CN115558021B - 一种转录因子、重组细胞及其在制备肿瘤治疗药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种转录因子、重组细胞及其在制备肿瘤治疗药物的应用。重组细胞为含有染色体整合多核苷酸分子的NK细胞；或含有重组表达载体的NK细胞，重组表达载体中包括表达载体和多核苷酸分子，所述多核苷酸分子用于编码转录因子，所述转录因子在c‑Myc^WT的第143位、第157位、第317位和第323位的赖氨酸突变为谷氨酰胺。本发明通过c‑Myc^4Q基因修饰NK细胞，能够提高c‑Myc蛋白的表达，显著促进NK细胞功能，特别是能够抵抗高脂环境对NK细胞功能的抑制效应、提高其肿瘤治疗效果。

Description

一种转录因子、重组细胞及其在制备肿瘤治疗药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种转录因子、重组细胞及其在制备肿瘤治疗药物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

自然杀伤(NK)细胞是天然免疫系统的重要组成部分，是肿瘤免疫监测的关键。NK细胞是抗肿瘤免疫反应中的快速反应者，通过产生细胞毒颗粒或炎性细胞因子直接杀伤肿瘤细胞。因此，NK细胞成为肿瘤免疫治疗的有力工具。游离脂肪酸在肿瘤微环境中的积累抑制了抗肿瘤免疫，从而导致了肿瘤中免疫细胞的功能障碍。在许多类型的实体瘤中，例如黑色素瘤、肾癌、肺癌和乳腺癌，NK细胞功能被抑制、数目减少。高比例的肿瘤浸润性NK细胞与良好的生存期有关。然而，NK细胞在实体肿瘤中的疗效仍然很差，因此，迫切需要开发一种潜在的免疫治疗策略来克服高脂状态下的NK细胞功能障碍。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种转录因子、重组细胞及其在制备肿瘤治疗药物的应用，本发明通过c-Myc^4Q基因修饰NK细胞，能够提高c-Myc蛋白的表达，显著促进NK细胞功能，特别是能够抵抗高脂环境对NK细胞功能的抑制效应、提高其肿瘤治疗效果。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

首先，c-Myc是一种重要的转录因子，参与调控众多基因的表达，在细胞生长、分化、代谢和死亡等生命活动中发挥至关重要的作用。本发明前期发现，高脂状态下NK细胞中c-Myc蛋白乙酰化修饰水平降低、泛素化修饰水平升高，蛋白半衰期缩短。

因而，本发明第一方面，一种转录因子，在c-Myc^WT的第143位、第157位、第317位和第323位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，所述c-Myc^WT的NCBI登录号为BAI46221.1。

本发明在c-Myc^WT的基础上进行上述突变，即获得c-Myc^4Q，在转染NK细胞后能够提高c-Myc蛋白的表达，显著促进NK细胞功能，特别是能够抵抗高脂环境对NK细胞功能的抑制效应、提高其肿瘤治疗效果。

第二方面，一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码上述转录因子。

第三方面，一种重组表达载体，包括表达载体和上述多核苷酸分子，所述多核苷酸分子连接在表达载体上。

具体地，表达载体为病毒载体、噬菌体、黏粒、F黏粒、质粒或人工染色体。所述病毒载体可以为慢病毒载体pUltra等。

第四方面，一种宿主细胞，所述宿主细胞含有整合上述多核苷酸分子的染色体或上述重组表达载体。

具体地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

第五方面，一种制备上述转录因子的方法，提供上述多核苷酸分子，将多核苷酸分子克隆至表达载体获得上述重组表达载体，将上述重组表达载体转染到宿主细胞，从而表达出所述转录因子。

第六方面，一种重组细胞，其为含有染色体整合上述多核苷酸分子的NK细胞；或含有重组表达载体的NK细胞。

第七方面，一种重组细胞的制备方法，将多核苷酸分子克隆至表达载体获得上述重组表达载体，将上述重组表达载体转染到宿主细胞，利用转染后的培养液感染NK细胞，即得。

具体地，转染后进行浓缩，然后感染NK细胞。浓缩后感染NK细胞的效果更好。采用真空高速离心机进行浓缩。

第八方面，一种上述转录因子、多核苷酸分子、重组表达载体、宿主细胞和/或重组NK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。

具体地，所述肿瘤为黑色素瘤、肾癌、肺癌和/或乳腺癌。

具体地，所述肿瘤位于高脂环境中。所述高脂为脂肪酸高于人体血液中脂肪酸的正常标准。

本发明的有益效果为：

经过流式细胞术表明，本发明提供的转录因子（c-Myc^4Q）可显著提高NK细胞干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B水平。经过小鼠体内抗肿瘤实验表明，本发明提供的c-Myc^4Q基因修饰NK细胞的抗肿瘤效果显著增强。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中脂肪酸处理NK细胞的c-Myc稳定性的表征图，A为脂肪酸处理影响NK细胞中c-Myc表达的免疫印迹图，B为脂肪酸联合CHX处理影响NK细胞中c-Myc蛋白半衰期的免疫印迹图，C为脂肪酸联合MG132处理影响NK细胞中c-Myc表达的免疫印迹图，D为脂肪酸处理影响NK细胞中c-Myc蛋白乙酰化修饰的免疫印迹图，E为脂肪酸处理影响NK细胞中c-Myc蛋白泛素化修饰的免疫印迹图；

图2为本发明实施例中脂肪酸处理影响NK细胞中c-Myc富集程度的Chip-qPCR统计图；

图3为本发明实施例中将c-Myc^WT的第143位、第157位、第317位、第323位的四个赖氨酸（K）突变为谷氨酰胺（Q）的示意图；

图4为本发明实施例中pUltra-c-Myc^4Q、pUltra-c-Myc^WT或空载共转染到HEK293T细胞的镜下观察图，图中的标尺均为100 μm；

图5为本发明实施例中构建的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的c-Myc稳定性的表征图，A为脂肪酸处理影响c-Myc^4Q基因修饰NK细胞中c-Myc蛋白表达的免疫印迹图，B为脂肪酸处理影响c-Myc^4Q基因修饰NK细胞中c-Myc乙酰化修饰的免疫印迹图，C为脂肪酸处理影响c-Myc^4Q基因修饰NK细胞中c-Myc泛素化修饰的免疫印迹图；

图6为本发明实施例中构建的c-Myc^4Q基因修饰NK细胞的效应表征图，A为c-Myc^4Q影响NK细胞中干扰素γ含量对比图，B为c-Myc^4Q影响NK细胞中穿孔素含量对比图，C为c-Myc^4Q影响NK细胞中颗粒酶B含量对比图；

图7为本发明实施例中构建的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的在小鼠体内的各组小鼠生存期统计图；

图8为本发明实施例中构建的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的在小鼠体内的各组小鼠第十天和第二十天时活体成像图；

图9为本发明实施例中构建的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的在小鼠体内的各组小鼠的肿瘤负荷图，A为各组小鼠D10的肿瘤负荷图，B为各组小鼠D20的肿瘤负荷图。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中所述c-Myc^WT的NCBI登录号为BAI46221.1。

实施例

一、人NK细胞的获得和培养：

NK-92细胞系：购买于ATCC细胞库，培养于α-MEM+12.5%FBS+12.5% HBS+ 0.2mM肌醇 + 0.1mM 2-巯基乙醇+0.02mM叶酸+100U/ml重组人IL-2的完全培养基中，每3天传代一次。

二、高脂处理导致NK细胞中的c-Myc泛素化水平和乙酰化水平：

将NK细胞用脂肪酸处理，对照组不使用脂肪酸处理，蛋白免疫印迹结果显示，脂肪酸处理组NK细胞中c-Myc蛋白条带灰度值降低，说明c-Myc蛋白表达减少(图1A)。将脂肪酸联合CHX处理NK细胞，对照组不用脂肪酸处理，蛋白免疫印迹结果显示，随着时间增加，脂肪酸联合CHX处理组NK细胞中c-Myc蛋白条带灰度值逐渐降低，并且快于对照组，这说明脂肪酸联合CHX处理能够缩短c-Myc半衰期(图1B)。使用脂肪酸联合MG132处理NK细胞，对照组不使用脂肪酸处理，蛋白免疫印迹结果显示，脂肪酸联合MG132处理组NK细胞中c-Myc蛋白条带灰度值增加，这说明MG132处理能够使NK细胞中c-Myc蛋白积累(图1C)。使用脂肪酸联合MG132处理NK细胞，对照组不使用脂肪酸处理，CO-IP实验结果显示，脂肪酸处理后， c-Myc乙酰化条带的灰度值降低，这说明脂肪酸处理不利于c-Myc稳定(图1D)，c-Myc泛素化条带的灰度值升高，这说明脂肪酸处理促进c-Myc降解(图1E)。将NK细胞用脂肪酸处理，对照组不使用脂肪酸处理，Chip-qPCR结果显示，对照组中c-Myc在干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B启动子区的平均富集倍数分别为20、20、15，而脂肪酸处理组NK细胞中c-Myc在干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B启动子区的平均富集倍数分别为6、7、9，这说明脂肪酸处理后NK细胞中c-Myc在干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B启动子区的富集程度降低(图2)。上述结果提示，高脂状态下NK细胞中c-Myc蛋白乙酰化修饰水平降低、泛素化修饰水平升高，通过影响c-Myc蛋白质的稳定性从而导致NK功能障碍。

三、构建c-Myc^4Q突变体：

为进一步探讨乙酰化修饰对c-Myc稳定性的影响，本实施例开发出能够发生持续乙酰化修饰的c-Myc突变体c-Myc^4Q。利用KOD技术将c-Myc^WT的第143位、第157位、第317位、第323位的四个赖氨酸（K）突变为谷氨酰胺（Q）（图3）。将c-Myc^4Q或c-Myc^WT基因克隆到慢病毒载体pUltra中，然后将pUltra-c-Myc^4Q、pUltra-c-Myc^WT或空载共转染到HEK293T细胞以产生慢病毒颗粒，72小时后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光(图4)。转染72h后，收集含慢病毒的培养液。为了提高病毒液浓度，利用真空高速离心机将慢病毒培养液浓缩以用于后续实验。

四、c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞中的c-Myc稳定性：

分别使用c-Myc^4Q、c-Myc^WT或空载(Con)的慢病毒浓缩液感染NK细胞，分别进行脂肪酸处理，对照组不经过脂肪酸处理。蛋白免疫印迹结果显示，在c-Myc^4Q、c-Myc^WT基因修饰的NK细胞中，c-Myc蛋白条带灰度值增加，这说明c-Myc^4Q、c-Myc^WT均有良好的过表达效果，c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞中c-Myc蛋白条带灰度值更高，并且脂肪酸处理也不影响c-Myc蛋白条带灰度值，这说明c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞中c-Myc表达水平更高并且不受脂肪酸处理的影响(图5A)。对c-Myc^4Q、c-Myc^WT或空载的慢病毒浓缩液感染的NK细胞，使用脂肪酸联合MG132处理，对照组不使用脂肪酸处理， CO-IP结果显示，c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞中c-Myc乙酰化条带的灰度值增加，并且脂肪酸处理也不影响c-Myc乙酰化条带灰度值，这说明c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞中c-Myc乙酰化修饰水平升高且不受脂肪酸处理的影响(图5B)，同时，c-Myc泛素化条带灰度值降低(图5C)。上述结果提示，经过基因工程改造的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞可以增强c-Myc稳定性。

五、c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的效应分子表达：

利用体外实验，进一步明确c-Myc^4Q对于NK细胞功能的影响，分别利用c-Myc^4Q和c-Myc^WT感染的NK细胞，实验组使用脂肪酸处理，对照组不使用脂肪酸处理。流式细胞术结果显示，空载感染NK细胞的对照组产生干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B的百分比分别为9、17、34，脂肪酸处理后分别为6、12、28，c-Myc^4Q感染的NK细胞产生干扰素γ（图6A）、穿孔素（图6B）和颗粒酶B（图6C）的百分比分别为15、24、67，并且不受脂肪酸处理的影响，这说明c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞可显著提高NK细胞干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B水平。上述结果提示，经过基因工程改造的c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞可以增强效应分子的表达。

六、c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞的体内抗肿瘤能力：

使用南京大学模式动物所提供的NSG雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，饲养条件按照SPF级动物标准执行。NSG小鼠经过12周的高脂喂食后，每只小鼠腹腔注射5×10⁶个HepG2-luc细胞进行荷瘤造模，记为day 0，随后小鼠被随机分成三组。然后每组分别在day7尾静脉回输效应细胞：组1回输PBS，体系200μL；组2回输2×10⁶个NK细胞，体系200μL；组3回输2×10⁶个c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞，体系200μL。分别在day 10、day 20进行小鼠活体成像实验。统计结果显示，回输c-Myc^4Q基因修饰NK细胞后小鼠生存期延长（图7）。小鼠活体成像实验结果显示，回输c-Myc^4Q基因修饰NK细胞后小鼠肿瘤荧光强度最弱（图8）。进一步统计结果显示，在day 10（图9A）、day 20（图9B），回输c-Myc^4Q基因修饰NK细胞后，都能明显降低肿瘤负荷。上述结果提示，c-Myc^4Q基因修饰的NK细胞抗肿瘤效果显著增强。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种转录因子，其特征是，在c-Myc^WT的第143位、第157位、第317位和第323位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，所述c-Myc^WT的NCBI登录号为BAI46221.1。

2.一种多核苷酸分子，其特征是，所述多核苷酸分子编码权利要求1所述的转录因子。

3.一种重组表达载体，其特征是，包括表达载体和权利要求2所述的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子连接在表达载体上。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征是，表达载体为病毒载体、质粒或人工染色体。

5.一种宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞含有整合权利要求2所述的多核苷酸分子的染色体或权利要求3或4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

7.一种制备权利要求1所述的转录因子的方法，其特征是，提供权利要求2所述的多核苷酸分子，将多核苷酸分子克隆至表达载体获得权利要求3或4所述的重组表达载体，将所述重组表达载体转染到宿主细胞，从而表达出所述转录因子。

8.一种重组NK细胞，其特征是，其为含有整合权利要求2多核苷酸分子的染色体的NK细胞；或含有权利要求3或4所述的重组表达载体的NK细胞。

9.一种重组NK细胞的制备方法，其特征是，将权利要求2所述的多核苷酸分子克隆至表达载体获得权利要求3或4所述的重组表达载体，将所述重组表达载体转染到宿主细胞，利用转染后的培养液感染NK细胞，即得。

10.一种权利要求1所述的转录因子、权利要求2所述的多核苷酸分子、权利要求3或4所述的重组表达载体、权利要求5或6所述的宿主细胞和/或权利要求7所述的重组NK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。

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