ緩衝液を作製するために、CTZの100倍原液をPBS中で0.5倍濃度に希釈した。別途指示されない限り、総体積15μLのCTZアッセイ緩衝液(上で調製されたもの)を、体積およそ50~60μLの培地中のルシフェラーゼの非分泌型を発現する細胞を含有する384ウェル白色プレート(Greiner、384ウェル白色プレートカタログ番号781075)の各ウェルに添加し、BioTek synergyH4プレートリーダーを使用してプレートを発光について読み取った。96ウェルプレートの場合、細胞を200μLの培地中にプレーティングし、およそ50μLの0.5倍CTZアッセイ緩衝液を添加した。別途指示されない限り、0.5倍CTZアッセイ緩衝液を、GLuc、TurboLuc16、およびMLuc7の活性をアッセイするために使用した。CTZアッセイ緩衝液(0.125倍濃度に希釈したもの)もいくつかの実験でNLuc活性を測定するために使用した。概して、別途指示されない限り、添加した0.5倍CTZアッセイ緩衝液の体積は、細胞を含有するウェル中の液体の体積のおよそ4分の1であったが、このアッセイは、0.5倍CTZアッセイ緩衝液を、細胞を1:1の体積比で含有する培地に添加したときにも機能した。培地のみ(Med)を含有するウェルおよび標的細胞をいずれのCAR構築物(T-UI)にも感染しなかったT細胞とインキュベートしたウェルにおけるGluc活性を、必要に応じて対照として使用した。
天然セレンテラジンの100倍原液(CTZ、Nanolight、カタログ番号303)を、CTZの経時的な酸化を避けるために1mgの凍結乾燥CTZ粉末を30μLの6N HClを補充した1.1mLの100%メタノール中に溶解することによって作製した。CTZアッセイ緩衝液を作製するために、CTZの100倍原液をPBS中で0.5倍濃度に希釈した。別途指示されない限り、総体積15μLのCTZアッセイ緩衝液(上で調製されたもの)を、体積およそ50~60μLの培地中のルシフェラーゼの非分泌型を発現する細胞を含有する384ウェル白色プレート(Greiner、384ウェル白色プレートカタログ番号781075)の各ウェルに添加し、BioTek synergyH4プレートリーダーを使用してプレートを発光について読み取った。96ウェルプレートの場合、細胞を200μLの培地中にプレーティングし、およそ50μLの0.5倍CTZアッセイ緩衝液を添加した。別途指示されない限り、0.5倍CTZアッセイ緩衝液を、GLuc、TurboLuc16、およびMLuc7の活性をアッセイするために使用した。CTZアッセイ緩衝液(0.125倍濃度に希釈したもの)もいくつかの実験でNLuc活性を測定するために使用した。概して、別途指示されない限り、添加した0.5倍CTZアッセイ緩衝液の体積は、細胞を含有するウェル中の液体の体積のおよそ4分の1であったが、このアッセイは、0.5倍CTZアッセイ緩衝液を、細胞を1:1の体積比で含有する培地に添加したときにも機能した。培地のみ(Med)を含有するウェルおよび標的細胞をいずれのCAR構築物(T-UI)にも感染しなかったT細胞とインキュベートしたウェルにおけるGluc活性を、必要に応じて対照として使用した。
標的細胞上での抗原の発現を検出し、CARおよびBiTeの構築に使用される様々な抗原結合部分の抗原結合活性を決定するためのアッセイ
標的細胞上での抗原の発現を、抗原特異的抗体での免疫染色または参照により全体が本明細書に組み込まれるPCT/US2017/025602に記載の高感度抗原検出アッセイと組み合わせた生物情報学アプローチによって決定した。このアッセイは、GLucまたはNLucレポーター断片の、抗体の抗原結合ドメイン、scFv、vHH、もしくは任意の他の抗原結合断片、または任意の受容体およびリガンドへのの融合を含む。結果として生じた融合タンパク質を、試験抗原を発現する標的細胞とインキュベートし、融合タンパク質の結合を、セレンテラジンまたはルシフェラーゼレポーターの他の好適な基質の添加によって決定する。
標的細胞上での抗原の発現を、抗原特異的抗体での免疫染色または参照により全体が本明細書に組み込まれるPCT/US2017/025602に記載の高感度抗原検出アッセイと組み合わせた生物情報学アプローチによって決定した。このアッセイは、GLucまたはNLucレポーター断片の、抗体の抗原結合ドメイン、scFv、vHH、もしくは任意の他の抗原結合断片、または任意の受容体およびリガンドへのの融合を含む。結果として生じた融合タンパク質を、試験抗原を発現する標的細胞とインキュベートし、融合タンパク質の結合を、セレンテラジンまたはルシフェラーゼレポーターの他の好適な基質の添加によって決定する。
CAR T細胞の多様なプールの生成
上記のアッセイを使用して、本発明のCARの構築に使用される異なる抗原結合モジュール(例えば、scFv、vHH、受容体、リガンド)をスクリーニングし、特異的結合活性を示すことが認められた抗原結合モジュールをCARの構築のために選択した。さらに、scFV断片のうちのいくつかも、文献または我々の実験室におけるそれらの既知の活性に基づいて選択した。
上記のアッセイを使用して、本発明のCARの構築に使用される異なる抗原結合モジュール(例えば、scFv、vHH、受容体、リガンド)をスクリーニングし、特異的結合活性を示すことが認められた抗原結合モジュールをCARの構築のために選択した。さらに、scFV断片のうちのいくつかも、文献または我々の実験室におけるそれらの既知の活性に基づいて選択した。
異なるCARまたはCARのサブセットが、病原細胞および疾患関連細胞の有病率およびそれらにおける標的抗原の発現レベル、疾患負荷、ならびに疾患の進行速度を含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて異なる疾患状態に最適に適合されることが可能である。異なるCARは、それらの有効性および毒性プロファイルならびに患者の状態に応じて異なる患者における単一の疾患状態にさえも最適に適合され得る。本開示は、多様な養子免疫応答の生成の著しい技術的および論理的な困難への解決策を提供する。
正常TCR多様性が遺伝子再編成によってもたらされる。胸腺における厳密な陽性および陰性選択プロセスは、低い親和性範囲内で自己ペプチド/MHCの認識に制限されるαβ TCRを発現するT細胞のみが周辺に生息することができることを確実にする。したがって、胸腺環境は、自己制限的であるが、自己反応性ではないαβ T細胞のプールの生成を可能にする。
異なる抗原結合ドメインからのCAR-T細胞の多様なプールの生成は、複数の抗原結合ドメインの生成および試験の技術的および経済的困難によって制限される。より重要なことには、抗原結合ドメイン(例えば、抗体のvL断片およびvH断片)が各々他の抗原に結合し、かつ標的外の毒性を引き起こす可能性があるため、複数の抗原結合ドメインのみに基づくCARの多様なプールは、毒性の危険性の増加を有する可能性がある。したがって、かかるプールの潜在的な多様性は、標的外の毒性の低減に制限されなければならない。本出願は、単一または少数の抗原結合ドメインをTCR鎖、シグナル伝達ドメイン、および骨格の異なるバリアントに結合させることによって単一または少数の抗原結合ドメインからCARの多様なプールを生成することによってこの問題を打開する。CARプールの多様性は、異なるリンカーの使用によってさらに増加する。このプールを発現するT細胞の多様性は、本開示に記載の異なるアクセサリーモジュールの使用によってさらに増加し得る。
この多様なCARプールを使用して、その抗原を発現する病原細胞または疾患関連細胞に対する多様な免疫応答を提供することができる。あるいは、この多様なCARプールは、当該技術分野で既知の技法を使用して任意選択的にDNAバーコード化され、その後、これを使用して、最適な生物学的および臨床的特性を有するCARの単一群または下位群を選択することができる。これらの特性には、インビトロ生物学的アッセイにおける性能(例えば、細胞毒性、サイトカイン分泌、結合親和性、細胞表面発現、標的外効果、T細胞増殖、疲弊マーカーの発現、および末端分化等)、インビボアッセイにおける性能(例えば、生存、腫瘍低減、T細胞持続性、T細胞拡大等)、ならびに臨床経験(例えば、疾患寛解、再発率、毒性等)が含まれ得るが、これらに限定されない。本開示のCARを単独でまたは他のCARならびに当該技術分野で既知の他の天然および合成免疫受容体と組み合わせて、それらの標的抗原を発現する細胞によって引き起こされるか、またはそれに関連する様々な疾患状態を予防および治療するための免疫エフェクター細胞の多様なプールを生成することができる。
所望の特性を有するCARを選択するためのインビトロおよびインビボ選択の使用。CD19を標的とするCAR(配列番号1594~1608、1016~1026、1900~1910)のプールを、TRAC gRNAおよび当該技術分野で既知の技法を使用して、T細胞におけるTRAC遺伝子座に標的させる。標的ベクターは、CAR挿入の終止コドンの下流に位置するDNAバーコードも有する。T細胞を、末梢血から得ることができる。代替実施形態では、T細胞を、当該技術分野で既知の技法を使用してiPSCまたは造血幹細胞の単一のクローンから得る。CARプールを発現するT細胞をRAJI細胞とインビトロで1~21日間共培養する。標的細胞と培養する前にCAR-T細胞プールの一定分量を収集し、共培養後の様々な日に収集する。試料を次世代シーケンシングに供して、標的細胞への曝露後の異なるCARの相対頻度を決定する。生物情報学分析を使用して、標的細胞との共培養後のより良好な増殖応答に関連するCARを決定する。本質的に同様のアプローチを使用して、腫瘍チャレンジに屈する動物と比較して、T細胞増にインビボでより高い殖能を付与する、および/またはインビボで長期存続する、および/または生存動物における出発T細胞集団でのそれらの頻度に正規化した場合により高い頻度で存在するCARを決定する。本開示の代替実施形態では、本質的に同様のアプローチをヒト臨床試料に使用して、より良好な長期生存、より低いサイトカイン放出症候群罹患率、より低い神経毒性、および/またはより高い長期持続性を含むが、これらに限定されない異なる特性および/または結果に関連するCARを特定する。その後、かかるCARを単独でまたは様々な組み合わせでのいずれかで使用して、異なる疾患状態および異なる患者の治療の多様な特性を有する、同じまたは異なる抗原結合ドメインを標的とするCARを含む異なるCARサブプールを生み出すことができる。他の実施可能形態では、CAR-T細胞をそれらの標的細胞株に曝露し、その後、フローサイトメトリーによって決定される細胞内IFNγの程度に基づいて異なる組に選別する。低IFNγ集団対高IFNγ集団における異なるCARの頻度を次世代シーケンシングによって決定し、対照CAR-T細胞集団、すなわち、標的細胞株に曝露されていないか、またはCARの標的を発現しない細胞株に曝露されるCAR-T細胞におけるそれらの頻度に正規化する。この分析から、異なるIFNγ産生レベルに関連するCARを決定することができる。同様のアプローチを使用して、より低い疲弊マーカーの発現、より低い末端分化マーカーの発現、および/またはより高い細胞毒性マーカーの発現を含むが、これらに限定されない所望の特性または特質のうちのいずれかまたはそれらの組み合わせを有するCARをスクリーニングおよび選択することができる。
共刺激を提供するためのNEMO-突然変異体の使用
マウスNEMO-K270A(配列番号992)は、NF-κBを構成的に活性化することで知られている。T細胞に共刺激を提供するこの突然変異体の能力を実証するために、CD3陽性T細胞を、10ng/mLの可溶性抗CD3、10ng/mLの可溶性抗CD28、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中で培養した。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養し、1日後、EGFPを発現するレンチウイルスベクター(pLENTI-EGFP-Blasticidin)、およびマウスNEMO-K270A突然変異体(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-ブラストサイジンおよびpLENTI-mNEMO-K270A-HA-ブラストサイジン)またはマウスNEMO-wt(pLENTI-mNEMO-FLAG-ブラストサイジン)を発現するレンチウイルスベクターに感染させた。mNEMO-K270AおよびmNEMO-wtの配列を、それぞれ、配列番号992および991に提供する。感染のおよそ1日後、細胞をブラストサイジンで選択し、細胞の数を定期的に計算した。マウスNEMO-K270A突然変異体(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-ブラストサイジンおよびpLENTI-mNEMO-K270A-HA-ブラストサイジン)をコードするレンチウイルスに感染したT細胞は、EGFPまたはマウスNEMO-wt(pLENTI-mNEMO-FLAG-ブラストサイジン)をコードするレンチウイルスに感染したT細胞と比較して、より活発に増殖することが示された。
マウスNEMO-K270A(配列番号992)は、NF-κBを構成的に活性化することで知られている。T細胞に共刺激を提供するこの突然変異体の能力を実証するために、CD3陽性T細胞を、10ng/mLの可溶性抗CD3、10ng/mLの可溶性抗CD28、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中で培養した。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養し、1日後、EGFPを発現するレンチウイルスベクター(pLENTI-EGFP-Blasticidin)、およびマウスNEMO-K270A突然変異体(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-ブラストサイジンおよびpLENTI-mNEMO-K270A-HA-ブラストサイジン)またはマウスNEMO-wt(pLENTI-mNEMO-FLAG-ブラストサイジン)を発現するレンチウイルスベクターに感染させた。mNEMO-K270AおよびmNEMO-wtの配列を、それぞれ、配列番号992および991に提供する。感染のおよそ1日後、細胞をブラストサイジンで選択し、細胞の数を定期的に計算した。マウスNEMO-K270A突然変異体(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-ブラストサイジンおよびpLENTI-mNEMO-K270A-HA-ブラストサイジン)をコードするレンチウイルスに感染したT細胞は、EGFPまたはマウスNEMO-wt(pLENTI-mNEMO-FLAG-ブラストサイジン)をコードするレンチウイルスに感染したT細胞と比較して、より活発に増殖することが示された。
ヒトNEMOは、もはやマウスNEMOではなく、ヒトNEMO-K277A(hNEMO-K277A、配列番号979)突然変異体は、マウスNEMO-K270A(mNEMO-K270A)突然変異体に相当するhNEMO-K277A突然変異体がNF-κBも活性化するかを試験するために、この突然変異体をコードする発現ベクター(pCDNA3)を生成した。加えて、アミノ酸残基277のLys(K)を異なるアミノ酸残基(例えば、K277Q、K277T、K277I、K277N、K277S、K277M、K277G、K277R)に置き換えたhNEMOのいくつかの他の突然変異体をコードする発現構築物を生成した。異なる構築物をNF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物およびRSV-LacZ(正規化対照)レポーター構築物とともに293FT細胞にトランスフェクトし、前述のアッセイを使用してNF-κBを活性化するそれらの能力について試験した。図3は、mNEMO-K270A突然変異体およびhNEMO-K277A突然変異体によるNF-κBの強い活性化、ならびにhNEMO-K277I突然変異体およびhNEMO-K277G突然変異体による弱い活性化を示す。同様の実験において、hNEMO-K277L突然変異体およびhNEMO-K277A-DeltaV249-K255突然変異体も、293FT細胞にトランスフェクトしたときにNF-κB活性化を示した。hNEMO-K277A-DeltaV249-K255突然変異体は、ヒトNEMOのアミノ酸残基V249~K255を欠き、K277A突然変異も有する。これらの結果は、NEMOの構成的活性突然変異体がマウスNEMOのK270残基およびヒトNEMOのK277残基を突然変異させることによって迅速に生成および特定され得ることを示唆する。同様のアプローチを使用して、NF-κBを活性化する能力を有する他のNEMO残基に突然変異体を生成することができる。
FMC63ベースのCD19 CAR。N末端FKBPx2二量体化因子ドメインと融合した全長hNEMO-K277AまたはhNEMO-L753突然変異体(アミノ酸1~251をコードする)と共発現するCAR構築物を生成した。構築物をNF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物およびRSV-LacZレポーター構築物とともに293FT細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ8時間後、細胞を未処理のまま放置したか、またはAP20187(100nM)で処理した。およそ72時間後、細胞溶解物を調製し、前述のようにNF-κBルシフェラーゼおよびLacZ活性について分析した。NF-κB-Luc活性をLacZ活性に正規化して、トランスフェクション効率の差を制御した。結果は、AP20187での処理により、FKBPx2-hNEMO-K277A突然変異体(配列番号1006)およびFKBPx2-hNEMO-L753(配列番号1007)突然変異体の両方を共発現する構築物をコードするCARでトランスフェクトした293FT細胞におけるNF-κB活性の増加がもたらされたことを示した。これらの結果は、二量体化因子ドメインと融合した全長NEMOまたはその欠失突然変異体の共発現、その後、二量体化因子の付加によってCARまたはTCRまたはキメラTCR構築物においてNF-κBを誘導的様式で活性化する能力を実証する。
J-N-G細胞を、FKBPx2-hNEMO-K277AまたはFKBPx2-hNEMO-L753を共発現するCD19指向性FMC63ベースの第一世代CARに感染させる。細胞をAP20187化合物の存在下および不在下でRAJI標的細胞と共培養し、これらの細胞がEGFP発現を誘導することが示され、FKBPx2-hNEMO-K277AまたはFKBPx2-hNEMO-L753がCARとその活性を妨害することなく共発現され得ることを示す。
NEMOに加えて、いくつかの他の細胞タンパク質がNF-κBを構成的に活性化することで知られており、これらの細胞タンパク質を本発明の代替実施形態で使用して、養子細胞療法の目的のためにT細胞に共刺激を提供することができる。例示的なタンパク質としては、TCL-1A(配列番号1005)、ならびに構成的活性突然変異体IKKα/IKK1(IKK1-S176E-S180E、配列番号1004)、IKKβ/IKK2(IKK2-S177E-S181E、配列番号1002)、およびMYD88-L265P(配列番号1000)が挙げられる。ある実施形態実施形態では、これらのタンパク質は、二量体化因子ドメインなしで発現して、養子細胞療法の目的のためにT細胞に構成的共刺激を提供する。これらのタンパク質を、任意のベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、AAV、もしくはSleeping Beautyトランスポゾンベクター)、または当該技術分野で既知の非ベクター(DNAまたはRNAトランスフェクション)遺伝子送達方法を使用してT細胞に発現させることができる。あるいは、これらのタンパク質を、当該技術分野で既知の遺伝子改変技法(例えば、Cas9、Talon、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ)を使用してそれらのゲノムコピーを改変することによって発現させることができる。例示的な実施形態では、hNEMOの1つ以上のゲノムコピーを、当該技術分野で既知の技法を使用したT細胞における相同組換えを使用してhNEMO-K277Aに突然変異させる。
これらの共刺激タンパク質の発現を、Tet誘導性プロモーターまたはRheoGene系等の当該技術分野で既知の誘導性プロモーターを使用してそれらを発現させることによって制御することができる。ある実施形態では、hNEMO-K277A突然変異体およびhNEMO-K277A-DeltaV249-K255をpSLIK-Tet-Onベクターにクローン化し(Gopalakrishnan et al,Clinical Cancer Res;19(18),2013)、結果として生じたウイルスをT細胞の感染のために使用する。T細胞のドキシサイクリンでの処理がhNEMO-K277AおよびhNEMO-K277A-DeltaV249-K255発現ならびにNF-κB活性誘導することが示される。NF-κB活性を、AlexaFlourコンジュゲートPhospho-IκBα抗体およびフローサイトメトリーによって測定する。
本発明の代替実施形態では、他のNF-κB活性化タンパク質またはそれらのシグナル伝達ドメイン(例えば、IKK1、IKK2、RIP等)を、二量体化因子ドメインとの融合として発現させて、T細胞に共刺激を誘導的様式で提供する。本発明のこれらの構成的または誘導的NF-κB活性化タンパク質が他の免疫細胞(NF-κB活性化がそれらの機能を増強することで知られている細胞、例えば、NK細胞、樹状細胞、抗原提示細胞等)に共刺激を提供することができるため、これらの使用は、T細胞に共刺激を提供することに限定されない。NF-κBがアポトーシスから保護し、かつ細胞生存を促進することで知られているため、これらの構成的および誘導的NF-κB活性化タンパク質を細胞操作に使用して、生物学的製品の製造に使用される細胞の生存を増強することもできる。例示的な実施形態では、ハイブリドーマ細胞を、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255(配列番号7769)、K13、IKKα/IKK1(IKK1-SS/EE、配列番号1004)、IKKβ/IKK2(IKK2-S177E-S181E、配列番号1002)、またはMYD88-L265P(配列番号1000)を構成的に発現するように操作して、それらの増殖および高細胞密度で成長する能力を増強する。
T細胞養子細胞療法のためのNF-κB活性化因子
バフィーコート細胞をBlood Bankの健常な匿名成人ドナーから入手し、それらを使用して末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll-Hypaque勾配遠心分離によって単離する。T細胞を、CD3マイクロビーズ(Miltenyi)を使用して単離し、CD3/CD28 Dynabeadsおよび50IU/mLの組換えIL2を補充したXVIVO15培地中で培養する。あるいは、T細胞を、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中に再懸濁する。
バフィーコート細胞をBlood Bankの健常な匿名成人ドナーから入手し、それらを使用して末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll-Hypaque勾配遠心分離によって単離する。T細胞を、CD3マイクロビーズ(Miltenyi)を使用して単離し、CD3/CD28 Dynabeadsおよび50IU/mLの組換えIL2を補充したXVIVO15培地中で培養する。あるいは、T細胞を、10ng/mLのCD3抗体、10ng/mLのCD28抗体、および100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)中に再懸濁する。
翌日、T細胞を、pCCL3-MND3骨格におけるCD19標的CAR(次世代CARを含む)をコードするレンチウイルスベクターに感染させる。CARの核酸配列を、配列番号1016~1029、1318~1331、1594~1604、1900~1913、2206~2219、2512~2525、2818~2831、3124~3127、3324~3327に示す。加えて、T細胞を、上記の構築物に相当するが、hNEMO-K277Aモジュールを欠くCAR構築物に感染させる。各感染について、1800万個のT細胞を、6ウェルプレート内での32℃で90分間の2800rpmでのスピン感染によって、500μLの異なるCAR構築物をコードする濃縮ウイルスおよび8μg/mLのポリブレンに感染させる。プレートを37℃で6時間インキュベートする。細胞を収集し、遠心分離してウイルスおよびポリブレンを除去し、新鮮な培養培地中に再懸濁し、37℃で一晩培養する。
翌日、スピン感染を繰り返し、細胞を、CD3/CD28 Dynabeads、50IU/mLのIL2、および5%FBSを補充したXVIVO15培地を有するT-75細胞培養フラスコに移す。
拡大の4日後、CAR-T細胞を、タンパク質L染色、CD19結合、サイトカイン産生(IL2、IFNγ、TNFa)、および細胞毒性(Matadorアッセイ)を使用してCAR発現について確認する。
拡大の10日後、CAR/SIR-T細胞をインビボ実験に使用する。この目的のために、NSGマウスに106Nalm-6-Luc細胞を尾静脈注射によって注射する。2日後、3×106CAR/SIR-T細胞を注射する。マウスをD-ルシフェリンの投与後に生物発光画像化法によって毎週画像化し、生存について追跡する。
第一世代CARをhNEMO-K277A(配列番号1594-1604)とともに発現するT細胞が、BBz共刺激ドメインを有する第二世代CAR(配列番号1594~1604)を発現するT細胞と比較して、RAJI細胞に曝露したときに、ELISAによって測定される優れたIL2産生を示すことに留意されたい。加えて、第一世代CARをhNEMO-K277A(配列番号1594-1604)とともに発現するT細胞は、BBz共刺激ドメインを有する第二世代CAR(配列番号1594~1604)を発現するT細胞と比較して、RAJI細胞と3週間にわたって共培養したときに、細胞増殖、サイトカイン(IL2、IFNγ、TNFα)産生、疲弊マーカーの発現(例えば、PD1)、および細胞毒性(Matador細胞毒性アッセイ)によって測定されるより低い疲弊兆候を示す。最後に、第一世代CARをhNEMO-K277A(配列番号1594~1604)とともに発現するT細胞は、NALM-6-Luc細胞を異種移植したNSGマウスに投与したときに、インビボでのT細胞拡大および持続性、腫瘍成長の低減、ならびに改善された生存によって決定される優れたインビボ活性を示す。第一世代CARをhNEMO-K277A(骨格2、配列番号1594~1604)とともに発現するT細胞は、概して、第一世代CARを発現し、かつvFLIP K13(すなわち、骨格1、配列番号1016~1029)を共発現するT細胞と比較して、RAJI細胞に曝露したときに、サイトカイン(例えば、IL2、IFNγ、およびTNFα)のより弱い産生を示す。
hNEMO-K277Aを発現する配列番号1900~1913、2206~2219、2512~2525、2818~2831、3124~3127、3324~3327に対応するCAR構築物を発現するT細胞は、同様であるが、hNEMO-K277Aモジュールを欠く構築物を発現するT細胞と比較して、優れたインビトロおよびインビボ活性を示す。hNEMO-K277Aモジュールの共発現がCD20を標的とするSIR(配列番号9683)を発現するT細胞のインビトロおよびインビボ性能を改善することも示される。これらの結果は、hNEMO-K277Aアクセサリーモジュールの共発現が、第一世代CAR構築物のみならず、TFP、Ab-TCR、およびSIRのインビトロ活性(例えば、増殖、サイトカイン産生、疲弊の遅延)およびインビボ活性(例えば、改善されたT細胞の拡大および抗腫瘍活性)も増強することを実証する。
同じ骨格を有するが、異なる抗原結合ドメインを有する異なる構築物間の相違にも留意されたい。したがって、hNEMO-K277A(すなわち、骨格2)を共発現する第一世代CAR構築物のうち、4G7(例えば、配列番号1599)、huBly3(例えば、配列番号1604)、およびhuSJ25C1(例えば、配列番号1605)scFVに由来する抗原結合ドメインを有する構築物は、FMC63(例えば、配列番号1594)、hu-FMC63-11(例えば、配列番号1595)、huFMC63-11-N203Q(例えば、配列番号1596)、Bu12(例えば、配列番号1597)、CD19-MOR0028(例えば、配列番号1602)、およびCD19-hu-mROO5(例えば、配列番号1607)に基づくscFvに由来する抗原結合ドメインを有する構築物と比較して、概ね弱い。同様の傾向が、CARの抗原結合ドメインの性質に基づく他の骨格でのCARのインビトロおよびインビボ活性で観察される。
前述の実験では、hNEMO-K277Aモジュールを単一のベクターを使用してT細胞にCARモジュールと共発現させる。2つの別個のレンチウイルスベクターを使用して2つのモジュールを発現させる実験を繰り返す。hNEMO-K277Aモジュールを欠く例示的なCD20 CARをコードする核酸構築物の配列番号は、配列番号9668に提示される。T細胞を2つのレンチウイルスベクターに5の感染多重度で共感染させ、2つのベクターの比率(すなわち、CAR:hNEMO-K277A)は、1:1~1:10である。T細胞を拡大させ、インビトロおよびインビボアッセイにおいて試験する。hNEMO-K277AのCAR構築物との共発現が、IL2産生、細胞増殖、疲弊の欠如、インビボ拡大、および抗腫瘍活性についてのアッセイによって決定される、CAR-T細胞のインビトロおよびインビボ性能を改善することが示される。
代替実施形態では、当該技術分野で既知の遺伝子編集技法(例えば、CRISP/Cas9、TALON、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ等)を使用した相同組換えを使用して、T細胞における内在性ヒトNEMO遺伝子の一方または両方でのK277A突然変異を誘導する。その後、hNEMO-K277A突然変異を有する結果として生じたT細胞を、CD19を標的とするCAR構築物およびNY-ESO-1を標的とするTCR構築物の発現を含む養子細胞療法に使用する。hNEMO-K277A突然変異を有するT細胞が、hNEMO-K277A突然変異を欠く対照T細胞と比較して、増強された増殖、サイトカイン産生、拡大、インビボでの長期持続性、および抗腫瘍活性を示すことが示される。
hNEMO-K277Aアクセサリーモジュールを、FKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(配列番号1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(配列番号1007)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(配列番号1008)、IKK2-デルタ-SCD-FKBPv36x2(配列番号7782)、IKK1-デルタ-SCD-FKBPv36x2(配列番号7781)、およびFKBPx2-RIP-ID(配列番号1009)をコードするアクセサリーモジュールに置き換えたCAR構築物を使用することによって、前段落に記載の実験を繰り返す。CARおよびこれらのアクセサリーモジュールを発現するT細胞を、二量体化因子AP20187(100nM)の不在下および存在下でのインビトロアッセイを使用して試験する。AP20187の付加により、標的抗原(すなわち、CD19)を発現するRAJI細胞に曝露したときに、FKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(配列番号1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(配列番号1007)、IKK2-デルタ-SCD-FKBPv36x2(配列番号7782)、IKK1-デルタ-SCD-FKBPv36x2(配列番号7781)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(配列番号1008)、およびFKBPx2-RIP-ID(配列番号1009)モジュールを発現するCAR-T細胞による増殖およびサイトカイン産生が誘導されることが示される。インビボ実験では、NSGマウス(1群当たりn=12)に200万個のRAJI-Luc細胞を尾静脈注射によって異種移植し、3日後、CD19-CARを発現し、かつFKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(配列番号1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(配列番号1007)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(配列番号1008)、およびFKBPx2-RIP-ID(配列番号1009)モジュールを共発現するT細胞を500万個投与する。各群のマウスの半数(n=6)に、以前に説明されているように(Chinnery et al,J Immunol 2009;182:2738-2744)、40μgのAP20187を腹腔内注射によって10日間毎日投与する。AP20187投与により、CAR-T細胞の拡大が促進されることが示される。代替実施形態では、この実験を、両方のFKBPドメインが脂質透過性二量体化リガンドRimiducidに高親和性で結合するFKBP12V36突然変異を有する構築物を使用して繰り返す。融合タンパク質の二量体化は、Rimiducidの投与によってもたらされる。インビトロ実験の場合、Rimiducidを10~100nMの最終濃度で使用する。NSGマウスにおけるインビボ研究の場合、Rimiducidを5mg/kgで腹腔内(i.p)注射により毎週投与する。
hNEMO-K277Aアクセサリーモジュールを、hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MYD88-L265P、TCL-1A、およびMTCP-1をコードするアクセサリーモジュールに置き換えた構築物を使用することによって、前段落に記載の実験を繰り返す。hNEMO-K277A-DeltaV249-K255、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MYD88-L265Pアクセサリーモジュールを発現するCAR-T細胞が、これらのアクセサリーモジュールを欠くCAR-T細胞と比較して、増加したサイトカイン産生、増殖、インビボ拡大、および抗腫瘍活性を示すことが示される。TCL-1AおよびMTCP-1アクセサリーモジュールを発現するCAR-T細胞が増加した増殖応答を有することが示される。
ワクチン接種におけるヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eの使用
ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eを発現するレンチウイルスベクターを生成する。ニワトリオボアルブミンアミノ酸残基242~353およびRowe HM et al,Molecular Therapy,13,2,2006に記載されるバリアント鎖における主要組織適合性複合体(MHC)クラスIIのC末端(Ii-OVA)を発現するレンチウイルスベクターも生成する。最後に、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、またはIKK2-S177E-S181Eをコードするカセットを、Ii-OVAをコードするカセットと共発現するレンチウイルスベクターを生成し、これらの2つのカセットは、2A切断配列によって分離されている。
ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eを発現するレンチウイルスベクターを生成する。ニワトリオボアルブミンアミノ酸残基242~353およびRowe HM et al,Molecular Therapy,13,2,2006に記載されるバリアント鎖における主要組織適合性複合体(MHC)クラスIIのC末端(Ii-OVA)を発現するレンチウイルスベクターも生成する。最後に、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、またはIKK2-S177E-S181Eをコードするカセットを、Ii-OVAをコードするカセットと共発現するレンチウイルスベクターを生成し、これらの2つのカセットは、2A切断配列によって分離されている。
DCの形質導入およびフローサイトメトリー。マウス骨髄由来の樹状細胞(DC)を前述のように調製する。記載されるように(Rowe HM et al,Molecular Therapy,13,2,2006)、4日目に未熟DCに20のMOIでレンチウイルスベクターを形質導入し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含有する新鮮な培地(50ng/mL、Peprotech製)を4日毎に供給する。形質導入後5日目に、DCを採取し、洗浄し、Fc受容体を遮断した後、以下のビオチンコンジュゲート抗体:抗CD11c、抗CD86、および抗I-Ab(MHCクラスII)(全てBD Pharmingen製)、抗CD40(Serotec製)、ならびに抗CD80、抗ICAM-1、および抗Kb(MHCクラスI)(全てeBioscience製)で成熟マーカーについて表面染色する。ハムスターアイソタイプ対照抗体(ビオチンコンジュゲート)をBD Pharmingenから購入する。その後、抗体をストレプトアビジンRPE Cy-5 2o試薬(DakoCytomation)で標識した後、フローサイトメトリーを行う。リポ多糖類(LPS)(50ng/mL)(Sigma)を形質導入していないDCに添加し、成熟の陽性対照として一晩放置する。ザイモサンA(10μg/mL)処理物(37℃で30分間)をERK活性化の対照として使用する。
ELISA。培養上清を5×105細胞/ウェル(1.5mL中)でプレーティングした DCから採取する。IL-12p70および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)を、eBioscience製のキットを製造業者のガイドラインに従って使用して、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって検出する。
DCのリンパ節からの精製。C57/BL6マウス(Harlan)の尾の付け根に1×108感染単位(i.u.)のレンチベクターを皮下(s.c.)注射する。6日後、リンパ節(傍大動脈および鼠径部)を採取し(各群のマウス由来の細胞をプールした)、コラゲナーゼCLS-4(Worthington)とインキュベートし、潰して、単細胞懸濁液を得る。Fc受容体を遮断した後、MACSビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してCD11c陽性細胞を選択する。
五量体染色。1試料当たり100万個の脾細胞を10μLのフィコエリトリンコンジュゲートSIINFEKL/Kb五量体または四量体(Proimmune)と室温で12分間インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、ビオチンコンジュゲート抗CD8(Serotec)と氷上で15分間インキュベートした後、洗浄し、ストレプトアビジン-アロフィコシアニン(eBioscience)と15分間インキュベートする。試料を洗浄し、Cell-Questソフトウェア(BD Biosciences)を使用してBD LSR機上に得る。
細胞内サイトカイン染色。脾細胞をOVA257-264ペプチドありまたはなしで一晩インキュベートする。モネンシン溶液(eBiosciences、最終濃度2μM)を添加し、3時間放置した後、細胞をCD8について表面染色する。その後、細胞を固定し、BD Biosciences製のCytofix/Cytopermキットを使用して透過化する。その後、アロフィコシアニンコンジュゲート抗ガンマインターフェロン(抗IFN-γ)抗体(BD Pharmingen)を添加し、30分間放置した後、細胞を洗浄し、試料をBD LSR機にかける。
ELISPOTアッセイ。酵素結合免疫スポット(ELISPOT)プレート(Millipore)に、精製された抗IFN-γ(BD Pharmingen)を4℃で一晩コーティングする。クラスI OVA257-264ペプチド(Proimmune)ありまたはなしで、全脾細胞を三連で連続希釈して、エクスビボELISPOTアッセイを行う。プレートを一晩培養し、製造業者の指示に従って成長させる。AID ELISPOT計数器およびソフトウェアを使用してスポットを計数する。
腫瘍療法。EG7.OVA腫瘍細胞を、0.4mg/mLのG418(Invitrogen)を含有するRPMI中で成長させる。C57BL/6マウスに2×106腫瘍細胞をs.c.注射してフラスコに入れ、その後、ワクチン接種する。これらのマウスを、15mm超の直径に達した腫瘍を有した時点で屠殺する。
マウスBM由来の樹状細胞(DC)を、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eをコードするレンチベクターに単独でまたはIi-OVAと組み合わせてのいずれかで感染させる。ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eの発現により、細胞質p65のレベルがより高い未処理または対照ベクターDCではなく、LPS処理DCにおけるレベルと同様のレベルでDCの核におけるp65(RelA)の核転座がもたらされることが示される。増加した核NF-κB結合活性もヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eで形質導入されたDCにおいて検出されるが、核AP1結合活性によって決定されるMAPK経路の活性化に影響を及ぼさない。
BM由来のDCを、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eで形質導入した後、形質導入細胞または非形質導入細胞上の成熟マーカーを分析する。CD86、CD40、ICAM-1、およびCD80は、対照ベクター群における形質導入DCと比較して、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eを発現するDCにおいて上方調節される。さらに、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eで形質導入されたDCが、それらの上方調節されたCD86を培養下で数週間保持することが示される。IL-12p70およびTNF-αの分泌が、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eで形質導入されたDC培養下で上方調節されることが認められる。
レンチベクターをs.c.注射した後、形質導入されたDCが流入領域リンパ節内で検出される。同様のパーセンテージのリンパ節DC(CD11c+/MHCクラスII+)を、対照またはヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eベクターのいずれかをs.c.注射した後に形質導入する。しかしながら、対照ベクターを注入した動物と比較して、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eを注入した動物におけるDCにおいてCD86が上方調節される。
s.c.ワクチン接種後にマウスにおけるOva特異的CD8+T細胞応答を誘導する、ヒトNEMO-K277A-2A-Ii-OVA、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA、マウスNEMO-K270A-2A-Ii-OVA、IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA、およびIi-OVAをコードするベクターの能力を試験する。5×105i.u.のベクター用量を使用する。ヒトNEMO-K277A-2A-Ii-OVA、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA、マウスNEMO-K270A-2A-Ii-OVA、およびIKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVAをワクチン接種したマウスは、細胞内蛍光活性化細胞選別またはELISPOTアッセイによって測定される、SIINFEKL/Kb五量体陽性CD8+T細胞およびIFN-γ分泌CD8+T細胞を示す。
マウスに致死量のEG7.OVA腫瘍細胞を接種した後に、形質導入DCまたはヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eベクターのいずれかを直接ワクチン接種する。全てのマウスが腫瘍を発症することが示される。形質導入DC注射またはレンチベクター直接注射のいずれか後、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181E群における腫瘍のないマウスの数は、対照群における数よりも高い。NEMO-K277A-2A-Ii-OVA、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA、マウスNEMO-K270A-2A-Ii-OVA、IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVAベクターの有効性を、L.donovani発現オボアルブミンを使用して寄生虫保護モデル(Polley R et al,Infect.Immun.74:773-776,2016)において試験する。
ワクチン接種におけるヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eの使用
単一白血球除去療法において収集した抗原提示細胞に、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eをコードするアデノウイルスベクターを形質導入し、その後、ヒト前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインを含むタンパク質PA001とインキュベートする。1以下の前化学療法レジメン後の進行性mCRPCを有する男性を登録して、2~4週間毎に皮内投与した結果として生じたワクチンの3つの用量(4×106、12.5×106、および25×106細胞)を評価する。用量制限毒性はない。免疫上方調節、ならびに抗腫瘍活性が、PSA減少で観察される。
単一白血球除去療法において収集した抗原提示細胞に、ヒトNEMO-K277A、ヒトNEMO-K277A-deltaV249-K255、マウスNEMO-K270A、およびIKK2-S177E-S181Eをコードするアデノウイルスベクターを形質導入し、その後、ヒト前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインを含むタンパク質PA001とインキュベートする。1以下の前化学療法レジメン後の進行性mCRPCを有する男性を登録して、2~4週間毎に皮内投与した結果として生じたワクチンの3つの用量(4×106、12.5×106、および25×106細胞)を評価する。用量制限毒性はない。免疫上方調節、ならびに抗腫瘍活性が、PSA減少で観察される。
161抗体に由来するscFv断片に基づくヒト化MPL CARの構築および試験
マウスモノクローナル抗体161は、ヒトMPL(トロンボポエチン受容体TPO-R)を標的とする。MPLを標的とするが、免疫原性が低下したCARを生成するために、マウス161抗体の抗原結合ドメインを含むscFV断片の配列をヒト化した。hu-161-2と指定されるヒト化161scFv断片(配列番号891)を、41BB共刺激ドメインおよびCD3z活性化ドメインを含む第二世代CAR骨格(配列番号1582)においてクローン化した。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、ヒト化MPL-hu-161-2 CAR構築物をコードするレンチウイルスを安定的に形質導入した。その後、親JurkatおよびCAR発現JurkatをHEL細胞と共培養し、4時間後にEGFP発現の誘導をFACS分析によって監視した。MPL-hu-161-2 CAR構築物を発現するJurkat細胞のHEL細胞との共培養により、HEL細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされ、標的抗原を認識し、かつシグナル伝達を活性化するヒト化MPL-hu-161-2 CAR構築物の能力を示す。この実験を、hu-161-2 scFVを組み込み、かつvFLIP K13(配列番号1286)またはhNEMO-K277A突然変異体(配列番号1878)のいずれかを共発現する第一世代CARで繰り返したときに、本質的に同様の結果が得られる。
マウスモノクローナル抗体161は、ヒトMPL(トロンボポエチン受容体TPO-R)を標的とする。MPLを標的とするが、免疫原性が低下したCARを生成するために、マウス161抗体の抗原結合ドメインを含むscFV断片の配列をヒト化した。hu-161-2と指定されるヒト化161scFv断片(配列番号891)を、41BB共刺激ドメインおよびCD3z活性化ドメインを含む第二世代CAR骨格(配列番号1582)においてクローン化した。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、ヒト化MPL-hu-161-2 CAR構築物をコードするレンチウイルスを安定的に形質導入した。その後、親JurkatおよびCAR発現JurkatをHEL細胞と共培養し、4時間後にEGFP発現の誘導をFACS分析によって監視した。MPL-hu-161-2 CAR構築物を発現するJurkat細胞のHEL細胞との共培養により、HEL細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされ、標的抗原を認識し、かつシグナル伝達を活性化するヒト化MPL-hu-161-2 CAR構築物の能力を示す。この実験を、hu-161-2 scFVを組み込み、かつvFLIP K13(配列番号1286)またはhNEMO-K277A突然変異体(配列番号1878)のいずれかを共発現する第一世代CARで繰り返したときに、本質的に同様の結果が得られる。
175および111抗体に由来するscFv断片に基づくヒト化MPL CARの構築および試験
マウスモノクローナル175および111は、ヒトMPLにも結合する。したがって、これらの抗体の抗原結合ドメインを含むscFV断片の配列をヒト化し、これを使用して、対応する第二世代CAR(CAR II)構築物(配列番号1583および1584)、ならびにvFLIP K13(配列番号1287、1288)およびhNEMO-K277A(配列番号1896および1897)を共発現する骨格1および骨格2を作製する。この実験を前実施例にあるように繰り返す。MPL-hu-175-2およびhu-111-2 CAR構築物を発現するJurkat細胞のHEL細胞との共培養により、HEL細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされ、標的抗原を認識し、かつシグナル伝達を活性化するヒト化MPL-hu-175-2およびhu-111-2 CAR構築物の能力を示す。
マウスモノクローナル175および111は、ヒトMPLにも結合する。したがって、これらの抗体の抗原結合ドメインを含むscFV断片の配列をヒト化し、これを使用して、対応する第二世代CAR(CAR II)構築物(配列番号1583および1584)、ならびにvFLIP K13(配列番号1287、1288)およびhNEMO-K277A(配列番号1896および1897)を共発現する骨格1および骨格2を作製する。この実験を前実施例にあるように繰り返す。MPL-hu-175-2およびhu-111-2 CAR構築物を発現するJurkat細胞のHEL細胞との共培養により、HEL細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされ、標的抗原を認識し、かつシグナル伝達を活性化するヒト化MPL-hu-175-2およびhu-111-2 CAR構築物の能力を示す。
CD70を標的とするCARの構築および試験
CD70を標的とするいくつかの構築物を構築する(配列番号9781~10086、および7783~7789)。これらの構築物をJ-N-G細胞およびT細胞に発現させ、インビトロおよびインビボアッセイを使用してCD70発現標的細胞株RAJIおよびTHP-1に対するT細胞活性化および細胞毒性について試験する。
CD70を標的とするいくつかの構築物を構築する(配列番号9781~10086、および7783~7789)。これらの構築物をJ-N-G細胞およびT細胞に発現させ、インビトロおよびインビボアッセイを使用してCD70発現標的細胞株RAJIおよびTHP-1に対するT細胞活性化および細胞毒性について試験する。
CD70、PTK7、カッパ軽鎖、Claudin18A2、Ras/HLA-A2複合体、NY-ESO/HLA-A2複合体、Streptag、および白血病細胞に発現したCD43エピトープを標的とするCARの構築および試験
第二世代骨格(例えば、従来のCAR II)またはvFLIP K13またはhNEMO-K277Aのいずれかを共発現する骨格1および骨格2のいずれかに、PTK7、カッパ軽鎖、Claudin18A2、Ras/HLA-A2複合体、NY-ESO/HLA-A2複合体、Streptag、および白血病細胞に発現したCD43エピトープを標的とするCAR構築物を生成する。この実験を前実施例にあるように繰り返す。異なるCAR構築物を発現するJurkat細胞のそれらのそれぞれの標的細胞との共培養により、標的細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされた。同様に、異なるCAR構築物を発現するT細胞のGLucを発現するそれらのそれぞれの標的細胞との共培養により、GLuc活性の増加によって測定される細胞死の増加がもたらされた。
第二世代骨格(例えば、従来のCAR II)またはvFLIP K13またはhNEMO-K277Aのいずれかを共発現する骨格1および骨格2のいずれかに、PTK7、カッパ軽鎖、Claudin18A2、Ras/HLA-A2複合体、NY-ESO/HLA-A2複合体、Streptag、および白血病細胞に発現したCD43エピトープを標的とするCAR構築物を生成する。この実験を前実施例にあるように繰り返す。異なるCAR構築物を発現するJurkat細胞のそれらのそれぞれの標的細胞との共培養により、標的細胞に曝露されなかった細胞と比較して増加したEGFP発現がもたらされた。同様に、異なるCAR構築物を発現するT細胞のGLucを発現するそれらのそれぞれの標的細胞との共培養により、GLuc活性の増加によって測定される細胞死の増加がもたらされた。
MPLを標的とするTFP
MPLを標的とするいくつかのTFPベースのCARを抗原結合ドメインとしてhu-161-2 scFVに基づいて構築する。これらのTFP CAR構築物の配列を、配列番号3526~3533に示す。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、MPLを標的とするTFP CARをコードするレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択する。MPLを標的とするTFP CARを発現するJ-N-G細胞が、HEL.92.1.7(HEL)細胞との4時間の共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。MPLを標的とするTFP CARを初代T細胞にも発現させ、4時間の共培養時にHEL-GLuc細胞の溶解を誘導するそれらの能力について試験する。175、111、hu-175-2、およびhu-111-2 scFv(配列番号10476~10483)に基づくMPL TFP CAR構築物を、hu-161-2に基づくTFP CARについて上述されるJ-N-G細胞および初代T細胞を使用して同様に構築し、試験する。J
MPLを標的とするいくつかのTFPベースのCARを抗原結合ドメインとしてhu-161-2 scFVに基づいて構築する。これらのTFP CAR構築物の配列を、配列番号3526~3533に示す。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、MPLを標的とするTFP CARをコードするレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択する。MPLを標的とするTFP CARを発現するJ-N-G細胞が、HEL.92.1.7(HEL)細胞との4時間の共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。MPLを標的とするTFP CARを初代T細胞にも発現させ、4時間の共培養時にHEL-GLuc細胞の溶解を誘導するそれらの能力について試験する。175、111、hu-175-2、およびhu-111-2 scFv(配列番号10476~10483)に基づくMPL TFP CAR構築物を、hu-161-2に基づくTFP CARについて上述されるJ-N-G細胞および初代T細胞を使用して同様に構築し、試験する。J
他の抗原を標的とするTFP
次に、いくつかの異なる抗原を標的とするTFP CARを構築する。共刺激を提供するために、これらの構築物は、hNEMO-K277Aも共発現する。これらの構築物をJ-N-G細胞および初代T細胞に発現させ、上述のアッセイを使用して、それらの標的抗原を発現する細胞を認識するそれらの能力について試験する。J-N-G細胞を発現するTFP CARが、それらの同族抗原を発現する標的細胞との共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。上述のGLucベースの細胞毒性アッセイを使用して、異なる抗原を標的とするこれらのTFP CARを発現するT細胞が、対応する抗原を発現する標的細胞の細胞毒性を誘導することが示される。表Aは、このアッセイで使用する異なる標的抗原を発現する標的細胞株を示す。異なる標的抗原を発現する追加の細胞株は当該技術分野で既知であるか、または当該技術分野で既知の技法によって所望の抗原を発現するように遺伝子操作することができる。上記の実施例では、TFP構築物は、共刺激を提供するためのhNEMO-K277A突然変異体を共発現するアクセサリーモジュールを含む。代替実施形態では、共刺激を提供するためのアクセサリーモジュールを欠くか、またはvFLIP K13等の他のタンパク質の共発現によって共刺激を提供するアクセサリーモジュールを含むかのいずれかのTFP構築物も構築する。この実験を、同様の結果を有するJ-N-G細胞および初代T細胞におけるTFP構築物の発現によって上述のように繰り返す。
次に、いくつかの異なる抗原を標的とするTFP CARを構築する。共刺激を提供するために、これらの構築物は、hNEMO-K277Aも共発現する。これらの構築物をJ-N-G細胞および初代T細胞に発現させ、上述のアッセイを使用して、それらの標的抗原を発現する細胞を認識するそれらの能力について試験する。J-N-G細胞を発現するTFP CARが、それらの同族抗原を発現する標的細胞との共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。上述のGLucベースの細胞毒性アッセイを使用して、異なる抗原を標的とするこれらのTFP CARを発現するT細胞が、対応する抗原を発現する標的細胞の細胞毒性を誘導することが示される。表Aは、このアッセイで使用する異なる標的抗原を発現する標的細胞株を示す。異なる標的抗原を発現する追加の細胞株は当該技術分野で既知であるか、または当該技術分野で既知の技法によって所望の抗原を発現するように遺伝子操作することができる。上記の実施例では、TFP構築物は、共刺激を提供するためのhNEMO-K277A突然変異体を共発現するアクセサリーモジュールを含む。代替実施形態では、共刺激を提供するためのアクセサリーモジュールを欠くか、またはvFLIP K13等の他のタンパク質の共発現によって共刺激を提供するアクセサリーモジュールを含むかのいずれかのTFP構築物も構築する。この実験を、同様の結果を有するJ-N-G細胞および初代T細胞におけるTFP構築物の発現によって上述のように繰り返す。
MPLを標的とするAb-TCR
MPLを標的とするいくつかのAb-TCRを抗原結合ドメインとしてマウス161 scFVに基づいて構築する。TCRαおよびTCRβベースのAb-TCRの発現を改善するために、特異的突然変異をそれらのTCR受容体モジュールに導入する。TCRγ/TCRd、野生型TCRα/TCRβ(wt-op2とラベル付けされる)、および突然変異体TCRα/TCRβ(SDVP-IAHとラベル付けされる)を含むAb-TCR構築物の配列を、配列番号959~964に示す。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、MPLを標的とするAb-TCR(配列番号2091、2397、2703)をコードするレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択する。MPLを標的とするAb-TCRを発現するJ-N-G細胞が、HEL細胞との4時間の共培養時にEGFP発現を誘導することが示され、MPLを認識し、かつシグナル伝達を活性化するMPLを標的とするAb-TCRの能力を示す。MPLを標的とするAb-TCRを初代T細胞にも発現させ、4時間の共培養時にHEL-GLuc細胞の溶解を誘導するそれらの能力について試験する。MPL Ab-TCRを発現するT細胞が、GLuc活性の増加によって測定される、HEL-GLuc細胞の溶解を誘導することが示される。マウス175および111 scFv(配列番号10492~10493)に基づくMPL Ab-TCR構築物を、161に基づくAb-TCRについて上述されるJ-N-G細胞および初代T細胞を使用して同様に構築し、試験する。
MPLを標的とするいくつかのAb-TCRを抗原結合ドメインとしてマウス161 scFVに基づいて構築する。TCRαおよびTCRβベースのAb-TCRの発現を改善するために、特異的突然変異をそれらのTCR受容体モジュールに導入する。TCRγ/TCRd、野生型TCRα/TCRβ(wt-op2とラベル付けされる)、および突然変異体TCRα/TCRβ(SDVP-IAHとラベル付けされる)を含むAb-TCR構築物の配列を、配列番号959~964に示す。Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)細胞に、MPLを標的とするAb-TCR(配列番号2091、2397、2703)をコードするレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択する。MPLを標的とするAb-TCRを発現するJ-N-G細胞が、HEL細胞との4時間の共培養時にEGFP発現を誘導することが示され、MPLを認識し、かつシグナル伝達を活性化するMPLを標的とするAb-TCRの能力を示す。MPLを標的とするAb-TCRを初代T細胞にも発現させ、4時間の共培養時にHEL-GLuc細胞の溶解を誘導するそれらの能力について試験する。MPL Ab-TCRを発現するT細胞が、GLuc活性の増加によって測定される、HEL-GLuc細胞の溶解を誘導することが示される。マウス175および111 scFv(配列番号10492~10493)に基づくMPL Ab-TCR構築物を、161に基づくAb-TCRについて上述されるJ-N-G細胞および初代T細胞を使用して同様に構築し、試験する。
他の抗原を標的とするAb-TCR
次に、いくつかの異なる抗原を標的とするAb-TCRを構築する。共刺激を提供するために、これらの構築物は、hNEMO-K277Aも共発現する。これらの構築物をJ-N-G細胞および初代T細胞に発現させ、上述のアッセイを使用してそれらの標的抗原を発現する細胞を認識するそれらの能力について試験する。J-N-G細胞を発現するAb-TCRが、それらの同族抗原を発現する標的細胞との共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。上述のGLucベースの細胞毒性アッセイを使用して、異なる抗原を標的するこれらのAb-TCRを発現するT細胞が、対応する抗原を発現する標的細胞の細胞毒性を誘導することが示される。表Aは、このアッセイで使用する異なる標的抗原を発現する標的細胞株を示す。異なる標的抗原を発現する追加の細胞株は当該技術分野で既知であるか、または当該技術分野で既知の技法によって所望の抗原を発現するように遺伝子操作することができる。上記の実施例では、Ab-TCR構築物は、共刺激を提供するためのhNEMO-K277A突然変異体を共発現するアクセサリーモジュールを含む。代替実施形態では、共刺激を提供するためのアクセサリーモジュールを欠くか、またはvFLIP K13等の他のタンパク質の共発現によって共刺激を提供するアクセサリーモジュールを含むかのいずれかのAb-TCR構築物も構築する。この実験を、同様の結果を有するJ-N-G細胞および初代T細胞におけるAb-TCR構築物の発現によって上述のように繰り返す。
次に、いくつかの異なる抗原を標的とするAb-TCRを構築する。共刺激を提供するために、これらの構築物は、hNEMO-K277Aも共発現する。これらの構築物をJ-N-G細胞および初代T細胞に発現させ、上述のアッセイを使用してそれらの標的抗原を発現する細胞を認識するそれらの能力について試験する。J-N-G細胞を発現するAb-TCRが、それらの同族抗原を発現する標的細胞との共培養時にEGFP発現を誘導することが示される。上述のGLucベースの細胞毒性アッセイを使用して、異なる抗原を標的するこれらのAb-TCRを発現するT細胞が、対応する抗原を発現する標的細胞の細胞毒性を誘導することが示される。表Aは、このアッセイで使用する異なる標的抗原を発現する標的細胞株を示す。異なる標的抗原を発現する追加の細胞株は当該技術分野で既知であるか、または当該技術分野で既知の技法によって所望の抗原を発現するように遺伝子操作することができる。上記の実施例では、Ab-TCR構築物は、共刺激を提供するためのhNEMO-K277A突然変異体を共発現するアクセサリーモジュールを含む。代替実施形態では、共刺激を提供するためのアクセサリーモジュールを欠くか、またはvFLIP K13等の他のタンパク質の共発現によって共刺激を提供するアクセサリーモジュールを含むかのいずれかのAb-TCR構築物も構築する。この実験を、同様の結果を有するJ-N-G細胞および初代T細胞におけるAb-TCR構築物の発現によって上述のように繰り返す。
HIV-1に感染した標的細胞に応答した形質導入CD8+Tリンパ球のCAR媒介増殖のフローサイトメトリー
HIV1エンベロープ糖タンパク質を標的とするいくつかのCARを生成し、配列番号8704~9349によって表す。以下のアッセイを使用して、それらのインビトロでの抗HIV1活性を試験する。これらの活性構築物を、HIV1およびAIDSを有する患者の治療のために単独で組み合わせで使用する。
HIV1エンベロープ糖タンパク質を標的とするいくつかのCARを生成し、配列番号8704~9349によって表す。以下のアッセイを使用して、それらのインビトロでの抗HIV1活性を試験する。これらの活性構築物を、HIV1およびAIDSを有する患者の治療のために単独で組み合わせで使用する。
プロセシング関連トランスポーター(TAP)の欠失のためMHCクラスI低であり(Salter,et al.(1986)EMBO J 5:943-949)、かつHIV-1特異的CARに好適な標的細胞であることが以前に示されている(Severino,et al.(2003)Virology 306:371-375)HIV-1に感染したT2細胞は、標的細胞の役割を果たす。これらを、vpr遺伝子座におけるマウスCD24(mCD24)遺伝子を有する過度のHIV-1 NL4-3ベースのレポーターウイルスに感染させて(Ali,et al.(2003)J Virol Methods 110:137-142)、以前に説明されているように(Bennett,et al.(2007)J Virol 81:4973-4980、Yang,et al.(1996)J Virol 70:5799-5806、およびYang,et al.(1997)J Virol 71:3120-3128)、感染の3日または4日後までに90%超の感染細胞を得る。これらを、セシウム照射器内で使用直前に10,000ラドで照射し、健常なドナー由来の末梢血単核細胞を3,000ラドで照射する(フィーダーPBMC)。HIV1-CARを形質導入した初代CD8+Tリンパ球を、製造業者(ThermoFisher Scientific,Grand Island,NY)の指示に従ってCellTrace Violetで標識し、洗浄する。48ウェルプレートのウェル内に、5×105個の標識した形質導入細胞を5×105個の照射した感染T2細胞および2×106個の照射したフィーダーPBMCに添加し、1mLのR10-50中で5日間培養し、培地を3日後に取り替える。その後、ヒトCD8(PerCP-抗ヒトCD8、カタログ番号30130、Biolegend,San Diego,CA)で共染色してフローサイトメトリー(LSR Fortessa II cytometer,BD Biosciences)を行い、FlowJoソフトウェア(FlowJo,Ashland,OR)を使用して増殖の分析を行う。HIV1-CAR形質導入T細胞が、HIV-1に感染したT2細胞に曝露されたときに増殖することが示される。
ウイルス抑制アッセイ
HIV-1の複製を抑制するHIV1-CAR形質導入CD8+Tリンパ球ならびにその拡大および富化されたクローンの能力を、以前に説明されているように(Yang,et al.(1997)PNAS USA 94:11478-11483、およびYang,et al.(1997)J Virol 71:3120-3128)試験する。94US_3393 IN(カタログ番号11250)、90JJS873(カタログ番号11251)、96TH_NP1538(カタログ番号11252)、00TZ_A246(カタログ番号11256)等の試験するHIV-1系統を、NIH AIDS Reference and Reagentから入手する。簡潔には、ヒトCCR5を形質導入したTl細胞を1細胞当たり感染多重度0.1の組織培養感染用量で感染させ、96ウェルプレート内で、200μLのRl 0-50中それぞれ5×104細胞:1.25×104細胞の比率で、HIV1 CAR形質導入細胞と共培養するか、または対照としていずれのエフェクター細胞とも共培養しない。エフェクター細胞が90%超形質導入したことが確認される。各条件を三連で行い、p24定量的ELISA(XpressBio,Frederick,MD)を使用してウイルス複製を監視する。HIV1 CAR細胞への曝露が、p24 ELISAによって測定されるHIV1の抑制をもたらすことが示される。
HIV-1の複製を抑制するHIV1-CAR形質導入CD8+Tリンパ球ならびにその拡大および富化されたクローンの能力を、以前に説明されているように(Yang,et al.(1997)PNAS USA 94:11478-11483、およびYang,et al.(1997)J Virol 71:3120-3128)試験する。94US_3393 IN(カタログ番号11250)、90JJS873(カタログ番号11251)、96TH_NP1538(カタログ番号11252)、00TZ_A246(カタログ番号11256)等の試験するHIV-1系統を、NIH AIDS Reference and Reagentから入手する。簡潔には、ヒトCCR5を形質導入したTl細胞を1細胞当たり感染多重度0.1の組織培養感染用量で感染させ、96ウェルプレート内で、200μLのRl 0-50中それぞれ5×104細胞:1.25×104細胞の比率で、HIV1 CAR形質導入細胞と共培養するか、または対照としていずれのエフェクター細胞とも共培養しない。エフェクター細胞が90%超形質導入したことが確認される。各条件を三連で行い、p24定量的ELISA(XpressBio,Frederick,MD)を使用してウイルス複製を監視する。HIV1 CAR細胞への曝露が、p24 ELISAによって測定されるHIV1の抑制をもたらすことが示される。
HIV1-CARを発現するエフェクター細胞を、感染CD4+細胞に対する抗ウイルス活性についても試験する。T2-CCR5細胞を、初代R5向性単離物を含むHIV-1系統のパネルに感染させ、HIV1-CAR形質導入エフェクター細胞の不在下または存在下で培養する。ウイルス複製を、培養7日目~10日目のp24抗原の測定によって評価する。複製の抑制を、エフェクター細胞との培養なしとエフェクター細胞との培養ありとの間のp24の論理単位の差として計算し、その後、これをエフェクター細胞なしでの全複製に対する比率として正規化する。
HIV-1に感染した標的細胞のCAR媒介死滅のためのクロム放出死滅アッセイ
上述のようにHIV-1系統NL4-3に感染させたT2-GLuc細胞を、Matadorアッセイにおいて、または以前に説明されているように(Bennett,et al.(2007)J Virol 81:4973-4980、Yang,et al.(1996)J Virol 70:5799-5806、およびBennett,et al.(2010)Aids 24:2619-2628)標準の51Cr放出アッセイを使用して、HIV1-CAR形質導入初代CD8+Tリンパ球の標的細胞として使用する。簡潔には、感染T2細胞および対照非感染T2細胞を51Crで1時間標識し、96ウェルU底プレート内で様々な細胞比でエフェクターCD8+Tリンパ球ありまたはなしで4時間インキュベートする。その後、上清を採取し、細胞外51Crを96ウェルプレート内でのmicro204シンチレーション計数によって測定する。自発的放出をエフェクター細胞なしの標的細胞で測定し、最大放出を2.5%Triton X-100で溶解した標的細胞で測定する。特異的溶解を、(実験的放出クロム-自発的放出)÷(最大放出-自発的放出)として計算する。
上述のようにHIV-1系統NL4-3に感染させたT2-GLuc細胞を、Matadorアッセイにおいて、または以前に説明されているように(Bennett,et al.(2007)J Virol 81:4973-4980、Yang,et al.(1996)J Virol 70:5799-5806、およびBennett,et al.(2010)Aids 24:2619-2628)標準の51Cr放出アッセイを使用して、HIV1-CAR形質導入初代CD8+Tリンパ球の標的細胞として使用する。簡潔には、感染T2細胞および対照非感染T2細胞を51Crで1時間標識し、96ウェルU底プレート内で様々な細胞比でエフェクターCD8+Tリンパ球ありまたはなしで4時間インキュベートする。その後、上清を採取し、細胞外51Crを96ウェルプレート内でのmicro204シンチレーション計数によって測定する。自発的放出をエフェクター細胞なしの標的細胞で測定し、最大放出を2.5%Triton X-100で溶解した標的細胞で測定する。特異的溶解を、(実験的放出クロム-自発的放出)÷(最大放出-自発的放出)として計算する。
MPLを標的とする二重特異性抗体
二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)および二重親和性再標的(DART)等の二重特異性抗体を使用して、T細胞を特定の抗原を発現する標的細胞に再標的させることができる。
二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)および二重親和性再標的(DART)等の二重特異性抗体を使用して、T細胞を特定の抗原を発現する標的細胞に再標的させることができる。
161 scFVに基づくMPLを標的とする二重特異性T細胞エンゲージャーを抗原結合ドメインとして構築する。この二重特異性構築物の配列を、配列番号3736に示す。この二重特異性構築物は、GGGSG-Streptagx2-Tagリンカー(配列番号287)を含むが、代替リンカー(例えば、SGGGS)を使用することもできる。
二重特異性構築物を293FT細胞中にトランスフェクトし、融合タンパク質を含有する上清を48~96時間後に収集した。MPL-161二重特異性融合タンパク質の存在下でT細胞と培養したHEL-GLuc細胞が、二重特異性融合タンパク質のみまたはT細胞のみと培養した細胞と比較して、GLucアッセイによって決定される細胞溶解を経ることが示された。
次に、175、111、hu-161-2、hu-175-2、およびhu-111 scFvに基づく構築物をコードする二重特異性抗体を構築し、HEL-GLuc細胞毒性アッセイにおいて活性を有することが認められる。最後に、PTK7、DLL3、TROP2、CD179a、CD179b、CD23、LAMP1、CDH1、CDH17、CD32、CDH19、HIV1-gp120エンベロープ糖タンパク質等を含むいくつかの他の抗原を標的とする二重特異性抗体を同様に構築し、それらの同族抗原を発現する標的細胞株と共培養したときに活性を有することが認められる。
図4.MPLを標的とし、かつ161-scFv標的ドメインを使用する二重特異性T細胞エンゲージャーの活性。HEL-pLenti-hGlucおよびT細胞を、以下の上清、培地のみおよびpLenti-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02(042517-P02-SC)と4℃で2時間別個にプレインキュベートした。インキュベートした後、細胞を、1:1または5:1のE:T比で、U底96ウェルプレート内37℃で4時間共培養した。1ウェル当たり50μLの細胞+上清を三連で384ウェルプレートに移した。hGLucアッセイを、15uLのCTZアッセイ緩衝液(1:100)を使用して行った。
TCRαおよびTCRβ発現を欠くJurkat細胞におけるTFPの発現および活性。
Jurkat-NFAT-GFP(J-N-G)細胞(T細胞リンパ腫)を、TCRαおよびTCRβ1/β2定常鎖を標的とするgRNAを発現し、かつStreptococcus Pyogenes Cas9を共発現するレンチウイルスベクターに感染させる。TCRα鎖の例示的なgRNA標的配列を、配列番号7754および7755に提供する。TCRβ1/β2鎖の例示的なgRNA標的配列を、配列番号7756~7758に提供する。代替の実施形態では、Knipping F et al,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,Vol 4,2017に記載されるようにgRNAおよびTALONを使用して、TCRαおよびTCRβ1/β2定常鎖遺伝子座を標的とする。TCRαまたはTCRβ1/β2鎖の発現を欠くJ-N-G細胞を、TCR/CD3複合体に対して指向された抗体を使用して、細胞選別によって精製する。EF1αプロモーター下でヒトMPLに対して指向されたTFPを発現する(配列番号2184、2490、2796)レンチウイルスベクターを使用して、親J-N-G細胞(対照)およびTCRαまたはTCRβ1/β2鎖の発現を欠くものを感染させる。細胞におけるTFPの発現を、タンパク質L染色での免疫染色およびMPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5融合タンパク質(配列番号4923)での染色によって決定する。J-N-G親細胞が、細胞表面に頑強なTFP発現を示す一方で、TCRαまたはTCRβ1/β2鎖を欠くJ-N-G細胞は、TFP発現不良またはTFP発現なしを示す。J-N-G細胞の異なる集団をHEL.92.1.7標的細胞に24時間曝露し、NFAT-プロモーター駆動GFP発現およびIL2産生の増加について試験する。MPL特異的TFPを発現するJ-N-G親細胞は、HEL.92.1.7細胞との共培養時にGFP蛍光およびIL2分泌の著しい増加を示す。対照的に、TCRαまたはTCRβ1/β2鎖の不在下でMPL特異的TFPを発現するJ-N-G細胞は、弱いGFP誘導およびIL2分泌またはGFP誘導およびIL2分泌なしを示す。この実験を、CD19(配列番号1913、2219、2525)、CD20(配列番号1945、2251、2557)、およびCD22(配列番号1950、2256、2562)を標的とするTFPの発現時に、かつRAJIおよびNalm6標的細胞との共培養時に、J-N-G親細胞およびTCRα欠損またはTCRβ1/β2欠損細胞で繰り返したときに、本質的に同様の結果が得られる。
Jurkat-NFAT-GFP(J-N-G)細胞(T細胞リンパ腫)を、TCRαおよびTCRβ1/β2定常鎖を標的とするgRNAを発現し、かつStreptococcus Pyogenes Cas9を共発現するレンチウイルスベクターに感染させる。TCRα鎖の例示的なgRNA標的配列を、配列番号7754および7755に提供する。TCRβ1/β2鎖の例示的なgRNA標的配列を、配列番号7756~7758に提供する。代替の実施形態では、Knipping F et al,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,Vol 4,2017に記載されるようにgRNAおよびTALONを使用して、TCRαおよびTCRβ1/β2定常鎖遺伝子座を標的とする。TCRαまたはTCRβ1/β2鎖の発現を欠くJ-N-G細胞を、TCR/CD3複合体に対して指向された抗体を使用して、細胞選別によって精製する。EF1αプロモーター下でヒトMPLに対して指向されたTFPを発現する(配列番号2184、2490、2796)レンチウイルスベクターを使用して、親J-N-G細胞(対照)およびTCRαまたはTCRβ1/β2鎖の発現を欠くものを感染させる。細胞におけるTFPの発現を、タンパク質L染色での免疫染色およびMPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5融合タンパク質(配列番号4923)での染色によって決定する。J-N-G親細胞が、細胞表面に頑強なTFP発現を示す一方で、TCRαまたはTCRβ1/β2鎖を欠くJ-N-G細胞は、TFP発現不良またはTFP発現なしを示す。J-N-G細胞の異なる集団をHEL.92.1.7標的細胞に24時間曝露し、NFAT-プロモーター駆動GFP発現およびIL2産生の増加について試験する。MPL特異的TFPを発現するJ-N-G親細胞は、HEL.92.1.7細胞との共培養時にGFP蛍光およびIL2分泌の著しい増加を示す。対照的に、TCRαまたはTCRβ1/β2鎖の不在下でMPL特異的TFPを発現するJ-N-G細胞は、弱いGFP誘導およびIL2分泌またはGFP誘導およびIL2分泌なしを示す。この実験を、CD19(配列番号1913、2219、2525)、CD20(配列番号1945、2251、2557)、およびCD22(配列番号1950、2256、2562)を標的とするTFPの発現時に、かつRAJIおよびNalm6標的細胞との共培養時に、J-N-G親細胞およびTCRα欠損またはTCRβ1/β2欠損細胞で繰り返したときに、本質的に同様の結果が得られる。
次に、EF1αプロモーター下でコドン最適化TCRα定常鎖(IgSP-[hTRAC-opt2]、配列番号1010)またはTCRβ定常鎖(IgSP-[hTRBC-opt2]、配列番号1011)を発現するレンチウイルスベクターを使用して、異なるJ-N-G細胞集団を感染させる。TCRα鎖がgRNA媒介遺伝子ノックアウトによって破壊されたMPL特異的TFPを発現するJ-N-G細胞におけるTCRα定常鎖の発現により、HEL.92.1.7標的細胞との共培養時に、細胞表面でのTFPの発現、ならびにGFP発現およびIL2分泌の誘導の増加がもたらされる。同様に、TCRβ1/β2鎖がgRNA媒介遺伝子ノックアウトによって破壊されたMPL特異的TFPを発現するJ-N-G細胞におけるTCRβ定常鎖の発現により、HEL.92.1.7標的細胞との共培養時に、細胞表面でのTFPの発現、ならびにGFP発現およびIL2分泌の誘導の増加がもたらされる。
TCRαおよびTCRβ発現を欠くJurkat細胞におけるAb-TCRおよびcTCR/SIRの発現および活性
CD19を標的とするTFPの代わりにヒトCD19を標的とするAb-TCRおよびSIRをコードする発現カセットを使用することを除いて、上記の実験を繰り返す。CD19を標的とするAb-TCRを、配列番号3124によって表す。CD19を標的とするcTCR/SIRを、配列番号3878~3880によって表す。TCRαまたはTCRβ1/β2発現を欠くJ-N-G細胞におけるAb-TCR、cTCR、およびSIRの発現により、親J-N-G細胞におけるそれらの発現と比較して増加した発現および活性がもたらされることが示される。
CD19を標的とするTFPの代わりにヒトCD19を標的とするAb-TCRおよびSIRをコードする発現カセットを使用することを除いて、上記の実験を繰り返す。CD19を標的とするAb-TCRを、配列番号3124によって表す。CD19を標的とするcTCR/SIRを、配列番号3878~3880によって表す。TCRαまたはTCRβ1/β2発現を欠くJ-N-G細胞におけるAb-TCR、cTCR、およびSIRの発現により、親J-N-G細胞におけるそれらの発現と比較して増加した発現および活性がもたらされることが示される。
本開示のCAR、TFP、およびAb-TCRを発現する同種および既製のT細胞
同種または既製のCAR-T細胞を、TALON、CRISP/Cas9、または他のヌクレアーゼを使用して内在性TCRαおよび/またはTCRβ鎖の発現を低減または排除することによって生成する。
同種または既製のCAR-T細胞を、TALON、CRISP/Cas9、または他のヌクレアーゼを使用して内在性TCRαおよび/またはTCRβ鎖の発現を低減または排除することによって生成する。
MPL特異的TFPカセット(配列番号3527、3529、3531)を、TRAC ゲノム遺伝子座を標的とし、かつTRACゲノム配列に由来する右および左ホモロジーアームを含むように設計された標的構築物にクローン化する。ポリアデニル化配列をTFPの終止コドンの下流に挿入する。標的構築物および標的戦略の概略図を図5Aに示す。標的構築物の配列を、配列番号3858、7773、および7776に提供する。これらの標的構築物を、組み込み欠損レンチウイルスベクター(IDLV)およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターにクローン化する。構築物を、当該技術分野で既知の技法に記載のCRISP/Cas9(図5A)を使用し、かつTRAC gRNA配列(配列番号7751):5′C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU* U* U* U-3′を使用して、精製されたヒトT細胞におけるTRAC遺伝子座に指向させる。アスタリスク(*)は、2′-O-メチル3′ホスホロチオエートを表す。IDLVおよびAAVを使用して標的構築物をTRAC遺伝子座に送達するための例示的な技法が、それぞれ、Knipping F et al,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,Vol 4,2017およびEyquem J et al Nature,543(7643):113-117,2017に記載されている。並行して、従来のアプローチを使用して、精製されたヒトT細胞に対応するTFP構築物(配列番号2184、2490、2796)をコードするレンチウイルスベクターをEF1αプロモーター下で形質導入して、異なるTFPを発現する細胞を生成する。T細胞におけるTCRαβおよびTFPの発現を、それぞれ、TCR/CD3抗体およびタンパク質L染色での免疫染色によって決定する。T細胞におけるTFPの発現も、MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5融合タンパク質(配列番号4923)での染色によって試験する。T細胞の異なる集団をHEL.92.1.7-GLuc標的細胞に曝露し、インビトロおよびインビボアッセイを使用して、細胞活性化、増殖、サイトカイン産生(例えば、IL2)、標的細胞溶解、老化、疲弊、インビボ拡大、インビボ持続性、およびインビボ抗腫瘍活性を比較する。TFPは、レンチウイルスベクターを使用してそれらを発現させたときと比較して、それらの発現をTRAC遺伝子座に指向させたときに、T細胞表面での発現障害、およびT細胞における活性低下または活性なし(例えば、T細胞活性化、増殖、サイトカイン産生、および細胞毒性等)を示す。次に、TCRα定常鎖(TRAC鎖)の発現を使用して、TFP発現ならびにシグナル伝達および活性を、内在性TRACゲノム遺伝子座がTFP発現カセットによって破壊されたT細胞において回復させることができるかを試験する。この目的のために、TFPを、アミノ末端シグナルペプチド(IgSP)を有するTCRα定常鎖をコードするアクセサリーモジュールと共発現する標的構築物を構築する(図5B)。このアクセサリーモジュールを、フーリン-SGSG-P2AリンカーによってTFPコード配列から分離する。TCRα定常鎖を、MPLを標的とするTFP構築物と共発現する例示的な標的構築物のヌクレオチド配列を、配列番号3859、7774、および7777)に示す。これらの構築物におけるTCRα定常鎖のヌクレオチド配列をコドン最適化し、そのヌクレオチド配列内の内在性TCRα定常鎖とは異なる。代替実施形態では、TRAC鎖をコドン最適化し、ヒトTCRα定常鎖の発現を増強することで知られているアミノ酸置換を有する。内在性TCRα遺伝子の発現が標的とすることによって下方調節または排除されたT細胞におけるTCR/CD3複合体の再発現を可能にするために使用され得る例示的な外因性TRAC鎖のヌクレオチド配列を、配列番号3886~3894に示す。外因性TRACは、T細胞に単独で発現し得る(配列番号1010)か、または単一のベクターを使用してTFP発現カセットと共発現し得る。
MPL特異的TFP構築物(配列番号3858、7773、および7776)およびTFP-TRAC構築物(配列番号3859、7774、および7777)をIDLVおよびAAVベクターにクローン化し、本質的に以前に説明されているようにTRAC遺伝子座に指向させる。
これらの構築物を発現する細胞をHEL.92.1.7-GLuc標的細胞に曝露し、上述の機能的アッセイにおいて試験する。TFP-TRAC構築物をTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、TFP構築物のみ(すなわち、外因性TRAC鎖との共発現なし)をTRAC遺伝子座に指向させたT細胞と比較して、細胞表面にTFPのより良好な発現を示す。加えて、TFP-TRAC構築物をTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、TFP構築物のみ(すなわち、外因性TRAC鎖との共発現なし)をTRAC遺伝子座に指向させたT細胞と比較して、より高い増殖、活性化、サイトカイン(例えば、IL2およびTNFα)産生、細胞毒性、インビボ拡大、標的細胞に対するインビボ抗腫瘍活性を示す。
TFPの発現および活性は、TFPカセットの後に、インフレームで、2A切断可能なリンカー、シグナルペプチド(例えば、CD8シグナルペプチドまたはIgHシグナルペプチド)、およびTCRα鎖(TRAC)の第1のエクソンが続くように標的カセットを設計することによって、内在性TRAC遺伝子座が破壊されたT細胞においても回復する(図5C)。例示的な標的構築物のヌクレオチド配列を、配列番号3860、7775、および7778に示す。この実施形態では、TRACタンパク質を、細胞表面発現が標的カセットに提供されるシグナルペプチドによって促進される内在性TRAC鎖によって産生する。
天然TCRα鎖の発現を欠くが、TFP細胞表面発現および活性がTCRα定常鎖の発現によってレスキューされるTFP-TRAC発現T細胞の同種反応性を、同種ドナーに由来する照射T細胞を使用した混合リンパ球培養反応を使用して試験する。天然TCRαの発現を欠くTFP-TRAC発現T細胞は、レンチウイルスベクターを使用してTFPを発現させたT細胞と比較して、増殖応答によって測定される著しく低減した同種反応性または同種反応性なしを示す。移植片対宿主病(GVHD)を誘発する天然TCRαの発現を欠くTFP-TRAC発現ヒトT細胞の能力を、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に1動物当たり5億個のTFP-TRAC発現TCRα欠損T細胞を投与することによって試験する。動物を90日間にわたって観察する。TFP-TRACカセットをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞が、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に注入したときに著しく軽減された移植片対宿主病(GVHD)またはGVHDなしを示す一方で、レンチウイルスベクターを使用してTFPを発現させたT細胞を投与した動物にはGVHDが観察される。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するTFP-TRAC発現TCRα欠損ヒトT細胞の能力を、リンパ球枯渇化学療法を受けた同種ヒトレシピエントに1キログラム当たり1億個の細胞を投与することによっても試験する。TFP-TRACカセットをTRAC遺伝子座に指向させた同種T細胞は、同種レシピエントに投与したときに移植片対宿主病(GVHD)の著しく低下した罹患率および重症度を示す。
この実験を、TFPをTRBC遺伝子座に指向させたT細胞で繰り返したときに、本質的に同様の結果が得られる。TRBCを標的とするgRNAの標的配列を、配列番号7756~7758に示す。これらのgRNAを、当該技術分野で既知の方法を使用して、Streptococcuc Pyogenes Cas9と組み合わせて使用する。TFP発現カセットのTRBCゲノム遺伝子座への指向が、MPL特異的TFPの活性障害をもたらすことが示される。しかしながら、TFPの活性は、外因性TCRβ定常鎖(TRBC)の共発現によって回復する。TCR/CD3複合体シグナル伝達機能を回復させるために使用され得る例示的な外因性TRBC鎖のヌクレオチド配列を、配列番号3899~3910に示す。外因性TRBCは、T細胞に単独で発現し得る(配列番号1011)か、または単一のベクター由来のTFP発現カセットと共発現し得る。TRBC鎖を、MPLを標的とするTFP構築物と共発現する例示的な構築物のヌクレオチド配列を、配列番号3537、3539、および3541に示す。これらのTFP発現構築物を、当該技術分野で既知の技法を使用して、好適なTRBC標的ベクターにクローン化することができる。代替実施形態では、TRBCの発現は、TFPカセットの後に、インフレームで、2A切断可能なリンカー、シグナルペプチド(例えば、CD8シグナルペプチドまたはIgHシグナルペプチド)、およびTCRβ鎖(TRBC)の第1のエクソンが続くように標的カセットを設計することによって、内在性TRBC遺伝子座が破壊されたT細胞において回復し得る。
Ab-TCR構築物のTRAC遺伝子座への指向
FMC63 scFvに基づくCD19を標的とする2つのAb-TCR構築物を、EF1αプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成する。これらの構築物CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]およびCD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]のヌクレオチド配列を、配列番号3124および3324のAb-TCR成分をコードするヌクレオチド配列によって表す。初代ヒトT細胞を対応するレンチウイルス上清に感染させ、FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清(配列番号1014)を使用してAb-TCR細胞表面発現についてアッセイし、RAJI-GLuc細胞に対する細胞毒性についてアッセイする。Ab-TCRを発現するT細胞は、中程度の発現および活性を示す。Ab-TCRの発現を、配列番号3861~3864によって表される遺伝子標的構築物(図6を参照のこと)を使用して本質的にEyquem J et alによって説明されているように(Nature,543(7643):113-117,2017)TRAC遺伝子座に指向させる。標的構築物は、スプライスアクセプター(SA)を含み、F2Aコード配列、Ab-TCRカセットが続き、TRAC遺伝子座と相同の配列(LHAおよびRHA、左および右ホモロジーアーム)と隣接している。カセットAおよびB(配列番号3861~3862)では、Ab-TCR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、ポリA配列、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続く。カセットCでは、Ab-TCR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続くが、転写物が3’末端にTRAC遺伝子およびそのポリアデニル化配列を持つようにポリA配列を含まない。カセットDでは、Ab-TCRカセットは、自身のTCRαモジュールを欠き、TRACの第1のエクソンの3’側半分にインフレームで融合したIgG1-CH1領域にまでしか伸長しない。したがって、この構築物では、TCRαモジュールは、エクソン1の一部、ならびにエクソン2およびエクソン3の全部を含むゲノムTRAC遺伝子座によってコードされる。カセットEは、標的構築物のRHAがTRACの発現を増強することができる突然変異(SDVP)を持つことを除いて、カセットDに類似している。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用して発現させたAb-TCRカセットと比較して、インビボおよびインビトロアッセイを使用して決定される導入遺伝子の均一な生理学的発現ならびに長期持続性および活性を示す。Ab-TCR発現T細胞を、PE-タンパク質Lでの染色、その後、流動選別によって精製する。Ab-TCR発現T細胞の同種反応性を、同種ドナーに由来する照射T細胞を使用した混合リンパ球培養条件を使用して試験する。Ab-TCRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用してAb-TCRを発現させたT細胞と比較して、増殖応答によって測定される著しく低減した同種反応性または同種反応性なしを示す。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するAb-TCR発現ヒトT細胞の能力を、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に1動物当たり500万個のAb-TCR発現T細胞を投与することによって試験する。動物を90日間にわたって観察する。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞が、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に注入したときに著しく軽減された移植片対宿主病(GVHD)またはGVHDなしを示す一方で、レンチウイルスベクターを使用してAb-TCRを発現させたT細胞を投与した動物にはGVHDが観察される。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するAb-TCR発現ヒトT細胞の能力を、同種ヒトレシピエントにAb-TCR発現T細胞(1キログラム当たり100万個の細胞)を投与することによっても試験する。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させた同種T細胞は、同種レシピエントに投与したときに移植片対宿主病(GVHD)の著しく低下した罹患率および重症度を示す。発現カセットをTRBC遺伝子座に指向させることによってAb-TCRを発現させたT細胞を使用して、本質的に同様の結果が得られる。
FMC63 scFvに基づくCD19を標的とする2つのAb-TCR構築物を、EF1αプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成する。これらの構築物CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]およびCD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]のヌクレオチド配列を、配列番号3124および3324のAb-TCR成分をコードするヌクレオチド配列によって表す。初代ヒトT細胞を対応するレンチウイルス上清に感染させ、FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清(配列番号1014)を使用してAb-TCR細胞表面発現についてアッセイし、RAJI-GLuc細胞に対する細胞毒性についてアッセイする。Ab-TCRを発現するT細胞は、中程度の発現および活性を示す。Ab-TCRの発現を、配列番号3861~3864によって表される遺伝子標的構築物(図6を参照のこと)を使用して本質的にEyquem J et alによって説明されているように(Nature,543(7643):113-117,2017)TRAC遺伝子座に指向させる。標的構築物は、スプライスアクセプター(SA)を含み、F2Aコード配列、Ab-TCRカセットが続き、TRAC遺伝子座と相同の配列(LHAおよびRHA、左および右ホモロジーアーム)と隣接している。カセットAおよびB(配列番号3861~3862)では、Ab-TCR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、ポリA配列、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続く。カセットCでは、Ab-TCR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続くが、転写物が3’末端にTRAC遺伝子およびそのポリアデニル化配列を持つようにポリA配列を含まない。カセットDでは、Ab-TCRカセットは、自身のTCRαモジュールを欠き、TRACの第1のエクソンの3’側半分にインフレームで融合したIgG1-CH1領域にまでしか伸長しない。したがって、この構築物では、TCRαモジュールは、エクソン1の一部、ならびにエクソン2およびエクソン3の全部を含むゲノムTRAC遺伝子座によってコードされる。カセットEは、標的構築物のRHAがTRACの発現を増強することができる突然変異(SDVP)を持つことを除いて、カセットDに類似している。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用して発現させたAb-TCRカセットと比較して、インビボおよびインビトロアッセイを使用して決定される導入遺伝子の均一な生理学的発現ならびに長期持続性および活性を示す。Ab-TCR発現T細胞を、PE-タンパク質Lでの染色、その後、流動選別によって精製する。Ab-TCR発現T細胞の同種反応性を、同種ドナーに由来する照射T細胞を使用した混合リンパ球培養条件を使用して試験する。Ab-TCRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用してAb-TCRを発現させたT細胞と比較して、増殖応答によって測定される著しく低減した同種反応性または同種反応性なしを示す。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するAb-TCR発現ヒトT細胞の能力を、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に1動物当たり500万個のAb-TCR発現T細胞を投与することによって試験する。動物を90日間にわたって観察する。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞が、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に注入したときに著しく軽減された移植片対宿主病(GVHD)またはGVHDなしを示す一方で、レンチウイルスベクターを使用してAb-TCRを発現させたT細胞を投与した動物にはGVHDが観察される。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するAb-TCR発現ヒトT細胞の能力を、同種ヒトレシピエントにAb-TCR発現T細胞(1キログラム当たり100万個の細胞)を投与することによっても試験する。Ab-TCRカセットをTRAC遺伝子座に指向させた同種T細胞は、同種レシピエントに投与したときに移植片対宿主病(GVHD)の著しく低下した罹患率および重症度を示す。発現カセットをTRBC遺伝子座に指向させることによってAb-TCRを発現させたT細胞を使用して、本質的に同様の結果が得られる。
キメラTCRまたは合成免疫受容体(SIR)構築物のTRAC遺伝子座への指向
FMC63 scFvに基づくCD19を標的とする3つのcTCR(またはSIR)構築物を、EF1αプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成する。これらの構築物のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号3878、3879、および3880によって表す。これらは全て、同じvL領域およびvH領域を有する。配列番号3880がTCRαおよびTCRβ定常鎖の野生型ヌクレオチド配列を有する一方で、配列番号3878および3879は、コドン最適化配列を有する。配列番号3878は、TCRαおよびTCRβ定常鎖の発現および塩基対合を増強するためのいくつかのアミノ酸置換をさらに有する。初代ヒトT細胞を対応するレンチウイルス上清に感染させ、FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清(配列番号1014)を使用してSIRの細胞表面発現についてアッセイし、RAJI-GLuc細胞に対する細胞毒性についてアッセイする。配列番号3880を有するcTCR/SIR構築物が良好に発現することも標的細胞溶解を誘導することも認められない。cTCR/SIRも、配列番号3865~3868、および3873によって表される例示的な遺伝子標的構築物(図7を参照のこと)を使用して本質的にEyquem J et alによって説明されているように(Nature,543(7643):113-117,2017)TRAC遺伝子座に指向させる。標的構築物は、スプライスアクセプター(SA)を含み、F2Aコード配列、Ab-TCRカセットが続き、TRAC遺伝子座と相同の配列(LHAおよびRHA、左および右ホモロジーアーム)と隣接している。カセットAおよびB(配列番号3865、3866、および3873)では、SIR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、ポリA配列、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続く。カセットEでは、SIR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続くが、転写物が3’末端にTRAC遺伝子およびそのポリアデニル化配列を持つように介在ポリA配列を含まない。カセットDでは、SIRカセットは、自身のTCRαモジュールを欠き、標的構築物に存在するTRACの第1のエクソンにインフレームで融合したFMC63-vH領域にまでしか伸長しない。したがって、この構築物では、TCRαモジュールは、エクソン 1の一部、ならびにエクソン2およびエクソン3の全部を含むゲノムTRAC遺伝子座によってコードされる。カセットFは、標的構築物のRHAがTRACの発現を増強することができるTRACのエクソン1および2に突然変異(CSDVP)を持つことを除いて、カセットEに類似している。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座(配列番号3873)に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用して発現させたcTCR/SIRカセットと比較して、インビボおよびインビトロアッセイを使用して決定される導入遺伝子の均一な生理学的発現ならびに長期持続性および活性を示す。他のcTCR(配列番号3865~3868)も、TRAC遺伝子座に指向させたときに、均一な発現および活性を示す。cTCRおよびSIR発現T細胞を、FITCコンジュゲートCD3抗体およびPE-タンパク質Lでの染色、その後、流動選別によって精製する。cTCRおよびSIR発現T細胞の同種反応性を、同種ドナーに由来する照射T細胞を使用した混合リンパ球培養条件を使用して試験する。cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用してcTCR/SIRを発現させたT細胞と比較して、増殖応答によって測定される著しく低減した同種反応性または同種反応性なしを示す。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するcTCR/SIR発現ヒトT細胞の能力を、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に1動物当たり500万個のcTCR/SIR発現T細胞を投与することによって試験する。動物を90日間にわたって観察する。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞が、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に注入したときに著しく軽減された移植片対宿主病(GVHD)またはGVHDなしを示す一方で、レンチウイルスベクターを使用してcTCR/SIRを発現させたT細胞を投与した動物にはGVHDが観察される。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するcTCRおよびSIR発現ヒトT細胞の能力を、リンパ球枯渇化学療法を受けた同種ヒトレシピエントにcTCR/SIR発現T細胞(1キログラム当たり100万個の細胞)を投与することによっても試験する。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座に指向させた同種T細胞は、同種レシピエントに投与したときに移植片対宿主病(GVHD)の著しく低下した罹患率および重症度を示す。発現カセットをTRBC遺伝子座に指向させることによってcTCRおよびSIRを発現させたT細胞を使用して、本質的に同様の結果が得られる。
FMC63 scFvに基づくCD19を標的とする3つのcTCR(またはSIR)構築物を、EF1αプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成する。これらの構築物のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号3878、3879、および3880によって表す。これらは全て、同じvL領域およびvH領域を有する。配列番号3880がTCRαおよびTCRβ定常鎖の野生型ヌクレオチド配列を有する一方で、配列番号3878および3879は、コドン最適化配列を有する。配列番号3878は、TCRαおよびTCRβ定常鎖の発現および塩基対合を増強するためのいくつかのアミノ酸置換をさらに有する。初代ヒトT細胞を対応するレンチウイルス上清に感染させ、FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清(配列番号1014)を使用してSIRの細胞表面発現についてアッセイし、RAJI-GLuc細胞に対する細胞毒性についてアッセイする。配列番号3880を有するcTCR/SIR構築物が良好に発現することも標的細胞溶解を誘導することも認められない。cTCR/SIRも、配列番号3865~3868、および3873によって表される例示的な遺伝子標的構築物(図7を参照のこと)を使用して本質的にEyquem J et alによって説明されているように(Nature,543(7643):113-117,2017)TRAC遺伝子座に指向させる。標的構築物は、スプライスアクセプター(SA)を含み、F2Aコード配列、Ab-TCRカセットが続き、TRAC遺伝子座と相同の配列(LHAおよびRHA、左および右ホモロジーアーム)と隣接している。カセットAおよびB(配列番号3865、3866、および3873)では、SIR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、ポリA配列、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続く。カセットEでは、SIR発現カセットをコードするヌクレオチド配列の後に、終止コドン、TRACのエクソン1、およびTRAC遺伝子座と相同の配列(RHA:右ホモロジーアーム)が続くが、転写物が3’末端にTRAC遺伝子およびそのポリアデニル化配列を持つように介在ポリA配列を含まない。カセットDでは、SIRカセットは、自身のTCRαモジュールを欠き、標的構築物に存在するTRACの第1のエクソンにインフレームで融合したFMC63-vH領域にまでしか伸長しない。したがって、この構築物では、TCRαモジュールは、エクソン 1の一部、ならびにエクソン2およびエクソン3の全部を含むゲノムTRAC遺伝子座によってコードされる。カセットFは、標的構築物のRHAがTRACの発現を増強することができるTRACのエクソン1および2に突然変異(CSDVP)を持つことを除いて、カセットEに類似している。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座(配列番号3873)に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用して発現させたcTCR/SIRカセットと比較して、インビボおよびインビトロアッセイを使用して決定される導入遺伝子の均一な生理学的発現ならびに長期持続性および活性を示す。他のcTCR(配列番号3865~3868)も、TRAC遺伝子座に指向させたときに、均一な発現および活性を示す。cTCRおよびSIR発現T細胞を、FITCコンジュゲートCD3抗体およびPE-タンパク質Lでの染色、その後、流動選別によって精製する。cTCRおよびSIR発現T細胞の同種反応性を、同種ドナーに由来する照射T細胞を使用した混合リンパ球培養条件を使用して試験する。cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルスベクターを使用してcTCR/SIRを発現させたT細胞と比較して、増殖応答によって測定される著しく低減した同種反応性または同種反応性なしを示す。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するcTCR/SIR発現ヒトT細胞の能力を、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に1動物当たり500万個のcTCR/SIR発現T細胞を投与することによって試験する。動物を90日間にわたって観察する。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞が、免疫不全NSGマウス(Jackson Lab)に注入したときに著しく軽減された移植片対宿主病(GVHD)またはGVHDなしを示す一方で、レンチウイルスベクターを使用してcTCR/SIRを発現させたT細胞を投与した動物にはGVHDが観察される。移植片対宿主病(GVHD)を誘発するcTCRおよびSIR発現ヒトT細胞の能力を、リンパ球枯渇化学療法を受けた同種ヒトレシピエントにcTCR/SIR発現T細胞(1キログラム当たり100万個の細胞)を投与することによっても試験する。cTCR/SIRカセットをTRAC遺伝子座に指向させた同種T細胞は、同種レシピエントに投与したときに移植片対宿主病(GVHD)の著しく低下した罹患率および重症度を示す。発現カセットをTRBC遺伝子座に指向させることによってcTCRおよびSIRを発現させたT細胞を使用して、本質的に同様の結果が得られる。
TCRまたはcTCR/SIR構築物のTRAC遺伝子座への指向
NY-ESO-1/HLA-A2複合体を標的とするTCR構築物およびcTCR(またはSIR)構築物をレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成し、TCR NYESO-1G4およびTCR模倣抗体 NYESO-35-15に基づく。これらの構築物のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号3883および3882によって表す。これらの2つの構築物を、配列番号3874~3877によって表される標的構築物を使用してTRAC遺伝子座にも標的させる。標的構築物の設計を図8に示す。NY-ESO-1 TCRまたはcTCRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、導入遺伝子の均一な発現、NY-ESO-1/HLA-A2複合体を発現する標的細胞の良好な認識を示し、インビボアッセイを使用したレンチウイルス媒介遺伝子導入を使用して上記の構築物を発現させたT細胞と同等に良好にまたはそれよりも良好に機能する。NY-ESO-1 TCRまたはcTCRをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞は、レンチウイルス媒介遺伝子導入を使用してNY-ESO-1またはcTCRを発現させたT細胞と比較して、混合リンパ球反応における低減された同種反応性およびNSGマウス異種移植モデルにおける軽減されたGVHDも示す。
NY-ESO-1/HLA-A2複合体を標的とするTCR構築物およびcTCR(またはSIR)構築物をレンチウイルスベクター(配列番号3837)に生成し、TCR NYESO-1G4およびTCR模倣抗体 NYESO-35-15に基づく。これらの構築物のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号3883および3882によって表す。これらの2つの構築物を、配列番号3874~3877によって表される標的構築物を使用してTRAC遺伝子座にも標的させる。標的構築物の設計を図8に示す。NY-ESO-1 TCRまたはcTCRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、導入遺伝子の均一な発現、NY-ESO-1/HLA-A2複合体を発現する標的細胞の良好な認識を示し、インビボアッセイを使用したレンチウイルス媒介遺伝子導入を使用して上記の構築物を発現させたT細胞と同等に良好にまたはそれよりも良好に機能する。NY-ESO-1 TCRまたはcTCRをTRAC遺伝子座に指向させたヒトT細胞は、レンチウイルス媒介遺伝子導入を使用してNY-ESO-1またはcTCRを発現させたT細胞と比較して、混合リンパ球反応における低減された同種反応性およびNSGマウス異種移植モデルにおける軽減されたGVHDも示す。
一本鎖cTCR/SIR構築物のTRAC遺伝子座への指向
FMC63-scFvがコドン最適化TCRa定常鎖またはコドン最適化およびマウス化TCRa 定常鎖(配列番号3881)に結合した一本鎖cTCR/SIRを、レンチウイルスベクターを使用してT細胞に発現させ、不良な発現および活性を示す。同じ構築物を、図9に示され、かつ配列番号3869~3872によって表される標的構築物を使用してTRAC遺伝子座に指向させる。一本鎖cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、以前に説明されているアッセイを使用してアッセイしたときにcTCRの均一な発現および活性を示す。加えて、一本鎖cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルス媒介遺伝子導入を使用してNY-ESO-1またはcTCRを発現させたT細胞と比較して、MLRを使用して同種反応性の低下した罹患率およびNSGマウス異種移植モデルを使用してGVHDの低下した罹患率を示す。
FMC63-scFvがコドン最適化TCRa定常鎖またはコドン最適化およびマウス化TCRa 定常鎖(配列番号3881)に結合した一本鎖cTCR/SIRを、レンチウイルスベクターを使用してT細胞に発現させ、不良な発現および活性を示す。同じ構築物を、図9に示され、かつ配列番号3869~3872によって表される標的構築物を使用してTRAC遺伝子座に指向させる。一本鎖cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、以前に説明されているアッセイを使用してアッセイしたときにcTCRの均一な発現および活性を示す。加えて、一本鎖cTCR/SIRをTRAC遺伝子座に指向させたT細胞は、レンチウイルス媒介遺伝子導入を使用してNY-ESO-1またはcTCRを発現させたT細胞と比較して、MLRを使用して同種反応性の低下した罹患率およびNSGマウス異種移植モデルを使用してGVHDの低下した罹患率を示す。
上記の実施例では、CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCRをTRAC遺伝子座に指向させる。本質的に同様の手順が、当該技術分野で既知の技法を使用してCAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCRまたはアクセサリーモジュールをTCBC、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζ遺伝子座に指向させるために使用され得る。
より短いEF1αプロモーターがT細胞において強いプロモーター活性を保持し、養子細胞療法に好適である。
養子細胞療法用途における強いウイルスプロモーターの使用は、下流癌遺伝子の活性化およびがん発症の危険性を有する。したがって、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターが強い発現を提供し、ヒト起源であるため、養子細胞療法用途において頻繁に使用されている。しかしながら、EF1αプロモーターの制限は、その比較的大きいサイズにある。小型EF1αプロモーターについて説明されているが、EF1αプロモーターと比較してはるかに弱い。EF1αプロモーター強度を保ちながらEF1αプロモーターの内部欠失がその長さの短縮を可能にするかを決定するために、SacII断片をEF1αプロモーターから欠失させた。結果として生じたEF1α-D-SacIIプロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号3842に提示する。CD19指向性FMC63-BBz CARをコードするレンチウイルスベクターを、野生型EF1αプロモーター(配列番号3840)またはEF1α-D-SacIIプロモーター(配列番号3839)を有するベクターに構築した。これらのベクターは、2Aリンカーを介してEGFPおよびブラストサイジン耐性遺伝子を共発現した。レンチウイルスを293FT細胞に生成し、これを使用してJ-N-G細胞に感染させた。感染細胞をブラストサイジンで選択し、その後、CD19陽性RAJI細胞との共培養時にEGFP発現を誘導するそれらの能力について試験した。EGFP発現のほぼ同等の誘導が、いずれかのレンチウイルス構築物を形質導入したJ-N-G細胞で観察された。加えて、CD19-ECD-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって決定されるFMC63-BBz CARのほぼ同等の発現が、いずれかの構築物を形質導入したJ-N-G細胞の表面で観察された。これらの結果は、EF1α-D-SacIIプロモーターを養子細胞療法用途に使用することができることを示す。これらの結果は、EF1α-D-SacIIプロモーターが野生型EF1αプロモーターよりもサイレンシング傾向が低く、これを長期導入遺伝子発現に使用することができることをさらに示す。
養子細胞療法用途における強いウイルスプロモーターの使用は、下流癌遺伝子の活性化およびがん発症の危険性を有する。したがって、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターが強い発現を提供し、ヒト起源であるため、養子細胞療法用途において頻繁に使用されている。しかしながら、EF1αプロモーターの制限は、その比較的大きいサイズにある。小型EF1αプロモーターについて説明されているが、EF1αプロモーターと比較してはるかに弱い。EF1αプロモーター強度を保ちながらEF1αプロモーターの内部欠失がその長さの短縮を可能にするかを決定するために、SacII断片をEF1αプロモーターから欠失させた。結果として生じたEF1α-D-SacIIプロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号3842に提示する。CD19指向性FMC63-BBz CARをコードするレンチウイルスベクターを、野生型EF1αプロモーター(配列番号3840)またはEF1α-D-SacIIプロモーター(配列番号3839)を有するベクターに構築した。これらのベクターは、2Aリンカーを介してEGFPおよびブラストサイジン耐性遺伝子を共発現した。レンチウイルスを293FT細胞に生成し、これを使用してJ-N-G細胞に感染させた。感染細胞をブラストサイジンで選択し、その後、CD19陽性RAJI細胞との共培養時にEGFP発現を誘導するそれらの能力について試験した。EGFP発現のほぼ同等の誘導が、いずれかのレンチウイルス構築物を形質導入したJ-N-G細胞で観察された。加えて、CD19-ECD-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって決定されるFMC63-BBz CARのほぼ同等の発現が、いずれかの構築物を形質導入したJ-N-G細胞の表面で観察された。これらの結果は、EF1α-D-SacIIプロモーターを養子細胞療法用途に使用することができることを示す。これらの結果は、EF1α-D-SacIIプロモーターが野生型EF1αプロモーターよりもサイレンシング傾向が低く、これを長期導入遺伝子発現に使用することができることをさらに示す。
養子細胞療法中に観察されるサイトカイン放出症候群および神経学的合併症を制御するための水溶性ダサチニブ塩の使用
ダサチニブは、水難溶性薬物であり、商業用ダサチニブは、一水和物であり、24℃で8μg/mLの溶解度を有すると報告されている。CRSおよび神経学的合併症を有する患者は、経口形態のダサチニブを服用するのが困難であり、水溶性形態のダサチニブが望ましい。水溶性ダサチニブ塩がWO2015107545 A1に記載されている。メタンスルホン酸ダサチニブ一水和物の可溶性塩を含む注射可能な組成物を、WO2015107545 A1の方法に従って調製し、これを使用して、CAR-T細胞およびブリナツモマブの投与に関連するCRSおよび神経学的合併症を有する患者を治療することができる。メタンスルホン酸ダサチニブ一水和物の用量を滴定して、有効な血漿濃度を達成することができる。例示的な実施形態では、ダサチニブの血漿濃度を、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、または300nMよりも高く保つ。別の例示的な実施形態では、ダサチニブの血漿濃度を、5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、または75ng/mLよりも高く保つ。最後に、正常生理食塩水中に溶解したメタンスルホン酸ダサチニブ一水和物を使用して、CAR-T細胞およびブリナツモマブ由来の神経学的合併症を有する患者に髄腔内投与することができる。例示的な実施形態では、メタンスルホン酸ダサチニブ髄腔内用量を調整して、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、または300nMよりも高いCSF濃度を達成する。例示的な実施形態では、メタンスルホン酸ダサチニブの髄腔内用量を調整して、5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、または75ng/mLよりも高いよりも高いCSF濃度を達成する。
ダサチニブは、水難溶性薬物であり、商業用ダサチニブは、一水和物であり、24℃で8μg/mLの溶解度を有すると報告されている。CRSおよび神経学的合併症を有する患者は、経口形態のダサチニブを服用するのが困難であり、水溶性形態のダサチニブが望ましい。水溶性ダサチニブ塩がWO2015107545 A1に記載されている。メタンスルホン酸ダサチニブ一水和物の可溶性塩を含む注射可能な組成物を、WO2015107545 A1の方法に従って調製し、これを使用して、CAR-T細胞およびブリナツモマブの投与に関連するCRSおよび神経学的合併症を有する患者を治療することができる。メタンスルホン酸ダサチニブ一水和物の用量を滴定して、有効な血漿濃度を達成することができる。例示的な実施形態では、ダサチニブの血漿濃度を、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、または300nMよりも高く保つ。別の例示的な実施形態では、ダサチニブの血漿濃度を、5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、または75ng/mLよりも高く保つ。最後に、正常生理食塩水中に溶解したメタンスルホン酸ダサチニブ一水和物を使用して、CAR-T細胞およびブリナツモマブ由来の神経学的合併症を有する患者に髄腔内投与することができる。例示的な実施形態では、メタンスルホン酸ダサチニブ髄腔内用量を調整して、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、または300nMよりも高いCSF濃度を達成する。例示的な実施形態では、メタンスルホン酸ダサチニブの髄腔内用量を調整して、5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、または75ng/mLよりも高いよりも高いCSF濃度を達成する。
複数の抗原を標的とする従来のCARおよび骨格1~72を発現する自己T細胞の養子細胞療法のための使用
感染性疾患(例えば、HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、変性疾患(例えば、アルツハイマー病)、アレルギー性疾患(例えば、慢性特発性蕁麻疹様)、および多発性癌を含む多くの異なる疾患を有する患者を、異なる病原抗原または疾患関連抗原を標的とするNEMO-K277A(骨格2)を共発現する養子導入自己CAR-T細胞での免疫療法のIRBに認可された第1相臨床試験に登録する。異なる疾患に対するCARを、病原細胞または疾患関連細胞におけるそれらの標的抗原の既知の発現に基づいて選択する。可能な場合、病原細胞または疾患関連細胞におけるCAR標的の発現を、CARの抗原結合ドメインが可動性リンカーを介してNLucタンパク質の非分泌形態に融合している抗原結合ドメイン-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって確認する。あるいは、市販の抗体を使用した免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用して、病原細胞または疾患関連細胞におけるCARの標的抗原の発現を確認する。白血球除去療法を使用してT細胞を対象から収集し、適切なレンチウイルスベクターを形質導入し、閉鎖系でCD3/CD28ビーズを使用してエクスビボで拡大させる。結果として生じた細胞産物が品質管理試験(滅菌および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む)を受けた後、これらを凍結保存する。CAR-T細胞産物を前実施例に記載されるように対象に投与する。その後、医師の判断で臨床的および実験室相関追跡研究を行うことができる。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載の他の骨格におけるCARを試験する。
感染性疾患(例えば、HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、変性疾患(例えば、アルツハイマー病)、アレルギー性疾患(例えば、慢性特発性蕁麻疹様)、および多発性癌を含む多くの異なる疾患を有する患者を、異なる病原抗原または疾患関連抗原を標的とするNEMO-K277A(骨格2)を共発現する養子導入自己CAR-T細胞での免疫療法のIRBに認可された第1相臨床試験に登録する。異なる疾患に対するCARを、病原細胞または疾患関連細胞におけるそれらの標的抗原の既知の発現に基づいて選択する。可能な場合、病原細胞または疾患関連細胞におけるCAR標的の発現を、CARの抗原結合ドメインが可動性リンカーを介してNLucタンパク質の非分泌形態に融合している抗原結合ドメイン-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって確認する。あるいは、市販の抗体を使用した免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用して、病原細胞または疾患関連細胞におけるCARの標的抗原の発現を確認する。白血球除去療法を使用してT細胞を対象から収集し、適切なレンチウイルスベクターを形質導入し、閉鎖系でCD3/CD28ビーズを使用してエクスビボで拡大させる。結果として生じた細胞産物が品質管理試験(滅菌および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む)を受けた後、これらを凍結保存する。CAR-T細胞産物を前実施例に記載されるように対象に投与する。その後、医師の判断で臨床的および実験室相関追跡研究を行うことができる。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載の他の骨格におけるCARを試験する。
複数の抗原を標的とする従来のCARおよび骨格1~72を発現する同種T細胞の養子細胞療法のための使用
感染性疾患(例えば、HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、変性疾患(例えば、アルツハイマー病)、アレルギー性疾患(例えば、慢性特発性蕁麻疹様)、および多発性癌を含む多くの異なる疾患を有する患者を、異なる病原または疾患関連抗原を標的とする養子導入同種CAR-T細胞での免疫療法のIRBに認可された第1相臨床試験に登録する。異なる疾患に対するCARを、病原細胞または疾患関連細胞におけるそれらの標的抗原の既知の発現に基づいて選択する。可能な場合、病原細胞または疾患関連細胞におけるCAR標的の発現を、CARの抗原結合ドメインが可動性リンカーを介してNLucタンパク質の非分泌形態に融合している抗原結合ドメイン-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって確認する。あるいは、市販の抗体を使用した免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用して、病原細胞または疾患関連細胞におけるCARの標的抗原の発現を確認する。T細胞を、白血球除去療法を使用して健常なドナーから収集する。CAR発現カセット(配列番号1900~配列番号2205)を標的ベクターにクローン化し、本質的に(Eyquem J et al,Nature、543(7643):113-117)によって説明されているように、CARモジュールをT細胞におけるTRAC遺伝子座に指向させる。表面でのCD3発現を欠くT細胞を免疫磁気精製によって選択し、その後、閉鎖系でCD3/CD28ビーズを使用してエクスビボで拡大させる。結果として生じた細胞産物が品質管理試験(滅菌および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む)を受けた後、これらを凍結保存する。CAR-T細胞産物を前実施例に記載されるように対象に投与する。その後、医師の判断で臨床的および実験室相関追跡研究を行うことができる。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載のVαドメインを欠くTCRα定常鎖(TRAC)を共発現するCARを含む、他の骨格におけるCARを試験する。
感染性疾患(例えば、HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、変性疾患(例えば、アルツハイマー病)、アレルギー性疾患(例えば、慢性特発性蕁麻疹様)、および多発性癌を含む多くの異なる疾患を有する患者を、異なる病原または疾患関連抗原を標的とする養子導入同種CAR-T細胞での免疫療法のIRBに認可された第1相臨床試験に登録する。異なる疾患に対するCARを、病原細胞または疾患関連細胞におけるそれらの標的抗原の既知の発現に基づいて選択する。可能な場合、病原細胞または疾患関連細胞におけるCAR標的の発現を、CARの抗原結合ドメインが可動性リンカーを介してNLucタンパク質の非分泌形態に融合している抗原結合ドメイン-GGS-NLuc融合タンパク質への結合によって確認する。あるいは、市販の抗体を使用した免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用して、病原細胞または疾患関連細胞におけるCARの標的抗原の発現を確認する。T細胞を、白血球除去療法を使用して健常なドナーから収集する。CAR発現カセット(配列番号1900~配列番号2205)を標的ベクターにクローン化し、本質的に(Eyquem J et al,Nature、543(7643):113-117)によって説明されているように、CARモジュールをT細胞におけるTRAC遺伝子座に指向させる。表面でのCD3発現を欠くT細胞を免疫磁気精製によって選択し、その後、閉鎖系でCD3/CD28ビーズを使用してエクスビボで拡大させる。結果として生じた細胞産物が品質管理試験(滅菌および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む)を受けた後、これらを凍結保存する。CAR-T細胞産物を前実施例に記載されるように対象に投与する。その後、医師の判断で臨床的および実験室相関追跡研究を行うことができる。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載のVαドメインを欠くTCRα定常鎖(TRAC)を共発現するCARを含む、他の骨格におけるCARを試験する。
CAR-T細胞の肝動脈内注入
静脈内注入に加えて、本発明に記載の従来のCARおよび骨格1~72を発現するT細胞を、動脈内注入して、疾患に関与する局部または臓器に高濃度のCAR-T細胞を提供することができる。以下の実施例では、葉酸受容体アルファ(FR1)を発現する胃腸癌由来の肝転移を有する患者の場合、このアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、他の腫瘍抗原を標的とする従来のCARおよび骨格1~72を発現するT細胞を動脈内注入することができる。
静脈内注入に加えて、本発明に記載の従来のCARおよび骨格1~72を発現するT細胞を、動脈内注入して、疾患に関与する局部または臓器に高濃度のCAR-T細胞を提供することができる。以下の実施例では、葉酸受容体アルファ(FR1)を発現する胃腸癌由来の肝転移を有する患者の場合、このアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、他の腫瘍抗原を標的とする従来のCARおよび骨格1~72を発現するT細胞を動脈内注入することができる。
マッピング血管造影をベースライン時に右総大腿動脈アプローチにより行う。他の潜在的な肝外灌流源に加えて、胃十二指腸動脈および右胃動脈をマイクロコイルで塞栓する。同じ動脈アクセス手順を、構築物CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(配列番号1727)を発現するT細胞を投与するために行う。T細胞を0日目に患者から収集し、構築物CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PACをコードするレンチウイルスに感染させ、前実施例に記載されるように拡大させる。CAR-T細胞を、用量漸増様式で、14日目(107個のCAR-T細胞)、28日目(108個のCAR-T細胞)、および44日目(109個のCAR-T細胞)に投与する。CAR-T細胞を、2cc/秒未満の速度で60ccシリンジにより手動で注射する。総注入体積は、およそ100ccである。較正コントラスト比での血管造影を第1の50cc注入後およびCAR-T注入の終了時に行い、動脈流が保たれていることを確認する。可能な場合、注入物を適切な肝動脈に送達する。ある特定の患者は、右肝動脈または左肝動脈のいずれかが適切な肝動脈から生じない異常な肝動脈内解剖学的形態を有し得る。かかる場合、CAR-T細胞の用量を肺葉体積計算に基づいて分割する。かかる場合、分割用量を右肝動脈および左肝動脈に別個に送達して、両肝葉への比例したCAR-T送達を確実にする。
CAR-T細胞の腹腔内投与
CAR-T細胞を、本質的にKoneru M et alに記載されるように(Journal of Translational Medicine;2015;13:102)、腹腔内投与することもできる。以下の実施例では、葉酸受容体アルファ(FR1)を発現する卵巣癌を伴う腹膜病変を有する患者にこのアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載の他の腫瘍抗原を標的とするCAR-T細胞を腹腔内注入することができる。
CAR-T細胞を、本質的にKoneru M et alに記載されるように(Journal of Translational Medicine;2015;13:102)、腹腔内投与することもできる。以下の実施例では、葉酸受容体アルファ(FR1)を発現する卵巣癌を伴う腹膜病変を有する患者にこのアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、本開示に記載の他の腫瘍抗原を標的とするCAR-T細胞を腹腔内注入することができる。
スクリーニングインフォームドコンセントを、再発性高悪性度卵巣癌を有する患者に提示して、患者の癌をFR1の発現について試験する。FR1の発現を免疫組織化学によって確認した後、患者の末梢血から白血球除去療法産物を得る。過度の血小板および赤血球混入物を白血球除去療法産物から除去し、この産物を凍結させる。この研究の治療段階で、白血球除去療法産物を解凍し、洗浄する。その後、CD3+T細胞を、CD3/CD28ビーズを使用した磁気分離によって解凍した白血球除去療法産物から単離する。活性化したT細胞にCD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC構築物をレンチウイルス形質導入し、CD3/CD28ビーズ拡大プロトコルを使用してさらに拡大させる。
保存(パラフィン包埋)または新たに生検した腫瘍の免疫組織化学(IHC)分析によって確認されるFR1抗原を発現することを示す再発性高悪性度卵巣癌、原発性腹膜癌、または卵管癌を有する患者が、この研究に適格である可能性がある。
第1相用量漸増投薬をこの試験に使用する。3~6名の患者のコホートに漸増用量の修飾されたT細胞を注入して、最大耐量(MTD)を確立する。4つの計画用量レベル:3×105、1×106、3×106、および1×107CAR-T細胞/kgがある。コホートIおよびコホートIIを3×105CAR-T細胞/kgで治療するが、コホートIIの患者にはリンパ球枯渇シクロホスファミドも投与する。コホートII~Vには、シクロホスファミドでの前治療後に漸増用量の修飾されたT細胞を投与する。リンパ球枯渇シクロホスファミドを最初のT細胞注入の2~4日前に750mg/m2用量で投与する。標準の3+3用量漸増スキーマに従う。
IPカテーテルを設置した後にT細胞を注入する。患者を入院病棟に入れた後に第1のCAR T細胞注入を行い、第2のCAR T細胞注入の少なくとも3日間は入院を続ける。治療される患者の第1のコホート、および各々のその後のコホートにおける治療される第1の患者を集中治療室(ICU)に入れ、その後の患者を内科的腫瘍学入院患者サービスに入れてもよい(治療医師の臨床上の判断に従う)。
患者は、CAR修飾T細胞での治療を開始する2~4日前に、単回投与によるリンパ球枯渇シクロホスファミド(750mg/m2 IV)化学療法を受ける。形質導入T細胞を、注入前に、数、純度、生存能力、および滅菌について品質試験する。全ての患者に遺伝子修飾されたT細胞用量の50%を静脈内投与する。患者を毒性について注意深く監視する。1~3日後、残りのT細胞用量をIP注入で投与する。少なくとも3名の患者を用量レベル1で治療し、各用量レベル内に1ヶ月当たり2名より多くの患者が発生することはない。前コホートにおける治療された全ての患者を最初のT細胞注入日から最低4週間観察した後、次のコホートへの漸増を行う。治療前および治療後に血液試料を全ての患者から得て、遺伝子修飾されたT細胞の毒性、治療効果、および生存を評価する。
腫瘍内注射のためのCAR-T細胞の使用
CAR-T細胞を、本質的にBrown CE,et al,Clin Cancer Res.2015 September 15;21(18):4062-4072に記載されるように、腫瘍内投与することもできる。以下の実施例では、IL13Ra2を発現する再発性膠芽細胞腫(GBM)を有する患者の場合、このアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、従来のCARを発現するT細胞または他の腫瘍抗原を標的とするアクセサリーモジュール(骨格1~72)を発現する従来のCARを腫瘍内注射することができる。
CAR-T細胞を、本質的にBrown CE,et al,Clin Cancer Res.2015 September 15;21(18):4062-4072に記載されるように、腫瘍内投与することもできる。以下の実施例では、IL13Ra2を発現する再発性膠芽細胞腫(GBM)を有する患者の場合、このアプローチを使用する。本質的に同様のアプローチを使用して、従来のCARを発現するT細胞または他の腫瘍抗原を標的とするアクセサリーモジュール(骨格1~72)を発現する従来のCARを腫瘍内注射することができる。
パイロット安全性および実現可能性研究を行って、再発性GBMにおけるCD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(配列番号1769)を発現するT細胞を試験する。全ての参加患者は、書面によるインフォームドコンセントを提出するよう義務付けられている。臨床プロトコルは、University of Southern California Institutional Review Boardに認可されたものであり、この臨床プロトコルをInvestigational New Drug Applicationの下で行われ、ClinicalTrials.govに登録する。適格な患者には、腫瘍が心室/CSF経路との伝達を示さず、かつ切除術に適している再発性または難治性単巣性テント上グレードIIIまたはIV神経膠腫を有する成人(18~70歳)が含まれる。この試験への参加は、IL13Rα2(またはIL13Ra2)腫瘍抗原状態とは無関係である。患者を高悪性度神経膠腫(WHOグレードIIIまたはIV)の初期診断後に登録し、この時点で、白血球除去療法を受けて、末梢血単核細胞(PBMC)を収集する。前述の実施例に記載されるように対応するレンチウイルスベクターに感染させた後に、これらの細胞を使用して、ピューロマイシン耐性遺伝子(PAC)を含む構築物CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PACを発現させるようにT細胞を操作する。あるいは、CAR-T細胞を、レトロウイルスベクター感染後に、またはSleeping Beautyトランスポゾンを使用して、またはIVT mRNAのトランスフェクションによって生成することができる。その後、放出試験後の治療用CAR-T細胞を凍結保存し、後で使用するために保管する。第1の腫瘍再発時に、研究参加者は腫瘍切除術を受け、加えてRickhamリザーバー/カテーテルも設置する。同時に、治療用CAR-T細胞を解凍し、CD3/CD28ビーズベースの急速拡大プロトコルを使用してインビトロで再拡大させる。手術からの回復後およびベースラインMR画像法後、CAR-T細胞を、本質的に説明されているように(Brown CE,et al,Clin Cancer Res.2015 21(18):4062-4072)、留置カテーテルを介して切除空洞に直接投与する。細胞を、21ゲージの翼状針を使用してRickhamリザーバーに手動で注入して、2mL体積を5~10分間にわたって送達し、その後、2mLの防腐剤を含まない正常生理食塩水で5分間にわたって洗い流す。プロトコル治療計画は、12回のCAR T細胞用量の毎週治療サイクルから成る5週間期間にわたる頭蓋内投与を目標とする患者内用量漸増スケジュールを指定する。サイクル1、2、4、および5の期間中、T細胞注入をサイクル週の1、3、および5日目に行い、3週目が休止サイクルである。安全のために、サイクル1では、1注入当たり107、5×107、および108細胞のCAR T細胞用量を、それぞれ、1、3、および5日目に投与する患者内用量漸増戦略を使用し、その後、108細胞の9回の追加のCAR T細胞注入を4週間にわたって行う。応答を評価するための画像化を、3週目の休止サイクル中および5週目以降に行う。毒性監視および有害事象報告について、NCI Common Toxicity Criteriaバージョン2.0(https://ctep.ifo.nih.gov/l)に提供されるガイドラインに従う。
移植前の骨髄または末梢血幹細胞調製物のエクスビボパージのためのCAR-T細胞の使用
CAR T細胞を使用して、幹細胞移植前にがん細胞の骨髄または末梢血幹細胞調製物をパージすることができる。以下の実施例では、CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(配列番号1699)を発現するT細胞を使用して、自己幹細胞(または骨髄)移植前に多発性骨髄腫を有する患者から得た骨髄または末梢血幹細胞をパージする。
CAR T細胞を使用して、幹細胞移植前にがん細胞の骨髄または末梢血幹細胞調製物をパージすることができる。以下の実施例では、CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(配列番号1699)を発現するT細胞を使用して、自己幹細胞(または骨髄)移植前に多発性骨髄腫を有する患者から得た骨髄または末梢血幹細胞をパージする。
患者は白血球除去療法を受けて、末梢血単核細胞(PBMC)を収集する。T細胞を、CD3ビーズを使用して精製する。前述の実施例に記載されるように対応するレンチウイルスベクターに感染させた後に、これらの細胞を使用して、CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC CARを発現させるようにT細胞を操作する。その後、放出試験後の治療用CAR-T細胞を凍結保存し、後で使用するために保管するか、または新鮮な状態で使用する。骨髄細胞および末梢血前駆細胞産物を、標準の手順に従って多発性骨髄腫を有する患者から収集する。末梢血幹細胞の動員のために、患者に、シクロホスファミド(3gm/m2)を投与し、その後、G-CSF(10μg/kg)をシクロホスファミド投与の24時間後から開始してフェレーシスが完了するまで毎日皮下投与する。末梢血CD34+-細胞計数が15細胞/μLになった時点で、末梢血幹細胞を収集する。収集目標は、処理後に最低2.0回の106 CD34+細胞/kgに達するまで1日3つの血液量を処理することである。Miltenyi Biotec製のCliniMACS Prodigy(登録商標)Systemを使用し、製造業者の推奨に従って、骨髄および末梢血幹細胞産物から赤血球を任意選択的に枯渇させ、かつ/またはCD34発現細胞を富化する。これらの産物を新鮮な状態で、または凍結保存した状態で使用して、エクスビボパージする。パージのために、骨髄または末梢血幹細胞産物を、100IUの組換えヒト-IL2で置き換えたXVIVO培地(Lonza)内で、解凍したCAR-T細胞と5:1~30:1の範囲のエフェクター:標的比で4~24時間共培養する。細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で培養する。共培養期間の終了時、細胞の一定分量を採取して、滅菌および品質検査(CFU-GMの測定ならびにCD34およびCD138陽性細胞のフローサイトメトリーを含む)を行う。残りの試料を、以前に骨髄破壊的化学療法(例えば、2回の分割用量70mg/m2、総用量140mg/m2の高用量メルファラン)を受けた患者に静脈内投与する。
二重特異性T細胞エンゲージャーの使用
二重特異性T細胞エンゲージャーによってコードされたタンパク質を、表13に列記される配列番号を有する構築物を使用してHela細胞に発現させる。標準のタンパク質精製技法を使用して、タンパク質を、金属親和性タグまたはStrepTag IIカラムを使用して精製する。精製したタンパク質を第1相臨床試験において試験する。当該技術分野で既知の異なるアッセイを使用して、患者を二重特異性抗体の標的抗原の発現に基づいて選択する。二重特異性抗体を24時間注入によって投与する。毒性監視および有害事象報告について、NCI Common Toxicity Criteria version 2.0(http[s://]ctep.ifo.nih.gov/l)に提供されるガイドラインに従う。
二重特異性T細胞エンゲージャーによってコードされたタンパク質を、表13に列記される配列番号を有する構築物を使用してHela細胞に発現させる。標準のタンパク質精製技法を使用して、タンパク質を、金属親和性タグまたはStrepTag IIカラムを使用して精製する。精製したタンパク質を第1相臨床試験において試験する。当該技術分野で既知の異なるアッセイを使用して、患者を二重特異性抗体の標的抗原の発現に基づいて選択する。二重特異性抗体を24時間注入によって投与する。毒性監視および有害事象報告について、NCI Common Toxicity Criteria version 2.0(http[s://]ctep.ifo.nih.gov/l)に提供されるガイドラインに従う。
CAR組み合わせの使用
中皮腫および膠芽細胞腫を有する患者に、メソテリン(中皮腫に発現)、IL13Ra2(膠芽細胞腫に発現)、および造血マーカー(CD19、CD20、CD22、BCMA)を標的とするCARの組み合わせをコードするレンチウイルスに感染させたT細胞を投与する。T細胞は、野生型TCR鎖のものであるか、またはCRISP/Cas9アプローチによってノックアウトされたTCRα鎖を有するかのいずれかである。メソテリンを標的とするCAR、CD19、CD20、CD22、またはBCMAを標的とするCARの野生型TCR鎖との同じT細胞における共発現により、メソテリンのみの発現と比較して、インビボでのT細胞拡大の増加がもたらされることが観察される。膠芽細胞腫を標的とするCARでも本質的に同様の結果が得られる。しかしながら、TCR鎖が欠損したT細胞において、TFPベースのCD20(配列番号9660)を標的とするCARの共発現が、インビボ拡大を誘導することができない一方で、SIR(配列番号9668)またはAb-TCR(配列番号9676)ベースのCARの共発現は、T細胞拡大を誘導することができる。
中皮腫および膠芽細胞腫を有する患者に、メソテリン(中皮腫に発現)、IL13Ra2(膠芽細胞腫に発現)、および造血マーカー(CD19、CD20、CD22、BCMA)を標的とするCARの組み合わせをコードするレンチウイルスに感染させたT細胞を投与する。T細胞は、野生型TCR鎖のものであるか、またはCRISP/Cas9アプローチによってノックアウトされたTCRα鎖を有するかのいずれかである。メソテリンを標的とするCAR、CD19、CD20、CD22、またはBCMAを標的とするCARの野生型TCR鎖との同じT細胞における共発現により、メソテリンのみの発現と比較して、インビボでのT細胞拡大の増加がもたらされることが観察される。膠芽細胞腫を標的とするCARでも本質的に同様の結果が得られる。しかしながら、TCR鎖が欠損したT細胞において、TFPベースのCD20(配列番号9660)を標的とするCARの共発現が、インビボ拡大を誘導することができない一方で、SIR(配列番号9668)またはAb-TCR(配列番号9676)ベースのCARの共発現は、T細胞拡大を誘導することができる。
上述の様々な方法および技法は、本出願を行うためのいくつかの方法を提供する。言うまでもなく、記載される全ての目的または利点が必ずしも本明細書に記載のいずれかの特定の実施形態に従って達成され得るわけではないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、それらの方法が、必ずしも本明細書で教示または提案される他の目的または利点を達成することなく、本明細書で教示される1つの利点または一群の利点を達成または最適化する様式で行われ得ることを認識する。様々な代替案について本明細書で言及されている。いくつかの好ましい実施形態が、1つの、別の、またはいくつかの特徴を具体的に包含する一方で、他の実施形態は、1つ、別の、またはいくつかの特徴を具体的に除外し、さらに他の実施形態は、1つ、別の、またはいくつかの有利な特徴の包含によって特定の特徴を軽減することを理解されたい。
さらに、当業者であれば、異なる実施形態からの様々な特徴の適用性を認識する。同様に、当業者であれば、上述の様々な要素、特徴、およびステップ、ならびに各々のかかる要素、特徴、またはステップの他の既知の等価物を様々な組み合わせで用いて、本明細書に記載の原理による方法を行うことができる。様々な要素、特徴、およびステップのうち、多様な実施形態では、いくつかは具体的に包含され、他のものは具体的に除外される。
本開示を例証するために、いくつかの実施形態が上述されている。以下の特許請求の範囲は、出願人が自身の発明とみなすものをさらに記載する。
Claims (69)
- (i)少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および(ii)NF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化する少なくとも1つの天然に存在しない薬剤を発現する免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体が、少なくとも1つの抗原結合ドメインおよび少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体が、少なくとも1つのTCR関連シグナル伝達モジュールを動員することができる、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)または組換えTCRである、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体の前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される抗原に結合する、請求項2に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、vFLIP K13、K13-opt、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、NF-κBを選択的に活性化することができる任意の遺伝子編集系、それらの任意の相同体またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、非ウイルス起源のものである、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、遺伝子編集系である、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、NEMO/IKKγのオリゴマー化を誘導する、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、IKK複合体の活性化を誘導する、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる少なくとも1つの前記天然に存在しない薬剤が、AKT経路を活性化しない、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、構成的または誘導的様式で発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、過渡的に発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、安定的に発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤の活性が、前記細胞を化合物と接触させることによって翻訳後に制御される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、スイッチドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- NF-κB経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤の活性が、前記スイッチドメインの二量体化を誘導する化合物の治療有効量を投与することによって翻訳後レベルで制御される、請求項9に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記スイッチドメインが、FKBP12ドメインの1つ以上のコピーを含む、請求項16または17に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記化合物が、AP20187またはRimiducidまたはそれらの相同体である、請求項15に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記免疫細胞が、Tリンパ球(T細胞)、CAR-T細胞、TCR発現T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、組織常在性リンパ球、幹細胞、誘導多能性幹細胞、またはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記免疫細胞が、機能的天然T細胞受容体(TCR)シグナル伝達複合体および/またはβ2マイクログロブリンを欠くように操作されている、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの薬剤が、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの薬剤の発現が、前記TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる、請求項1および21に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- がん、感染性疾患、免疫疾患、およびアレルギー性疾患の群から選択される疾患の予防および治療のために使用される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 少なくとも1つのポリヌクレオチドが、前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードし、単一のプロモーターから発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体およびNF-κBシグナル伝達経路を選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドが、2つ以上の別個のプロモーターを使用して発現される、請求項1に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、NF-κBを選択的に活性化することができる前記天然に存在しない薬剤をコードする第2の核酸配列とは別個の前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体をコードする第1の核酸コード配列を含み、それにより、前記第1の核酸コード配列および前記第2の核酸コード配列の発現時に、天然に存在しない免疫受容体とNF-κBを選択的に活性化することができる天然に存在しない薬剤とが物理的または化学的に連結されないようになる、請求項24または25に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤をコードするポリヌクレオチド(複数可)が、内在性TCR遺伝子にクローン化され、それにより、前記少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体および/またはNF-κBを選択的に活性化することができる前記少なくとも1つの天然に存在しない薬剤が、前記TCR遺伝子の内在性調節要素/プロモーターの制御下に置かれるようになる、請求項24または25に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 前記TCR遺伝子の1つ以上の定常鎖が、機能的に再発現される、請求項21または27に記載の免疫細胞またはその免疫細胞集団。
- 少なくとも1つの天然に存在しない免疫受容体をコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドであって、
(a)内在性タンパク質の一部または全ての膜貫通および/または細胞質ドメインならびに任意選択的に細胞外ドメインをコードする第1の核酸ドメインであって、前記内在性タンパク質がリンパ球の表面に発現され、前記リンパ球の活性化および/または増殖を誘発する、第1の核酸ドメインと、
(b)任意選択的に、ポリヌクレオチドaリンカーと、
(c)前記第1の核酸ドメインに作動可能に連結された第2の核酸ドメインであって、1つ以上の非天然TCR抗原結合ドメインをコードする、第2の核酸ドメインと、
(d)共刺激ドメインをコードする任意選択的な第3の核酸ドメインと、
(e)アクセサリーモジュールをコードする任意選択的な追加の核酸ドメインと、を含む、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド。 - 少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドであって、
a)天然に存在しない免疫受容体をコードする第1の核酸と、
b)選択的NF-κB活性化因子を含むアクセサリーモジュールをコードする第2の核酸と、を含む、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド。 - 前記第1の核酸および前記第2の核酸が、切断可能なペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドリンカーによって分離されている、請求項30に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド。
- 前記第1の核酸および前記第2の核酸が別個のベクターから発現されるように2つの組換えポリヌクレオチドを含む、請求項30に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド。
- 前記選択的NF-κB活性化因子が、天然に存在しない選択的NF-κB活性化因子である、請求項30に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド。
- 前記天然に存在しない免疫受容体が、CAR、Ab-TCR、TFP、cTCR、SIR、および組換えTCRからなる群から選択される、請求項30に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記天然に存在しない免疫受容体が、(i)細胞外抗原特異的ドメイン、(ii)膜貫通ドメイン、および(iii)免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含む任意選択的な細胞内シグナル伝達ドメインを含み、(iii)が、前記天然に存在しない免疫受容体のC末端に位置する、請求項30に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の発現時に、前記天然に存在しない免疫受容体と前記選択的NF-κB活性化因子ポリペプチドとが物理的または化学的に連結されない、請求項30に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記細胞外抗原特異的ドメインが、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS1(CD2サブセット1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ(FRaまたはFR1);葉酸受容体ベータ(FRb);受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);AFP/MHC複合体;上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);WT1/MHC I複合体;癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);NY-ESO-1/MHC I複合体、癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビン;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);HPV E6/MHC I複合体;ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);HPV E7/MHC I複合体;AFP/MHC I複合体;Ras/MHC I複合体;腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原);フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、Claudin18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原のうちのいずれか1つ以上に結合する、請求項35に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記選択的NF-κB活性化因子が、vFLIP K13、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、FKBPx2-RIP-ID、IKK1、FKBPx2-IKKa、IKK2、FKBPx2-IKK2、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、NF-κBを選択的に活性化することができる遺伝子編集系、NF-κBを選択的に活性化するRNA干渉系、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項30に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記選択的NF-κB活性化因子が、FKBPドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される、請求項37に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド。
- 前記細胞外抗原特異的ドメインが、
-所定の標的抗原に特異的な抗体またはその断片の重鎖(vH)の可変領域、
-所定の標的抗原に特異的な抗体またはその断片の軽鎖(vL)の可変領域、
-所定の標的抗原に特異的な一本鎖可変断片(scFv)またはその断片、
-所定の標的抗原に特異的な抗体断片(例えば、Fv、Fab、a(Fab’)2)、
-所定の標的抗原に特異的な単一ドメイン抗体(SDAB)断片、
-所定の標的抗原に特異的なラクダ類vHHドメイン、
-所定の標的抗原に特異的な非免疫グロブリン抗原結合足場、
-所定の標的抗原に特異的な受容体またはその断片、
-所定の標的抗原に特異的なリガンドまたはその断片、
-1つ以上の所定の標的抗原に特異的な二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、二重特異性scFV、二重特異性vHH、二重特異性SDAB、二重特異性非免疫グロブリン抗原結合足場、二重特異性受容体、または二重特異性リガンド、および
-自己抗原またはその断片からなる群から選択される、請求項35に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項30~40のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、少なくとも1つのベクター。
- 前記ベクターが、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Sleeping Beautyトランスポゾンベクター、およびPiggyBacトランスポゾンベクターからなる群から選択される、請求項41に記載の少なくとも1つのベクター。
- 請求項30~40のいずれかに記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドを含む、免疫エフェクター細胞または幹細胞。
- 請求項41に記載の少なくとも1つのベクターを含む、免疫エフェクター細胞または幹細胞。
- 請求項42に記載の少なくとも1つのベクターを含む、免疫エフェクター細胞または幹細胞。
- 請求項41に記載の少なくとも1つのベクターを含む、抗原提示細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞が、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、ヒトT細胞、ヒトNKT細胞もしくは合成T細胞、NK細胞、または幹細胞であり、任意選択的に、前記T細胞が、ジアグリセロールキナーゼ(DGK)および/またはIkaros欠損性および/またはBrd4欠損性である、請求項43~45のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞または幹細胞。
- (i)発現している免疫細胞の寿命を延長させ、(ii)免疫細胞の増殖を刺激し、(iii)免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激し、(iv)免疫細胞による抗原提示を増強し、(v)免疫細胞をアポトーシスから保護するための方法であって、前記免疫細胞を、選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質転換することを含む、方法。
- 前記選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドが、vFLIP K13、K13-opt、NEMO突然変異体、NEMO融合タンパク質、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任意のNF-κB活性化タンパク質またはタンパク質断片、NF-κB経路阻害剤の任意の阻害剤、それらの任意の相同体またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項48に記載の方法。
- 前記選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドが、構成的または誘導的様式で発現される、請求項49に記載の方法。
- 前記選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドが、前記T細胞を化合物と接触させることによって翻訳後に制御される、請求項50に記載の方法。
- 前記選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドが、FKBPドメインの1つ以上のコピーを有する融合構築物として発現される、請求項50に記載の方法。
- 前記選択的NF-κB活性化因子またはNF-κB特異的刺激ポリペプチドの活性が、前記FKBPドメインの二量体化を誘導する化合物の治療有効量を投与することによって翻訳後レベルで制御される、請求項52に記載の方法。
- 前記化合物が、AP20187またはRimiducidである、請求項51に記載の方法。
- 天然に存在しない免疫受容体を発現する免疫エフェクター細胞を作製する方法であって、請求項41に記載の少なくとも1つのベクターまたは請求項29に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドを、天然に存在しない免疫受容体が発現されるような条件下で、免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる造血幹細胞もしくは前駆細胞に導入することを含み、前記免疫エフェクター細胞が、NFkB特異的刺激ポリペプチドを欠くCAR-T細胞と比較して、(i)延長された寿命、(ii)改善されたT細胞増殖、および/または(iii)減少したアポトーシスを含む、方法。
- a)免疫エフェクター細胞の集団を提供することと、
b)前記集団から調節性T細胞を除去し、それにより、調節性T細胞枯渇集団を提供することと、をさらに含み、
ステップa)およびステップb)が、前記CARおよび/または前記NFkB特異的刺激ポリペプチドをコードする前記ベクターまたは前記組換えポリヌクレオチドを前記集団に導入する前に行われる、請求項55に記載の方法。 - 前記調節性T細胞が、抗CD25抗体または抗GITR抗体を使用して前記細胞集団から除去される、請求項56に記載の方法。
- a)免疫エフェクター細胞の集団を提供することと、
b)前記集団からP-糖タンパク質(P-gpまたはPgp;MDR1、ABCB1、CD243)陽性細胞を富化し、それにより、P-糖タンパク質(P-gpまたはPgp;MDR1、ABCB1、CD243)富化細胞集団を提供することと、をさらに含み、
ステップa)およびステップb)が、前記CARおよび/または前記NFkB特異的刺激ポリペプチドをコードする前記ベクターまたは前記組換えポリヌクレオチドを導入する前または導入した後に行われる、請求項55に記載の方法。 - 前記P-糖タンパク質陽性細胞が、
i)P-糖タンパク質特異的抗体のうちの1つまたはそのカクテルを使用した免疫選択、
ii)P-糖タンパク質がポンプとして活性である条件下での、P-糖タンパク質の基質である蛍光色素、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、アドリアマイシン、およびアクチノマイシン-D)のうちの1つ以上での染色、および前記色素でわずかに染色される細胞の富化、
iii)P-糖タンパク質の基質である光毒性化合物、例えば、TH9402、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸メチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸エチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸オクチルエステル塩酸塩、2-(4,5-ジブロモ-6-アミノ-3-イミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸n-ブチルエステル塩酸塩、2-(6-エチルアミノ-3-エチルイミノ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸n-ブチルエステル塩酸塩、またはそれらの誘導体もしくはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上に耐性を示す細胞の選択、および
iv)P-糖タンパク質の基質である細胞毒性化合物、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、パクリタキセル、ミトキサントロン、エトポシド、アドリアマイシン、ダウノルビシン、およびアクチノマイシン-Dに耐性を示す細胞の選択からなる群から選択される方法のうちのいずれか1つ以上を使用して富化される、請求項58に記載の方法。 - RNA操作細胞の集団を生成する方法であって、インビトロ転写RNA(複数可)または合成RNA(複数可)を細胞または細胞集団に導入することを含み、前記RNA(複数可)が、組換えポリヌクレオチドまたは請求項30に記載のポリヌクレオチドを含む、方法。
- 対象に抗疾患免疫を提供する方法であって、前記対象に、請求項43~47のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生み出すことができる幹細胞の有効量を投与することを含み、前記細胞が、免疫エフェクター細胞を生み出すことができる、自己T細胞もしくは同種T細胞、または自己NKT細胞もしくは同種NKT細胞、または自己もしくは同種造血幹細胞、または自己もしくは同種iPSCである、方法。
- 前記同種T細胞または前記同種NKT細胞または造血幹細胞またはiPSCが、機能的TCRまたは機能的HLAの発現を欠くか、またはその低発現を有する、請求項61に記載の方法。
- 天然に存在しない免疫受容体および選択的NFkB活性化因子を含む免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞を生成することができる幹細胞を含む組成物であって、前記天然に存在しない免疫受容体が、疾患関連抗原関連に結合する抗原結合ドメインを含み、前記疾患関連抗原が、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ 3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシル GM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビンg;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原)フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、KSHV-K8.1タンパク質、KSHV-gHタンパク質、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2 OR CLDN18A.2))、P-糖タンパク質、STEAP1、LIV1、ネクチン-4、クリプト、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される、組成物。
- 対象における疾患関連抗原の発現に関連する疾患を治療または予防する方法であって、前記対象に、天然に存在しない免疫受容体および選択的NFkB活性化因子を含む免疫エフェクター細胞の有効量を投与することであって、前記天然に存在しない免疫受容体が、疾患関連抗原関連に結合する抗原結合ドメインを含み、前記疾患関連抗原が、CD5;CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも称される);C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1);CD33;上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRviii);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;急性白血病またはリンパ腫に発現するが、造血前駆細胞には発現しないグリコシル化CD43エピトープ、非造血癌に発現するグリコシル化CD43エピトープ、癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Ra2またはCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体アルファ(IL-llRa);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(TestisinまたはPRSS21);血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1(細胞表面結合型)(MUC1);上皮成長因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸ホスファターゼ(PAP);伸長因子2突然変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAlX);プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニットベータ型9(LMP2);糖タンパク質100(gpl00);切断点クラスター領域(BCR)およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質;チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoH糖セラミドの六糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座バリアント遺伝子6(染色体12pに位置)(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリーメンバーlA(XAGEl);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;スルビビンg;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-1またはガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanAまたはMARTI);ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンBl;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来相同体(MYCN);Ras相同体ファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);シトクロムP450 lB 1(CYPlB 1);CCCTC結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORISまたはインプリント部位の調節因子の同胞)、T細胞によって認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TESl);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6);ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIRl);IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89);白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLLl)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRアルファ4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9;シアリルルイス抗原)フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマ-デルタ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-アルファ)、TGFベータR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-ベータ1鎖、TCR-ベータ2鎖、TCR-ガンマ鎖、TCR-デルタ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、A型インフルエンザ赤血球凝集素(HA)、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC(GCC)、KSHV-K8.1タンパク質、KSHV-gH タンパク質、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2(CLD18A2 OR CLDN18A.2))、P-糖タンパク質、STEAP1、LIV1、ネクチン-4、クリプト、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される、投与することを含み、
それにより、前記対象を治療するか、または前記対象における疾患を予防する、方法。 - 前記疾患関連抗原の発現に関連する前記疾患が、前記疾患関連抗原の発現に関連する、増殖性疾患、前がん状態、がん、および非がん関連適応症からなる群から選択される、請求項63または64に記載の使用または方法。
- 前記がんが、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、または前白血病のうちの1つ以上から選択される血液学的癌である、請求項65に記載の使用または方法。
- 前記がんが、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、環境誘発癌、前記癌の組み合わせ、および前記癌の転移病巣からなる群から選択される、請求項65に記載の使用または方法。
- 前記疾患が、HIV1、HIV2、HTLV1、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス8インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスによる感染に関連するか、またはmycobacterium tuberculosis、非定型マイコバクテリア種、Pneumocystis jirovecii、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ケカビ、またはカンジダによる感染に関連する、請求項65に記載の使用または方法。
- 前記疾患が、真性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、SLE、サルコイドーシス、強皮症、混合結合組織病、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない免疫疾患または変性疾患である、請求項65に記載の使用または方法。
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