JP2023514337A - 組換えウイルスベクター、それを含む免疫組成物及び用途 - Google Patents

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Abstract

組換えウイルスベクター、これを含む免疫組成物及び用途であって、前記組換えウイルスベクターは、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記サイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦから１つ又は複数選ばれる。当該組換えウイルスベクターは、抗腫瘍ワクチンの製造に使用できる。【選択図】なし

Description

本発明は、分子生物学及び免疫学の分野に属する。具体的には、本発明は、組換えウイルスベクター、それを含む免疫組成物及び用途に関し、特に、様々な腫瘍の予防及び／又は治療に用いる抗腫瘍ワクチンの製造に使用できる組換えウイルスベクターに関する。
腫瘍生物学及び免疫学の発展に伴い、腫瘍免疫療法は大きな進歩を遂げ、現在は腫瘍治療の発展において大きな方向性になってきている。特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法が大きな成功を収めるのに伴い、腫瘍免疫療法の開発は現在腫瘍治療の新たな標的として注目を浴びている。
抗腫瘍ワクチンは、腫瘍に対する体内の特異的免疫応答を刺激して、多くの活性化免疫細胞を生成させることにより、腫瘍細胞を殺し腫瘍細胞の成長を阻害して、腫瘍成長を低減又は阻害する効果を得る。現在、抗腫瘍ワクチンの開発も腫瘍免疫療法の研究において重点な方向性となっている。
関連の研究によると、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞とヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞が腫瘍拒絶反応において重要な役割を果たすことが判明した。そのため、抗腫瘍ワクチンの殆どは細胞の特異的Ｔ細胞応答を誘導することを目的としている。腫瘍細胞が腫瘍抗原を合成するプロセスで、分解されたポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子によって腫瘍細胞の表面に提示されてＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージを含み、主に特殊な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在し、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。腫瘍細胞が分泌した又は腫瘍溶解で放出された外因性タンパク質はＡＰＣによって捕捉される。ＡＰＣ内では、抗原がポリペプチドフラグメントに処理されてＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋細胞に提示される。活性化された抗原特異的ＣＤ８＋細胞は最終的に細胞傷害性Ｔ細胞になり、腫瘍細胞を溶解する。
腫瘍特異的抗原としては強い免疫原性を有し、腫瘍細胞によって発現されるが、正常な細胞では発現されないというのが望ましい。しかし、腫瘍抗原の殆どは、効果的な免疫応答を誘導するのに十分な免疫原性を備えず、腫瘍抗原の多くはある程度において正常な組織でも発現されるため、生体内の免疫寛容が生じる。したがって、これらの腫瘍抗原は免疫原性が弱いという固有の特徴を有しており、抗腫瘍ワクチンの設計段階では生体の免疫寛容という障壁を乗り越え、腫瘍抗原に対する免疫応答を活性化させる必要がある。
抗腫瘍ワクチンは、主に、全細胞ワクチン、タンパク質ワクチン、ポリペプチドワクチン、ウイルスワクチン、樹状細胞ワクチンに分けられる。ＤＮＡワクチンとＲＮＡワクチンは本質的には分子ワクチンであり、使用する発現系が違うだけである。
細胞ワクチン：これまでに、腫瘍抗原と臨床上の関連性が十分に解明されていないため、全細胞が抗腫瘍ワクチンとして使用され、これで知られていない腫瘍抗原で免疫系を活性化させることができる。マウス腫瘍モデルでは、接種した腫瘍からマウスを保護するために、放射線で不活性化させた腫瘍細胞でマウスを免疫するのが一般的である。しかし、腫瘍細胞ワクチンの投与時間を腫瘍細胞接種１週間後に繰り下げると、ワクチンはマウスを保護する能力を失う。腫瘍細胞ワクチンは臨床治療の反応が鈍いため、特殊な腫瘍抗原を持たない腫瘍患者の再発の予防のみに適用される。進行期患者を対象とする臨床試験で良い効果はあまり得られなかった。近年、腫瘍抗原の認識と解析技術の進歩、特に、Ｔ細胞が抗原を認識するメカニズムへの理解が深まるにつれて、腫瘍抗原ワクチンは細胞ワクチンに代わって腫瘍免疫療法に定着していると言える。
ポリペプチドとタンパク質ワクチン：Ｔ細胞の認識するＭＨＣ分子の表面の抗原ポリペプチドエピトープが一般に７～１２のアミノ酸であるため、抗原ポリペプチドと免疫アジュバントを混合すれば生体内で空のＭＨＣ分子にロードするという目的は果たせる。これまでに、ポリペプチドに基づくワクチンの殆どはＭＨＣクラスＩ抗原拘束性ポリペプチドである。ポリペプチドワクチンの使用にはいくつかの制限がある。使用されるポリペプチドワクチンは患者のＭＨＣクラスＩ抗原分子に適合しなければならず、いわゆる個別化の問題がある。しかし患者によってＭＨＣクラスＩ分子のサブタイプが違うため、使用される腫瘍抗原ポリペプチドの配列も異なり、これは腫瘍抗原ポリペプチドの臨床応用に大きな難題をもたらしている。
組換え分子ワクチン：腫瘍抗原タンパク質ワクチンを用いると上記の難題を克服できるが、タンパク質だけを使うと対象の免疫応答を活性化できない。霊長類動物を用いる試験研究では最良の免疫効果を得るには腫瘍タンパク質と強力な免疫原性タンパク質を共有結合する必要があることが判明した。弱い抗原で効果的な免疫応答を誘導するためには、免疫アジュバントと併用して、免疫系を活性化させるための非特異的シグナルを提供する必要があり、免疫アジュバントの多くは多かれ少なかれ毒性を持っているため臨床では用いられないので、抗原タンパク質ワクチンの殆どは組換え形態で出現している。
組換え形態で腫瘍タンパク質の免疫原性を高める方法とは、組換えにより腫瘍抗原とＧＭ－ＣＳＦやインターロイキンなどのサイトカインから融合タンパク質を形成させることである。弱い腫瘍抗原と、細菌、又はウイルス抗原、又はジフテリア毒素やシュードモナス外毒素などの毒素との組換えが腫瘍抗原の抗原性を明らかに高め、腫瘍抗原に対するＤＣの貪食及び提示を促進することができ、効果が認められる。しかし、腫瘍抗原と毒素と単独の組換えでは、今までに満足のいく効果が得られなかった。
樹状細胞ワクチン：Ｔ細胞が媒介する有効な免疫応答では、Ｔ細胞は抗原をナイーブＴ細胞に提示して、ナイーブＴ細胞に感作させる必要があり、感作させたＴリンパ球が再刺激を受ける。Ｔ細胞が媒介する有効な腫瘍免疫を開始させるには、体内のあらゆる部位の腫瘍抗原ポリペプチドがＴ細胞によって認識される必要がある。そのため、抗原の提示は効果的な免疫応答を得るための重要なステップである。ワクチンから刺激される免疫応答は、主に、ＡＰＣによる効果的な抗原の初期処理と更なる提示に依存している。
インターロイキン７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７、ＩＬ－７）は骨髄と胸腺間質細胞が分泌する造血成長因子である。角化細胞、樹状細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞からも生成されるが、正常なリンパ球はＩＬ－７を分泌しない。ＩＬ－７が造血幹細胞のリンパ系前駆細胞への分化を促進する。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など、リンパ系のあらゆる細胞の増殖を刺激することもできる。特定の段階のＢ細胞の成熟、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ、ＮＫ細胞）の生存、発達、均衡にとって特に重要である。
インターロイキン１５（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１５、ＩＬ－１５）は、ウイルス感染後に単核貪食細胞から分泌産生される。その構造はインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２、ＩＬ－２）に似ており、ＩＬ－１５はＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体β鎖（ＣＤ１２２）と共有受容体γ鎖（ＣＤ１３２）複合体に結合することでシグナルを伝達する。当該サイトカインはＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化と増殖を調節する。抗原が存在しない場合は、ＩＬ－１５はメモリーＴ細胞を維持する生存シグナルを提供できる。ＩＬ－１５に関する前臨床試験では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍効果を高められることが示されている。また、ＩＬ－１５はワクチンアジュバントとして、ワクチンの免疫原性を高めることもできる。
インターロイキン２１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２１、ＩＬ－２１）は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌産生され、免疫系の様々な細胞を調節できる役割を果たす。ＩＬ－２１は持続的にＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を増加させることで抗腫瘍効果を実現できる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１７３（２）：９００－９）。ＩＬ－２１は慢性ウイルス感染の抑制にも重要な役割を果たす。ＨＩＶ感染者において、ＩＬ－２１はＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の応答（Ｂｌｏｏｄ．１０９（９）：３８７３－８０．）及びＮＫ細胞の機能（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．８７（５）：８５７－６７．）を高めることができる。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ－ＣＳＦ）は、コロニー刺激因子２（ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ２、ＣＳＦ２）とも呼ばれ、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、線維芽細胞から分泌産生される単量体糖タンパク質である。ＧＭ－ＣＳＦは、幹細胞を刺激して様々な顆粒球と単球を生成させ、多くのマクロファージを急速に活性化させ増殖させて、抗感染効果を実現するなど、様々な機能を有する。アムジェン社（Ａｍｇｅｎ）によって開発されたＧＭ－ＣＳＦを使用する腫瘍溶解性ウイルス療法は、ＦＤＡによって黒色腫の治療への使用が承認された。
そこで、本発明は、腫瘍抗原の免疫原性を高め、腫瘍特異的免疫応答を刺激して、根本的に腫瘍を治癒するために、複数の免疫関連サイトカインを１つの組換えウイルスベクターに共同で発現させることにより、ワクチンの免疫効果を高め、サイトカインの抗腫瘍効果を発揮させることを課題とする。
本発明の目的は、様々な腫瘍の予防及び／又は治療に用いる抗腫瘍ワクチンの製造に利用できる組換えウイルスベクターを提供することである。
本発明の一実施形態において、前記組換えウイルスベクターは、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明の目的を達成するために下記の用語を次のとおりに定義する。
「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ＣＫ）」とは、刺激で免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）とある非免疫細胞（内皮細胞、表皮細胞、線維芽細胞など）に合成及び分泌された、幅広い生物学的活性を有する一連の小分子タンパク質を指す。サイトカインは一般に対応の受容体に結合して細胞の成長、分化及び効果を制御し、免疫応答を調節する。サイトカインは免疫原、有糸分裂促進因子又は他の刺激物質が様々な細胞を誘導して生成させる低分子量の可溶性タンパク質で、先天性免疫と適応免疫、血球の生成、細胞成長、ＡＰＳＣ多能性細胞に対する調節、損傷組織の修復など様々な機能を有する。サイトカインはインターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分けられる。本発明の実施形態において、前記サイトカインはＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦから１つ又は複数選ばれる。本発明の一実施形態において、前記ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列は配列番号２に示されるとおりであり、好ましくは、それをコードする核酸配列は配列番号１に示されるとおりである。本発明の一実施形態において、前記ＧＭ－ＣＳＦはヒトＧＭ－ＣＳＦであり、好ましくは、前記ヒトＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列は配列番号４に示されるとおりであり、好ましくは、それをコードする核酸配列は配列番号３に示されるとおりである。本発明の一実施形態において、前記ＩＬ－７はヒトＩＬ－７であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列は配列番号６に示されるとおりであり、好ましくは、それをコードする核酸配列は配列番号５に示されるとおりである。本発明の一実施形態において、前記ＩＬ－２１はヒトＩＬ－２１であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列は配列番号８に示されるとおりであり、好ましくは、それをコードする核酸配列は配列番号７に示されるとおりである。本発明の好ましい実施形態において、前記サイトカインはヒトＩＬ－１５、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＩＬ－７、ヒトＩＬ－２１を含み、好ましくは、前記サイトカインをコードするポリヌクレオチドの核酸配列は配列番号１５に示されるとおりであり、好ましくは、それをコードするアミノ酸配列は配列番号１６に示されるとおりである。
「腫瘍抗原」とは、腫瘍が発生又は進行する過程で新たに出現し又は過剰に発現される抗原性物質を指す。腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織分化抗原、プロトオンコウイルス抗原、がん精巣抗原（ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＴ抗原）などを含むが、これらに限定されない。
「腫瘍特異的抗原」（Ｔｕｍｏｒ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＳＡ）とは腫瘍細胞だけで発現され、正常な細胞では発現されない抗原性物質を指す。例えば、変異した抗原、特に、ｒａｓ、ｐ５３などのがん原遺伝子とがん抑制遺伝子の変異産物である。
「腫瘍関連抗原」（Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）とは、腫瘍細胞及び一部の正常な細胞において発現される抗原性物質を指す。
好ましくは、前記ウイルスベクターはワクシニアウイルスベクターであり、好ましくは複製型ワクシニアウイルスベクターであり、例えば、ワクシニアウイルスＴｉａｎｔａｎ株であり、例えば、７５２－１株であり、又は、非複製型ワクシニアウイルスベクターであり、例えば、ワクシニアウイルス弱毒化ワクチンアンカラ株（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ）である。
本発明の更なる目的は、予防及び／又は治療有効量の本発明に係る組換えウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む免疫組成物を提供することである。
本発明の更なる目的は、予防及び／又は治療有効量の本発明に係る組換えウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む抗腫瘍ワクチンを提供することである。
本発明の更なる目的は、本発明に係る組換えウイルスベクターと、免疫組成物又は抗腫瘍ワクチンと、その取扱説明書とを含むキットを提供することである。
本発明は、さらに、腫瘍の治療及び／又は予防薬物又はワクチンの製造における、本発明に係る組換えウイルスベクター、免疫組成物又は抗腫瘍ワクチンの用途を提供する。好ましくは、前記腫瘍は悪性腫瘍である。より好ましくは、前記悪性腫瘍は乳がん又は結腸がんである。
本発明は、さらに、それを必要とする被験者に、予防及び／又は治療有効量の本発明に係る組換えウイルスベクター、免疫組成物又は抗腫瘍ワクチンを投与することを含む腫瘍を治療及び／又は予防する方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は悪性腫瘍であり、より好ましくは、前記悪性腫瘍は乳がん又は結腸がんである。
本発明に係る組換えウイルスベクターは、腫瘍特異的免疫応答を刺激して、腫瘍細胞の成長を効果的に阻害し、腫瘍患者の生存期間を延長することができる。
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳しく説明する。
図１は、サイトカインをコードする配列を備えるシャトルベクターｐＳＣ６５ＣＹのプラスミドマップである。 図２は、サイトカインをコードする配列を備えるシャトルベクターｐＳＣ６５ＣＹの二重酵素消化同定の結果図である。 図３は実施例５におけるヒトＧＭ－ＣＳＦの活性測定結果である。 図４は実施例６におけるヒトＩＬ－２１の活性測定結果である。
以下、実施例を用いて本発明の一層の説明を行う。なお、実施例は、本発明を限定するではなく、本発明の更なる説明に供するものに過ぎない。
特段の定義がない限り、本明細書で使用する科学技術用語は当業者が一般的に理解しているのと同じ意味である。実験又は実際の使用でここに記されるものに似にている又は同じ方法と材料を使用してもよいが、本明細書では材料と方法の説明を提供する。矛盾が生じる場合は、本明細書の定義に準拠する。また、材料、方法とその例は、限定を加えるのではなく、説明に供するものである。
実施例１：シャトルベクターｐＳＣ６５ＣＹの構築
ヒトサイトカインのアミノ酸とその核酸配列は全てＮＣＢＩデータベースから提供される。ヒトサイトカインＩＬ－１５（ＮＭ＿０００５８５．４、核酸配列は配列番号１参照、アミノ酸配列は配列番号２参照）、ＧＭ－ＣＳＦ（ＮＭ＿０００７５８．３、核酸配列は配列番号３参照、アミノ酸配列は配列番号４参照）、ＩＬ－７（ＮＭ＿０００８８０．３、核酸配列は配列番号５参照、アミノ酸配列は配列番号６参照）、ＩＬ－２１（ＮＭ＿００１２０７００６．２、核酸配列は配列番号７参照、アミノ酸配列は配列番号８参照）の配列から終止コドンを除去して直列に接続させ、各サイトカインの核酸配列の間には当業者に熟知されるＰ２Ａ核酸配列が介在し（核酸配列は配列番号９に示され、アミノ酸配列は配列番号１０に示され、内因性プロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質を効果的に切断して、活性のあるサイトカインモノマーを形成することができる。文献「Ｋｉｍ ＪＨ，Ｌｅｅ Ｓ－Ｒ，Ｌｉ Ｌ－Ｈ，Ｐａｒｋ Ｈ－Ｊ，Ｐａｒｋ Ｊ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｉｇｈ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａ ２Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ Ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）：ｅ１８５５６．」を参照する）、最後に、マーカーをスクリーニングするために当業者に熟知される緑色蛍光タンパク質核酸発現配列ＥＧＦＰ（核酸配列は配列番号１１参照、アミノ酸配列は配列番号１２参照）と直列に接続させて、最終的に４重サイトカイン核酸発現配列ＣＹ（核酸配列は配列番号１３参照、アミノ酸配列は配列番号１４参照）を形成させた。蘇州金唯智公司が合成した配列を、分子クローニング技術によりシャトルベクターｐＳＣ６５（ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号３０３２７）上のＸｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩ制限部位の間に挿入して、４つのサイトカインを発現できるシャトルベクターｐＳＣ６５ＣＹ（プラスミドマップは図１参照）を構築し、配列決定で正しいと判定したらウエアハウスに入れた。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ ＶでベクターｐＳＣ６５ＣＹ（酵素消化系は表１参照）を同定し、酵素消化同定の結果図は図２であった。
Figure 2023514337000001
実施例２：組換えワクシニアウイルスベクターｒｖｖ－ＣＹの構築
１４３Ｂ細胞において組換えワクシニアウイルスベクターを得、方法は具体的に次のとおりである。初日に、６ウェル細胞培養プレート（ＪＥＴ、ＴＣＰ－０１０－００６）に１×１０6／ウェルで１４３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８３０３）をプレーティングし、３７℃下で二酸化炭素セルインキュベーターにおいて一晩インキュベートした。翌日に、０．０５ＭＯＩ（即ち、５×１０4ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ウェル）でワクシニアウイルス野生株７５２－１を加え（北京生物制品研究所により提供）、その後、３７℃二酸化炭素セルインキュベーターに入れて２時間インキュベートし、その間にシャトルベクター／トランスフェクション試薬複合体を調製した。シャトルベクターは実施例１に得たｐＳＣ６５ＣＹで、トランスフェクション試薬はＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒ０５３１）であり、トランスフェクション用量と複合方法についてはトランスフェクション試薬取扱書を参照できる。複合系が出来上がったら、１４３Ｂ細胞上清を２ｍＬ／ウェルの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ維持培地に取り替え、その後、シャトルベクター／トランスフェクション試薬複合体を加えた。４８時間トランスフェクションした後、上清を除去して、細胞を回収し、０．５ｍＬの維持培地において再懸濁させ、凍結－融解を３回繰り返し、その後、組換え細胞溶解物を新しい１４３Ｂ細胞（５０μｇ／ｍＬＢｒｄＵ含有）に加え、３７℃下で１～２日インキュベートした。その間に細胞の病変を観察し、ウイルスプラークの数（２０プラーク未満／ウェル）が好適になったら、シングルプラークの精製を行った。
シングルプラークの精製：
蛍光顕微鏡下において緑色蛍光を発現するウイルスプラークを観察し、マークを付けた。
上清を除去して、各ウェルから充分に分散していた緑色蛍光プラークをいくつか選び、それぞれ、０．５ｍＬの維持培養液を含むＥｐチューブに移した。
ウイルスを含むＥｐチューブを振盪して均一に混合させ、凍結－融解（－８０℃冷蔵庫で約５分間、室温約２分間）を３回繰り返し、最後に振盪して均一に混合させ、－８０℃下で冷凍保存した。
シングルプラークの精製を、純度が１００％になるまで少なくとも６回繰り返した。
実施例３：組換えワクシニアウイルスベクターｒｖｖ－ＣＹの増幅と滴定
実施例２において構築された組換えワクシニアウイルスベクターｒｖｖ－ＣＹ、ワクシニアウイルス野生株（ｒｖｖ－ＷＴ）を、それぞれ、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１）において増幅させ、増幅方法は次のとおりである。
前日に、密集度が１００％の単層Ｖｅｒｏ細胞（１×１０7細胞／シャーレ）を用意し、１０シャーレ分であった。
上清を除去して、維持培地に取り替え、増幅用のワクシニアウイルスを細胞（０．０１ＰＦＵ／細胞）に接種し、３７℃インキュベーターにおいて２～３日インキュベートし、観察により明らかな細胞病変が見られた。
細胞をかき集め、１８００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。
５ｍＬの維持培地において再懸濁させ、氷上において超音波細胞破砕装置で超音波処理し、超音波条件としては、５０Ｗで、５秒間の超音波と５秒の間隔を１５分間続けた。
凍結－融解（－８０℃冷蔵庫で約５分間、室温約２分間）を２回繰り返し、最後に振盪して均一に混合させた。
クラスII生物学的安全キャビネットにおいて１ｍＬ／管で１．５ｍＬ遠心管に分注し、－８０℃下で冷凍保存した。
感染力価を測定するために、増幅させたワクシニアウイルスをＶｅｒｏ細胞において滴定し、方法は具体的に次のとおりである。
前日に、２４ウェルプレートに、３×１０5／ウェルで、１００％のコンフルエンスに達するＶｅｒｏ細胞を用意した。
上清を除去して、各ウェルには、細胞が乾燥するのを防ぐために、２００μＬの維持培養液を追加した。
１００μＬの被検ワクシニアウイルスに９００μＬの維持培地を加えて、１０倍希釈で１０1、１０2、１０3、…、１０9倍と連続希釈した。なお、希釈する時は、濃度が低くなるため、低い濃度に希釈するたびにピペットチップを交換すべきである。
ウイルスの低い濃度のほうから（１０9、１０8、…１０4）２４ウェルプレートに加え、各ウェルは４００μＬの希釈液とし、２連ウェルで、６つの希釈倍数に対して連続的に測定した。追加済みの２４ウェルプレートを３７℃セルインキュベーターに入れて２日間インキュベートした。
顕微鏡下においてウイルスプラークを数え、２０を超えれば、２０＋と記す。計数可能な２０以下のプラークの数の２連ウェルの平均×２．５（１０００μＬ／４００μＬ）×ウェルの対応の希釈倍数を、組換えウイルスの力価（ＰＦＵ／ｍＬ）とした。
ワクシニアウイルスベクターの力価滴定結果は表２に示すとおりである。
Figure 2023514337000002
実施例４：サイトカインの発現測定
実施例３において、ワクシニアウイルス野生型ｒｖｖ－ｗｔ及び組換えワクシニアウイルスｒｖｖ－ＣＹに感染されたｖｅｒｏ細胞の上清をそれぞれ得、ＥＬＩＳＡ法で感染上清におけるサイトカインの含有量を測定した。ヒトＩＬ－７（カタログ番号ＳＥＫ１１８２１）、ヒトＩＬ－１５（カタログ番号ＳＥＫ１０３６０）、ヒトＧＭ－ＣＳＦ（カタログ番号ＳＥＫ１００１５）測定用のＥＬＩＳＡキットは北京義翹神州社から購入した。ヒトＩＬ－２１（カタログ番号８８－８２１８）測定用のＥＬＩＳＡキットはサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。測定方法はキットの取扱説明書を参照した。ウイルス感染上清から測定した各サイトカインの含有量を表３に示す。測定結果がいずれも検出限界未満（＜０．０１ｎｇ／ｍＬ）であることから、ワクシニアウイルス野生型ｒｖｖ－ｗｔ感染上清にサイトカインが発現されていないことが判明した。これに対し、製造されたサイトカイン核酸配列を備える組換えワクシニアウイルスｒｖｖ－ＣＹの場合はいずれも各サイトカインの発現が測定され、ヒトＧＭ－ＣＳＦの分泌量が１４４．６ｎｇ／ｍＬのレベルに達しており最多で、他のサイトカインの分泌量がほぼ同じで、１～６ｎｇ／ｍＬのレベルに集中していた。
Figure 2023514337000003
実施例５：サイトカインヒトＧＭ－ＣＳＦの活性測定
完全ＲＰＭＩ－１６４０培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）、２ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３）においてＴＦ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２００３）を対数期まで培養し、１２５ｇで１０分間遠心分離して細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地で再懸濁させ、再び遠心分離して細胞を回収し、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で１×１０5の細胞／ｍＬに希釈し、充分に均一に混合させて、９６ウェルプレートに加え、各ウェルは１００μＬ（１×１０4の細胞）であった。
ヒトＧＭ－ＣＳＦ標準物質（近岸タンパク提供、カタログ番号ＣＣ７９）を２倍勾配で段階的に希釈し、低い濃度のほうからそれぞれ９６ウェルプレートに加え、ブランク対照を設け、各濃度では２連ウェルとし、合わせて１２の勾配とした。３７℃×５％ＣＯ2インキュベーターに入れて９６時間培養した。
その後、９６ウェルプレートの各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８（ＭＣＥ社、カタログ番号ＨＹ－Ｋ０３０１）試薬を加えて、インキュベーターに戻して引き続き２～４時間培養し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定した。
図３の測定結果に示されるように、実施例３において製造されたサイトカイン核酸配列を備える組換えワクシニアウイルスｒｖｖ－ＣＹ感染上清において分泌されたヒトＧＭ－ＣＳＦは活性（半数効果濃度（ＥＣ50）は４．２ｎｇ／ｍＬ）を有しており、ヒトＧＭ－ＣＳＦ標準物質（ＥＣ50は２．８ｎｇ／ｍＬ）と同等であった。
実施例６：サイトカインヒトＩＬ－２１の活性測定
完全ＲＰＭＩ－１６４０培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ））においてＭｉｎｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３０００）を対数期まで培養し、１２５ｇで遠心分離して細胞を回収し、完全培地で２×１０5個／ｍＬに希釈した。
ヒトＩＬ－２１標準物質（北京義翹神州提供、カタログ番号１０５８４－ＨＮＡＥ）を９６ウェルプレートにおいて２倍勾配で段階的に希釈し、ブランク対照を設け、合わせて１２の勾配とし、各ウェルは１００μＬとし、希釈した後に均一に混合した細胞５０μＬ（１×１０4の細胞）を加え、各ウェルは合計で１５０μＬの液体とした。９６ウェルプレートを３７℃×５％ＣＯ2インキュベーターに入れて６～７日培養した。
培養を終えた９６ウェルプレートの各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ社、カタログ番号ＨＹ－Ｋ０３０１）を加えて、インキュベーターに戻して引き続き４～８時間培養し（色の変化に応じて時間を決定する）、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定した。
図４の測定結果に示されるように、実施例３において製造されたサイトカイン核酸配列を備える組換えワクシニアウイルスｒｖｖ－ＣＹ感染上清において分泌されたヒトＩＬ－２１は活性（ＥＣ50は１．１ｎｇ／ｍＬ）を有しており、ヒトＩＬ－２１標準物質（ＥＣ50は７ｎｇ／ｍＬ）と同等であった。
実施例５と実施例６の結果は、製造されたサイトカイン核酸配列を備える組換えワクシニアウイルスｒｖｖ－ＣＹが、生物学的活性を有するサイトカインを正しく発現できることを示していた。
実施例７：腫瘍治療実験
蘇州大学動物実験センターから６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを２０匹購入し、蘇州大学動物実験センターのＳＰＦ飼育室において飼育した。０日目に、全てのマウスに腫瘍細胞ＣＴ２６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８）を皮下接種し、接種量は１×１０5細胞／匹で、その後、ランダムに２群に分けた。腫瘍細胞接種後の１日目、１４日目及び２８日目に、マウスに、それぞれ、実施例３において製造された組換えウイルスベクターｒｖｖ－ＣＹ又は対照ワクシニアウイルスベクター野生株ｒｖｖ－ＷＴを接種した。また、相応的に、腫瘍細胞接種後の１日目、１４日目及び２８日目に、ワクシニアウイルス群のマウスに、実施例３において製造されたワクシニアウイルスベクターを前脛骨筋に接種した（ワクチン接種計画の詳細は表４参照）。接種後に連続的に観察し腫瘍の成長状況を測定した。次の算式で腫瘍体積を計算した。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝長さ×幅2／２。
マウスの腫瘍体積が２０００ｍｍ3を超えると、マウスを殺した。
Figure 2023514337000004
ワクシニアウイルスベクターワクチンｒｖｖ－ＣＹ治療群のマウスは対照群のマウスより全生存期間が明らかに長かった。結果は、ワクシニアウイルスベクターワクチンｒｖｖ－ＣＹが、発現腫瘍にかかっているマウスの生存を延長できることを示していた。
本発明ではある程度説明しているものの、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、各条件を適切に変更したりできることは自明である。なお、本発明は前記実施形態に限定されず、特許請求の範囲と、その各要素を同等に置き換えたものに準拠する。

Claims (12)

  1. サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターであって、前記サイトカインはＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦから１つ又は複数選ばれる、前記組換えウイルスベクター。
  2. 前記ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列は配列番号２に示されるとおりであり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－１５のコーディング核酸配列は配列番号１に示されるとおりである、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
  3. 前記ＧＭ－ＣＳＦはヒトＧＭ－ＣＳＦであり、好ましくは、前記ヒトＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列は配列番号４に示されるとおりであり、好ましくは、前記ヒトＧＭ－ＣＳＦのコーディング核酸配列は配列番号３に示されるとおりである、請求項１又は２に記載の組換えウイルスベクター。
  4. 前記ＩＬ－７はヒトＩＬ－７であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列は配列番号６に示されるとおりであり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－７のコーディング核酸配列は配列番号５に示されるとおりである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
  5. 前記ＩＬ－２１はヒトＩＬ－２１であり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列は配列番号８に示されるとおりであり、好ましくは、前記ヒトＩＬ－２１のコーディング核酸配列は配列番号７に示されるとおりである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
  6. 前記サイトカインはヒトＩＬ－１５、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＩＬ－７、ヒトＩＬ－２１を含み、好ましくは、前記サイトカインをコードするポリヌクレオチドの核酸配列は配列番号１５に示されるとおりであり、好ましくは、前記ポリヌクレオチドにコードされたアミノ酸配列は配列番号１６に示されるとおりである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
  7. 前記ウイルスベクターはワクシニアウイルスベクターであり、好ましくは複製型ワクシニアウイルスベクターであり、例えば、ワクシニアウイルスＴｉａｎｔａｎ株であり、例えば、７５２－１株であり、又は、非複製型ワクシニアウイルスベクターであり、例えば、ワクシニアウイルス弱毒化ワクチンアンカラ株（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
  8. 予防及び／又は治療有効量の請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、免疫組成物。
  9. 予防及び／又は治療有効量の請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、抗腫瘍ワクチン。
  10. 請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターと、請求項８に記載の免疫組成物又は請求項９に記載の抗腫瘍ワクチンと、その取扱説明書とを含む、キット。
  11. 腫瘍の治療及び／又は予防薬物の製造における、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター、請求項８に記載の免疫組成物又は請求項９に記載の抗腫瘍ワクチンの用途であって、好ましくは、前記腫瘍は悪性腫瘍であり、より好ましくは、前記悪性腫瘍は乳がん又は結腸がんである、前記用途。
  12. それを必要とする被験者に、予防及び／又は治療有効量の請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター、請求項８に記載の免疫組成物又は請求項９に記載の抗腫瘍ワクチンを投与することを含み、好ましくは、前記腫瘍は悪性腫瘍であり、より好ましくは、前記悪性腫瘍は乳がん又は結腸がんである、腫瘍を治療及び／又は予防する方法。
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